Εργαστηριακές ασκήσεις κλινικής χημείας

Transcript

1

2

3 Εργαστηριακές ασκήσεις κλινικής χημείας ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ ΠΕΤΡΟΣ Καθηγητής Εφαρμογών Κλινικής Χημείας ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΖΩΗ Κλινική Χημικός, Ph.D. ΚΡΟΥΠΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ Επίκουρος καθηγητής Κλινικής χημείας Μοριακής Διαγνωστικής ΠΑΠΑΙΩΑΝΝΟΥ ΑΓΓΕΛΟΣ Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας ΠΛΑΓΕΡΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής χημείας ΣΠΥΡΟΠΟΥΛΟΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Καθηγητής Βιοϊατρικής Τεχνολογίας ΤΣΟΤΣΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ ΕΛΕΝΗ Χημικός Ph.D. ΦΟΥΝΤΖΟΥΛΑ ΧΡΙΣΤΙΝΑ Επίκουρη Καθηγήτρια Χημείας 2

4 Εργαστηριακές ασκήσεις κλινικής χημείας Συγγραφή Γεωργίου Ζωή, Κλινική Xημικός, Ph.D. Βιοχημικό Εργαστήριο, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας Καρκαλούσος Πέτρος, Καθηγητής Εφαρμογών Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας Κρούπης Χρήστος, Επίκουρος Καθηγητής Κλινικής Χημείας Μοριακής Διαγνωστικής, Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας, Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Παπαϊωάννου Άγγελος, Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Θεσσαλίας Πλαγεράς Παναγιώτης, Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Θεσσαλίας Σπυρόπουλος Βασίλειος, Καθηγητής Βιοϊατρικής τεχνολογίας, Τμήμα Μηχανικών Βιοϊατρικής Τεχνολογίας, ΤΕΙ Αθήνας Τσότσου Γεωργία Ελένη, Χημικός Ph.D. Επιστημονικός Συνεργάτης Εργαστηρίου Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας Φούντζουλα Χριστίνα, Επίκουρη Καθηγήτρια Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας Κριτικός αναγνώστης Γιώργος-Αλβέρτος Καρίκας Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας Συντελεστές έκδοσης ΓΛΩΣΣΙΚΗ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Νεκταρία Κλαδά ΓΡΑΦΙΣΤΙΚΗ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ & TEXNIKH ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Πέτρος Σταυρουλάκης Copyright ΣΕΑΒ, 2015 Το παρόν έργο αδειοδοτείται υπό τους όρους της άδειας: Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική Χρήση - Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα (CC BY-NC-ND 3.0 GR) ΣΥΝΔΕΣΜΟΣ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Ζωγράφου ISBN:

5 Αφιερώνεται στους ανθρώπους που δοκιμάζονται, αλλά συνεχίζουν να αγωνίζονται, στον τόπο τους ή σε τόπους μακρινούς 4

6 5

7 Ευχαριστίες Θα θέλαμε ιδιαίτερα να ευχαριστήσουμε τα παρακάτω άτομα που συνέβαλαν στην παραγωγή του οπτικοακουστικού υλικού του συγγράμματος: Θεοδώρα Νικολακοπούλου, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Γιάννης Κλάρας, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Εργαστήριο βιοχημείας και τοξικολογίας, ΠΕΔΥ Νικολίτσα Καφάτη, Βιοπαθολόγος, Διευθύντρια ΕΣΥ, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό Παναγιώτα Χριστοφίδη, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Διαγνωστικό κέντρο: Δημήτρης Παπανδρέου - Ιατρικές Υπηρεσίες ΑΕ Δημήτρης Χρονόπουλος, Βιολόγος, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό Καλλιρόη Τσαλιμαλμά, Βιοπαθολόγος, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό Φελιπινία Τσουμπρή, Βοηθός Ιατρικών και Βιολογικών Εργαστηρίων, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό Αλίκη Ινιωτάκη, Βιοπαθολόγος, Διευθύντρια ΕΣΥ, Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς Κυριακή Μασσέλου, Βιοπαθολόγος, Εργαστήριο πρωτεϊνών και ελέγχου ανοσίας, Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς Δήμητρα Μελισσού, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Εργαστήριο πρωτεϊνών και ελέγχου ανοσίας, Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς Κατερίνα Μανδαράκα, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Εργαστήριο πρωτεϊνών και ελέγχου ανοσίας, Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς 6

8 7

9 Πρόλογος Το σύγγραμμα περιλαμβάνει τις σημαντικότερες εργαστηριακές τεχνικές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα βιοχημικά εργαστήρια ή αλλιώς εργαστήρια κλινικής χημείας. Προσπαθεί να καλύψει όλο το φάσμα των γνώσεων που χρειάζονται οι εκπαιδευόμενοι φοιτητές ή απόφοιτοι στον εργαστηριακό χώρο της κλινικής χημείας, ανεξαρτήτου σχολής και τμήματος φοίτησης. Έτσι περιλαμβάνονται, τόσο απλές τεχνικές που γίνονται κυρίως σε χώρους εκπαίδευσης, όσο και πολύπλοκες τεχνικές που εφαρμόζονται σε εξειδικευμένα βιοχημικά εργαστήρια νοσοκομείων, διαγνωστικών κέντρων και ερευνητικών κέντρων. Τα θέματα που καλύπτονται εδώ, δεν αφορούν μόνο φοιτητές, αλλά και ασκούμενους σε βιοχημικά εργαστήρια που ενδιαφέρονται κυρίως να κατανοήσουν την σχετική τεχνολογία. Επιπλέον, κάποια από τα κεφάλαια που αναπτύσσονται σε αυτό το σύγγραμμα αφορούν εξίσου και εργαζόμενους εργαστηριακούς επιστήμονες σε εργαστήρια κλινικής χημείας. Ενδεικτικά οι τεχνικές που παρουσιάζονται είναι: οι φωτομετρήσεις τελικού και κινητικού σταδίου, η ποτενσιομετρία, η μέτρηση αερίων, η ηλεκτροφόρηση, οι τεχνικές χρωματογραφίας με έμφαση στην υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, οι ανοσοχημικές μέθοδοι με έμφαση στην ELISA και στη χημειοφωταύγεια, η ατομική απορρόφηση και η υπέρυθρη φασματοσκοπία. Επιπλέον παρουσιάζονται σημαντικά θέματα που αφορούν τις αναλύσεις κλινικής χημείας όπως είναι η εξέλιξη της σχετικής βιοϊατρικής τεχνολογίας, ο έλεγχος ποιότητας των αποτελεσμάτων, τα διεθνή πρότυπα για τα ιατροδιαγνωστικά προϊόντα στο χώρο της κλινικής χημείας, η ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων, η επικύρωση και επαλήθευση των εργαστηριακών μεθόδων καθώς και η βιοασφάλεια στα βιοχημικά εργαστήρια. Ο επιμελητής της έκδοσης Πέτρος Καρκαλούσος 8

10 9

11 Οι συγγραφείς κάθε κεφαλαίου 1. Βασικές αρχές φωτομετρίας και χρωματομετρικών αναλύσεων, Άγγελος Παπαϊωάννου, Παναγιώτης Πλαγεράς 2. Χρωματομετρικοί προσδιορισμοί τελικού σημείου. Παραδείγματα από την κλασική κλινική χημεία κατά τον προσδιορισμό υποστρωμάτων. Βαθμονόμηση και τεχνική, Γεωργία Ελένη Τσότσου 3. Κινητικοί χρωματομετρικοί προσδιορισμοί. Παραδείγματα από την κλασική κλινική χημεία: προσδιορισμός ενζύμων. Βαθμονόμηση και τεχνική, Γεωργία Ελένη Τσότσου. 4. Εργαστηριακός έλεγχος οξεοβασικής ισορροπίας και ηλεκτρολυτών, Γεωργία Ελένη Τσότσου. 5. Ηλεκτροφόρηση. Βασικές αρχές. Σύγχρονη τεχνολογία. Εφαρμογές στην Κλινική Χημεία, Άγγελος Παπαϊωάννου, Παναγιώτης Πλαγεράς 6. Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί. Βασικές τεχνικές ELISA, Πέτρος Καρκαλούσος 7. Αυτόματοι αναλυτές και σύγχρονη βιοϊατρική τεχνολογία στο εργαστήριο κλινικής χημείας, Βασίλειος Σπυρόπουλος. 8. Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (απόδοσης) στην κλινική χημεία. Βασικές αρχές και παραδείγματα, Γεωργία Ελένη Τσότσου. 9. IVD προϊόντα εσώκλειστα φυλλάδια των αντιδραστηρίων και πληροφορίες που περιλαμβάνουν. Ο προσδιορισμός των τιμών αναφοράς και άλλες σχετικές απαιτήσεις, Χρήστος Κρούπης 10. Υλικά αναφοράς ιχνηλασιμότητα. Διαπίστευση εργαστηρίων. Η έννοια της αβεβαιότητας, Χρήστος Κρούπης 11. Ο έλεγχος ποιότητας στις σύγχρονες αναλύσεις κλινικής χημείας, Άγγελος Παπαϊωάννου, Παναγιώτης Πλαγεράς 12. Η ατομική απορρόφηση και οι εφαρμογές της, Ζωή Γεωργίου 13. Η υπέρυθρη φασματοσκοπία και οι εφαρμογές της στην κλινική χημεία, Χριστίνα Φούντζουλα 14. Υγιεινή και ασφάλεια εργασίας στο κλινικό εργαστήριο. Διαχείριση υγειονομικών αποβλήτων, Ζωή Γεωργίου 15. Eρωτήσεις/Απαντήσεις επανάληψης, Συλλογικό 16. Αγγλοελληνικό και Ελληνοαγγλικό λεξιλόγιο, Συλλογικό 10

12 11

13 Πίνακας περιεχομένων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Η φύση του φωτός Η Ηλεκτρομαγνητική θεωρία του Μaxwell Η Θεωρία του Planck (Θεωρία των κβάντα) Η Φασματοσκοπία Ο νόμος Lambert Beer Οι προϋποθέσεις ισχύος του νόμου Lambert-Beer Το Φασματοφωτόμετρο Τα κριτήρια επιλογής Φωτόμετρου Η διαδικασία της Φωτομέτρησης Οι εφαρμογές της Φασματοφωτομετρίας Ο Ποσοτικός Προσδιορισμός Η Φασματοφωτομετρία UV-Vis Η Βαθμονόμηση των οργάνων Τα υλικά Βαθμονόμησης (Calibrators) Η Βαθμονόμηση των Ενόργανων μεθόδων Οι Καμπύλες Βαθμονόμησης Η καμπύλη Αναφοράς (ή Πρότυπη καμπύλη) Η μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας (standard addition method) Η μέθοδος των Πολλαπλών Προσθηκών Η μέθοδος Παρεμβολής Η μέθοδος της Μειώσεως κατά Γνωστή Ποσότητα Η εξίσωση Αναφοράς ή Συνάρτηση Βαθμονόμησης Ο έλεγχος της Καμπύλης Βαθμονόμησης ή Αναφοράς Η αρχή της μεθόδου της Παλινδρόμησης Η εκτίμηση της Ευθείας Παλινδρόμησης με τη Μέθοδο Ελαχίστων Τετραγώνων (Least Squares Method) Η γραμμική Καμπύλη Παλινδρόμησης με Διαστήματα Εμπιστοσύνης Σύνοψη της πορείας της Προσαρμογής (Παλινδρόμησης) Τα Διαστήματα Εμπιστοσύνης O Συντελεστής Συσχετίσεως (Correlation Coefficient) Η Μη Γραμμική Παλινδρόμηση Η Γραμμικότητα της Μεθόδου Ανάλυσης Το Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection) Το Όριο Ποσοτικοποίησης (Limit of Quantitation) Εφαρμογές Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο\ Aναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο. ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΕΛΙΚΟΥ ΣΗΜΕΙΟΥ. ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ Προαπαιτούμενες γνώσεις Εισαγωγή Κριτήρια επιλογής αναλυτικής μεθοδολογίας στην Kλινική Aνάλυση Φωτομετρικές Aναλυτικές Mέθοδοι στην Kλινική Aνάλυση Μεθοδολογίες Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών Μέθοδοι Τελικού Σημείου Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών

14 2.5 Πειραματικό Μέρος Προσδιορισμός γλυκόζης με μέθοδο Τελικού Σημείου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 O. ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ ΣΎΝΟΨΗ ΠΡΟΑΠΑΙΤΟΎΜΕΝΕΣ ΓΝΏΣΕΙΣ Εισαγωγή Βασικές αρχές Χημικής και Ενζυμικής Κινητικής ΧΗΜΙΚΉ ΚΙΝΗΤΙΚΉ ΕΝΖΥΜΙΚΉ ΚΙΝΗΤΙΚΉ Κινητικές μέθοδοι Κλινικών Προσδιορισμών ΑΡΧΈΣ ΚΙΝΗΤΙΚΉΣ ΜΕΘΌΔΟΥ Πλεονεκτήματα Κινητικών Μεθόδων Ενζυμική Δραστικότητα και Συγκέντρωση Πειραματική διαδικασία Ποσοτικού Φωτομετρικού Κλινικού Προσδιορισμού με Κινητική Μέθοδο Υπολογισμός Ενζυμικής Συγκέντρωσης Πρωτόκολλο ανάλυσης με Κινητική Μέθοδο Πειραματικό μέρος Προσδιορισμός Αμυλάσης με Κινητική μέθοδο Προσδιορισμός GOT με Κινητική Μέθοδο Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΟΞΕΟΒΑΣΙΚΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Οξεοβασική Ισορροπία Ορισμοί- Βασικές Έννοιες Σημασία Οξεοβασικής Ισορροπίας Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Οξεοβασικής Ισορροπίας Διαταραχές της Οξεοβασικής Ισορροπίας Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση οξεοβασικών διαταραχών Εκτίμηση του Είδους της Οξεοβασικής Διαταραχής και Κλινική Σημασία των αποτελεσμάτων της ανάλυσης Οργανολογία Παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης Ηλεκτρολυτική Ισορροπία Σημασία Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας Διαταραχές της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση ηλεκτρολυτικών διαταραχών Οργανολογία Πειραματικό μέρος Ηλεκτρολυτική Ισορροπία Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Η ηλεκτροφόρηση ως βασική μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών Οι βασικές αρχές της Ηλεκτροφόρησης Τα Υποστρώματα της Ηλεκτροφόρησης Χρώση κλασμάτων Καθήλωση και ανίχνευση των συστατικών μείγματος

15 5.2.5 Πυκνομετρία (densitometry) Εργαστηριακά όργανα και σκεύη Ηλεκτροφόρησης Το βιολογικό δείγμα Διαχωριστική ικανότητα - τεχνικές ηλεκτροφόρησης Τα χαρακτηριστικά ορισμένων τεχνικών Hλεκτροφόρησης Ηλεκτροφόρηση σε Oξική Κυτταρίνη και Nιτρική Kυτταρίνη Ηλεκτροφόρηση πηκτής Αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aκρυλαμιδίου Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aμύλου H Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Η Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη (ηλεκτροφόρηση ζώνης) Πειραματικό μέρος Αντιδραστήρια και αναλώσιμα Συσκευές και υλικά Προετοιμασία της διαδικασίας Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Γαλακτικής Αφυδρογονάσης (LDH) Η Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Αλκαλικής Φωσφατάσης H Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Κρετανικής Κινάσης Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρίνης (Γλυκοζυλιωμένη Αιμοσφαιρίνη) Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Aναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Ο ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ELISA Εισαγωγή Η βασική αρχή των Ανοσοχημικών τεχνικών Οι κατηγορίες των Ανοσοχημικών τεχνικών Ομογενείς και Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι Οι διαφορές των Ανοσοχημικών μεθόδων ανάλογα με τον Ιχνηθέτη Ανταγωνιστικοί και μη Ανταγωνιστικοί μέθοδοι Οι Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι, η ELISA Βασικά αντιδραστήρια και αναλώσιμα που περιέχονται στα kits της ELISA Υλικά και Εξοπλισμός που δεν παρέχονται με τα kits Τα βασικά στάδια της μεθοδολογίας ELISA Εργαστηριακό μέρος Παραδείγματα Ανταγωνιστικής και μη Ανταγωνιστικής ELISA Ο προσδιορισμός της FT3 με ELISA Ο Προσδιορισμός της TSH με ELISA Παρατηρήσεις και επιπλέον πληροφορίες για τις Καμπύλες Βαθμονόμησης Μονά ή Διπλά δείγματα; H Διχρωματική Ανάλυση Άλλοι τρόποι υπολογισμού των Εξισώσεων Αναφοράς Στοιχεία για τις άλλες Ανοσοχημικές μεθόδους Χημειοφωταύγεια Οι Ομογενείς Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί Η Ανοσοενζυμική Ενισχυμένη μέθοδος Ο Πολωμένος Φθορισμός Η Μικροσωματιδιακή Ανάλυση Παράγοντες που επηρεάζουν τις Ανοσοχημικές αναλύσεις Το φαινόμενο του Αγκίστρου Τα Eτερόφιλα Αντισώματα Τα Αυτοαντισώματα Τα Θεραπευτικά Αντισώματα Άλλοι ανοσολογικοί παράγοντες που παρεμβαίνουν στις μετρήσεις

16 Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Ο. ΑΥΤΌΜΑΤΟΙ ΑΝΑΛΥΤΈΣ. ΚΑΙ ΣΎΓΧΡΟΝΗ BΙΟΪΑΤΡΙΚΉ ΤΕΧΝΟΛΟΓΊΑ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΉΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΉΣ ΧΗΜΕΊΑΣ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Εισαγωγή Πλήρη Οπτικά Συστήματα Αυτόματων Αναλυτών Αναλυτικές λύσεις που συνδυάζουν Χρωματομετρικές, Ανοσοχημικές κ.λπ. αναλύσεις Εργαστηριακά Συστήματα Πληροφοριών Αναδυόμενες εργαστηριακές τεχνολογίες Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Ο. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (ΑΠΟΔΟΣΗΣ) (HPLC) ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Εισαγωγή Διάκριση Χρωματογραφικών τεχνικών Χρωματογραφία Στήλης Επίπεδη Χρωματογραφία Αέρια Χρωματογραφία Υγρή Χρωματογραφία Άλλες Χρωματογραφικές τεχνικές Χρωματογραφία HPLC Οργανολογία HPLC Σύνοψη των βασικών σταδίων της Χρωματογραφίας Στήλης Σύγκριση HPLC/TLC Βασικές έννοιες που περιγράφουν μία Xρωματογραφική ανάλυση Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός με Χρωματογραφία HPLC Ποιοτικός προσδιορισμός Παραδείγματα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Η επιλογή της Στατικής Φάσης Η επιλογή της Κινητής Φάσης Παράδειγμα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Σιμβαστατίνης σε ορό Εφαρμογές της HPLC στην Κλινική Ανάλυση Προσδιορισμός των επιπέδων της Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης και άλλων Αιμοσφαιρινικών κλασμάτων με HPLC Πειραματικό μέρος Προσδιορισμός συγκέντρωσης Σιμβαστατίνης σε ορό Παράδειγμα προσδιορισμού HbA1c με HPLC Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Ο. IVD ΠΡΟЇΟΝΤΑ-ΕΣΩΚΛΕΙΣΤΑ ΦΥΛΛΑΔΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΥΝ. Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΆΛΛΕΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Εισαγωγή για τα IVDs Γενικές προδιαγραφές των IVDs Ετικέτα και εσώκλειστα φυλλάδια των IVDs Αναλυτικά χαρακτηριστικά των ΙVD αντιδραστηρίων

17 9.5 Προσδιορισμός τιμών αναφοράς Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Ο. ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ - ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ. ΔΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ. Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Υλικά αναφοράς Ιχνηλασιμότητα Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων Αβεβαιότητα Πηγές από το διαδίκτυο για εύρεση υλικών αναφοράς Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Ο. Ο ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΙΣ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Βασικές έννοιες Προ-αναλυτικοί παράγοντες Αναλυτικοί παράγοντες Μετα-αναλυτικοί παράγοντες Διαχείριση ολικής ποιότητας Εσωτερικός Έλεγχος Ποιότητας Ακρίβεια και Ολικό Σφάλμα (Total Error) Ορθότητα (Trueness) και Συστηματικό σφάλμα (Systematic error) Πιστότητα Η Αβεβαιότητα της ανάλυσης Ολικό Εργαστηριακό Σφάλμα (Total Laboratory Error) Υλικά ελέγχου Χάρτες ή Διαγράμματα Ελέγχου Κατασκευή Χαρτών Ελέγχου Levey Jennings Κριτήρια Westgard Κριτήρια χρήσης ενός Υλικού Ελέγχου Ο Εσωτερικός Ποιοτικός Έλεγχος της Ορθότητας (ακρίβειας) (Συσσωρευτικό Αθροιστικό Διάγραμμα (Cusum chart, CUSUM) O Eξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας Ορισμός του Εξωτερικού ελέγχου Ποιότητας Βασικοί στόχοι του Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας Διεργαστηριακά Προγράμματα ELQA (Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας Διαγνωστικών και Βιοαναλυτικών Εργαστηρίων Αξιολόγηση των επιδόσεων των εργαστηρίων σε προγράμματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας Διαγράμματα Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Aναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 O. Η ΑΤΟΜΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Εισαγωγή Τα Χημικά Στοιχεία του ανθρώπινου οργανισμού Ο ρόλος των Ιχνοστοιχείων Η δράση των τοξικών Ιχνοστοιχείων Μέθοδοι προσδιορισμού Ιχνοστοιχείων Δειγματοληψία Επεξεργασία Δειγμάτων H αρχή λειτουργίας Φασματοσκοπίας Ατοµικής Απορρόφησης Τα βασικά τμήματα των συστημάτων Ατομοποίησης

18 Οι πηγές Ακτινοβολίας για την Ατομική Απορρόφηση Το σύστηµα Ατοµοποίησης (Καύσης και Εκνέφωσης) Το Οπτικό Σύστηµα και το Σύστηµα Μέτρησης Υπολογισμοί, Καμπύλη Αναφοράς και Έλεγχος Ποιότητας Πειραματικό μέρος Υλικά και αντιδραστήρια Τα βήματα εφαρμογής Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων Ασφάλεια Εργαστηρίου Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Aναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 Ο. Η ΥΠΕΡΥΘΡΗ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Εισαγωγή H νεφρολιθίαση Η σύσταση των ουρολίθων Μακροσκοπική εξέταση των ουρολίθων Ποιοτική ανάλυση των Ουρολίθων Υπέρυθρη φασματοσκοπία Υπέρυθρη ακτινοβολία Αρχή Φασματοσκοπίας Υπέρυθρου Φασµατοσκοπία υπέρυθρου µε µετασχηµατισµό Fourier Πειραματικό μέρος Προετοιμασία δισκίου δείγματος Λήψη φάσματος Αξιολόγηση φασμάτων FTIR Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Σχετικό οπτικό υλικό στο διαδίκτυο Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 Ο. ΥΓΙΕΙΝΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΥΓΕΙΟΝΟΜΙΚΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ Σύνοψη Προαπαιτούμενες γνώσεις Υγιεινή και Ασφάλεια Εργασίας στο Κλινικό Εργαστήριο Εισαγωγή Κύριες πηγές κινδύνου στα εργαστήρια Διαχείριση Υγειονομικών Αποβλήτων - Απόβλητα Υγειονομικών Μονάδων (ΑΥΜ) Εισαγωγή Είδη Αποβλήτων Υγειονομικών Μονάδων Μεταφορά και προσωρινή αποθήκευση Αποκομιδή Επεξεργασία - διάθεση Σχέδιο έκτακτης ανάγκης Σχετικό οπτικό υλικό και ενημερωτικό υλικό από το διαδίκτυο Χρήσιμα ακρωνύμια από οδηγούς διαχείρισης ιατρικών αποβλήτων Νομοθεσία Αναφορές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 15 Ο. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ/ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 16 Ο. ΛΕΞΙΛΟΓΙΑ

19 18

20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό γίνεται εισαγωγή στις πιο ευρύτερα χρησιμοποιούμενες μεθόδους στη κλινική χημεία, τις φωτομετρικές ή αλλιώς χρωματομετρικές αναλύσεις. Βασίζονται στην ιδιότητα του φωτός να απορροφάται από συγκεκριμένα έγχρωμα μόρια μέσα σε διαφανή διάλυμα. Το κεφάλαιο επεκτείνεται στην κατασκευή των καμπυλών αναφοράς και στον υπολογισμό των άγνωστων συγκεντρώσεων με τη χρήση γνωστών συγκεντρώσεων προτύπων διαλυμάτων. Περιγράφονται αναλυτικά πολλά διαφορετικά μαθηματικά μοντέλα υπολογισμού των αγνώστων συγκεντρώσεων, καθώς και τα σημαντικότερα σημεία των καμπυλών αναφοράς (π.χ. όριο ανίχνευσης). Τέλος, γίνεται εισαγωγή στην έννοια της αβεβαιότητας των μετρήσεων και στους σχετικούς στατιστικούς υπολογισμούς. Προαπαιτούμενες γνώσεις Το πρώτο κεφάλαιο του βιβλίου βασίζεται σε βασικές γνώσεις φυσικής και ιδιαίτερα οπτικής (απορρόφηση φωτός) και ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Θα χρειαστούν, αν και περιγράφονται αναλυτικά, βασικές γνώσεις στατιστικής π.χ. μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων, συντελεστής συσχέτισης, μέση τιμή, τυπική απόκλιση κ.α. 1.1 Η φύση του φωτός Οι James Clerk Maxwell και ο Μax Planck, διατύπωσαν τις θεωρίες τους για τη φύση του φωτός, στις αρχές του 20 ου αιώνα, οι οποίες είναι αποδεκτές μέχρι σήμερα από την επιστημονική κοινότητα. 1.2 Η Ηλεκτρομαγνητική θεωρία του Μaxwell Το 1873 o Μaxwell διατύπωσε την ηλεκτρομαγνητική του θεωρία σύμφωνα με την οποία: «Κάθε χρονικά μεταβαλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο δημιουργεί ένα αλληλένδετο μεταβαλλόμενο μαγνητικό πεδίο και αντίστροφα. Το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο που δημιουργείται με τον παραπάνω τρόπο διαδίδεται στο χώρο με τη μορφή ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων τα οποία, όπως παρατήρησε ο Maxwell, διαδίδονται με την ταχύτητα του φωτός. Συνεπώς, το φως είναι ηλεκτρομαγνητικό κύμα». Φως ονομάζεται η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που ανιχνεύεται από τον ανθρώπινο οφθαλμό. Το ορατό φως αποτελεί ένα μικρό μέρος της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Τα μήκη κύματος που είναι ορατά στο ανθρώπινο μάτι κυμαίνονται από 400 έως 700 nm περίπου. Συνεπώς, μόνο ένα μικρό μέρος της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας γίνεται αντιληπτό από τον άνθρωπο. Ο παρακάτω πίνακας (Πίνακας 1.1) δείχνει τα χρώματα που αντιλαμβάνεται η ανθρώπινη όραση, ανάλογα με το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας (Παπαϊωάννου & Πλαγεράς, 2012). Μήκος κύματος (nm) Χρώμα Υπεριώδες (δεν είναι ορατό) Ιώδες Μπλε Πράσινο Κίτρινο προς πορτοκαλί Πορτοκαλί προς κόκκινο πάνω από 700 Σχεδόν υπέρυθρο (δεν είναι ορατό) Πίνακας 1.1 Μήκη κύματος και το αντίστοιχο χρώμα που αντιλαμβάνεται ο άνθρωπος με την όρασή του. 19

21 Σημείωση: Ένα χρώμα, π.χ. κίτρινο, δεν συνεπάγεται και γνώση του μήκους κύματος της ακτινοβολίας (590 nm), αλλά μπορεί να οφείλεται σε περισσότερες της μιας ακτινοβολίες με μήκη κύματος μεταξύ 590 και 600 nm). Φυσικά, ανάλογα με τον αριθμό των ακτινοβολιών και τα μήκη κύματος θα λαμβάνουμε κίτρινο χρώμα, αλλά διαφορετικών αποχρώσεων. 1.3 Ηλεκτρομαγνητικό Φάσμα Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Περιοχή φάσματος Ακτίνες Χ Υπεριώδες Ορατό Εγγύς Υπέρυθρο Υπέρυθρο Άπω Υπέρυθρο Μικροκύματα Ραδιοσυχνότητες Μήκος Κύματος 0,3 100 Α nm nm 0,75 2,5μm 2,5 15 μm μm 0,2 7,0 mm m Πίνακας 1.2 Επιμέρους περιοχές του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Όπως ήδη γίνεται φανερό, τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα διαφέρουν τόσο ως προς τη συχνότητα, όσο και ως προς το μήκος κύματός τους. Το σύνολο των συχνοτήτων των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων αποτελούν το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Στον Πίνακα 1.2 παρουσιάζονται οι επιμέρους ζώνες του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. 1.4 Η Θεωρία του Planck (Θεωρία των κβάντα) Η θεωρία του Maxwell δεν κατάφερε να ερμηνεύσει φαινόμενα που σχετίζονται με την αλληλεπίδραση του φωτός και την ύλη (π.χ. φωτοηλεκτρικό φαινόμενο). Ο Planck, το 1900, για να εξηγήσει την ακτινοβολία που παράγει ένα θερμαινόμενο σώμα διατύπωσε τη θεωρία των κβάντα φωτός. Σύμφωνα μ αυτή: 1. Κάθε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία εκπέμπεται και απορροφάται από τα άτομα της ύλης όχι με συνεχή αλλά με μη συνεχή τρόπο. Δηλαδή κάθε άτομο εκπέμπει ή απορροφά στοιχειώδη ποσά ενέργειας (κβάντα φωτός ή φωτόνια). 20

22 2. Κάθε φωτόνιο μεταφέρει ενέργεια (Ε), η οποία υπολογίζεται από τη σχέση: E = h f, όπου h είναι η σταθερά του Planck (h = 6, J s). Σημείωση: Ο Εinstein, στηριζόμενος στη θεωρία του Planck, εξήγησε το φωτοηλεκτρικό φαινόμενο. Έτσι, η διπλή φύση του φωτός (κύμα και σωματίδιο) άνοιξε το δρόμο για την κατανόηση της συμπεριφοράς του μικρόκοσμου. 1.5 Η Φασματοσκοπία Όταν ένα σύστημα απορροφά ενέργεια, τότε διεγείρεται από τη βασική του κατάσταση σε μία διεγερμένη κατάσταση, ενώ, όταν από μία διεγερμένη κατάσταση επανέρχεται στη βασική ή σε μια άλλη ενδιάμεση ενεργειακή κατάσταση, τότε αποβάλλει ενέργεια. Έτσι, κάθε μεταπήδηση ηλεκτρονίων από μια ενεργειακή στάθμη σε μια άλλη (μέσα στα άτομα ή στα μόρια) και κάθε περιστροφική κίνηση και δόνηση ομάδων ατόμων και μορίων, έχει ως αποτέλεσμα την απορρόφηση ή την αποβολή ενέργειας. Οι ενεργειακές αυτές μεταβολές γίνονται με τη μορφή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με χαρακτηριστικό μήκος κύματος ή συχνότητα ανάλογα με το είδος της ηλεκτρονικής μετάπτωσης ή της μοριακής κίνησης. Η φασματοσκοπία ασχολείται με τον προσδιορισμό της συχνότητας ή του μήκους κύματος της απορροφούμενης ή εκπεμπόμενης ακτινοβολίας καθώς και με τον καθορισμό των σχέσεων και των νόμων που διέπουν τις μεταβολές αυτές. Η φασματοφωτομετρία είναι ένα τμήμα της φασματοσκοπίας, που μελετά τις ποσοτικές σχέσεις που διέπουν την ένταση της απορροφούμενης (ή εκπεμπόμενης) ακτινοβολίας και τους νόμους της απορρόφησης του φωτός. 1.6 Ο νόμος Lambert Beer Οι Lambert & Beer μελετώντας μονοχρωματικές ακτινοβολίες κατέληξαν στον παρακάτω νόμο (γνωστός και ως νόμος Beer Lambert), που αποτελεί την αρχή της φασματοφωτομετρίας: Σχήμα 1.2 Αναπαράσταση της απορρόφησης του φωτός σε κυβέττα με έγχρωμο διάλυμα. Η απορρόφηση (A) για σταθερό πάχος στοιβάδας (d) και ορισμένο μήκος κύματος φωτός είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύματος (C) της ουσίας που απορροφά (Σχήμα 1.2). Συνεπώς: Α = -logτ = -log(i/i ο) = ε d C (Εξίσωση 1.1) Η διαπερατότητα (Τ) εκφράζεται σε % (Αν Τ = 0% τότε η Α = και αν Τ = 100% τότε η Α = 0). Η απεικόνιση της απορρόφησης (Α) σε συνάρτηση με το μήκος κύματος (λ) καλείται φάσμα απορρόφησης Οι προϋποθέσεις ισχύος του νόμου Lambert-Beer Γενικά θα πρέπει: τα διαλύματα να μην είναι πυκνά (0,1 < Α < 1), η ακτινοβολία να είναι μονοχρωματική, η κυψελίδα να έχει ομοιόμορφη διατομή, τα μόρια της διαλυμένης ουσίας να μην αντιδρούν μεταξύ τους, 21

23 η μέτρηση να γίνεται στο λmax (το μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης, χαρακτηριστικό για κάθε έ- νωση). 1.7 Το Φασματοφωτόμετρο Η μέτρηση της απορρόφησης του φωτός και η καταγραφή ενός φάσματος απορρόφησης, π.χ. στην περιοχή ορατού υπεριώδους (UV Vis), γίνεται με ειδικά όργανα, τα φασματοφωτόμετρα (Σχήμα 1.3). Σχήμα 1.3 Σχηματική παράσταση φασματοφωτόμετρου UV - Vis Τα κριτήρια επιλογής Φωτόμετρου Η επιλογή φωτόμετρου πραγματοποιείται με βάση τις ανάγκες του εργαστηρίου. Έτσι, όταν η χρήση του αφορά: ερευνητικούς σκοπούς: απαιτείται συνεχές φάσμα, μεγάλη ακρίβεια και επαναληψιμότητα, εξετάσεις καθημερινής χρήσης: απαιτείται ταχύτητα, επαναληψιμότητα, αυτοματοποίηση με φίλτρα, θερμοστατούμενη κυψελίδα, χρονόμετρο, μνήμη και καταγραφικό. Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και άλλοι παράμετροι, όπως: ευκολία στη χρήση, όγκος, σχήμα, δυνατότητα συντήρησης κ.α Η διαδικασία της Φωτομέτρησης Γενικά πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω: το διάλυμα που θα φωτομετρηθεί θα πρέπει να είναι σε ισορροπία. ο μηδενισμός του φωτόμετρου πραγματοποιείται με το τυφλό (blank) διάλυμα το οποίο περιέχει όλα τα αντιδραστήρια και έχει υποστεί την ίδια διαδικασία με το προς μέτρηση διάλυμα, δεν περιέχει όμως την ένωση που θέλουμε να προσδιορίσουμε. οι κυψελίδες που θα χρησιμοποιηθούν θα πρέπει να είναι ίδιες και καθαρές και κατάλληλες για το μήκος κύματος της μέτρησης (π.χ. στο υπεριώδες χρησιμοποιούνται κυψελίδες χαλαζία) Οι εφαρμογές της Φασματοφωτομετρίας Ο Ποιοτικός προσδιορισμός (ταυτοποίηση, ανίχνευση) Π.χ. Στα 280 nm πραγματοποιείται ανίχνευση πρωτεϊνών σε απομονωμένο DNA. 22

24 Ο Ποσοτικός Προσδιορισμός Ο ποσοτικός προσδιορισμός με Πρότυπο Διάλυμα Έστω ότι το πρότυπο διάλυμα Δ π έχει συγκέντρωση C π και η απορρόφησή του είναι ίση με Α π. Η απορρόφηση του άγνωστου διαλύματος Δ x συγκέντρωσης C x έστω ότι είναι ίση με Α x. Με εφαρμογή του νόμου των Lambert-Beer για τα δύο διαλύματα, έχουμε: Άγνωστο Διάλυμα: Αx = k l Cx (Εξίσωση 1.2) Πρότυπο Διάλυμα: A π = k l C π (Εξίσωση 1.3) Με διαίρεση κατά μέλη έχουμε: Αx / Aπ = Cx / Cπ Λύνοντας ως προς C x έχουμε: Cx = (Αx / Aπ) Cπ (Εξίσωση 1.4) Ο ποσοτικός προσδιορισμός με κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης Χρησιμοποιούνται πρότυπα διαλύματα της ουσίας που θέλουμε να αναλύσουμε. Με φωτομέτρηση των πρότυπων διαλυμάτων λαμβάνουμε τις απορροφήσεις τους (Α i). Με γραφική παράσταση, σε σύστημα ορθογώνιων αξόνων, των ζευγών (Α i, C i) κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη (Σχήμα 1.4). Σχήμα 1.4 Πρότυπη καμπύλη. 1.8 Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι ανάλυσης στην κλινική βιοχημεία Στην κλινική βιοχημεία, όπως και στην αναλυτική χημεία, χρησιμοποιούνται διάφορες ενόργανες τεχνικές (Τietz, 1995 Παπαϊωάννου & Πλαγεράς, 2012). Οι ενόργανες αναλύσεις διακρίνονται κυρίως σε: οπτικές μεθόδους, χρωματομετρικές μεθόδους, ηλεκτροχημικές μεθόδους, 23

25 φασματοσκοπία μάζας, υπέρυθρη φασματοσκοπία, φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), μοριακές μέθοδους. Οι οπτικές μέθοδοι ανάλυσης περιλαμβάνουν κυρίως τις μεθόδους: φασματοφωτομετρία UV Vis, φασματοσκοπία εκπομπής, φλογοφωτομετρία, πολωσιμετρία, κ.α. 1.9 Η Φασματοφωτομετρία UV-Vis Στην πράξη το φως που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο επιλέγεται να είναι συγκεκριμένου μήκους κύματος λ. Όπως ήδη γνωρίζουμε, το ορατό φως αποτελεί τμήμα ενός μεγάλου αριθμού ηλεκτρομαγνητικών ακτινοβολιών που καλύπτουν ένα πολύ μεγάλο φάσμα μηκών κύματος. Το φάσμα του φωτός που αξιοποιείται στα βιοϊατρικά εργαστήρια, μπορεί να διακριθεί σε δύο περιοχές: 1. στην υπεριώδη περιοχή (ultraviolet ή UV) που είναι αόρατη στον οφθαλμό, με μήκος κύματος nm, 2. στην ορατή περιοχή (visible ή Vis) που είναι ορατή στον οφθαλμό, με μήκος κύματος ακτινοβολίας nm. Τα πιο συνηθισμένα φασματόμετρα που συναντώνται στα βιοϊατρικά εργαστήρια είναι τα φασματοφωτόμετρα ορατής-υπεριώδους ακτινοβολίας, που χρησιμοποιούν τα μήκη κύματος nm. Το φάσμα της μετρούμενης ουσίας δίνεται συνήθως ως διάγραμμα της απορρόφησης συναρτήσει του μήκους κύματος, όπως φαίνεται στο Σχήμα Η Βαθμονόμηση των οργάνων Σχήμα 1.5 Τυπικό φάσμα στο UV Vis. 24

26 Συχνά ο όρος «Βαθμονόμηση» συγχέεται με τον όρο «Διακρίβωση», επειδή ο αγγλικός όρος είναι ο ίδιος «Calibration». Η βαθμονόμηση (calibration) ενός οργάνου, είναι μια απαραίτητη διαδικασία για τον έλεγχο της αξιοπιστίας του οργάνου (εκτός λίγων περιπτώσεων, π.χ. σταθμική ανάλυση και κουλομετρία). Για να γίνει βαθμονόμηση πρέπει να υπάρχει αναμφισβήτητη εμπειρική ή θεωρητική σχέση μεταξύ αναλυτικής παραμέτρου (σήματος) και συγκεντρώσεως ή ποσότητας (x). Η σχέση αυτή καλείται αναλυτική συνάρτηση ή συνάρτηση βαθμονόμησης (calibration function): y = g(x). Παραδείγματα αναλυτικής συνάρτησης: Ποτενσιομετρία (Εξίσωση Nernst): E (δυναμικό) = E σταθ + S log α = E σταθ + S log C (Εξίσωση 1.5) Πολαρογραφία (Εξίσωση ρεύματος διαχύσεως Ilkovic): I d (ρεύμα διαχύσεως) = 708 n D 1/2 C m 2/3 t 1/6 = k C (Εξίσωση 1.6) Φασματοφωτομετρία (Νόμος Lambert Beer): Α (απορρόφηση) = ε b C Φθορισμομετρία: F (ισχύς φθορισμού) = 2.3 Φ P o ε b c = k C (Εξίσωση 1.7) Φλογοφασματομετρία εκπομπής: P (ισχύς εκπεμπόμενης ακτινοβολίας) = k C (Εξίσωση 1.8) Υγρή και Αέρια Χρωματογραφία: Α (εμβαδόν κορυφής) = k C (Εξίσωση 1.9) Ανοσοχημική τεχνική: Logit y = a + log C (Εξίσωση 1.10) όπου: logit y = ln [y/(1-y)] και y = B/B o (B: σήμα προτύπου, Β o: σήμα μηδενικού προτύπου). Παρόλο που η ακριβής διαδικασία της βαθμονόμησης μπορεί να ποικίλλει από όργανο σε όργανο, αυτή γενικά περιλαμβάνει τη χρήση ενός οργάνου, το οποίο θα προσδιορίσει την ποσότητα μιας γνωστής ουσίας, γνωστής ποσότητας, η οποία θα βρίσκεται σε ένα ειδικό δείγμα που ονομάζεται «βαθμονομητής». Η βαθμονόμηση είναι η διαδικασία ρύθμισης των παραμέτρων ενός οργάνου, ώστε το αποτέλεσμα μιας εξέτασης - παραμέτρου για ένα συγκεκριμένο δείγμα (βαθμονομητής) να βρεθεί εντός ενός αποδεκτού εύρους τιμών. Τα αποτελέσματα της βαθμονόμησης χρησιμοποιούνται για να δημιουργηθεί μια σχέση μεταξύ της μεθόδου προσδιορισμού μίας ουσίας που χρησιμοποιείται από το όργανο και των γνωστών τιμών (π.χ. συγκεντρώσεων) αυτής. Με αυτό τον τρόπο, το όργανο μπορεί να παρέχει πιο ακριβή αποτελέσματα, όταν προσδιορίζει άγνωστα δείγματα. Για παράδειγμα, η μέτρηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε ένα δείγμα βαθμονομητή πρέπει να δώσει ένα συγκεκριμένο εύρος τιμών, σύμφωνα με την τιμή στόχο και την τυπική απόκλιση, που μας δίνονται από την εταιρεία κατασκευής του βαθμονομητή. 25

27 1.11 Τα υλικά Βαθμονόμησης (Calibrators) Οι βαθμονομητές είναι διαλύματα που προσομοιάζουν με τα προς ανάλυση δείγματα. Στην κλινική χημεία, είναι διαλύματα με βάση το βόειο ή το ανθρώπινο αίμα. Στο εμπόριο υπάρχουν είτε σε υγρή μορφή έτοιμα προς χρήση, είτε σε λυοφιλοποιημένη μορφή, οπότε θα πρέπει να ανασυσταθούν πριν τη χρήση τους. Πλεονέκτημα των βαθμονομητών σε υγρή μορφή είναι ότι χρησιμοποιούνται χωρίς καμία άλλη ανθρώπινη ενέργεια, όμως έχουν μικρή σχετικά ημερομηνία λήξης. Αντίθετα, οι βαθμονομητές σε λυοφιλοποιημένη μορφή χρειάζονται ανασύσταση, έχουν όμως μεγαλύτερη ημερομηνία λήξης. Σήμερα, καλύτεροι θεωρούνται οι βαθμονομητές με βάση το ανθρώπινο αίμα, διότι προσομοιάζουν περισσότερο με τα προς ανάλυση δείγματα Η Βαθμονόμηση των Ενόργανων μεθόδων Όλοι οι τύποι αναλυτικών μεθόδων, με δύο εξαιρέσεις (σταθμική ανάλυση και κουλομετρία), απαιτούν βαθμονόμηση. Η καμπύλη βαθμονόμησης (calibration curve), κατασκευάζεται με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων με ακριβώς γνωστές συγκεντρώσεις του αναλύτη (προσδιοριζόμενη ουσία). Τα διαλύματα αυτά μετρούνται (π.χ. φωτομετρούνται) και καταγράφεται η ένδειξη του οργάνου (π.χ. Ρ). Με τις μετρήσεις που λαμβάνονται σχεδιάζεται διάγραμμα της ένδειξης του οργάνου (Ρ) ως προς τη συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ουσίας (C). Συνήθως τα διαγράμματα που προκύπτουν είναι γραμμικά σε μια αρκετά μεγάλη περιοχή συγκεντρώσεων (δυναμική περιοχή - γραμμικότητα). Τα διαγράμματα αυτά είναι επιθυμητό να είναι γραμμικά, επειδή έτσι έχουμε λιγότερα σφάλματα σε σχέση με τις μη γραμμικές καμπύλες. Δεν είναι όμως ασυνήθιστο να προκύπτουν και μη γραμμικά διαγράμματα, τα οποία απαιτούν μεγαλύτερο αριθμό δεδομένων βαθμονόμησης (περισσότερα πρότυπα διαλύματα), για να εξακριβωθεί ακριβέστερα η σχέση μεταξύ της ένδειξης του οργάνου και της συγκέντρωσης. Συνήθως από την καμπύλη βαθμονόμησης προκύπτει μια εξίσωση με τη μέθοδο ελάχιστων τετραγώνων, ώστε να είναι δυνατός ο άμεσος υπολογισμός των συγκεντρώσεων των δειγμάτων Οι Καμπύλες Βαθμονόμησης Όπως ήδη αναφέρθηκε, οι μετρήσεις των ενόργανων τεχνικών αναλύσεως (εκτός από ολιγάριθμες περιπτώσεις) είναι σχετικές και απαιτούν τη βαθμονόμηση των οργάνων με πρότυπα ή διαλύματα προτύπων παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα. Οι κυριότερες μέθοδοι βαθμονόμησης που χρησιμοποιούνται είναι: Η καμπύλη Αναφοράς (ή Πρότυπη καμπύλη) Η κατασκευή της καμπύλης αναφοράς πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα: 1. Παρασκευάζονται πρότυπα διαλύματα του μετρούμενου συστατικού, κατά το δυνατόν παρόμοιας συστάσεως με τα διαλύματα των προς προσδιορισμό δειγμάτων (ιονική ισχύς, ph, παρουσία διαφόρων ουσιών, ιξώδες. κ.α.) στη χρήσιμη αναλυτική περιοχή, και μετρούνται οι τιμές της αναλυτικής παραμέτρου. 2. Από τις μετρήσεις των πρότυπων διαλυμάτων κατασκευάζεται η καμπύλη αναφοράς, δηλαδή γραφική παράσταση της αναλυτικής παραμέτρου (Ρ) ως προς συγκέντρωση (ή ποσότητα συστατικού) των προτύπων διαλυμάτων (Σχήμα 1.6). Θα πρέπει πάντα να έχουμε υπόψη ότι η ισχύς της πρότυπης καμπύλης είναι συγκεκριμένης χρονικής διάρκειας (πολλές φορές μικρής) και συνεπώς θα πρέπει η μέτρηση των αγνώστων διαλυμάτων να γίνεται έ- γκαιρα. Στην περίπτωση που η γραμμικότητα της καμπύλης αναφοράς διέρχεται από το μηδέν, τότε είναι δυνατή η χρησιμοποίηση ενός μόνο πρότυπου διαλύματος, συγκεντρώσεως C s, οπότε η συγκέντρωση του αγνώστου C x υπολογίζεται από την Eξίσωση 1.4. Για όσες ενόργανες τεχνικές απαιτείται μηδενισμός της κλίμακας, αυτή γίνεται με τη βοήθεια του τυφλού διαλύματος. 26

28 Animation 1.1 Κατασκευή καμπύλης αναφοράς με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων Η μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας (standard addition method) Βήματα εφαρμογής Εφαρμόζεται στις περιπτώσεις στις οποίες το μητρικό υλικό του δείγματος ασκεί μεγάλη επίδραση στη συνάρτηση βαθμονόμησης (στατιστικά διαφορετική κλίση b) και είναι αδύνατη η παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων παρόμοιας συστάσεως με τα διαλύματα των αγνώστων, είτε διότι είναι άγνωστη η σύστασή τους, ή ποικίλλει από δείγμα σε δείγμα, είτε επειδή υπάρχουν ουσίες που παρεμποδίζουν. Απαιτείται γραμμική σχέση της καμπύλης βαθμονόμησης και υποχρεωτική διέλευσή της από αρχή αξόνων (a = 0). Κατά τη μέθοδο αυτή, μετρείται το διάλυμα του άγνωστου δείγματος και στη συνέχεια μετρείται το ίδιο ή άλλο τμήμα του διαλύματος του δείγματος, στο οποίο έχει προστεθεί μικρός όγκος πρότυπου διαλύματος, ώστε να προκαλέσει αύξηση της συγκεντρώσεως του συστατικού κατά ΔC (θεωρείται μικρή ή αμελητέα η αύξηση του όγκου του διαλύματος). Συνεπώς, χρησιμοποιείται σε εκείνες τις περιπτώσεις που ισχύουν τα παρακάτω: 1. Εάν η σχέση που συνδέει τη μετρούμενη φυσική/χημική παράμετρο P και τη συγκέντρωση C X της ουσίας X που μας ενδιαφέρει να προσδιορίσουμε, είναι αναλογική, δηλ. εάν P = k C X. 2. Εάν ο συντελεστής αναλογίας k επηρεάζεται έντονα από τη σύσταση του δείγματος (όλες οι άλλες ουσίες που υπάρχουν στο μετρούμενο διάλυμα) του δείγματός μας. 3. Εάν έχουμε να αναλύσουμε πολλά δείγματα με διαφορετική σύσταση ή έστω και ένα δείγμα αλλά με άγνωστη σύσταση, τότε είναι πρακτικά αδύνατη η χρησιμοποίηση καμπύλης αναφοράς. Σχήμα 1.6 Αναπαράσταση του πειράματος προσδιορισμού συγκέντρωσης. 27

29 Βήμα 1 ο Από το άγνωστο διάλυμα της ουσίας Χ, με άγνωστη συγκέντρωση C X, λαμβάνουμε γνωστό όγκο V X δείγματος με σιφώνιο (π.χ. V X = 10,00 ml) και τον μεταφέρουμε σε δύο μικρά ποτήρια ζέσεως (Δ 0 και Δ 1), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.7. Βήμα 2 ο Με ένα σιφώνιο μεταφέρουμε ακριβώς γνωστό όγκο V S πρότυπου διαλύματος της ουσίας Χ, συγκέντρωσης C S (π.χ. C S = 1000 μg X/ ml) στο ποτήρι Δ 1. Ο όγκος αυτός θα πρέπει να είναι πολύ μικρότερος [τυπικά το 1/100 ή ακόμη λιγότερο] από τον όγκο V X (π.χ. V S = 0,100 ml). Σχήμα 1.7 Αναπαράσταση μέτρησης της απορρόφησης σε φωτόμετρο. Βήμα 3 ο Μετρούμε με το όργανο τη φυσική/χημική παράμετρο P στο ποτήρι Δ 0, όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα. Στην περίπτωσή μας, δεν ενδιαφέρει η τεχνική που χρησιμοποιούμε και το όργανο ανάλυσης, αρκεί να ισχύει η αναλογική σχέση μεταξύ του μετρούμενου μεγέθους και της συγκέντρωσης. Έστω ότι βρίσκουμε P 0 = 35,0. Βήμα 4 ο Μετρούμε με το όργανο την παράμετρο P στο ποτήρι Δ 1. Προφανώς θα είναι P 1 > P 0, αφού στο ποτηράκι Δ 1 βάλαμε επιπλέον ποσότητα της ουσίας Χ («γνωστή προσθήκη»). Έστω ότι τη βρίσκουμε P 1 = 61,0. Επειδή προσθέσαμε πολύ μικρό όγκο προτύπου στο ποτήρι Δ 1, ουσιαστικά η αραίωση ήταν αμελητέα και δεν διαταράξαμε τη σύσταση του δείγματος. Οπότε ο συντελεστής k είναι ο ίδιος και στις δύο μετρήσεις. Η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης ΔC X υπολογίζεται εύκολα και ως εξής: H ποσότητα της Χ που προσθέσαμε στο ποτήρι Δ 1 είναι V S C S. Αυτή αραιώθηκε σε τελικό όγκο: V X + V S, οπότε η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης είναι: ΔC 1 = (V S C S) / (V X + V S) (Εξίσωση 1.11) και επειδή V X >> V S, πρακτικά είναι: ΔC 1 = (V S C S) / V X (Εξίσωση 1.12) Με τις τιμές που έχουμε δώσει σαν παράδειγμα θα είναι: ΔC 1 = (V S C S) / V X = (0,100 ml) (1000 μg X/mL) / (20,00 ml) = 5,00 μg X/mL Τότε θα είναι: P 0 = k C X P 1 = k (C X + ΔC 1) 28

30 Από τις οποίες με διαίρεση κατά μέλη και επίλυση ως προς C x προκύπτει ότι: C x = [P 0 / (P 1 P 0)] / ΔC 1 (Εξίσωση 1.13) Αντικαθιστώντας τις πειραματικές τιμές, υπολογίζουμε τελικά την άγνωστη συγκέντρωση της ουσίας Χ στο δείγμα: C x = [35,0 / (61,0 35,0)] / (5,00 μg X/mL) = 6,73 μg/ml Ο Γραφικός Υπολογισμός Το παραπάνω αποτέλεσμα μπορεί να προκύψει και γραφικά (Σχήμα 1.8) ως εξής. Σχεδιάζουμε ένα διάγραμμα των τιμών της μετρούμενης παραμέτρου P ως προς τις τιμές ΔC X. Η προέκταση της ευθείας, η οποία ορίζεται από τα δύο πειραματικά σημεία (P 0, 0) και (P 1, ΔC 1), θα τμήσει τον άξονα των τιμών ΔC X σε σημείο (C) που αντιστοιχεί στην τιμή -C X. Σχήμα 1.8 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔC x. Η μέθοδος αυτή πρέπει να χρησιμοποιείται, όταν δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποια καλύτερη τεχνική ποσοτικοποίησης. Γενικά, δεν είναι ιδιαίτερα ακριβής. Η γνωστή προσθήκη ΔC 1 δεν πρέπει να είναι ούτε μεγάλη, ούτε μικρή. Ιδανικά θα πρέπει η ΔC 1 να είναι στην περιοχή 0,5 C X < ΔC 1 < 1,5 C X. Συνεπώς τα όρια γραμμικότητας με τη μέθοδο αυτή είναι σχετικά περιορισμένα, οπότε υπάρχει ενδεχόμενο η μέτρηση της P 1 να πραγματοποιηθεί σε περιοχή συγκεντρώσεων της Χ, όπου δεν ισχύει πλέον η γραμμική σχέση, με αποτέλεσμα να έχουμε στη μέτρησή μας συστηματικά σφάλματα. Στο Σχήμα 1.10 παρουσιάζεται το σφάλμα που θα είχε το αποτέλεσμα της μέτρησής μας, αν οι τιμές P 0 και P 1 κυμαίνονταν γύρω από μια κεντρική τιμή. 29

31 Σχήμα 1.9 Σφάλμα μέτρησης λόγω κοντινών μετρήσεων Ρ 0 και Ρ 1. Από την παραπάνω γραφική παράσταση είναι προφανές πως μικρές σχετικά διακυμάνσεις στις τιμές P 0 μια P 1 δημιουργούν μια μεγάλη (σχετικά) διακύμανση στις τιμές C X Η μέθοδος των Πολλαπλών Προσθηκών Οι «πολλαπλές προσθήκες» αποτελούν μια βελτιωμένη εφαρμογή της μεθόδου προσθήκης γνωστής ποσότητας. Συχνά, αντί μίας γνωστής προσθήκης πραγματοποιούνται 2 ή 3 γνωστές προσθήκες για καλύτερη ακρίβεια και κυρίως για να είμαστε βέβαιοι ότι όλες οι μετρούμενες τιμές της φυσικής παραμέτρου (Ρ) βρίσκονται στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης βαθμονόμησης (όλα τα σημεία θα βρίσκονται σε μία ευθεία). Στις περιπτώσεις αυτές προχωρούμε σε ανάλογο γραφικό υπολογισμό, όπως ανωτέρω. Το Σχήμα 1.11 παρουσιάζει την περίπτωση 3 γνωστών προσθηκών (ΔC 1, ΔC 2, ΔC 3). Σχήμα 1.10 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔCx με προσθήκη 3 γνωστών ποσοτήτων. 30

32 Από τη γραφική παράσταση του Σχήματος 1.10 με προέκταση της ευθείας μπορούμε να υπολογίσουμε και σε αυτή την περίπτωση τη ζητούμενη τιμή C X. Εναλλακτικά, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων για τον υπολογισμό των συντελεστών α και b της εξίσωσης, που προσαρμόζεται στα πειραματικά σημεία: (0, P 0), (ΔC 1, P 1), (ΔC 2, P 2) και (ΔC 3, P 3) ως εξής: P = α ΔC + b (Εξίσωση 1.14) Από την οποία, για την τιμή P = 0, προκύπτει ότι: ΔC = C Χ = b / α (Εξίσωση 1.15) Η μέθοδος Παρεμβολής Χρησιμοποιείται, όταν η καμπύλη βαθμονόμησης δεν είναι γραμμική. πχ. στη φλογοφωτομετρία, όπου λόγω αυτο-απορρόφησης υπάρχει καμπύλωση προς τα κάτω. Για την κατασκευή της μη γραμμικής καμπύλης απαιτείται σχετικά μεγάλος αριθμός προτύπων. O υ- πολογισμός του αγνώστου γίνεται γραφικά, χρησιμοποιώντας το τμήμα της καμπύλης μεταξύ δυο σημείων / προτύπων που περικλείουν το σήμα του αγνώστου. Αυτό το τμήμα, χωρίς μεγάλο σφάλμα, θεωρείται γραμμικό. Εναλλακτικά, υπολογιστικά υπολογίζεται ως ακολούθως: Πρότυπο 1 με συγκέντρωση C 1 και απόκριση P 1 Πρότυπο 2 με συγκέντρωση C 2 και απόκριση P 2 Άγνωστο Χ με συγκέντρωση C x και απόκριση P x Ισχύει: (Ρ 2 - Ρ x) / (C 2 C x) = (P x P 1) / (C x C 1) ή C x = [C 1 (P 2 P x) + C 2 (P x P 1)] / (P 2 P 1) (Εξίσωση 1.16) Η μέθοδος της Μειώσεως κατά Γνωστή Ποσότητα Είναι παρόμοια με την προηγούμενη και διαφέρει μόνο κατά το ότι με την προσθήκη του προτύπου προκαλείται μείωση της συγκεντρώσεως του συστατικού κατά ΔC, λόγω στοιχειομετρικής αντιδράσεως, συμπλοκοποιήσεως ή καθιζήσεως. Χρησιμοποιείται κυρίως στην απόλυτη ποτενσιομετρία με εκλεκτικά ηλεκτρόδια ιόντων. Δίνονται και οι σχετικές εξισώσεις Η μέθοδος Κανονικοποίησης Χρησιμοποιείται στις χρωματογραφικές τεχνικές (π.χ. GLC, HPLC), για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας των συστατικών ενός μείγματος. Χρησιμοποιούνται τα εμβαδά των κορυφών των συστατικών του δείγματος (κλάσμα εκάστου εμβαδού ως προς το συνολικό άθροισμα των εμβαδών): C = A i A i 100 (Εξίσωση 1.16) Στην περίπτωση που ο ανιχνευτής δεν παρουσιάζει την ίδια απόκριση για όλα τα συστατικά του μείγματος, είναι ανάγκη να υπολογισθεί για κάθε συστατικό ο πειραματικός παράγοντας απόκρισης F i ως προς ένα κύριο συστατικό (ουσία αναφοράς) χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα των ουσιών. Στην περίπτωση αυτή για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας κάθε συστατικού λαμβάνονται τα μεγέθη F ia i και ΣF ia i: 31

