ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΚΑΙ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ LISTERIA MONOCYTOGENES ΣΕ ΧΗΜΙΚΩΣ ΚΑΘΟΡΙΣΜΕΝΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΣΤΟΥΣ 7 C

Transcript

1 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, - ΙΟΥΝΙΟΥ, 01. ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΚΑΙ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ LISTERIA MONOCYTOGENES ΣΕ ΧΗΜΙΚΩΣ ΚΑΘΟΡΙΣΜΕΝΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΣΤΟΥΣ C Ν.Α. Τυροβούζης Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, 1 Θεσσαλονίκη Α.Σ. Αγγελίδης Τμήμα Κτηνιατρικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, 1 Θεσσαλονίκη Ν.Γ. Στοφόρος Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, 11 Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σε ορισμένες κατηγορίες έτοιμων προς κατανάλωση τροφίμων, η ικανότητα της Listeria monocytogenes να αναπτύσσεται σε χαμηλές θερμοκρασίες μπορεί να οδηγεί σε αύξηση της πληθυσμιακής συγκέντρωσης του παθογόνου, σε επίπεδα που καθιστούν τα μολυσμένα τρόφιμα μη συμμορφούμενα προς τα κριτήρια ασφάλειας της Ευρωπαϊκής νομοθεσίας. Προηγούμενες έρευνες αναφορικά με τη συμπεριφορά παθογόνων βακτηρίων σε συνθήκες καταπόνησης (stress) που συναντώνται κατά την παρασκευή και συντήρηση των τροφίμων έχουν καταδείξει ενδοστελεχιακή παραλλακτικότητα. Επομένως, σκοπό της παρούσας έρευνας αποτέλεσε ο προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης έξι ετερογενών (από άποψη πηγής απομόνωσης, ορότυπου και γενετικής καταγωγής) στελεχών της L. monocytogenes σε θερμοκρασία ψύξης ( C) με χρήση χημικώς καθορισμένου υποστρώματος (Modified Welshimer s Broth) και άμεσης μεθόδου προσδιορισμού της βακτηριακής ανάπτυξης (αρίθμηση αποικιών σε τρυβλία BHI agar). Επίσης, πραγματοποιήθηκε σύγκριση των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης των μεμονωμένων στελεχών με εκείνες καλλιεργειών που ενοφθαλμίστηκαν με μίγμα ίσων αρχικών πληθυσμών των έξι στελεχών (με ενοφθάλμισμα ca. 10 cfu/ml τόσο για τις καλλιέργειες των μεμονωμένων στελεχών όσο και του μίγματος). Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική ενδοστελεχιακή παραλλακτικότητα του παθογόνου αναφορικά με τις κινητικές παραμέτρους ανάπτυξής του, ενώ οι τιμές των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης στις καλλιέργειες που ενοφθαλμίστηκαν με μίγμα στελεχών ήταν παρόμοιες με εκείνες που υπολογίστηκαν από τα δεδομένα ανάπτυξης του ταχύτερα αναπτυσσόμενου στελέχους. Συμπερασματικά, η ανάπτυξη διαφορετικών στελεχών της L. monocytogenes σε χαμηλές θερμοκρασίες παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια, με τους υπεύθυνους υποκείμενους φυσιολογικούς μηχανισμούς να παραμένουν ως επί το πλείστον άγνωστοι, ενώ η περιγραφή της ανάπτυξης του παθογόνου δεν δύναται να γενικευτεί βάσει της ανάπτυξης μεμονωμένων στελεχών. Αντίθετα, o προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης μίγματος στελεχών είναι ιδιαίτερα χρήσιμος (από άποψη χρόνου και κόστους) για την εξαγωγή συμπερασμάτων αναφορικά με την ασφάλεια των τροφίμων. