Δράση 28: Επιβίωση του Παθογόνου Listeria monocytogenes

Transcript

1 Journal Odysseus Environmental & Cultural Sustainability of the Mediterranean Region: 5 (2013): Δράση 28: Παθογόνου Listeria Αναστασιάδου Κυριακή, Απόφοιτος του Τμήματος Βιολογικής Γεωργίας του ΤΕΙ Ιονίων Νήσων Ρούσσα Χρυσούλα, Εξωτερικός Συνεργάτης του Τμήματος Τεχνολογίας Τροφίμων του ΤΕΙ Ιονίων Νήσων Ηρειώτου Ευφημία, Επίκουρος Καθηγήτρια του Τμήματος Τεχνολογίας Τροφίμων του ΤΕΙ Ιονίων Νήσων >29 Περίληψη Κατά τη μελέτη αυτή εξετάστηκε η επιβίωση του παθογόνου βακτηρίου L. σε δύο τύπους γιαουρτιού. Πληθυσμοί του μικροοργανισμού (10 2 cfu/gr) ανιχνεύθηκαν μέχρι και την έκτη ημέρα. Εισαγωγή Τα γαλακτοκομικά προϊόντα περιέχουν μεγάλο αριθμό μικροοργανισμών οι οποίοι χωρίζονται σε ωφέλιμους και παθογόνους (Adesiyun, A.A.,1994). Τα τελευταία χρόνια έχει καταδειχτεί ότι ορισμένα στελέχη βακτηρίων γαλακτικού οξέος συμβάλλουν στην προστασία του ανθρώπινου οργανισμού, με αποτέλεσμα να χρησιμοποιούνται σε προϊόντα διατροφής. Μια απ τις ιδιότητες των βακτηρίων γαλακτικού οξέος είναι ότι παράγουν οργανικά οξέα τα οποία καθυστερούν την αλλοίωση των ζυμώμενων τροφίμων και προλαμβάνουν την μόλυνση από παθογόνα βακτήρια. Μια άλλη ευεργετική ιδιότητα των οξυγαλακτικών βακτηρίων είναι ότι ορισμένα στελέχη απελευθερώνουν ουσίες που ονομάζονται βακτηριοσίνες (Cheikhyousef et al., 2009, Gibson and Wang, 1994, Gomes and Malcata, 1999, Ibrahim and Salameh, 2001). Οι βακτηριοσίνες έχουν την ικανότητα να καταστρέφουν άλλα επιβλαβή βακτήρια, με αποτέλεσμα να αποτελούν ένα είδος φυσικού όπλου ενάντια στα παθογόνα βακτήρια (Martinez, et al., 2013). Τα γαλακτικά βακτήρια εντοπίζονται στο πεπτικό μας σύστημα, το δέρμα και το κολπικό βλεννογόνο, προστατεύοντας τον οργανισμό από παθογόνα βακτήρια. Τις κύριες προβιοτικές ομάδες αποτελούν στελέχη των γενών Streptococcus, Lactobacillus και Bifidobacterium τα οποία χρησιμοποιούνται για την παρασκευή γιαουρτιού καθότι μετατρέπουν το γάλα σε γιαούρτι και διαμορφώνουν τα ιδιαίτερα γευστικά χαρακτηριστικά.

2 >30 Αριστερά ανάπτυξη αποικιών Lactobacillus και δεξιά ανάπτυξη αποικιών Bifidobacterium σε τρυβλία MRS. Ένα από τα παθογόνα βακτήρια που απαντάται στο γάλα και στα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι η Listeria. Πρόκειται για ένα θετικό κατά Gram βακτήριο, το οποίο κινείται με τη βοήθεια μαστιγίων και θεωρείται αερόβιο έως μικροαερόφιλο. Η L. είναι αρκετά ανθεκτική και αντιστέκεται στα επιβλαβή αποτελέσματα του παγώματος, της ξήρανσης και της θερμότητας, γεγονός εντυπωσιακό για ένα βακτήριο το οποίο δεν παράγει ενδόσπορους. Προσαρμόζεται εύκολα σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (2 ο C- 42 ο C), καθώς επίσης σε χαμηλό ph και σε μεγάλες συγκεντρώσεις άλατος. Έρευνες απέδειξαν ότι 1-10% των ανθρώπων μπορεί να είναι εντερικοί φορείς του. Έχει βρεθεί σε τουλάχιστον 37 θηλαστικά είδη, οικόσιτα και άγρια, καθώς επίσης και σε 17 είδη πουλιών και ενδεχομένως σε μερικά είδη ψαριών και οστρακόδερμων. Μπορεί να απομονωθεί από το χώμα, το χορτάρι και άλλες περιβαλλοντικές πηγές. Αποικίες της L.