33 F ι = Cι C ref (Εξίσωση 1.17) Aι A ref 1.14 Η εξίσωση Αναφοράς ή Συνάρτηση Βαθμονόμησης Η συνάρτηση βαθμονόμησης είναι η προσαρμογή (fitting) ενός κατάλληλου μαθηματικού μοντέλου στα διαθέσιμα πειραματικά δεδομένα (Σήμα Υ Συγκέντρωση C). Η περισσότερο εύχρηστη συνάρτηση βαθμονόμησης είναι η γραμμική (linear), που διέρχεται από την αρχή των αξόνων (origin) και είναι εφαρμόσιμη σε μία ευρεία δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων. Σημειώνεται ότι στην πράξη εμφανίζονται αποκλίσεις από ιδανική γραμμή βαθμονόμησης, όπως: αποκλίσεις νόμου Beer (πυκνά διαλύματα, χημική ισορροπία σωματιδίων, παράσιτη ακτινοβολία), καμπύλωση στην ποτενσιομετρία ιοντικών αισθητήρων σε πυκνές συγκεντρώσεις), καμπύλωση στη φλογοφωτομετρία λόγω αυτο-απορρόφησης. Για την πλειονότητα των αναλυτικών τεχνικών, χρησιμοποιείται η γραμμική εξίσωση βαθμονόμησης: y = a + b x (Εξίσωση 1.18) όπου: y το αναλυτικό σήμα, x η συγκέντρωση προτύπων, a η τομή στον άξονα των y, b η κλίση Ο έλεγχος της Καμπύλης Βαθμονόμησης ή Αναφοράς Ο έλεγχος περιλαμβάνει τα παρακάτω σημεία: εάν είναι γραμμική ή όχι και, εάν όχι, ποιάς μορφής είναι, ποιά είναι η καλύτερη ευθεία που πρέπει να χαραχθεί; ποιά είναι η γραμμική περιοχή (περιοχή εργασίας); ποιό είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης των παραμέτρων της τομής και της κλίσεως της ευθείας; ποιό είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης στην προσδιοριζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου που λαμβάνεται από την καμπύλη βαθμονόμησης; Σημείωση: Στη βαθμονόμηση χρησιμοποιείται η μονο-παραμετρική παλινδρόμηση ή προσαρμογή (univariate regression), που σημαίνει ότι οι μετρούμενες τιμές του αναλυτικού σήματος εξαρτώνται από μία μόνο ανεξάρτητη (χωρίς σφάλμα) μεταβλητή, τη συγκέντρωση προτύπων Η αρχή της μεθόδου της Παλινδρόμησης Είναι η εκτίμηση μιας εξαρτημένης μεταβλητής από μία άλλη που ονομάζεται ανεξάρτητη μεταβλητή. Η μέθοδος ή η διαδικασία αυτή καλείται παλινδρόμηση. Εάν θεωρήσουμε ότι μία εξαρτημένη μεταβλητή Υ θα εκτιμηθεί από μία ανεξάρτητη μεταβλητή Χ με βάση μια εξίσωση, η εξίσωση αυτή ονομάζεται εξίσωση παλινδρόμησης της Υ ως προς Χ. Η καμπύλη που παριστάνει την Υ συναρτήσει της Χ την ονομάζουμε καμπύλη παλινδρόμησης. Γενικά τα μοντέλα που μπορούμε να βρούμε είναι: Y = α + βx + ε (απλή γραμμική παλινδρόμηση, simple linear regression). 32

34 Y = α + β 1X β kx k + ε (πολλαπλή παλινδρόμηση, multiple regression). Y = α + β 1X + β 2X β kx + ε (πολυωνυμική παλινδρόμηση, multinomial regression) Η εκτίμηση της Ευθείας Παλινδρόμησης με τη Μέθοδο Ελαχίστων Τετραγώνων (Least Squares Method) Αποδεχόμαστε ότι οι τιμές x στερούνται σφάλματος (η παρασκευή προτύπων είναι πολύ ακριβής με σφάλματα της τάξεως 0,1%, δηλαδή μικρότερα από τα μετρήσιμα σφάλματα). Οι τιμές x τοποθετούνται στον οριζόντιο άξονα. Οι τιμές y (αναλυτικό σήμα), είναι η εξηρτημένη μεταβλητή, και εμπεριέχουν σφάλμα. Τοποθετούνται στο κάθετο άξονα. Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να υπολογισθούν εκείνες οι τιμές των παραμέτρων a, b1,, bm, για τις οποίες το μοντέλο θα έχει την καλύτερη προσαρμογή στα πειραματικά δεδομένα (xi yi). Για τις περισσότερες αναλυτικές τεχνικές η καμπύλη βαθμονόμησης (πρότυπη καμπύλη ή καμπύλη αναφοράς) περιγράφεται από μια ευθεία γραμμή (γραμμικό μοντέλο) και έτσι χρησιμοποιείται η γραμμική μέθοδος προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων (linear least square regression). Η σχέση μεταξύ κάθε ζεύγους παρατηρήσεων (x i, y i) παριστάνεται ως: yi = a +bxi + ei (Εξίσωση 1.19) Δηλαδή το σήμα y i συνίσταται από ένα καθορισμένο μέγεθος (a + bx i) που προβλέπεται από το γραμμικό μοντέλο και ένα τυχαίο συστηματικό (σφάλμα) e i. Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να βρεθούν οι εκτιμήτριες (estimates) των αληθινών τιμών a και b. Αυτό πετυχαίνεται με τον υπολογισμό τιμών a και b, για τις οποίες το άθροισμα των τετραγώνων των αποκλίσεων (δηλαδή των e i) να γίνεται ελάχιστο: e 2 0 Μετά από επεξεργασία λαμβάνονται οι σχέσεις: b = n i (x i x )(y i y ) n i (x i x ) 2 = n n x i n n n i y i i x i i y i n x 2 n i i ( x i i ) 2 (Εξίσωση 1.20) a = y bx = n y n 2 n i i i x i i x i y i n n x 2 n i i ( x i i ) 2 (Εξίσωση 1.21) y = n i y i n (Εξίσωση 1.22) x = n i x i n (Εξίσωση 1.23) 33

35 1.18 Η γραμμική Καμπύλη Παλινδρόμησης με Διαστήματα Εμπιστοσύνης Στο Σχήμα 1.11 παρουσιάζεται η αβεβαιότητα μιας μέτρησης, λόγου προσδιορισμού της μέσω πρότυπης καμπύλης. Σχήμα 1.11 Αβεβαιότητα μέτρησης Σύνοψη της πορείας της Προσαρμογής (Παλινδρόμησης) 1. Επιλογή του μοντέλου (συνήθως γραμμικό). 2. Υπολογισμός (εκτίμηση) των παραμέτρων του μοντέλου με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. 3. Αξιολόγηση του μοντέλου. 4. Υπολογισμός ορίων εμπιστοσύνης των παραμέτρων για τη συνάρτηση παλινδρόμησης και για το αναλυτικό αποτέλεσμα Τα Διαστήματα Εμπιστοσύνης Η ακρίβεια της προσδιοριζόμενης συγκέντρωσης του αγνώστου εξαρτάται από: το σφάλμα μέτρησης, από το διάστημα εμπιστοσύνης (confidence interval) της καμπύλης βαθμονομήσεως στο σημείο του αγνώστου, που εξαρτάται από τις αβεβαιότητες των εκτιμητριών των α και b. Ο υπολογισμός διακυμάνσεων των α και b δίνεται από τους τύπους: Sy x = n i (yi y ) 2 n 2 (Εξίσωση 1.24) S a = Sy x = n i x i 2 (Εξίσωση 1.25) n n i (x i x ) 2 S b = Sy x n i (x i x ) 2 (Εξίσωση 1.26) 34

36 1.20 O Συντελεστής Συσχετίσεως (Correlation Coefficient) Ο συντελεστής συσχετίσεως (r) παίρνει τιμές από: -1 r +1 και είναι μέτρο της γραμμικότητας της καμπύλης βαθμονόμησης. Έχει περισσότερη αξία στην ανάλυση συσχετίσεως πειραματικών δεδομένων (correlation analysis) Η Μη Γραμμική Παλινδρόμηση Σχήμα 1.12 Μη γραμμικό μοντέλο. Στην περίπτωση του Σχήματος 1.12 το βέλτιστο μοντέλο προκύπτει να είναι: Y = 1,73 0,2συν(0,63X) 1,41ημ(0,63X) 0,77συν(2 0,63X) 1,31ημ(2 0,63X) (Εξίσωση 1.27) το οποίο ένα έμπειρο μάτι ίσως τα αναγνωρίζει ως τους πρώτους 4 όρους μίας σειράς Fourier! Πολλές φορές, ιδιαίτερα στις βιολογικές επιστήμες, το διάγραμμα διασποράς συνηγορεί σε μία μη γραμμική σχέση (Σχήμα 1.13). Στην περίπτωση του Σχήματος 1.13 το βέλτιστο μοντέλο είναι: u = V maxx K m +X (Εξίσωση 1.28) 35

37 Σχήμα 1.13 Μη γραμμικό μοντέλο. Η ακρίβεια της προσδιοριζόμενης συγκέντρωσης του αγνώστου εξαρτάται από: το σφάλμα μέτρησης, από το διάστημα εμπιστοσύνης της καμπύλης βαθμονομήσεως στο σημείο του αγνώστου, που εξαρτάται από τις αβεβαιότητες των εκτιμητριών των α και b. Ο υπολογισμός διακυμάνσεων των α και b δίνεται από τους τύπους: 1.22 Η Γραμμικότητα της Μεθόδου Ανάλυσης Είναι εκείνο το τμήμα της καμπύλης, στο οποίο το μετρούμενο μέγεθος είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση της προς προσδιορισμό ουσίας. Όταν αναφερόμαστε στη Φασματοφωτομετρία UV Vis, είναι το τμήμα της καμπύλης, στο οποίο ισχύει ο νόμος του Beer Το Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection) Το όριο ανίχνευσης ή αναλυτική ευαισθησία (Analytical Sensitivity) μιας μεθόδου είναι η ελαχίστη συγκέντρωση μιας παραμέτρου που μπορεί να ανιχνευθεί «αξιόπιστα» από τη μέθοδο αυτή. Ως όριο ανίχνευσης ορίζουμε τη συγκέντρωση ενός αναλύτη (π.χ. μιας ουσίας) σε διάλυμά του, που ανιχνεύεται με βεβαιότητα 95%. Ισοδύναμα μπορούμε να πούμε πως είναι η ποσότητα του αναλύτη που δίνει μία τιμή στο όργανο μέτρησης ίση με το διπλάσιο (ή το τριπλάσιο κατ άλλους) της σταθερής τυπικής απόκλισης (SD), μιας σειράς δηλαδή, δέκα τουλάχιστον προσδιορισμών με διάλυμα μηδενικής συγκέντρωσης (τυφλό). Στην περίπτωση της φλογοφωτομετρίας το όριο ανίχνευσης φτάνει τα μg/ml. Για τις ανοσοχημικές μεθόδους, αραιώνεται ορός ασθενούς με βαθμονομητή μηδενικής συγκέντρωσης ή κατάλληλο αραιωτικό, σε τέτοιο βαθμό, ώστε ο συντελεστής διακύμανσης (CV), ο οποίος προκύπτει από είκοσι μετρήσεις, που πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας να είναι ίσος με την τιμή 20. Η συγκέντρωση αυτή αντιστοιχεί στο όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Όμως η διαδικασία των αραιώσεων δύσκολα εφαρμόζεται σε ένα κλινικό εργαστήριο με πρόγραμμα μέτρησης δειγμάτων ασθενών. Στην πράξη, για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης των βιοχημικών κλινικών δοκιμών, των ο- ποίων η καμπύλη βαθμονόμησης είναι γραμμική, χρησιμοποιείται ως πειραματικό υλικό αραιωμένος ορός ε- λέγχου χαμηλής συγκέντρωσης και εκτελούνται τουλάχιστον 15 μετρήσεις μεταξύ διαδοχικών ημερών. Υπολογίζεται η τυπική απόκλιση των μετρήσεων και το όριο ανίχνευσης (LOD) από τον μαθηματικό τύπο: 36

38 LOD = 3 SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 99,9% (Εξίσωση 1.29) ή LOD = 2 SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% (Εξίσωση 1.30) 1.24 Το Όριο Ποσοτικοποίησης (Limit of Quantitation) Το όριο ποσοτικοποίησης ή λειτουργική ευαισθησία (Functional Sensitivity) είναι η ελαχίστη συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου, που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί (να προσδιορισθεί ποσοτικά) με αποδεκτή ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) δίδεται από τον τύπο: LOQ = 10 SD (Εξίσωση 1.31) Ένας τρόπος προσδιορισμού του ορίου ποσοτικοποίησης για τις αναλύσεις που οι καμπύλες αναφοράς τους δεν είναι γραμμικές (π.χ. ανοσοχημικές), είναι ο εξής: πραγματοποιούνται 10 μετρήσεις των παρεχομένων βαθμονομητών, στα χαμηλότερα διαθέσιμα επίπεδα συγκεντρώσεων και υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση SD ανά επίπεδο, τα αποτελέσματα τοποθετούνται σε διάγραμμα δύο αξόνων. Στον άξονα των x εμφανίζονται οι τιμές των συγκεντρώσεων και στον άξονα των y οι τιμές της τυπικής απόκλισης, υπολογίζεται με τη βοήθεια της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων η εξίσωση γραμμικής καμπύλης της μορφής y = αx + β, προσδιορίζεται η τιμή της τυπικής απόκλισης (SD) για μηδενική συγκέντρωση (y = β). Το όριο ανίχνευσης προκύπτει από την εξίσωση LOD= 3 x SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 99,9% ή LOD = 2 SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% Εφαρμογές 1 η Εφαρμογή Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) Κατασκευή Φάσματος Απορρόφησης Στόχος της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης είναι η κατασκευή φάσματος απορρόφησης γνωστής ουσίας με τη φασματοφωτομετρία UV Vis. Ρυθμίζουμε το φασματοφωτόμετρο και ορίζουμε το μήκος κύματος στα 600 nm. Η φωτομέτρηση θα πραγματοποιηθεί από τα 600 nm και κατεβαίνοντας κάθε 10 nm προς τα μικρότερα μήκη κύματος, μετρώντας κάθε φορά την απορρόφηση μέχρι τα 410 nm. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στο μηδενισμό του οργάνου με το τυφλό, πριν από τη λήψη κάθε επιμέρους μέτρησης για κάθε μεταβολή του μήκους κύματος. Στη συνέχεια κατασκευάζουμε το φάσμα απορρόφησης, για να προσδιοριστεί το μήκος κύματος στο οποίο παρατηρείται η μέγιστη απορρόφηση. Για την κατασκευή του φάσματος απορρόφησης, καταγράφουμε στον παρακάτω πίνακα τις τιμές Α που αντιστοιχούν σε κάθε μήκος κύματος. 37

39 λ (nm) Απορρόφηση (Α) 600 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,08 Πίνακας 1.3 Παράδειγμα υπολογισμού του λ max λαμβάνοντας φάσμα απορρόφησης. Στη συνέχεια κατασκευάζουμε το φάσμα απορρόφησης της ουσίας σε χιλιοστομετρικό χαρτί και σημειώνουμε το λ max που βρήκαμε (Σχήμα 1.14). Στο παράδειγμα το λ max ισούνται με 510 nm. Σχήμα 1.14 Ο υπολογισμός του λ max από την καμπύλη του φάσματος απορρόφησης. 2 η Εφαρμογή Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) Κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης & Υπολογισμός Συγκέντρωσης Άγνωστου Διαλύματος 38

40 Στόχος της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης διαλύματος γνωστής ουσίας με τη φασματοφωτομετρία UV Vis. Με φωτομέτρηση και προσδιορισμό της απορρόφησης Α = f (C) μιας σειράς προτύπων διαλυμάτων σε ένα ορισμένο εύρος συγκεντρώσεων, μπορούμε να κατασκευάσουμε την καμπύλη αναφοράς ή βαθμονόμησης (calibration curve). Ακολούθως, μετρώντας την απορρόφηση ενός διαλύματος άγνωστης συγκέντρωσης, της ίδιας με τα πρότυπα διαλύματα ουσίας, σε συγκεκριμένο μήκος κύματος και με χρήση της καμπύλης αναφοράς, μπορούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση του άγνωστου διαλύματος. Στάδια προσδιορισμού 1. Παρασκευάζουμε μία σειρά τεσσάρων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων μιας ουσίας (Π i) που απορροφά στο UV Vis (π.χ. ουσία Α). 2. Φωτομετρούμε τα πρότυπα διαλύματα στο λmax για να προσδιορίσουμε τις απορροφήσεις τους. Εάν διαθέτουμε φωτόμετρο απλής δέσμης, τότε κάθε φορά μηδενίζουμε το φωτόμετρο με διαλύτη (στη περίπτωσή μας νερό), ενώ, εάν διαθέτουμε φωτόμετρο διπλής δέσμης, τότε στη μία κυψελίδα τοποθετούμε το τυφλό διάλυμα (νερό) και στην άλλη το πρότυπο ή το προς μέτρηση διάλυμα. 3. Καταγράφουμε τα αποτελέσματα στον ακόλουθο πίνακα: Διάλυμα Συγκέντρωση (Μ) Απορρόφηση Π 1 Π 2 Π 3 Π 4 Άγνωστο 1. Κατασκευάζουμε την καμπύλη αναφοράς Α = f (C) (Σχήμα 1.4). 2. Φωτομετρούμε το άγνωστο διάλυμα. 39

41 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Ο υπολογισμός του λ max από την καμπύλη του φάσματος απορρόφησης, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Λειτουργία σπεκτροφωτoμέτρου: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Ερμηνεία του νόμου Lambert-Beer: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Προσδιορισμός συγκέντρωσης με χρωματομετρία: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Αρχή μεθόδου της χρωματομετρίας: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο\ Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα, (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Aναφορές 1. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, A. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Εξειδικευμένα Θέματα Κλινικής Χημείας. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 2. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, A. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Ειδικά Θέματα Βιοχημείας. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 3. ADERSON, S & COCKAYNE, S. (1993) Clinical Chemistry Concepts and Applications. Philadelphia: W. B. Sauders Company Ltd. 4. ALEXANDER, R. & GRIFFIT, M. (1993) Basic Biochemical Methods. New York: Wiley-Liss Inc. 5. BURGOSS, C. & KNOWLES A. (1984) Techniques in Vis and UV Spectroscopy Series. London: Chapman and Hall. 40

42 6. MARHALL, J., BOTHAM, M., RODWELL, W., BENDER, A., KENNELLY, J., ANTHONH, P. (2011) Harper s Εικονογραφημένη Βιολογική Χημεία. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 7. TIETZ, W. (1995) Clinical Guide to Laboratory Tests. 3 rd ed. Philadelphia: W.B. Sauders Company Ltd. 41

43 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΕΛΙΚΟΥ ΣΗΜΕΙΟΥ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό παρουσιάζονται τα κριτήρια με τα οποία ένα κλινικό εργαστήριο επιλέγει την αναλυτική μεθοδολογία που θα ακολουθήσει για τον προσδιορισμό κάποιου αναλύτη (συστατικού). Επεξηγούνται επίσης οι γενικές αρχές των φωτομετρικών μεθόδων κλινικών προσδιορισμών. Η μεθοδολογία που εφαρμόζεται στους κλινικούς φωτομετρικούς προσδιορισμούς τελικού σημείου παρουσιάζεται στη συνέχεια λεπτομερώς, όσον αφορά τα πειραματικά στάδια της, τον τρόπο βαθμονόμησης, τους τρόπους ελέγχου παρεμβολών της μήτρας των δειγμάτων, τα χαρακτηριστικά του πρωτοκόλλου της και τους εμπλεκόμενους υπολογισμούς. Προαπαιτούμενες γνώσεις Απαιτείται η μελέτη του Κεφαλαίου 1, ειδικά σε ό, τι αφορά στις αρχές φωτομετρίας και βαθμονόμησης και τις έννοιες δείγματος, τυφλού και προτύπου, ορίου ανίχνευσης, ορίου ποσοτικοποίησης και ορίου γραμμικότητας. 2.1 Εισαγωγή H αποτελεσματικότητα μίας κλινικής ανάλυσης εξαρτάται από την ειδικότητα και την ευαισθησία αυτής να εντοπίσει με πιστότητα και ακρίβεια κάποια παθολογική αλλαγή. Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα κριτήρια αξιολόγησης μίας μεθοδολογίας κλινικού προσδιορισμού και οι γενικές αρχές των πιο κοινά χρησιμοποιούμενων μεθόδων, των φωτομετρικών κλινικών προσδιορισμών. 2.2 Κριτήρια επιλογής αναλυτικής μεθοδολογίας στην Kλινική Aνάλυση Η αναλυτική μεθοδολογία που εφαρμόζεται σε κάποια κλινική ανάλυση αξιολογείται και επιλέγεται με βάση τα παρακάτω κριτήρια (Burtis & Ashwood, 2015) (βλ. Κεφάλαια 1 και 9): 1. To πόσο αναπαραγώγιμη είναι, δηλαδή την πιστότητα (precision) της μεθόδου. H επαναληπτικότητα (repeatability ή intra-assay precision) και η αναπαραγωγιμότητα (reproducibility ή inter-assay precision) των αναλυτικών δεδομένων αναφέρονται στο βαθμό συμφωνίας μεταξύ μετρήσεων που λήφθηκαν με τον ίδιο τρόπο. Αποτελούν μέτρο του τυχαίου σφάλματος της ανάλυσης. Τα πιο κοινά κριτήρια αξιολόγησής τους είναι η απόλυτη και σχετική τυπική απόκλιση (Standard Deviation ή SD και Relative Standard Deviation ή RSD), ο συντελεστής μεταβλητότητας (Coefficient of Variation ή CV) και η διακύμανση (Variance). Αυτά αναλύονται περισσότερο στο Κεφάλαιο Το πόσο κοντινό είναι το υπολογιζόμενο αποτέλεσμα στην πραγματική τιμή της μέτρησης, δηλαδή την ακρίβεια της μέτρησης (accuracy). Η ακρίβεια μίας μέτρησης αναφέρεται στη διαφορά μεταξύ του μέσου όρου μιας σειράς μετρήσεων και της τιμής, η οποία είναι αποδεκτή ως η αληθής τιμή μίας μέτρησης. 3. Το πόσο μικρό σήμα μπορεί να μετρήσει, δηλαδή την ανιχνευσιμότητα (detectability) της μεθόδου. Η ανιχνευσιμότητα αναφέρεται στην ικανότητα της μεθόδου να διακρίνει το σήμα του αναλύτη από το σήμα του υποβάθρου ή θορύβου (δηλαδή από το σήμα του τυφλού (blank, backgrοund, noise). Το όριο ανίχνευσης (Detection Limit ή DL ή Limit of Detection ή LOD) αναφέρεται στη μικρότερη συγκέντρωση 42

44 ή ποσότητα του μετρούμενου συστατικού, που μπορεί να προσδιορισθεί με ορισμένη πιστότητα και ακρίβεια από τη μέθοδο (βλ. Ενότητα 1.24). Συνήθως ορίζεται ως η συγκέντρωση ή ποσότητα του συστατικού για την οποία η απόκριση της μεθόδου διαφέρει από την απόκριση του τυφλού κατά το τριπλάσιο της τυπικής απόκλισης του μέσου όρου του τυφλού. Σχετιζόμενο με το όριο ανίχνευσης είναι το όριο ποσοτικού προσδιορισμού ή ποσοτικοποίησης (Limit of Quantification ή Limit of Quantitation ή LOQ). Είναι το τριπλάσιο του ορίου ανίχνευσης. Χαρακτηρίζει τη μικρότερη συγκέντρωση του μετρούμενου συστατικού, που μπορεί να προσδιορισθεί ποσοτικά με ορισμένη πιστότητα και ακρίβεια από τη μέθοδο. 4. Την ευαισθησία της (sensitivity), δηλαδή το λόγο της μεταβολής του μετρούμενου μεγέθους (πχ. απορρόφηση) προς τη μεταβολή της συγκέντρωσης του αναλύτη. 5. Τo εύρος γραμμικότητας (linearity range). Εξακριβώνεται με κατασκευή καμπύλης αναφοράς (γραφική παράσταση αναλυτικού σήματος ως προς τη συγκέντρωση του αναλύτη, Σχήμα 2.1) και εφαρμογή ανάλυσης παλινδρόμησης ελαχίστων τετραγώνων (βλ. Ενότητα 1.17). Το άνω άκρο του εύρους γραμμικότητας καλείται όριο γραμμικότητας (Limit of Linearity ή LOL). 6. Tη χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων ή δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων (working range ή dynamic range). Είναι η περιοχή συγκεντρώσεων μεταξύ του ορίου ποσοτικοποίησης και του ορίου γραμμικότητας, στην οποία βέβαια η καμπύλη συσχέτισης είναι ευθεία. Στο Σχήμα 2.1 υποδεικνύεται επάνω στην καμπύλη αναφοράς η χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων μίας αναλυτικής μεθοδολογίας. Μόνο εντός αυτής της περιοχής, είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός του αναλύτη με καθορισμένη αποδεκτή πιστότητα και ακρίβεια, με τη συγκεκριμένη μέθοδο. Σχήμα 2.1 Καμπύλη αναφοράς. Σημειώνονται το όριο ανίχνευσης (DL) και ποσοτικοποίησης (LOQ), το όριο γραμμικότητας (LOL) και η χρήσιμη αναλυτική (δυναμική) περιοχή συγκεντρώσεων. Είναι φανερό ότι η γραμμική σχέση μεταξύ του σήματος του οργάνου μέτρησης και της συγκέντρωσης του προσδιοριζόμενου αναλύτη διατηρείται μόνο μέχρι μία συγκεκριμένη συγκέντρωση του αναλύτη (LOL). 7. Το πόσο σημαντική είναι η επίδραση των άλλων συστατικών του δείγματος στην ακρίβεια του προσδιορισμού, δηλαδή ποια είναι η εκλεκτικότητα (selectivity) ή ειδικότητα (specificity) της αντίδρασης. Οι δύο όροι συχνά χρησιμοποιούνται χωρίς διάκριση, κι έτσι θα χρησιμοποιηθούν για τις ανάγκες αυτού του εργαστηριακού οδηγού. Μία αναλυτική μεθοδολογία θεωρείται ειδική, όταν μπορεί να προσδιορίσει με ορισμένη ακρίβεια, χωρίς επίδραση από τα άλλα συστατικά του δείγματος, τον αναλύτη. 43

45 Τα κριτήρια αυτά για κάθε προτεινόμενη αναλυτική μεθοδολογία ποσοτικού προσδιορισμού, μελετούνται από την επιστημονική κοινότητα και δημοσιεύονται στην επιστημονική βιβλιογραφία. Πολύ συχνά, ένα κλινικό εργαστήριο επιλέγει να χρησιμοποιήσει μία τέτοια μεθοδολογία κατόπιν αξιολόγησής της, με βάση τα παραπάνω κριτήρια, από ειδικές επιτροπές επιστημονικών ενώσεων. Τέτοιες είναι: η Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας (International Federation of Clinical Chemistry ή IFCC), η Γερμανική Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής (Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriums Μedizin ή DGKL), η Γαλλική Ένωση Κλινικής Βιολογίας (Société Française de Biologie Clinique ή SFBC) κ.α. Η κάθε επιστημονική ένωση εξετάζει τα παραπάνω κριτήρια και αποφαίνεται σχετικά με την υιοθέτηση μίας μεθόδου ως επίσημη, αποδεκτή μέθοδο ή μη αποδεκτή μέθοδο, για τον ποσοτικό προσδιορισμό κάποιου αναλύτη σε κλινικά δείγματα. Έτσι, για παράδειγμα, η Γερμανική Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής και η Γαλλική Ένωση Κλινικής Βιολογίας έχουν υιοθετήσει ως επίσημη μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού της LDH σε πλάσμα την καταλυόμενη από LDH μετατροπή του πυροσταφυλικού σε γαλακτικό οξύ σε ph 7,4-7,8 (Standardization Committee of the German Society for Clinical Chemistry, 1993 Mathieu et al., 1982). Αντίθετα, η Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας προτείνει τη μετατροπή του γαλακτικού σε πυροσταφυλικό σε ph 8,8-9,8 (Bais & Philcox, 1994). Πέραν των γνωμοδοτήσεων αυτών, άλλα κριτήρια που παίζουν ρόλο στην επιλογή της αναλυτικής μεθοδολογίας μιας ανάλυσης από ένα συγκεκριμένο κλινικό εργαστήριο αποτελούν η διαθεσιμότητα του απαραίτητου εξοπλισμού, το κόστος και ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης, ο βαθμός πολυπλοκότητας της μεθοδολογίας και η εμπειρία/επιδεξιότητα του διαθέσιμου επιστημονικού προσωπικού. Σύνοψη: Τα ποσοτικά κριτήρια που λαμβάνονται υπ όψιν κατά την επιλογή μίας αναλυτικής μεθοδολογίας ποσοτικού προσδιορισμού κλινικού αναλύτη αποτελούν οι πιστότητα, ακρίβεια, ανιχνευσιμότητα, ευαισθησία, εκλεκτικότητα και δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων της μεθόδου. Με βάση τα κριτήρια αυτά, διάφορες επιστημονικές ενώσεις κλινικής χημείας υιοθετούν μία μέθοδο προσδιορισμού κλινικού αναλύτη ως επίσημη. Τα διαγνωστικά εργαστήρια μπορούν στη συνέχεια να επιλέξουν μία εκ των επίσημων μεθόδων με βάση ποιοτικά κριτήρια, όπως η διαθεσιμότητα του απαιτούμενου εξοπλισμού και εμπειρίας, το κόστος, η πολυπλοκότητα και ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης. 2.3 Φωτομετρικές Aναλυτικές Mέθοδοι στην Kλινική Aνάλυση Καθ ότι οι φωτομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού είναι οι πλέον εύχρηστες, γρήγορες, και απαιτούν κοινό εργαστηριακό εξοπλισμό, βρίσκουν ευρύτατη εφαρμογή στην κλινική ανάλυση (McPherson & Pincus, 2011). Πολύ σπάνια όμως, στην κλινική ανάλυση, ο προσδιορισμός μίας κλινικής παραμέτρου βασίζεται στην εκλεκτική απορρόφηση του προσδιοριζόμενου αναλύτη σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Αυτό ισχύει γιατί στην πλειοψηφία τους οι αναλύτες κλινικού ενδιαφέροντος δεν είναι έγχρωμοι. Έτσι, δεν απορροφούν στο ορατό (Vis), αλλά απλώς στο υπεριώδες (UV) και κυρίως μεταξύ 220 και 315 nm (δηλαδή εντός της UVC και UVB περιοχής), όπου επίσης απορροφάται και πλήθος άλλων μορίων που περιέχονται σε κάποιο κλινικό δείγμα. Κατά συνέπεια, δεν είναι δυνατόν η συντριπτική πλειοψηφία των κλινικών αναλυτών να προσδιοριστεί εκλεκτικά με βάση απλώς την απορρόφηση των αναλυτών σε αυτές τις περιοχές του UV. Προκειμένου να αυξηθεί η εκλεκτικότητα του προσδιορισμού, η μεγάλη πλειοψηφία των αναλυτικών μεθόδων στην κλινική ανάλυση βασίζεται στον ποσοτικό προσδιορισμό μίας έγχρωμης ένωσης, που παράγεται όταν το προς ανάλυση κλινικό δείγμα αναμιγνύεται με κατάλληλα αντιδραστήρια, υπό καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Οι έγχρωμες ενώσεις (βλ. Ενότητα 1.1) απορροφούν στην ορατή περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος (Vis). Η γενική αντίδραση που περιγράφει την αρχή των προσδιορισμών αυτών είναι η: Δείγμα + Χρωμογόνο Έγχρωμη ένωση (Αντίδραση 2.1) Το χρωμογόνο προστίθεται πάντοτε σε περίσσεια. Εάν οι συνθήκες της παραπάνω αντίδρασης είναι τέτοιες, ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη στο δείγμα, η αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του αναλύτη. Ως παράδειγμα τέτοιου κλινικού προσδιορισμού, αναφέρεται ο in vitro ποσοτικός προσδιορισμός του μαγνησίου σε ορό ή ούρα. Σε αλκαλικό περιβάλλον το μαγνήσιο αντιδρά με την ένωση καλμαγίτη προς σχηματισμό χηλικής ένωσης ερυθρού χρώματος. 44

46 Καλμαγίτης + Mg 2+ Έγχρωμη χηλική ένωση (Αντίδραση 2.2) Η οφειλόμενη στη χημική ένωση απορρόφηση στα 520 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του μαγνησίου στο κλινικό δείγμα. Μεταξύ των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή του έγχρωμου προϊόντος μπορεί να συγκαταλέγονται και ένζυμα. Στις περιπτώσεις αυτές τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες της αντίδρασης. Παραδείγματα ενζυμικά καταλυόμενων κλινικών προσδιορισμών αποτελούν οι χημικές αντιδράσεις 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 και 2.7 παρακάτω. Σύνοψη: Πολύ συχνά ο ποσοτικός προσδιορισμός κάποιου κλινικού αναλύτη επιτυγχάνεται με φωτομέτρηση έγχρωμης ένωσης που παράγεται, σε ένα ή περισσότερα στάδια, όταν ο αναλύτης αντιδράσει με κατάλληλο χρωμογόνο, υπό την κατάλυση ενζύμου ή όχι. Οι συνθήκες της αντίδρασης θα πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη στο κλινικό δείγμα. Σε αρκετές περιπτώσεις δεν είναι δυνατή η παραγωγή έγχρωμης ένωσης κατά την αντίδραση ενός κλινικού αναλύτη σε ένα στάδιο. Στις περιπτώσεις αυτές καταφεύγουμε σε συζευγμένες αντιδράσεις. Συζευγμένη μέθοδος (coupled assay) είναι αυτή όπου μία δεύτερη αντίδραση επιστρατεύεται (συχνά ενζυμικά καταλυόμενη) στην οποία το προϊόν μιας πρώτης αντίδρασης, όπου συμμετέχει ο αναλύτης ως αντιδρών, μετατρέπεται σε έγχρωμη ένωση. Όταν η δεύτερη αντίδραση προχωρά με πολύ ταχύτερο ρυθμό σε σχέση με την πρώτη αντίδραση, ο ρυθμός σχηματισμού του χρώματος είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του αναλύτη που συμμετέχει στην πρώτη αντίδραση. Υπό τις συνθήκες αυτές, η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του συγκεκριμένου κλινικού αναλύτη. Παράδειγμα συζευγμένης μεθόδου που χρησιμοποιείται ευρύτατα στην κλινική ανάλυση για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γλυκόζης είναι η παρακάτω: Παρουσία του ενζύμου οξειδάση της γλυκόζης (Glucose Oxidase ή GOD) η γλυκόζη οξειδώνεται παράγοντας Η 2Ο 2. Το Η 2Ο 2 αντιδρά στη συνέχεια με φαινολικό παράγωγο και 4-αμινοφαιναζόνη και παράγει έγχρωμο προϊόν ερυθρού χρώματος. Η τελευταία αντίδραση καταλύεται από το ένζυμο υπεροξειδάση (Peroxidase ή POD). Γλυκόζη + Η 2Ο + O 2 GOD Γλυκονικό οξύ + 2Η 2Ο 2 (Αντίδραση 2.3) Η 2Ο 2 + φαινολικό παράγωγο + 4-αμινοφαιναζόνη POD έγχρωμο προϊόν + 4 Η 2Ο (Αντίδραση 2.4) Η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος στα 510 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της γλυκόζης στο δείγμα. Σύνοψη: Συχνά για τον ποσοτικό προσδιορισμό κάποιου κλινικού αναλύτη επιστρατεύεται και δεύτερη αντίδραση στην οποία το προϊόν μίας πρώτης αντίδρασης, όπου συμμετέχει ο αναλύτης ως αντιδρών, μετατρέπεται σε έγχρωμη ένωση. Τότε μιλάμε για σύστημα συζευγμένων αντιδράσεων. Οι συνθήκες της συνολικής αντίδρασης θα πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη στο κλινικό δείγμα. Πέραν των έγχρωμων παραγώγων, κοινό προϊόν των αντιδράσεων στις οποίες βασίζονται πολλοί βιοχημικοί προσδιορισμοί αποτελεί το συνένζυμο ΝADH (ή η φωσφορυλιωμένη μορφή του, ΝΑDPH) είτε στη οξειδωμένη NAD(P) +, είτε στην ανηγμένη του μορφή NAD(P)Η. Το ΝΑD(P)H απορροφά στα 340 nm, ενώ η οξειδωμένη μορφή του ΝΑD(P) + δεν απορροφά σε αυτό το μήκος κύματος. Καθώς το ΝΑD(P)H συμμετέχει και στα δύο σκέλη μίας τέτοιας αντίδρασης υφιστάμενο οξείδωση ή αναγωγή, μπορούμε να προσδιορίσουμε τον αναλύτη που μας ενδιαφέρει, καταγράφοντας την αύξηση ή μείωση της απορρόφησης στα 340 nm. Ως παράδειγμα αναφέρεται η εναλλακτική μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της γλυκόζης: Παρουσία του ενζύμου εξοκινάση (Hexokinase ή HK) η γλυκόζη φωσφορυλιώνεται προς 6-φωσφορική γλυκόζη. Η τελευταία με τη βοήθεια του ενζύμου 6-φωσφορική αφυδρογονάση της γλυκόζης (Glucose 6P-dehydrogenase ή G6P-DH) οξειδώνεται με ταυτόχρονη αναγωγή του συνενζύμου NAD + σε NΑDH. 45

47 γλυκόζη +ΑΤP HK γλυκόζη-6p +ADP (Αντίδραση 2.5) γλυκόζη-6p +NAD + G6P DH γλυκoνικό-6p+ ΝADΗ + Η + (Αντίδραση 2.6) Η αύξηση της απορρόφησης στα 340 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της γλυκόζης στο δείγμα. Σύνοψη: Πολύ συχνή στη κλινική ανάλυση είναι και η χρήση ποσοτικών μεθοδολογιών βασισμένων στη μεταβολή της οξειδωτικής κατάστασης του συνενζύμου NAD(P)H. Στις μεθοδολογίες αυτές παρακολουθείται η μεταβολή της απορρόφησης στα 340 nm, όπου απορροφά η ανηγμένη μόνο μορφή του συνενζύμου. Σε αναλογία με ό, τι ειπώθηκε παραπάνω, πολύ λίγα ένζυµα (κλινικού ή μη ενδιαφέροντος) µπορούν να προσδιοριστούν µε άμεσες φωτοµετρικές µεθόδους. Για τα περισσότερα ένζυµα, ο προσδιορισμός τους γίνεται έμμεσα, μέσω της προόδου συγκεκριμένων αντιδράσεων που καταλύουν. Η συγκέντρωση δε του ενζύμου υπολογίζεται από την ταχύτητα της καταλυόμενης αντίδρασης (βλ. Κεφάλαια 1 & 3). Αντίστοιχες αναλυτικές μέθοδοι, απλές ή συζευγμένες, που παράγουν έχρωμη ένωση ή μεταβάλλουν την οξειδωτική κατάσταση του συνενζύμου NAD(P)H χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για τον προσδιορισμό ενζύμων με κλινικό ενδιαφέρον. Ως παράδειγμα αναφέρεται ο προσδιορισμός της δραστικότητας της δεϋδρογονάσης του γαλακτικού οξέος (Lactate Dehydrogenase ή LDH), μέσω της αναγωγής του πυροσταφυλικού οξέος. Πυροσταφυλικό + NADH + H + LDH L-γαλακτικό + NAD + (Αντίδραση 2.7) Ο ρυθμός ελάττωσης της απορρόφησης στα 340 nm (λόγω της οξείδωσης του NADH) είναι ανάλογος της δραστικότητας της LDH στο δείγμα. Όπως αναφέρθηκε, φωτομετρικές μεθοδολογίες χρησιμοποιούνται στη συντριπτική πλειονότητα των βιοχημικών αναλύσεων, κυρίως λόγω της ευρείας διαθεσιμότητας του απαραίτητου εξοπλισμού. Σε μεμονωμένες όμως περιπτώσεις βιοχημικών προσδιορισμών το παραγόμενο προϊόν προσδιορίζεται φθορισμομετρικά, ποτενσιομετρικά, ή αγωγιμομετρικά, ή μέσω της παραγόμενης χημειοφωταύγειας. 2.4 Μεθοδολογίες Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών Για τον ποσοτικό φωτομετρικό προσδιορισμό ενός κλινικού αναλύτη βασιζόμενο σε μία συγκεκριμένη αντίδραση, είναι δυνατόν να εφαρμοστούν δύο εναλλακτικές μεθοδολογίες, η μέθοδος τελικού σημείου και η κινητική μέθοδος (Chang, 2005 Palmer & Bonner, 2007 Pillay, 2014). Στο κεφάλαιο αυτό θα αναπτυχθεί η μέθοδος τελικού σημείου, και στο επόμενο (Κεφάλαιο 3) η κινητική μέθοδος. Στη μέθοδο τελικού σημείου (end point method) η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος μετριέται μόνο σε μία συγκεκριμένη χρονική στιγμή μετά την έναρξη της αντίδρασης. Η μέτρηση γίνεται κατά κανόνα στο τέλος της αντίδρασης, δηλαδή αφού έχει παραχθεί η μέγιστη ποσότητα προϊόντος. Η συγκέντρωση του παραγόμενου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη. Στην κινητική μέθοδο (kinetic method) λαμβάνονται σειρά μετρήσεων και υπολογίζεται ο ρυθμός εξέλιξης μίας αντίδρασης για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενός αναλύτη. Πέραν αυτής της βασικής διαφοράς τους, οι δύο κατηγορίες κλινικών προσδιορισμών διαφέρουν επίσης ως προς τη βαθμονόμηση, όπως κι ως προς τον τρόπο με τον οποίο τα αποτελέσματα επεξεργάζονται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του αναλύτη ενδιαφέροντος. Στο Κεφάλαιο 3 επεξηγείται γιατί η δραστικότητα κάποιου ενζύμου προσδιορίζεται κατά κανόνα με κινητικές μεθόδους. Αντίθετα, στους προσδιορισμούς μη ενζυμικών κλινικών αναλυτών, η κινητική όπως και η μέθοδος τελικού σημείου μπορούν να εφαρμοστούν. 46

48 2.4.1 Μέθοδοι Τελικού Σημείου Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών Βασικές Αρχές Ένα πρωτόκολλο φωτομετρικού προσδιορισμού με μέθοδο τελικού σημείου είναι αυτό της Φωτογραφίας 2.1 κατά τον προσδιορισμό της γλυκόζης στον ορό με το σύστημα των ενζύμων GOD/POD (Αντιδράσεις 2.3, 2.4). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, λαμβάνεται μία τιμή απορρόφησης για κάθε άγνωστο, πρότυπο και για το τυφλό στα 510 nm, μετά από 15 min επώασης στους 37 ο C. Το διάγραμμα μεταβολής της οφειλόμενης στο έγχρωμο προϊόν απορρόφησης με το χρόνο, για τη συγκεκριμένη αντίδραση στους 37 ο C φαίνεται στο Σχήμα 2.2. Είναι φανερό ότι ήδη από τα 9,5 min μετά την έναρξη της αντίδρασης η καμπύλη συσχέτισης παρουσιάζει «πλάτωμα». Αυτό σημαίνει ότι ουσιαστικά δεν υπάρχει πλέον μεταβολή της απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου, δηλαδή δεν συμβαίνει πλέον παραγωγή έγχρωμου προϊόντος. Επομένως, είναι βέβαιο ότι, εάν γίνει μία μέτρηση της απορρόφησης στα 15 min από την έναρξη της αντίδρασης, η λαμβανόμενη απορρόφηση θα αντιστοιχεί στη μέγιστη μετατροπή του αντιδρώντος σε έγχρωμο προϊόν. Σχήμα 2.2 Διάγραμμα μεταβολής της οφειλόμενης στο έγχρωμο προϊόν απορρόφησης με το χρόνο, κατά τον φωτομετρικό προσδιορισμό τελικού σημείου της γλυκόζης στον ορό με το σύστημα των ενζύμων GOD/POD. Η κάθετη διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει τη χρονική στιγμή πέραν της οποίας η καμπύλη συσχέτισης παρουσιάζει «πλάτωμα». Για τη συσχέτιση της μετρούμενης απορρόφησης με τη συγκέντρωση του αναλύτη, σε μία μέθοδο τελικού σημείου, απαιτείται βαθμονόμηση π.χ. με καμπύλη αναφοράς ή χρήση μόνο ενός προτύπου (Harr, 2012). Σύνοψη: Στους προσδιορισμούς μη ενζυμικών κλινικών αναλυτών η κινητική όπως και η μέθοδος τελικού σημείου μπορούν να εφαρμοστούν. Στις φωτομετρικές μεθόδους τελικού σημείου η απορρόφηση μετριέται κατά κανόνα μόνο στο τέλος της αντίδρασης, αφού πλέον δεν παράγεται άλλο προϊόν. Απαιτείται βαθμονόμηση για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Αντίθετα, η δραστικότητα κάποιου κλινικού ενζύμου προσδιορίζεται κατά κανόνα με κινητική μέθοδο. 47

49 Φωτογραφία 2.1 Πρωτόκολλο ανάλυσης που παρέχεται από εταιρία παραγωγής kit προσδιορισμού γλυκόζης με μέθοδο τελικού σημείου βασισμένη στο ενζυμικό σύστημα GOD/POD Βαθμονόμηση Μεθόδων Τελικού Σημείου Καθώς οι μετρήσεις των ενόργανων τεχνικών ανάλυσης είναι σχετικές, απαιτούν τη βαθμονόμηση (calibration) των οργάνων (βλ. Ενότητα 1.13), προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στον ποσοτικό προσδιορισμό κάποιου αναλύτη. Η βαθμονόμηση είναι η διαδικασία που συσχετίζει το μετρούμενο αναλυτικό σήμα (π.χ. απορρόφηση) με τη συγκέντρωση του αναλύτη. Μέσω αυτής, το αναλυτικό σήμα μετατρέπεται σε χημική πληροφορία (συγκέντρωση ή περιεκτικότητα προσδιοριζόμενης ουσίας), όπως στα Σχήματα 2.1 και 2.3. Υπάρχουν πολλοί τύποι βαθμονόμησης (βλ. Ενότητα 1.13). Εδώ θα υπογραμμιστούν και πάλι μόνο τα βασικά βήματα της βαθμονόμησης με χρήση πολλαπλών εξωτερικών προτύπων και κατασκευή καμπύλης αναφοράς (calibration curve method) ή με χρήση ενός μόνο εξωτερικού προτύπου (single external standard method). Αυτές είναι οι δύο κυριότερες μεθοδολογίες που εφαρμόζονται στην καθημερινή πρακτική ενός κλινικού εργαστηρίου για τη βαθμονόμηση, κατά το προσδιορισμό αναλυτών με μεθόδους τελικού σημείου. Η βαθμονόμηση (βλ. Ενότητα ) και στις δύο περιπτώσεις επιτυγχάνεται με διαλύμα(τα) προτύπου(ων) της προσδιοριζόμενης ουσίας, ιδανικά σε μήτρα παραπλήσιας σύστασης με τα δείγματα. Η βαθμονόμηση εδώ προϋποθέτει ότι το μετρούμενο σήμα (π.χ. η απορρόφηση) είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του αναλύτη που προσδιορίζεται. Με τη μέθοδο απλού εξωτερικού προτύπου γίνεται βαθμονόμηση του οργάνου με χρήση ενός μόνο προτύπου, δηλαδή ενός μόνο πειραματικού σημείου, αντί πολλών, σε αντίθεση με τη μέθοδο της καμπύλης αναφοράς. Η βαθμονόμηση με χρήση ενός μόνο εξωτερικού προτύπου προϋποθέτει όχι απλά γραμμική, αλλά και αναλογική σχέση μεταξύ μετρούμενου σήματος/συγκέντρωσης. Αυτό σημαίνει ότι η ευθεία συσχέτισης θα πρέπει να διέρχεται από την αρχή των 48

50 αξόνων. H μέθοδος απλού εξωτερικού προτύπου έχει μικρότερη ακρίβεια από τη μέθοδο της καμπύλης αναφοράς. Σύνοψη: Οι δύο κυριότερες μεθοδολογίες βαθμονόμησης κλινικών προσδιορισμών τελικού σημείου είναι η βαθμονόμηση με χρήση πολλαπλών εξωτερικών προτύπων και κατασκευή καμπύλης αναφοράς, και η βαθμονόμηση με χρήση ενός μόνο εξωτερικού προτύπου. H τελευταία μέθοδος έχει μικρότερη ακρίβεια από τη μέθοδο της καμπύλης αναφοράς Ελαχιστοποίηση της επίδρασης παρεμβαλλόμενων ουσιών στην απορρόφηση Σε ένα φωτομετρικό προσδιορισμό κλινικού βιοχημικού αναλύτη είναι πολύ πιθανόν συστατικά της μήτρας να παρεμβάλλονται, λόγω απορρόφησης ή διάθλασης του φωτός, οδηγώντας σε εσφαλμένα ποσοτικά συμπεράσματα. Η επίδραση των παρεμβολών αυτών λαμβάνεται υπόψη μέσω της φωτομέτρησης τυφλού (blank) και αφαίρεσης της συνεισφοράς του στην απορρόφηση του δείγματος. Το τυφλό είναι όμοιο με το δείγμα που αναλύεται (άγνωστο), με τη διαφορά ότι δεν περιέχει την ουσία που επιθυμούμε να προσδιορίσουμε. Υποβάλλεται επίσης στους ακριβείς πειραματικούς χειρισμούς που υποβάλλεται το προς ανάλυση δείγμα. Επομένως, περιέχει τη μήτρα του δείγματος και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην αναλυτική μέθοδο. Στην καθημερινή εργαστηριακή πράξη όμως δεν είναι πάντοτε διαθέσιμο τυφλό που να αντιστοιχεί απολύτως στη μήτρα. Συχνά ως τυφλό χρησιμοποιείται είτε το πρότυπο 0, είτε φυσιολογικός ορός, είτε απιονισμένο νερό, το οποίο υποβάλλεται στους ακριβείς πειραματικούς χειρισμούς που υποβάλλεται το προς ανάλυση δείγμα. Είναι κατανοητό ότι ένα τέτοιο τυφλό όμως δεν αντικατοπτρίζει επακριβώς τη συνεισφορά της μήτρας. Αυτή η συνεισφορά μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική, π.χ. στην περίπτωση αιμολυμένων ή ικτερικών δειγμάτων, λόγω της απορρόφησης της αιμοσφαιρίνης και χολερυθρίνης αντίστοιχα, στο Vis. Η απορρόφηση της αιμοσφαιρίνης ή χολερυθρίνης καθώς και η θολερότητα σε λιπαιμικά δείγματα είναι οι πιο κοινές παρεμβολές σε κλινικούς φωτομετρικούς προσδιορισμούς. Επίσης μπορεί συστατικά της μήτρας να παρεμβάλλονται στον ποσοτικό προσδιορισμό λόγω αντίδρασης με το χρωμογόνο. Στις περιπτώσεις αυτές είναι δυνατόν να ελαχιστοποιηθεί η συνεισφορά του συστατικού της μήτρας στην ανάπτυξη του μετρούμενου σήματος με την εφαρμογή διχρωματικής ανάλυσης (bichromatic analysis) (Thomas, ejifcc). Στη διχρωματική ανάλυση, η απορρόφηση δειγμάτων και τυφλού μετράται σε δύο μήκη κύματος: Σε μήκος κύματος όπου απορροφούν από κοινού ο αναλύτης ενδιαφέροντος και η παρεμβαλλόμενη ουσία της μήτρας και σε ένα δεύτερο μήκος κύματος, όπου απορροφά μόνο η παρεμβαλλόμενη ουσία. Γνωρίζοντας το μοριακό συντελεστή απόσβεσης της ουσίας στο δεύτερο μήκος κύματος, μπορούμε να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση αυτής. Στη συνέχεια με βάση το μοριακό συντελεστή απόσβεσης αυτής στο πρώτο μήκος κύματος, όπου απορροφούν από κοινού αναλύτης και παρεμβαλλόμενη ουσία, είναι δυνατόν να υπολογιστεί η οφειλόμενη στην παρεμβολή απορρόφηση. Ακολούθως, υπολογίζεται και η καθαρή συνεισφορά του αναλύτη στην απορρόφηση. Π.χ. διχρωματική ανάλυση εφαρμόζεται κατά τον προσδιορισμό της νεογνικής χολερυθρίνης μέσω της απορρόφησης αυτής στα 452 nm. Η διχρωματική ανάλυση εφαρμόζεται για την ελαχιστοποίηση της επίδρασης της αιμοσφαιρίνης που επίσης απορροφά στα 452 nm. Το δεύτερο μήκος κύματος όπου παρακολουθείται η απορρόφηση είναι τα 540 nm, εκεί όπου εμφανίζεται η εκλεκτική απορρόφηση της αιμοσφαιρίνης. Μάλιστα, επειδή ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης της αιμοσφαιρίνης στα 452 nm και στα 540 nm είναι πολύ αντίστοιχος, ο προσδιορισμός της χολερυθρίνης γίνεται απευθείας στα 452 nm μετά από μηδενισμό του φωτόμετρου με το τυφλό στα 540 nm. Αντίστοιχη είναι η έννοια και η χρήση της πολυχρωματικής ανάλυσης, όπου η απορρόφηση δειγμάτων και τυφλού μετράται σε περισσότερα από δύο μήκη κύματος. Η τεχνική της διχρωματικής (ή πολυχρωματικής) ανάλυσης δυστυχώς δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε κάθε περίπτωση παρεμβολών της μήτρας, λόγω έλλειψης περιοχής του UV/Vis, όπου απορροφά εκλεκτικά η παρεμβαλλόμενη ουσία. Σε τέτοιες περιπτώσεις η ελαχιστοποίηση των παρεμβολών επιτυγχάνεται με εναλλακτικές τεχνικές, όπως με καταβύθιση της παρεμβαλλόμενης ουσίας ή μέσω (ενζυματικής ή χημικής) μετατροπής αυτής. Η καταβύθιση επιτυγχάνεται για παράδειγμα με υπερφυγοκέντρηση, στην περίπτωση λιπαιμικών δειγμάτων, ή με χημική καταβύθιση σε άλλες περιπτώσεις. Τέτοιο παράδειγμα, αποτελεί η μετατροπή της παρεμβαλλόμενης στον προσδιορισμό της κρεατινίνης, χολερυθρίνης, σε παράγωγο αυτής μετά από κατεργασία με άλκαλι ή με θειοκυανιούχο σίδηρο. Το σχηματιζόμενο παράγωγο δεν απορροφά πλέον σε 49