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ύπαρξη διαφορετικών ειδών ή και στελεχών του ίδιου βακτηριακού είδους σε ένα τρόφιμο ή στο περιβάλλον επεξερφασίας τροφίμων είναι συνήθης. Έρευνες αναφορικά με την ανάπτυξη της Listeria monocytogenes σε θρεπτικά υποστρώματα σε χαμηλές θερμοκρασίες [1,,,,,,,,] έδειξαν διακύμανση στην ικανότητα προσαρμογής, αλλά και ετερογένεια των κινητικών παραμέτρων μεταξύ διαφορετικών στελεχών του παθογόνου, με τη μεταβλητότητα στην ανάπτυξη μεταξύ στελεχών να αυξάνεται όσο απομακρυνόμαστε από τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης. Μεγαλύτερη διακύμανση έχει παρατηρηθεί στη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης σε σχέση με τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, ενώ οι διαφορές στην ανάπτυξη ήταν περισσότερο αξιοσημείωτες όσο πιο χαμηλή ήταν η θερμοκρασία, αλλά και κατά την ανάπτυξη των στελεχών σε φτωχό υπόστρωμα. Σε καλλιέργειες μιγμάτων στελεχών σε ζωμούς, διαφορετικά στελέχη ενδέχεται να παρουσιάζουν διαφορετική προσαρμοστικότητα ή και ικανότητα ανάπτυξης ανάλογα με τη θερμοκρασία. Ως αποτέλεσμα, οι εκάστοτε υπό εξέταση τιμές της θερμοκρασίας ανάπτυξης δύναται να καθορίζουν διαφορετικό, κάθε φορά, «κυρίαρχο» στέλεχος στο μίγμα, με το στέλεχος αυτό να καθορίζει τις τιμές των κινητικών παραμέτρων και επομένως τη «συνολική» ανάπτυξη της καλλιέργειας [10,11]. Το γεγονός αυτό καθιστά δύσκολη την επιλογή κάποιου στελέχους της L. monocytogenes ως «αντιπροσωπευτικού», σε επίπεδο βακτηριακού είδους, για την κατασκευή προρρητικών μοντέλων ανάπτυξης του παθογόνου σε εργαστηριακά υποστρώματα ή τρόφιμα [,1]. Σκοπό της παρούσας έρευνας αποτέλεσε ο προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης ετερογενών -από άποψη πηγής απομόνωσης, ορότυπου και γενετικής καταγωγής- στελεχών της L. monocytogenes σε χημικώς καθορισμένο εργαστηριακό υπόστρωμα στους C, τόσο σε μονοκαλλιέργεια όσο και υπό μορφή μίγματος, με χρήση άμεσης μεθόδου προσδιορισμού της βακτηριακής ανάπτυξης.

2 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, - ΙΟΥΝΙΟΥ, 01. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χρησιμοποιήθηκαν έξι στελέχη L. monocytogenes (FSL J1- (Scott A), FSL J1-110, FSL J1-0, FSL J1-1, FSL N-01 και FSL R-0), τα οποία ανήκουν στη συλλογή μικροβιακών στελεχών του ILSI NA [1]. Κριτήριο επιλογής αποτέλεσε αφενός η παραλλακτικότητα μεταξύ τους, όσον αφορά στην αρχική πηγή απομόνωσης (άνθρωποι, ζώα, τρόφιμα), στη γενετική καταγωγή (genetic lineage) και στον ορότυπο (Πίνακας 