2) Ανάπτυξη βασικών αρχών της in vivo μεταφοράς γονιδίων με την βοήθεια ειδικών συστημάτων μεταφοράς (πλασμίδια, αδενοϊοί)

Transcript

1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 4 η Ενότητα: 1) Ανάπτυξη βασικών αρχών πειραματικών in vivo μεθόδων για την δημιουργία διαγονιδιακών ζώων (knock-out / knock-in) 2) Ανάπτυξη βασικών αρχών της in vivo μεταφοράς γονιδίων με την βοήθεια ειδικών συστημάτων μεταφοράς (πλασμίδια, αδενοϊοί) 3) ex vivo τεχνολογία: αρχές και σκοπιμότητα στην έρευνα στην Φυσιολογία Κατερίνα Κωνσταντίνου, PhD Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστήμιο Πατρών Εαρινό Εξάμηνο Ακαδ. Έτος

2 Το ποντίκι ως πρότυπος οργανισμός μελέτης ανθρώπινων ασθενειών

3 Μοντελοποίηση ανθρώπινων Ασθενειών Υπάρχουν πολλές γνωστές μεταλλάξεις γονιδίων οι οποίες αναπαράγουν ανθρώπινες ασθένειες σε ποντίκια. Είναι τα ποντίκα αυτή ακριβή πρώτυπα της ανθρώπινης ασθένειας; Δεν αντιστοιχούν όλοι οι φαινότυποι του ποντικού με εκείνους του ανθρώπου Ο δημοφιλέστερος κλώνος ανάπτυξης πειραματικών μοντέλων είναι το C57BL/6 Είναι μια μελέτη ενός και μόνο στελέχους αρκετή για να κάνει συμπεράσματα για τον άνθρωπο;

4 Σύγκριση πειραματικών μοντέλων Numbers of Eggs per ovulation Mouse Chick Zebrafish Xenopus 5-10 Development controlled by temp Lots and lots Lots and lots Initial Size ~100 µm 2-3mm 600 µm ~1 mm Gestation time days ~20 days ~1-2 days 4 days to swimming tadpole Development Environment In utero In ovo External External Genome Sequenced Sequenced Sequenced Sequenced Genomic Manipulation Surgical Manipulation Common Cannot Do It Common Difficult Common Common Cannot Do It Common

5 Επισκόπηση Αναπαραγωγή Μη ομόλογος ανασυνδυασμός Ομόλογος ανασυνδυασμός Cre / loxρ ανασυνδυασμός Ανάπτυξη ιστών Ιστολογία Μοντέλα των ανθρώπινων ασθενειών

6 Αναπαραγωγή 5-10 γέννες / έτος 5-10 απόγονοι/ γέννα ημέρες κύησης Σεξουαλικά ώριμα στις 7 εβδομάδες 4-5 γενιές / έτος

7 Τεχνικές για το ποντίκι

8 Τύποι γενετικών τροποποιήσεων «knock-in» Η εισαγωγή ενός διαγονιδίου ή ενός τροποποιημένου αλληλόμορφου μπορεί να παράγει ένα gain-of-function μετάλλαξη «Knockout» η απάλειψη ενός συγκεκριμένου γονιδίου ή τμήματος του DNA loss-of-function μετάλλαξη «Conditional Mutant» ιστοειδικά και χρονικά ελεγχόμενα μεταλάγματα

9 Δημιουργώντας ένα διαγονιδιακό ζώο

10 A Πιο αναλυτικά... C B

11 Α. Μέθοδοι εισαγωγής επιθυμητού γονιδίου σε κύτταρα 1) Μικροέγχυση κλωνοποιημένου γονιδίου στον πυρήνα ενός γονιμοποιημένου ωραρίου με: 3) Διαμόλυνση εμβρυικών βλαστοκυττάρων, η οποία απαιτεί επώαση των βλαστοκυττάρων σε ειδικό διάλυμα που τα κάνει δεκτικά στην είσοδο του ξένου DNA. έχει χαμηλό ποσοστό επιτυχίας και απαιτεί σύστημα επιλογής των κυττάρων που πήραν το ξένο DNA από εκείνα που δεν το πήραν 3) Ηλεκτροδιάτρηση ένας παλμός υψηλής τάσης «σπρώχνει» το ξένο DNA στα κύτταρα 4) Ρετροϊικοί φορείς ο πιο φυσικός τρόπος εισαγωγής γονιδίων σε κύτταρα. Στο γενετικό υλικό του ρετροϊού πρέπει να έχουν αποσιωπηθεί τα γονίδια πολλαπλασιασμού