51 μήκος κύματος, που παρεμβάλλεται στον προσδιορισμό της κρεατινίνης (O Leary et al., 1992 Vaishya et al., 2010). Τέλος, η χρήση κινητικών μεθόδων προσδιορισμού αντί μεθόδων τελικού σημείου, μπορεί να ελαχιστοποιήσει τη συνεισφορά της παρεμβαλλόμενης ουσίας. Σε μία κινητική μέθοδο ο σχηματισμός του έγχρωμου προϊόντος παρακολουθείται επί πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, όπου (ανάλογα με την περίπτωση) είναι δυνατόν η οποιαδήποτε συνεισφορά της παρεμβαλλόμενης ουσίας στην ανάπτυξη του έγχρωμου προϊόντος να είναι αμελητέα. Επίσης, καθώς σε μία κινητική μέθοδο υπολογίζεται η μεταβολή της απορρόφησης με το χρόνο, η συνεισφορά της μήτρας στην απορρόφηση ακυρώνεται, εάν βέβαια η απορρόφηση της μήτρας δε μεταβάλλεται με το χρόνο Πειραματική διαδικασία ποσοτικού Φωτομετρικού κλινικού προσδιορισμού Τελικού Σημείου Η πειραματική διαδικασία ποσοτικού φωτομετρικού κλινικού προσδιορισμού τελικού σημείου περιλαμβάνει τα παρακάτω γενικά στάδια: Α. Εφαρμόζεται η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού του κλινικού αναλύτη, όπως ακριβώς περιγράφεται στο πρωτόκολλο, για το τυφλό, τα πρότυπα και το άγνωστο. Β. Το φωτόμετρο μηδενίζεται με απιονισμένο νερό και λαμβάνονται οι μετρήσεις απορρόφησης του αγνώστου, του τυφλού και των προτύπων. Η μέτρηση του τυφλού δε θα πρέπει να είναι υψηλότερη συγκεκριμένης, δεδομένης από το πρωτόκολλο τιμής. Στην αντίθετη περίπτωση, τα αντιδραστήρια εργασίας που εμπεριέχονται στο τυφλό απορρίπτονται. Αυτό, διότι μία τέτοια υψηλή τιμή για το τυφλό είναι ενδεικτική αλλοίωσης των αντιδραστηρίων εργασίας π.χ. λόγω επιμόλυνσής τους με τον προσδιοριζόμενο αναλύτη. Ανάλογα με την εφαρμοζόμενη μέθοδο βαθμονόμησης ακολουθούνται τα βήματα Γ και Δ ή το βήμα Ε. Γ. Βαθμονόμηση με μέθοδο καμπύλης αναφοράς: Κατασκευάζεται στη συνέχεια η γραφική παράσταση του λαμβανόμενου σήματος (απορρόφησης) (άξονας ψ) με τη συγκέντρωση του αναλύτη στα πρότυπα (άξονας χ), δηλαδή η καμπύλη αναφοράς. Η μέτρηση του τυφλού πρέπει να αφαιρεθεί από τη μέτρηση των προτύπων πριν κατασκευαστεί η καμπύλη αναφοράς. Εφαρμόζεται η μέθοδος των ελαχίστων τετραγώνων (βλ. Ενότητα 1.17) και υπολογίζεται η γραμμική εξίσωση συσχέτισης απορρόφησης/συγκέντρωσης: y = αx+ β. Δ. Από την τιμή του σήματος του αγνώστου επίσης αφαιρείται η τιμή του τυφλού. Εάν η προκύπτουσα τιμή σήματος (απορρόφησης) αντιστοιχεί στη δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων της καμπύλης, η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο μπορεί να προσδιοριστεί με τη βοήθεια της εξίσωσης παλινδρόμησης. Προσοχή: Εάν η τιμή της απορρόφησης του αγνώστου αντιστοιχεί εκτός της δυναμικής περιοχής συγκεντρώσεων στην καμπύλη αναφοράς, γίνεται αραίωση του αρχικού δείγματος. Εφαρμόζεται εκ νέου το πρωτόκολλο της μεθόδου στο αραιωμένο δείγμα, μέχρις ότου η τιμή του μετρούμενου σήματος (απορρόφησης) αντιστοιχεί εντός της δυναμικής περιοχής συγκεντρώσεων της καμπύλης. Υπολογίζεται τότε η συγκέντρωση του αραιωμένου δείγματος με βάση την καμπύλη αναφοράς και πολλαπλασιάζεται επί τον συντελεστή αραίωσης για να υπολογιστεί η συγκέντρωση του μη αραιωμένου δείγματος. Ας υποθέσουμε ότι κατά τον φωτομετρικό προσδιορισμό κάποιου αναλύτη μετρήθηκαν οι απορροφήσεις των προτύπων, του τυφλού (Α τυφλού = 0,05) και του άγνωστου (Α Αγνώστου = 0,65), και ότι υπολογίστηκε η εξίσωση παλινδρόμησης της απορρόφησης ως προς τη συγκέντρωση του αναλύτη. Ο υπολογισμός της εξίσωσης παλινδρόμησης έγινε όπως περιγράφηκε στην Ενότητα 1.17, λαμβάνοντας υπόψη μόνο τα σημεία αυτά, όπου είναι εμφανής η γραμμική συσχέτιση μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αναλύτη. Στο παράδειγμα του Σχήματος 2.3 δε λήφθηκαν υπόψη τα σημεία για συγκεντρώσεις αναλύτη > 10 mg/ml. Η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο δείγμα ([Άγνωστο]) υπολογίζεται αντικαθιστώντας στην εξίσωση της ευθείας όπου y = Α Άγνωστο-Α Τυφλό και όπου x = [Άγνωστο]: y = 0,0789 x + 0,0265 => (Α Άγνωστο - Α Τυφλό) = 0,0789 [Άγνωστο] + 0,0265 => [Άγνωστο] = (0,65-0,05 0,0265)/0,0789 => [Άγνωστο] = 0,5735/0,0789 => [Άγνωστο] = 7,27 mg/ml 50

52 Σχήμα 2.3 Ευθεία παλινδρόμησης που κατασκευάσθηκε με χρήση πολλαπλών εξωτερικών προτύπων. Στην κατασκευή της δεν λήφθηκαν υπόψη τα σημεία για συγκεντρώσεις αναλύτη > 10 mg/ml. Η εξίσωση της ευθείας και ο συντελεστής συσχέτισης R 2 σημειώνονται. Βλέπουμε, ότι το τετράγωνο του συντελεστή συσχέτισης για την εξίσωση παλινδρόμησης του Σχήματος 2.3 πλησιάζει πολύ κοντά στη μονάδα, το οποίο καταδεικνύει πολύ καλή γραμμική συσχέτιση απορρόφησης/συγκέντρωσης για την περιοχή των συγκεντρώσεων που εξετάσθηκαν. Εάν ληφθούν υπόψη και τα σημεία για συγκεντρώσεις αναλύτη > 10 mg/ml, η υπολογιζόμενη τιμή R 2 μειώνεται σε R 2 = 0,9819. Ο χαμηλότερος συντελεστής συσχέτισης υποδεικνύει φτωχότερη συσχέτιση. Γενικά στοχεύουμε να έχουμε τιμές R 2 > 0,99, προκειμένου η ακρίβεια υπολογισμού να είναι αποδεκτή. Ε. Βαθμονόμηση με μέθοδο απλού εξωτερικού προτύπου: Εάν χρησιμοποιείται μόνο ένα εξωτερικό πρότυπο με συγκέντρωση αναλύτη [Πρότυπο], τότε η συγκέντρωση του αναλύτη στο Άγνωστο ([Άγνωστο]) προσδιορίζεται με βάση τη σχέση: [Άγνωστο]= Α Αγνώστου Α Τυφλού Α Προτύπου Α Τυφλού x [Πρότυπο] (Εξίσωση 2.1) όπου Α Αγνώστου, Α Προτύπου και Α Τυφλού οι τιμές απορρόφησης που μετρήθηκαν για το Άγνωστο, το Πρότυπο και το Τυφλό αντίστοιχα. Έτσι π.χ. εάν μετρήθηκαν οι απορροφήσεις Α Τυφλού = 0,1, Α Αγνώστου = 1,1, Α Προτύπου = 0,6 και είναι γνωστό ότι [Πρότυπο] = 50 mg/dl, τότε η συγκέντρωση του αναλύτη στο Άγνωστο θα είναι: [Άγνωστο]= 1,1 0,1 x 50 (mg/ dl)= 100 mg/ dl (Εξίσωση 2.2) 0.6 0,1 Εάν η τιμή του σήματος (απορρόφησης) αντιστοιχεί εκτός της περιοχής γραμμικής συσχέτισης (αναφέρεται ως «γραμμικότητα» στο πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 2.1), γίνεται αραίωση του αρχικού δείγματος. Εφαρμόζεται εκ νέου το πρωτόκολλο της μεθόδου στο αραιωμένο δείγμα, μέχρις ότου η τιμή της απορρόφησης του αραιωμένου δείγματος αντιστοιχεί εντός της περιοχής γραμμικής συσχέτισης. Στη συνέχεια, υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του αραιωμένου δείγματος και λαμβάνουμε υπόψη τον συντελεστή αραίωσης, για να υπολογιστεί η συγκέντρωση του μη αραιωμένου δείγματος. Εξυπακούεται, ότι και στις δύο περιπτώσεις βαθμονόμησης, η ακρίβεια της μέτρησης βασίζεται στην ακρίβεια των συγκεντρώσεων των προτύπων και στο κατά πόσο πανομοιότυπη είναι η μήτρα των προτύπων με τη μήτρα του αγνώστου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μία διαφορά στη μήτρα μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικά αναλυτικά σφάλματα. 51

53 Σύνοψη: Κατά τον φωτομετρικό κλινικό προσδιορισμό τελικού σημείου εφαρμόζεται η μέθοδος στο τυφλό, τα(ο) πρότυπα(ο) και το άγνωστο. Η μέτρηση του τυφλού δε θα πρέπει να είναι υψηλότερη συγκεκριμένης, δεδομένης από το πρωτόκολλο τιμής. Η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο υπολογίζεται κατόπιν βαθμονόμησης. Εάν η τιμή της απορρόφησης του αγνώστου αντιστοιχεί εκτός της δυναμικής περιοχής συγκεντρώσεων της καμπύλης αναφοράς, ή εκτός της περιοχής γραμμικής συσχέτισης σε βαθμονόμηση με χρήση ενός προτύπου, γίνεται αραίωση του αρχικού δείγματος. Εφαρμόζεται εκ νέου το πρωτόκολλο της μεθόδου στο αραιωμένο δείγμα. Υπολογίζεται η συγκέντρωση του αρχικού, μη αραιωμένου, δείγματος, λαμβάνοντας υπόψη τον συντελεστή αραίωσης Πρωτόκολλο ανάλυσης Φωτομετρικού προσδιορισμού Τελικού Σημείου Το πρωτόκολλο ανάλυσης (analytical protocol) αποτελεί μία λεπτομερή περιγραφή της πορείας ενός συγκεκριμένου προσδιορισμού που είναι πλήρως προδιαγεγραμμένη και εγκεκριμένη. Η περιγραφή αυτή περιλαμβάνει μία σειρά πληροφοριών που αναφέρονται παρακάτω. Ας θεωρήσουμε ότι ο προσδιορισμός του μορίου κλινικού ενδιαφέροντος Α βασίζεται στο παρακάτω ενζυματικά καταλυόμενο σύστημα μετατροπών: Α + Β E 1, Mg +2 Γ (Αντίδραση 2.8) Γ + Ζ Ε 2 Έγχρωμο προϊόν (Αντίδραση 2.9) Όπου η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του Α. Αυτό το γενικό σχήμα ακολουθεί π.χ. το σύστημα των συζευγμένων αντιδράσεων, που εκμεταλλευόμαστε στον ποσοτικό προσδιορισμό γλυκόζης (Αντιδράσεις 2.3, 2.4). Γλυκόζη + Η 2Ο + O 2 GOD Γλυκονικό οξύ + 2Η 2Ο 2 (Αντίδραση 2.3) Η 2Ο 2 + φαινολικό παράγωγο + 4-αμινοφαιναζόνη POD έγχρωμο προϊόν + 4Η 2Ο (Αντίδραση 2.4) Στη Φωτογραφία 2.1 παρουσιάστηκε το πρωτόκολλο του προσδιορισμού της γλυκόζης κατά το σύστημα των συζευγμένων Aντιδράσεων 2.3 και 2.4, με χρήση kit, που περιέχει όλα τα απαραίτητα αντιδραστήρια και πρότυπα. Από το πρωτόκολλο και την παραπάνω συζευγμένη αντίδραση γίνεται φανερό ότι προκειμένου να παραχθεί το έγχρωμο προϊόν, απαιτείται η επώαση του κλινικού δείγματος που εμπεριέχει τον αναλύτη ενδιαφέροντος (ενζυμικό υπόστρωμα (Α ή γλυκόζη) σε περιβάλλον (διάλυμα) που περιέχει: Ένζυμα (Ε1, Ε2 στο γενικό παράδειγμα, ή GOD και POD στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο): Μπορεί να είναι φυτικής, ζωικής ή βακτηριακής προέλευσης, φυσικά ή γενετικά τροποποιημένα. Συμπαράγοντες, ενεργοποιητές, ιόντα: Δεν καταναλώνονται κατά την αντίδραση, όμως την επιταχύνουν πολύ σημαντικά, π.χ. ιόντα Mg ++ χρησιμοποιούνται στο συγκεκριμένο γενικό παράδειγμα. Άλλα αντιδρώντα: Το B στο γενικό παράδειγμά μας (ή τα Η 2Ο + O 2 στο πρωτόκολλο). Αυτό σημαίνει ότι η αντίδραση οξείδωσης της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ πρέπει να γίνει υπό αερόβιες συνθήκες και σε υδατικό περιβάλλον. Το αερόβιο και υδατικό περιβάλλον είναι προφανώς εξασφαλισμένα σε κάθε κλινικό προσδιορισμό, οπότε για τον προσδιορισμό της γλυκόζης με GOD/POD δεν χρειάζεται κάποιο άλλο αντιδρών. Χρωμογόνο: Η ουσία η οποία κατά την αντίδραση θα μετατραπεί σε έγχρωμο προϊόν. Το Ζ στο γενικό παράδειγμα μας (ή το ζεύγος φαινολικό παράγωγο + 4-αμινοφαιναζόνη στο πρωτόκολλο). Ρυθμιστικό διάλυμα: με σκοπό τη διατήρηση σταθερού ph και ιοντικής ισχύος, ώστε η ενζυματική μετατροπή(ες) να εκτυλίσσεται υπό τις βέλτιστες συνθήκες. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο ρυθμιστικό διάλυμα 0,2 Μ ph 8,0 χρησιμοποιείται. Tα χρωμογόνο, ένζυμο, ρυθμιστικό διάλυμα, συμπαράγοντες και άλλα τυχόν απαιτούμενα αντιδρώντα αποτελούν τα συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας (Working Reagent ή WR). Πολύ συχνά 52

54 τα ασταθή επιμέρους συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας εμπεριέχονται σε ξεχωριστά φιαλίδια και αναμιγνύονται αμέσως πριν την εκτέλεση της αντίδρασης. Αυτό γίνεται προκειμένου να αποφευχθεί η αλλοίωση ή η κατανάλωση αυτών (π.χ. μέσω της οξείδωσής τους ή γενικότερα της αντίδρασής τους, ή της καταβύθισής τους, μετουσίωσής τους κ.λπ.). Μία τέτοια αλλοίωση θα είχε ως αποτέλεσμα είτε τη μη εκλεκτική ανάπτυξη χρώματος στο τυφλό (δηλαδή την ανάπτυξη χρώματος απουσία του αναλύτη), είτε την αδυναμία ανάπτυξης χρώματος σύμφωνα με τις προκαθορισμένες συνθήκες, παρουσία του αναλύτη. Το πρωτόκολλο μίας κλινικής ανάλυσης τελικού σημείου καθορίζει τα παρακάτω: 1. Την επακριβή σύσταση του διαλύματος εργασίας. 2. Τη τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία του δείγματος, ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο προσδιορίζεται ο αναλύτης. 3. Τη τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία στο αντιδραστήριο εργασίας πριν τη χρήση του (π.χ. ανασύσταση, αραίωση, επαναιώρηση, ανάμιξη κ.λπ.). Στο πρωτόκολλο προσδιορισμού του σακχάρου τα ένζυμα (GOD και POD) φυλάσσονται πριν την αντίδραση μαζί λυοφιλοποιημένα σε ξεχωριστό φιαλίδιο. Απαιτείται η ανασύσταση των ενζύμων με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει όλα τα υπόλοιπα συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας. 4. Τη θερμοκρασία επώασης για το κάθε στάδιο. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 37 ο C. 5. Το χρόνο επώασης, δηλαδή σε πόσο χρόνο μετά την έναρξη της αντίδρασης θα πρέπει να γίνει η καταγραφή της απορρόφησης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 10 ή 15 min, ανάλογα με το kit. 6. Το μήκος κύματος καταγραφής της απορρόφησης. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο είναι 510 nm. 7. Τη συγκέντρωση των (του) προτύπων (προτύπου). Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται ένα εξωτερικό πρότυπο με συγκέντρωση 100 mg γλυκόζης/dl. 8. Τις τιμές αναφοράς για τον συγκεκριμένο κλινικό αναλύτη ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο προσδιορίζεται. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο είναι mg γλυκόζης/dl ορού. Διαφορετικά, οι τιμές αναφοράς εκφράζονται ως 3,89-6,67 mmol γλυκόζης/l ορού. 9. Τις μαθηματικές σχέσεις υπολογισμού της άγνωστης συγκέντρωσης του αναλύτη. 10. Άλλους παράγοντες που αφορούν την εκτέλεση της αντίδρασης ανάπτυξης του έγχρωμου προϊόντος π.χ τη σειρά ανάμιξης των επιμέρους αντιδραστηρίων και τους χρησιμοποιούμενους όγκους αντιδραστηρίων και δείγματος για το πρότυπο, δείγμα και τυφλό. Αυτοί φαίνονται αναλυτικά στον πίνακα του πρωτοκόλλου. 11.Πιο ειδικές πληροφορίες π.χ. τυχόν παρεμποδίσεις και τρόπους αναίρεσης αυτών, σχετικές βιβλιογραφικές μελέτες κ.α. 12.Τους χρόνους ζωής των επιμέρους αντιδραστηρίων και τη σταθερότητα του παραγόμενου έγχρωμου προϊόντος. Στο πρωτόκολλο αναφέρεται ότι το διάλυμα εργασίας είναι σταθερό για 45 ημέρες στους 2-10 ο C. Επίσης αναφέρεται εκεί, ότι το παραγόμενο έγχρωμο προϊόν είναι σταθερό επί 2 ώρες. 13.Τη σταθερότητα του προσδιοριζόμενου αναλύτη, ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο προσδιορίζεται ο αναλύτης. Αναφέρεται στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο ότι η γλυκόζη είναι σταθερή στον ορό επί 7 ημέρες, στους 2-10 ο C. 14.Τα τεχνικά χαρακτηριστικά της μεθόδου, όπως το εύρος γραμμικότητας μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αναλύτη, το όριο ανίχνευσης, την επαναληπτικότητα και αναπαραγωγιμότητα. 2.5 Πειραματικό Μέρος Προσδιορισμός γλυκόζης με μέθοδο Τελικού Σημείου Ως πειραματικό παράδειγμα κλινικού ενζυμικού προσδιορισμού με μέθοδο τελικού σημείου θα περιγραφεί ο προσδιορισμός της γλυκόζης, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 2.1. Αναλυτική παρουσίαση του πρωτοκόλλου και της μεθοδολογίας προσδιορισμού και υπολογισμού της συγκέντρωσης της γλυκόζης στο άγνωστο έγινε στις προηγούμενες παραγράφους. Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 3,5 ml αντιδραστηρίου εργασίας. Ο σωλήνας πωματίζεται και προθερμαίνεται σε υδρόλουτρο στους 37 ο C. Εάν δεν υπάρχει η δυνατότητα προθέρμανσης στους 37 ο C, επισημαίνεται ότι το αντιδραστήριο εργασίας θα πρέπει να έχει έρθει τουλάχιστον σε θερμοκρασία δωματίου πριν την έναρξη της επώασης με το τυφλό, άγνωστο και πρότυπο. Μετά την προθέρμανση, σε έναν νέο δοκιμαστικό σωλήνα προστίθεται ο ορός (10 μl). Σε δεύτερο σωλήνα προστίθεται 10 μl προτύπου, ενώ σε τρίτο δοκιμαστικό σωλήνα 10 μl απιονισμένου νερού. Και στους 53

55 τρεις σωλήνες προστίθεται αμέσως μετά 1 ml από το προθερμασμένο αντιδραστήριο εργασίας. Οι σωλήνες πωματίζονται και ακολουθεί ανάμιξη. Οι τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες επωάζονται σε υδρόλουτρο στους 37 ο C. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Σύμφωνα με τη σύσταση του κατασκευαστή του kit, η καταγραφή της απορρόφησης πρέπει να γίνει σε 10 min ή 15 min μετά την έναρξη της αντίδρασης. Στον κατάλληλο χρόνο οι σωλήνες αποσύρονται από το υδρόλουτρο, επαναφέρονται σε θερμοκρασία δωματίου και φωτομετρείται το περιεχόμενο τους στα 510 nm. Απιονισμένο νερό χρησιμοποιείται για το μηδενισμό του φωτόμετρου. Οι τιμές της απορρόφησης που μετρήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 2.1. Είναι σημαντικό η μέτρηση της απορρόφησης για το τυφλό, πρότυπο και δείγμα να γίνει στο ίδιο μήκος κύματος και χρησιμοποιώντας κυψελίδα με ίδιο μήκος διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος. Δείγμα Α (510 nm) Τυφλό 0,020 Πρότυπο 0,556 Άγνωστο 0,612 Πίνακας 2.1 Μετρήσεις απορρόφησης που λαμβάνονται στο τελικό σημείο κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό γλυκόζης με μέθοδο GOD/POD, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 2.1. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του αγνώστου γίνεται στη συνέχεια σύμφωνα με την Eξίσωση 2.1. Aντικαθιστώντας τις τιμές του Πίνακα 2.1 έχουμε: [Άγνωστο]= 0,612 0,020 x 100 mg/ dl = 110 mg/dl 0,556 0,020 Καθώς οι τιμές αναφοράς της γλυκόζης στον ορό σύμφωνα με το πρωτόκολλο είναι mg/dl, συμπεραίνουμε πως το δείγμα μας είναι φυσιολογικό (διεθνώς οι τιμές αναφοράς έχουν αναθεωρηθεί σε mg/dl). 54

56 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Μέθοδος φωτομετρίας τελικού σημείου. Επιδεικνύεται ο προσδιορισμός της γλυκόζης με τη μέθοδο οξειδάσης της γλυκόζης, Σχετικό οπτικό υλικό στο διαδίκτυο Λειτουργία ημιαυτόματου φωτόμετρου: (τελευταία προσπέλαση: 1/7/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση: 1/1/2015). Αναφορές 1. BAIS, R. & PHILCOX, M. (1994) Approved recommendation on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 8. IFCC method for lactate dehydrogenase. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 32, p BURTIS, A. & ASHWOOD, E.R. (2015) Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. Εds. 7th Edition, Philadelphia: WB Saunders. 3. CHANG, R. (2005) Physical Chemistry for the Biosciences. California: University Science Books. 4. HARR, R. (2012) Medical Laboratory Science Review. 4 th Edition, Philadelphia: F. A. Davis Company. 5. MATHIEU, M., ARTUR, Y., AUDRY, A., BAILLY, M., BRAUN, J.P., BRETAUDIERE, J.P., et al.. (1982) Recommendations for determining the catalytic concentration of lactate dehydrogenase in human serum at +30 C. Ann Biol Clin, 40, p MCPHERSON, A. & PINCUS, R. (2011) Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Philadelphia: Elsevier-Saunders. 55

57 7. O LEARY, N., PEMBROKE A., DUGGAN, F. (1992) A simplified procedure for eliminating the negative interference of bilirubin in the Jaffe reaction for creatinine. Clin Chem, 38, p PALMER, T. & BONNER, P. (2007) Enzymes: Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry. Cambridge: Woodhead Publishing Ltd. 9. PILLAY, S. (2014) Practical Clinical Chemistry: Core Concepts. A training Manual. itunes book. 10. STANDARDIZATION COMMITTEE OF THE GERMAN SOCIETY FOR CLINICAL CHEMISTRY, ENZYME WORKING GROUP OF THE GERMAN SOCIETY FOR CLINICAL CHEMISTRY. (1993) Recommendation for the determination of the catalytic concentration of lactate dehydrogenase at 37 degrees C. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 31, p THOMAS, L. Haemolysis as influence and interference factor, ejifcc 13(4) Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση: 1/1/2015). 12. VAISHYA, R., ARORA, S., SINGH, B., MALLIKA, V., (2010) Modification of Jaffe s kinetic method decreases bilirubin interference: A preliminary report. Ind J Clin Biochem, 25, p

58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 o KINHTIKOI ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΩΝ - ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό γίνεται μία εισαγωγή στις βασικές έννοιες της χημικής και ενζυμικής κινητικής, προκειμένου να γίνει κατανοητή η μεθοδολογία που εφαρμόζεται στους κινητικούς φωτομετρικούς προσδιορισμούς κλινικών αναλυτών. Η μεθοδολογία αυτή παρουσιάζεται στη συνέχεια λεπτομερώς, σε ό, τι αφορά στα πεδία εφαρμογής της, τα πειραματικά στάδια της, τον τρόπο βαθμονόμησης, την ανάγκη ανάλυσης τυφλού δείγματος, τα χαρακτηριστικά του πρωτοκόλλου της και τους εμπλεκόμενους υπολογισμούς. Υπογραμμίζονται οι διαφορές της κινητικής μεθόδου σε σχέση με τη μέθοδο του τελικού σημείου και καταγράφονται τα πλεονεκτήματα της πρώτης. Προαπαιτούμενες γνώσεις Απαιτείται η μελέτη του Κεφαλαίου 1, ειδικά σε ό, τι αφορά στις αρχές φωτομετρίας και βαθμονόμησης και τις έννοιες δείγματος, τυφλού και προτύπου. Απαιτείται επίσης, η μελέτη των κριτηρίων επιλογής μιας αναλυτικής μεθοδολογίας και των φωτομετρικών αναλυτικών μεθόδων στην κλινική ανάλυση, καθώς και των αρχών κλινικών φωτομετρικών προσδιορισμών τελικού σημείου, που αναπτύχθηκαν στο Κεφάλαιο 2. Τέλος, οι βασικές γνώσεις χημικής κινητικής, ενζυμολογίας και ενζυμικής κατάλυσης θεωρούνται απαραίτητες για την κατανόηση του Κεφαλαίου Εισαγωγή Τα κριτήρια με τα οποία μια αναλυτική μεθοδολογία αξιολογείται και επιλέγεται στον ποσοτικό προσδιορισμό κάποιου αναλύτη παρουσιάστηκαν ήδη στα Κεφάλαια 1 και 2. Αναφέρθηκε επίσης, ότι καθώς οι φωτομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού είναι οι πλέον εύχρηστες, γρήγορες, και απαιτούν κοινό εργαστηριακό εξοπλισμό, βρίσκουν ευρύτατη εφαρμογή στην κλινική βιοχημική ανάλυση. Πολύ συχνά ο ποσοτικός προσδιορισμός κάποιου κλινικού αναλύτη (συστατικού) επιτυγχάνεται με φωτομέτρηση έγχρωμης ένωσης που παράγεται, σε ένα ή περισσότερα στάδια, όταν ο αναλύτης αντιδράσει με κατάλληλο χρωμογόνο. Οι συνθήκες της αντίδρασης θα πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη στο κλινικό δείγμα. Επίσης, πολύ συχνή στην κλινική βιοχημεία είναι και η χρήση ποσοτικών μεθοδολογιών βασιζόμενων στη μεταβολή της οξειδωτικής κατάστασης του συνενζύμου NAD(P)H. Στις μεθοδολογίες αυτές παρακολουθείται η μεταβολή της απορρόφησης στα 340 nm, όπου απορροφά η ανηγμένη μόνο μορφή του συνενζύμου, δηλαδή η NAD(P)H. Αναφέρθηκε επίσης, στο Κεφάλαιο 2 ότι για τον ποσοτικό φωτομετρικό προσδιορισμό ενός κλινικού βιοχημικού αναλύτη, είναι δυνατόν να εφαρμοστούν δύο εναλλακτικές μεθοδολογίες, η μέθοδος του τελικού σημείου και η κινητική μέθοδος. Η κινητική μέθοδος ανάλυσης θα παρουσιαστεί αναλυτικά στη συνέχεια. Στην κινητική μέθοδο (kinetic method) λαμβάνονται σειρά μετρήσεων και υπολογίζεται ο ρυθμός εξέλιξης μίας αντίδρασης που είναι ανάλογος της συγκέντρωσης ενός αναλύτη. Αντίθετα, στη μέθοδο τελικού σημείου λαμβάνεται μόνο μία μέτρηση, όταν πλέον δεν παράγεται περισσότερο προϊόν. Η συγκέντρωση του παραγόμενου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη. Πέραν αυτής της βασικής διαφοράς τους, οι δύο κατηγορίες κλινικών προσδιορισμών διαφέρουν επίσης, ως προς τη βαθμονόμηση, όπως και τον τρόπο με τον οποίο τα αποτελέσματα επεξεργάζονται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του αναλύτη (Pardue, 1977). Πριν την αναλυτική παρουσίαση της κινητικής μεθόδου θα πρέπει να περιγραφούν κάποιες απαραίτητες εισαγωγικές έννοιες. 57

59 3.2 Βασικές αρχές Χημικής και Ενζυμικής Κινητικής Χημική Κινητική Η ταχύτητα μίας χημικής αντίδρασης (reaction velocity, v) ορίζεται ως η μεταβολή της συγκέντρωσης ενός εκ των συστατικών της αντίδρασης, στη μονάδα του χρόνου. Η ταχύτητα μιας αντίδρασης ισούται δηλαδή με τον ρυθμό μεταβολής της συγκέντρωσης των αντιδρώντων ή των προϊόντων αυτής. Για μια αντίδραση της γενικής μορφής: aα + bβ cγ (Αντίδραση 3.1) όπου Α και Β είναι τα αντιδρώντα της αντίδρασης και Γ είναι το προϊόν αυτής, η ταχύτητα της αντίδρασης μπορεί να εκφραστεί ως: v= 1 a Δ[Α] Δt = 1 b Δ[Β] = 1 Δ[Γ] Δt c Δt (Εξίσωση 3.1) Το αρνητικό πρόσημο εμφανίζεται λόγω της μείωσης της συγκέντρωσης των αντιδρώντων συναρτήσει του χρόνου, και χρησιμοποιείται, ώστε η ταχύτητα να λάβει θετικές τιµές. H ταχύτητα της ίδιας αντίδρασης έχει αποδειχτεί ότι ισούται με: v= k [A] a [B] b (Εξίσωση 3.2) όπου k είναι σταθερά, η οποία εξαρτάται από όλους τους άλλους παράγοντες που επηρεάζουν την ταχύτητα (ph, θερμοκρασία, ενεργοποιητές κ.α.), εκτός από τις συγκεντρώσεις. Ονομάζεται σταθερά της ταχύτητας της αντίδρασης ή ειδική ταχύτητα της αντίδρασης (rate constant). Η Εξίσωση 3.2 αποτελεί έκφραση του νόμου της ταχύτητας μιας αντίδρασης (rate law). Οι συντελεστής a ονομάζεται τάξη της αντίδρασης (reaction order) ως προς Α, ενώ ο b τάξη της αντίδρασης ως προς Β. Το άθροισμα των εκθετών των συγκεντρώσεων των αντιδρώντων του νόμου της ταχύτητας, n = a + b, ονομάζεται συνολική τάξη της αντίδρασης. Η τάξη μίας αντίδρασης ως προς το κάθε αντιδρών προσδιορίζεται πειραματικά και δεν ταυτίζεται πάντοτε με τον στοιχειομετρικό συντελεστή του κάθε αντιδρώντος στην Αντίδραση 3.1. Ως παράδειγμα, η αντίδραση: 2NO + O 2 2NO 2 (Αντίδραση 3.2) με πειραματικά προσδιοριζόμενη ταχύτητα αντίδρασης v = k [ΝΟ] 2 [Ο 2] είναι 2 ης τάξης (second order) ως προς ΝΟ και 1 ης (first order) ως προς Ο 2. Ετσι η συνολική τάξη της αντίδρασης είναι n = = 3. Η ταχύτητα μίας αντίδρασης δεν είναι σταθερή, αλλά μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Έτσι, έχει νόημα να μιλάμε για τη στιγμιαία ταχύτητα μίας αντίδρασης (instantaneous rate of reaction). Στην αρχή της αντίδρασης η ταχύτητα είναι η µέγιστη και σταθερή, αλλά ελαττώνεται µε την πάροδο του χρόνου, μέχρι να μηδενιστεί στο τέλος της αντίδρασης. H φάση της αντίδρασης, όπου υπάρχει γραμμική σχέση μεταξύ συγκέντρωσης προϊόντος και χρόνου ονομάζεται γραμμική περιοχή (linear range) ή φάση σταθεροποιημένης κατάστασης (steady-state phase) και σημειώνεται με σκίαση στο Σχήμα 3.1. Η προοδευτική μείωση της ταχύτητας οφείλεται στη μείωση της συγκέντρωσης των αντιδρώντων, αλλά και στην αύξηση της συγκέντρωσης των προϊόντων, με τυχόν συνεπαγόμενες παρεμποδίσεις της αντίδρασης από τα προϊόντα. Η στιγμιαία ταχύτητα μίας αντίδρασης μπορεί να υπολογιστεί από τη γραφική παράσταση της μεταβολής της συγκέντρωσης των αντιδρώντων ή των προϊόντων (καμπύλη αντίδρασης) με το χρόνο. Η στιγμιαία ταχύτητα μίας αντίδρασης σε κάθε χρονική στιγμή είναι ίση με την κλίση της εφαπτόμενης (ΔC/Δt) στην καμπύλη της αντίδρασης στο συγκεκριμένο χρόνο (Σχήμα 3.1). H κλίση αυτή στη γραμμική περιοχή καλείται αρχική ταχύτητα αντίδρασης,v 0 (initial reaction rate) (Chang, 2005 Arneson & Brickell, 2007 Palmer & Bonner, 2007 Κλώνης, 2008 Rogers & Gibon, 2009 Καρίκας, 2012). 58

60 Σχήμα 3.1 Διάγραμμα μεταβολής της συγκέντρωσης του αντιδρώντος Α (κόκκινη καμπύλη) και του προϊόντος Γ (μπλε καμπύλη) της Αντίδρασης 3.1 σε συνάρτηση με τον χρόνο από την έναρξη της αντίδρασης. Σημειώνεται με σκίαση το γραμμικό τμήμα της κάθε καμπύλης. Η κλίση της εφαπτομένης ΔC/Δt σε οποιοδήποτε σημείο της κάθε καμπύλης ισούται με την ταχύτητα της αντίδρασης στο σημείο αυτό Ενζυμική Κινητική Μία ουσία, η παρουσία της οποίας προκαλεί αύξηση της ταχύτητας μιας χημικής αντίδρασης ονομάζεται καταλύτης (catalyst). Τα ένζυμα (enzymes) είναι βιολογικοί καταλύτες που προάγουν/επιταχύνουν αντιδράσεις κάτω από τις ήπιες συνθήκες που επικρατούν στους περισσότερους ζωντανούς οργανισμούς. Αυτό επιτυγχάνεται με τη δέσμευση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο (active site) του ενζύμου με συνέπεια τη μείωση της απαιτούμενης ενέργειας ενεργοποίησης (activation energy, ΔG ). Αναφέρθηκε ότι η μέτρηση της ταχύτητας μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης, είναι πολύ σημαντική στον προσδιορισμό της δραστικότητας ενός ενζύμου. Το πιο κοινό μοντέλο που περιγράφει την κινητική των ενζυμικά καταλυόμενων αντιδράσεων είναι αυτό των Michaelis Menten. Ας θεωρήσουμε μια τέτοια αντίδραση, όπου το ενζυμικό υπόστρωμα S (substrate) μετατρέπεται από το ένζυμο Ε (enzyme) στο προϊόν P (product), μέσω σχηματισμού του ενδιάμεσου συμπλόκου ενζύμου υποστρώματος ES (enzyme-substrate complex). Στο τέλος της αντίδρασης το ένζυμο, E, ως καταλύτης, ανακτάται. k 1, k -1 και k 2 είναι οι σταθερές ταχύτητας των επιμέρους αντιδράσεων. E + S k1 k 1 ES k 2 P + E (Aντίδραση 3.3) Η εξέλιξη της ενζυμικής αντίδρασης ακολουθεί τη γραφική παράσταση του Σχήματος 3.1. Η κλίση της εφαπτομένης σε οποιοδήποτε σημείο της καμπύλης ισούται με την ταχύτητα της αντίδρασης στο σημείο αυτό. Με βάση την παραπάνω αντίδραση, διαμορφώθηκε η εξίσωση των Leonor Michaelis- Maud Μenten (1913) (Εξίσωση 3.3), σύμφωνα με την οποία, η ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης της μορφής 3.3 υπακούει στη σχέση: ν = νmax[s] KM+[S] (Εξίσωση 3.3) όπου K M η σταθερά Michaelis και νmax είναι η μέγιστη ταχύτητα (maximum velocity) της αντίδρασης. Η σταθερά Michaelis συνδέεται με τις σταθερές ισορροπίας των επιμέρους αντιδράσεων (Αντίδραση 3.3), με τη σχέση: KΜ = ( k-1 + k2) / k1 Αποδεικνύεται από την Εξίσωση 3.3 ότι η σταθερά K M ταυτίζεται με εκείνη τη συγκέντρωση του υποστρώματος [S], για την οποία η αντίδραση πραγματοποιείται με ταχύτητα ίση με το μισό της νmax. Η φυσική σημασία της σταθεράς Κ Μ είναι ότι αποτελεί μέτρο της συγγένειας ενζύμου-υποστρώματος. Είναι 59

61 ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του ενζύμου. Μεγάλη συγγένεια του ενζύμου προς το υπόστρωμα, αντιστοιχεί σε χαμηλή τιμή Km και αντίστροφα. Επίσης, αποδεικνύεται ότι η μέγιστη ταχύτητα είναι γραμμικώς ανάλογη της συνολικής συγκέντρωσης του ελεύθερου (μη δεσμευμένου) ενζύμου [Ε 0], δηλαδή: ν max = kcat [E 0] (Εξίσωση 3.4) Όπου kcat είναι η σταθερά κατάλυσης, γνωστή ως αριθμός μετατροπής ή ανακύκλισης (turnover number). Η σταθερά kcat δηλώνει τον μέγιστο αριθμό των μορίων του υποστρώματος, την μετατροπή των οποίων κάθε ενεργό κέντρο ενζύμου μπορεί να καταλύσει στη μονάδα του χρόνου. Ο μέγιστος αυτός αριθμός μετατροπών σε προϊόν συμβαίνει όταν το υπόστρωμα βρίσκεται σε μεγάλη περίσσεια και όλα τα ενεργά κέντρα του ενζύμου είναι κορεσμένα σε υπόστρωμα. H σταθερά kcat, συνεπώς, αποτελεί μέτρο της ταχύτητας και αποτελεσματικότητας ενός ενζύμου (Chang, 2005 Arneson & Brickell, 2007 Palmer & Bonner, 2007 Κλώνης, 2008, Rogers & Gibon, 2009 Καρίκας, 2012). Στο Σχήμα 3.2 απεικονίζεται η μεταβολή της αρχικής ταχύτητας μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης με την αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, S 0. Είναι φανερό ότι όσο μικρότερη είναι η αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, τόσο μικρότερη είναι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης. Η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης φτάνει μία μέγιστη τιμή ν max, μόνο σε μεγάλες τιμές αρχικής συγκέντρωσης υποστρώματος [S 0]. Στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης (σκιασμένο τμήμα του Σχήματος 3.2) η αρχική ταχύτητα είναι ευθέως ανάλογη προς την [S 0], οπότε η κινητική είναι πρώτης τάξεως. Όταν η ταχύτητα της αντίδρασης προσεγγίζει τη v max, η κινητική είναι μηδενικής τάξεως. Επομένως, πέραν μιας ορισμένης περίσσειας υποστρώματος η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης είναι μέγιστη και ανεξάρτητη της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος, S 0. Σχήμα 3.2 Διάγραμμα μεταβολής της αρχικής ταχύτητας μιας ενζυματικά καταλυόμενης μετατροπής σε συνάρτηση με την αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος [S 0]. Σημειώνονται η v max και KM. Με κυανή σκίαση σημειώνεται το γραμμικό τμήμα της καμπύλης (κινητική πρώτης τάξεως), ενώ με πράσινη σκίαση το πλάτωμα (κινητική μηδενικής τάξεως). Από τα παραπάνω προκύπτει ότι υπό μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, ο ρυθμός σχηματισμού προϊόντος ή ο ρυθμός κατανάλωσης αντιδρώντος (αρχική ταχύτητα) είναι ανεξάρτητος της συγκέντρωσης του υποστρώματος και ανάλογος μόνο της δραστικότητας του ενζύμου. Με άλλα λόγια, υπό μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης, αποτελεί μέτρο της δραστικότητας του ενζύμου. Στην πράξη λοιπόν, σε μία κινητική φωτομετρική μέθοδο κλινικής ανάλυσης χρησιμοποιείται μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, ώστε ο ρυθμός σχηματισμού προϊόντος ή ο ρυθμός κατανάλωσης αντιδρώντος να είναι αρχικά ανάλογος μόνο της δραστικότητας του ενζύμου (Chang, 2005 Arneson & Brickell, 2007 Palmer & Bonner, 2007 Κλώνης, 2008 Rogers & Gibon, 2009 Καρίκας, 2012). Σύνοψη: Η ταχύτητα μίας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης ακολουθεί το μοντέλο των Michaelis-Menten: ν = (νmax[s] )/(K M+[S]). Η σταθερά Κ Μ αποτελεί μέτρο της συγγένειας ενζύμου-υποστρώματος. H σταθερά kcat 60

62 αποτελεί μέτρο της ταχύτητας και της αποτελεσματικότητας ενός ενζύμου. Στην πράξη, σε μια κινητική φωτομετρική μέθοδο κλινικής ανάλυσης χρησιμοποιείται μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, ώστε ο ρυθμός σχηματισμού προϊόντος ή ο ρυθμός κατανάλωσης αντιδρώντος (ταχύτητα της αντίδρασης), να είναι αρχικά ανάλογος μόνο της δραστικότητας του ενζύμου και ανεξάρτητος της συγκέντρωσης του υποστρώματος. 3.3 Κινητικές μέθοδοι Κλινικών Προσδιορισμών Αρχές Κινητικής Μεθόδου Η κινητική μέθοδος χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενζύμων κλινικού ενδιαφέροντος. Όπως επεξηγήθηκε αμέσως παραπάνω, σε μια κινητική φωτομετρική μέθοδο κλινικής ανάλυσης χρησιμοποιείται μεγάλη περίσσεια υποστρώματος, ώστε η ταχύτητα της αντίδρασης να είναι αρχικά ανάλογη μόνο της δραστικότητας του ενζύμου. Αυτή η περιορισμένη σε διάρκεια περιοχή μιας αντίδρασης, ονομάζεται γραμμική περιοχή ή φάσης σταθεροποιημένης κατάστασης (steady-state phase), της αντίδρασης. Σε μία κινητική μέθοδο, η απορρόφηση μετράται σε διαδοχικά τακτά διαστήματα, στη γραμμική περιοχή της αντίδρασης, και υπολογίζεται η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης v 0 (initial reaction rate). Προκειμένου ένα συζευγμένο σύστημα αντιδράσεων να είναι κατάλληλο για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης ενζύμου που καταλύει το πρώτο στάδιο των συζευγμένων αντιδράσεων, η δεύτερη αντίδραση θα πρέπει να βαίνει ταχύτατα σε σχέση με την πρώτη, ώστε η ταχύτητα σχηματισμού του έγχρωμου προϊόντος να είναι ουσιαστικά ίση, με την ταχύτητα του πρώτου σταδίου (Chang, 2005 Arneson & Brickell, 2007 Palmer & Bonner, 2007 Κλώνης, 2008 Rogers & Gibon, 2009 Καρίκας, 2012). Εάν καταγράψουμε τη μεταβολή της απορρόφησης (ή άλλου μετρούμενου σήματος γενικότερα) με τον χρόνο από την έναρξη της αντίδρασης μιας ενζυμικά καταλυόμενης μετατροπής, θα πάρουμε καμπύλες σαν αυτές που φαίνονται στο Σχήμα 3.3. Η κάθε καμπύλη αντιστοιχεί σε διαφορετική συγκέντρωση ενζύμου, παρουσία σταθερής ποσότητας υποστρώματος. Μάλιστα, το υπόστρωμα βρίσκεται αρχικά σε περίσσεια σε σχέση με το ένζυμο, η οποία περίσσεια είναι σημαντική για τις χαμηλές συγκεντρώσεις ενζύμου. Όσο μικρότερη η συγκέντρωση του ενζύμου, τόσο πιο αργά καταναλώνεται το υπόστρωμα και συνεπώς τόσο αργότερα φτάνουμε στο μέγιστο της απορρόφησης. Ταυτόχρονα, τόσο ευρύτερη είναι η γραμμική περιοχή της καμπύλης σήματος/χρόνου. Εντός αυτής της γραμμικής περιοχής (που στο Σχήμα 3.3 υποδεικνύεται με κόκκινο χρωματισμό της καμπύλης) παίρνουμε τις μετρήσεις απορρόφησης σε μια κινητική μέθοδο. Σε μια μέθοδο τελικού σημείου θα πάρουμε μία μέτρηση, όταν έχει καταναλωθεί όλο το υπόστρωμα και πλέον δεν αυξάνεται η απορρόφηση με το χρόνο (δηλαδή στο πλάτωμα της κάθε καμπύλης). Στο ένθετο του ίδιου σχήματος απεικονίζονται λεπτομερώς τα πολύ αρχικά στάδια της καμπύλης εξέλιξης της αντίδρασης. Είναι φανερό ότι η γραμμική περιοχή δεν ξεκινάει αμέσως με την έναρξη της αντίδρασης, αλλά μετά από πολύ σύντομο διάστημα κατόπιν αυτής. Στο διάστημα αυτό που ονομάζεται φάση έναρξης (initiation phase), σχηματίζεται το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος σε μια ενζυμική αντίδραση, σύμφωνα με την Αντίδραση 3.3. Η φάση έναρξης διαρκεί από μερικά δέκατα του δευτερολέπτου, έως λίγα δευτερόλεπτα. Η καθυστέρηση αυτή στην έναρξη της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης (steady-state phase), δηλαδή στην έναρξη της γραμμικής περιοχής της αντίδρασης είναι ο λόγος για τον οποίο, όταν παρακολουθείται η εξέλιξη μίας ενζυμικής αντίδρασης με κινητική μέθοδο, η καταγραφή του σήματος του οργάνου με τον χρόνο ξεκινάει συνηθέστερα 0,5-1,0 min μετά την έναρξη της αντίδρασης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η κλίση του γραμμικού τμήματος στο διάγραμμα απορρόφησης/χρόνου είναι ανάλογη της αρχικής ταχύτητας, v 0. Αυτό ισχύει διότι σύμφωνα με το νόμο των Lambert Beer (βλ. Ενότητα 2.2) η απορρόφηση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης, ενώ σύμφωνα με το Σχήμα 3.1 η κλίση του γραμμικού τμήματος στο διάγραμμα συγκέντρωσης/χρόνου ταυτίζεται με την αρχική ταχύτητα, v 0. Καθώς τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες, επηρεάζουν μόνο την κινητική περιοχή μιας αντίδρασης και συνεπώς η δραστικότητα κάποιου ενζύμου μπορεί να προσδιοριστεί μόνο με κινητικές μεθόδους. Αντίθετα, η συγκέντρωση του υποστρώματος επηρεάζει και την κινητική αλλά και την περιοχή, όπου παρατηρείται το πλάτωμα της καμπύλης εξέλιξης της αντίδρασης. Γι αυτό το λόγο στους προσδιορισμούς μη ενζυμικών κλινικών αναλυτών, η κινητική όπως και η μέθοδος τελικού σημείου, μπορεί να εφαρμοστεί. 61

63 Σχήμα 3.3 Διάγραμμα μεταβολής του μετρούμενου σήματος με τον χρόνο από την έναρξη μίας ενζυμικά καταλυόμενης μετατροπής, για μια σειρά ενζυμικών συγκεντρώσεων. Με κόκκινο χρώμα σημειώνεται η γραμμική περιοχή της αντίδρασης για κάθε ενζυμική συγκέντρωση. Στο ένθετο φαίνεται λεπτομέρεια του αρχικού τμήματος μιας τέτοιας καμπύλης εξέλιξης της αντίδρασης. Με μπλε χρώμα δίνεται η καμπύλη εξέλιξης του δείγματος, ενώ με πράσινο χρώμα του τυφλού. Εκεί διακρίνεται η φάση έναρξης (δίνεται με σκίαση). Ένα διάγραμμα ταχύτητας αντίδρασης-συγκέντρωσης ενζύμου έχει τη μορφή του Σχήματος 3.4. Εκεί φαίνεται ότι αρχικά η ταχύτητα είναι ανάλογη της ενζυμικής συγκέντρωσης. Για τέτοιες συγκεντρώσεις ενζύμου, όπου το υπόστρωμα βρίσκεται σε σημαντική περίσσεια σε σχέση με το ένζυμο (περιοχή σημειωμένη με κόκκινο) λαμβάνονται οι μετρήσεις απορρόφησης σε μια κινητική μέθοδο. Στη συνέχεια της καμπύλης είναι εμφανές ότι δεν διατηρείται αυτή η αναλογία. Σε μεγάλες μάλιστα συγκεντρώσεις ενζύμου (όταν δηλαδή το υπόστρωμα δε βρίσκεται σε περίσσεια), ο ρυθμός αυξάνεται πολύ λίγο με την αύξηση της ενζυμικής συγκέντρωσης. Έτσι, σε τέτοιες συγκεντρώσεις, η μέτρηση της ταχύτητας μιας αντίδρασης δε μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον ποσοτικό προσδιορισμό ενός ενζύμου. Η περιοχή της καμπύλης, που σημειώνεται με κόκκινο, είναι η γραμμική περιοχή της μεθόδου μας, και εντός αυτής θα πρέπει να βρεθεί ο υπολογιζόμενος ρυθμός της αντίδρασης σε ανάλυση βιολογικού δείγματος προκειμένου να αντιστοιχιστεί σε ενζυμική συγκέντρωση διαφορετικά θα πρέπει να γίνει αραίωση του αρχικού δείγματος. Σχήμα 3.4 Διάγραμμα ταχύτητας αντίδρασης-συγκέντρωσης ενζύμου για μια ενζυμικά καταλυόμενη μετατροπή. Είναι φανερό ότι αρχικά η ταχύτητα είναι ανάλογη της ενζυμικής συγκέντρωσης. Η περιοχή σημειωμένη με κόκκινο είναι η γραμμική περιοχή της μεθόδου μας. Σύνοψη: Η αρχική ταχύτητα αντίδρασης ταυτίζεται με το ρυθμό μεταβολής της συγκέντρωσης προϊόντος ή αντιδρώντος στη γραμμική περιοχή (φάση σταθεροποιημένης κατάστασης) της αντίδρασης. Στις κινητικές 62

64 φωτομετρικές μεθόδους μετριέται ο ρυθμός μεταβολής της απορρόφησης στη γραμμική περιοχή της αντίδρασης. Αυτός είναι ανάλογος του ρυθμού μεταβολής της συγκέντρωσης του έγχρωμου προϊόντος, δηλαδή της αρχικής ταχύτητας της αντίδρασης και της ενζυμικής συγκέντρωσης Πλεονεκτήματα Κινητικών Μεθόδων Το πιο σημαντικό πλεονέκτημα των κινητικών μεθόδων είναι η ταχύτητά τους. Οι κινητικές μέθοδοι μετρούν τον αρχικό ρυθμό μιας αντίδρασης και ολοκληρώνονται συνήθως, όταν έχει πραγματοποιηθεί το 3-10% μιας αντίδρασης. Μέσα σε αυτό το χρονικό διάστημα από την έναρξη της αντίδρασης, η επίδραση της αντίστροφης πορείας της αντίδρασης ή τυχόν παρεμποδίσεις λόγω των προϊόντων της αντίδρασης δεν είναι ακόμα σημαντικές. Έτσι, μέχρι αυτού του ορίου, η καμπύλη μεταβολής του μετρούμενου σήματος (π.χ. απορρόφησης) σε συνάρτηση µε τον χρόνο είναι συνήθως ευθεία γραµµή. Βρισκόμαστε δηλαδή στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης των Σχημάτων 3.1 και 3.3. Στο διάστημα αυτό, με άλλα λόγια, ο ρυθμός μεταβολής της απορρόφησης με το χρόνο είναι σταθερός, άρα η ταχύτητα της αντίδρασης είναι σταθερή. Πρόκειται για την αρχική ταχύτητα της αντίδρασης, που είναι και η μέγιστη ταχύτητα αυτής. Άλλο πλεονέκτημα των κινητικών μεθόδων είναι η μη ανάγκη χρήσης προτύπων και τυφλού (για τις περισσότερες κινητικές μεθοδολογίες). Οι κινητικές μέθοδοι είναι προτιμώμενες σε προσδιορισμούς σε δείγματα, όπου υπάρχει κάποια ενδογενής ουσία που παρεμβάλλεται στον προσδιορισμό. H επίδραση μιας τέτοιας παρεμβολής είναι αμελητέα, όταν η ουσία απορροφά μεν στην ίδια περιοχή με το έγχρωμο προϊόν, με απορρόφηση όμως που μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης της αντίδρασης. Επιπλέον, λόγω της πολύ σύντομης διάρκειας των μετρήσεων σε μια κινητική μέθοδο (π.χ. μπορεί να είναι λίγων δευτερολέπτων) ακόμα και όταν μια παρεμβαλλόμενη ουσία αντιδρά κατά την αντίδραση προς παραγωγή επιπλέον έγχρωμου προϊόντος, η επίδραση της παρεμβολής δύναται να είναι αμελητέα. Για παράδειγμα, μια φωτομετρική κινητική μέθοδος που είναι εκλεκτική για κάποιον κλινικό βιοχημικό αναλύτη μπορεί να εφαρμοστεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του σε ολικό αίμα. Σε μια τέτοια περίπτωση, η μέτρηση της αύξησης της απορρόφησης, παρουσία της έγχρωμης μήτρας, είναι δυνατή. Αντίθετα, μια μέθοδος τελικού σημείου δεν μπορεί να είναι ακριβής στη συγκεκριμένη εφαρμογή. Αυτό, διότι δεν είναι δυνατόν να γίνει πάντοτε με ακρίβεια ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του παραγόμενου έγχρωμου προϊόντος μέσω της απορρόφησης αυτού σε μήκος κύματος που απορροφά και η μήτρα. Αυτό ισχύει ιδίως, όταν η συμμετοχή της μήτρας στην απορρόφηση είναι σημαντική ή δεν είναι σταθερή από δείγμα σε δείγμα. Τέλος, όπως αναφέρθηκε ήδη, καθώς τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες επηρεάζουν μόνο την κινητική περιοχή μιας αντίδρασης. Συνεπώς, η δραστικότητα κάποιου ενζύμου προσδιορίζεται κατά κανόνα με κινητικές μεθόδους (Pardue, 1977 Skoog et al., 2014). Σύνοψη: Οι κινητικές μέθοδοι είναι ταχύτερες και κυρίως προτιμώμενες σε προσδιορισμούς σε δείγματα, όπου υπάρχει κάποια ενδογενής ουσία που παρεμβάλλεται στον προσδιορισμό. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενζύμων με κλινικό ενδιαφέρον χρησιμοποιούνται κατά κανόνα κινητικές μέθοδοι. Οι κινητικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται επίσης σε προσδιορισμούς κλινικών αναλυτών μη ενζυμικής φύσης (όπως και οι μέθοδοι τελικού σημείου) Ενζυμική Δραστικότητα και Συγκέντρωση Η ενζυμική συγκέντρωση δεν εκφράζεται με τις κλασικές εκφράσεις περιεκτικότητας και συγκέντρωσης. Εκφράζεται κατά κανόνα ως ενζυμική ενεργότητα ή δραστικότητα (enzyme activity) ανά μονάδα όγκου και μετριέται σε μονάδες ενζυμικής δραστικότητας (enzyme units, U) ανά μονάδα όγκου, δηλαδή σε U/L. Μια μονάδα ενζυμικής δραστικότητας (U), αντιστοιχεί στην ποσότητα του ενζύμου που μετατρέπει ένα μmol υποστρώματος ανά min, ή παράγει ένα μmol προϊόντος ανά min, κάτω από καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Επίσης, μετριέται σε katal (kat). To 1 kat αντιστοιχεί στην ενζυμική ενεργότητα που μετατρέπει ένα mole υποστρώματος ανά sec κάτω από συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Η αντιστοιχία είναι 1 kat = U. Οι κυριότερες πειραματικές συνθήκες που καθορίζονται, όταν προσδιορίζεται η ενζυμική δραστικότητα είναι το ph, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση του υποστρώματος. Η ενζυμική μονάδα καλείται και διεθνής μονάδα (International Unit ή IU ή U). Επειδή η ενζυμική ενεργότητα εξαρτάται από τις πειραματικές συνθήκες, οι τιμές αναφοράς της μεταβάλλονται με τις πειραματικές συνθήκες. Η ειδική δραστικότητα (specific activity) 63

65 ενός ενζύμου ισούται με το λόγο της ενζυμικής ενεργότητας προς τα συνoλικά mg του ενζύμου στο παρασκεύασμα ή στο προς ανάλυση δείγμα. Μετράται σε U/mg. Σύνοψη: Η ενζυμική συγκέντρωση δεν εκφράζεται με τις κλασικές εκφράσεις περιεκτικότητας και συγκέντρωσης, αλλά ως ενζυμική δραστικότητα ανά μονάδα όγκου, με μονάδες U/L. Μια μονάδα ενζυμικής δραστικότητας (U), αντιστοιχεί στην ποσότητα του ενζύμου που μετατρέπει ένα μmol υποστρώματος ανά min, ή παράγει ένα μmol προϊόντος ανά min, υπό καθορισμένες πειραματικές συνθήκες Πειραματική διαδικασία Ποσοτικού Φωτομετρικού Κλινικού Προσδιορισμού με Κινητική Μέθοδο Η πειραματική διαδικασία φωτομετρικού κλινικού προσδιορισμού με κινητική μέθοδο περιλαμβάνει τα παρακάτω γενικά στάδια: 1. Το φωτόμετρο μηδενίζεται με απιονισμένο νερό στο μήκος κύματος, όπου παρακολουθείται η αντίδραση (δηλαδή σε μήκος κύματος όπου απορροφά κάποιο προϊόν ή αντιδρών της αντίδρασης). 2. Στις κινητικές μεθόδους, όπου λαμβάνονται περισσότερες μετρήσεις απορρόφησης, δεν απαιτείται χρήση τυφλού. Επίσης, δεν απαιτείται χρήση προτύπων για βαθμονόμηση. Οι δύο αυτές ιδιαιτερότητες της κινητικής μεθόδου επεξηγούνται παρακάτω. 3. Εφαρμόζεται για το άγνωστο η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού, όπως ακριβώς περιγράφεται στο πρωτόκολλο. Στη θερμοστατούμενη κυψελίδα του φασματοφωτόμετρου προστίθενται το κλινικό δείγμα με το προς προσδιορισμό ένζυμο ή αναλύτη, και αμέσως μετά, υπό ανάδευση, το αντιδραστήριο εργασίας. Το τελευταίο έχει ήδη προθερμανθεί στη θερμοκρασία επώασης. Η προσθήκη του αντιδραστηρίου εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθείται μέσω καταγραφής της αύξησης (ή μείωσης) της οπτικής απορρόφησης, συναρτήσει του χρόνου. Η καταγραφή της απορρόφησης ξεκινάει μετά την πάροδο της φάσης έναρξης. Λαμβάνονται τιμές απορρόφησης σε διαδοχικούς χρόνους από την έναρξη της αντίδρασης, εντός της γραμμικής περιοχής αυτής. Υπολογίζονται στη συνέχεια οι διαφορές ΔΑ και Δt ανάμεσα σε δύο διαδοχικές μετρήσεις και τέλος η μέση τιμή ΔΑ/Δt. Σπανιότερα υπολογίζεται η εξίσωση της ευθείας παλινδρόμησης με βάση τις μετρήσεις. Η μέση τιμή ΔΑ/Δt ή η κλίση της ευθείας παλινδρόμησης χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της ενζυμικής συγκέντρωσης, όπως αναλύεται παρακάτω. Ενδείκνυται, κατά καιρούς μέτρηση του δείγματος σε χρόνο 0, (ή αλλιώς μέτρηση τυφλού), και σύγκριση αυτής με τιμή που δίνεται από το πρωτόκολλο. Η τιμή της μέτρησης δε θα πρέπει να είναι υψηλότερη της δεδομένης από το πρωτόκολλο τιμής. Στην αντίθετη περίπτωση, το αντιδραστήριο εργασίας απορρίπτεται. Αυτό, διότι μία τέτοια υψηλή τιμή είναι ενδεικτική αλλοίωσης του αντιδραστηρίου εργασίας π.χ. λόγω επιμόλυνσής του με τον προσδιοριζόμενο αναλύτη (Pardue, 1977) Υπολογισμός Ενζυμικής Συγκέντρωσης Όπως αναφέρθηκε στις κινητικές μεθόδους δεν είναι απαραίτητη η βαθμονόμηση με την κλασική έννοια αυτής, δηλαδή με τη χρήση προτύπων που αναπτύσσονται παράλληλα με το δείγμα, για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Η μη ανάγκη βαθμονόμησης με τη χρήση προτύπων οφείλεται στο ότι η ενζυμική συγκέντρωση υπολογίζεται στην πλειοψηφία των πρωτοκόλλων μόνο με βάση τα πειραματικά δεδομένα του δείγματος. Ο υπολογισμός αυτός βασίζεται στον πολλαπλασιασμό της υπολογιζόμενης μέσης τιμής του λόγου ΔΑ/Δt ή της κλίσης της ευθείας παλινδρόμησης, επί έναν συντελεστή μετατροπής. Αυτό επεξηγείται παρακάτω: Αντικαθιστώντας στην Εξίσωση 3.1 την έκφραση του νόμου των Lambert-Beer (βλ. Ενότητα 1.6) προκύπτει για την ταχύτητα της αντίδρασης: v = Δ[προϊόν] Δt ή Δ (moles προϊόντος) Δt = ΔΑπροϊόντος ε d Δt = ΔΑπροϊόντος ΤV Δt ε d (Εξίσωση 3.4) (Εξίσωση 3.5) 64