3 Η ασθένεια που προκαλεί ονομάζεται λιστερίωση. Η λιστερίωση είναι μία βακτηριακή λοίμωξη που προκαλεί σηψαιμία, μηνιγγοεγκεφαλίτιδα και αποβολή του κυήματος στις εγκυμονούσες και έχει συνδεθεί με τρόφιμα όπως, το ακατέργαστο γάλα, τα τυριά (ιδιαίτερα μαλακά τυριά ή μη ωριμασμένες ποικιλίες), το παγωτό, τα ακατέργαστα λαχανικά, κρέατα, πουλερικά και ψάρια. Πειραματικό Μέρος >31 Κατά τη διάρκεια της πειραματικής μελέτης χρησιμοποιήθηκαν δυο είδη συσκευασμένου γιαουρτιού από διαφορετικές εταιρίες. Το πρώτο είδος περιείχε καλλιέργεια γιαούρτης (Lactobacillus delbruekii και Streptococcus thermophilus) και καλλιέργεια Bifidobacterium ενώ το δεύτερο είδος περιείχε μόνο καλλιέργεια γιαούρτης. Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική εργασία περιελάμβαναν το υλικό Listeria Selective agar (LA) της Merck που εμπεριείχε την απαραίτητη συγκέντρωση Selective Supplement και Enrichment Supplement και το θρεπτικό υπόστρωμα DeMan, Rogosa and Sharpe (MRS) agar (Difco). Στη συνέχεια πάρθηκαν πέντε δείγματα των 200 gr από το κάθε είδος γιαούρτης, τα οποία εμβολιάστηκαν ξεχωριστά το καθένα με Listeria (ATCC No 15313) και διατηρήθηκαν σε άσεπτες συνθήκες. Ακολούθησε ομογενοποίηση του κάθε δείγματος ξεχωριστά σε μηχάνημα Stomacher. Από το κάθε είδος πάρθηκαν 2 δείγματα των 10 gr τα οποία ομογενοποιήθηκαν με 90 ml πεπτόνης. Έγινε δειγματοληψία σε τακτά χρονικά διαστήματα, απ όπου έγιναν διαδοχικές αραιώσεις του 1/10. Από τη κάθε αραίωση χρησιμοποιήθηκαν 100 μl στην επιφάνεια του κατάλληλου θρεπτικού υποστρώματος (L.A., M.R.S) Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 35 ο C για 48 ώρες και υπολογίστηκε ο αριθμός των μικροοργανισμών για κάθε χρονικό σημείο. Αποτελέσματα και Συμπεράσματα Ο πληθυσμός των ευεργετικών μικροοργανισμών καταμετρείται στο υλικό MRS ενώ τα κύτταρα της Listeria στο υλικό LA. Από τα Διαγράμματα 1 και 2 φαίνεται ότι και στους δύο τύπους γιαουρτιού ο αριθμός των ενδογενών βακτηρίων (των βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή του γιαουρτιού) δεν παρουσιάζει ιδιαίτερη μεταβολή κατά τη χρονική διάρκεια που εξετάστηκε. Στη πρώτη περίπτωση πρόκειται για γιαούρτι που εκτός από την κλασσική καλλιέργεια γιαούρτης (Lactobacillus delbruekii και Streptococcus thermophilus) εμπεριέχει και το αναερόβιο Bifidobacterium actiregularis. Είναι γνωστό ότι όλα αυτά τα είδη παράγουν στο περιβάλλον που αναπτύσσονται βακτηριοσίνες. Πρόκειται για ουσίες που αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων βακτηρίων χωρίς να επηρεάζουν αρνητικά τον άνθρωπο. Είναι λογικό ότι αναμένεται μεγαλύτερη παραγωγή βακτηριοσινών και κατ επέκταση μεγαλύτερη αναστολή των παθογόνων όταν ο πληθυσμός των συγκεκριμένων βακτηρίων είναι μεγαλύτερος.

4 >32 log cfu/gr DEATH CURVE yogurt TIME (hrs) LA MRS Διάγραμμα 1: Καμπύλη θανάτου για οξυγαλακτικά βακτήρια (MRS) και Listeria (LA) στο γιαούρτι τύπου 1. DEATH CURVE yogurt log cfu/gr TIME (hrs) LA MRS Διάγραμμα 2: Καμπύλη θανάτου για οξυγαλακτικά βακτήρια (MRS) και Listeria (LA) στο γιαούρτι τύπου 2. Σημαντική διαφορά ανάμεσα στα δύο είδη γιαουρτιού είναι ο αριθμός των ευεργετικών μικροοργανισμών που υπάρχουν. Στο δεύτερο τύπο (ο οποίος έχει μόνο τα δύο κλασσικά είδη) ο συνολικός αριθμός είναι κατά δέκα φορές μικρότερος (10 7 cfu/gr). Αν οι βακτηριοσίνες προκαλούν αναστολή στη Listeria θα έπρεπε να παρατηρούμε την αναστολή αυτή στο πρώτο τύπο γιαουρτιού πολύ πιο έντονα, απ ότι παρατηρείται. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι είτε το συγκεκριμένο είδος Bifidibacterium που υπάρχει στο γιαούρτι δεν παράγει βακτηριοσίνες, είτε οι βακτηριοσίνες που