1). Ως καλλιεργητικό μέσο επιλέχθηκε το χημικά καθορισμένο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα Modified Welshimer s Broth (MWB) [1]. Σε κωνικές φιάλες των 1 ml που περιείχαν 0 ml MWB πραγματοποιήθηκαν μονοκαλλιέργειες του κάθε στελέχους (τρεις επαναλήψεις ανά συνθήκη), αλλά και καλλιέργειες μίγματος των έξι στελεχών (δυο επαναλήψεις ανά συνθήκη), για τον ενοφθαλμισμό των οποίων χρησιμοποιήθηκε ίσος αριθμός κυττάτων από κάθε μεμονωμένο στέλεχος. Σε κάθε περίπτωση, το συνολικό αρχικό ενοφθάλμισμα ήταν ca. 10 /ml και αποτελούνταν από κύτταρα που είχαν αναπτυχθεί σε MWB στους 0ºC [1]. Οι καλλιέργειες τοποθετήθηκαν στους C υπό ανάδευση (10 rpm) σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας. Σε κάθε δειγματοληψία, ο προσδιορισμός της μικροβιακής πυκνότητας γινόταν με τη μέθοδο της επιφανειακής εξάπλωσης σε διπλή σειρά τρυβλίων Brain Heart Infusion Agar. Ακολουθούσε επώαση για ώρες στους 0 C και καταμέτρηση των αποικιών (υπολογισμός cfu/ml). Από τις μετρήσεις του μικροβιακού πληθυσμού δημιουργήθηκαν οι καμπύλες ανάπτυξης για κάθε συνθήκη και προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι ανάπτυξης χρησιμοποιώντας την εξίσωση Baranyi, Εξ. (1) [1,1]: exp max At ( ) 1 y( t) yo max A( t) ln 1 exp ymax yo (1) όπου y ο ο φυσικός λογάριθμος της αρχικής πυκνότητας του πληθυσμού (ln(cfu/ml)), μ max ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (ln(cfu/ml)/d), y max ο φυσικός λογάριθμος της μέγιστης πυκνότητας του πληθυσμού (ln(cfu/ml)) και λ η λανθάνουσα φάση (d). Επίσης, ισχύει: 1 A( t) t ln exp t exp exp ( t ) max max max max () Οι τιμές των κινητικών παραμέτρων υπολογίστηκαν μέσω μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το σύνολο των δεδομένων των επαναλήψεων για κάθε συνθήκη ταυτόχρονα μέσω της Εξ. (1). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η αύξηση των πληθυσμών της L. monocytogenes στην πλειοψηφία των δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν ακολούθησε την τυπική σιγμοειδή καμπύλη ανάπτυξης, αν και υπήρξαν καλλιέργειες που η ανάπτυξη του βακτηρίου έλαβε χώρα διφασικά, δηλαδή, με δύο διαδοχικές σιγμοειδούς τύπου καμπύλες ανάπτυξης (δύο δοκιμές στο σύνολο των 1 μονοκαλλιεργειών, μία για το στέλεχος FSL Ν-01 και μια για το στέλεχος FSL J1-1). Η παρατήρηση αυτή, ότι δηλαδή σε καλλιέργειες με υψηλό αρχικό ενοφθάλμισμα (10 cfu/ml) η ανάπτυξη της L. monocytogenes ακολουθεί μονοφασικού τύπου καμπύλες, βρίσκεται σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία [1]. Σε πέντε από τα έξι στελέχη, οι μικροβιακοί πληθυσμοί εισήλθαν σε στάσιμη φάση μετά την έλευση τουλάχιστον 0 ημερών. Συγκεκριμένα, όσον αφορά στα στελέχη FSL N-01 (Σχήμα 1) και Scott A (Σχήμα ), η ανάπτυξη ολοκληρώθηκε σε ca. 0 ημέρες, για το στέλεχος FSL J1-0 (Σχήμα ) σε ca. 0 ημέρες, ενώ για τα