66 όπου: TV o συνολικός όγκος της αντίδρασης, ε ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης του έγχρωμου προϊόντος, d το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος στην κυψελίδα, όπου παρακολουθείται η μεταβολή της απορρόφησης με το χρόνο. Επειδή όμως, η ενζυμική ενεργότητα ισοδυναμεί με την ποσότητα του ενζύμου που παράγει συγκεκριμένη ποσότητα προϊόντος στη μονάδα του χρόνου, το πρώτο σκέλος της Εξίσωσης 3.5 θα αντιστοιχεί στην ενζυμική ενεργότητα. Εάν στη συνέχεια διαιρέσουμε την ενζυμική ενεργότητα με τον όγκο του δείγματος (V δείγματος), λαμβάνουμε την ενζυμική συγκέντρωση. Η Εξίσωση 3.5 τότε γίνεται: Δ(moles προϊόντος) και: V δείγματος Δt Δ(moles προϊόντος) V δείγματος Δt = ΔΑ ΤV Δt ε d Vδείγματος = ΔΑ Σ. Μ (Εξίσωση 3.7) Δt (Εξίσωση 3.6) όπου Σ.Μ. είναι ο συντελεστής μετατροπής, σταθερά, διαφορετική για κάθε πρωτόκολλο κινητικής φωτομετρικής ανάλυσης. Ο Σ.Μ. δίνεται από τη εξίσωση: Σ.Μ.= TV ε d Vδείγματος (Εξίσωση 3.8) O Σ.Μ. έχει μονάδες min U/L και τιμή που δίνεται στο φυλλάδιο οδηγιών του κάθε πρωτοκόλλου κινητικής φωτομετρικής ανάλυσης. Εφόσον στις κινητικές φωτομετρικές μεθόδους υπολογίζεται η διαφορά απορρόφησης μεταξύ διαδοχικών χρόνων, οποιαδήποτε συνεισφορά που οφείλεται σε τυφλό δείγμα ακυρώνεται. Αυτό ισχύει φυσικά με την προϋπόθεση ότι η εφαρμοζόμενη μέθοδος είναι εκλεκτική ως προς τον αναλύτη ενδιαφέροντος και η απορρόφηση του τυφλού μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης της αντίδρασης. Σπανίως σε κάποια πρωτόκολλα φωτομετρικών κινητικών μεθόδων λαμβάνεται μία μόνο μέτρηση εντός της γραμμικής περιοχής. Σε αυτή την κατηγορία μεθόδων απαιτείται η χρήση τυφλού (Pardue, 1977). Σύνοψη: Στις κινητικές μεθόδους ο προσδιορισμός της ενζυμικής συγκέντρωσης γίνεται με πολλαπλασιασμό του πειραματικά υπολογιζόμενου ρυθμού μεταβολής της απορρόφησης επί κάποιον συντελεστή που δίνεται από το πρωτόκολλο. Στις κινητικές μεθόδους δεν είναι απαραίτητη η βαθμονόμηση με πρότυπα για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Επίσης, όταν ο προσδιορισμός γίνεται με κινητική μέθοδο, όπου καταγράφεται το μετρούμενο σήμα σε περισσότερες χρονικές στιγμές και η απορρόφηση του τυφλού μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης, δεν απαιτείται παράλληλη χρήση τυφλού Πρωτόκολλο ανάλυσης με Κινητική Μέθοδο Στη Φωτογραφία 3.1 παρουσιάζεται το πρωτόκολλο του προσδιορισμού της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (Aspartate Τransaminase [AST] ή Glutamate Oxaloacetate Transaminase [GOT]) κατά το σύστημα των συζευγμένων Αντιδράσεων 3.4 και 3.5. Αυτό παρέχεται στο φύλλο οδηγιών του κατασκευαστή του kit προσδιορισμού. α-κετογλουταρικό + L-ασπαρτικό GOT L-γλουταμικό + oξαλοξικό (Αντίδραση 3.4) οξαλοξικό + NADH + H + MDH L-μηλικό + NAD + (Αντίδραση 3.5) 65

67 Το ένζυμο GOT προσδιορίζεται έμμεσα μέσω της καταλυόμενης από αυτό μεταφοράς αμινομάδας από το μόριο του L-ασπαρτικού στο μόριο του α-κετογλουταρικού οξέος. Το παραγόμενο οξαλοξικό οξύ παρουσία του ενζύμου μηλική αφυδρογονάση (MDH) ανάγεται προς L-μηλικό οξύ με ταυτόχρονη οξείδωση του συνενζύμου NADH σε NAD +. Η ελάττωση της απορρόφησης στα 340 nm (οφειλόμενη στην ελάττωση της συγκέντρωσης του NADH) είναι ανάλογη της δραστικότητας της GOT στο δείγμα (Bergmeyer et al., 1976 Bergmeyer et al., 1978a Bergmeyer et al., 1978b McPherson & Pincus, 2011). Σε αναλογία με το πρωτόκολλο ανάλυσης μεθόδου τελικού σημείου (Κεφάλαιο 2) το πρωτόκολλο ανάλυσης μίας κινητικής μεθόδου περιλαμβάνει τις πληροφορίες που αναφέρονται παρακάτω: Την Επιστημονική Ένωση που έχει υιοθετήσει τη συγκεκριμένη μέθοδο ως επίσημη ή αποδεκτή για τον ποσοτικό προσδιορισμό του συγκεκριμένου αναλύτη. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο ο προσδιορισμός γίνεται σύμφωνα με τις προδιαγραφές της Διεθνούς Εταιρείας Κλινικής Χημείας (IFCC). Τη σύσταση του αντιδραστηρίου εργασίας. Το αντιδραστήριο εργασίας μπορεί να περιλαμβάνει όλα ή κάποια από τα παρακάτω συστατικά: Συμπαράγοντες, ενεργοποιητές, ιόντα: Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται το συνένζυμο NADH. Η παρακολούθηση της αντίδρασης γίνεται δυνατή μέσω της μείωσης της οφειλόμενης στο NADH απορρόφησης στα 340 nm. Υποστρώματα: L-ασπαρτικό στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο. Άλλα αντιδρώντα: To α-κετογλουταρικό αποτελεί το δέκτη της μεταφερόμενης αμινομάδας. Χρωμογόνο: Είναι η ουσία η οποία κατά την αντίδραση θα μετατραπεί σε έγχρωμο προϊόν. Δεν αποτελεί συστατικό του διαλύματος εργασίας στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθείται μέσω της μείωσης της οφειλόμενης στο NADH απορρόφησης στα 340 nm. Ρυθμιστικό διάλυμα: με σκοπό τη διατήρηση σταθερού ph και ιοντικής ισχύος, ώστε η(οι) ενζυμική μετατροπή(ες) να εκτυλίσσεται υπό τις βέλτιστες συνθήκες. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται ρυθμιστικό Tris 80 mm - ph 7,8. Τυχόν άλλα ένζυμα που καταλύουν συζευγμένες αντιδράσεις. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο η μηλική α- φυδρογονάση (MDH). Πολύ συχνά τα επιμέρους συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας εμπεριέχονται σε ξεχωριστά φιαλίδια. Τα ασταθή επιμέρους συστατικά αναμιγνύονται αμέσως πριν την εκτέλεση της αντίδρασης. Αυτό γίνεται προκειμένου να αποφευχθεί η αλλοίωση ή η κατανάλωση αυτών (π.χ. μέσω της οξείδωσής τους ή γενικότερα της αντίδρασής τους ή της καταβύθισής τους, μετουσίωσής τους κ.λπ.). Μια τέτοια αλλοίωση θα είχε ως αποτέλεσμα, είτε τη μη εκλεκτική ανάπτυξη χρώματος στο τυφλό (απουσία του αναλύτη), είτε την αδυναμία ανάπτυξης χρώματος σύμφωνα με τις προκαθορισμένες συνθήκες, παρουσία του αναλύτη. Έτσι, και στο πρωτόκολλο της GOT, τo ένζυμo (ΜDH) φυλάσσεται λυοφιλοποιημένo σε ξεχωριστό φιαλίδιο και, πριν τη χρήση του αντιδραστηρίου εργασίας, απαιτείται η ανασύστασή του. Το πρωτόκολλο μιας κινητικής ανάλυσης θα πρέπει ακόμα να καθορίζει τα παρακάτω: Την τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία του δείγματος, ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο προσδιορίζεται ο αναλύτης. Την τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία του αντιδραστηρίου εργασίας πριν τη χρήση του (π.χ. ανασύσταση, αραίωση, επαναιώρηση, ανάμιξη κ.λπ.). Στο πρωτόκολλο προσδιορισμού της GOT τo ένζυμo (ΜDH) φυλάσσεται λυοφιλοποιημένo σε ξεχωριστό φιαλίδιο και απαιτείται η ανασύσταση του ενζύμου με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει όλα τα υπόλοιπα συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας πριν την αντίδραση. Τη θερμοκρασία επώασης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 37 ο C. Το χρόνο που διαρκεί η φάση έναρξης της αντίδρασης. Στο πρωτόκολλο αυτό δεν ορίζεται. Η φάση έναρξης είναι κοινώς διάρκειας μόνο λίγων δευτερολέπτων κατά το μέγιστο. Έτσι, αναμονή επί 1 min πριν τη λήψη της πρώτης μέτρησης εξασφαλίζει μέτρηση εντός της γραμμικής περιοχής. Τους προτεινόμενους χρόνους καταγραφής της απορρόφησης κατά τη γραμμική περιοχή της αντίδρασης. Στο πρωτόκολλο αυτό δεν αναφέρονται. Αναφέρεται μόνο η διάρκεια της γραμμικής περιοχής (3 min). Έτσι, μετρήσεις απορρόφησης θα μπορούσαν να γίνουν στα 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 και 3,0 min. Το μήκος κύματος καταγραφής της απορρόφησης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 340 nm. 66

68 Το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου το διαλύματος στην κυψελίδα, βάση του οποίου υπολογίστηκε από τον κατασκευαστή ο συντελεστής μετατροπής. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 1 cm. Τις τιμές αναφοράς για τον συγκεκριμένο κλινικό αναλύτη ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο προσδιορίζεται. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι μέχρι 45 U/L στον ορό. Οι τιμές αναφοράς αναφέρονται στις πειραματικές συνθήκες (υπόστρωμα, θερμοκρασία, ph κ.ά.) που ορίζονται στο πρωτόκολλο. Τον συντελεστή μετατροπής για τον υπολογισμό της ενζυμικής συγκέντρωσης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 1746 min U/L. Πιο ειδικές πληροφορίες π.χ. τυχόν παρεμποδίσεις και τρόπους αναίρεσης αυτών, σχετικές βιβλιογραφικές μελέτες κ.α. Τους χρόνους ζωής των επιμέρους αντιδραστηρίων και τη σταθερότητα του ενζύμου που προσδιορίζεται στο κλινικό δείγμα. Στο πρωτόκολλο αυτό το διάλυμα εργασίας είναι σταθερό επί 15 ημέρες σε θερμοκρασία 2-10 ο C, μετά την ανασύσταση της MDH. H σταθερότητα της GOT σε ορό αναφέρεται ως 48 h σε θερμοκρασία ο C, ή 3 ημέρες σε θερμοκρασία 2-10 ο C. Τα τεχνικά χαρακτηριστικά της μεθόδου, όπως το εύρος γραμμικότητας μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αναλύτη, το όριο ανίχνευσης, την επαναληπτικότητα και αναπαραγωγιμότητα. Φωτογραφία 3.1 Πρωτόκολλο ανάλυσης που παρέχεται από εταιρία παραγωγής kit προσδιορισμού GOT με κινητική μέθοδο. 67

69 3.4 Πειραματικό μέρος Προσδιορισμός Αμυλάσης με Κινητική μέθοδο Ως πρώτο πειραματικό παράδειγμα κλινικού ενζυμικού προσδιορισμού με κινητική μέθοδο θα αναφερθεί ο προσδιορισμός της αμυλάσης (Amylase ή AMYL), (Winn-Deen et al., 1988), σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 3.2. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, ο προσδιορισμός της αμυλάσης στον ορό βασίζεται στην καταλυόμενη από την αμυλάση, μετατροπή ενός παραγώγου σακχαρίτη σε έγχρωμο προϊόν. Το έγχρωμο προϊόν απορροφά στα 405 nm. Η επώαση πραγματοποιείται στους 37 ο C. Ρυθμίζουμε το φωτόμετρο, ώστε να μετρά στα 405 nm και το μηδενίζουμε με απιονισμένο νερό. Στη θερμοστατούμενη κυψελίδα του φασματοφωτομέτρου προστίθενται ο ορός (20 μl) με το προς προσδιορισμό ένζυμο και αμέσως μετά 1 ml από το αντιδραστήριο εργασίας (που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, συμπαράγοντα, συντηρητικό και υπόστρωμα), το οποίο έχει ήδη προθερμαθεί στους 37 ο C. Το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος στην κυψελίδα θα πρέπει να είναι 1 cm. Αναμιγνύουμε αμέσως με αναρρόφηση με την πιπέτα και απότομη απόδοση του περιεχομένου της. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθείται στα 405 nm μέσω καταγραφής της αύξησης της οπτικής απορρόφησης, συναρτήσει του χρόνου. Σύμφωνα με τη σύσταση του κατασκευαστή του kit, η καταγραφή της απορρόφησης ξεκινάει μετά τα 30 sec (λήξη της φάσης έναρξης της αντίδρασης) και συνεχίζεται επί 3 min, ανά 30 sec. Οι τιμές της απορρόφησης που μετρήθηκαν στους αντίστοιχους χρόνους από την έναρξη της αντίδρασης φαίνονται στον Πίνακα 3.1. Στον ίδιο πίνακα υπολογίζονται και οι λόγοι ΔΑ/Δt για την κάθε χρονική στιγμή και η μέση τιμή ΔΑ/Δt. Όπως αναφέρθηκε στο θεωρητικό μέρος, στη γραφική παράσταση της μεταβολής της οπτικής απορρόφησης ΔΑ συναρτήσει του χρόνου t (Σχήμα 3.3), η κλίση του γραμμικού τμήματος είναι ανάλογη της αρχικής ταχύτητας, v 0. Η κλίση αυτή μπορεί να υπολογιστεί γραφικά. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, η γραμμική αυτή περιοχή διαρκεί τουλάχιστον από τα πρώτα 30 sec και για τα επόμενα 3 min της αντίδρασης. Με βάση τη γνώση αυτή και για την απλούστευση του υπολογισμού, υπολογίζεται ο λόγος ΔΑ/Δt δηλαδή ο λόγος μεταβολής της απορρόφησης προς τη μεταβολή του χρόνου, για κάθε μέτρηση. Ο λόγος αυτός ταυτίζεται με την κλίση της ευθείας στη γραμμική περιοχή και είναι ανάλογος της αρχικής ταχύτητα της αντίδρασης σε κάθε στιγμή. Εφόσον όμως αυτή η ταχύτητα είναι σταθερή εντός του συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος, έχει νόημα ο υπολογισμός της μέσης ΔΑ/Δt. Ο υπολογισμός της ενζυμικής συγκέντρωσης γίνεται στη συνέχεια σύμφωνα με την Eξίσωση 3.7. Πολλαπλασιάζουμε τη μέση ΔΑ/Δt του Πίνακα 3.1 επί τον συντελεστή μετατροπής, ο οποίος δίνεται από το πρωτόκολλο ως 3954 min U/L. H συγκέντρωση της αμυλάσης επομένως υπολογίζεται ως 0,0227 min min U/L = 89,6 U/L. Καθώς οι τιμές αναφοράς της αμυλάσης στον ορό είναι μέχρι 90 U/L, συμπεραίνουμε ότι το δείγμα μας είναι φυσιολογικό. Χρόνος (min) Α 405 nm ΔΑ Δt (min) ΔΑ/Δt (min -1 ) 0,5 0, ,229 0,012 0,5 0,024 1,5 0,241 0,012 0,5 0, ,252 0,011 0,5 0,022 2,5 0,264 0,012 0,5 0, ,275 0,011 0,5 0,022 3,5 0,285 0,010 0,5 0,020 Μέση ΔΑ/Δt (min -1 ) 0,0227 Πίνακας 3.1 Μετρήσεις απορρόφησης που λήφθηκαν σε αντίστοιχους χρόνους κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό αμυλάσης με κινητική μέθοδο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας

70 Φωτογραφία 3.2 Πρωτόκολλο ανάλυσης που παρέχεται από εταιρία παραγωγής kit προσδιορισμού αμυλάσης με κινητική μέθοδο Προσδιορισμός GOT με Κινητική Μέθοδο Ως εναλλακτικό πειραματικό παράδειγμα κλινικού ενζυμικού προσδιορισμού με κινητική μέθοδο θα αναφερθεί, εν συντομία, ο προσδιορισμός της GOT (Bergmeyer et al., 1976 Bergmeyer et al., 1978a Bergmeyer, et al., 1978b McPherson & Pincus, 2011) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 3.1. Αναλυτική περιγραφή του πρωτοκόλλου έγινε στην Παράγραφο Ρυθμίζουμε το φωτόμετρο στα 340 nm και το μηδενίζουμε με απιονισμένο νερό. Στη θερμοστατούμενη στους 37 ο C κυψελίδα του φασματοφωτομέτρου προστίθενται ο ορός (100 μl) με το προς προσδιορισμό ένζυμο, και αμέσως μετά 1 ml από το αντιδραστήριο εργασίας, το οποίο έχει ήδη προθερμαθεί στους 37 ο C. Το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος στην κυψελίδα θα πρέπει να είναι 1 cm. Αναμιγνύουμε αμέσως με αναρρόφηση με την πιπέτα και απότομη απόδοση του περιεχομένου της. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθείται στα 340 nm μέσω καταγραφής της μείωσης της οπτικής απορρόφησης, συναρτήσει του χρόνου. Η καταγραφή της απορρόφησης ξεκινάει μετά το 1 min 69

71 (λήξη της φάσης έναρξης της αντίδρασης) και συνεχίζεται επί 2 min, ανά 30 sec. Οι τιμές της απορρόφησης που μετρήθηκαν στους αντίστοιχους χρόνους από την έναρξη της αντίδρασης καταγράφονται στον Πίνακα 3.2. Στον ίδιο πίνακα πρέπει να υπολογιστούν και οι λόγοι ΔΑ/Δt για την κάθε χρονική στιγμή και η μέση τιμή ΔΑ/Δt. Ο υπολογισμός της ενζυμικής συγκέντρωσης γίνεται πολλαπλασιάζοντας τη μέση ΔΑ/Δt του Πίνακα 3.2 επί τον συντελεστή μετατροπής, ο οποίος δίνεται από το πρωτόκολλο ως 1746 min U/L. Έτσι, υπολογίζεται η συγκέντρωση της GOT σε U/L και συγκρίνεται με τις τιμές αναφοράς της GOT στον ορό (μέχρι 45 U/L). Χρόνος (min) Α 340nm ΔΑ Δt (min) ΔΑ/Δt (min -1 ) Μέση ΔΑ/Δt (min -1 ) 1 1,5 2 2,5 3 Πίνακας 3.2 Μετρήσεις απορρόφησης που λαμβάνονται σε αντίστοιχους χρόνους κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό GOT με κινητική μέθοδο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 3.1. Εφόσον το συνένζυμο NADH οξειδώνεται κατά τη συζευγμένη αντίδραση θα πρέπει να παρατηρηθεί μείωση της μετρούμενης απορρόφησης με το χρόνο (Αντιδράσεις 3.4 και 3.5). 70

72 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Ο προσδιορισμός της δραστικότητας του GOT με τη μέθοδο της IFCC στους 37 ο C, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Εργαστηριακό πείραμα υπό μορφή animation όπου φαίνεται η επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος στην παραγωγή έγχρωμου προϊόντος κατά μία ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Αnimation που επιδεικνύει τη βασική αρχή του μηχανισμού ενζυμικής κατάλυσης σύμφωνα με τη θεωρία «κλειδιού-κλειδαριάς» how_enzymes_w ork.html (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Animations με τις βασικές αρχές ενζυμικής κινητικής: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). 71

73 Αναφορές 1. ARNESON, L. & BRICKELL, M. (2007) Clinical Chemistry: A Laboratory Perspective. Philadelphia: Davis Company. 2. BERGMEYER, U., BOWERS, JR., HORDER, M., MOSS, W. (1976) Provisional recommendations on IFCC methods for the measurement of catalytic concentrations of enzymes. Part 2: IFCC method for aspartate aminotransferase. Clin Chim Acta, 70, p. F19-F BERGMEYER, U., HORDER, M., MOSS, W. (1978a) Provisional recommendations on IFCC methods for the measurement of catalytic concentrations of enzymes. Part 3: Revised IFCC method for aspartate aininotransferase. Clin Chem, 24, p BERGMEYER, U., SCHEIBE, P., WAHLEFELD, W. (1978b) Optimization of methods for aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase. Clin Chem, 24, p CHANG, R. (2005) Physical Chemistry for the Biosciences, California: University Science Books. 6. ΚΑΡΙΚΑΣ, Γ.Α. (2012) Εφαρμοσμένη Βιοχημεία. Αθήνα: Εκδόσεις Οδυσσέας, Βιβλιόπολις ΑΕΒΕ. 7. ΚΛΩΝΗΣ, Ι. (2008) Ενζυμική Βιοτεχνολογία. Ηράκλειο: Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. 8. MCPHERSON, A. & PINCUS, R. (2011) Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Philadelphia: Elsevier-Saunders. 9. PALMER, T. & BONNER, P. (2007) Enzymes: Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry, Cambridge: Woodhead Publishing Ltd. 10. PARDUE, L. (1977) A comprehensive classification of kinetic methods of analysis used in clinical chemistry. Clin Chem, 23, p ROGERS, A, & GIBON, Y. (2009; pp ) Enzyme Kinetics: Theory and Practice. In: Plant Metabolic Networks J. Schwender (ed.), Heidelberg: Springer Science and Business Media. 12. SEGEL, H. (1975) Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons. 13. SKOOG, D., WEST, D., HOLLER, F., CROUCH, S. (2014; pp ) Kinetic Methods of Analysis,. In: Fundamentals of Analytical Chemistry. California: Brooks/Cole. 14. WINN-DEEN, S., DAVID, H., SIGLER G., CHAVEZ, R. (1988) Development of a direct assay for alphaamylase. Clin Chem, 34, p

74 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΟΞΕΟΒΑΣΙΚΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό παρουσιάζονται οι βασικές έννοιες σχετικά με τη φυσιολογία, τις διαταραχές και την φυσιολογική και κλινική σημασία της οξεοβασικής και ηλεκτρολυτικής ισορροπίας του οργανισμού. Περισσότερο αναλυτικά παρουσιάζεται η οργανολογία προσδιορισμού των σχετικών εργαστηριακών παραμέτρων, ενώ αναφέρονται και η δειγματοληψία και ο χειρισμός των κλινικών δειγμάτων. Τέλος, στο πειραματικό μέρος του κεφαλαίου παρουσιάζονται περιληπτικά τα βασικά στάδια προσδιορισμού ηλεκτρολυτών με αυτόματο αναλυτή καθώς και με κλασική τεχνική ποσοτικής χημικής ανάλυσης. Προαπαιτούμενες γνώσεις Η κατανόηση του κεφαλαίου αυτού πρoϋποθέτει βασική γνώση της φυσιολογίας των νεφρών και των πνευμόνων. Η γνώση των εννοιών των οξέων και βάσεων, του ph, των ρυθμιστικών διαλυμάτων και της μερικής πίεσης των αερίων, καθώς και των βασικών αρχών της ποτενσιομετρίας και αμπερομετρίας, των φωτομετρικών μεθόδων τελικού σημείου και της φασματοφωτομετρίας ατομικής απορρόφησης, είναι επίσης απαραίτητη για την κατανόηση του κεφαλαίου αυτού. Τέλος, προαπαιτούμενες γνώσεις θεωρούνται ακόμα η σχετική με το ισοζύγιο του νερού και των ηλεκτρολυτών φυσιολογία, η ωσμωτικότητα, και η μεταφορά των μορίων που απαντώνται εσωκυττάρια διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. 4.1 Οξεοβασική Ισορροπία Ορισμοί- Βασικές Έννοιες Ο όρος οξεοβασική ισορροπία (acid-base balance) αναφέρεται στη διατήρηση της οξύτητας (δηλαδή της συγκέντρωσης των ιόντων Η + ) των υγρών του σώματος σε σταθερά επίπεδα, παρά το φορτίο οξέων αλλά και βάσεων που παράγονται κατά τον μεταβολισμό των κυττάρων ή που προσλαμβάνονται καθημερινά με τις τροφές. H συγκέντρωση των ιόντων Η + ([Η + ]) τυπικά εκφράζεται ως ph, το οποίο δίνεται από τη σχέση: ph = - log 10[H + ] (Εξίσωση 4.1) Θα πρέπει να σημειωθεί εδώ, ότι η [H + ] και το ph είναι αντιστρόφως ανάλογα μεγέθη. Αύξηση της [Η + ], δηλαδή αύξηση της οξύτητας, αντιστοιχεί σε μείωση του ph, και το αντίστροφο. Η φυσιολογική [Η + ] των 0,0004 mmol/l ισοδυναμεί με ph 7,40. Το φυσιολογικό εύρος των τιμών ph του αίματος είναι 7,35-7,45, δηλαδή το ph του περιβάλλοντος του οργανισμού παρουσιάζει μόνο μικρές διακυμάνσεις (Σχήμα 4.1). 73

75 Σχήμα 4.1 Σχηματική αναπαράσταση των διακυμάνσεων του ph του περιβάλλοντος του οργανισμού. Ο όρος «μερική πίεση» (partial pressure) αναφέρεται στην πίεση που εξασκείται στο αίμα από τα διαλυμένα αέρια του αίματος, εάν θεωρηθεί ότι το καθένα καταλαμβάνει μόνο του τον συνολικό όγκο του αίματος του οργανισμού. Η μερική πίεση ενός αερίου στο αίμα είναι ανάλογη της ποσότητας του διαλυμένου αερίου στο αίμα. Η μερική πίεση αερίου Χ συμβολίζεται ως P Χ. Επιπλέον, ο πεζός χαραχτήρας «a» στο «Pa», προστίθεται όταν γίνεται αναφορά στην τιμή της μερικής πίεσης αερίου στο αρτηριακό αίμα. Έτσι, η έκφραση PaCO 2 αναφέρεται στην πίεση που θα εξασκούνταν στο αρτηριακό αίμα από το διαλυμένο εκεί CΟ 2, εάν το CO 2 καταλάμβανε όγκο ίσο με το συνολικό όγκο του αρτηριακού αίματος. Η μερική πίεση μετράται σε kpa ή σε mm Hg. Για τη μετατροπή από kpa σε mm Hg πρέπει η μετρούμενη ένδειξη να πολλαπλασιαστεί επί 7,5. Για τη μετατροπή από mm Hg σε kpa πρέπει η μετρούμενη ένδειξη να διαιρεθεί διά 7, Σημασία Οξεοβασικής Ισορροπίας Αποκλίσεις πέραν των φυσιολογικών τιμών στη [H + ] έχουν ως αποτέλεσμα αποκλίσεις στη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών και των ενζυμικών συστημάτων, στη λειτουργία μεταφοράς οξυγόνου, στην κατανομή και κατάσταση ιονισμού των ηλεκτρολυτών (διαταραχές ηλεκτρολυτικής ισορροπίας) στην ερεθιστικότητα του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος, στη συσταλτικότητα του μυοκαρδίου και αλλού. Ως συνέπεια, η διατήρηση του ph του αίματος εντός στενών ορίων είναι απαραίτητη για την ομαλή λειτουργία του οργανισμού Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Οξεοβασικής Ισορροπίας Η διατήρηση της ομοιόστασης μέσω της σταθερότητας της οξύτητας του αίματος είναι αποτέλεσμα της λειτουργίας τριών φυσιολογικών μηχανισμών που εξομαλύνουν αιφνίδιες αλλαγές στην [Η + ] (Φύτου- Παλληκάρη, 2005): των ρυθμιστικών συστημάτων (buffer systems) του οργανισμού (ενδο- και εξω-κυττάριων), σημαντικότερο των οποίων είναι το ρυθμιστικό διάλυμα του ζεύγους H 2CO 3/ HCO 3-, της αναπνευστικής ρύθμισης (pulmonary control) της μερικής πίεσης του CO 2 (PCO 2), που επιτυγχάνεται με απαγωγή προς το περιβάλλον του CO 2 διαμέσου των πνευμόνων, της νεφρικής επαναρρόφησης ή απέκκρισης (renal reabsorption or rejection) της διττανθρακικής ρίζας (HCO 3- ) και της νεφρικής απέκκρισης οξέων και αμμωνίου. Η κεντρική σχέση που συνδέει τους τρεις παραπάνω μηχανισμούς ρύθμισης είναι η ακόλουθη: H 2Ο + CO 2 H 2CΟ 3 H + + HCO 3 - (Αντίδραση 4.1) Σύμφωνα με την παραπάνω σχέση, το διαλυμένο στο αίμα CO 2 παραλαμβάνει ένα μόριο νερού, ευρισκόμενο σε ισορροπία με το ανθρακικό οξύ H 2CO 3. Το H 2CO 3 επίσης βρίσκεται σε ισορροπία με τη διϊσταμένη μορφή αυτού, το διττανθρακικό ανιόν (bicarbonate anion, HCO 3- ) αποβάλλοντας ένα ιόν H +. Το CO 2 είναι προϊόν του κυτταρικού αερόβιου μεταβολισμού και συνεπώς παράγεται διαρκώς από τα κύτταρα. Αποβάλλεται στο αίμα και μεταφέρεται στους πνεύμονες (κατά 70% ως HCO 3- ), όπου τελικά απάγεται 74

76 προς το περιβάλλον. O ρυθμός παραγωγής του κατά τον οξειδωτικό μεταβολισμό και εκπνοής του από τους πνεύμονες είναι ίσος, έτσι που η PCO 2 να παραμένει σταθερή Σε διαταραχές του φυσιολογικού ph, οι παραπάνω μηχανισμοί εξομάλυνσης του ph ενεργοποιούνται προς την επιθυμητή κατεύθυνση, προκειμένου να επιτευχθεί αντιρρόπηση της αλλαγής. Γι αυτό το λόγο οι παραπάνω μηχανισμοί καλούνται και μηχανισμοί αντιρρόπησης (compensatory mechanisms). Τα ενδογενή ρυθμιστικά διαλύματα του οργανισμού αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού. Tα διαλύματα αυτά δρουν ταχύτατα με χημικό τρόπο ώστε να ελαχιστοποιήσουν αλλαγές του ph μέσω της ρύθμισης της σχετικής αναλογίας του οξέος και της συζυγούς βάσεως που συνιστούν το ρυθμιστικό. Το πιο σημαντικό είναι το ρυθμιστικό διάλυμα του ζεύγους H 2CO 3/ HCO 3-. Αναφέρθηκε ότι η ποσότητα του διαλυμένου CO 2 στο αίμα είναι ανάλογη της μερικής πίεσης του CO 2 (PCO 2) στο αίμα. Οι πνεύμονες, μέσω της εκπνοής και με βάση την Αντίδραση 4.1, ρυθμίζουν αποτελεσματικά τη συγκέντρωση και του H 2CO 3. Σύμφωνα με την Αντίδραση 4.1, η συσσώρευση του CO 2 στο αίμα έχει ως αποτέλεσμα την πτώση του ph, λόγω της μετατόπισης του δεύτερου σκέλους της ισορροπίας πρoς τα δεξιά. Το αναπνευστικό κέντρο του εγκεφάλου ρυθμίζει την ταχύτητα της αναπνοής των πνευμόνων καθορίζοντας το ρυθμό αποβολής του CO 2 και συνεπώς μπορεί να διατηρεί σταθερό το ph του αίματος. Έτσι, πτώση του ph, έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη λειτουργία των πνευμόνων (υπεραερισμός ή υπερκαπνία, hyperventilation ή hypercapnia) προκειμένου να απομακρυνθεί από τον οργανισμό η περίσσεια CO 2. Απομάκρυνση της περίσσειας του CO 2 μετατοπίζει την ισορροπία (Αντίδραση 4.1) προς τα αριστερά και συνεπώς οδηγεί σε μείωση της [Η + ]. Αντιστρόφως, αύξηση του ph επιβραδύνει την αναπνοή. Ο μειωμένος αερισμός (υποαερισμός ή υποκαπνία, hypoventilation ή hypocapnia) αυξάνει την PCO 2, μετατοπίζει την ισορροπία (Αντίδραση 4.1) προς τα δεξιά και επαναφέρει το ph προς τη φυσιολογική τιμή του. Η ρύθμιση του ph μέσω των πνευμόνων είναι ταχύτατη. Από την άλλη, η συγκέντρωση του διττανθρακικού ανιόντος, ([HCO 3- ]) είναι άμεσα ελεγχόμενη από τους νεφρούς. Ο μηχανισμός αντιρρόπησης των νεφρών ενεργοποιείται όταν οι δύο προηγούμενοι μηχανισμοί υπήρξαν αναποτελεσματικοί στην πλήρη αποκατάσταση του ph. Είναι όμως πολύ πιο αργός και απαιτεί κάποια 24ωρα προκειμένου να φτάσει στη μέγιστη δυναμικότητά του. Η πτώση του ph προκαλεί αποβολή από τους νεφρούς ιόντων Η + στα ούρα και κατακράτηση διττανθρακικών. Η κατακράτηση των διττανθρακικών έχει ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση της ισορροπίας (Αντίδραση 4.1) προς τα αριστερά και συνεπώς οδηγεί σε μείωση της [Η + ], δηλαδή σε αύξηση του ph. Αντίθετα, σε αύξηση του ph, οι νεφροί αποβάλλουν διττανθρακικά και κατακρατούν Η + υπό τη μορφή οργανικών οξέων, με αποτέλεσμα τη μετατόπιση της ισορροπίας (Αντίδραση 4.1) προς τα δεξιά και αποκατάσταση του φυσιολογικού ph. Η αμοιβαία εξάρτηση μεταξύ των παραπάνω μηχανισμών αποκατάστασης εκφράζεται από την εξίσωση των Henderson-Hasselbalch: ph = pk' + log ([HCO 3 - ]/ (S PCO 2) (Εξίσωση 4.2) όπου pk' ο αρνητικός λογάριθμoς της σταθεράς διάστασης του ανθρακικού οξέος και S η σταθερά διαλυτότητας του CO 2 στο αίμα. Η εξίσωση αυτή μπορεί να γραφεί απλoποιημένη ως: ph [HCO3 ] PCO2 (Εξίσωση 4.3) προκειμένου να τονισθεί η ανάλογη εξάρτηση του ph από το λόγο [HCO 3- ] / PCO 2. Η αμοιβαία εξάρτηση των βασικών οξεοβασικών παραμέτρων και η φυσιολογική ρύθμιση αυτών φαίνεται σχηματικά στο Σχήμα 4.2. Σύνοψη: Η αμοιβαία εξάρτηση μεταξύ των παραμέτρων της οξεοβασικής ισορροπίας και των μηχανισμών αποκατάστασης αυτής εκφράζεται από την εξίσωση των Henderson-Hasselbalch: ph ([HCO 3 - ])/PCO 2. Το διαλυμένο στο αίμα CO 2 παράγεται κατά τον κυτταρικό μεταβολισμό, οδηγώντας στην παραγωγή διττανθρακικού ανιόντος και ιόντων H +. Η PCO 2 ελέγχεται από τον αερισμό των πνευμόνων, ο οποίος προσαρμόζεται ώστε να διατηρούνται τα επίπεδα της PCO 2 εντός στενών ορίων. Η [HCO 3 ], όπως και η [H + ], ελέγχονται μέσω της νεφρικής απέκκρισης και επαναρρόφησης. Το τελικό ph του οργανισμού εξαρτάται από την ποσότητα των οξέων που παράγονται, τη ρυθμιστική ικανότητα των ρυθμιστικών συστημάτων του οργανισμού, και την αποβολή των οξέων μέσω των πνευμόνων και των νεφρών. 75

77 Σχήμα 4.2 Σχηματική αναπαράσταση της αμοιβαίας εξάρτησης μεταξύ των παραμέτρων της οξεοβασικής ισορροπίας και των μηχανισμών αποκατάστασης αυτής Διαταραχές της Οξεοβασικής Ισορροπίας Οι όροι οξέωση (acidosis) και αλκάλωση (alkalosis) αναφέρονται σε παθοφυσιολογικές διαταραχές της οξεοβασικής ισορροπίας που τείνουν να προκαλέσουν αύξηση ή μείωση της [Η + ], αντίστοιχα. Στην οξέωση λοιπόν έχουμε μείωση του ph του αίματος λόγω υψηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή λόγω μειωμένης συγκέντρωσης βάσεως). Αντίθετα, στην αλκάλωση σημειώνεται αύξηση του ph του αίματος λόγω χαμηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή λόγω αυξημένης συγκέντρωσης βάσεως). Η οξέωση και αλκάλωση διακρίνονται σε αναπνευστική ή μεταβολική, ανάλογα με το πρωτoγενές αίτιο τους. Έτσι, πρωτογενείς μεταβολές στην PCO 2 προκαλούν αναπνευστικής αιτιολογίας διαταραχές στην οξεοβασική ισορροπία, ενώ πρωτογενείς μεταβολές στην [HCO 3 - ] είναι υπεύθυνες για μεταβολικής αιτιολογίας διαταραχές. Συγκεκριμένα, η μεταβολική οξέωση (χαμηλή [HCO 3- ], primary metabolic acidosis) και η μεταβολική αλκάλωση (υψηλή [HCO 3- ], primary metabolic alkalosis) προκαλούνται πρωτογενώς λόγω της διαταραχής στην ισορροπία παραγωγής οξέων και βάσεων στον οργανισμό και αποβολής τους μέσω των νεφρών. Η αναπνευστική αλκάλωση (χαμηλό PCO 2, primary respiratory alkalosis), και αναπνευστική οξέωση (υψηλό PCO 2, primary respiratory acidosis), προκαλούνται πρωτογενώς από αλλαγές στην αποβολή του CO 2, λόγω πνευμονικών ή αναπνευστικών παθήσεων (Τιτόπουλος, 2001; Γιαμπίδου et al., 2010). Πέραν των απλών (αμιγών) διαταραχών στην οξεοβασική ισορροπία, οι οποίες προκαλούνται μόνο από έναν αιτιολογικό παράγοντα, είναι δυνατόν να εμφανίζονται και μεικτές διαταραχές (mixed acid-base disorders). Εκεί, περισσότερες οξεοβασικές διαταραχές συνυπάρχουν ως αιτιολογικοί παράγοντες. Στην τελευταία περίπτωση ο συνδυασμός των διαταραχών μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα φυσιολογική ή μη φυσιολογική τιμή ph. Κάθε πρωτογενής διαταραχή, προκαλεί την ενεργοποίηση κάποιου μηχανισμού αποκατάστασης (compensatory mechanism) του ph. Έτσι, η οξέωση και η αλκάλωση δεν έχουν απαραίτητα ως αποτέλεσμα μία οξυαιμία (ph < 7,35, acidemia) ή μία αλκαλαιμία (ph > 7,45, alkalemia). Οι διαταραχές της οξεοβασικής 76

78 ισορροπίας διακρίνονται σε μη αντιρροπούμενες ή οξείες (uncompensated ή acute), μερικώς αντιρροπούμενες (partly compensated) ή πλήρως αντιρροπούμενες (compensated), ανάλογα με το εάν ή όχι έχουν ενεργοποιηθεί οι μηχανισμοί για την αποκατάσταση του ph και με το πόσο αποτελεσματικοί υπήρξαν αυτοί. Η οξεία διαταραχή έχει νόημα στην περίπτωση των αναπνευστικών πρωτογενών διαταραχών, λόγω της καθυστέρησης στην ενεργοποίηση της αντιρροπιστικής απάντησης των νεφρών. Παρόμοια καθυστέρηση δεν υφίσταται σε φυσιολογική λειτουργία των πνευμόνων καθότι, όπως αναφέρθηκε, η αναπνευστική αντιρρόπηση ενεργοποιείται ταχύτατα. Έτσι, η οξεία αναπνευστική οξέωση διακρίνεται από τη δραστική ελάττωση του ph, ενώ στη χρόνια αναπνευστική οξέωση, το ph διατηρείται σε ικανοποιητικά επίπεδα, λόγω της ενεργοποίησης της αντιρροπιστικής απάντησης των νεφρών. Η σχέση των Hendersοn Hasselbalch (Εξίσωση 4.2) επιτρέπει την πρόβλεψη της αντιρροπιστικής απάντησης του οργανισμού σε συγκεκριμένες διαταραχές της οξεοβασικής ισορροπίας. Ως παραδείγματα παρουσιάζονται τα παρακάτω: 1. Kατά την αναπνευστική αλκάλωση αναφέρθηκε ότι η PaCO 2 είναι μειωμένη. Η αντιρροπιστική απάντηση του oργανισμού προκειμένου να διατηρηθεί σταθερό το ph (δηλ. σύμφωνα με την σχέση των Hendersοn Hasselbalch προκειμένου να διατηρηθεί ο λόγος ([HCO 3- ])/PCO 2 σταθερός) είναι η μείωση των διττανθρακικών. 2. Κατά τη μεταβολική οξέωση αναφέρθηκε ότι η [HCO 3- ] είναι μειωμένη. Η αναμενόμενη αντιρροπιστική απάντηση του oργανισμού προκειμένου να διατηρηθεί σταθερό το ph είναι η μείωση της PCO 2. Στον Πίνακα 4.1 φαίνεται η μεταβολή των βασικών παραμέτρων της οξεοβασικής ισορροπίας σε αναπνευστική ή μεταβολική αλκάλωση και οξέωση. Στον Πίνακα 4.2 παρουσιάζονται κάποια ειδικότερα αριθμητικά κριτήρια που βοηθούν στην εκτίμηση του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής από τον κλινικό επιστήμονα (Hennessey & Japp, 2007 Verma & Roach, 2010 Gaw et al., 2013). Μεταβολικές Διαταραχές Μεταβολική Οξέωση Μεταβολική Αλκάλωση Αναπνευστικές Διαταραχές Αναπνευστική Οξέωση Αναπνευστική Αλκάλωση ph PaCO2 [HCO3 - ] Σ Mη αντιρροπούμενη Aντιρροπούμενη Σ Mη αντιρροπούμενη Aντιρροπούμενη Πίνακας 4.1 Πίνακας συσχέτισης της τάσης μεταβολής των τιμών των κυριότερων οξεοβασικών παραμέτρων του αρτηριακού αίματος με τον τύπο της οξεοβασικής διαταραχής. Το γράμμα «Σ» υποδεικνύει μη μεταβολή στην τιμή της παραμέτρου. Σ Mη αντιρροπούμενη Aντιρροπούμενη Σ Mη αντιρροπούμενη Aντιρροπούμενη Περίσσεια Βάσης Σ ή Σ ή Οξεοβασική Διαταραχή ph PaCO2 HCO3 - Αναπνευστική Οξέωση Οξεία < 7,35 > 45 mmhg Φυσιολογικό 77

79 Μερικώς αντιρροπούμενη < 7,35 > 45 mmhg > 26 mmol/l Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό > 45 mmhg > 26 mmol/l Αναπνευστική Αλκάλωση Οξεία > 7,45 < 35 mmhg Φυσιολογικό Μερικώς αντιρροπούμενη > 7,45 < 35 mmhg < 22 mmol/l Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό < 35 mmhg < 22 mmol/l Μεταβολική Οξέωση Μερικώς αντιρροπούμενη < 7,35 < 35 mmhg < 22 mmol/l Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό < 35 mmhg < 22 mmol/l Μεταβολική Αλκάλωση Μερικώς αντιρροπούμενη > 7,45 > 45 mmhg > 26 mmol/l Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό > 45 mmhg > 26 mmol/l Πίνακας 4.2 Πίνακας συσχέτισης της μεταβολής των τιμών των κυριότερων οξεοβασικών παραμέτρων του αρτηριακού αίματος με τον τύπο της οξεοβασικής διαταραχής. Ο πίνακας περιέχει συγκεκριμένα αριθμητικά κριτήρια για την αξιολόγηση του τύπου της διαταραχής και της αντιρρόπησης. Σύνοψη: Οξέωση είναι η μείωση του ph του αίματος λόγω υψηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή λόγω μειωμένης συγκέντρωσης βάσεως). Αλκάλωση είναι η αύξηση του ph του αίματος λόγω χαμηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή λόγω αυξημένης συγκέντρωσης βάσεως). Η μεταβολική οξέωση και μεταβολική αλκάλωση προκαλούνται πρωτογενώς λόγω της διαταραχής στην ισορροπία παραγωγής οξέων και βάσεων στον οργανισμό και της αποβολής τους μέσω των νεφρών. Η αναπνευστική αλκάλωση και αναπνευστική οξέωση προκαλούνται πρωτογενώς από αλλαγές στην αποβολή του CO 2, λόγω πνευμονικών ή αναπνευστικών παθήσεων. Η σχέση των Hendersοn Hasselbalch επιτρέπει την εκτίμηση της αντιρροπιστικής απάντησης του οργανισμού σε συγκεκριμένες διαταραχές της οξεοβασικής ισορροπίας Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση οξεοβασικών διαταραχών Η ανάλυση των αερίων του αρτηριακού αίματος (Arterial Blood Gas Analysis ή ABG Analysis) και ο προσδιορισμός των υπόλοιπων οξεοβασικών παραμέτρων εκτελείται προκειμένου να εκτιμηθεί η αναπνευστική λειτουργία και η κατάσταση της οξεοβασικής ισορροπίας ενός ασθενούς. Έτσι είναι χρήσιμη στη: διάγνωση και παρακολούθηση της θεραπείας αναπνευστικών προβλημάτων και πνευμονικών παθήσεων όπως άσθμα, κυστική ίνωση, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (COPD), παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε περίπτωση παροχής οξυγόνου με μηχανική υποστήριξη σε ασθενή, μέτρηση της οξεοβασικής κατάστασης σε ασθενείς με νεφρική ή καρδιακή ανεπάρκεια, μη ρυθμιζόμενο διαβήτη, σε εκτεταμένη μόλυνση, σε διαταραχές της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας ή σε κατάχρηση ουσιών Ανάλυση Αερίων Αίματος Η ανάλυση των αερίων του αίματος γίνεται με αυτόματο αναλυτή αερίων (ΑΑΑ, blood gas analyser), συνηθέστερα σε δείγμα αρτηριακού αίματος, που συλλέγεται αναερόβια, συνήθως από την κερκιδική αρτηρία. Υπάρχουν στο διαδίκτυο πολλά σχετικά βίντεο που μπορούν να καθοδηγήσουν τον δειγματολήπτη όσον αφορά τη δειγματοληψία αρτηριακού αίματος, που είναι περισσότερο πολύπλοκη από τη δειγματοληψία φλεβικού αίματος. Μία εναλλακτική μεθοδολογία δειγματοληψίας αποτελεί η λήψη τριχοειδούς αίματος. Αυτή είναι ελάχιστα επώδυνη και παρεμβατική και τεχνικά απλούστερη σε σχέση με την αρτηριακή αιμοληψία, ενώ δεν εμπεριέχει τον κίνδυνο σοβαρών επιπλοκών ενός αρτηριακού καθετηριασμού (π.χ. αιμορραγίας, θρόμβωσης, συστημικής μόλυνσης). Αντίστοιχα πλεονεκτήματα παρουσιάζει η λήψη φλεβικού αίματος. Πολλές κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει ότι το τριχοειδές αίμα μπορεί να υποκαταστήσει το αρτηριακό αίμα μόνο στην περίπτωση μέτρησης των παραμέτρων ph και PCO 2 κι όχι της PO 2 (Higgins, 2008). Ο ίδιος περιορισμός έχει προταθεί και για το φλεβικό αίμα, για το οποίο υπάρχει μεγαλύτερη ασυμφωνία μεταξύ των μελετών ως προς 78

80 την κλινική σημασία του προσδιορισμού των αερίων αίματος σε αυτό (Toftegaard et al., 2009 Awasthi et al., 2013 Delost, 2014). Σε κάθε περίπτωση, δεν απαιτείται ιδιαίτερη προκατεργασία του δείγματος αίματος, πλην της ανάμιξης αυτού, πριν την εισαγωγή του στον αναλυτή. Μία σειρά περιβαλλοντικών παραγόντων ή παραγόντων σχετιζόμενων με τη δειγματοληψία, μπορεί όμως, να επηρεάσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης των οξεοβασικών παραμέτρων. Οι κρίσιμοι παράγοντες για τη σωστή εκτίμηση των οξεοβασικών παραμέτρων αναφέρονται στην Ενότητα Μέτρηση ph, PCO 2, PO 2 Στα πλαίσια της ανάλυσης των αερίων του αίματος προσδιορίζονται εργαστηριακά κατά το ελάχιστο το ph και η PCO 2 του αίματος. Συνήθως προσδιορίζεται εργαστηριακά και η PO 2. Στη συνέχεια ο προσδιορισμός της [ΗCΟ 3- ] γίνεται υπολογιστικά από την εξίσωση των Henderson-Hasselbalch (Εξίσωση 4.2). Ο προσδιορισμός των τεσσάρων αυτών παραμέτρων αναφέρεται ως «ανάλυση αερίων αίματος» (blood gas analysis). Σχεδόν το σύνολο των μορίων οξυγόνου στο αίμα βρίσκονται δεσμευμένα σε μία μεταφορική πρωτεΐνη που ονομάζεται αιμογλοβίνη ή αιμοσφαιρίνη (Hb, h(a)emoglobin). Μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα του οξυγόνου του αίματος (< 3%) βρίσκεται μη δεσμευμένο και διαλυμένο στο αίμα. Κατά συνέπεια, η μερική πίεση του οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα, PaO 2, η οποία αποτελεί μέτρο μόνο των διαλυμένων/μη δεσμευμένων μορίων οξυγόνου, δεν απεικονίζει με ακρίβεια την ολική περιεκτικότητα του αίματος σε οξυγόνο. Έτσι, δεν αποτελεί ένδειξη της οξεοβασικής κατάστασης του οργανισμού, αλλά ασφαλώς εξαρτάται από την πρόσληψη του οξυγόνου από τους πνεύμονες και συνεπώς απεικονίζει την αποτελεσματικότητα της αναπνευστικής λειτουργίας Υπολογιζόμενες παράμετροι Οξεοβασικής Ισορροπίας Εκτός από τις μετρούμενες παραμέτρους, υπολογίζονται και πολλές άλλες επικουρικές παράμετροι για την λεπτομερέστερη εκτίμηση της οξεοβασικής ισορροπίας. O υπολογιστικός προσδιορισμός τους βασίζεται σε συγκεκριμένες εξισώσεις, (Delost, 2014), όλες από τις οποίες δεν κρίνεται σκόπιμο να αναφερθούν στα πλαίσια αυτού του εργαστηριακού οδηγού. Η υπολογιζόμενη παράμετρος που συνοδεύει πάντοτε μία ανάλυση αερίων είναι η [ΗCΟ 3- ]. Άλλες τέτοιες παράμετροι είναι συνηθέστερα οι παρακάτω: Χάσμα Ανιόντων Ο προσδιορισμός του χάσματος ανιόντων (anion gap ή AG) βoηθά στην αιτιολογική διάγνωση της μεταβoλικής oξέωσης. Σχετίζεται και με την ηλεκτρολυτική ισορροπία (όπως θα αναπτυχθεί αναλυτικά παρακάτω). Υπολογίζεται από τη σχέση: Χάσμα ανιόντων ΑG = [Να + ]- ([Cl - ] +[ΗCΟ 3 - ]) (Εξίσωση 4.4) Ορισμένοι κλινικοί επιστήμονες χρησιμοποιούν την έκφραση της Εξίσωσης 4.5. για το χάσμα ανιόντων, όπου συνυπολογίζεται και η [Κ + ]. Χάσμα ανιόντων ΑG = ([Να + ]+[Κ + ])- ([Cl - ] +[ΗCΟ 3 - ]) (Εξίσωση 4.5) Η μέτρηση των [Νa + ], [Κ + ] και [Cl - ] αναπτύσσεται επίσης αργότερα στο ίδιο κεφάλαιο. Είναι εμφανές από τις Eξισώσεις 4.4 και 4.5, ότι εάν η μεταβoλική oξέωση οφείλεται σε προσθήκη οξέων το χάσμα ανιόντων υπολογίζεται αυξημένo (διότι αύξηση της [Η + ] συνεπάγεται μείωση της [ΗCΟ 3- ]), κατά τη μετατόπιση της Αντίδρασης 4.1 προς τα αριστερά. Αντιθέτως, εάν η μεταβoλική oξέωση oφείλεται σε απώλεια διττανθρακικών το χάσμα ανιόντων υπολογίζεται φυσιoλoγικό, κι όχι μειωμένο, διότι οι απώλειες των διττανθρακικών, στην περίπτωση αυτή, αντισταθμίζονται από αύξηση των χλωριόντων στον οργανισμό. Περίσσεια Βάσης Η τιμή της περίσσειας βάσης (base excess ή ΒΕ) δίνει την περίσσεια, πέραν των φυσιολογικών επιπέδων, των βάσεων που υπάρχουν στο αίμα και οι οποίες μπορούν να εξουδετερώσουν τα υπάρχοντα οξέα του. Ορίζεται 79

81 ως η ποσότητα του οξέος ή βάσεως που απαιτείται για τη τιτλοδότηση 1 L του αίματος υπό φυσιολογική PaCO 2 (40 mmhg) στη φυσιολογική τιμή του ph (7,40) και θερμοκρασία 37 ο C. Δίνεται σε meq/l ή πλέον συνηθέστερα σε mmol/l. Θετική τιμή περίσσειας βάσης σημαίνει ότι υπάρχει υψηλότερη των φυσιολογικών επιπέδων συγκέντρωση βάσης σε σχέση με τη συγκέντρωση των υπαρχόντων οξέων. Αρνητική τιμή δηλώνει έλλειμμα βάσεων (base deficit). Συνεπώς η ιδανική τιμή της παραμέτρου είναι 0, η οποία δηλώνει απουσία ελλείματος ή περίσσειας βάσης. Κορεσμός Οξυγόνου Αναφέρθηκε ότι σχεδόν το σύνολο των μορίων οξυγόνου στο αίμα βρίσκονται δεσμευμένα στη μεταφορική πρωτεΐνη αιμοσφαιρίνη (hemoglobin ή HgB). Για τον λόγο αυτό κοινώς, μετριέται ταυτόχρονα (ή υπολογίζεται μέσω εξίσωσης) και ο κορεσμός οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα (SaO 2, oxygen saturation). Αυτό είναι το ποσό της συνδεδεμένης με οξυγόνο αιμοσφαιρίνης, εκφραζόμενο ως κλάσμα του συνολικού ποσού αιμοσφαιρίνης. Στον Πίνακα 4.3 φαίνονται οι τιμές αναφοράς των κυριότερων παραμέτρων που προσδιορίζονται από τους αναλυτές αερίων και οι οποίες σχετίζονται με την αξιολόγηση της οξεοβασικής ισορροπίας και της πνευμονικής λειτουργίας. Οι τιμές αυτές διαφοροποιούνται ελαφρώς ανάλογα με τη βιβλιογραφική πηγή, ιδίως όσον αφορά το χάσμα ανιόντων. Έτσι, για την αξιολόγηση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων απαιτείται ο προσδιορισμός του διαστήματος αναφοράς από το ίδιο εργαστήριο όπου πραγματοποιείται η ανάλυση. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η μερική πίεση των αερίων εξαρτάται από τη θερμοκρασία και το υψόμετρο, ενώ το ph εξαρτάται μόνο από τη θερμοκρασία. Κατά συνέπεια, θα πρέπει οι δύο αυτές παράμετροι να καταγράφονται κατά τη λήψη του προς ανάλυση δείγματος, και μετά τον προσδιορισμό των PO 2, PCO 2 και ph, οι τιμές τους να διορθώνονται σχετικά. Οι σύγχρονοι αναλυτές αερίων εκτελούν αυτή τη διόρθωση αυτόματα. Η διόρθωση της PO 2 σε περίπτωση υπερθερμίας του ασθενούς θεωρείται γενικά απαραίτητη λόγω της σημαντικής εξάρτησης της διαλυτότητας του οξυγόνου σε υδατικά διαλύματα από τη θερμοκρασία. Αντίθετα πολλοί κλινικοί επιστήμονες αμφισβητούν την αναγκαιότητα διόρθωσης των τιμών ph και PCO 2 σε περίπτωση υπερθερμίας του ασθενούς. Παράμετρος Τιμή ph 7,35-7,45 PaCO mmhg, mmhg PaO mmhg SaO % [HCO - 3 ] mmol/l BE (Περίσσεια Βάσης) -2,0 έως +3,0 mmol/l AG (Χάσμα Ανιόντων) 8-12 mmol/l ή mmol/l, ανάλογα με το εάν στον προσδιορισμό του χρησιμοποιείται η Εξίσωση 4.4 ή 4.5 αντίστοιχα Πίνακας 4.3 Τιμές αναφοράς (στο επίπεδο της θάλασσας για ενήλικες και στους 37 C) των συνηθέστερων παραμέτρων που προσδιορίζονται ή υπολογίζονται κατά την ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος με αναλυτή αερίων. Στη Φωτογραφία 4.1 φαίνονται τα αποτελέσματα της ανάλυσης δείγματος αρτηριακού αίματος με αναλυτή αερίων. Ύστερα από σύγκριση των αποτελεσμάτων αυτών με τις τιμές αναφοράς του Πίνακα 4.3, είτε χρησιμοποιώντας τους κανόνες των Πινάκων 4.1 και 4.2, είτε το νομόγραμμα του Σχήματος 4.3, είτε τις υπολογιστικές μηχανές του διαδικτύου, σε κάθε περίπτωση, προκύπτει ότι πρόκειται για ασθενή που παρουσιάζει διαταραχή της οξεοβασικής ισορροπίας. 80