12 Μικροέγχυση

13 Διαμόλυνση εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων

14 Ηλεκτροδιάτρηση Ιδιαίτερα αποτελεσματική μέθοδος για εισαγωγή γονιδίων σε κυτταροκαλλιέργειες

15 Ρετροϊικοί Φορείς

16 Ρετροϊικοί Φορείς

17

18 Αποσιώπηση γονιδίων Ομόλογος ανασυνδιασμός Εισαγωγή ξένου DNA σε κύτταρα Κλωνοποίηση μεταλλαγμένου μη λειτουργικού γονιδίου Ο ομόλογος ανασυνδιασμός σε βλαστοκύτταρα θα πραγματοποιηθεί αυθόρμητα και το λειτουργικό γονίδιο θα αντικατασταθεί με μη λειτουργικό

19 Ομόλογος ανασυνδιασμός

20 BMP7

21 ιστοειδικά ή/και χρονικά ελεγχόμενα μεταλλάγματα Οι ιστοειδικές ή χρονικά ελεγχόμενες μεταλλάξεις απαιτούνται όταν θέλετε να μελετήσετε τις επιπτώσεις ενός γονιδίου σε ορισμένους ιστούς και στην ενήλικη ζωή, αλλά το γονίδιο είναι απαραίτητο νωρίς στην ανάπτυξη. Ένα παραδοσιακό νοκ-άουτ θα οδηγούσε σε ένα μεταλλαγμένο ζώο που δεν θα αναπτύσσοταν ώς το επιθυμητό στάδιο μελέτης. Η Cre είναι μια ρεκομπινάση που αποκόπτει το DNA που βρίσκεται μεταξύ 2 θέσεων lοχρ Σε αυτή την περίπτωση θα δημιουργήσετε δύο διαγονιδιακές σειρές: η μία θα εκφράζει την Cre στον ιστό που σας ενδιαφέρει και μια δεύτερη που θα περιέχει υπό μελέτη γονίδιο περιστοιχιζόμενο από lοχρ. Το γονίδιο θα διαγραφεί μόνο όταν και όπου η Cre εκφράζεται. Η έκφραση του γονίου της cre εξαρτάταται από τον υποκινητή που θα χρησιμοποιήσετε

22 Cre/loxP ανασυνδιασμός

23 Cre/loxP ανασυνδιασμός

24 Διαστάυρωση Cre/loxP για δημιουργία ιστοειδικών γονιδιακών ελλείψεων

25 Διαστάυρωση Cre/loxP για δημιουργία ιστοειδικών γονιδιακών ελλείψεων

26 In vivo versus ex vivo In vivo = η εισαγωγή των γονιδίων γίνεται μέσα στο σώμα Ex vivo = η εισαγωγή των γονιδίων γίνεται εκτός του σώματος και μετά τα κύτταρα επιστρέφουν στο σώμα

27 Oι in vivo τεχνικές χρησιμοποιούν ιικούς φορείς για την μεταφορά γονιδίων Ο ιός καθίσταται «ανάπηρος» με απενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων του, ως προς την ικανότητά του να προκαλέσει ασθένεια Οι μέθοδοι αυτές έχουν αποδειχθεί ότι είναι οι πιο αποτελεσματικές μέχρι σήμερα Πολλοί ιικοί φορείς (adenoassociated virus-gene transfer) μπορούν ενσωματώσουν σταθερά σε βάθος χρόνου πολλών μηνών το επιθυμητό γονίδιο στο γονιδίωμα του κυττάρου-στόχου

28 Oι ex vivo τεχνικές για την μεταφορά γονιδίων Ηλεκτροδιάτρηση Τα λιποσώματα Φωσφορικό ασβέστιο Σφαιρίδια χρυσού Ρετροτρανσποζόνια (μεταθετά γονίδια) Ανθρώπινα τεχνητά χρωμοσώματα (γονιδιακή θεραπεία)

29 Άλλες μέθοδοι πρόκλησης gain-of-function και loss-of-function μεταλλάξεων σε εμβρυικά βλαστοκύτταρα Zinc Finger Nuclease (ZFN) Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALEN) Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)

30