5 >33 Stomacher για ομογενοποίηση δείγματος παράγονται δεν έχουν επίδραση στο στέλεχος της Listeria που χρησιμοποιήθηκε. Αντίθετα με τα βακτήρια της καλλιέργειας της γιαούρτης ο αριθμός των κυττάρων του παθογενούς βακτηρίου μειώνεται σημαντικά σε χρόνο 120 ώρες (5 ημέρες). Τα αποτελέσματα αυτά συγκρίνονται με αυτά των Siragusa & Johnson (1988) όπου μελετώντας την επιβίωση στελέχους της Listeria βρήκαν ότι εάν το γιαούρτι εμβολιαζόταν με πολύ χαμηλό εμβόλιο βακτηρίων (10 2 cfu/gr), ο μικροοργανισμός δεν ανιχνευόταν μετά από 24 ώρες. Εάν όμως το εμβόλιο ήταν μεγαλύτερο (10 7 cfu/gr) τότε ανιχνευόταν μέχρι και την ημέρα 6 αλλά όχι την ημέρα 9. Κατά την προαναφερθείσα αυτή εργασία, τα χρονικά σημεία κατά τα οποία γινόταν δειγματοληψία ήταν κάθε 3 ημέρες με αποτέλεσμα να μην γνωρίζουμε τι συμβαίνει κατά τα ενδιάμεσα διαστήματα. Επιπλέον δεν καταμετρήθηκε το φορτίο αλλά τα αποτελέσματα δίδονται ως θετικά ή αρνητικά. Η μεθοδολογία που χρησιμοποιήσαμε απαγορεύει την ανίχνευση και καταμέτρηση βακτηρίων κάτω των 10 2 cfu/gr. Στο συγκεκριμένο πείραμα αυτό δεν αποτελεί πρόβλημα αφού στόχος ήταν η διερεύνηση της επιβίωσης του παθογόνου στο τρόφιμο. Παρατηρούμε ότι ο πληθυσμός έχει συνεχή μείωση και ότι μείωση κατά δύο λογαριθμικούς κύκλους παρατηρείται σε 4 ή 5 ημέρες και μείωση κατά 4 λογαριθμικούς κύκλους σε 6 ημέρες. Τέλος ο μικροοργανισμός ανιχνεύεται μέχρι και την έκτη ημέρα. Το γεγονός ότι δεν παρατηρείται πολύ πιο έντονη αναστολή της L. στο γιαούρτι που περιέχει κατά δέκα φορές (10 8 cfu/gr) περισσότερα τα βακτήρια του γαλακτικού οξέως, σημαίνει ότι η αναστολή δεν οφείλεται στην

6 >34 παραγωγή βακτηριοσινών αλλά στην μείωση θρεπτικού/θρεπτικών ουσιών στο τρόφιμο που αναπτύσσεται ο μικροοργανισμός. Συμπερασματικά παρατηρούμε ότι ο αριθμός των ευεργετικών μικροοργανισμών που υπάρχουν στο γιαούρτι παραμένει σταθερός καθ όλη τη χρονική διάρκεια της διεξαγωγής του πειράματος (10 7 cfu/gr ή 10 8 cfu/gr). Τα βακτήρια αυτά είναι σημαντικά, γιατί προσκολλώνται στο έντερο αποτρέποντας παθογόνους να εγκατασταθούν. Επιπλέον, μειώνουν το ph που και αυτό με τη σειρά του αναστέλλει την ανάπτυξη πολλών μικροοργανισμών. Το παθογόνο είδος L., του οποίου μελετήθηκε η επιβίωση στο γιαούρτι, φαίνεται να παραμένει σε καταμετρήσιμους αριθμούς για έξι τουλάχιστον ημέρες. Συνεπώς είναι απαραίτητη η σωστή παστερίωση του γάλακτος πριν τη παρασκευή των γιαουρτιών, ώστε αυτό να είναι ασφαλές στον καταναλωτή από το συγκεκριμένο παθογόνο. Βιβλιογραφία Adesiyun, A.A., Bacteriological quality and associated public health risk of pre-processed bovine milk in Trinidad. Int J Food Microbiol, : Amand SK, Srinivasan RA, Rao LK. Antimicrobial activity associated with Bifidobacterium bifidum-1. Cult Dairy Prod J, :6-7. Cheikhyoussef A. Cheikhyoussef N, Chen H, Zhao J, Tang J, Zhang H, et al. Bifidin 1-a new bacteriocin produced by Bifidobacterium infantis BCRC 14602: purification and partial amino acid sequence. Food Control, : Martinez F.A.C., Balciunas E.M., Converti A., Cotter P.D., Oliveira R.P.S., Bacteriocin production by Bifidobacterium spp. A review, : Von Ah U. Identification of Bifidobacterium thermophilum RBL67 isolated from baby faeces and partial purification of its bacteriocin. Culture. Swiss Federal Institute of Technology. Zurich: PhD Thesis: p Yildirim Z., Johnson M. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B. bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum ncfb J Food Prot : Yildirim Z, Winters D, Johnson M. Purification, amino acid sequence and more of action of bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454.j Appl Microbiol :45-54