82 Φωτογραφία 4.1 Αποτελέσματα ανάλυσης δείγματος αρτηριακού αίματος με αναλυτή αερίων. Σύνοψη: H ανάλυση των αερίων του αίματος για την εκτίμηση της οξεοβασικής κατάστασης του οργανισμού και της οξυγόνωσής του γίνεται με αυτόματο αναλυτή αερίων και περιλαμβάνει τον προσδιορισμο του ph, της PCO 2, της PO 2, καθώς και τον υπολογισμό της [HCO 3 - ]. Η PO 2 δεν αποτελεί ένδειξη της οξεοβασικής κατάστασης του οργανισμού, αλλά ένδειξη της πρόσληψης οξυγόνου και της ανταλλαγής αερίων και συνεπώς της αναπνευστικής λειτουργίας του ασθενούς. Πέραν των παραπάνω μετρούμενων παραμέτρων, υπολογίζονται και πολλές άλλες, όπως συνηθέστερα το χάσμα ανιόντων ή η περίσσεια βάσης. O υπολογιστικός προσδιορισμός τους βασίζεται σε συγκεκριμένες εξισώσεις Εκτίμηση του Είδους της Οξεοβασικής Διαταραχής και Κλινική Σημασία των αποτελεσμάτων της ανάλυσης Η μεθοδολογία της αξιολόγησης της ανάλυσης των οξεοβασικών παραμέτρων δε συγκαταλέγεται εντός των στόχων αυτού του εργαστηριακού οδηγού. Στους Πίνακες 4.1 και 4.2 αναφέρονται κάποια γενικά κριτήρια που μπορεί ο κλινικός επιστήμονας να ακολουθήσει προκειμένου να αξιολογήσει τον τύπο της οξεοβασικής διαταραχής. Επιπλέον, υπολογιστικές μηχανές αυτόματης εκτίμησης του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής (acid-base calculators) και νομογράμματα (nomograms) είναι διαθέσιμα στον κλινικό επιστήμονα, προκειμένου να τον βοηθήσουν στην αξιολόγηση του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής. Σύνδεσμοι πρόσβασης σε σχετικές υπολογιστικές μηχανές δίνoνται στο τέλος του κεφαλαίου. Στο Σχήμα 4.3 παρουσιάζεται σχετικό νομόγραμμα. Τα νομογράμματα απεικονίζουν γραφικά τις σχέσεις που συνδέουν τις τρείς βασικές παραμέτρους της οξεοβασικής ισορροπίας (ph, PCO 2 και [ΗCO 3- ]) και επιτρέπουν τον κατά προσέγγιση, γραφικό υπολογισμό του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής (Hennessey & Japp, 2007 Verma & Roach, 2010). 81

83 Σχήμα 4.3 Νομόγραμμα (Cogan, 1991) που συσχετίζει γραφικά τις τρείς βασικές παραμέτρους της οξεοβασικής ισορροπίας (ph, PaCO 2 και [ΗCO 3 - ]). Για να χαρακτηρίσουμε την οξεοβασική κατάσταση του ασθενούς με αποτελέσματα ανάλυσης αερίων αίματος, όπως αυτά της Φωτογραφίας 4.1 (ph = 7,49, PCO 2 = 42,3 mmhg και [ΗCO 3- ] = 32,0 mmol/l) ακολουθούμε στο νομόγραμμα την αντίστοιχη κάθετη ευθεία του ph, την αντίστοιχη οριζόντια ευθεία της [ΗCO 3- ] και την αντίστοιχη καμπύλη της PCO 2. Διαπιστώνουμε ότι το σημείο, όπου οι τρεις γραμμές τέμνονται, εντάσσεται στην περιοχή με ένδειξη «μεταβολική αλκάλωση». Αυτό είναι σε συμφωνία με την ένδειξη που προκύπτει μετά από μελέτη του Πίνακα 4.1 (μη αντιρροπούμενη μεταβολική αλκάλωση), αλλά και με υπολογιστικές μηχανές του διαδικτύου. Παρακάτω αναφέρονται κάποιες γενικότερες έννοιες σχετικές με την κλινική σημασία των εργαστηριακών ευρημάτων της ανάλυσης της οξεοβασικής ισορροπίας: Πάντοτε σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα, η ανάλυση των αερίων του αίματος μπορεί να διευκολύνει τη διάγνωση και παρακολούθηση της θεραπείας. Είναι σημαντικό να τονισθεί όμως ότι η ανάλυση των αερίων του αίματος δεν μπορεί, από μόνη της, να οδηγήσει σε συγκεκριμένη διάγνωση. Για παράδειγμα, διαφορετικές αναπνευστικές ή πνευμονικές παθολογίες μπορούν να δώσουν πολύ ανάλογες τιμές κατά την ανάλυση των αερίων του αίματος. Η ανάλυση των αερίων του αίματος δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα διαγνωστικό τεστ για την διάγνωση πνευμονικής παθολογίας, όταν αυτή βρίσκεται στα αρχικά στάδια της. Συνηθέστερα, σημαντική εκτροπή των τιμών που λαμβάνονται κατά την ανάλυση των αερίων του αίματος πέραν των φυσιολογικών δεν είναι εμφανής, πριν την εξέλιξη της παθολογίας σε προχωρημένο στάδιο. Τα αποτελέσματα της μέτρησης των αερίων του αίματος υποδεικνύουν κατά πόσο πρόκειται για οξέωση ή αλκάλωση και την αιτιογένεση αυτής, λόγω μεταβολικών ή αναπνευστικών διαταραχών. Κατά κανόνα, μία φυσιολογική τιμή ph συνοδευόμενη από μη φυσιολογική τιμή PaCO 2 ή [HCO 3ˉ] αποτελεί ένδειξη 82

84 μεικτού τύπου διαταραχής. Η PaCO 2 αντικατοπτρίζει την αποτελεσματικότητα του κυψελιδικού αερισμού, ενώ η PaO 2 αντικατοπτρίζει την αποτελεσματικότητα της οξυγόνωσης του αρτηριακού αίματος. Υπό χαμηλή PaO 2 η οξυγόνωση των ιστών είναι περιορισμένη και μπορεί να λάβει χώρα υποξία. Το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα και η καρδιά είναι περισσότερα ευαίσθητα στην υποξία με πολύ δυσμενείς συνέπειες για τον οργανισμό Οργανολογία Aυτόματοι Αναλυτές Αερίων Εργαστηριακοί και Παρακλίνιοι Αναλυτές Αερίων Ο προσδιορισμός των παραμέτρων που χαρακτηρίζουν την οξεοβασική ισορροπία γίνεται με τη χρήση αυτόματων αναλυτών αερίων (ΑΑΑ). Ένας αυτόματος αναλυτής αερίων αποτελεί κύριο διαγνωστικό εργαλείο των μονάδων εντατικής θεραπείας, για τη διαχείριση ασθενών σε επείγουσα κατάσταση, τη διάγνωση και υποστήριξη ασθενών πριν και μετά από χειρουργείο και των μονάδων εντατικής θεραπείας νεογνών. Πολύ συχνά χρησιμοποιούνται τελευταίως και φορητοί αναλυτές αερίων (portable blood gas analysers) στην παρακλίνια ανάλυση (point-of-care (POC) testing) προκειμένου να επιταχύνεται η λήψη των αποτελεσμάτων, και να πραγματοποιείται η ανάλυση κοντά στο χώρο περίθαλψης των ασθενών. Η χρήση των παρακλίνιων αναλυτών αερίων έτσι, μειώνει την πιθανότητα προ-αναλυτικού σφάλματος π.χ. λόγω ανταλλαγής αερίων μέσω του τοιχώματος της σύριγγας όπου περιέχεται το αίμα, ή λόγω συνεχιζόμενου κυτταρικού μεταβολισμού στο απομονωμένο δείγμα κ.λπ. Άλλα σημαντικά πλεονεκτήματά τους αποτελούν η μεγαλύτερη ευκολία χειρισμού τους και το μικρό μέγεθός τους (Chin et al., 2012 Delost, 2014). Μειονέκτημα των παρακλίνιων αναλυτών αποτελεί το γεγονός ότι συχνά χρησιμοπιούνται από προσωπικό που δεν είναι αρκετά και κατάλληλα εξειδικευμένο με αποτέλεσμα την αύξηση της πιθανότητας εισαγωγής αναλυτικών σφαλμάτων κυρίως στο προ-αναλυτικό στάδιο, ή στο μετα-αναλυτικό στάδιο, εάν τα αποτελέσματα πρέπει να μεταβιβαστούν χειρόγραφα στο κεντρικό πληροφοριακό σύστημα του εργαστηρίου. Επιπλέον, οι παρακλίνιοι αναλυτές αερίων βασίζονται στη χρήση δισκετών μίας χρήσης, οι οποίες περιέχουν Oλοκληρωμένα Hλεκτρονικά Kυκλώματα (microchips) με ενσωματωμένα τα ηλεκτρόδια μέτρησης και τα διαλύματα για τη βαθμονόμηση και τον ποιοτικό έλεγχο, γεγονός που αυξάνει το κόστος της ανάλυσης (Papadea, et al., 2002). Τέλος δεν υπάρχει σε όλες τις περιπτώσεις πλήρης συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από τους παρακλίνιους αναλυτές και τους εργαστηριακούς αναλυτές. Η συχνή απουσία πλήρους συσχέτισης οφείλεται σε διαφορές στην ακριβή μεθοδολογία της ανάλυσης και στην προέλευση του δείγματος αίματος (αρτηριακό ή μη) ανάμεσα στις δυο αναλύσεις (Delost, 2014). Μέρη ενός Αναλυτή Αερίων Μία βασική διάταξη εργαστηριακού αναλυτή αερίων περιλαμβάνει τα παρακάτω επιμέρους τμήματα (Φωτογραφία 4.2): τις θέσεις εισαγωγής δείγματος: τυπικά οι σύγχρονοι αναλυτές αερίων παρέχουν περισσότερες δυνατότητες εισαγωγής του δείγματος αίματος, είτε με αναρρόφηση από σύριγγα ή από τριχοειδικό σωλήνα, είτε με χειρωνακτική εισαγωγή από σύριγγα, το θάλαμο μέτρησης, ο οποίος αποτελείται από ένα τριχοειδικό σωλήνα όπου διοχετεύεται το αναρροφημένο, προς μέτρηση δείγμα αίματος και όπου καταλήγουν οι άκρες των ηλεκτροδίων μέτρησης του ph, της PO 2 και PCO 2, αντλία για την αναρρόφηση και προώθηση του δείγματος στον αναλυτή, το ηλεκτρόδιο υάλου μέτρησης ph, το ηλεκτρόδιο μέτρησης PO 2, το ηλεκτρόδιο μέτρησης PCO 2, οθόνη χειρισμού, καταγραφικό: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται κατά την ανάλυση στέλνεται στη συνέχεια σε κάποιον υπολογιστή, όπου εκτυπώνεται ή διοχετεύεται απευθείας στο κεντρικό πληροφορικό σύστημα του εργαστηρίου, 83

85 δεξαμενή αποβλήτων: Με την ολοκλήρωση της μέτρησης, το αίμα αυτόματα μεταγγίζεται προς μία δεξαμενή αποβλήτων, ενώ ο τριχοειδικός σωλήνας, όπου καταλήγουν οι άκρες των ηλεκτροδίων μέτρησης εκπλένεται αυτόματα. Ανάλογα με το μοντέλο του αναλυτή αερίων και τις ανάγκες του εργαστηρίου, μπορεί να είναι επιπλέον ενσωματωμένα και συστήματα μέτρησης ηλεκτρολυτών (ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια, βλ. Ενότητα ), μέτρησης HbO 2, μέτρησης μεταβολιτών (σακχάρου ή/και γαλακτικού οξέος) και προσδιορισμού του αιματοκρίτη. Οι αναλυτές αερίων περιλαμβάνουν επίσης ενσωματωμένα και άλλα συστήματα, που χαρακτηρίζουν τους σύγχρονους αυτόματους αναλυτές, όπως αυτόματα συστήματα βαθμονόμησης, σύστημα ποιοτικού ελέγχου, barcode scanner, υπολογιστή για τη διαχείριση, αποθήκευση και ανάκληση αρχείων κι έχουν πολύ συχνά τη δυνατότητα διοχέτευσης των δεδομένων απευθείας στο κεντρικό πληροφορικό σύστημα του εργαστηρίου (βλ. Eνότητα 7.4), (Cristalli & Manzoni 2000). Φωτογραφία 4.2 Εργαστηριακός αναλυτής αερίων Cobas b221 από τον οίκο Roche. Ο αναλυτής διαθέτει περισσότερες δυνατότητες εισαγωγής του δείγματος αίματος και δυνατότητα ανάλυσης 18 κλινικών παραμέτρων που είναι κοινές στη διαχείριση ασθενών στις μονάδες εντατικής θεραπείας, μεταξύ αυτών και των αερίων αίματος Αντιπροσωπευτικές διατάξεις φορητών παρακλίνιων αναλυτών αερίων αίματος φαίνονται στη Φωτογραφία 4.3. Οι παρακλίνιοι ΑΑΑ αποτελούνται από τα ίδια επιμέρους τμήματα με τη διαφορά ότι τα διαλύματα για τη βαθμονόμηση και ποιοτικό έλεγχο, τα μικροηλεκτρόδια μέτρησης (όπως και τα αντιδραστήρια ανάπτυξης για τον τυχόν προσδιορισμό μεταβολιτών) και η δεξαμενή αποβλήτων περιλαμβάνονται όλα σε δισκέτες μίας χρήσης που προσαρμόζονται στους αναλυτές και καθορίζουν τις παραμέτρους που πρόκειται να μετρηθούν. Έτσι δεν απαιτείται χειρωνακτική φόρτωση των αντιδραστηρίων και διαλυμάτων για τη βαθμονόμηση και ποιοτικό έλεγχο, ή περιοδική αντικατάσταση των ηλεκτροδίων και των τριχοειδών σωληναρίων του θαλάμου μέτρησης ή των αντλιών. 84

86 Φωτογραφία 4.3 Φορητοί παρακλίνιοι αναλυτές αερίων αίματος i-stat από τον οίκο Abbott (Α), Element POC από τον οίκο Heska (Β) και TRUPOINT από τον οίκο ITC (Γ). Οι συσκευές διοχετεύουν τα δεδομένα απευθείας στο κεντρικό πληροφορικό σύστημα του εργαστηρίου. Συνοδεύονται από μεγάλη ποικιλία δισκετών μίας χρήσης, που εισάγονται στη συσκευή (όπως στην Β1) και καθορίζουν τις παραμέτρους (αέρια αίματος, ηλεκτρολύτες, μεταβολικές παράμετροι κ.α.) που πρόκειται να μετρηθούν. Η φόρτωση του δείγματος αίματος γίνεται απευθείας στη δισκέτα (όπως στην Β2). Από την ιστοσελίδα των εμπορικών οίκων Abbott, Heska και ITC. Παρακάτω παρουσιάζονται οι βασικές αρχές λειτουργίας των ηλεκτροδίων ph και αερίων, που περιλαμβάνει κάθε αναλυτής αερίων. Ηλεκτρόδιο μέτρησης ph Περιλαμβάνει ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς (καλομέλανα ή Ag/AgCl) και ένα ηλεκτρόδιο μετρήσεως (Ag/AgCl σε διάταξη ηλεκτροδίου υάλου). Τα ηλεκτρόδια συνδέονται μεταξύ τους και με όργανο μετρήσεως δυναμικού. Το ηλεκτρόδιο υάλου φέρει στο κατώτερο τμήμα του ειδικά επεξεργασμένη μεμβράνη υάλου, της οποίας η μία πλευρά βρίσκεται σε επαφή με διάλυμα ΗCl γνωστού και σταθερού ph (όπου είναι εμβαπτισμένο το ηλεκτρόδιο Ag/AgCl) και η άλλη σε επαφή με το διάλυμα, του οποίου το ph επιθυμούμε να προσδιορίσουμε (Σχήμα 4.4). Το ηλεκτρόδιο καλομέλανα περιέχει κεκορεσμένο διάλυμα KCl γνωστού και σταθερού ph και είναι εμβαπτισμένο στο διάλυμα, του οποίου το ph επιθυμούμε να προσδιορίσουμε. Στο κατώτερο τμήμα του φέρει διαπερατό διάφραγμα που επιτρέπει την ελεύθερη διακίνηση ιόντων. Τα κατιόντα Νa + του επιφανειακού στρώματος της υάλου, στο ηλεκτρόδιο υάλου, ανταλλάσσονται με κατιόντα Η + του διαλύματος, εκατέρωθεν της μεμβράνης. Έτσι προκύπτει μία διαφορά δυναμικού μεταξύ υάλου και εσωτερικού διαλύματος και μία μεταξύ υάλου και εξωτερικού διαλύματος, κάθε μία από τις οποίες είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου που περιέχονται στο αντίστοιχο διάλυμα. Το αλγεβρικό άθροισμα αυτών των τιμών δίνει τη διαφορά δυναμικού μεταξύ των δύο διαλυμάτων, που ευρίσκονται εκατέρωθεν της μεμβράνης. Αυτή η διαφορά δυναμικού είναι ανάλογη προς τη διαφορά των ph των δύο διαλυμάτων. Επειδή δεν μπορεί να μετρηθεί άμεσα, μετριέται έμμεσα μέσω της ίσης διαφοράς δυναμικού ανάμεσα στο ηλεκτρόδιο αναφοράς και μετρήσεως (ποτενσιομετρική μέθοδος). Συνηθέστερα τα δύο ηλεκτρόδια βρίσκονται ενσωματωμένα στο συνδυασμένο ηλεκτρόδιο υάλου καλομέλανα το οποίο περιλαμβάνει και αισθητήρα θερμοκρασίας. 85

87 Σχήμα 4.4 Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροδίου υάλου για τη μέτρηση του ph σε διάταξη αναλυτή αερίων. Ηλεκτρόδιο μέτρησης της PCO 2 (Ηλεκτρόδιο Severinghaus) Πρόκειται ουσιαστικά για ένα τροποποιημένο ηλεκτρόδιο υάλου. Το ηλεκτρόδιο μέτρησης PCO 2 διαθέτει δύο μεμβράνες. Μία μεμβράνη από Teflon ή σιλικόνη που έρχεται σε επαφή με το δείγμα και η οποία είναι περατή μόνο από μόρια CO 2 και μία μεμβράνη υάλου. Μεταξύ των δύο μεμβρανών υπάρχει ενδιάμεσος χώρος, που περιέχει συνήθως ηλεκτρολυτικό διάλυμα διττανθρακικών (NaCl/NaHCO 3), όπως στο Σχήμα 4.5. Το αέριο CO 2 που είναι διαλυμένο στο δείγμα, διαχέεται μέσω της μεμβράνης Teflon μέσα στο ηλεκτρολυτικό διάλυμα, όπου παράγει κατιόντα Η + κατά τη γνωστή αντίδραση: H 2Ο + CO 2 H 2CΟ 3 H + +HCO 3 - (Αντίδραση 4.1) Όσο περισσότερο αέριο CO 2 υπάρχει στο μετρούμενο διάλυμα, τόσο μεγαλύτερη θα είναι η παραγόμενη [Η + ]. Η [Η + ] υπολογίζεται με το ηλεκτρόδιο υάλου, όπως αναφέρθηκε κατά τη μέτρηση του ph. Είναι προφανές ότι υπάρχει γραμμική συσχέτιση μεταξύ μετρούμενου ph και PCO 2 στο δείγμα. Σχήμα 4.5 Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροδίου Severinghaus για τη μέτρηση της PCO 2 σε διάταξη αναλυτή αερίων. Ηλεκτρόδιο μέτρησης της PO 2 (Ηλεκτρόδιο Clark) Το ηλεκτρόδιο Clark περιλαμβάνει μεμβράνη, συνήθως από πολυπροπυλένιο ή Teflon, που από την εξωτερική πλευρά της έρχεται σε επαφή με το δείγμα και η οποία είναι περατή μόνο από μόρια O 2. H εσωτερική πλευρά της μεμβράνης έρχεται σε επαφή με ηλεκτρολυτικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (Na 2HPO 4/KH 2PO 4, KCl). Μέσα στο διάλυμα αυτό υπάρχουν εμβαπτισμένα ένα ηλεκτρόδιο λευκοχρύσου (Pt) ως κάθοδος κι ένα 86

88 ηλεκτρόδιο Ag/AgCl ως άνοδος (Σχήμα 4.6). Κατά την εφαρμογή συγκεκριμένης τάσης μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων το διαχεόμενο Ο 2 ανάγεται στο ηλεκτρόδιο Pt, οπότε παράγεται ρεύμα, κατά τις αντιδράσεις: O 2 + 2H 2Ο + 2e - H 2O 2 + 2ΟΗ - (Αντίδραση 4.2) H 2O 2+ 2e - 2OH - (Αντίδραση 4.3) To μετρούμενο ρεύμα είναι ανάλογo προς την PΟ 2. Πρόκειται συνεπώς για μία αμπερομετρική μέθοδο προσδιορισμού της PΟ 2. Σχήμα 4.6 Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροδίου Clark για τη μέτρηση της PO 2 σε διάταξη αναλυτή αερίων Παλμικό οξύμετρο Τo παλμικό οξύμετρο (Pulse Oximeter) επιτρέπει με απλό, ανώδυνο και μη επεμβατικό τρόπο (χωρίς λήψη αίματος) την επιτόπια μέτρηση του κορεσμού οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα (SaO 2). Παράλληλα μετρά τους παλμούς της καρδιάς. Είναι σημαντικό να γίνει κατανοητό ότι η παλμική οξυμετρία δεν αποτελεί υποκατάστατο της αρτηριακής ανάλυσης των αερίων του αίματος και δεν ενδείκνυται για συνεχή παρακολούθηση, αφού δεν δίνει ενδείξεις για το ph του αίματος ή για τις συγκεντρώσεις του CO 2 και των HCO 3 - στο αίμα. H αρχή της παλμικής οξυμετρίας βασίζεται στη διαφορετική απορρόφηση της ερυθρής και υπέρυθρης ακτινοβολίας από την οξυγονωμένη (οξυαιμοσφαιρίνη) και μη οξυγονωμένη (αναχθείσα) αιμοσφαιρίνη. Έτσι, η οξυγονωμένη αιμοσφαιρίνη απορροφάει περισσότερο την υπέρυθρη ακτινοβολία, ενώ επιτρέπει περισσότερο ερυθρό φως να διέλθει. Το αντίστροφο ισχύει για την μη οξυγονωμένη αιμοσφαιρίνη. Ο μετρητής του παλμικού οξύμετρου τοποθετείται συνηθέστερα στο δάχτυλο και εμπεριέχει δύο διόδους εκπομπής φωτός, από τις οποίες η μία εκπέμπει στην ερυθρή περιοχή του ορατού φάσματος (στα 660 nm) και η άλλη στην υπέρυθρη (στα 940 nm), όπως στο Σχήμα 4.7. Καθώς οι ακτίνες φωτός διαπερνούν τους ιστούς, ένα μέρος του φωτός απορροφάται από το αίμα και τους ιστούς. Η απορρόφηση του φωτός μετράται από φωτοανιχνευτή που δέχεται την ακτινοβολία που διέρχεται διαμέσου του δακτύλου και υπό συνθήκες που γίνεται δυνατή η διάκριση της συνεισφοράς του αρτηριακού αίματος στην απορρόφηση. Η απορρόφηση του φωτός σε κάθε μήκος κύματος (στην ερυθρή και υπέρυθρη περιοχή) εξαρτάται από το βαθμό της οξυγόνωσης της αιμοσφαιρίνης μέσα στους ιστούς. Έτσι τα παλμικά οξύμετρα επιτρέπουν τη μέτρηση του κορεσμού οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα. Στη Φωτογραφία 4.4 φαίνεται ένα παλμικό οξύμετρο δακτύλου (fingertip pulse oximeter). Κάποιοι συγγραφείς έχουν προτείνει την επικουρική χρήση των παλμικών οξυμέτρων, σε συνδυασμό με τους αναλυτές αερίων για τον προσδιορισμό των οξεοβασικών παραμέτρων σε δείγμα φλεβικού αίματος, με βάση το παρακάτω σκεπτικό: Αναφέρθηκε ότι η σημαντικότερη διαφορά στις τιμές των οξεοβασικών παραμέτρων ανάμεσα στο φλεβικό και στο αρτηριακό αίμα έγκειται στην τιμή της PO 2. Έτσι προκειμένου να γίνει δυνατός ο προσδιορισμός των αερίων του αίματος σε δείγμα φλεβικού αίματος (η δειγματοληψία του οποίου είναι απλούστερη και εγκυμονεί λιγότερους κινδύνους), έχει προταθεί ο προσδιορισμός των υπολοίπων παραμέτρων με αναλυτή αερίου και ο προσδιορισμός της PO 2 με οξύμετρο (Delost, 2014). 87

89 Σχήμα 4.7 Σχηματική αναπαράσταση της αρχής λειτουργίας του παλμικού οξύμετρου δακτύλου. Μία συσκευή παλμικού οξυμέτρου δακτύλου περιλαμβάνει δύο διόδους εκπομπής φωτός οι οποίες κατά την εφαρμογή του οξύμετρου στο δάκτυλο διατάσσονται επάνω από το νύχι. Η μία εκπέμπει στην ερυθρή περιοχή του ορατού φάσματος και η άλλη στην υπέρυθρη. Η απορρόφηση του φωτός μετριέται από φωτοανιχνευτή που δέχεται την ακτινοβολία που διέρχεται διαμέσου του δακτύλου και ο οποίος κατά την εφαρμογή του οξύμετρου διατάσσεται κάτω από το δάκτυλο. Φωτογραφία 4.4 Παλμικό οξύμετρο δακτύλου (μοντέλο FTP101), από τον οίκο Silverline Meditech Παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης Μία σειρά περιβαλλοντικών παραγόντων ή παραγόντων σχετιζόμενων με τη δειγματοληψία μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης των οξεοβασικών παραμέτρων. Για τη σωστή εκτίμηση των οξεοβασικών παραμέτρων κρίσιμοι παράγοντες είναι: 1. Η πολύ σύντομη μετά τη δειγματοληψία ανάλυση του δείγματος (εντός 30 min κατά μέγιστο) και η συντήρηση αυτού στο μεταξύ διάστημα στους 2-4 o C, ώστε να αποφευχθεί η κατανάλωση του περιεχόμενου οξυγόνου από τα λευκά αιμοσφαίρια του αρτηριακού αίματος (με αποτέλεσμα ψευδώς μειωμένη PaO 2 και ψευδώς αυξημένη PaCO 2). Το δείγμα δε θα πρέπει να διατηρείται απλώς στον πάγο διότι υπάρχει κίνδυνος λύσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων, εάν αυτά παγώσουν. Καθυστέρηση στην ανάλυση του δείγματος μπορεί να διαφοροποιήσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης και λόγω διάχυσης των αερίων διαμέσου των τοιχωμάτων της πλαστικής σύριγγας. 2. Η αποφυγή εισαγωγής φυσαλίδων αέρα στο δείγμα κατά τη δειγματοληψία και η απομάκρυνσή τυχόν φυσαλίδων πριν την ανάμιξη του αίματος, με σκοπό την αποφυγή διάλυσης ατμοσφαιρικού οξυγόνου σε αυτό. Κάτι τέτοιο θα οδηγούσε σε ψευδώς μειωμένη PaCO 2 και ψευδώς αυξημένη PaO Η χρήση ηπαρινισμένης σύριγγας (με την κατάλληλη ποσότητα και το κατάλληλο άλας ηπαρίνης) για τη λήψη αρτηριακού αίματος. Η χρήση ηπαρινισμένης σύριγγας είναι απαραίτητη προκειμένου να αποφευχθεί η πήξη του αίματος, κάτι που θα οδηγούσε στην απόφραξη του τριχοειδικού σωλήνα του θαλάμου μέτρησης του αυτόματου αναλυτή αερίων. 4. Καθώς η μερική πίεση των αερίων είναι συνάρτηση της θερμοκρασίας και του υψόμετρου, και το ph επίσης εξαρτάται από τη θερμοκρασία, είναι απαραίτητη η καταγραφή της θερμοκρασίας του ασθενούς και του υψόμετρου κατά την δειγματοληψία. Για την ακριβή αξιολόγηση των μετρούμενων μερικών πιέσεων θα πρέπει στη συνέχεια να γίνεται η σχετική διόρθωση. 88

90 5. Η αποφυγή επιμόλυνσης του αρτηριακού δείγματος με φλεβικό αίμα, κάτι που θα έχει ως αποτέλεσμα σημαντικές αλλοιώσεις στις τιμές των οξεοβασικών παραμέτρων και κυρίως ψευδώς μειωμένη τιμή PaO Θα πρέπει να έχει ο αναλυτής κατά νου ότι το τριχοειδές ή φλεβικό αίμα μπορεί να υποκαταστήσει σε ικανοποιητικό βαθμό το αρτηριακό αίμα μόνο στην περίπτωση μέτρησης των οξεοβασικών παραμέτρων ph και PCO 2 κι όχι της PO Ηλεκτρολυτική Ισορροπία Ορισμοί Βασικές Έννοιες Οι ηλεκτρολύτες (electrolytes) είναι ουσίες οι οποίες διαλυόμενες στο νερό (συνεπώς και στα σωματικά υγρά) διίστανται σε θετικά και αρνητικά φορτισμένα ιόντα, καθιστώντας το διάλυμά τους ηλεκτρικά αγώγιμο. Στα βιολογικά συστήματα συγκεκριμένα, η χρήση του όρου ηλεκτρολύτες είναι ελαφρώς μεταποιημένη και περιλαμβάνει όλες τις διαλυμένες στα υγρά του σώματος ουσίες που φέρουν ηλεκτρικό φορτίο (Hinwood, 2001). Οι ηλεκτρολύτες, που απαντώνται στα βιολογικά συστήματα, έχοντας σημαντικό φυσιολογικό ρόλο είναι οι παρακάτω: Κατιόντα: Na +, Κ +, Ca ++, Mg ++ Ανιόντα: Cl -, HCO 3-, PA - (ανιόντα πρωτεϊνών, protein anions), HPO 4 --, SO 4 --, OA - (οργανικά ανιόντα, Organic Anions). Το σύνολο των ανόργανων ανιόντων (HPO SO 4 -- ), πλην των HCO 3-, αναφέρεται και ως ΑΑ - (ανόργανα ανιόντα, inorganic anions). Οι ηλεκτρολύτες απαντώνται στον οργανισμό τόσο ενδοκυττάρια, όσο και στον εξωκυττάριο χώρο. Σε κάθε διαμερισματοποιημένο χώρο του οργανισμού ισχύει η αρχή της ηλεκτροουδετερότητας (electroneutrality), σύμφωνα με την οποία το συνολικό θετικό φορτίο των περιεχόμενων εκεί ηλεκτρολυτών είναι ίσο με το συνολικό αρνητικό τους φορτίο. Ωσμωτική πίεση (osmotic pressure) καλείται η πίεση που αναπτύσσεται επάνω στα τοιχώματα που περιβάλλουν ένα διάλυμα λόγω των διαλυμένων σε αυτό σωματιδίων. Η ωσμωτική πίεση καθορίζεται μόνο από τον αριθμό των διαλυμένων σωματιδίων ανά μονάδα όγκου του διαλύματος, ενώ είναι ανεξάρτητη της μάζας των σωματιδίων. Η ωσμωτική πίεση απασχολεί τον κλινικό επιστήμονα, διότι, όπως θα επεξηγηθεί στα Κεφάλαια και 4.2.3, καθορίζει την ισορροπία των ηλεκτρολυτών, την οξεοβασική ισορροπία και την ισορροπία των υγρών του οργανισμού και συνεπώς την ομαλή λειτουργία του οργανισμού. Ως ωσμωμοριακότητα (osmolarity) - μέτρο της ωσμωτικής πίεσης - ορίζεται ο λόγος των διαλυμένων σε ένα διάλυμα σωματιδίων, ανά μονάδα όγκου του διαλύματος: αριθμός διαλυμένων σωματιδίων ωσμωμοριακότητα = (Εξίσωση 4.6) όγκος διαλύματος Μετριέται σε osmol/l ή αλλιώς Osm/L (ωσμώλια ανά λίτρο). Ως ωσμωτικότητα (osmolality) ορίζεται ο αριθμός όλων των διαλυμένων σωματιδίων, ανά kg διαλύτη (νερό, όσον αφορά τα βιολογικά υγρά). αριθμός διαλυμένων σωματιδίων ωσμωτικότητα = ( Εξίσωση 4.7) βάρος διαλύτη Μετριέται σε osmol/kg ή Osm/kg. Στην καθημερινή πρακτική στο κλινικό εργαστήριο οι όροι ωσμωτικότητα και ωσμωμοριακότητα χρησιμοποιούνται δίχως διάκριση, ενώ ως μονάδα και των δύο μεγεθών χρησιμοποιείται το Osm/L. Με τον ίδιο τρόπο, χωρίς διάκριση θα χρησιμοποιηθούν κι εδώ. Επίσης, χωρίς διάκριση, καταχρηστικά, χρησιμοποιείται και ο όρος τονικότητα, που επίσης μετριέται σε Osm/L. Η τονικότητα (tonicity) του πλάσματος εξαρτάται μόνο από τη συγκέντρωση αυτών των διαλυμένων ουσιών, που λόγω της παρουσίας τους 89

91 προκαλούν την ωσμωτική διακίνηση νερού (ωσμωτικά δραστικές ουσίες [π.χ. Νa +, γλυκόζη]). Αντίθετα, διαλυτές ουσίες για τις οποίες δεν παρατηρείται διαβάθμιση συγκέντρωσης εκατέρωθεν της μεμβράνης (π.χ. αλκοόλη) δεν προκαλούν την ωσμωτική διακίνηση του νερού, παρόλο που αυξάνουν την μετρούμενη ωσμωτικότητα. Ανάλογα με την τιμή της τονικότητάς τους σε σύγκριση με τη φυσιολογική τονικότητα του πλάσματος, τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική χαρακτηρίζονται ως υπότονα (hypotonic), υπέρτονα (hypertonic) ή ισότονα (isotonic) (Lord, 1999). Η συγκέντρωση και η ωσμωτικότητα ενός διαλύματος είναι έννοιες παραπλήσιες. Για μη διιστάμενα υδατοδιαλυτά μόρια μάλιστα, ένα osmol ταυτίζεται με ένα mol. Για τα υδατοδιαλυτά διιστάμενα μόρια, ο αριθμός των σωματιδίων στα οποία διίσταται το μόριο πρέπει να λαμβάνεται υπόψη. Έτσι στην περίπτωση του NaCl, εάν θεωρήσουμε ότι αυτό διίσταται πλήρως στο πλάσμα, πρέπει να λάβουμε υπόψη ότι το κάθε μόριο δίνει δύο διαλυμένα σωματίδια, δηλ. 1 mol = 2 οsmol. Τα δύο κυριότερα από τα απαντώμενα στα υγρά του οργανισμού μη διιστάμενα υδατοδιαλυτά μόρια είναι η γλυκόζη και η ουρία. Συνεπώς για τη γλυκόζη (όπου MΒ γλυκόζης = 180) η μοριακότητα ταυτίζεται αριθμητικά με την ωσμωτικότητα και 1 mosm/l = 1 mmol/l = 180 mg/l = 180 mg/10dl = 18 mg/dl. Αντιστοίχως για την ουρία μετρούμενη ως BUN (2 άτομα N ανά μόριο ουρίας, με AB N =14) ισχύει: 1 mosm/l = 28 mg/l = 28 mg/10 dl = 2,8 mg/dl. Στο Σχήμα 4.8 φαίνεται διαγραμματικά η κατανομή των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα φυσιολογικού ατόμου. Τέτοια διαγράμματα στην κλινική πρακτική καλούνται «Gamblegrams». Σχήμα 4.8 Διάγραμμα τύπου Gamblegram της κατανομής των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα φυσιολογικού ατόμου (προσαρμοσμένο από τον Hinwood, 2001). Σε υγιή άτομα, η τονικότητα υπολογίζεται προσθέτοντας τις συγκεντρώσεις όλων των ωσμωτικά ενεργών σωματιδίων στο εξωκυττάριο υγρό. Καθώς τα ιόντα Νa + (που συνιστούν σχεδόν το σύνολο των κατιόντων του εξωκυττάριου υγρού) εξισορροπούνται από ανιόντα (κυρίως τα Cl - ), υπάρχει περίπου ο ίδιος αριθμός Na + και ανιόντων ανά μονάδα όγκου. Επομένως, ο υπολογισμός της τονικότητας απλοποιείται θεωρώντας ότι η ολική συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα δίνεται από το διπλάσιο της [Na + ]. Βασιζόμενοι στις φυσιολογικές τιμές των παραμέτρων [Na + ], [Glucose] και [Urea] (η τελευταία εκφρασμένη ως ΒUN), προκύπτει: Τονικότητα Πλάσματος (mmol/l) = 2[Na + ] + [Urea] + [Glucose] (Εξίσωση 4.8) Όπου οι συγκεντρώσεις [Na + ], [Glucose] και [Urea] είναι εκφρασμένες σε mmol/l. ή 90

92 Τονικότητα Πλάσματος (mosm/l) =2 [Na + ] + ([glucose] / 18) + (ΒUN / 2,8) (Εξίσωση 4.9) Όπου η [Na + ] είναι εκφρασμένη σε mmol/l (= mosm/l) ενώ οι [glucose] και [urea] εκφράζονται σε mg/dl. Η φυσιολογική τονικότητα υπολογίζεται ως: Τονικότητα Πλάσματος (mosm/l) = (2 *140) + (90 / 18) + (14 / 2,8) = 290 mosm/l, Η φυσιολογική τονικότητα (καταχρηστικά στην κλινική πρακτική και ωσμωτικότητα) είναι συνεπώς περίπου 290 mοsm/l. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ουρία συμμετέχει στον υπολογισμό της τονικότητας, για λόγους ιστορικούς που δεν θα αναπτυχθούν περαιτέρω εδώ, παρόλο που διαχέεται ελεύθερα διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, και συνεπώς αποτελεί μη ωσμωτικά ενεργό μόριο. Επειδή όμως η συνεισφορά της στον υπολογισμό της τονικότητας δεν αλλοιώνει σημαντικά το αποτέλεσμα, εξακολουθεί να χρησιμοποιείται στον υπολογισμό. Επίσης, τα ιόντα K + (συν τα ανιόντα που τα συνοδεύουν) έχουν μια μικρή συνεισφορά στην υπολογιζόμενη τιμή της τονικότητας. Έτσι, στην κλινική πρακτική, οι Εξισώσεις 4.8 και 4.9 χρησιμοποιούνται και διαφοροποιημένες, όπου και η [Κ + ] συμμετέχει στον υπολογισμό της τονικότητας. Λόγω όμως της μικρής βαρύτητάς της, συχνά παραλείπεται από τον υπολογισμό της τονικότητας, όπως στις Εξισώσεις 4.8 και 4.9. Παρ όλο που τα επιμέρους διαμερίσματα του οργανισμού είναι σχετικά ισοτονικά (ώστε να διατηρείται η ομοιόσταση του οργανισμού), δηλαδή περιέχουν τον ίδιο αριθμό ωσμωτικά ενεργών διαλυμένων σωματιδίων ανά μονάδα όγκου διαλύματος, διαφέρουν σημαντικά ως προς τη σύσταση τους, όσον αφορά τα περιεχόμενα στα υγρά διαλυμένα σωματίδια. Έτσι, η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών και το είδος τους διαφέρει από διαμέρισμα σε διαμέρισμα. Το Κ + είναι το κυριότερο κατιόν του εσωτερικού των κυττάρων, ενώ το Νa + είναι το κυρίαρχο κατιόν στο εξωκυττάριο υγρό. Στον εξωκυττάριο χώρο επίσης, το ανιόν Cl - είναι κυρίαρχο, με τα ΗCO 3 - να αποτελούν το δεύτερο σημαντικότερο ανιόν. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες (PA - ) και οι οργανικές ενώσεις (ΟΑ - ) είναι «εγκλωβισμένες» μέσα στα κύτταρα, αποτελώντας μαζί τη σημαντική πλειοψηφία των ενδοκυττάριων ανιόντων. Το Σχήμα 4.9 δίνει διαγραμματικά την σχετική κατανομή των κατιόντων και ανιόντων στο πλάσμα και στο κυτταρόπλασμα. Σχήμα 4.9 Διαγράμματα όπου παρουσιάζεται συγκριτικά η σχετική κατανομή των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα (Α) και στον ενδοκυττάριο χώρο (Β) φυσιολογικού ατόμου. ΑΑ - είναι το σύνολο των ανόργανων οξέων(πλην των HCO 3- ), ΟΑ - το σύνολο των οργανικών οξέων, και PA - το σύνολο των ανιόντων πρωτεϊνών. Σύνοψη: Οι ηλεκτρολύτες είναι διαλυμένες στα υγρά του σώματος ουσίες που φέρουν ηλεκτρικό φορτίο. Απαντώνται στον οργανισμό τόσο ενδοκυττάρια, όσο και στον εξωκυττάριο χώρο. Τα επιμέρους διαμερίσματα του οργανισμού περιέχουν τον ίδιο αριθμό ωσμωτικά ενεργών διαλυμένων σωματιδίων ανά μονάδα όγκου. Η 91

93 συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών και το είδος τους όμως, διαφέρει από διαμέρισμα σε διαμέρισμα. Το Κ + είναι το κυριότερο κατιόν του εσωτερικού των κυττάρων ενώ το Νa + είναι το κυρίαρχο κατιόν στο εξωκυττάριο υγρό. Σε κάθε διαμερισματοποιημένο χώρο του οργανισμού ισχύει η αρχή της ηλεκτροουδετερότητας Σημασία Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας Οι ηλεκτρολύτες των υγρών του σώματος παίζουν ρόλο στη διατήρηση της ωσμωτικής ισορροπίας και στη συνακόλουθη διατήρηση της ισορροπίας του νερού του σώματος και στην ανταλλαγή του. Διατηρούν επίσης την οξεοβασική ισορροπία (ph). Διαδραματίζουν ρόλο στην καρδιακή και αναπνευστική λειτουργία, στη διεγερσιμότητα των νεύρων και στη μυϊκή δραστηριότητα γενικότερα. Είναι τέλος απαραίτητοι σε ενζυμικές αντιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων και αντιδράσεων μεταφοράς ηλεκτρονίων. Η ισορροπία του νερού του σώματος είναι άκρως σημαντική, διότι το νερό αποτελεί το υγρό μέσο για τον μεταβολισμό των κυττάρων, μεταφέρει εκεί θρεπτικές ουσίες και οξυγόνο και βοηθά στην αποβολή των προϊόντων του μεταβολισμού. Μαζί με τους ηλεκτρολύτες, διατηρεί τη φυσική και χημική σύσταση των ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων υγρών, επιτρέποντας τη φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού. Επίσης συμβάλλει στη ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος και είναι απαραίτητο στην πέψη των τροφών και στην απορρόφησή τους Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας Είναι γνωστό ότι το σώμα ενός ενήλικα αποτελείται κατά ποσοστό 60% από νερό. Το νερό κατανέμεται σε δύο βασικά διαμερίσματα, το εσωτερικό των κυττάρων (ενδοκυττάριο) και το εκτός των κυττάρων διαμέρισμα (εξωκυττάριο). Μία από τις βασικές λειτουργίες της ομοιόστασης είναι η διατήρηση της ισορροπίας (κατανομής) και η διατήρηση της σύστασης των επιμέρους υγρών του σώματος. Οι μεμβράνες των βιολογικών συστημάτων είναι ημιδιαπερατές, δηλαδή διαπερατές για το νερό, όχι όμως και για πολλές από τις διαλυμένες στα υγρά του οργανισμού ουσίες. Ουσίες που διαχέονται διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης είναι μη φορτισμένες, μικρού μοριακού βάρους ή/και λιπόφιλες ουσίες (π.χ. η αλκοόλη, τα αέρια αίματος, οι στεροειδείς ορμόνες). Η διάχυση αυτών των ουσιών λαμβάνει χώρα, έτσι, ώστε να εξαλειφθεί οποιαδήποτε διαβάθμιση συγκέντρωσής τους εκατέρωθεν της μεμβράνης. Αντίθετα, διαλυτές ουσίες που δεν διαπερνούν ελεύθερα τις κυτταρικές μεμβράνες με διάχυση είναι οι (φορτισμένοι) ηλεκτρολύτες, οι πρωτεΐνες και γενικότερα ενώσεις μεγαλύτερου μοριακού βάρους, ή πολικές ενώσεις π.χ. η γλυκόζη. Αυτές καλούνται ωσμωτικά δραστικές ουσίες. Η διέλευση της πλειοψηφίας των μη ωσμωτικά ενεργών ουσιών μέσω της κυτταρικής μεμβράνης είναι παρ όλα αυτά δυνατή μέσω άλλων μηχανισμών/οδών, οι οποίες όμως δεν είναι εξίσου ταχείες ή αποτελεσματικές, όσον αφορά την εξάλειψη των διαβαθμίσεων συγκέντρωσης (ή φορτίου) εκατέρωθεν αυτής. Μία βασική αρχή είναι ότι όταν δύο υδατικά διαλύματα διαχωρίζονται με μία τέτοια ημιδιαπερατή μεμβράνη, όπως και η κυτταρική μεμβράνη, λαμβάνει χώρα μετακίνηση νερού έως ότου εξισωθεί εκατέρωθεν της μεμβράνης ο αριθμός των διαλυμένων ωσμωτικά ενεργών σωματιδίων στη μονάδα όγκου, δηλαδή έως ότου εξισωθεί η τονικότητα εκατέρωθεν της μεμβράνης. Η διάχυση του νερού διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, λόγω διαφοράς στη συγκέντρωση διαλυτών ουσιών που δεν μπορούν να την διαπεράσουν με διάχυση ονομάζεται ώσμωση. Αυτή λαμβάνει χώρα από το διάλυμα με τη μικρότερη συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών προς αυτό με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών. Εφόσον ο ενδοκυττάριος και εξωκυττάριος χώρος διαχωρίζονται από την ημιδιαπερατή κυτταρική μεμβράνη, το ενδοκυτταρικό υγρό βρίσκεται σε ωσμωτική ισορροπία με το εξωκυττάριο υγρό. Ένας πολύπλοκος ομοιοστατικός μηχανισμός ελέγχει αυστηρά την ωσμωτικότητα του εξωκυττάριου υγρού, ώστε να παραμένει σταθερή και η ωσμωτική πίεση στο εσωτερικό των κυττάρων. Η αναγκαιότητα αυτή οφείλεται στο ότι τα κύτταρα του σώματος δεν μπορούν να εξισορροπούν μεγάλες αποκλίσεις από τη φυσιολογική ωσμωτική τους πίεση: Μεγάλες αλλαγές στην ωσμωτικότητα προκαλούν την συρρίκνωση των κυττάρων ή την αιμόλυσή τους, καταστρέφοντας την κυτταρική δομή και παρεμποδίζοντας τη φυσιολογική κυτταρική λειτουργία (Σχήμα 4.10). Συνεπώς, η διατήρηση της σταθερότητας του όγκου των υγρών του σώματος και της σύστασης των επιμέρους διαμερισμάτων επιτυγχάνεται με μία διαρκή ροή νερού και διαλυμένων ουσιών μεταξύ αυτών. Συμπερασματικά, η καλή λειτουργία του οργανισμού εξαρτάται από τα συστήματα ρύθμισης της ωσμωτικότητας των υγρών του σώματος. Τα συστήματα αυτά ασκούν άμεση επίδραση στον όγκο και ωσμωτικότητα του εξωκυττάριου υγρού, και λόγω ώσμωσης, έμμεση επίδραση στον όγκο και ωσμωτικότητα 92

94 του ενδοκυττάριου υγρού (Kee et al., 2004 Lippincott, 2007 Metheny, 2011 Lobo et al., 2013 Haws & Haws, 2015). Σχήμα 4.10 Ωσμωτική διακίνηση του νερού όταν ένα ερυθρό αιμοσφαίριο βρεθεί σε (Α) ισότονο περιβάλλον, (Β) υπέρτονο περιβάλλον και (Γ) υπότονο περιβάλλον πλάσματος. Στην περίπτωση (Α) διασφαλίζεται η ακεραιότητα της κυτταρικής δομής και η φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου. Στις (Β) και (Γ) προκαλείται συρρίκνωση και αιμόλυση του κυττάρου αντίστοιχα, με αποτέλεσμα την καταστροφή της κυτταρικής δομής. Σύνοψη: Η μετακίνηση του νερού διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, λόγω διαφοράς στην ωσμωτική πίεση εκατέρωθεν της μεμβράνης ονομάζεται ώσμωση. Η διαφορά στην ωσμωτική πίεση οφείλεται στη διαφορετική ανά διαμέρισμα συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών που δεν μπορούν να την διαπεράσουν με διάχυση. Εφόσον ο ενδοκυττάριος και εξωκυττάριος χώρος διαχωρίζονται από την ημιδιαπερατή κυτταρική μεμβράνη, το ενδοκυτταρικό υγρό βρίσκεται σε ωσμωτική ισορροπία με το εξωκυττάριο υγρό. Ένας πολύπλοκος ομοιοστατικός μηχανισμός ελέγχει αυστηρά την ωσμωτικότητα του εξωκυττάριου υγρού, ώστε να παραμένει σταθερή και η ωσμωτική πίεση στο εσωτερικό των κυττάρων. Η αναγκαιότητα αυτή οφείλεται στο ότι τα κύτταρα του σώματος δεν μπορούν να εξισορροπούν μεγάλες αποκλίσεις από τη φυσιολογική ωσμωτική τους πίεση: Μεγάλες αλλαγές στην ωσμωτικότητα προκαλούν την συρρίκνωση των κυττάρων ή την αιμόλυσή τους. Μία βασική αρχή της ομοιόστασης του οργανισμού αποτελεί η διατήρηση της σταθερότητας του όγκου των υγρών του σώματος και της σύστασης των επιμέρους διαμερισμάτων. Αυτό επιτυγχάνεται με μία διαρκή, καλά ελεγχόμενη ροή νερού και διαλυμένων ουσιών μεταξύ αυτών. Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι πέρα από τις μεταβολές του προσλαμβανόμενου και αποβαλλόμενου νερού (εξωτερικό ισοζύγιο νερού), το ισοζύγιο του νερού ρυθμίζεται ακόμα από εσωτερικές μετακινήσεις νερού μεταξύ των διαφόρων διαμερισμάτων του οργανισμού προκειμένου να διατηρείται η ωσμωτική ισορροπία. Είναι σημαντικό να γίνει κατανοητό ότι η ρύθμιση της ωσμωτικότητας (ωσμωρρύθμιση) και του όγκου των υγρών του σώματος (ογκορρύθμιση) είναι στενά συνδεδεμένες. Αυτό ισχύει, διότι μεταβολές στον όγκο των υγρών του σώματος προκαλούν αλλαγή της ωσμωτικότητας. Καθώς το νάτριο είναι το κυρίαρχο ιόν στο εξωκυττάριο υγρό, οι φυσιολογικοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τον όγκο και την πίεση του αίματος λειτουργούν μέσω ρύθμισης της συγκέντρωσης του νατρίου στο σώμα. Οι μηχανισμοί και όργανα που ελέγχουν την ηλεκτρολυτική ισορροπία του οργανισμού είτε μέσω της αποβολής νερού ή ηλεκτρολυτών, είτε μέσω της πρόσληψης ή επαναρρόφησης νερού και ηλεκτρολυτών συνοψίζονται στα παρακάτω: oι νεφροί μέσω της αποβολής ή επαναρρόφησης νερού και ηλεκτρολυτών, το γαστρεντερικό σύστημα μέσω των κοπράνων, το δέρμα μέσω της αποβολής υδρατμών και ιδρώτα (ηλεκτρολυτών και νερού), οι πνεύμονες μέσω της αποβολής υδρατμών, η οξεοβασική ισορροπία του οργανισμού, τα επίπεδα συγκεκριμένων ορμονών (όπως θα εξηγηθεί παρακάτω) και συνεπώς και η φυσιoλογική λειτουργία των αντίστοιχων αδένων, η καρδιά (μέσω της παραγωγής του ΑΝP, όπως θα εξηγηθεί παρακάτω). 93

95 Το όργανο που παίζει τον πιο σημαντικό ρόλο στην ωσμωρρύθμιση και ογκορρύθμιση είναι οι νεφροί. Η λειτουργία τους αυτή ρυθμίζεται ορμονικά από ωσμωϋποδοχείς (osmotic sensors) και ογκοϋποδοχείς ή τασεοϋποδοχείς (pressure sensors) του υποθαλάμου. Οι καθημερινές μέτριες μεταβολές στην πρόσληψη νερού και άλατος, προκαλούν αλλαγές στην τονικότητα του πλάσματος. Μικρές αυξήσεις στην τονικότητα ενεργοποιούν τους ωσμωϋποδοχείς και δρουν στο κέντρο δίψας, ενισχύοντας το αίσθημα της δίψας, αποσκοπώντας στην αύξηση του προσλαμβανόμενου νερού. Παράλληλα, οι ενεργοποιημένοι ωσμωϋποδοχείς του υποθαλάμου προκαλούν έκκριση της αντιδιουρητικής ορμόνης (vasopressin ή antidiuretic hormone ή ADH) από την υπόφυση, αποσκοπώντας στη ρύθμιση του αποβαλλόμενου νερού. Η ADH προκαλεί επαναρρόφηση νερού στα νεφρά (προς το πλάσμα), μειώνοντας έτσι την ποσότητα του νερού που αποβάλλεται με τα ούρα. Το αποτέλεσμα είναι η μείωση της τονικότητας του πλάσματος και η ταυτόχρονη συμπύκνωση των ούρων. Αντιθέτως, μικρές μειώσεις στην τονικότητα προκαλούν μείωση της έκκρισης της ADH με αποτέλεσμα τα νεφρά να εκκρίνουν περισσότερο νερό, προκαλώντας την αραίωση των ούρων. Στην περίπτωση μη φυσιολογικών απωλειών αίματος, ή σε αύξηση του όγκου του εξωκυττάριου υγρού ενεργοποιούνται οι ογκοϋποδοχείς, η δράση των οποίων υπερισχύει αυτής των ωσμωϋποδοχέων. Αυξημένος όγκος εξωκυττάριου υγρού προκαλεί αυξημένη πίεση στο τοίχωμα του αγγείου και το αντίστροφο. Τα ερεθίσματα προσάγονται στον υποθάλαμο και κινητοποιούνται μηχανισμοί αποκατάστασης νορμοογκαιμίας. Τέτοιοι μηχανισμοί είναι οι παρακάτω: Σύστημα Ρενίνης Αγγειοτενσίνης Αλδοστερόνης (renin-angiotensin-aldosterone system) : σε μείωση όγκου παρατηρείται αυξημένη έκκριση της ορμόνης ρενίνης από τους νεφρούς, που οδηγεί σε αύξηση της παραγωγής αγγειοτενσίνης ΙΙ που έχει αγγειοσυσπαστική δράση και έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της πίεσης του αίματος. Επίσης η αγγειοτενσίνη προκαλεί αύξηση της επαναρρόφησης νατρίου από τους νεφρούς και έκκριση αλδοστερόνης από τον φλοιό των επινεφριδίων (η τελευταία επίσης προκαλεί αύξηση της επαναρρόφησης νατρίου και αποβολής καλίου από νεφρούς και αίσθηση δίψας). Η κατακράτηση νατρίου από τα νεφρά αυξάνει την κατακράτηση νερού, που έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του όγκου του αίματος και της πίεσης. Αντιδιουρητική Ορμόνη: Mείωση στον όγκο και την πίεση του αίματος προκαλεί έκκριση ADH που δρα στα νεφρά και αυξάνει την επαναρρόφηση του νερού. Νεφρός: Ελέγχει τα επίπεδα των συγκεντρώσεων των διαλυτών ουσιών και τον όγκο του νερού με αποβολή ή επανακράτηση κυρίως νατρίου και νερού. Συμβαίνει νεφρική αποβολή ούρων ελεύθερων νατρίου ή αντίθετα μεγάλου φορτίου νατρίου ως απάντηση στην ελαττωμένη ή αυξημένη πρόσληψη νατρίου αντίστοιχα. Κολπικό Νατριουρητικό Πεπτίδιο (Atrial natriuretic peptide ή ANP): Εκφράζεται στην καρδιά και αναστέλλει τον άξονα ρενίνης-αγγειοτενσίνης προκαλώντας νατριούρηση (Metheny, 2011 Lobo et al., 2013 Haws & Haws, 2015). H ομοιοστατική απάντηση του οργανισμού προς αποκατάσταση της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας μπορεί να προβλεφθεί με βάση την Εξίσωση 4.6, τροποποιημένη όπως παρακάτω: ποσότητα ωσμωλίων Τονικότητα (Εξίσωση 4.10) εξωκυττάριος όγκος Ας δούμε πως εφαρμόζεται η Εξίσωση 4.10 στην πρόβλεψη της ομοιοστατικής απάντησης του οργανισμού σε περίπτωση περίσσειας νατρίου στον εξωκυττάριο χώρο. Εάν λοιπόν, υπάρχει περίσσεια νατρίου (δηλ. αυξημένα ωσμώλια διαλυμένων σωματιδίων) στο αίμα, η αυξημένη τονικότητα θα κινητοποιήσει ομοιοστατικούς μηχανισμούς που θα προκαλέσουν αύξηση του εξωκυττάριου όγκου (π.χ. με πόση νερού λόγω δίψας ή με επαναρρόφηση νερού στους νεφρούς), ώστε να επανέλθει η ωσμωτικότητα σε κανονικά επίπεδα. Αύξηση λοιπόν του αριθμητή της Εξίσωσης 4.10, αντιμετωπίζεται με ομοιοστατική απάντηση που προκαλεί αύξηση του παρονομαστή της Εξίσωσης 4.10, ώστε να αποκατασταθεί η τονικότητα του οργανισμού στα φυσιολογικά επίπεδα. Γενικά η κατακράτηση νατρίου έχει ως αποτέλεσμα την κατακράτηση νερού, ενώ η απώλεια νατρίου έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια νερού. 94