στελέχη J1-1 (Σχήμα ) και FSL R-0 (Σχήμα ) σε ca. 0 ημέρες. Σε αντίθεση με τα προηγούμενα στελέχη, στην περίπτωση της L. monocytogenes J1-110 (Σχήμα ) η ανάπτυξη πραγματοποιήθηκε ταχύτατα, με τους μικροβιακούς πληθυσμούς να εισέρχονται στην στάσιμη φάση σε περίπου 0 ημέρες, χρονικό διάστημα σαφώς συντομότερο σε σχέση με τα υπόλοιπα στελέχη που εξετάστηκαν. Στα Σχήματα 1- τα σύμβολα αναφέρονται στα πειραματικά δεδομένα της κάθε επανάληψης, ενώ οι γραμμές στις προβλεπόμενες τιμές. Όσον αφορά στις τιμές των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης των διαφόρων στελεχών της L. monocytogenes (Πίνακας ), διαπιστώθηκαν μεγάλες διαφορές τόσο στη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης όσο και στην τιμή του μέγιστου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης. Ιδιαίτερα μικρή ήταν η λανθάνουσα φάση της L. monocytogenes FSL J1-110 (ca. ημέρες), σε αντίθεση με τη μεγάλη λανθάνουσα φάση του στελέχους FSL R-0 (ca. 0 ημέρες), ενώ σε ενδιάμεσες τιμές κυμάνθηκε η διάρκεια της λανθάνουσας φάσης των υπόλοιπων στελεχων. Όσον αφορά στον ρυθμό ανάπτυξης, τα στελέχη μπορούν να ομαδοποιηθούν σε δυο κατηγορίες (Πίνακας ). Στην πρώτη κατατάσσονται τα στελέχη Scott A, FSL J1-0, FSL J1-1 και FSL R-0 που αναπτύχθηκαν με χαμηλούς ρυθμούς ανάπτυξης. ενώ στη δεύτερη εντάσσονται τα στελέχη FSL J1-110 και FSL N-01, που παρουσίασαν σχεδόν διπλάσιο μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης σε σχέση με τα στελέχη της πρώτης κατηγορίας. Σε ότι αφορά τις τιμές της τελικής μικροβιακής πυκνότητας, δεν διαπιστώθηκαν αξιοσημείωτες διαφορές ανάμεσα στα στελέχη.

3 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, - ΙΟΥΝΙΟΥ, 01. Πίνακας 1. Μικροβιακά στελέχη L. monocytogenes που χρησιμοποιήθηκαν. Στέλεχος Γενετική καταγωγή Ορότυπος Πηγή απομόνωσης Scott A I b Άνθρωπος FSL J1-110 I b Τρόφιμο FSL J1-0 II ½c Άνθρωπος FSL J1-1 III b Ζώο FSL N-01 II ½a Τρόφιμο FSL R-0 I ½b Τρόφιμο Σχήμα 1. Ανάπτυξη της L. monocytogenes FSL N-01 σε MWB στους C Σχήμα. Ανάπτυξη της L. monocytogenes Scott A σε MWB στους C.

4 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, - ΙΟΥΝΙΟΥ, 01. Πίνακας. Παράμετροι ανάπτυξης στελεχών L. monocytogenes και μίγματος αυτών σε MWB στους C. Στέλεχος λ μ max y o y max R d ln(cfu/ml)/d ln(cfu/ml) ln(cfu/ml) Scott A, ±, 0, ± 0,10 1,1 ± 0, 1, ± 0, 0, FSL J , ± 1, 0, ± 0, 1,0 ± 0, 1,1 ± 0, 0, FSL J1-0, ± 1, 0, ± 0,0 11, ± 0, 0, ± 0, 0,1 FSL J1-1, ±, 0, ± 0,10 11, ± 0, 1, ± 1,1 0,1 FSL N-01, ±,1 0, ± 0,01 10, ± 0, 1, ± 0, 0,0 FSL R-0 0,1 ±, 0, ± 0,0 11, ± 0, 0, ± 0, 0, Mίγμα στελεχών 0,0 ±,1 0, ± 0,0 11, ± 0, 1,0 ± 0, 0, Μέσες τιμές ± τιμές που ορίζουν το εύρος των % διαστημάτων εμπιστοσύνης Σχήμα. Ανάπτυξη της L. monocytogenes FSL J1-0 σε MWB στους C Σχήμα. Ανάπτυξη της L. monocytogenes FSL J1-1 σε MWB στους C.