96 Σύνοψη: Ένας αριθμός οργάνων και μηχανισμών ελέγχει το ισοζύγιο του νερού στον οργανισμό. Το όργανο που παίζει τον πιο σημαντικό ρόλο στην ωσμωρρύθμιση και ογκορρύθμιση είναι οι νεφροί. Η ωσμωρρύθμιση και ογκορρύθμιση ρυθμίζονται ορμονικά από υποδοχείς του υποθαλάμου. Αυτοί, μέσω ενδοκρινών αδένων κινητοποιούν ποικιλία μηχανισμών αποκατάστασης νορμοογκαιμίας και φυσιολογικής τονικότητας που περιλαμβάνουν τους νεφρούς: Η ποσότητα του νερού που διηθείται από το αίμα και αποβάλλεται στα ούρα εξαρτάται από τον όγκο του εξωκυττάριου υγρού και την ηλεκτρολυτική σύσταση aυτού την κάθε στιγμή Διαταραχές της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας Παρακάτω αναφέρονται ο παθοφυσιολογικός μηχανισμός και η κλινική αιτία των πιο κοινών κλινικών διαταραχών της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας (Weinstein, 2007 Lippincott, 2011 Metheny, 2011): Υπονατριαιμία (hyponatremia, [Na + ] ορού < 135 mmol/l - στην καθημερινή κλινική πράξη, [Na+] ορού < 130 mmol/l): ο βασικός παθοφυσιολογικός μηχανισμός στην υπονατριαιμία είναι η κατακράτηση νερού, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της [Na + ] ορού και συνεπαγόμενη μείωση της ωσμωτικότητας του πλάσματος. Η υπονατριαιμία εκδηλώνεται σε πάσχοντες από συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, κίρρωση του ήπατος ή νεφρική ανεπάρκεια. Αποτελεί ακόμα συχνά ιατρογενή επιπλοκή κατά τη παρεντερική χορήγηση διαλυμάτων, όπου δεν περιέχονται κατάλληλες ποσότητες ηλεκτρολυτών. Ιδιαίτερα χαμηλές συγκεντρώσεις [Na + ] ορού < 120 mmol/l μπορεί να οδηγήσουν στην είσοδο νερού στα εγκεφαλικά κύτταρα και την πρόκληση εγκεφαλικού οιδήματος. Υπερνατριαιμία (hypernatremia, όταν [Na + ] ορού > 145 mmol/l - στην καθημερινή κλινική πράξη, όταν [Na + ] ορού > 150 mmol/l). Η διαταραχή αυτή έχει ως συνέπεια τη μετακίνηση νερού από το εσωτερικό των κυττάρων προς τον εξωκυττάριο χώρο (αφυδάτωση). Οι αιτίες που οδηγούν σε υπερνατριαιμία μπορεί να είναι πολλαπλές. Η υπερνατριαιμία συχνότερα οφείλεται είτε σε απότομη αύξηση της [Na + ] ορού σε περιστατικά δηλητηρίασης με αλάτι ή μετά από σημαντική πόση θαλασσινού νερού, είτε σε σημαντική απώλεια νερού μέσω της άδηλου αναπνοής (π.χ σε ασθενείς με πυρετό ή εκτεταμένα εγκαύματα, σε υπερκαπνία, σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες περιβάλλοντος ή μετά από έντονη σωματική άσκηση), είτε τέλος στην αδυναμία απόκρισης στο αίσθημα δίψας (σε βρέφη ή υπερήλικους ασθενείς). Η υπερνατριαιμία συνεπάγεται αύξηση της ωσμωτικότητας του πλάσματος. Υπερκαλαιμία (hyperkalemia, όταν [Κ + ] ορού > 5,3 mmol/l): αυξημένα επίπεδα καλίου οφείλονται συνηθέστερα σε δυσλειτουργία των νεφρών, αλλά μπορούν επίσης να προκληθούν και από εγκαύματα, κάποιο άλλο είδος τραύματος, ή οποιαδήποτε παθολογική κατάσταση προκαλεί καταστροφή των κυττάρων των ιστών. Καταστροφή των κυττάρων οδηγεί σε απελευθέρωση του Κ + που είναι το σημαντικότερο ενδοκυτταρικό κατιόν. Υψηλά επίπεδα καλίου προκαλούν καρδιακές αρρυθμίες και μπορούν να οδηγήσουν και σε θάνατο, λόγω καρδιακής ανεπάρκειας και ασυστολίας. Υποκαλαιμία (hypokalemia, όταν [Κ + ] ορού < 3,5 mmol/l): Μειωμένα επίπεδα καλίου πολύ συχνά αντανακλούν μειωμένη πρόσληψη καλίου από τον οργανισμό ή αυξημένη αποβολή του λόγω απώλειας γαστρεντερικών υγρών ή ως αποτέλεσμα της χρήσης διουρητικών. Εμφανίζεται ατονία των μυών, και μπορεί ο ασθενής να οδηγηθεί σε καρδιακή αρρυθμία. Υπάρχει αντίστροφη σχέση μεταξύ των μεταβολών του ph και της [Κ + ]. Έτσι κατά την αλκάλωση, μετακινούνται Η + από τον ενδοκυττάριο χώρο στον εξωκυττάριο, ενώ κατά την οξέωση, από τον εξωκυττάριο, προς τον ενδοκυττάριο, προκαλώντας αντίστροφη μετακίνηση Κ +. Συνεπώς όταν το ph αυξάνεται, η [Κ + ] ορού μειώνεται και αντίστροφα. Διαταραχές [Cl - ]: Τα επίπεδα των Cl - στον οργανισμό μεταβάλλονται παράλληλα με τα επίπεδα των ιόντων Na +, παίζοντας τον κυριότερο ρόλο στη διατήρηση της ηλεκτρικής ουδετερότητας των διαμερισμάτων του οργανισμού. Έτσι, χαμηλά επίπεδα Cl - μπορεί να παρουσιαστούν σε υπονατριαιμία. Υψηλά επίπεδα Cl - μπορεί να είναι το αποτέλεσμα μειωμένης πρόσληψης υγρών, ή να εμφανιστούν σε νεφρική δυσλειτουργία. Η [Cl - ] μεταβάλλεται αντιστρόφως ανάλογα με την [ΗCO 3- ] στον οργανισμό, αντανακλώντας έτσι και την οξεοβασική κατάσταση του ασθενούς. Έτσι, χαμηλά επίπεδα Cl - μπορεί να παρουσιαστούν κατά την απώλεια οξέων από τον οργανισμό στη μεταβολική αλκάλωση, και σε χρόνια δυσλειτουργία των πνευμόνων 95

97 PaCO 2: Σχετικά με τη μέτρηση της PaCO 2, ως μέτρο της συγκέντρωσης των [HCO 3- ] αναφερθήκαμε στις Ενότητες 4.1.3, και Τα επίπεδα [HCO 3- ] ρυθμίζουν την οξεοβασική ισορροπία σε συνάρτηση με το νάτριο, κάλιο και χλωριόντα. Διαταραχές στην ωσμωτικότητα: Αναφέρθηκε ότι η μείωση της ωσμωτικότητας είναι αποτέλεσμα είτε αυξημένης πρόσληψης νερού, είτε υπονατριαιμίας οφειλόμενης σε άλλο αίτιο. Πέραν της υπερνατριαιμίας, η υπεργλυκαιμία, η υπερουριαιμία, η παρουσία εξωγενών μορίων ή συνδυασμός των παραπάνω μπορεί να προκαλέσουν αύξηση της τιμής της ωσμωτικότητας του εξωκυττάριου υγρού Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση ηλεκτρολυτικών διαταραχών Η διάγνωση των ηλεκτρολυτικών διαταραχών στηρίζεται στο ιστορικό, στην κλινική εικόνα, στην φυσική εξέταση του ασθενούς και τέλος σε σειρά μετρήσεων και εργαστηριακών αναλύσεων: Στα πλαίσια των δύο τελευταίων εκτιμάται ο εξωκυττάριος όγκος, αξιολογούνται ο ρυθμός της διούρησης και μετρούνται η ωσμωτική πίεση του πλάσματος και των ούρων (εναλλακτικά το ειδικό βάρος των ούρων αντί της ωσμωτικότητας), καθώς και η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών σε αίμα και ούρα (Lippincott, 2007 Metheny, 2011). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι παραπάνω αναλύσεις και αξιολογήσεις δεν πραγματοποιούνται στο ενδοκυττάριο υγρό, προφανώς λόγω τεχνικών δυσκολιών. Εφόσον όμως διαταραχές στην ηλεκτρολυτική ισορροπία στο εξωκυττάριο υγρό αντανακλούν εσωκυττάριες διαταραχές και αντανακλώνται εσωκυττάρια, μια τέτοια ανάλυση είναι περιττή. Ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών Η ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών (electrolyte panel analysis) περιλαμβάνει τον προσδιορισμό των επιπέδων των ιόντων Νa +, K +, Cl - και HCO 3 - (PCO 2) (Foxall, 2008). Η ανάλυση των ηλεκτρολυτών πραγματοποιείται όταν ο ασθενής έχει συμπτώματα ανισορροπίας ηλεκτρολυτών (συχνότερα νατρίου) ή διαταραχές που σχετίζονται με μη φυσιολογικά επίπεδα αυτών. Καθώς διαταραχές στην ηλεκτρολυτική και οξεοβασική ισορροπία μπορεί να είναι το αποτέλεσμα πολλών οξέων ή χρόνιων παθολογιών, η ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών είναι πολύ κοινή σε νοσηλευόμενους ασθενείς και ασθενείς στο τμήμα επειγόντων περιστατικών. Συνηθέστερα χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση συμπτωμάτων, που παραπέμπουν σε καρδιακή νόσο και για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας θεραπειών σχετικών με την αντιμετώπιση υψηλής πίεσης αίματος, καρδιακής ανεπάρκειας, και νόσων των νεφρών και του ήπατος. Έτσι, συχνά, η ανάλυση των ηλεκτρολυτών συνδυάζεται επίσης με ανάλυση των αερίων του αίματος και μεταβολιτών. Πέρα από την ανίχνευση διαταραχών στην ηλεκτρολυτική και οξεοβασική ισορροπία εκτελείται και για την παρακολούθηση σχετικών θεραπειών. Έτσι, είναι χρήσιμη στην εκτίμηση της συμμόρφωσης ασθενών με δίαιτα φτωχή σε κάποιον ηλεκτρολύτη (συνηθέστερα στο νάτριο). Τα επίπεδα των ηλεκτρολυτών εκφράζονταν παλαιότερα συνηθέστερα σε meq/l, ενώ πλέον περισσότερο κοινή είναι η έκφρασή τους σε mmol/l ή mg/dl. Διαφορική Διάγνωση Εκτός των αναλύσεων των ηλεκτρολυτών και της ωσμωτικότητα πλάσματος και ούρων, περαιτέρω εργαστηριακές αναλύσεις που σχετίζονται με την εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας απαιτούνται για τον προσδιορισμό της αιτίας των παθολογικών επιπέδων ηλεκτρολυτών στο αίμα. Ως παράδειγμα, σε διαφορική διάγνωση της υπερνατριαιμίας ή της υπονατριαιμίας (differential diagnosis), οι αναλύσεις περιλαμβάνουν: ηλεκτρολύτες πλάσματος (K +, Na +, Cl -, HCO 3- ), ηλεκτρολύτες ούρων 24ώρης συλλογής (K +, Na + ), ωσμωτικότητα πλάσματος και ούρων (ή ειδικό βάρος ούρων), γλυκόζη ορού, ουρία ορού και ούρων, κρεατινίνη ορού, ουρικό οξύ ορού, 96

98 άζωτο ουρίας αίματος (BUN), όγκος ούρων 24ώρου. Επιπλέον για τη διάγνωση της υπονατριαιμίας αναλύονται τα επίπεδα κορτιζόλης (Cortisol) και θυρεοτρόπου ορμόνης (TSH). Η αναλυτική επεξήγηση της διαφορικής διάγνωσης των διαταραχών των ηλεκτρολυτών δεν εντάσσεται στους διδακτικούς σκοπούς αυτού του συγγράμματος. Σύντομα θα αναφερθεί ότι εάν η αιτία της υπονατριαιμίας οφείλεται σε ανεπαρκή πρόσληψη νατρίου, η [Na + ] στα ούρα και στον ορό θα είναι χαμηλή. Εάν, αντίθετα, η αιτία οφείλεται σε νεφρική δυσλειτουργία, η [Na + ] στα ούρα θα είναι υψηλή, λόγω νεφρικών απωλειών, ενώ στον ορό θα είναι χαμηλή. Υψηλή [Na + ] ούρων και χαμηλή [Na + ]ορού είναι επίσης συμβατή με κατακράτηση νερού. Χαμηλή [Na + ] ορού και υψηλή ωσμωτικότητα αποτελεί ένδειξη υπεργλυκαιμίας ή υψηλής συγκέντρωσης ουρίας, αφού η παρουσία της γλυκόζης ή της ουρίας σε αυξημένα επίπεδα αυξάνει τον φαινόμενο όγκο του εξωκυττάριου υγρού, μειώνοντας έτσι τη φαινόμενη συγκέντρωση [Νa + ]ορού, ενώ παράλληλα αυξάνουν και την ωσμωτικότητα σύμφωνα με την Εξίσωση 4.8. Τέλος, χαμηλή [Na + ] ορού και φυσιολογική ωσμωτικότητα αποτελεί ένδειξη υπερλιπιδαιμίας, αφού τα υψηλά λιπαρά αυξάνουν τον φαινόμενο όγκο του εξωκυττάριου υγρού, μειώνοντας τη φαινόμενη συγκέντρωση [Νa + ] ορού, ενώ δε συμβάλουν στην ωσμωτικότητα. Χαμηλή [Na + ] και χαμηλή ωσμωτικότητα μετρούνται σε υπονατριαίμια είτε λόγω χαμηλής πρόσληψης Νa, είτε λόγω αραίωσης του Νa σε υψηλή πρόσληψη νερού. Κλινικός διαγνωστικός αλγόριθμος υπονατριαιμίας παρουσιάζεται αναλυτικά στην βιβλιογραφία από τους Milionis και συνεργάτες (Milionis et al., 2002 Zaoutis & Chiang, 2007). Η τελευταία βιβλιογραφική πηγή περιλαμβάνει και διαγνωστικό αλγόριθμο υπερνατριαιμίας. Τέλος, κλινικός διαγνωστικός αλγόριθμος για την υπερκαλαιμία αναφέρεται από τους Burtis A. και συνεργάτες (Burtis et al., 2007). Χάσμα Ανιόντων Μία εισαγωγή στην έννοια του χάσματος ανιόντων (anion gap [AG]) έγινε στην Ενότητα Υπολογίζεται από τις Εξισώσεις 4.4 ή 4.5. ΑG = [Να + ]- ([Cl - ] +[ΗCΟ 3 - ]) (Εξίσωση 4.4) ΑG = ([Νa + ]+ [K + ])- ([Cl - ] +[ΗCΟ 3 - ]) (Εξίσωση 4.5) Αναφέρθηκε ότι στην κλινική πρακτική το panel των ηλεκτρολυτών περιλαμβάνει τον προσδιορισμό των επιπέδων Na +, K +, Cl - και HCO 3-. Κατά συνέπεια, σύμφωνα με το γράφημα «Gamblegram» του Σχήματος 4.8, ο υπολογισμός με την Εξίσωση 4.4 δεν περιλαμβάνει τα περίπου 7 mmol/l των υπόλοιπων κατιόντων (Ca ++, Mg ++ ) καθώς και τα περίπου 23 mmol/l των υπόλοιπων ανιόντων του οργανισμού (φωσφορικών, θεϊκών, οργανικών οξέων, πρωτεϊνών). Ως αποτέλεσμα, το χάσμα ανιόντων σύμφωνα με την Εξίσωση 4.5, θα πρέπει σε ηλεκτρολυτική ισορροπία να δίνει τιμή (23-7) mmol/l= 16 mmol/l. Στη πράξη, τιμές mmol/l θεωρούνται μη ενδεικτικές ηλεκτρολυτικής διαταραχής. Το χάσμα ανιόντων επηρεάζεται από αλλαγές στη συγκέντρωση των μετρούμενων αλλά και των μη μετρούμενων ανιόντων. Η πιο κοινή μεταβολή είναι η αύξηση του χάσματος ανιόντων λόγω συσσώρευσης όξινων μεταβολιτών (όπως κετοξέων ή ανόργανων οξέων (φωσφορικού, θειϊκού)), σε παθολογικές καταστάσεις των νεφρών ή σε μη ελεγχόμενο διαβήτη. Λιγότερο συχνά παρατηρείται μείωση του χάσματος ανιόντων, όπως σε περιπτώσεις υποαλβουμιναιμίας (η οποία παρατηρείται σε πολλές νόσους) ή σε αύξηση της θετικά φορτισμένης παραπρωτεΐνης, χαρακτηριστικό εργαστηριακό εύρημα της νόσου του πολλαπλού μυελώματος. Ωσμωτικότητα Η εκτίμηση της ωσμωτικότητας κλινικών δειγμάτων γίνεται είτε με απευθείας μέτρησής της με ωσμώμετρο, είτε, κυρίως στην περίπτωση της ωσμωτικότητας των ούρων, έμμεσα μέσω υπολογισμού του ειδικού βάρους των ούρων. Η τιμή ωσμωτικότητας που προσδιορίζεται με τη βοήθεια των ωσμωμέτρων (ή μέσω του ειδικού βάρους) καλείται μετρούμενη ωσμωτικότητα (measured osmolarity). Πέραν της ενόργανης μέτρησής της, συχνά στην κλινική πρακτική υπολογίζεται η ωσμωτικότητα με βάση άλλες προσδιοριζόμενες κλινικές παραμέτρους μεταξύ των οποίων και η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών (υπολογιζόμενη ωσμωτικότητα ή calculated osmolarity). 97

99 Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα Αναφέρθηκε στην Ενότητα ότι η ωσμωτικότητα του ορού οφείλεται σχεδόν εξ ολοκλήρου στα περιεχόμενα Νa + και τα ανιόντα που τα συνοδεύουν. Τα μόρια της γλυκόζης επίσης έχουν μια μικρότερη συνεισφορά στην υπολογιζόμενη τιμή της ωσμωτικότητας. Έτσι η υπολογιζόμενη ωσμωτικότητα (calculated osmolarity) προαναφέρθηκε ότι δίνεται από τις Εξισώσεις 4.8 και 4.9: Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα (mmol/l) = 2[Na + ] + [urea] + [glucose] (Εξίσωση 4.8) Όπου οι [Na + ], [glucose] και [urea] είναι εκφρασμένες σε mmol/l ή Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα (mosm/l)= 2 [Na + ] + ([glucose] / 18) + (ΒUN / 2,8) (Εξίσωση 4.9) όπου η [Na + ] είναι εκφρασμένη σε mmol/l (ίσο με mosmol/l), ενώ οι [glucose] και [urea] εκφράζονται σε mg/dl. Στην κλινική πρακτική, οι παραπάνω εξισώσεις χρησιμοποιούνται και διαφοροποιημένες, όπου και η [Κ + ] συμμετέχει στον υπολογισμό της ωσμωτικότητας. Η χρησιμότητα του υπολογισμού της ωσμωτικότητας έγκειται στην έννοια του ωσμωτικού χάσματος (Osmolal gap), όπου: Ωσμωτικό Xάσμα = Μετρούμενη Ωσμωτικότητα Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα (Εξίσωση 4.11) Τιμή ωσμωτικού χάσματος υψηλότερη της φυσιολογικής μπορεί να αποτελεί ένδειξη υπερλιπιδαιμίας ή υπερπρωτεϊναιμίας. Στις δύο αυτές παθολογικές καταστάσεις, τα λιπίδια ή οι πρωτεΐνες αντίστοιχα καταλαμβάνουν μεγάλο μέρος του εξωκυττάριου όγκου οδηγώντας σε προσδιορισμό ψευδώς μειωμένης τιμής [Na + ] ορού και [Κ + ] ορού. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε ψευδώς μειωμένη τιμή υπολογιζόμενης ωσμωτικότητας και κατά συνέπεια τιμή ωσμωτικού χάσματος υψηλότερη της φυσιολογικής. Τιμή ωσμωτικού χάσματος υψηλότερη της φυσιολογικής μπορεί επίσης να οφείλεται σε αύξηση άλλων ενδογενών μορίων όπως κετονικών οξέων σε κετοξέωση. Ο υπολογισμός του ωσμωτικού χάσματος χρησιμοποιείται συχνά και στην τοξικολογία, όπου αυξημένη τιμή του αποτελεί ένδειξη λήψης δηλητηρίου, αιθανόλης, αιθυλενικής γλυκόλης, μεθανόλης ή ισοπροπανόλης. Η ένδειξη πρέπει ασφαλώς να επιβεβαιωθεί με χρωματογραφική ανάλυση ορού. Καθώς τα νεφρά λειτουργούν ως ένα φίλτρο, που προσαρμόζουν τη διέλευση νερού και διαλυμένων ουσιών ώστε να διατηρείται η ομοιόσταση του οργανισμού είναι αναμενόμενο το εύρος των τιμών αναφοράς της ωσμωτικότητας των ούρων να είναι ιδιαίτερα μεγάλο. Σημαντική είναι και η διαγνωστική αξία του λόγου ωσμωτικότητα ούρων 24ώρου/ωσμωτικότητα ορού. Τιμή του λόγου αυτού μεγαλύτερης της μονάδας είναι φυσιολογική. Αντίθετα, τιμή ίση ή ελαφρώς ανώτερη της μονάδας υποδηλώνει διαταραχή της νεφρικής λειτουργίας, εφόσον ουσιαστικά δεν λαμβάνει χώρα διήθηση του ορoύ από τους νεφρούς. Τιμή του λόγου μικρότερη της μονάδας, μετριέται σε ασθενείς με άποιο διαβήτη (diabetes insipidus), (Lord, 1999 Strasinger & Di Lorenzo, 2014). Σχετική Πυκνότητα (Ειδικό Βάρος) Απουσία ωσμωμέτρου, αντί της ωσμωτικότητας των ούρων μετράται εναλλακτικά η σχετική πυκνότητα των ούρων που καλείται και ειδικό βάρος, (relative density ή specific gravity). Κάτω από καθορισμένες συνθήκες, υπάρχει γραμμική σχέση μεταξύ ειδικού βάρους και ωσμωτικότητας. Ορισμένες όμως παθολογικές καταστάσεις και η λήψη κάποιων φαρμάκων οδηγούν σε εσφαλμένη εκτίμηση της ωσμωτικότητας, μέσω της μέτρησης του ειδικού βάρους. Έτσι η ενόργανη μέτρηση της ωσμωτικότητας προτιμάται αυτής της σχετικής πυκνότητας, όπου υπάρχει η δυνατότητα επιλογής. 98

100 Στην κλινική ανάλυση, η σχετική πυκνότητα του ορού ή ούρων (d σχ) ορίζεται ως ο λόγος της μάζας (m χ) ορισμένου όγκου (V χ) του ορού ή ούρων, προς τη μάζα (m Η2Ο) ίσου όγκου νερού (V χ), όπως στην Εξίσωση d σχ = m χ mη 2 O (Εξίσωση 4.12) Η τιμή του ειδικού βάρους εξαρτάται από τη θερμοκρασία και κατά κανόνα η θερμοκρασία αναφοράς είναι 20 C. Καθώς τα ούρα είναι ουσιαστικά υδατικά διαλύματα, που περιέχουν διαλυμένα ποικιλία συστατικών, η σχετική πυκνότητά τους αποτελεί μέτρο της πυκνότητας των συστατικών που εμπεριέχονται. Κατά συνέπεια, το ειδικό βάρος των ούρων καθορίζεται από το πλήθος αλλά και το μέγεθος των διαλυμένων συστατικών. Έτσι, η συνεισφορά των μεγαλύτερων σε μέγεθος μορίων στην τιμή του ειδικού βάρους είναι μεγαλύτερη. Αντιθέτως η τιμή της ωσμωτικότητας καθορίζεται μόνο από το πλήθος των διαλυμένων συστατικών. Έτσι, απαιτείται διόρθωση της μετρούμενης τιμής του ειδικού βάρους των ούρων με βάση το περιεχόμενο τους σε μόρια που κλασσικά δεν απαντώνται εκεί, όπως η γλυκόζη και οι πρωτεΐνες. Τιμή ειδικού βάρους 1,010 αντιστοιχεί σε φυσιολογική ωσμωτικότητα ούρων 320 mosm/kg. Καθώς όμως η ωσμωτικότητα των ούρων αποτελεί συνάρτηση των προσλαμβανόμενων με την τροφή συστατικών, η τιμή του ειδικού βάρους μπορεί να διαφοροποιείται ελαφρώς από τη μία μέρα στην άλλη. Μάλιστα, μη διαφοροποίηση της τιμής του ειδικού βάρους δεν θεωρείται φυσιολογική και συνήθως αποτελεί ένδειξη νεφρικής δυσλειτουργίας (Strasinger & Di Lorenzo, 2014). Στον Πίνακα 4.4 φαίνονται ενδεικτικές τιμές αναφοράς των κυριότερων παραμέτρων της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας. Οι τιμές αυτές διαφοροποιούνται ελαφρώς ανάλογα με τη βιβλιογραφική πηγή, ιδίως όσον αφορά το χάσμα ανιόντων και την ωσμωτικότητα. Έτσι, για την αξιολόγηση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων απαιτείται ο προσδιορισμός του διαστήματος αναφοράς από το ίδιο εργαστήριο όπου πραγματοποιείται η ανάλυση. Σύνοψη: Η διάγνωση των ηλεκτρολυτικών διαταραχών στηρίζεται στο ιστορικό, στην κλινική εικόνα, στη φυσική εξέταση του ασθενούς στη μέτρηση του εξωκυττάριου όγκου, στην αξιολόγηση του ρυθμού διούρησης, στη μέτρηση της ωσμωτικότητας του πλάσματος και των ούρων (εναλλακτικά το ειδικό βάρος των ούρων αντί της ωσμωτικότητας), καθώς και στη συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών σε αίμα και ούρα.. Η ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών (electrolyte panel analysis) περιλαμβάνει τυπικά τον προσδιορισμό των επιπέδων των ιόντων νατρίου, καλίου, χλωριόντων και διττανθρακικών. Ο προσδιορισμός της ωσμωτικότητας κλινικών δειγμάτων γίνεται είτε με απευθείας μέτρησή της με ωσμώμετρο, είτε μέσω υπολογισμού του ειδικού βάρους των ούρων, είτε τέλος υπολογίζεται βάσει εξίσωσης. Ο υπολογιστικός προσδιορισμός του ωσμωτικού χάσματος, του χάσματος ανιόντων και του λόγου ωσμωτικότητα ούρων 24ώρου/ωσμωτικότητα ορού έχουν επίσης διαγνωστική αξία. Η ισορροπία των ιόντων νατρίου, καλίου, χλωριόντων και διττανθρακικών στο αίμα, αποτελεί μία καλή ένδειξη τις λειτουργικότητας των νεφρών και της καρδιάς. 99

101 Κλινική Παράμετρος [Νa + ] ορού Τιμές Αναφοράς mmol/l [Κ + ] ορού 3,5-5,5 mmol/l [Mg ++ ] ορού 1,5-2,5 mmol/l [Ca ++ ] ορού 4,65-5,28 mg/dl [Ca ολικό] ορού 8,2-10,2 mg/dl [Cl - ] ορού mmol/l [PO - 4 ] ορού 2,7-4,5 mg/dl Ωσμωτικότητα Ορού mosm/l Ωσμωτικότητα Ούρων mosm/l Ωσμωτικότητα Ούρων 24ώρου mosm Ειδικό Βάρος Ούρων 1,005-1,030 Χάσμα Ανιόντων 8-12 mmol/l ή mmol/l, ανάλογα με το εάν στον προσδιορισμό του χρησιμοποιείται η Εξίσωση 4.4 ή 4.5 αντίστοιχα Ωσμωτικό Χάσμα < 10 mosm/kg PaCO mmhg, mmhg Πίνακας 4.4 Τιμές αναφοράς ηλεκτρολυτών και άλλων κλινικών παραμέτρων, που χαρακτηρίζουν την ηλεκτρολυτική ισορροπία Οργανολογία Προφυλάξεις κατά το προαναλυτικό στάδιο Για τον προσδιορισμό των παραμέτρων της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας στο εξωκυττάριο υγρό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ορός ή πλάσμα. Υπάρχουν μια σειρά από προφυλάξεις που πρέπει να τηρούνται κατά το προαναλυτικό στάδιο, όπως αναφέρονται παρακάτω: Ο ορός και το πλάσμα πρέπει να διαχωρίζονται από τα έμμορφα συστατικά ταχύτατα μετά τη λήψη, ώστε να μην λαμβάνει χώρα λύση κυττάρων (κι απελευθέρωση ενδοκυττάριου K + ), αλλά και να αποφεύγεται ανταλλαγή ιόντων μεταξύ ορού και μεταλλοπρωτεϊνών. Ως αντιπηκτικό κατά τη δειγματοληψία πρέπει να προτιμάται το ηπαρινικό αμμώνιο, χωρίς προσμίξεις μετάλλων. Σε περίπτωση που χρησιμοποιηθούν, ως αντιπηκτικά, άλατα του EDTA με μέταλλα, ή κιτρικά ή οξαλικά τέτοια άλατα, η συνεισφορά τους στη μετρούμενη ωσμωτικότητα του πλάσματος θα είναι ιδιαίτερα μεγάλη, αλλοιώνοντας το αποτέλεσμα. Επίσης, EDTA ή οξαλικά αντιπηκτικά είναι ακατάλληλα διότι δεσμεύουν ιόντα Ca ++ και Mg ++ του δείγματος. Η φλεβοκέντηση κατά την αιμοληψία πρέπει να γίνεται γρήγορα ώστε να μην υπάρχει στάση του αίματος. Σε διαφορετική περίπτωση, μέταλλα όπως το Ca και Mg είναι δυνατόν να αποσπαστούν από τις πρωτεΐνες που τα περιέχουν, δίνοντας ψευδώς αυξημένες συγκεντρώσεις αυτών στο αίμα. Aποθήκευση επί μακρόν δειγμάτων αίματος πριν την ανάλυσή των ηλεκτρολυτών πρέπει να αποφεύγεται. Αυτό, διότι λαμβάνει χώρα λύση λευκών και ερυθρών αιμοσφαιρίων, προκαλώντας τη σημαντική αύξηση της [K + ] ορού Αναλύσεις ηλεκτρολυτών Οι αναλύσεις των ηλεκτρολυτών αποτελούν από τις πιο τακτικά εκτελούμενες εργαστηριακές αναλύσεις σε κλινικά δείγματα. Στην καθημερινή κλινική πρακτική προσδιορίζονται μόνο οι ηλεκτρολύτες Na +, K +, Cl - και HCO 3 - (ο τελευταίος μέσω της PCO 2). Η ανάλυση τους καλείται panel ηλεκτρολυτών (electrolyte panel). Αρχικά θα αναφερθούν περιληπτικά δύο παλαιότερες τεχνολογίες προσδιορισμού ιόντων που πλέον έχουν περιορισμένη εφαρμογή σε κλινικούς προσδιορισμούς ηλεκτρολυτών και στη συνέχεια θα αναπτυχθεί η τεχνολογία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων, που πλέον σχεδόν αποκλειστικά εφαρμόζεται στον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών σε κλινικά δείγματα. Τέλος, θα γίνει αναφορά στην εφαρμογή κλασικών 100

102 μεθόδων ποσοτικής χημικής ανάλυσης για τον προσδιορισμό των ηλεκτρολυτών. Ο προσδιορισμός της PCO 2 στα πλαίσια του panel ηλεκτρολυτών, πραγματοποιείται με Ηλεκτρόδιο Severinghaus, όπως περιγράφηκε στην Ενότητα Φλογοφωτομετρία Είναι γνωστό στον αναλυτικό χημικό ότι τα αλκάλια και οι αλκαλικές γαίες καιόμενα εκπέμπουν ακτινοβολία χαρακτηριστικού χρώματος (π.χ. κόκκινου χρώματος το Ca, ή κίτρινου χρώματος το Na, ή ιώδους χρώματος το Κ). Η τεχνική της φλογοφωτομετρίας (flame spectrometry) εκμεταλλεύεται αυτήν την ιδιότητα των αλκαλίων και αλκαλικών γαιών για τη μέτρηση της συγκέντρωσης τους σε διαλύματα αυτών, περιλαμβανομένων και κλινικών υγρών. Η φλογοφωτομετρία βασίζεται στη θερμική διέγερση ατόμων εντός φλόγας και τη μέτρηση της εκπεμπόμενης χαρακτηριστικής (κατά άτομο) ακτινοβολίας κατά την αποδιέγερσή τους. Προκειμένου να επιτευχθεί η ατομοποίηση των συστατικών του υγρού δείγματος, το δείγμα υπό μορφή αερολύματος αναμιγνύεται με καύσιμο αέριο και αέρα και εισάγεται σε φλόγα, όπου αρχικά λαμβάνει χώρα η εξάτμιση του διαλύτη, ενώ στη συνέχεια εξατμίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος και ατομοποιούνται. Τα περιεχόμενα άτομα διεγείρονται θερμικά σε ανώτερες ενεργειακές καταστάσεις. Η τεχνική της φλογοφωτομετρίας βρίσκει συνεπώς εφαρμογή στην κλινική ανάλυση στον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό ηλεκτρολυτών. Το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας εξαρτάται από την ταυτότητα του ηλεκτρολύτη, ιδιότητα στην οποία στηρίζεται η ταυτοποίηση του ηλεκτρολύτη. Επίσης η ένταση της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλυόμενου ηλεκτρολύτη. Αυτό επιτρέπει και τον ποσοτικό προσδιορισμό του ηλεκτρολύτη, μετά από κατασκευή καμπύλης αναφοράς με χρήση προτύπων διαλυμάτων αυτού. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η περιορισμένη περιοχή γραμμικότητας αυτής και η μη δυνατότητα εφαρμογής της σε φορητούς αναλυτές. Άλλο μειονέκτημα αποτελούν οι κίνδυνοι που συνδέονται με τη χρήση σε εργαστήριο εύφλεκτων αερίων και με τη χρήση διάταξης με φλόγα, αλλά και ο μεγαλύτερος χρόνος βαθμονόμησης που απαιτείται σε σχέση με τη χρήση ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων. Τα βασικά μέρη μίας διάταξης φλογoφωτόμετρου φαίνονται διαγραμματικά στo Σχήμα Αναφέρονται παρακάτω, ενώ επεξηγείται σύντομα και η λειτουργία τους: σύστημα εισόδου του δείγματος με αναρρόφηση (sample aspirator), εκνεφωτής (nebulizer): Μέσω του εκνεφωτή το προς ανάλυση υγρό δείγμα μετατρέπεται σε αερόλυμα, καυστήρας (burner): Το αερόλυμα του δείγματoς εισάγεται στη συνέχεια στη φλόγα, όπου αρχικά λαμβάνει χώρα η εξάτμιση του διαλύτη, ενώ στη συνέχεια εξατμίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος και ατομοποιούνται. Τα περιεχόμενα άτομα διεγείρονται θερμικά σε ανώτερες ενεργειακές καταστάσεις, κάτοπτρο (mirror), αναλυτής φάσματος εκπομπής (φίλτρο ή μονοχρωμάτορας, filter ή monochromator): απομονώνει την εκπεμπόμενη ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος (π.χ. για το Na είναι 589 nm, για το K 766 nm) που ανταποκρίνεται στον ηλεκτρολύτη που ενδιαφερόμαστε να αναλύσουμε, ανιχνευτής (detector), ενισχυτής-φωτοπολλαπλασιαστής (amplifier-photomultiplier), καταγραφέας (recorder). Η τεχνική είναι γνωστή και ως φλογοφασματοσκοπία εκπομπής (flame emission spectroscopy, FES) όταν μονοχρωμάτορας, αντί φίλτρου, χρησιμοποιείται για την απομόνωση της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος (Burtis et al., 2007). Φασματοσκοπία Ατομικής Απορρόφησης Η τεχνική της Φασματοσκοπίας Aτομικής Απορρόφησης (Atomic Absorption Spectrometry, ΑΑS) βασίζεται στη μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας από άτομα που βρίσκονται στη θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση, εντός φλόγας. Η τεχνική της ΑΑS χρησιμοποιείται σε μετρήσεις της συγκέντρωσης μετάλλων/ιχνοστοιχείων σε διάφορα υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων και των κλινικών υγρών. Προκειμένου να επιτευχθεί η ατομοποίηση των συστατικών ενός υγρού δείγματος, το δείγμα υπό μορφή 101

103 αερολύματος αναμειγνύεται με καύσιμο αέριο και αέρα και εισάγεται σε φλόγα, όπου αρχικά λαμβάνει χώρα η εξάτμιση του διαλύτη, ενώ στη συνέχεια εξατμίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος και ατομοποιούνται. Τα περιεχόμενα άτομα απορροφούν προσπίπτουσα ακτινοβολία, σε συγκεκριμένο μήκος κύματος για κάθε άτομο. Ουσιαστικά πρόκειται για μία παραλλαγή της φλογοφασματοσκοπίας εκπομπής. Οι βασικότερες διαφορές των δύο τεχνικών έγκεινται στον τρόπο διέγερσης των ατόμων (θερμικά για την FES και μετά από απορρόφηση ακτινοβολίας για την AAS) και στο μετρούμενο σήμα (εκπομπή ακτινοβολίας ή απορρόφηση ακτινοβολίας αντίστοιχα). Στην κλινική ανάλυση η AAS βρίσκει συνεπώς εφαρμογή στον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό ιχνοστοιχείων, συμπεριλαμβανομένων των ηλεκτρολυτών. Το μήκος κύματος της απορροφούμενης ακτινοβολίας εξαρτάται από την ταυτότητα του μετάλλου, ιδιότητα στην οποία στηρίζεται η ταυτοποίηση του ηλεκτρολύτη. Επίσης η απορρόφηση της ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλυόμενου ηλεκτρολύτη που απορροφά στο μήκος κύματος αυτό, σύμφωνα με τον νόμο των Beer-Lambert (Κεφάλαιο 1). Αυτό επιτρέπει και τον ποσοτικό προσδιορισμό του ηλεκτρολύτη, μετά από κατασκευή καμπύλης αναφοράς με χρήση προτύπων διαλυμάτων. Πλεονέκτημά της AAS σε σχέση με την FES αποτελεί η αυξημένη ευαισθησία της πρώτης και η ευρύτερη περιοχή γραμμικότητάς της (Drees & Wu, 2009). Τα βασικά μέρη μιας διάταξης φασματοφωτόμετρου ατομικής απορρόφησης είναι τα ίδια με αυτά μιας διάταξης φλογoφωτόμετρου, με μοναδική προσθήκη μίας λυχνίας πολλαπλών στοιχείων που εκπέμπει ακτινοβολία χαρακτηριστικού για κάθε ηλεκτρολύτη μήκους κύματος, όπως φαίνεται στο ένθετο του Σχήματος Σχήμα 4.11 Σχηματική αναπαράσταση διάταξης φλογοφωτόμετρου και φασματοφωτόμετρου ατομικής απορρόφησης. Η λυχνία που εμφανίζεται μέσα σε ένθετο, αποτελεί τη μόνη προσθήκη που διακρίνει ένα φασματοφωτόμετρο ατομικής απορρόφησης από ένα φλογοφωτόμετρο. Aυτόματοι Αναλυτές Ηλεκτρολυτών Ο προσδιορισμός των παραμέτρων που χαρακτηρίζουν την ηλεκτρολυτική ισορροπία γίνεται με τη χρήση αυτόματων εργαστηριακών και παρακλίνιων αναλυτών (Chin et al., 2012). Πάρα πολύ συχνά οι αναλυτές αυτοί συνδυάζονται με τους αναλυτές αερίων που περιγράφηκαν αναλυτικά στο Κεφάλαιο Για τη μέτρηση του panel των ηλεκτρολυτών με τους αυτόματους αναλυτές χρησιμοποιείται η τεχνολογία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων. Στη Φωτογραφία 4.5 φαίνεται αυτόματος βιοχημικός αναλυτής, που προσδιορίζει μεταξύ άλλων παραμέτρων [Κ + ], [Νa + ], [Cl - ] με ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια. 102

104 Ιοντοεπιλεκτικά Ηλεκτρόδια (Ποτενσιομετρικός Προσδιορισμός) Βασικά πλεονεκτήματα της τεχνολογίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων (Ion Selective Electrodes ή ISE) σε σχέση με τη Φασματοσκοπία Ατομικής Απορρόφησης ή τη Φλογοφωτομετρία αποτελούν το χαμηλό κόστος ανάλυσης, η ταχύτητα της ανάλυσης και η ευκολία χειρισμού και ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Το σημαντικότερο όμως πλεονέκτημα είναι η δυνατότητα προσαρμογής της τεχνολογίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων σε πολύ μικρή κλίμακα επιτρέποντας την ανάλυση του panel ηλεκτρολυτών με Oλοκληρωμένα Hλεκτρονικά Kυκλώματα (microchips) σε παρακλίνιους αναλυτές (Ενότητα ), παράλληλα με την ανάλυση κλινικών παραμέτρων που περιγράφουν την άμεσα συνδεόμενη οξεοβασική ισορροπία του οργανισμού. Η αρχή λειτουργίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων είναι ανάλογη με την αρχή λειτουργίας του ηλεκτροδίου υάλου (Ηλεκτροδίου Υδρογόνου), που αναφέρθηκε στην Ενότητα Το συγκεκριμένο ιόν για το οποίο είναι εκλεκτικό το ηλεκτρόδιο, διεισδύει μέσω μιας περατής από αυτό μεμβράνης από το βιολογικό δείγμα σε ένα εσωτερικό διάλυμα ηλεκτρολύτη όπου ανάγεται στην κάθοδο (για τα κατιόντα) ή οξειδώνεται στην άνοδο (για τα ανιόντα). Η προκύπτουσα διαφορά δυναμικού είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση του διαλυμένου ιόντος. Συγκρινόμενο με το δυναμικό που αναπτύσσεται σε πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης προσδιορίζεται η άγνωστη συγκέντρωση του ηλεκτρολύτη στο δείγμα, με βάση την εξίσωση του Nernst. Το ηλεκτρόδιο υδρογόνου είναι το πιο κοινό ιοντοεπιλεκτικό ηλεκτρόδιο. Παρόλο που ηλεκτρόδια επιλεκτικά για κάποια ιόντα, πράγματι λειτουργούν με ευκολία και απλότητα αντίστοιχης αυτής του ηλεκτροδίου υάλου, αυτό δεν ισχύει για το σύνολο των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων. Παράγοντες όπως: H μειωμένη εκλεκτικότητα κάποιων ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων, η οποία έχει ως αποτέλεσμα παρεμποδίσεις από άλλα ιόντα, που τυχόν εμπεριέχονται στο μετρούμενο διάλυμα, H περιορισμένη γραμμική περιοχή και υψηλότερο όριο ανίχνευσης των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων σε σχέση με το ηλεκτρόδιο υδρογόνου, H ικανοποιητική λειτουργία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων μόνο εντός περιορισμένων τιμών ph, αποτελούν σημαντικά εμπόδια στην εφαρμογή της τεχνολογίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων στη μέτρηση όλων των κλινικά σχετικών ιόντων. Παρ όλα αυτά, εάν ληφθούν κατάλληλες σχετικές προφυλάξεις κατά την ανάλυση, η τεχνολογία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων γίνεται ένα πολύ χρήσιμο αναλυτικό εργαλείο, που επιτρέπει τον προσδιορισμό των ηλεκτρολυτών σε κλινικά δείγματα με απλότητα χειρισμού και χαμηλό κόστος ανάλυσης (Burtis et al., 2007). Τα ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια που είναι ενσωματωμένα στους αυτόματους αναλυτές θεωρούνται αναλώσιμα και πρέπει να αντικαθίστανται μετά από συγκεκριμένο αριθμό αναλύσεων. Καινοτομία στον χώρο των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων αποτελεί η τεχνολογία Integrated Multisensor Technology (IMT): Η τεχνολογία αυτή συνδυάζει τον παράλληλο προσδιορισμό των [K + ], [Na + ], [Cl - ] σε κλινικό δείγμα. Το μετρούμενο ηλεκτρικό δυναμικό είναι ανάλογο του λογάριθμου της συγκέντρωσης του κάθε αναλύτη στο δείγμα. 103

105 Φωτογραφία 4.5 Αυτόματος βιοχημικός αναλυτής (Roche Hitachi 902) που διαθέτει ενσωματωμένα τρία Ιοντοεπιλεκτικά Ηλεκτρόδια για τον προσδιορισμό [Κ + ], [Νa + ], [Cl - ]. Κλασικές Μέθοδοι Ποσοτικής Χημικής Ανάλυσης Μία τελευταία κατηγορία μεθοδολογιών ποσοτικού προσδιορισμού ηλεκτρολυτών, βασίζεται σε κλασικές τεχνικές ποσοτικής χημικής ανάλυσης, όπως τιτλομετρήσεις καταβύθισης, σταθμική ανάλυση και συμπλοκομετρικές τιτλομετρήσεις, αλλά και σε κουλομετρικές τεχνικές. Η παραπάνω κατηγορία μεθοδολογιών εφαρμόζεται πλέον περιορισμένα στην κλινική ανάλυση δευτερευόντων ηλεκτρολυτών (Ca ++, Mg ++, PΟ κ.α), ενώ έχει καταστεί πρακτικά απαρχαιωμένη στην ανάλυση του panel των ηλεκτρολυτών (K +, Na +, Cl - ). Υπάρχει στη βιβλιογραφία μία μεγάλη πληθώρα σχετικών μεθοδολογιών, οι περισσότερες από τις οποίες βασίζονται στις παρακάτω αρχές: Παρουσία κατάλληλου αντιδραστηρίου, δημιουργείται έγχρωμη σύμπλοκη ένωση με τον ηλεκτρολύτη. Η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη στο κλινικό δείγμα. Παρουσία γνωστής συγκέντρωσης κατάλληλου αντιδραστηρίου, δημιουργείται αδιάλυτη ένωση με τον η- λεκτρολύτη, η οποία καταβυθίζεται. Το παραμένον σε διάλυμα αντιδραστήριο προσδιορίζεται ποσοτικά μέσω σχηματισμού διαλυτού έγχρωμου συμπλόκου μετά από προσθήκη κατάλληλης ουσίας. Έτσι υπολογίζεται η ποσότητα του αντιδραστηρίου που καταβυθίστηκε και εμμέσως η συγκέντρωση του ηλεκτρολύτη. Κατάλληλο υπόστρωμα μετατρέπεται ενζυμικά σε έγχρωμο προϊόν παρουσία ενζύμου, του οποίου η δραστικότητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη. Η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη στο κλινικό δείγμα Προσδιορισμός Ωσμωτικότητας Μετρούμενη ωσμωτικότητα Αναφέρθηκε ότι η ωσμωτικότητα του ορού αποτελεί δείκτη της συγκέντρωσης διαλυμένων ουσιών στο αίμα. Είναι γνωστό ότι τα διαλυμένα σωματίδια μεταβάλλουν κάποιες φυσικοχημικές ιδιότητες των διαλυμάτων, που ονομάζονται προσθετικές και οι τιμές των οποίων εξαρτώνται μόνο από τον αριθμό των διαλυμένων σωματιδίων σε ορισμένο όγκο διαλύματος. Τέτοιες ιδιότητες είναι η ωσμωτική πίεση, το σημείο ζέσεως, και το σημείο πήξεως (ή σημείο κατάψυξης). Η μέτρηση της ωσμωτικότητας του αίματος και ούρων γίνεται με το ωσμώμετρο (osmometer) και βασίζεται στην ανάλογη σχέση μεταξύ της ωσμωτικότητας και έκτασης της επιφερόμενης μεταβολής σε κάποια από τις παραπάνω ιδιότητες του εξεταζόμενου βιολογικού υγρού κατά την αύξηση της συγκέντρωσης των διαλυμένων σωματιδίων στο υγρό. Η τιμή ωσμωτικότητας που προσδιορίζεται με τη βοήθεια των ωσμωμέτρων καλείται μετρούμενη ωσμωτικότητα (measured osmolarity). Ωσμώμετρο ταπείνωσης σημείου πήξεως (ωσμώμετρο κρυοπηξίας, freezing point depression osmometer) Συνήθως, η λειτουργία των ωσμωμέτρων βασίζεται στη μέθοδο της κρυοπηξίας: όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση των διαλυμένων σωματιδίων στο βιολογικό υγρό, τόσο πιο πολύ ταπεινώνεται το σημείο πήξεως 104

106 αυτού σε σχέση με την τιμή αναφοράς. Όταν 1 mol, οποιασδήποτε μη διιστάμενης ουσίας, διαλυθεί σε 1 kg νερού, το σημείο πήξεως ταπεινώνεται κατά 1,858 C. 1 mol ενός ηλεκτρολύτη μειώνει διαλυόμενο το σημείο πήξεως κατά ποσό πολλαπλάσιο του 1,858 C, τόσες φορές, όσες και ο αριθμός των ιόντων στα οποία διίσταται. Πειραματικά, το κλινικό δείγμα, το σημείο πήξεως του οποίου επιθυμούμε να προσδιορίσουμε (πλάσμα, αίμα, ούρα) πληρώνει ειδικό περιέκτη όπου ψύχεται και στη συνέχεια υπερψύχεται. Ο όρος υπέρψυξη (supercooling) αναφέρεται στη μείωση της θερμοκρασίας κάτω του σημείου πήξης του δείγματος, χωρίς τον σχηματισμό κρυστάλλων. Η ψύξη και υπέρψυξη επιτυγχάνονται είτε με κυκλοφορία ψυκτικού υγρού στο τοιχώματα ενός περιέκτη που δεν ανταλλάσσει θερμότητα με το περιβάλλον, είτε με σύστημα peltier temperature controller. Στη συνέχεια ξεκινά η πυρηνογένεση που ευνοείται είτε υπό απότομη δόνηση ενός αναδευτήρα, είτε υπό εμβάπτιση στο δείγμα βελόνας με πυρήνες πάγου. Κατά την κρυστάλλωση του δείγματος, θα σημειωθεί αύξηση της θερμοκρασίας, λόγω της απελευθέρωσης της θερμότητας κρυστάλλωσης (Σχήμα 4.12). Στη συνέχεια η θερμοκρασία θα παραμείνει στάσιμη σε αυτή την τιμή για παρατεταμένο χρονικό διάστημα, όπου θα υπάρχει ισορροπία υγρής/στερεής κατάστασης. Αυτή η θερμοκρασία ισορροπίας είναι το σημείο πήξεως του δείγματος και καταγράφεται με τη βοήθεια θερμίστορα. Καθώς υπάρχει γραμμική σχέση μεταξύ ωσμωτικότητας και σημείου πήξεως, η μέτρηση του σημείου πήξεως επιτρέπει τον προσδιορισμό της ωσμωτικότητας του δείγματος, μετά από σύγκριση με πρότυπα διαλύματα. Αυτή είναι και η ένδειξη σε mosm/kg H 2Ο που διαβάζεται στο ωσμώμετρο. Τα βασικά μέρη μίας τυπικής διάταξη ωσμώμετρου ταπείνωσης σημείου πήξεως παρουσιάζονται στο Σχήμα Σχήμα 4.12 Τυπική καμπύλη μεταβολής της θερμοκρασίας με το χρόνο κατά τη μέτρηση της ωσμωτικότητας κλινικού δείγματος με ωσμώμετρο ταπείνωσης σημείου πήξεως (προσαρμοσμένο από Abele, 1963). 105

107 Σχήμα 4.13 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης μέτρησης της ωσμωτικότητας με βάση την ταπείνωση του σημείου πήξεως Εκτίμηση Εξωκυττάριου Όγκου Ο εξωκυττάριος όγκος (Extracellular fluid volume ή EFV) εκτιμάται με τη χορήγηση στον ασθενή κάποιας ουσίας η οποία δεν διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη αλλά διέρχεται διαμέσου των τριχοειδών πόρων. Φυσικά η παραδοχή ότι το σύνολο της χορηγούμενης ουσίας διαλυόμενο κατανέμεται πλήρως, ομοιόμορφα και μόνο στο εξωκυττάριο υγρό προϋποθέτει ότι αυτή δε μεταβολίζεται ή δεν απεκκρίνεται μέχρι τη στιγμή της μέτρησης. Καθώς η μη απέκκριση είναι αναπόφευκτη, σχετική διόρθωση είναι απαραίτητη για τη σωστή εκτίμηση του εξωκυττάριου όγκου. Συχνά στην εκτίμηση του εξωκυττάριου όγκου χορηγείται ραδιενεργή ινουλίνη. Εάν χορηγήθηκαν V A ml της ουσίας συγκέντρωσης [Α] και σε δείγμα ορού προσδιορίσθηκε η ουσία σε συγκέντρωση [Β], τότε ο όγκος του εξωκυττάριου υγρού (Extracellular Fluid Volume ή EFV) υπολογίζεται από την εξίσωση: EFV= V A x [A] (Εξίσωση 4.13) [B] Μέτρηση Ειδικού Βάρους (Σχετικής Πυκνότητας) Διαθλασιμετρία Η τεχνική της διαθλασιμετρίας (refractometry) βασίζεται στη μέτρηση του δείκτη διάθλασης (refractive index), ο οποίος ορίζεται ως ο λόγος της ταχύτητας του φωτός στον αέρα, προς την ταχύτητα του φωτός στο αναλυόμενο διάλυμα. Ο δείκτης διάθλασης εξαρτάται από τον αριθμό και το μέγεθος των διαλυμένων σωματιδίων μέσα στο διάλυμα. Πλεονέκτημα της τεχνικής αποτελεί ο πολύ μικρός απαιτούμενος όγκος δείγματος, η ταχύτητα και απλότητα της ανάλυσης, η ευκολία καθαρισμού του οργάνου πριν την επόμενη χρήση και η μηδενική απαιτούμενη προκατεργασία δείγματος. Το σημαντικότερο μειονέκτημά της είναι η ανάγκη διόρθωσης της μετρούμενης τιμής της σχετικής πυκνότητας των ούρων για την περιεχόμενη γλυκόζη και πρωτεΐνες. Η μέτρηση του ειδικού βάρους εφαρμόζεται συχνά στην ανάλυση τυχαίων δειγμάτων ούρων, ούρων 24ώρου και σπανιότερα άλλων σωματικών υγρών. Παραδοσιακά αποτελεί από τις σημαντικότερες τεχνικές παρακολούθησης της νεφρικής λειτουργίας. Επίσης, καθώς ο δείκτης διάθλασης του πλάσματος ή ορού εξαρτάται κυρίως από τη συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης αυτού, υπάρχουν διαθλασίμετρα που μετρούν την ολική πρωτεΐνη ορού (εμμέσως, μετά τη μέτρηση του δείκτη διάθλασης αυτού) (Drees & Wu, 2009). 106

108 Στο Σχήμα 4.14 φαίνεται διαγραμματικά μία τυπική διάταξη φορητού αναλογικού διαθλασίμετρου, ενώ στη Φωτογραφία 4.6 παρουσιάζεται η φωτογραφία ενός κλινικού φορητού διαθλασίμετρου. Για τη μέτρηση, προστίθενται μόνο λίγες σταγόνες του υγρού δείγματος στην επιφάνεια του πρίσματος μέτρησης και καλύπτονται με το πρίσμα φώτισης/καπάκι. Η μπροστινή άκρη του διαθλασίμετρου (αριστερή άκρη στη Φωτογραφία 4.5) στη συνέχεια προσανατολίζεται προς μια πηγή φωτός (π.χ διάχυτο ηλιακό φως). Το φως διαθλάται καθώς περνά μέσα από το υγρό δείγμα και οι διαθλώμενες ακτίνες φωτίζουν μέρος της κλίμακας του διαθλασίμετρου. Η μέτρηση διαβάζεται στην κλίμακα από τον παρατηρητή, ο οποίος καταγράφει την ένδειξη της κλίμακας στο φωτεινό/σκιερό όριο. Ένα διαθλασίμετρο περιλαμβάνει τυπικά περισσότερες κλίμακες, όπου διαβάζεται παράλληλα τουλάχιστον η ένδειξη του ειδικού βάρους και δείκτη διάθλασης (όπως στη Φωτογραφία 4.5.Β). Για τη βαθμονόμηση του οργάνου χρησιμοποιείται απεσταγμένο νερό και ρυθμίζεται χειρωνακτικά η κλίμακα με τη βοήθεια διορθωτικού κοχλία στην ένδειξη ειδικού βάρους 1,000 πάντα σε θερμοκρασία δωματίου στους 20 C. Πέραν των αναλογικών διαθλασίμετρων υπάρχουν και ψηφιακά διαθλασίμετρα, όπου η βαθμονόμηση γίνεται αυτόματα με απεσταγμένο νερό. Υπάρχουν διαθλασίμετρα με αυτόματη αντιστάθμιση θερμοκρασίας, και άλλα όπου η αντιστάθμιση γίνεται από τον χρήστη με χρήση κατάλληλου πίνακα. Τέλος υπάρχουν και μη φορητά διαθλασίμετρα που περιλαμβάνουν σύστημα θερμοστάτισης του δείγματος στους 20 C. Σχήμα 4.14 Τυπική διάταξη φορητού αναλογικού διαθλασίμετρου. Φωτογραφία 4.6 (A) Κλινικό φορητό διαθλασίμετρο που επιτρέπει τη μέτρηση του δείκτη διάθλασης (ND) του ειδικού βάρους ούρων (U.G.) καθώς και τη μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης ορού (S.P) (εμπορικού οίκου ATAGO). Καταγράφει τη θερμοκρασία του δείγματος και διορθώνει αυτόματα τις τιμές του δείκτη διάθλασης που παρέχει. (B). Πολλαπλή κλίμακα του συγκεκριμένου κλινικού διαθλασίμετρου, όπου διαβάζονται ταυτόχρονα ο δείκτης διάθλασης, το ειδικό βάρος ούρων καθώς και η πρωτεΐνη ορού. 107

109 Εμβαπτιζόμενες ταινίες Οι εμβαπτιζόμενες ταινίες (reagent strips) έχουν προσροφημένα μόρια πολυμερούς με επαναλαμβανόμενες καρβοξυλικές ομάδες, καθώς και μόρια πεχαμετρικών δεικτών. Ο βαθμός διάστασης των καρβοξυλικών ομάδων του πολυμερούς καθορίζεται από την ιοντική ισχύ του διαλύματος. Συνεπώς, κατά την εμβάπτιση των ταινιών στο βιολογικό δείγμα απελευθερώνονται πρωτόνια που οδηγούν σε μείωση του ph, και σε αντίστοιχο χρωματισμό των δεικτών. Σύγκριση του λαμβανόμενου χρώματος με κατάλληλο χρωματολόγιο βαθμονομημένο με δείγματα ούρων γνωστού ειδικού βάρους επιτρέπει τον οπτικό προσδιορισμό του ειδικού βάρους στο άγνωστο δείγμα ούρων. Σημαντικά πλεονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η ταχύτητα και η απλότητα της ανάλυσης, η δυνατότητα απευθείας εφαρμογής της σε θολερά δείγματα και η μη ανάγκη διόρθωσης του αποτελέσματος για την περιεχόμενη γλυκόζη ή πρωτεΐνη, σε συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μέχρι 7,5 g/l. Μειονεκτήματα της είναι η περιορισμένη ακρίβειά της ιδιαίτερα σε αλκαλικά δείγματα ούρων και η έλλειψη ανταπόκρισης σε τυχόν περιεχόμενα, μη ιονικά μόρια. Συχνά οι εμβαπτιζόμενες ταινίες προσδιορισμού του ειδικού βάρους των ούρων (Φωτογραφία 4.7) επιτρέπουν τον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών άλλων κλινικών παραμέτρων με διαγνωστική αξία για τη νεφρική λειτουργία. Υπάρχουν στο εμπόριο και αναλυτές που σαρώνουν τις εμβαπτιζόμενες ταινίες μετά την εμβάπτισή τους στο δείγμα ούρων για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Η πειραματική διαδικασία συνίσταται στην εμβάπτιση της ταινίας στο δείγμα ούρων, στο σύντομο στέγνωμα αυτής για την απομάκρυνση της περίσσειας των ούρων και στην μέτρηση της ωσμωτικότητας είτε με τη βοήθεια σαρωτή είτε οπτικά. Φωτογραφία 4.7 (Α) Εμβαπτιζόμενες ταινίες για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό σειράς κλινικών παραμέτρων με διαγνωστική αξία για τη νεφρική λειτουργία, μεταξύ άλλων και του ειδικού βάρους των ούρων. (Β). Σαρωτής για την αυτόματη ανάγνωση της τιμής των μετρούμενων παραμέτρων. Από τον οίκο Changchun Matenu Medical Apparatus Ltd. 4.3 Πειραματικό μέρος Οξεοβασική Ισορροπία Προκειμένου να επιτευχθεί η εξοικείωση των φοιτητών με τη χρήση αυτόματου αναλυτή αερίων αίματος, αλλά και να καταδειχθεί η σημασία της προέλευσης του δείγματος αίματος, προτείνεται ο συγκριτικός προσδιορισμός των παραμέτρων ph, PCO 2, PO 2 και ο υπολογισμός της [HCO 3- ] σε δείγματα φλεβικού και αρτηριακού αίματος ικανού αριθμού ασθενών. Ως πρότυπο προτείνεται η συγκριτική μελέτη των Awasthi και συνεργατών (Awasthi et al., 2013). Κατά την μελέτη, δείγμα αρτηριακού και φλεβικού αίματος λήφθηκε ταυτόχρονα σε ηπαρινισμένη σύριγγα από πλήθος 45 ασθενών μονάδας εντατικής θεραπείας. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε μοντέλο αναλυτή αερίων ABL 555 series (Radiometer, Copenhagen, Denmark) και ακολούθησε η στατιστική 108

110 επεξεργασία των αποτελεσμάτων με υπολογισμό του Συντελεστή Γραμμικής Συσχέτισης του Pearson. Η μελέτη απέδειξε καλή συσχέτιση μεταξύ των παραμέτρων ph (συντελεστής συσχέτισης 0,95), PCO 2 (συντελεστής συσχέτισης 0,83), και [HCO 3- ] (συντελεστής συσχέτισης 0,98). Αντιθέτως δεν βρέθηκε καλή συσχέτιση μεταξύ των τιμών PO 2 που μετρήθηκαν σε αρτηριακό και φλεβικό αίμα (συντελεστής συσχέτισης < 0,3). Στον Πίνακα 4.5 φαίνονται τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της συγκεκριμένης μελέτης. Στην προτεινόμενη εργαστηριακή άσκηση πρέπει να συμπληρωθεί πίνακας αντίστοιχος του 4.5. Για τον υπολογισμό του Συντελεστή Γραμμικής Συσχέτισης του Pearson μπορούν να χρησιμοποιηθούν αυτόματες υπολογιστικές μηχανές του διαδικτίου. Οξεοβασική Παράμετρος Αρτηριακό αίμα (M.O. ± SD) Φλεβικό αίμα (M.O. ± SD) Συντελεστής συσχέτισης (r) ph 7,418 ±0,117 7,365 ±0,11 0,95 PCO2 36,37 ±13,336 41,958±15,496 0,83 PO2 97,669 ± 44,44 36,63 ± 12,49 0,21 [HCO3 - ] 21,876 ±6,718 23,390±6,821 0,98 Πίνακας 4.5 Σύγκριση οξεοβασικών παραμέτρων μεταξύ αρτηριακού και φλεβικού αίματος (Awasthi et al., 2013) Ηλεκτρολυτική Ισορροπία Ανάλυση panel ηλεκτρολυτών με τεχνολογία ΙΜΤ Προκειμένου να επιτευχθεί η εξοικείωση των φοιτητών με τη χρήση αυτόματου αναλυτή που χρησιμοποιεί το σύστημα IMT για τον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών ορού αλλά και με τη διαδικασία βαθμονόμησης και ελέγχου αραίωσης, προτείνεται η παρακάτω άσκηση. Στη Φωτογραφία 4.8. φαίνεται η εκτύπωση αυτόματου αναλυτή τύπου Siemens Dimension Xpand Plus που χρησιμοποιεί το σύστημα QuikLYTE IMT για τον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών ορού. Ο πολυαισθητήρας (multisensor) είναι αναλώσιμο εξάρτημα του αυτόματου αναλυτή και πρέπει να αντικατασταθεί είτε μετά από 5 ημέρες χρήσης, είτε μετά από ανάλυση 1000 δειγμάτων. Εμπορικά διαθέσιμα πρότυπα διαλύματα απαιτούνται για τη βαθμονόμηση (calibration) του πολυαισθητήρα. Το σύστημα IMT προχωρεί αυτόματα σε βαθμονόμηση δύο σημείων, κάθε δύο ώρες, ή νωρίτερα, σε περίπτωση αντικατάστασης προτύπων, ή αντικατάστασης ιοντοεπιλεκτικού πολυ-ηλεκτροδίου (πολυαισθητήρα). Στη σελίδα Α της εκτύπωσης φαίνεται η τιμή της κλίσης της καμπύλης βαθμονόμησης που προέκυψε μετά από βαθμονόμηση δύο σημείων με χρήση των προτύπων Α και Β για το κάθε προσδιοριζόμενο ιόν. Ο κατασκευαστής του αναλυτή δίνει ως αποδεκτές τιμές κλίσης (σε mv/decade) των καμπυλών βαθμονόμησης τις ακόλουθες: Na: 53 έως 65 K: 53 έως 65 Cl: - 40 έως -55 Με βάση τις παραπάνω τιμές και σε συνδυασμό με την εκτύπωση της Φωτογραφίας 4.8.Α φαίνεται ότι η συγκεκριμένη βαθμονόμηση υπήρξε επιτυχής. Πέραν της βαθμονόμησης ο αναλυτής σε τακτική βάση πραγματοποιεί έλεγχο αραίωσης (Dilution Check), όπως αυτός τα αποτελέσματα του οποίου φαίνονται στη Φωτογραφία 4.8.Β. Ο έλεγχος αραίωσης ελέγχει την ακρίβεια 1:10 αραίωσης ειδικού, εμπορικά διαθέσιμου αντιδραστηρίου, γνωστής συγκέντρωσης σε Κ + και Na +. Πραγματοποιούνται 5 επαναλήψεις αραιώσεων από την αντλία της διάταξης QuikLYTE IMT. Tα λαμβανόμενα αποτελέσματα συγκρίνονται με τη γνωστή συγκέντρωση Κ + και Na + (bottle) και υπολογίζεται ο μέσος όρος (mean), τυπική απόκλιση (SD) και η ακρίβεια των τιμών (% bias). Τιμές bias μεταξύ ± 1% θεωρούνται αποδεκτές. Ο έλεγχος αραίωσης έχει ιδιαίτερη σημασία στον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών στα ούρα, όπου απαιτείται αραίωση του δείγματος πριν τον προσδιορισμό. Εφόσον η ακρίβεια (Φωτογραφία 4.8.B) υπολογίστηκε σε 0.00% (< ± 1%) ο έλεγχος αραίωσης γίνεται δεκτός και ο αναλυτής μπορεί να προχωρήσει στον καθαυτό προσδιορισμό των ηλεκτρολυτών. 109

111 Φωτογραφία 4.8 Εκτύπωση αυτόματου αναλυτή τύπου Siemens Dimension Xpand Plus που χρησιμοποιεί το σύστημα QuikLYTE IMT για τον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών. (Α) Βαθμονόμηση, (Β) Έλεγχος Αραίωσης Ποσοτικός προσδιορισμός Ca ++ σε ορό με χρωματομετρική μέθοδο Στη Φωτογραφία 4.9 παρουσιάζεται πρωτόκολλο τελικού σημείου προσδιορισμού Ca ++ σε ορό και ούρα με χρωματομετρική μέθοδο. Η αρχή της μεθόδου έγκειται στο ότι σε ουδέτερο περιβάλλον το ασβέστιο αντιδρά με την εξωγενώς προστιθέμενη ένωση Arsenazo III προς σχηματισμό σύμπλοκης ένωσης κυανού χρώματος, που απορροφά στα 650 nm (Αντίδραση 4.4). Η αύξηση της απορρόφησης στα 650 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ασβεστίου στο δείγμα. Ανάλογη σύμπλοκη ένωση υπό τις ίδιες συνθήκες δίνει το Mg ++. Προκειμένου να αναιρεθεί η παρεμπόδιση των ιόντων μαγνησίου, το πρωτόκολλο περιλαμβάνει παράλληλη προσθήκη περίσσειας 8-υδροξυκινολίνης. H 8-υδρόξυκινολίνη δίνει αδιάλυτη σύμπλοκη ένωση με το Mg ++, με αποτέλεσμα την απομάκρυνσή του από το υπερκείμενο. Arsenazo III + Ca ++ προϊόν κυανού χρώματος (Αντίδραση 4.4) Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 3,5 ml αντιδραστηρίου εργασίας. Αυτό αποτελείται από ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm Goods ph 6,5, 5 mm 8-υδροξυκινολίνη, 0,2 mm Arsenazo III, διαβρέκτη και σταθεροποιητές. Ο σωλήνας πωματίζεται και προθερμαίνεται σε υδρόλουτρο στους 37 ο C. Εάν δεν υπάρχει η δυνατότητα προθέρμανσης στους 37 ο C, επισημαίνεται ότι το αντιδραστήριο εργασίας θα πρέπει να έχει έρθει τουλάχιστον σε θερμοκρασία δωματίου πριν την έναρξη της επώασης με το τυφλό, άγνωστο και πρότυπο. Μετά την προθέρμανση, σε έναν νέο δοκιμαστικό σωλήνα προστίθεται ο ορός αραιωμένα ή 1:3 ούρα (20 μl). Σε δεύτερο σωλήνα προστίθεται 20 μl προτύπου, ενώ σε τρίτο δοκιμαστικό σωλήνα 20 μl νερού. Και στους τρεις σωλήνες προστίθεται αμέσως μετά 1 ml από το προθερμασμένο αντιδραστήριο εργασίας. Οι σωλήνες πωματίζονται και ακολουθεί ανάμιξη. Οι τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες επωάζονται σε υδρόλουτρο στους 37 ο C. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Σύμφωνα με τη σύσταση του κατασκευαστή του kit, η καταγραφή της απορρόφησης πρέπει να γίνει σε 5 min μετά την έναρξη της αντίδρασης. Στον κατάλληλο χρόνο οι σωλήνες αποσύρονται από το υδρόλουτρο, επανέρχονται σε θερμοκρασία δωματίου και φωτομετράται το περιεχόμενο τους στα 650 nm. Για το μηδενισμό του φωτόμετρου χρησιμοποιείται νερό. Οι τιμές της απορρόφησης που μετρούνται καταγράφονται. Είναι σημαντικό η μέτρηση της απορρόφησης για το τυφλό, πρότυπο και δείγμα να γίνει στο ίδιο μήκος κύματος και χρησιμοποιώντας κυψελίδα με ίδιο μήκος διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του αγνώστου γίνεται στη συνέχεια σύμφωνα με την Eξίσωση

112 Φωτογραφία 4.9 Πρωτόκολλο τελικού σημείου προσδιορισμού Ca ++ σε ορό και ούρα με χρωματομετρική μέθοδο. 111

113 Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Για την κατανόηση της σχετικής με την οξεοβασική ισορροπία φυσιολογίας παρακολουθήστε τα animations στις ιστοσελίδες: (τελευταία προσπέλαση 5/2015). (τελευταία προσπέλαση 5/2015). gas_exchange_ during_respiration.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για την κατανόηση της φυσιολογίας σχετικά με την ηλεκτρολυτική ισορροπία και την ισορροπία των υγρών του σώματος παρακολουθήστε τα animations: hormonal_com munication.html Για την κατανόηση του σκεπτικού της ερμηνείας των τιμών μίας ανάλυσης αερίων στα πλαίσια της διάγνωσης της οξεοβασικής διαταραχής παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για πρόσβαση σε υπολογιστική μηχανή για την εκτίμηση του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής ακολουθήστε έναν από τους παρακάτω συνδέσμους: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). δέχεται μόνο ακέραιες τιμές για όλες τις παραμέτρους, πέραν του ph (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). δέχεται μόνο ακέραιες τιμές για όλες τις παραμέτρους, πέραν του ph (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη παρακλίνιου, φορητού αναλυτή αερίων παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη εργαστηριακού αναλυτή αερίων παρακολουθήστε τo βίντεο στην ιστοσελίδα: system.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη της αρχής λειτουργίας της παλμικής οξυμετρίας και της χρήσης του παλμικού οξύμετρου παρακολουθήστε το βίντεο στην ιστοσελίδα: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη δειγματοληψίας αρτηριακού ή τριχοειδούς αίματος παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες: για δειγματοληψία αρτηριακού αίματος (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). για δειγματοληψία τριχοειδούς αίματος (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη της αρχής λειτουργίας της φασματοσκοπίας ατομικής απορροφησης και της σχετικής πειραματικής διαδικασίας ανάλυσης παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 5/2015). Για επίδειξη της αρχής λειτουργίας της φλογοφωτομετρίας με φλογοφωτόμετρο παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη του πειραματικού προσδιορισμού της ωσμωτικότητας με ωσμώμετρο παρακολουθήστε το βίντεο στην ιστοσελίδα: 112

114 oint_thermodynamics (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για επίδειξη του πειραματικού προσδιορισμού του ειδικού βάρους των ούρων με εμβαπτιζόμενες ταινίες παρακολουθήστε το βίντεο στην ιστοσελίδα: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Για πρόσβαση σε υπολογιστική μηχανή για τον υπολογισμό του συντελεστή γραμμικής συσχέτισης του Pearson ακολουθήστε έναν από τους παρακάτω συνδέσμους: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Φωτογραφία system.html (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Φωτογραφία 4.3 Abbott, (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015), Heska, (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). ITC. (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Αναφορές 1. ΓΙΑΜΠΙΔΟΥ, Α., ΜΥΡΙΑΝΘΕΥΣ, Π., ΜΠΑΛΤΟΠΟΥΛΟΣ, Γ. (2010) Ερμηνεία Αερίων Αρτηριακού Αίματος: Διαταραχές Οξεοβασικής Ισορροπίας. Αθήνα: Συχνές Ερωτήσεις στην Πνευμονολογία, Περιοδικές εκδόσεις της Ελληνικής Πνευμονολογικής Εταιρείας. Διαθέσιμο στο: 2. ΤΙΤΟΠΟΥΛΟΣ, Η. (2001) Κλινική Ερμηνεία των Αερίων Αρτηριακού Αίματος. Η Ιατρική Σήμερα, 36, p Διαθέσιμο στο: 3. ΦΥΤΟΥ-ΠΑΛΛΗΚΑΡΗ, Α. (2005) Θεωρία Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος. 4. ABELE, E. (1963) The physical background to freezing point osmometry and its medical-biological applications. Am J Med Electronics, 2, p AWASTHI, S., RANI, R., MALVIYA, D. (2013) Peripheral venous blood gas analysis: An alternative to arterial blood gas analysis for initial assessment and resuscitation in emergency and intensive care unit patients. Anesth Essays Res, 7, p BUCHER, L. (2005; pp ) Arterial puncture (Procedure). AACN procedure manual for critical care, Lynn-McHale Wiegand, D.J., Carlson, K. 5th Ed. New York: Churchill Livingstone-Elsevier. 7. BURTIS, A., ASHWOOD, R., BRUNS, E., (2007) Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 5th Ed. New York: Churchill Livingstone-Elsevier. 8. CHIN, D., LINDER, V., SIA, S.K. (2012) Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip, 12, p COGAN, G. (1991) Fluid & Electrolytes: Physiology & Pathophysiology. Norwalk: Appleton & Lange. 10. CRISTALLI, C. & MANZONI, A. (2000; pp. A1-A11) Basics of Blood Gas Instrumentation. In: The Biomedical Engineering Handbook: 2 nd Ed., Bronzino, J. D (ed). New York: CRC Press LLC. 11. DELOST, M. (2014; pp ). Blood Gas and Critical Care Analyte Analysis. In: Equipment for Respiratory Care, Volsko T.A., Chatburn, R.L., and El-Khatib, M.F. (ed.). New York: J&B Learning, Burlington. 12. DREES, C. & WU, B. (2009; pp ) Analytical Techniques, In: Clinical Chemistry: Techniques, Principles, Correlations (6th Ed.). Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA. 113

115 13. FOXALL, F. (2008) Arterial Blood Gas Analysis: An Easy Learning Guide. New York: M&K Update Ltd. 14. GAW, A., MURPHY, J., SRIVASTAVA, R., COWAN, A., O'REILLY, J. (2013) Clinical Biochemistry: An Illustrated Colour Text. 5 th Ed. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA. 15. HAWS, J. & HAWS, S. (2015) Fluids, Electrolytes and Acid-Base Balance: a Guide for Nurses. 1 st Ed. Charleston: CreateSpace. 16. HENNESSEY, M. & JAPP, G. (2007) Arterial Blood Gases Made Easy. 1 st Ed. New York: Churchill Livingstone-Elsevier. 17. HIGGINS, C. (2008) Capillary-blood gases: To arterialize or not. MLO Online. p HINWOOD, G. (2001) A Textbook of Science for the Health Professions. 4 th Ed., Nelson Thornes Ltd, Cheltenham. 19. KEE, L., PAULANKA, J., PURNELL, D. (2004) Fluids and Electrolytes with Clinical Applications: A Programmed Approach. 7th Ed. New York: Delmar Learning. 20. LIPPINCOTT, W. (2005) Just the facts: Fluids and Electrolytes. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA. 21. LIPPINCOTT, W. (2007) Straight A's in Fluids and Electrolytes. Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA. 22. LIPPINCOTT, W. (2011) Fluid & Electrolytes Made Incredibly Easy, 5 th Ed. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA. 23. LOBO, N., LEWINGTON, P., ΕLLISON, P. (2013) Basic Concepts of Fluid and Electrolyte Therapy. Melsungen: Bibliomed. Διαθέσιμο στο: LORD, R. (1999) Osmosis, osmometry, and osmoregulation. Postgrad Med J, 75, p METHENY, N. (2011) Fluid and Electrolyte Balance: Nursing Considerations. 5 th Ed. Sudbury: Jones & Bartlett Publishers. 26. MILIONIS, J., LIAMIS, L., ELISAF, S. (2002) Clinical diagnostic algorithm for hyponatremia Can Med Assoc J, 166, p PAPADEA, C., FOSTER, J., GRANT, S., BALLARD S.A., CATE J.C., SOUTHGATE, W.M., PUROHIT, D.M. (2002) Evaluation of the i-stat Portable Clinical Analyzer for Point-of-Care Blood Testing in the Intensive Care Units of a University Children s Hospital. Ann Clin Lab Sci, 32, p STRASINGER, K. & SCHAUB DI LORENZO (2014) Urinalysis and Body Fluids. 6 th Ed. Philadelphia: FA Davis Company. 29. TOFTEGAARD, M., REES, E. et al. (2009) Evaluation of a method for converting venous values of acid base and oxygenation status to arterial values. Emerg. Med. J, 26, p VERMA, B. & ROACH, P. (2010) The interpretation of arterial blood gases. Aust Prescr, 33, p WEINSTEIN, S. (2007) Plumer's Principles and Practice of Intravenous Therapy, 8 th Ed. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA. 32. WHO (2010) WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. Geneva: WHO. 33. ZAOUTIS, B. & CHIANG, W. (2007) Comprehensive Pediatric Hospital Medicine. Philadelphia: Mosby Inc. 114

116 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό επιχειρείται μια εισαγωγή στις περισσότερο χρησιμοποιούμενες μεθόδους ηλεκτροφόρησης στη κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική. Οι τεχνικές ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για το διαχωρισμό μακρομορίων, όπως οι πρωτεΐνες, οι λιποπρωτεΐνες, τα ένζυμα και τα ισοένζυμά τους κ.α. και στη συνέχεια για τον υπολογισμό των επιμέρους κλασμάτων με σκοπό την άμεση ή έμμεση διάγνωση νοσολογικών καταστάσεων. Περιγράφονται αναλυτικά αρκετές βασικές τεχνικές ηλεκτροφόρησης, αλλά γίνεται αναφορά και σε πιο εξειδικευμένες και σύγχρονες τεχνικές, όπως η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση. Τέλος, επισημαίνεται η χρησιμότητα των τεχνικών αυτών στην κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική. Προαπαιτούμενες γνώσεις Το πέμπτο κεφάλαιο του βιβλίου βασίζεται σε βασικές γνώσεις βιοχημείας και κλινικής χημείας. Θα χρειαστούν βασικές γνώσεις όσον αφορά τα βιολογικά μακρομόρια. 5.1 Η ηλεκτροφόρηση ως βασική μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μία τεχνική διαχωρισμού και εν συνεχεία προσδιορισμού μίγματος ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους, όπως π.χ. πρωτεϊνών, λιποπρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA), ενζύμων και ισοενζύμων ή μορίων με μικρότερο μοριακό βάρος, όπως πεπτίδια ή ακόμη και μίγματος ουσιών με μικρό μοριακό βάρος, όπως π.χ. αμινοξέα, βάσεις κ.α. Εφαρμόζεται ακόμη και σε περιπτώσεις κυττάρων. Με λίγα λόγια μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιαδήποτε δείγμα περιέχει χημικές ενώσεις που φέρουν φορτίο. Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται (Καρκαλούσος, 2012): Α) για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό μορίων ποικίλου μοριακού βάρους ενός μίγματος, Β) για τον προσδιορισμό μοριακού βάρους, Γ) για τον προσδιορισμό της καθαρότητας ενός δείγματος, Δ) για την απομόνωση, τον καθαρισμό και χαρακτηρισμό ουσιών, π.χ. πρωτεϊνών, κ.α. Η ηλεκτροφόρηση βρίσκει εφαρμογές στην βιοχημεία και κλινική χημεία, στην μοριακή βιολογία, στην φαρμακολογία και τοξικολογία, στην εγκληματολογία και άλλες επιστήμες. Η ηλεκτροφόρηση είναι απλή, φθηνή και εύκολα εφαρμόσιμη τεχνική, θεμελιώδες εργαλείο στην μοριακή βιολογία και στην εργαστηριακή διαγνωστική ιατρική. 5.2 Οι βασικές αρχές της Ηλεκτροφόρησης Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μια μέθοδο διαχωρισμού (Σχήμα 5.1), κατά την οποία φορτισμένα μόρια (π.χ. πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα) μετακινούνται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου στο εσωτερικό πηκτών ή διαλυμάτων. Διαφορετικά μόρια κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες και τα συστατικά ενός μίγματος διαχωρίζονται εάν βρεθούν μέσα σε κατάλληλο ηλεκτρικό πεδίο. 115

117 Ηλεκτροφόρηση αμινοξέων επί χάρτου Άνοδος Κάθοδος Animation 5.1 H διαδικασία της ηλεκτροφόρησης. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των φορτισμένων μορίων εξαρτάται κυρίως από (Λιανίδου, 2015; Νταλαμάγκα, 2015): Το καθαρό φορτίο: αρνητικά φορτισμένα μόρια (ανιόντα) μετακινούνται προς την άνοδο (+), ενώ θετικά φορτισμένα μόρια (κατιόντα) μετακινούνται προς την κάθοδο (-). Τα μόρια που φέρουν υψηλό σθένος μετακινούνται γρηγορότερα προς το ηλεκτρόδιο με το αντίθετο φορτίο από μόρια με μικρότερο σθένος. Το μέγεθος: η αντίσταση (λόγω της τριβής) που υφίστανται τα μόρια που κινούνται μέσα σε ένα διάλυμα ή μία πηκτή, έχει ως συνέπεια τα μικρά μόρια να κινούνται γρηγορότερα από τα μεγάλα. Το σχήμα: η τριβή επηρεάζεται από το σχήμα του μορίου, με αποτέλεσμα η κινητικότητα να είναι διαφορετική ανάμεσα σε σφαιρικές και ινώδεις πρωτεΐνες ή ανάμεσα σε γραμμικό και κυκλικό DNA. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου: όσο αυξάνεται η τάση του πεδίου, τόσο αυξάνεται και η κινητικότητα. Όμως, υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί στη χρήση υψηλής τάσης, έτσι ώστε να μην αναπτυχθούν θερμικά φαινόμενα Παράγοντες που επηρεάζουν την τεχνική της Ηλεκτροφόρησης Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την τεχνική της ηλεκτροφόρησης (Πίνακας 5.1) είναι: το ph, η ιοντική ισχύς, η ιοντική σύσταση, η ένταση, η θερμοκρασία, ο χρόνος και το υπόστρωμα. Παράγοντες ph Ιοντική ισχύς Ιοντική σύσταση Ένταση Θερμοκρασία Χρόνος Υπόστρωμα Επίδραση Τροποποίηση φορτίου πρωτεϊνών και αποτελεσματικής κίνησης. Σπάνια επηρεάζει τη δομή και οδηγεί σε μετουσίωση. Τροποποίηση ισχύος και έντασης. Με την αύξηση της ιοντικής ισχύος μειώνεται η κινητικότητα και αυξάνεται η έκλυση θερμότητας. Κινητικότητα μορίων Κατά κανόνα η κινητικότητα είναι ανάλογη της έντασης. Προκαλεί εκτροπή των κλασμάτων. Η υψηλή θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει μετουσίωση των πρωτεϊνών, ενώ η χαμηλή θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει διήθηση, αλλά δεν μεταβάλει τον διαχωρισμό. Ο διαχωρισμός αυξάνει με το χρόνο, αλλά παρατηρείται διήθηση των κλασμάτων. Το μέγεθος των πόρων επηρεάζει την ταχύτητα της κινητικότητας των συστατικών Πίνακας 5.1 Παράγοντες που επηρεάζουν την ηλεκτροφόρηση. 116

118 Animation 5.2 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών με βάση το μοριακό βάρος Τα Υποστρώματα της Ηλεκτροφόρησης Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση είναι αδρανή υλικά και μπορούν να είναι επίπεδα, κυλινδρικά ή σε μορφή σφαιριδίων (πηκτή με πόρους). Στην περίπτωση των επίπεδων πηκτών επιτυγχάνεται η εισαγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων δείγματος, ενώ οι κυλινδρικές πηκτές εμφανίζουν μεγαλύτερη ευαισθησία. Ως υπόστρωμα μπορεί να χρησιμοποιηθούν τα παρακάτω: πηκτή αγαρόζης, πηκτή αμύλου, πηκτή πολυακρυλαμιδίου, οξική κυτταρίνη, διηθητικό χαρτί ή χαρτί Whatman. Πηκτή αγαρόζης Είναι διαυγής και επιτρέπει την μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των ζωνών. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και DNA (Πίνακας 5.4). Το άγαρ είναι πολυσακχαρίτης (σύσταση: όξινη καρραγενάση και ουδέτερη αγαρόζη [D-γαλακτόζη και 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζη]). Πηκτές αγαρόζης σε μορφή σφαιριδίων, συγκέντρωσης 2-10%, ονομάζονται Sepharose (Pharmacia, LKB, π.χ. Sepharose 4B είναι πηκτή 4% σε αγαρόζη) και διατίθενται σε διάφορες ενεργοποιημένες μορφές. Πηκτή αμύλου Χρησιμοποιείται για την ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. Το άμυλο είναι πολυσακχαρίτης και βρίσκεται σε μορφή μίγματος διαλυτής αμυλόζης (20%) και αδιάλυτης αμυλοπηκτίνης (80%). Μερική υδρόλυση της αμυλοπηκτίνης οδηγεί σε μίγμα ολιγοσακχαριτών, τις δεξτρίνες. Οι δεξτρίνες με επιχλωροϋδρίνη (C 3H 5OCl) παρέχουν το υλικό Sephadex (εμπορική ονομασία), 117

119 το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως ως υλικό πλήρωσης χρωματογραφικών στηλών και ως υλικό ακινητοποίησης (ηλεκτροφόρηση), μετά την ενεργοποίηση του με BrCN. Πηκτή πολυακρυλαμιδίου Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων (Πίνακας 5.4). Συνθετικά πολυμερή, όπως τα συμπολυμερή διαφόρων υδρόφιλων ακρυλικών μονομερών (ακρυλικού οξέος, ακρυλαμιδίου, μεθακρυλικού οξέος) χρησιμοποιούνται ως υλικά ακινητοποίησης, π.χ. παράγωγα του πολυακρυλαμιδίου διατίθενται με διάφορες εμπορικές ονομασίες όπως: 1. Bio-Gel CM (ακρυλαμίδιο/ακρυλικό οξύ), 2. Bio-Gel P (ακρυλαμίδιο/ν,ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο), 3. Enzaryl AA (ακρυλαμίδιο/p-νιτροακρυλαμίδιο/ν,ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο), 4. Enzaryl AH (ακρυλαμίδιο/n-ακρυλοϋλο-ν -t-βουτυλοξυκαρβονυλο-υδραζίνη). Το πήκτωμα του πολυακρυλαμιδίου είναι ουδέτερο, τρισδιάστατο πλέγμα υδρογονανθράκων συνδεδεμένων με μεθυλενομάδες. Προκύπτει από το πολυμερισμό δύο συστατικών: α) των μονομερών ακρυλαμιδίου (MBA) και β) του Ν,Ν1-μεθυλενο-bis-ακρυλαμιδίου (ή απλώς bis), το οποίο παίζει συνεκτικό ρόλο στο πήκτωμα. Η αντίδραση πολυμερισμού γίνεται με την προσθήκη υπερθειϊκού αμμωνίου (ammoniumpersulfate, APS) και του Ν,Ν,Ν1Ν1,-τετραμεθυλεθυλενοδιαμίνης (TEMED) (Σχήμα 5.1). Το μέγεθος των πόρων του πλέγματος που σχηματίζεται κυμαίνεται με βάση τα παρακάτω: Την ολική συγκέντρωση ακρυλαμίδης (%Τ) και ΜΒΑ (%C, crosslinker) και τη σχετική συγκέντρωση της ΜΒΑ ως προς την ακρυλαμίδη. Τα πηκτώματα με μικρή συγκέντρωση πολυακρυλαμίδηςέχουν μεγαλύτερους πόρους και το αντίστροφο. Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιβραδύνουν τη μετανάστευση των πρωτεϊνών περίπου ανάλογα με το λόγο φορτίου προς μάζα. Χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες ηλεκτροφορήσεις (Σχήμα 5.2) εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη και μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε σε συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς αυτή. Οξική κυτταρίνη Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών. Η κυτταρίνη είναι πολυσακχαρίτης και αποτελείται από πλήθος μορίων γλυκόζης συνδεδεμένα με (1,4)-β-γλυκοζιτικούς δεσμούς. Κάθε μόριο γλυκόζης έχει τρία ελεύθερα υδροξύλια. Κατά τη μερική ή ολική νίτρωση (HNO 3/H 2SO 4) ή ακετυλίωση (οξικός ανυδρίτης/h 2SO 4) της κυτταρίνης, λαμβάνονται τα παράγωγα της (τρι-)νιτρικής ή (τρι-)οξικής κυτταρίνης, τα οποία σε μορφή μεμβρανών χρησιμοποιούνται ευρέως για την ακινητοποίηση βιομορίων (ηλεκτροφόρηση) ή ως φράγματα διάχυσης. Διηθητικό χαρτί ή χαρτί Whatman Εμφανίζει φαινόμενα προσρόφησης ουσιών και για το λόγο αυτό δεν χρησιμοποιείται. 118

120 Σχήμα 5.1 Η χημική δομή του πυκτώματος ακριλαμίδης Χρώση κλασμάτων Η χρώση των διαχωρισθέντων κλασμάτων (ζωνών) αποτελεί σημαντικό στάδιο των ηλεκτροφορητικών τεχνικών (Πίνακας 5.2). Η χρώση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ένα στάδιο ή διαδοχικά σε πολλά στάδια, με τη χρήση δύο ή και περισσοτέρων χρωστικών. Οι χρωστικές μπορεί να είναι εξειδικευμένες, όπως π.χ. η νυνιδρίνη για τις αζωτούχες ομάδες των νουκλεϊκών οξέων, πρωτεϊνών, κ.α. Από την άλλη μεριά οι χρωστικές μπορεί να είναι εξειδικευμένες για πρωτεΐνες, γλυκοπρωτεϊνες, λιπίδια κ.α. Για τη χρώση των πρωτεϊνών ορού χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Amidoblack (απορρόφηση στα 640 nm), PonceauS (520 nm), Coomassie Brilliant Blue (595 nm), Bromophenol Blue (600 nm), Nigrosin (540 nm) κ.α. Για το διαχωρισμό ισοενζύμων: ενζυμικές αντιδράσεις με NADH ή NADPH, με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή φορμαζάνης (570 nm). Με τη χρήση της Coomassie Brilliant Blue μπορεί να ανιχνευθεί 1 μg πρωτεΐνης σε συγκεκριμένο κλάσμα. Η χρώση όμως με νιτρικό άργυρο γίνεται 100 φορές πιο ευαίσθητη και μπορεί να ανιχνευτεί 1 ng πρωτεΐνης σε συγκεκριμένο κλάσμα. Για την χρώση και ανίχνευση των λιποπρωτεϊνών χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Oil Red O (520 nm), Sudan Black (600 nm), Sudan Red 7B (540 nm), κ.α. (Μακέδου, 2015). Ειδικά για ραδιοενεργά ιχνηθετημένα δείγματα η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια της αυτοραδιογραφίας. 119

121 Σχήμα 5.2 Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Βιομόρια Περισσότερο χρησιμοποιούμενες Πρωτεΐνες Coomassi ebrilliant BlueR 250 Νιτρικός άργυρος Χρωστικές Λιγότερο χρησιμοποιούμενες Amidoblack PonceauS Bromophenol blue Nigrosin DNA Βρωμιούχο αιθίδιο Bromophenol blue Λιποπρωτεϊνες OilRed Ο SudanBlack Β PeriodicAcid Νιτρικός άργυρος Πίνακας 5.2 Παραδείγματα χρησιμοποιούμενων χρωστικών, ανά κατηγορία βιομορίων Καθήλωση και ανίχνευση των συστατικών μείγματος Για την καθήλωση και την ανίχνευση των συστατικών μείγματος χρησιμοποιούνται είτε άμεσες, είτε έμμεσες μέθοδοι. Έμμεση καθήλωση: στη περίπτωση αυτή χρησιμοποιούνται διάφορες χημικές αντιδράσεις, περισσότερο ή λιγότερο εξειδικευμένες για την ανίχνευση συστατικών, όπως η χρώση πρωτεϊνών και των συστατικών τους, ενζυμικές αντιδράσεις, κ.α. Άμεση καθήλωση: στη περίπτωση αυτή προσδιορίζονται οι φυσικές ιδιότητες των συστατικών και συγκεκριμένα: Α) Προσδιορισμός απορρόφησης στα 280 nm (τρυπτοφάνη, τυροσίνη, φαινυλαλανίνη), στα 220 nm, στα 210 nm, κ.λπ. Τα νουκλεϊκά οξέα απορροφούν πιο έντονα στα 260 nm. Σε περίπτωση που το πρωτεϊνικό δείγμα περιέχει και νουκλεϊκά οξέα, για το προσδιορισμό της πρωτεΐνης χρησιμοποιείται ο παρακάτω τύπος: 120

122 Πρωτεΐνη (mg/ml) = 1,55 A 280 0,76 A 260 (Εξίσωση 5.3) Η μέθοδος αυτή είναι ιδιαίτερα απαραίτητη για πρωτεΐνες στα όρια του 0,5 έως 1,5 mg/ml. Β) Άμεσος προσδιορισμός με φθορισμό. Η μέθοδος είναι χιλιάδες φορές πιο ευαίσθητη από την φασματοφωτομετρία και την χρωματομετρία. Γ) Προσδιορισμός του δείκτη διάθλασης του εκάστοτε συστατικού Πυκνομετρία (densitometry) Η πυκνομετρία αποτελεί μία από τις μεθόδους για την ποσοτική εκτίμηση των συστατικών της ηλεκτροφορητικής τεχνικής (Σχήμα 5.3). Συνήθως τα χρωματισμένα και στεγνά των ηλεκτροφορημάτων των πρωτεϊνών αναλύονται με πυκνομετρική ανάλυση της μεμβράνης ή της πηκτής. Με τη μέθοδο αυτή η ποσότητα κάθε κλάσματος μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της απορρόφησης. Συνεπώς, η συγκέντρωση του κάθε κλάσματος πρέπει να είναι ευθέως ανάλογη της απορρόφησης. Σχήμα 5.3 Διαγραμματική απεικόνιση λειτουργίας πυκνόμετρου Εργαστηριακά όργανα και σκεύη Ηλεκτροφόρησης Για τις περισσότερες τεχνικές ηλεκτροφόρησης απαιτούνται τα παρακάτω όργανα και σκεύη (Kaplan et al., 2003 Δημητριάδης, 2015): τροφοδοτικό, λουτρό ηλεκτροφόρησης, ηλεκτρόδια, υπόστρωμα, διηθητικό χαρτί (Watmann), διαλύτες, 121

123 απορρυπαντικά μετουσίωσης πρωτεϊνών (SDS, Urea. LithiumDodecylSulfate, BRij 35, CHAPSO, κ.α.) χτενάκια (Applicator - για την εναπόθεση του δείγματος, συνήθως 1-10 μl, παράλληλα με το δείγμα φορτώνεται μάρτυρας και πρότυπο), λουτρό χρωματισμού και αποχρωματισμού σταθεροποίησης, επιφανειακά ηλεκτρόδια, υπολογιστής, ph-μετρο, ρυθμιστές θερμοκρασίας, δείκτες ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, δείκτες για πρότυπα και μάρτυρες Το βιολογικό δείγμα Στις τεχνικές ηλεκτροφόρησης μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλά και διαφορετικά δείγματα ποικίλης προέλευσης, π.χ. ορός, εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ούρα. Επίσης πλάσμα, πλευριτικό υγρό, αλλά και βιοψίες από ιστούς, σπανίως και ομάδες κυττάρων. Ανάλογα με την τεχνική ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιείται και την συγκέντρωση πρωτεϊνών του δείγματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί φυσικό ή προκαταβολικά επεξεργασμένο βιολογικό δείγμα Διαχωριστική ικανότητα - τεχνικές ηλεκτροφόρησης Η διαχωριστική ικανότητα είναι η δυνατότητα της μεθόδου να διαχωρίσει το μίγμα ουσιών σε όσο το δυνατόν περισσότερα κλάσματα. Τα είδη των τεχνικών ηλεκτροφόρησης διακρίνονται με βάση την διαχωριστική τους ικανότητα, η οποία είναι συνάρτηση των παρακάτω παραγόντων: υποστρώματος, ph του διαλύματος, έντασης και της ισχύος, θερμοκρασίας στο δοχείο ηλεκτροφόρησης, τρόπου χρώσης εμφάνισης των κλασμάτων (ζωνών) και του προσδιορισμού τους, κινητικότητα των ουσιών του μίγματος, κ.α. Κατά την εφαρμογή του ηλεκτρικού πεδίου τα λιγότερα ευκίνητα ιόντα ακολουθούν τα περισσότερο ευκίνητα και για το λόγο αυτό, για τα λιγότερο ευκίνητα εφαρμόζεται πιο μεγάλη ισχύς. Ειδικά οι πρωτεΐνες έχουν μέση κινητική ικανότητα, δηλαδήενδιάμεση μεταξύ των πιο ευκίνητων και των λιγότερο ευκίνητων ιόντων και για αυτό τον λόγο ο διαχωρισμός τους εξαρτάται από τη συγκέντρωση και το φορτίο Ταξινόμηση τεχνικών Ηλεκτροφόρησης Η ταξινόμηση των τεχνικών ηλεκτροφόρησης πραγματοποιείται με ποικίλα κριτήρια, όπως το είδος του υποστρώματος, τη διάταξη της πηκτής, το σχήμα της πηκτής, την ποσότητα του δείγματος, τις συνθήκες στις οποίες πραγματοποιείται η τεχνική, κ.α. (Πίνακας 5.3). Κριτήριο ταξινόμησης Είδος ηλεκτροφόρησης Είδος υποστρώματος Χάρτου Οξικής κυτταρίνης Αγαρόζης Πολυακρυλαμίδη ς Διάταξη πηκτής Οριζόντια Κατακόρυφη Σχήμα πηκτής Επίπεδη Κυλινδρική Συνθήκες τεχνικής Μη Αποδιατακτικ αποδιατακτική ή Ποσότητα δείγματος Παρασκευαστική Αναλυτική Πηκτής αμύλου Οι κυριότερες τεχνικές ηλεκτροφόρησης είναι: Πίνακας 5.3 Είδη τεχνικών ηλεκτροφόρησης. 122

124 ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου, τριχοειδής ηλεκτροφόρηση, δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, ισοηλεκτρική εστίαση. Στον Πίνακα 5.4. παρουσιάζονται τα βασικά είδη τεχνικών ηλεκτροφόρησης και τα μόρια ή κλάσματα που κατά κανόνα διαχωρίζονται με αυτές. Είδος ηλεκτροφόρησης Διαχωρισμός Μορίων ή Κλασμάτων Πηκτής αγαρόζης Πρωτεΐνες ορού Ισοένζυμα (π.χ. LDH, ALP, CK, αιμοσφαιρινών, κ.α.) Πηκτής πολυακρυλαμιδίου Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Ισοηλεκτρική εστίαση Λιποπρωτεΐνες Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA) Πρωτεΐνες ορού Ισοενζύμα Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA) Πρωτεΐνες, Σάκχαρα Φαρμακευτικές Πεπτίδια Ουσίες Πρωτεΐνες Πρωτεΐνες Πίνακας 5.4 Είδη βασικών τεχνικών ηλεκτροφόρησης και διαχωρισμός μορίων/κλασμάτων. Νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA), ολιγονουκλεοτιδίωνκαι Αλληλούχιση DNA Παρακάτω, παρουσιάζονται ορισμένα μόνο χαρακτηριστικά που αφορούν κάποιες από τις τεχνικές ηλεκτροφόρησης. 5.3 Τα χαρακτηριστικά ορισμένων τεχνικών Hλεκτροφόρησης Ηλεκτροφόρηση σε Oξική Κυτταρίνη και Nιτρική Kυτταρίνη Τα υλικά αυτά επιτρέπουν την ανάλυση πολύ μικρών δειγμάτων. Η χρώση του ηλεκτροφορήματος, όταν πρόκειται για χρώση πρωτεϊνών πάνω σε οξική κυτταρίνη, γίνεται συνήθως με PonceauS. Πλεονεκτήματα της ηλεκτροφόρησης σε κυτταρίνη (σε σχέση με το χαρτί) αποτελούν: η μεγαλύτερη ευαισθησία της μεθόδου, ο πιο ευδιάκριτος διαχωρισμός των ζωνών, η μικρότερη προσρόφηση των πρωτεϊνών, η μικρή παρατήρηση «ουράς» σε κάθε επιμέρους κλάσματος, κ.α Ηλεκτροφόρηση πηκτής Αγαρόζης Η αγαρόζη είναι ουδέτερος, καθαρός πολυσακχαρίτης και χρησιμεύει για το διαχωρισμό σχεδόν όλων των βιολογικών μακρομορίων με συγκεκριμένο ηλεκτρικό φορτίο. Υπάρχουν εξειδικευμένοι τύποι αγαρόζης, π.χ. για την ανοσοηλεκτροφόρηση ή για την παρασκευή στο εργαστήριο πηκτών, οι οποίες επιτρέπουν τον διαχωρισμό συστατικών στη βάση της διάχυσης και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των βιομορίων. Η αγαρόζη διαλύεται σε υδατόλουτρο και παραμένει υγρή σε θερμοκρασία έως 40 ο C. Ο χρωματισμός και ο αποχρωματισμός είναι εύκολες διαδικασίες. Το μέγεθος των πόρων και ο μοριακός ηθμός εξαρτώνται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις εξασφαλίζεται μικρότερο μέγεθος πόρων. 123

125 Η συγκέντρωση της αγαρόζης κυμαίνεται συνήθως από 0,4 έως 4% (w/v). Το πάχος της πηκτής κυμαίνεται από 0,1 έως 5 mm. Το μέγεθος των πόρων συγκριτικά με την ακρυλαμίδη, είναι μεγαλύτερο. Το τελευταίο καθιστά την αγαρόζη περισσότερο χρήσιμη σε ανοσοηλεκτροφορητικές τεχνικές. Η διαύγεια της πηκτής μπορεί να βελτιωθεί με ξέπλυμα αυτής με 15% γλυκερόλης. Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για το διαχωρισμό πρωτεϊνών μεγάλου μοριακού βάρους, πρωτεϊνικών συμπλόκων και νουκλεϊκών οξέων ( βάσεων). Σήμερα χρησιμοποιούνται παραλλαγές της συγκεκριμένης ηλεκτροφόρησης, με σκοπό την αύξηση της διαχωριστικής της ικανότητας. Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα αγαρόζης αποτελούν: η ανοσοηλεκτροφόρηση, η ανοσοηλεκτροφόρηση τύπου ρουκέτας ή ζώνης, η ανοσοηλεκτροφόρηση πολλαπλών πηκτών, η δισδιάστατη διασταυρούμενη ανοσοηλεκτροφόρηση με ενδιάμεσες πηκτές, η ανοσοπροσήλωση και η ηλεκτροφόρηση αγχιστείας. Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού νουκλεϊκών οξέων με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα αγαρόζης αποτελούν: η ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου και η ηλεκτροφόρηση comet Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aκρυλαμιδίου Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιβραδύνουν τη μετανάστευση των πρωτεϊνών περίπου ανάλογα με το λόγο φορτίου προς μάζα. Χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες ηλεκτροφορήσεις, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη και μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε σε συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς αυτή. Το μέσο μέγεθος της πηκτής ακρυλαμιδίου με συγκέντρωση από 5 έως 10% είναι αποτελεσματικό για διαχωρισμό πρωτεϊνών από έως Da (ή σύμφωνα με άλλους επιστήμονες από έως Da) και νουκλεοτιδίων από 5 έως βάσεις (Αντωνέλλου & Παπασιδέρη, 2015). Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα πολυακρυλαμιδίου αποτελούν: η ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες παρουσία SDS (SDSPAGE), η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF), η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (2D). Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού νουκλεϊκών οξέων με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα πολυακρυλαμιδίου αποτελούν (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001): η ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση σε παρασκευαστικά πηκτώματα κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου αλληλουχία (sequencing) κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες, η ηλεκτροφόρηση κάτω από διαβαθμισμένη συγκέντρωση μετουσιωτικού παράγοντα (DGGE), η ηλεκτροφόρηση διαβαθμισμένης θερμοκρασίας (TGGE), η ηλεκτροφόρηση μονόκλωνου DNA κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες. Τεχνική SSCPA. 124

126 5.3.4 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aμύλου Το άμυλο σπάνια χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα. Διαθέτει μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από την αγαρόζη, αλλά η προετοιμασία της πηκτής είναι δύσκολη. Χρησιμοποιείται συνήθως σε παρασκευαστική ηλεκτροφόρηση. 5.4 H Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (Σχήμα 5.4) αποτελεί μια μοντέρνα τεχνική διαχωρισμού και ανάλυσης. Βασικά χαρακτηριστικά της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης είναι (Hu, 1996): 1. ο διαχωρισμός των μορίων πραγματοποιείται με κίνηση διαμέσου τριχοειδούς σωλήνα (περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα), 2. η μετακίνηση εξαρτάται από το φορτίο και το μοριακό βάρος, 3. η μικρή εσωτερική διάμετρος του τριχοειδούς σωλήνα (30-70 mm), 4. χαρακτηριστικό της τεχνικής αποτελεί η υψηλή τάση (10-30 kv), το ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο ( V/cm) σε σχετικά λίγα Ampere (0-300 ma) και ισχύς (0,6W), 5. η ευαισθησία της τεχνικής αυξάνει, είτε με την αύξηση της εσωτερικής διαμέτρου του τριχοειδούς σωλήνα αποκλειστικά στη θέση της ανίχνευσης, είτε με την χρήση μεμβράνης στην αρχή του σωλήνα, με σκοπό την έκλουση συστατικών που παρεμποδίζουν την ανάλυση, 6. η ταχύτητα διαχωρισμού των συστατικών μπορεί να επιτευχθεί σε λεπτά και σε ορισμένες περιπτώσεις σε πιο μεγάλο χρονικό διάστημα, 7. ο τριχοειδής σωλήνας μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου μετά το πέρας της τεχνικής, μετά από διαδικασία αναγέννησης, 8. η ανίχνευση μέσω κατάλληλου ανιχνευτεί μπορεί να πραγματοποιηθεί α) με UV-VIS ανίχνευση, β) με συνδυασμό UV Laser γ) φθορισμομετρικά, δ) με έμμεση UV φθορισμομετρία - αμπερομετρία, ε) με αμπερομετρία, στ) φασματοφωτομετρία μάζας, κ.α., 9. ορισμένοι από τους ανιχνευτές μπορούν να ανιχνεύσουν μάζες από 10-5 έως mol, 10. ο συνδυασμός της συγκεκριμένης τεχνικής με άλλες, όπως η HPLC, GC, MS, PCR, κ.α., 11. τα διαχωρισθέντα συστατικά προσδιορίζονται μέσω ανιχνευτή και καταγράφονται με μορφή κορυφών. Κάθε ουσία που διέρχεται από τον ανιχνευτή καταγράφεται σε διάγραμμα με μορφή κορυφής απορρόφησης και κατ αυτό τον τρόπο στο τέλος λαμβάνεται διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου. Βασικά πλεονεκτήματα της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης αποτελούν: η μικρή απαιτούμενη ποσότητα δείγματος (από 1 έως 50 nl), η μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, η μικρή κατανάλωση διαλυτών, η ανάλυση διάφορων βιολογικών υγρών (αίμα, ορός, πλάσμα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, πλευριτικό υγρό, δείγματα βιοψιών κ.α.), η εισαγωγή του δείγματος στην ηλεκτροφόρηση χωρίς προαπαιτούμενη επεξεργασία, η υψηλή αναλυτική ικανότητα επαναληψιμότητα και ακρίβεια, η δυνατότητα άμεσης λήψης ποσοτικών αποτελεσμάτων και η αυτοματοποίηση της τεχνικής. Η οργανολογία της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης περιλαμβάνει: μία γεννήτρια υψηλής διαφοράς δυναμικού, δύο ηλεκτρόδια, δύο ρεζερβουάρ ρυθμιστικών διαλυμάτων, τριχοειδή σωλήνα και έναν ανιχνευτή. 125

127 Σχήμα 5.4 Αναπαράσταση οργανολογίας τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. Σήμερα χρησιμοποιούνται διάφορα επιμέρους είδη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (Πίνακας 5.5). Είδη Τριχοειδούς Ηλεκτροφόρησης Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζώνης Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση πηκτής Τριχοειδής ισοταχοφόρηση Μικκυλιακή ηλεκτροκινητική τριχοειδής χρωματογραφία Τριχοειδής ηλεκτροχρωματογραφία Τριχοειδής ισοηλεκτρική εστίαση Διαχωρισμός Ουσιών Στηρίζεται στις διαφορετικές ταχύτητες μετακίνησης των ιόντων στο ρυθμιστικό διάλυμα, που οφείλονται στις διαφορετικές ηλεκτροφορητικές κινητικότητες των διαλυτών και συστατικών. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό ιόντων, πεπτιδίων, ορμονών, πρωτεϊνών κ.α. Στηρίζεται στο μέγεθος διαλυτών συστατικών καθώς μετακινούνται μέσα από τους πόρους της πηκτής (μοριακός ηθμός). Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό κυρίως υδατανθράκων, πρωτεϊνών, λιπιδίων, απο-λιποπρωτεϊνών, ορμονών, προϊόντων DNA, κ.α. Μηδενική ηλεκτροωσμωτική ροή - EOF (κίνηση διαλύτη μαζί με διαλυμένες σε αυτόν ουσίες, και κατεύθυνση αντίθετη από αυτή του ηλεκτρικού ρεύματος). Αρχή κινητού ορίου (moving boundary). Χρησιμοποιείται για ανάλυση μικρών μορίων, βιταμινών, ορμονών και πεπτιδίων. Στηρίζεται στη κατανομή διαλυτών συστατικών μεταξύ της μικκυλιακής φάσης και της διαλυτής φάσης. Χρησιμοποιείται για ανάλυση φαρμάκων, μεταβολιτών, προϊόντων DNA, κ.α. Στηρίζεται στη βάση των διαφορετικών χρωματογραφικών ιδιοτήτων (πολικότητα ή λιποφιλικότητα του αναλύτη) και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας Με βάση τα ισοηλεκτρικά τους σημεία. Χρησιμοποιείται για διαχωρισμό πρωτεινών, πεπτιδίων, κ.α. Πίνακας 5.5 Είδη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζώνης στηρίζεται στην ηλεκτροφορητική ικανότητα των μορίων και την ηλεκτροοσμωτική ροή. Το φαινόμενο της ηλεκτροοσμωτικής ροής οφείλεται στην φορτισμένη εσωτερική 126

128 επιφάνεια του τριχοειδούς. Ο βαθμός ιονισμού εξαρτάται από το ph του ρυθμιστικού διαλύματος. Το αρνητικά φορτισμένο τοίχωμα του τριχοειδούς έλκει τα θετικά φορτισμένα ιόντα του ρυθμιστικού διαλύματος, δημιουργώντας μια διπλοστοιβάδα φορτισμένων ιόντων. Όταν εφαρμόζεται διαφορά δυναμικού, τα κατιόντα της διπλοστοιβάδας μεταναστεύουν προς την κάθοδο μεταφέροντας μόρια νερού, με αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας ροής ρυθμιστικού διαλύματος προς την κατεύθυνση του αρνητικά φορτισμένου ηλεκτροδίου. Συνεπώς, οτιδήποτε βρίσκεται μέσα στο ρυθμιστικό διάλυμα μετακινείται μέσω ηλεκτροοσμωτικής ροής (Σχήμα 5.5). Σχήμα 5.5 Παραγωγή ηλεκτρο-ωσμωτικής ροής προς την κάθοδο στην ηλεκτροφόρηση τριχοειδών. Στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείγμα τα διάφορα βιολογικά υγρά, κύτταρα, δείγματα βιοψίας, κ.α. Μπορούν να διαχωριστούν πρωτεΐνες, πεπτίδια, αμινοξέα, ένζυμα, ισοένζυμα, αιμοσφαιρίνες, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (βλ. Ενότητα 5.7), γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες, λιποπρωτεΐνες, υδατάνθρακες, ορμόνες, ηλεκτρολύτες, φάρμακα, κ.α. 5.5 Η Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη (ηλεκτροφόρηση ζώνης) Αρχή της μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση είναι μία μέθοδος διαχωρισμού μεγαλομοριακών ουσιών ή και κυττάρων ενός μίγματος. Η ηλεκτροφόρηση στηρίζεται στο γεγονός πως όταν μέσα σε ένα διάλυμα ηλεκτρολύτη βαπτιστούν δύο ηλεκτρόδια και εφαρμοστεί ηλεκτρικό πεδίο, τότε τα φορτισμένα μόρια κινούνται με βάση το φορτίο τους αντίστοιχα προς τον έναν ή τον άλλο πόλο. Οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος Οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος, όπως η αλβουμίνη και οι σφαιρίνες (α 1, α 2, β και γ) μπορούν να προσδιοριστούν με βιοχημικές μεθόδους. Στις πρωτεΐνες του πλάσματος συμπεριλαμβάνεται και το ινοδωγόνο. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού 127