5 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, - ΙΟΥΝΙΟΥ, 01. Σε καλλιέργειες με μίγμα στελεχών (Σχήμα ), η ανάπτυξη της L. monocytogenes ολοκληρώθηκε περίπου σε 0 ημέρες, γεγονός που αποδίδεται στην παρουσία στο μίγμα του ταχύτατα αναπτυσσόμενου στελέχους J1-110, η ανάπτυξη του οποίου σε μονοκαλλιέργεια ολοκληρώθηκε στον ίδιο χρόνο. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Σε μονοκαλλιέργειες στελεχών της L. monocytogenes που διέφεραν ως προς τη γενετική καταγωγή, τον ορότυπο και την πηγή απομόνωσης, διαπιστώθηκαν μεγάλες διακυμάνσεις μεταξύ στελεχών, τόσο στη διάρκεια της λανθάνουσας φάσης, όσο και στον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης. Έτσι, οι πληθυσμοί εισέρχονταν στη στάσιμη φάση μετά από διάστημα 0 έως και 0 ημέρες, με την εξαίρεση ενός στελέχους (FSL J1-110), η ανάπτυξη του οποίου ήταν ταχύτατη (ca. 0 ημέρες). Σε καλλιέργειες με μίγμα στελεχών, οι πληθυσμοί εισέρχονταν στη στάσιμη φάση επίσης σε διάστημα περίπου 0 ημερών, πιθανώς εξαιτίας της επικράτησης του στελέχους FSL J Σχήμα. Ανάπτυξη της L. monocytogenes FSL R-0 σε MWB στους C Σχήμα. Ανάπτυξη της L. monocytogenes FSL J1-110 σε MWB στους C.

6 10 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, - ΙΟΥΝΙΟΥ, Σχήμα. Ανάπτυξη του μίγματος στελεχών της L. monocytogenes σε MWB στους C. Συμπερασματικά, δεδομένου ότι η ύπαρξη ενός ταχύτατα αναπτυσσόμενου στελέχους σε ένα μίγμα στελεχών δύναται να προσδώσει στο μίγμα τα χαρακτηριστικά ανάπτυξής του, η περιγραφή της ανάπτυξης του παθογόνου δεν δύναται να γενικευτεί βάσει της ανάπτυξης μεμονωμένων στελεχών. Επομένως, o προσδιορισμός των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης μίγματος στελεχών είναι ιδιαίτερα χρήσιμος (από άποψη χρόνου και κόστους) για την εξαγωγή συμπερασμάτων αναφορικά με την ασφάλεια των τροφίμων. Ωστόσο, η προσέγγιση αυτή ενίοτε δύναται να υποτιμά τη διάρκεια ζωής ευπαθών, στην ανάπτυξη της L. monocytogenes, τροφίμων κατά τη συντήρησή τους υπό ψύξη. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Arguedas-Villa C., Kovacevic J., Allen K.J., Stephan R. and Tasara T., Food Microbiol. 0:1 (01). []. Arguedas-Villa C., Stephan R. and Tasara T., Food Microbiol. : (010). []. Barbosa W.B., Sofos J.N., Schmidt G.R. and Smith G.C., J. Food Protect. : (1). []. Begot C., Lebert I. and Lebert A., Food Microbiol. 1:0 (1). []. De Jesús A.J. and Whiting R.C., J. Food Protect. :111 (00). []. Lebert I., Bégot C. and Lebert A., Food Microbiol. 1: (1). []. Lianou A., Stopforth J.D., Yoon Y., Wiedmann M. and Sofos J.N., J. Food Protect. :0 (00). []. Nufer U., Stephan R.and Tasara T., Food Microbiol. : (00). []. Pal A., Labuza T.P. and Diez-Gonzalez F., Int. J. Food Microbiol. 1:10 (00). [10]. McMeekin T.A., Olley J.N., Ross T. and Ratkowsky D.A., Predictive microbiology: Theory and application, 1 st ed., Research Studies Press Ltd, England (1), p.0. [11]. Schaffner D.W. and Labuza T.P., Food Technol.-Chicago 1: (1). [1]. Whiting R.C., Food Technol.-Chicago 1: (1). [1]. Fugett E., Fortes E., Nnoka C. and Wiedmann M., J. Food Protect. : (00). [1]. Premaratne R.J., Lin W.-J. and Johnson E.A., Appl. Environ. Microb. :0 (11). [1]. Tyrovouzis N.A., Angelidis A.S. and Stoforos N.G., Int. J. Food Microbiol. 1:110 (01). [1]. Baranyi J. and Roberts T.A., Int. J. Food Microbiol. : (1). [1]. Baranyi J. and Roberts T.A., Int. J. Food Microbiol. :1 (1).