129 Τα πρωτεϊνικά μόρια του ορού με την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος μετακινούνται προς την άνοδο ή την κάθοδο με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με το φορτίο τους (Καρκαλούσος, 2012). Είναι γνωστό πως οι πρωτεΐνες ιονίζονται, όπως και τα αμινοξέα. Ο ιονισμός εξαρτάται από το ph. Οι πρωτεΐνες λόγω των πολλών διαφορετικών ομάδων στις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων ιονίζονται ως κατιόντα και ένα μέρος ως ανιόντα. Δηλαδή, συμπεριφέρονται ως πολυηλεκτρολύτες (πολυϊόντα). Το ph στο οποίο οι πρωτεΐνες δεν φέρουν καθαρό ηλεκτρικό φορτίο ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο και συμβολίζεται με pi. Στη προκειμένη περίπτωση η πρωτεΐνη έχει ολικό φορτίο ίσο με το μηδέν. Όταν το ph του περιβάλλοντος είναι όξινο σε σχέση με το pi της πρωτεΐνης, αυτή φορτίζεται θετικά. Σε μια τέτοια περίπτωση η πρωτεΐνη κινείται προς την κάθοδο. Στην αντίθετη περίπτωση, όταν το ph του περιβάλλοντος είναι βασικό σε σχέση με το pi της πρωτεΐνης, αυτή φορτίζεται αρνητικά. Σε μια τέτοια περίπτωση η πρωτεΐνη κινείται προς την άνοδο. Όταν το ph του περιβάλλοντος είναι ίσο με το pι και συνεπώς το φορτίο της πρωτεΐνης είναι ίσο με το μηδέν, η πρωτεΐνη δεν μετακινείται. Η ταχύτητα (U) με την οποία κινείται ένα πρωτεϊνικό μόριο εξαρτάται: από το φορτίο του, από την ισχύ του ηλεκτρικού πεδίου, από το μέσο διαχωρισμού, από το ΜΒ των κλασμάτων, κ.λπ. Όπως έχουμε περιγράψει υπάρχουν πολλές μέθοδοι ηλεκτροφόρησης, από τις πιο απλές είναι η ηλεκτροφόρηση ζώνης όπου η ηλεκτροφόρηση σταματά στο σημείο που οι πρωτεΐνες σχηματίζουν ξεχωριστές ζώνες. Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης μπορούμε να χρωματίσουμε τα κλάσματα και να τα προσδιορίσουμε ποσοτικά. Η χρώση γίνεται με διάφορες κατάλληλες χρωστικές όπως το Red PonceauS, το κυανούν του Coomassie, το αμιδομέλαν, κ.α., που αντιδρούν με τις βασικές ομάδες των πρωτεϊνών. 5.6 Πειραματικό μέρος Αντιδραστήρια και αναλώσιμα Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού σε μη μετουσιωτικές συνθήκες θα χρησιμοποιηθούν τα παρακάτω αντιδραστήρια και αναλώσιμα: ρυθμιστικό διάλυμα: TEB (0,12 M Tris, 5 mm EDTA, 15 mm βορικό οξύ, ph 8,6), διάλυμα χρωστικής (PonceauS), διάλυμα αποχρωματισμού και σταθεροποίησης, μεμβράνες οξικής κυτταρίνης, διηθητικό χαρτί, αποστειρωμένα γυάλινα πλακάκια, γυάλινοι ράβδοι. Ως αντιδραστήρια μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε επίσης: ρυθμιστικό διάλυμα: 0,05 Μ βαρβιτουρικό ph 8,6, διάλυμα χρώσης: 0,5% w/v PonceauS σε 5% w/v TCA (τριχλωροοξικό οξύ), διάλυμα αποχρωματισμού: 5% v/v CH 3COOH Συσκευές και υλικά Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού θα χρησιμοποιηθούν οι παρακάτω συσκευές: Συσκευή ηλεκτροφόρησης που περιλαμβάνει (Φωτογραφία 5.1): βάση ηλεκτροφόρησης, γέφυρα ηλεκτροφόρησης, αpplicator (χτένα), dispocard Holder, λουτρό ηλεκτροφόρησης, 128

130 τροφοδοτικό, αυτόματες πιπέτες (10 μl ή 20 μl). Φωτογραφία 5.1 Συσκευή ηλεκτροφόρησης(τροφοδοτικό και λουτρό) χάρτου ή οξικής κυτταρίνης Προετοιμασία της διαδικασίας Η προετοιμασία πριν την ηλεκτροφόρηση αποτελεί βασική προϋπόθεση για την επιτυχία της. Συγκεκριμένα απαιτείται η προετοιμασία: του συστήματος, της βάσης της ηλεκτροφόρησης, των μεμβρανών και των δειγμάτων Προετοιμασία του συστήματος Πρώτο βασικό στάδιο αποτελεί η αποσύνδεση του λουτρού από το τροφοδοτικό και το γέμισμα των δύο διαμερισμάτων του με 400 ml ρυθμιστικού διαλύματος (Φωτογραφία 5.2). Φωτογραφία 5.2 Σύστημα ηλεκτροφόρησης. 129

131 Προετοιμασία της βάσης της ηλεκτροφόρησης Δεύτερο σημαντικό στάδιο της προετοιμασίας αποτελεί η προετοιμασία της βάσης της ηλεκτροφόρησης, την οποία γεμίζουμε με 80 ml από το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Στη βάση τοποθετούμε τη γέφυρα της ηλεκτροφόρησης (Φωτογραφία 5.3). Φωτογραφία 5.3 Βάση και γέφυρα ηλεκτροφόρησης Προετοιμασία των μεμβρανών Οι μεμβράνες οξικής κυτταρίνης τοποθετούνται σε μία μικρή λεκάνη με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο πραγματοποιείται η ηλεκτροφόρηση. Αρχικά τοποθετείται στην επιφάνεια του ρυθμιστικού διαλύματος και στη συνέχεια τη βυθίζουμε στο υγρό. Η μεμβράνη παραμένει στο διάλυμα για πέντε λεπτά και στη συνέχεια μεταφέρεται και τοποθετείται μεταξύ δύο διηθητικών φύλλων. Με μία γυάλινη ράβδο απομακρύνουμε τη περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος, χωρίς να στεγνώσει η μεμβράνη, απομακρύνοντας ταυτόχρονα τυχόν φυσαλίδες, που υπάρχουν πάνω σε αυτή. Η μεμβράνη τοποθετείται στη γέφυρα με προσοχή ώστε να είναι τεντωμένη και επίπεδη, ώστε να μην εμποδίζεται η μετακίνηση των δειγμάτων και ο διαχωρισμός των κλασμάτων. Για περισσότερες από μία μεμβράνες χρησιμοποιούνται νέα φύλλα διηθητικού χαρτιού (Φωτογραφία 5.4) Προετοιμασία των δειγμάτων Φωτογραφία 5.4 Μεμβράνη οξικής κυτταρίνης. Τα δείγματα τοποθετούνται στο ονομαζόμενο dispocard, το οποίο έχει προκαταβολικά τοποθετηθεί στη θήκη του. Το dispocard που θα χρησιμοποιήσουμε, ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων προς εξέταση, διαθέτει σε 130

132 κάθε σειρά τέσσερις, έξι ή οκτώ θέσεις δειγμάτων. Με αυτόματη πιπέτα τοποθετούμε την κατάλληλη ποσότητα ορού ασθενούς σε κάθε θέση του dispocard. Οι τύποι των dispocard που μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε είναι: Micro (D8, D6M, D6), semimicro (D4, D4MS, D4M), macro (D2) Τοποθέτηση των δειγμάτων στη μεμβράνη Με τη χρήση του κατάλληλου applicator (χτενάκι) που ταιριάζει στο dispocard παίρνουμε τα δείγματα τοποθετώντας το χτενάκι κάθετα πάνω στο dispocard (Φωτογραφία 5.5). Το χτενάκι τοποθετείται στη συνέχεια κάθετα πάνω στη μεμβράνη για 10 περίπου δευτερόλεπτα, ώστε να πραγματοποιηθεί η μεταφορά των δειγμάτων στην μεμβράνη (το δείγμα προς την κάθοδο). Φωτογραφία 5.5 Dispocard και Applicator (χτενάκι) ηλεκτροφόρησης. Τεχνική ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ορού Τα επιμέρους βήματα έχουν ως εξής (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001): 1. Αφαιρείται το καπάκι του λουτρού. 2. Η γέφυρα μεταφέρεται από τη βάση της ηλεκτροφόρησης μέσα στο λουτρό, έχοντας υπόψη ότι ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών θα γίνει προς την άνοδο. 3. Επιλογή της κατάλληλης τάσης. 4. Τοποθετείται το καπάκι του λουτρού. 5. Τίθεται σε λειτουργία το τροφοδοτικό. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τάση ίση με 0,5 ma/cm για μία ώρα. Όμως οι προτεινόμενες τάσεις με βάση τον τύπο του dispocard, που χρησιμοποιήσαμε έχουν ως εξής: Micro (D8, D6M, D6): 250 Vdc min, Semimicro (D4, D4MS, D4M): Vdc min, Macro (D2): Vdc min. Στο τέλος του χρόνου κλείνουμε το διακόπτη του τροφοδοτικού και αφαιρούμε το καπάκι του λουτρού. Σηκώνουμε τη γέφυρα, διατηρώντας τη μεμβράνη σε οριζόντιο επίπεδο. Απομακρύνουμε τη μεμβράνη από τη γέφυρα και κόβουμε τις προεκτάσεις τους στα σημεία, όπου υπάρχουν διάτρητες γραμμές Χρώση των κλασμάτων 131

133 Γεμίζουμε μία λεκάνη με διάλυμα κατάλληλης χρωστικής (Φωτογραφία 5.6) και βαπτίζουμε τη μεμβράνη για δέκα λεπτά. Η χρωστική συμπλέκεται με τις πρωτεΐνες προσδίδοντας σε αυτές κόκκινο χρώμα. Φωτογραφία 5.6 Χρωστική PonceauS και το διάλυμα αποχρωματισμού Αποχρωματισμός και Διαφανοποίηση της μεμβράνης Σε μία άλλη λεκάνη τοποθετούμε διάλυμα αποχρωματισμού και διαφανοποίησης (Φωτογραφία 5.5). Με μία λαβίδα η μεμβράνη μεταφέρεται από το διάλυμα χρωματισμού στο διάλυμα αποχρωματισμού και διαφανοποίησης. Με τη λαβίδα ή με μία γυάλινη ράβδο αναδεύουμε ελαφρά. Το διάλυμα αντικαθίσταται με νέο έως ότου η μεμβράνη αποχρωματιστεί πλήρως. Μετά το τέλος του αποχρωματισμού παραμένουν χρωματισμένες μόνο οι ζώνες των πρωτεϊνών. Η μεμβράνη τοποθετείται σε γυάλινο αποστειρωμένο πλακάκι, το οποίο τοποθετείται σε κλίβανο θερμοκρασίας ο C για 5-10 λεπτά. Στη συνέχεια η μεμβράνη, εφόσον είναι πλέον στεγνή και ξηρή, μπορεί να φωτομετρηθεί. Η φωτομέτρηση πραγματοποιείται στα 525 nm (εφόσον έχουμε χρησιμοποιήσει χρωστική Red PonceauS) ή στα 620 nm εάν έχει γίνει χρώση με Amidoschwartz Πυκνομετρία (Densitometry) Η πυκνομετρία πραγματοποιείται με ειδικό όργανο (Σχήμα 5.6), το οποίο καταγράφει και απεικονίζει τις ποσότητες των πρωτεϊνικών κλασμάτων με ειδικό γραμμικό διάγραμμα (Φωτογραφία 5.7). Σχήμα 5.6 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη. Ηλεκτρογράφημα υπολογισμός κλασμάτων με τη χρήση πυκνομέτρου (Φωτογραφία 5.7). Το δεξιό διάγραμμα είναι παθολογικό αφού οι γ σφαιρίνες κατέχουν ποσοστό 19% έναντι 18% που είναι το ανώτερο όριο (Πίνακας 5.6). 132

134 Φωτογραφία 5.7 Πυκνόμετρο (Minidensit Densitometer SEAC) Υπολογισμοί Καταγράφουμε τις οπτικές απορροφήσεις και τις προσθέτουμε. Υπολογίζουμε το ποσοστό επί τοις εκατό του κάθε κλάσματος. Εάν με κάποια άλλη μέθοδο προσδιορίσουμε το ολικό ποσό των πρωτεϊνών του ορού, τότε μπορούμε να βρούμε το ποσό του κάθε κλάσματος. Ο υπολογισμός μπορεί να γίνει και με Scanner. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να διαφανοποιήσουμε υποχρεωτικά την μεμβράνη (ταινία) μετά τον χρωματισμό. Με τη βοήθεια του Scanner βρίσκουμε το ποσοστό κάθε κλάσματος που μας δίδεται απ ευθείας από τον καταγραφέα Διαγνωστική αξία των αποτελεσμάτων Κατά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού λαμβάνονται πέντε ταινίες, κάθε μία εκ των οποίων αντιστοιχεί σε μία από τις εξεταζόμενες πρωτεΐνες (Σχήματα 5.7, 5.8): λευκωματίνη (η πιο παχιά και απομακρυσμένη από το σημείο έναρξης του διαχωρισμού), α 1-σφαιρίνη (η δεύτερη κατά σειρά), α 2-σφαιρίνη (η τρίτη κατά σειρά), β-σφαιρίνη (η τέταρτη κατά σειρά), γ-σφαιρίνη (η τελευταία κατά σειρά και η πλησιέστερη στο σημείο έναρξης του διαχωρισμού των κλασμάτων). Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών του ορού βοηθά στην εκτίμηση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων όπως: η απώλεια πρωτεϊνών, οι φλεγμονές, οι γαμμαπάθειες, κ.α. Στον Πίνακα 5.6 δίνονται ενδεικτικά οι φυσιολογικές τιμές πρωτεϊνών ορού (συνίσταται κάθε εργαστήριο να προσδιορίσει το δικό του εύρος τιμών). Πρωτεΐνες Ποσοστό (%) g/l Αλβουμίνες 55,0 69, α1 σφαιρίνη 1,5 4,0 1-3 α2 σφαιρίνη 8,0 13,0 5-8 β σφαιρίνες 7,0 15, γ σφαιρίνες 9,0 18, Πίνακας 5.6 Εκατοστιαία αναλογία πρωτεϊνών. Η διαγνωστική αξία των πρωτεϊνικών κλασμάτων δίνεται για διάφορες παθήσεις στον Πίνακα 5.7. Στον πίνακα προσδιορίζονται οι περιπτώσεις, στις οποίες παρατηρείται αύξηση ή μείωση ενός ή περισσοτέρων κλασμάτων (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001 Devlin, 2009). 133

135 Παθήσεις Πρωτεΐνες Ορού Αλβουμίνη Σφαιρίνες α1 α2 β γ Αποφρακτικός ίκτερος Χρόνιος ηπατικός ίκτερος Κίρρωση του ήπατος Νεφρωσικό σύνδρομο Οξείες λοιμώξεις Χρόνιες λοιμώξεις Παθήσεις κολλαγόνου Οξείς τραυματισμοί Βαρύς διαβήτης Μυέλωμα & μακροσφαιριναιμίες Πίνακας 5.7 Διαγνωστική αξία πρωτεϊνικών κλασμάτων ορού. Σχήμα 5.7 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Πρωτεϊνόγραμμα. Σχήμα 5.8 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Πρωτεϊνόγραμμα ασθενούς με μονοκλωνική γαμμαπάθεια (Monoclonalgammopathy, Multiple Myeloma). 134

136 5.7 Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Γαλακτικής Αφυδρογονάσης (LDH) Η γαλακτική αφυδρογονάση ή γαλακτική δεϋδρογενάση (Lactate Dehydrogenase ή LDH) αποτελεί ένζυμο του κυτταροπλάσματος και καταλύει την μετατροπή του γαλακτικού οξέος σε πυροσταφυλικό οξύ (Σχήμα 5.9). Πυροσταφυλικό Γαλακτικό Σχήμα 5.9 Η καταλυόμενη αντίδραση από την LDH. Το συγκεκριμένο ένζυμο βρίσκεται σε πολλούς ιστούς. Ιδιαίτερα σε μεγάλες συγκεντρώσεις βρίσκεται στο μυοκάρδιο, τους νεφρούς, το ήπαρ και τους σκελετικούς μύες. Σε μικρότερες συγκεντρώσεις απαντά στα ερυθρά αιμοσφαίρια, τους πνεύμονες, τον εγκέφαλο και το πάγκρεας. Στον ορό βρίσκεται σε πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις (τουλάχιστον 500 φορές). Αυτό σημαίνει, πως η αύξηση της LDH στον ορό δεν μπορεί να αποτελεί ειδικό δείκτη βλάβης των κυττάρων, λόγω του ότι βρίσκεται ευρέως κατανεμημένη στον οργανισμό. Συνεπώς, η όποια διαγνωστική αξία της εργαστηριακής διερεύνησης της LDH επιτυγχάνεται με τη διάκριση της ιστικής προέλευσης των ισοενζύμων της και της κλινικής εικόνας του ασθενούς (Φύτου- Παλλικάρη, 2005). Με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης μπορούν να διακριθούν τα πέντε (5) διαφορετικά ισοένζυμα της LDH (Σχήμα 5.10) με βάση τον αριθμό των υπομονάδων Η (Heart) και Μ (Muscle) που περιέχουν. Τα ισοένζυμα της LDH δίνονται στον Πίνακα 5.14 (Koomn & Roehm, 2007). Σχήμα 5.10 Ηλεκτροφορητική ικανότητα (διαχωρισμός) των ισοενζύμων της LDH. Ta αποτελέσματα κρίνονται φυσιολογικά σύμφωνα και με τον Πίνακα

137 σότητες στ Ισοένζυμα LDH Υπομονάδες Τιμές Αναφοράς Όργανο (%) * LDH-1 H Στην καρδ LDH-2 H3M LDH-3 H2M Στους πνεύ LDH-4 HM Στους σκε LDH-5 M Ολική LDH U/L * Οι τιμές αναφοράς σχετίζονται με την μέθοδο ηλεκτροφόρησης οξικής κυτταρίνης. Πίνακας 5.14 Ισοένζυμα-υπομονάδες της γαλακτικής αφυδρογονάσης/όργανο και tιμές aναφοράς. Αύξηση της ολικής LDH με φυσιολογική κατανομή των ισοενζύμων μπορεί να παρατηρηθεί σε έμφραγμα του μυοκαρδίου, χρόνια καρδιακή ανεπάρκεια και ηπατικές νόσους. Στον Πίνακα 5.15 δίνονται ορισμένες από τις μεταβολές, που σχετίζονται με τα ισοένζυμα της LDH και αντίστοιχες παθολογικές καταστάσεις (Loeffler 2007 Gaw et al., 2010). Αύξηση ισοενζύμων LDH Παθολογικές καταστάσεις Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου * Κακοήθης αναιμία, Μεγαλοβλαστική αναιμία LDH-1 ή & LDH-2 Δρεπανοκυτταρική αναιμία Οξεία νέκρωση του φλοιού του νεφρού Πνευμονική εμβολή Διαταραχές του κολλαγόνου Συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια LDH-2, LDH-3 & LDH-4 Καταστροφή αιμοπεταλίων έπειτα από μετάγγιση Λοιμώδης μονοπυρήνωση Λεμφώματα, Λεμφοκυτταρική λευχαιμία Κίρρωση, ηπατίτιδα, Οξεία ηπατική συμφόρηση Τραυματισμός σκελετικών μυών LDH-5 Εγκαύματα, Δερματομυοσίτιδα Νεοπλασίες Κ.Ν.Σ * Σήμερα για τη διάγνωση-παρακολούθηση του οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου χρησιμοποιούνται CK, CK-MB και τροπονίνη Ι και Τ. Πίνακας 5.15 Μεταβολές στις συγκεντρώσεις των ισοενζύμων της LDH σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις Η Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Αλκαλικής Φωσφατάσης Η αλκαλική φωσφατάση (Alkaline phosphatase ή ALP) υδρολύει τα φωσφορικά άλατα σε αλκαλικό ph 6,0 8,0. Η ALP κατανέμεται ευρέως σε πολλούς ιστούς, όπως στους οστεοβλάστες των ιστών, το ήπαρ, τον πλακούντα, τους νεφρούς, το εντερικό τοίχωμα και τους γαλουχούντες μαστικούς αδένες. Με την ηλεκτροφορητική τεχνική επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός και ο προσδιορισμός των ισοενζύμων της και είναι δυνατή η επιβεβαίωση της πηγής προέλευσής της. Τα κύρια ισοένζυμα της ALP και οι τιμές αναφοράς δίνονται στον Πίνακα Ισοένζυμα ALP Ποσοστό επί της ολικής ALP (%) Τιμές αναφοράς (U/L) Οστικό Ηπατικό Εντερικό Πλακουντιακό 0 Ολική ALP U/L Πίνακας 5.16 Κύρια ισοένζυμα και τιμές αναφοράς των ισοενζύμων της ALP. 136

138 Στα φυσιολογικά άτομα, η αλκαλική φωσφατάση του ορού προέρχεται σχεδόν αποκλειστικά από τα ισοένζυμα του ήπατος και των οστών. Μερικές φορές, ελάχιστες ποσότητες προέρχονται από το έντερο και σε περιόδους κυοφορίας και γαλουχίας, από τον πλακούντα και το μαστό (Σχήμα 5.11). Σχήμα 5.11 Ηλεκτροφόρηση ισοενζύμων ALP (Ηλεκτροφητική κινητικότητα ισοενζύμων σε άτομο φυσιολογικό, με ηπατική και πάθηση οστών). Η ολική ALP αυξάνεται φυσιολογικά στις παρακάτω περιπτώσεις: κατά την κύηση, μετά το 2 ο τρίμηνο (πλακουντιακό ισοένζυμο), σε αναπτυσσόμενα παιδιά (οστικό ισοένζυμο), μετά από πρόσληψη τροφής σε άτομα ομάδας αίματος Ο και Β Lewis θετικά, που εκκρίνουν την ουσία Η της ομάδας αίματος (εντερικό ισοένζυμο). Η πιο κοινή αιτία αυξημένης ολικής ALP είναι η ηπατοχολική νόσος. Οι τιμές της ολικής ALP είναι παθολογικές στο 60% των περιπτώσεων. Σε συνδυασμό με τρανσαμινάσες και γgt βοηθά στην διαφορική διάγνωση χολοστατικών καταστάσεων. Τα επίπεδα της ALP είναι υψηλά σε σχέση προς τις τιμές των τρανσαμινασών σε χολόσταση και φυσιολογικά σε απουσία χολόστασης. Σε νόσους του ήπατος φυσιολογικές ή ελάχιστα αυξημένες τιμές ALP σε συνδυασμό με υψηλές τιμές γgt υποδηλώνουν αλκοολική ηπατική νόσο (Murray et al., 2011 Nelson & Cox, 2008). 137

139 Στον Πίνακα 5.17 δίνονται οι μεταβολές της ALP σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Αύξηση της ALP Νόσος του Paget Υπερπαραθυρεοειδισμός Οστεομαλακία Ραχίτιδα Μεταστατικό καρκίνωμα οστών Οστεογενές σάρκωμα Κάταγμα οστών Μυέλωμα Νόσος του Hodgkin Σύνδρομο Cushing Μεγαλακρία Οξεία και χρόνια ιογενής ηπατίτιδα Αλκοολική ηπατίτιδα Κίρρωση ήπατος Αποφρακτικός ίκτερος Χολική κίρρωση Λοιμώδης μονοπυρήνωση Πρωτοπαθές ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Καρκίνος ωοθήκης Καρκίνος όρχεων Ηπατικές μεταστάσεις Ελκώδης κολίτιδα κ.α. Μείωση της ALP Υποθυρεοειδισμός Αναιμία Υποφωσφαταιμία Σκορβούτο Αχονδροπλασία κ.α. Πίνακας 5.17 Μεταβολές της ALP σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις H Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Κρετανικής Κινάσης Η κρεατινική κινάση (Creatine Kinase ή CK) αποτελεί ένα ένζυμο το οποίο καταλύει την αντιστρεπτή μεταφορά φωσφορικού από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) στην κρεατινίνη. Κρεατινίνη + ATP CK Φωσφορική κρεατινίνη + ADP Με την διαδικασία αποθηκεύεται φωσφορικό υψηλής ενέργειας σε μορφή σταθερότερη του ATP. Η CK βρίσκεται σε πολλούς ιστούς του ανθρώπινου οργανισμού. Οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις απαντούν στο σκελετικό μυ, στον καρδιακό μυ, στον θυρεοειδή, στον εγκέφαλο και στον προστάτη. Σε μικρότερες συγκεντρώσεις βρίσκεται στο ήπαρ, τους νεφρούς, τους πνεύμονες κ.α. Η αύξηση της CK του ορού αποδίδεται κατά κύριο λόγο σε βλάβη γραμμωτών σκελετικών ή καρδιακών μυών (Σχήμα 5.12). Η συγκέντρωση της CK του ορού αυξάνεται από 3-6 ώρες μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου και φτάνει μια μέγιστη τιμή μετά από 24 ώρες. 138

140 Σχήμα 5.12 Γραφική παράσταση συγκέντρωσης βιοδεικτών στο αίμα μετά από έμφραγμα. Η κρεατινική κινάση είναι ένα διμερές και αποτελείται από 2 υπομονάδες: Μ και Β. Η Μ υπομονάδα κυριαρχεί στο σκελετικό μυ και η Β υπομονάδα κυριαρχεί στον εγκέφαλο. Τρία ισοένζυμα τα οποία διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά συμπεριφέρονται ως διμερή: το CK-BB (CK1) αποτελείται από 2 Β υπομονάδες [κυρίως στον εγκέφαλο], το CK-MB (CK2) αποτελείται από μία υπομονάδα Μ και μία Β [κυρίως στην καρδιά] και το CK-MM (CK3) που αποτελείται από 2 υπομονάδες Μ [κυρίως στους σκελετικούς μυς και στην καρδιά]. Με την ηλεκτροφόρηση τα ισοένζυμα αυτά διαχωρίζονται και προσδιορίζονται (Σχήμα 5.13). Σχήμα 5.13 Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός ισοενζύμων CK (Πίνακας 5.18). 139

141 Στον Πίνακα 5.18 δίνονται τα ισοένζυμα της CK και οι τιμές αναφοράς τους. Η δοκιμασία δεν πρέπει να εκτελείται για επίπεδα της ολικής CK 150 U/L. Ισοένζυμα CK Θέση Τιμές αναφοράς ως % CK-BB (CK1) Κυρίως στον εγκέφαλο 0 CK-MB (CK2) Κυρίως στην καρδιά 0-3 CK-MM (CK3) Κυρίως στους σκελετικούς μυς και στην καρδιά Πίνακας 5.18 Ισοένζυμα της CK και οι φυσιολογικές τους τιμές. 5.8 Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρίνης (Γλυκοζυλιωμένη Αιμοσφαιρίνη) Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης [Hb] συμβάλλει στον προσδιορισμό των επιμέρους ειδών φυσιολογικών αιμοσφαιρινών στο αίμα, όπως της αιμοσφαιρίνης Α, της αιμοσφαιρίνης Α 2, της αιμοσφαιρίνης F, ή παθολογικών αιμοσφαιρινών, όπως οι S, C, E κ.α. Η σημασία της ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών συμβάλλει στη διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών (κληρονομικές παθήσεις που οφείλονται σε μεταλλάξεις των γονιδίων υπεύθυνων για την σύνθεση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης) (Φωτογραφία 5.8). Αιμοσφαιρινοπάθειες είναι η δρεπανοκυτταρική αναιμία, η μεσογειακή αναιμία (ή θαλασσαιμία), κ.α. Η συγκεκριμένη εξέταση αποτελεί ρουτίνα του προγεννητικού ελέγχου για την διάγνωση ή μη αιμοσφαιρινοπαθειών στην αρχόμενη κύηση. Φωτογραφία 5.8 Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. Οι φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες του ανθρώπινου οργανισμού είναι η Α, η Α 1 και η F. Η αιμοσφαιρίνη Α (ή Α 1) αποτελεί το βασικό συστατικό της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, ενώ η Α 2 αποτελεί μόνο το 2-3% της φυσιολογικής. Η εμβρυική αιμοσφαιρίνη F είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη του εμβρύου και μετά τη γέννηση αντικαθίσταται από την Α 1. Η αιμοσφαιρίνη S είναι μία παθολογική αιμοσφαιρίνη που συνδέεται με τη δρεπάνωση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και την δρεπανοκυταρική αναιμία. Στη δρεπανοκυτταρική αναιμία, τα ερυθρά αιμοσφαίρια έχουν σχήμα δρεπάνου), αντί του φυσιολογικού σφαιρικού, με αποτέλεσμα την πρόωρη καταστροφή τους, που οδηγεί στην αναιμία (Φωτογραφία 5.9) (Αντωνέλου & Παπασιδέρη, 2015). 140

142 Φωτογραφία 5.9 Ερυθρά αιμοσφαίρια με φυσιολογικό σχήμα (σφαιρικό) και με παθολογικό σχήμα (σχήμα δρεπάνου). Η κάθε μία από τις παραπάνω αιμοσφαιρίνες έχει κάποιο ηλεκτρικό φορτίο, συνεπώς μία καλή μέθοδος διαχωρισμού τους είναι η διάβαση τους μέσα από ηλεκτρικό πεδίο. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης τα συστατικά της αιμοσφαιρίνης διαχωρίζονται σε ευδιάκριτες χρωματισμένες ζώνες, που συγκρίνονται με τις ζώνες φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, για να εξαχθεί το ποσοστό του κάθε συστατικού. Στον Πίνακα 5.19 δίνονται οι τιμές για φυσιολογικές και κάποιες αιμοσφαιρινοπάθειες, που μπορεί να διαφέρουν από εργαστήριο σε εργαστήριο (Ζαμπέτα, 2015). Αιμοσφαιρίνες Φυσιολογικά Ποσοστά Ποσοστά σε Παθολογικές Καταστάσεις Ενήλικες (%) Παιδιά Μεσογειακή Αναιμία Hg H ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ Α (ήα1) Μεσογειακ ή Αναιμία (στίγμα) Α ,8 < 2 F 0,8 2,0 6 μήνες: 8 > 6 μήνες: 1 2 Νεογνά (Hgb F): Δρεαπανοκυττ αρική Αναιμία ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ S Πίνακας 5.19 Ποσοστά (%) αιμοσφαιρινών σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Αύξηση της παραγωγής της HbF κατά την ενήλικη ζωή, οφείλεται κυρίως: σε μεταλλάξεις που ρυθμίζουν θετικά την παραγωγή της HbF, γνωστές ως Κληρονομική Παραμονή της HbF (HPFH), όπου η HbF κυμαίνεται από 3-20%, σε μεταλλάξεις που προκαλούν Μεσογειακή Αναιμία (δβ-μα), όπου η HbF κυμαίνεται από 5-20%, και σε περιπτώσεις πασχόντων από Μεσογειακή Αναιμία ή Δρεπανοκυτταρική Αναιμία, όπου η επαγωγή της παραγωγής της HbF βελτιώνει την αιματολογική κατάσταση και την κλινική εικόνα των ασθενών και σε υψηλό ποσοστό της HbF που παράγεται (20-40%) σε περιπτώσεις συνδυασμών της ετερόζυγης β-μεσογειακής αναιμίας και HPFH. Πολλές φορές για την διάγνωση σακχαρώδους διαβήτη και προδιαβήτη ή για την παρακολούθηση διαβητικών ατόμων και την υποβοήθηση λήψης θεραπευτικών αποφάσεων, απαιτείται ο προσδιορισμός της γλυκιωμένης αιμοσφαιρίνης, η οποία αποτελεί το 5-8% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Η γλυκιωμένη (γλυκοζυλιωμένη) αιμοσφαιρίνη (HbΑ 1c) αποτελεί μια φυσιολογική μορφή της αιμοσφαιρίνης, που βρίσκεται συνδεδεμένη με την γλυκόζη. Η αιμοσφαιρίνη συνδέεται μη ενζυμικά με την γλυκόζη σε περίπτωση υπεργλυκαιμίας. Όσο πιο υψηλή είναι η συγκέντρωση της γλυκόζης, τόσο πιο υψηλή είναι και η συγκέντρωση της γλυκιωμένης αιμοσφαιρίνης. Η τιμή της HbA 1c εξαρτάται από τη μέση συγκέντρωση της γλυκόζης του 141

143 αίματος τις τελευταίες 3 με 6 εβδομάδες, γι αυτό και αποτελεί δείκτη της πορείας της νόσου (Marshall & Bangert, 2001). Σχήμα 5.14 Αντιστοίχιση τιμών σακχάρου (τιμές γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης και τιμές γλυκόζης αίματος [μέσο ισοδύναμο πλάσματος]). Η τιμή της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης εκφράζεται σε εκατοστιαίο ποσοστό της ολικής αιμοσφαιρίνης. Στα φυσιολογικά άτομα η τιμή αυτή είναι η εξής: HbA 1 (A 1a, A 1b, A 1c) = 5,0-8,0%, μέση τιμή 6,5% HbA 1c = 4,5-6,5%, μέση τιμή 5,0% Στους διαβητικούς ασθενείς, στους οποίους δεν ελέγχονται τα επίπεδα της γλυκόζης, η τιμή του αιμοσφαιρινικού κλάσματος είναι σαφώς αυξημένο (2-3 φορές πάνω από τη φυσιολογικό) (Μάλιου, 2015). Σχήμα 5.15 Εφαρμογή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (ανάλυση HbA 1c σε φυσιολογικό και σε άτομο με διαβήτη). 142

144 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Eπίδειξη χειρισμού αναλυτή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση πηκτής (gel), (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση δισδιάστατη, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Hλεκτροφόρηση αγαρόζης, (τελευταία προσπέλαση 1/8/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). 143

145 Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα glycated-hemoglobin (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015). Aναφορές 1. ΑΝΤΩΝΕΛΟΥ, Μ. & ΠΑΠΑΣΙΔΕΡΗ, Ι. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης διαχωρισμός πρωτεϊνών ερυθροκυτταρικής μεμβράνης. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 2. ΔΑΡΜΗ, Θ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. ΤΕΙ Αθήνας. στο: (τελευταία προσπέλαση ). 3. ΔΗΜΗΤΡΙΑΔΗΣ, Ι. (2015) Θεωρία και Πράξη των τεχνικών ηλεκτροφόρησης, ανοσοκαθήλωσης και ανοσοηλεκτροφόρησης. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 4. ΖΑΜΠΕΤΑ, Δ. (2015) Αιμοσφαιρινοπάθειες. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση: ). 5. ΠΕΤΡΟΣ, Κ., & ΑΥΓΟΥΣΤΙΝΟΣ, Α. (2015) Εργαστηριακές ασκήσεις βιολογίας. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 6. ΦΥΤΟΥ-ΠΑΛΛΗΚΑΡΗ, Α. (2005). Θεωρία Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος. 7. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2012) Αρχές Ηλεκτροφόρησης. 1η έκδοση. Αθήνα: ΑΤΕΙ Αθήνας. 8. ΛΙΑΝΙΔΟΥ, Ε. (2015) Ηλεκτροφορητικές τεχνικές. (τελευταία προσπέλαση ). 9. ΜΑΚΕΔΟΥ, Γ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών λιποπρωτεϊνών. τελευταία προσπέλαση (τελευταία προσπέλαση ) (τελευταία προσπέλαση ). 11. ΜΑΛΛΙΟΥ, Κ. (2015) Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ) 12. ΝΤΑΛΑΜΑΓΚΑ, Μ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, Πρακτική Εργαστηριακή Προσέγγιση. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 13. ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. & ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. (2001) Βασικά θέματα βιοχημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 14. ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. & ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. (2011) Εξειδικευμένα θέματα κλινικής χημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 15. ΣΑΟΥΛΗ, Ζ. (2015) Αιμοσφαιρινοπάθειες. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση: ). 16. BAYNES, J. & DOMINICZAK, M. (2002) Ιατρική Βιοχημεία. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου. 17. BECKETT, G., WALKER, S., RAE, P., ASHBY, P. (2010) Κλινική Βιοχημεία. 7 η έκδοση. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου. 18. DEVLIN, Μ. (2009) Βιοχημεία - Κλινικοί Συσχετισμοί Τόμος Ι & II. Αθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 19. HU, Y. (1996) The capillary electrophoresis. New York: Springer-Verlag. 20. KAPLAN, A., JACK, R., OPHEIM, K., TOIVOLA, B., LYON, A. (2003) Κλινική Χημεία Δοκιμασίες και Τεχνικές. 4 η έκδοση. Αθήνα: Εκδόσεις Πασχαλίδης. 21. KOOLMAN, J. & ROEHM, K. (2007) Eγχειρίδιο Βιοχημείας. Αθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 144

146 22. LOEFFLER, G. (2007) Βασικές Αρχές Βιοχημείας με στοιχεία Παθοβιοχημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 23. MARSHALL, W. & BANGERT, S. (2001) Κλινική Χημεία. Αθήνα: Εκδόσεις: Π. Χ. Πασχαλίδης (μετάφραση από το πρωτότυπο, Elsevier Inc). 24. MURRAY, R., BOTHAM, K., RODWELL, V., BENDER, D., KENNELLY, P., WEI, L., ANTHONY, P. (2011) Harper s Εικονογραφημένη Βιολογική Χημεία. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 25. NELSON, L. & COX, Μ. (2008) Αρχές της βιοχημείας. 1 η έκδοση. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 26. GAW, A., MURPHY, M., COWAN, R., O REILLY, D., STEWART, M., SHEPHERD, J. (2010) Κλινική Βιοχημεία. 4 η έκδοση. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου. 27. ΣΠΑΝΟΣ, Ε. (2001) Κλινική χημεία. Αθήνα: Βιοϊατρική. 28. ΠΑΠΑΘΑΝΑΣΙΟΥ, Α. (2011) Γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη. Διαθέσιμο στο: (τελευταία προσπέλαση ). 145

147 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΒΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ELISA Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι σημαντικότερες ανοσοχημικές τεχνικές και συγκεκριμένα οι αρχές μεθόδων των ανοσοενζυμικών τεχνικών, των ραδιοανοσοενζυμικών τεχνικών και της χημειοφωταύγειας. Και οι τρεις τεχνικές αποτελούν τους βασικούς τρόπους προσδιορισμών πρωτεϊνών ποιοτικά ή ποσοτικά. Χρησιμοποιούν και οι τρεις αντισώματα αλλά επιπλέον ένζυμα, ραδιοισότοπα και χημικές ενώσεις φωταύγειας. Επίσης, θα περιγραφούν οι ανοσοχημικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στη κλινική χημεία με τη μορφή IVDs (βλ. Κεφάλαια 7 & 9). Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στις ανοσοενζυμικές μεθόδους και ιδιαίτερα στην τεχνική ELISA, η οποία αποτελεί και την πλέον διαδεδομένη ανοσοχημική μέθοδο, λόγω της ευκολίας της χρήσης της από την άποψη του εξοπλισμού, της τεχνικής, της ασφάλειας, αλλά και της ποικιλίας των πρωτεϊνικών μορίων που μπορούν να προσδιοριστούν με αυτή. Προαπαιτούμενες γνώσεις Στο κεφάλαιο αυτό, θα διδαχθούν τεχνικές που βασίζονται μεταξύ άλλων στην απορρόφηση του φωτός. Κατά συνέπεια είναι απαραίτητη η γνώση του Kεφαλαίου 1, που αφορά στις βασικές αρχές φωτομετρίας και χρωματομετρικών αναλύσεων. 6.1 Εισαγωγή Oι ανοσοχημικοί προσδιορισμοί, όπως υπονοεί και η ονομασία τους, αναφέρονται σε εκείνη την κατηγορία των αναλυτικών μεθόδων που συνδυάζουν τεχνολογίες χημείας και ανοσολογίας. Πρακτικά αναφέρονται στις μεθόδους που χρησιμοποιούν τουλάχιστον μία φορά αντισώματα. Δεδομένου ότι τα αντισώματα συνδέονται μόνο με πρωτεΐνες, είναι προφανές ότι οι μέθοδοι αυτοί χρησιμοποιούνται μόνο για τον ποσοτικό ή ποιοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών και όχι άλλης οργανικής ή ανόργανης ένωσης. Οι διαφορετικές αρχές μεθόδων που εφαρμόζουν, απαιτούν, όπως είναι αναμενόμενο, διαφορετικές τεχνολογίες από τις φωτομετρικές αναλύσεις, δηλαδή διαφορετικά όργανα, διαφορετικά αντιδραστήρια και διαφορετικούς αναλυτές. Η σύγχρονη τεχνολογία όμως, έχει οδηγήσει στην κατασκευή πολύ-αναλυτών, που συνδυάζουν φωτομετρικές και ανοσοχημικές τεχνικές στην ίδια πλατφόρμα, μειώνοντας έτσι σημαντικά κόστη σε υλικούς και ανθρώπινους πόρους. 6.2 Η βασική αρχή των Ανοσοχημικών τεχνικών Οι ανοσοχημικοί αναλυτές μετρούν με ειδικό ανιχνευτή το σήμα που παράγεται από κάποια χημική αντίδραση. Αυτή η χημική αντίδραση πυροδοτείται από την ένωση της πρωτεΐνης με το αντίσωμα και της δημιουργίας ενός ανοσοσυμπλέγματος (Διαμαντής et al., 1987). Επειδή δε, μέσα στον οργανισμό τα αντισώματα ενώνονται με αντιγόνα, οι πρωτεΐνες αυτές ονομάζονται γενικά «αντιγόνα», αν και πολλές φορές απέχουν από την πραγματική έννοια του αντιγόνου της ανοσολογίας. Μπορεί δηλαδή να είναι πραγματικά αντιγόνα, υπό την ανοσολογική έννοια, αλλά μπορεί να είναι και αντισώματα (π.χ. αντισώματα έναντι ιών) καθώς και απτένια. Τα απτένια είναι πρωτεΐνες που διεγείρουν τον οργανισμό για την παραγωγή αντισωμάτων παρά μόνο ύστερα από τη σύνδεση τους με μεγαλύτερες από αυτά πρωτεΐνες. Υπάρχει μεγάλη ποικιλία ανοσοχημικών τεχνικών, ανάλογα με το σήμα που μετράται από αυτές, τον αριθμό των αντισωμάτων που συμμετέχουν στις χημικές αντιδράσεις, αλλά και στον διαχωρισμό των ανοσοσυμπλόκων (σύνδεση αντιγόνων αντισωμάτων) από τα υπόλοιπα μέρη του διαλύματος. Στον Πίνακα 6.1 καταγράφονται οι σημαντικότερες κατηγορίες τους. Θα πρέπει εδώ να τονιστεί, ότι στις ανοσοχημικές μεθόδους η μετατροπή της απορρόφησης σε συγκέντρωση δεν είναι τόσο απλή όπως στις φωτομετρικές αναλύσεις. Σε αντίθεση με τις φωτομετρικές 146

148 αναλύσεις, οι καμπύλες βαθμονόμησης στις ανοσοχημικές αντιδράσεις δεν είναι πάντα ευθείες γραμμές (Σχήμα 6.1). Οπότε δεν ισχύει η «απλή μέθοδος των τριών» που γνωρίσαμε στις φωτομετρικές αναλύσεις τελικού σημείου (βλ. Κεφάλαια 1 & 2). Σχήμα 6.1 Πιθανές καμπύλες αναφοράς σε ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές ανοσοχημικές μεθόδους. Οι κατασκευαστές αναλυτών και αντιδραστηρίων προσπαθούν σήμερα να προσαρμόσουν τις καμπύλες αναφοράς σε ευθεία γραμμή για να αυξήσουν την ευαισθησία τους. Ανάλογα με το σήμα Χρωματική αντίδραση Κρούσεις ραδιοϊσοτόπων Ένταση παραγόμενου φωτός Ανοσοενζυμικές μέθοδοι Ραδιοανοσολογικές μέθοδοι Χημειοφωταύγεια Ανάλογα με τον αριθμό των αντισωμάτων που συμμετέχουν στην αντίδραση Ένα αντίσωμα Δύο αντισώματα Ανταγωνιστικές μέθοδοι Μη ανταγωνιστικές μέθοδοι Ανάλογα με τον διαχωρισμό ανοσοσυμπλόκων Διαλυτό ανοσοσύμπλοκο Ακινητοποιημένο ανοσοσύμπλοκο Ομογενείς μέθοδοι Ετερογενείς μέθοδοι Πίνακας 6.1 Οι βασικές κατηγορίες των ανοσοχημικών μεθόδων. 6.3 Οι κατηγορίες των Ανοσοχημικών τεχνικών Ομογενείς και Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι Από τις δύο αυτές κατηγορίες συνηθέστερες είναι οι ετερογενείς μέθοδοι και από αυτές η ELISA (Enzyme Linked Immunoassay Antibody) είναι αυτή που χρησιμοποιείται πολύ στις δια χειρός μεθόδους (manual). Στις ετερογενείς μεθόδους τα αντισώματα είναι προσκολλημένα πάνω σε στερεή επιφάνεια (Σχήμα 6.2α). Τέτοιες συνηθισμένες επιφάνειες είναι ο πλαστικός πυθμένας των πηγαδιών (wells) μιας πλάκας μικροτιτλοδότησης, ο πυθμένας γυάλινων ή συνηθέστερα πλαστικών σωληναρίων και η επιφάνεια σφαιριδίων latex ή μαγνητικών σφαιρών. Οι ετερογενείς μέθοδοι επιλέγονται για αντιγόνα που έχουν την ίδια χημική συμπεριφορά, είτε είναι ενωμένα με αντιγόνα, είτε όχι. Αντίθετα, στις ομογενείς ανοσοχημικές μεθόδους τα ανοσοσύμπλοκα παραμένουν σε διαλυτή μορφή μέσα στο διάλυμα αντίδρασης (Σχήμα 6.2β). Στις ομογενείς μεθόδους τα ενωμένα με τα αντισώματα αντιγόνα έχουν διαφορετική συμπεριφορά από τα μη συνδεδεμένα. Έτσι, είναι δυνατή η μέτρησή τους, χωρίς να 147

149 χρειάζεται να απομακρυνθούν τα μη συνδεδεμένα. Αυτή η ιδιότητα των αντιγόνων στις ομογενείς μεθόδους τις καθιστά εύκολα αυτοματοποιήσιμες, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι δεν μπορούν να αυτοματοποιηθούν και οι ετερογενείς μέθοδοι. Σχήμα 6.2 Η σύνδεση αντιγόνων και αντισωμάτων σε ετερογενείς και ομογενείς μεθόδους. Κάθε αντίσωμα (συμβολίζεται ως Υ λόγω του σχήματος του) μπορεί να ενωθεί με ένα ή δύο ίδια αντιγόνα σε εξειδικευμένες θέσεις που ονομάζονται Fab 1,2 καθώς και με μία σταθερή επιφάνεια με την τρίτη κενή θέση που ονομάζεται Fc Οι διαφορές των Ανοσοχημικών μεθόδων ανάλογα με τον Ιχνηθέτη Υπάρχουν πολλών ειδών ιχνηθέτες που χρησιμοποιούνται στις ανοσοχημικές τεχνικές. Σε γενικές γραμμές διακρίνονται σε ένζυμα, ραδιοισότοπα και μόρια χημειοφωταύγειας Όταν ο Ιχνηθέτης είναι Ένζυμο οι Ανοσοενζυμικές μέθοδοι Από τους τρεις διαφορετικούς ιχνηθέτες, αυτοί που προκαλούν μεγαλύτερη καθυστέρηση στην ολοκλήρωση της μεθόδου είναι τα ένζυμα, αφού απαιτείται η αντίδραση τους με το υπόστρωμα και ο σχετικός επιπλέον χρόνος επώασης. Παρ όλα αυτά οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι είναι οι πλέον διαδιδόμενες λόγω του εύκολου και ασφαλούς χειρισμού τους. Τριών ειδών ένζυμα χρησιμοποιούνται στις ανοσοενζυμικές μεθόδους. Και τα τρία καταλύουν χρωμογόνα και φθορίζοντα υποστρώματα (Πίνακας 6.2). Τα χρωμογόνα υποστρώματα οδηγούν στη παραγωγή έγχρωμου διαφανούς διαλύματος, το οποίο μπορεί να απορροφήσει φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Ό,τι ακριβώς γίνεται δηλαδή, και στις φωτομετρικές μεθόδους, όπου η μετατροπή της απορρόφησης σε συγκέντρωση βασίζεται στον γνωστό νόμο του Lambert-Beer: A = ε d C (βλ. Ενότητα 1.6). Η απορρόφηση του φωτός μετράται σε κατάλληλο φωτόμετρο που μετατρέπει την απορρόφηση σε συγκέντρωση χρησιμοποιώντας συγκεκριμένη καμπύλη αναφοράς. Αντίθετα, τα φθορίζοντα υποστρώματα παράγουν φθορισμό ύστερα από τη διέγερση τους με φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Η ένταση του φθορισμού μετατρέπεται σε συγκέντρωση, βάση καμπύλης αναφοράς, κατά κανόνα σε ειδικό αναλυτή. Γενικά τα φθορίζοντα υποστρώματα αποτελούν τη βασική επιλογή στις αυτοματοποιημένες ανοσοενζυμικές μεθόδους. Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι χαρακτηρίζονται από πολύ μεγάλη ποικιλία, αφού υπάρχουν ετερογενείς (η γνωστή ELISA) αλλά και πολλές ομογενείς μέθοδοι (Σχήμα 6.3). Όπως και οι υπόλοιπες ανοσοχημικές μέθοδοι διαιρούνται σε ανταγωνιστικές (Σχήμα 6.4) μη ανταγωνιστικές μεθόδους (Σχήμα 6.5). 148

150 Σχήμα 6.3 Τα τυπικά στάδια μιας μεθοδολογίας ELISA. Αριστερά φαίνεται μία ανταγωνιστική μεθοδολογία, όπου τα ακινητοποιημένα αντισώματα δέχονται τα αντιγόνα του δείγματος, καθώς και τα σημασμένα αντιγόνα με κατάλληλο ένζυμο. Δεξιά φαίνεται μία μη ανταγωνιστική μεθοδολογία, όπου τα αντιγόνα του ασθενούς καλύπτουν σχεδόν εξ ολοκλήρου τα ακινητοποιημένα αντισώματα και δέχονται πάνω τους μία δεύτερη ομάδα σημασμένων αντισωμάτων με κατάλληλο ένζυμο. Και στις δύο περιπτώσεις το ένζυμο αντιδρά με το υπόστρωμα και παράγει έγχρωμο σήμα. Σχήμα 6.4 Η διάταξη αντισωμάτων και αντιγόνου στις ανταγωνιστικές μεθόδους. Το ελεύθερο αντιγόνο προέρχεται από τον ασθενή και δεσμεύει θέσεις σύνδεσης του σημασμένου αντιγόνου με κατάλληλο ιχνηθέτη. 149

151 Σχήμα 6.5 Η διάταξη αντισωμάτων και αντιγόνου στις μη ανταγωνιστικές μεθόδους. Το ελεύθερο αντιγόνο ενώνεται με δύο αντισώματα εκ των οποίων το ένα (στις ετερογενείς μεθόδους) το ακινητοποιεί πάνω στη στερεή επιφάνεια και το δεύτερο φέρει τον ιχνηθέτη που θα παράγει το σήμα για τον μέτρηση. Ένζυμο Υπεροξειδάση (ΗRP) Αλκαλική φωσφατάση (ALP) β- γαλακτοσιδάση (β-gal) Είδος ενζύμου Οξειδάση 3-(π-υδροξυφαινυλο) προπιονικό οξύ HPPA Υδρολάση Χρωμογόνα υποστρώματα Συντόμευση Μήκος κύματος π-φωσφορική νιτροφαινόλη pnpp 405 Χρωμογόνα υποστρώματα Συντόμευση Μήκος κύματος (nm) 2,2-άζινο δις-(3- ABTS 415 αιθυλβενζοθειαζολίνη-6- σουλφονικό οξύ 3,3,5,5 -τετραμεθυλοβενζιδίνη TMB 450 Oρθo-φαινυλενοδιαμίνη OPD 492 Φθορίζοντα υποστρώματα Συντόμευση π-υδροξυφαινυλοξεικό οξύ HPAA Φθορίζοντα υποστρώματα Συντόμευση 4-μεθυλο φωσφορική ουμπελιφερόνη MUP Υδρολάση Χρωμογόνα υποστρώματα Συντόμευση Μήκος κύματος o-νιτροφαινυλ-β-dγαλακτοπυρανοσίδη onpg 420 Ερυθρό χλωροφαινόλης-β-dγαλακτοπυρανοσίδης CPRG 571 Φθορίζοντα υποστρώματα Συντόμευση 4-μεθυλουμπελιφερολ-β-D γαλακτοπυρανοσίδη MUG Πίνακας 6.2 Τα κυριότερα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται σε ανοσοενζυμικές μεθόδους (Ρίζος, 1994) Όταν ο Ιχνηθέτης είναι Ραδιοισότοπο οι Ραδιοανοσολογικές μέθοδοι Οι ραδιοανοσολογικές μέθοδοι (RIA, IRMA) (Σχήμα 6.6) αποτελούν την παλαιότερη ανοσοχημική μέθοδο (Yellow & Berson, 1959). Για την εφαρμογή τους έχουν κατά καιρούς χρησιμοποιηθεί διάφορα ραδιοισότοπα, αλλά σήμερα αυτό που χρησιμοποιείται ευρέως είναι το 125 I. To 125 I έχει χρόνο ημίσειας ζωής 60 ημέρες, δηλαδή μέσα σε 60 ημέρες η ραδιενέργεια που εκπέμπει μειώνεται στο 50%. Aυτός ο χρόνος είναι ικανοποιητικός για διαγνωστική χρήση. Σε αντίθεση με τις ανοσοενζυμικές μεθόδους δεν είναι εύκολη η πλήρη αυτοματοποίηση τους, ενώ έχουν το μεγάλο πλεονέκτημα της πολύ υψηλής ευαισθησίας, της ικανοποιητικής ταχύτητας, του χαμηλού κόστους και της εύκολης σχετικά δημιουργίας των αντίστοιχων μεθόδων. Μειονέκτημα τους είναι η επικινδυνότητα των ραδιοισοτόπων. 150

152 Το σήμα που μετράται στις ραδιοανοσολογικές μεθόδους είναι οι κρούσεις ανά λεπτό (cpm). Με την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς είναι δυνατή η μετατροπή των κρούσεων σε συγκέντρωση του αντιγόνου. Υπάρχουν ανταγωνιστικές (Σχήματα 6.4, 6.6) και μη ανταγωνιστικές ραδιοανοσολογικές μέθοδοι (Σχήματα 6.5 & 6.6), όπου ανταγωνίζεται ή όχι το μετρούμενο αντιγόνο του ασθενούς (ψυχρό αντιγόνο), με το αντιγόνο του αντιδραστηρίου που περιέχει ραδιοισότοπο (θερμό αντιγόνο) (Ευαγγελάτος, 1999). Σχήμα 6.6 Τα τρία βασικά στάδια στις ραδιοανοσολογικές μεθόδους. Αριστερά φαίνεται η ανταγωνιστική μέθοδος (RIA), όπου το θερμό αντιγόνο (αυτό που φέρει το ραδιοισότοπο 125 Ι) ανταγωνίζεται το αντιγόνο του ασθενούς. Δεξιά φαίνεται η μη ανταγωνιστική μέθοδος (IRMA), όπου το ραδιοισότοπο είναι ενωμένο με αντίσωμα το οποίο ενώνεται με το ακινητοποιημένο αντίγονο του ασθενούς από δεύτερο αντίσωμα Όταν ο Ιχνηθέτης είναι μόριο Φωταύγειας η Χημειοφωταύγεια Η χημειοφωταύγεια (CIA, ICMA) είναι το φυσικό φαινόμενο της παραγωγής φωτεινής ακτινοβολίας από μία εξώθερμη χημική αντίδραση (A+B). Η οξειδοαναγωγική αυτή αντίδραση παρέχει την ενέργεια σε προϊόν της, ώστε αυτό να διεγερθεί (C*). Καθώς αμέσως αποδιεγείρεται για να επιστρέψει σε σταθερή ενεργειακή κατάσταση (C), εκπέμπει χαρακτηριστική φωτεινή ακτινοβολία (hv). Η συνολική αντίδραση περιγράφεται απλοποιημένα από την εξίσωση: A + B C* C + hν Η απόδοση της αντίδρασης σε φωτεινή ακτινοβολία, δηλαδή ο αριθμός των φωτονίων ανά μόριο αντιδρώντος, εκφράζεται από τον «λόγο απόδοσης» που ισούνται με το κλάσμα: αριθμός εκπεμπόμενων φωτονίων / αριθμός μορίων Α ή Β. Η μέγιστη τιμή του λόγου είναι η μονάδα, προς την οποία πλησιάζει η εκπομπή του φωτός, που παράγει το έντομο της πυγολαμπίδας κατά την οξείδωση του μορίου της λουσιφερόλης. Στην εργαστηριακή πάντως τεχνολογία το σήμα της χημειοφωταύγειας ονομάζεται «σχετική μονάδα φωτός» (Relative Light Unit). Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα σήμερα μόρια παραγωγής φωταύγειας είναι οι κυκλικές υδραζίδες (λουμινόλη, ισολουμινόλη, αμινικά παράγωγα της ισολουμινόλης), οι εστέρες της ακριδίνης, τα διοξετάνια και τα άλατα του ρουθηνίου. Η χημειοφωταύγεια αποτελεί τη νεώτερη ανοσοχημική μέθοδο και την πλέον αυτοματοποιημένη. Είναι ταχύτατη, προσεγγίζει την ευαισθησία των ραδιοανοσολογικών μεθόδων, αλλά παράλληλα είναι ασφαλέστερη από αυτές. Οι μέθοδοι της χημειοφωταύγειας έχουν όμως μεγάλο κόστος, δεδομένου ότι παρέχονται πλήρως αυτοματοποιημένες. Υπάρχουν ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές μέθοδοι χημειοφωταύγειας (Σχήμα 6.7). 151

153 Σχήμα 6.7 Τα τρία βασικά στάδια στις μεθόδους χημειοφωταύγειας. Το σχήμα αναπαριστάνει μία άμεση ετερογενή μέθοδο, όπου τα αντισώματα είναι ακινητοποιημένα πάνω σε μεταλλικές μπίλιες. Αριστερά φαίνεται η ανταγωνιστική μέθοδος (CIA), όπου το σημασμένο αντιγόνο (φέρει εστέρα ακριδίνης) ανταγωνίζεται το αντιγόνο του ασθενούς. Δεξιά φαίνεται η μη ανταγωνιστική μέθοδος (ICMA, όπου ο εστέρας ακριδίνης είναι ενωμένος με αντίσωμα το οποίο ενώνεται με το ακινητοποιημένο αντίγονο του ασθενούς από δεύτερο αντίσωμα Ανταγωνιστικοί και μη Ανταγωνιστικοί μέθοδοι Μία σημαντική διαφοροποίηση των ανοσοχημικών μεθόδων είναι αυτή μεταξύ ανταγωνιστικών και μη ανταγωνιστικών μεθόδων. Η επιλογή μεταξύ των δύο αυτών μεθοδολογιών μεθόδων έχει να κάνει με τον αριθμό των «επιτόπων» πάνω στο αντιγόνο που πρόκειται να μετρηθεί. Οι επίτοποι είναι θέσεις πάνω στα αντιγόνα στις οποίες ενώνονται τα αντιγόνα. Όταν το αντιγόνο έχει δύο επιτόπους μπορεί να συνδεθεί με δύο αντισώματα ίδια ή διαφορετικά. Αυτά τα αντιγόνα μπορεί να είναι ορμόνες π.χ. TSH, δείκτες καρκίνου π.χ. CEA, Ferr, TSH, PSA, αλλά και αντιγόνα των ιών HBV, HIV, HCV. H μέθοδος αυτή ονομάζεται μη ανταγωνιστική ή αλλιώς Sandwitch. Σε αυτή την περίπτωση το αντιγόνο ακινητοποιείται μεταξύ δύο αντισωμάτων. Το πρώτο αντίσωμα είναι σταθερά ενωμένο πάνω σε στερεή φάση και το δεύτερο φέρει τη σήμανση (Σχήμα 6.5). Σε αυτή την περίπτωση το σήμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του αντιγόνου και αυξάνεται, όσο αυξάνεται η συγκέντρωσή του (Σχήμα 6.1α). Αντίθετα, όταν το αντιγόνο έχει ένα μόνο επίτοπο, χρησιμοποιούνται οι ανταγωνιστικές μέθοδοι. Στις ανταγωνιστικές μεθόδους το αντιγόνο είναι σε έλλειψη και καταλαμβάνει ένα μέρος μόνο από τις διαθέσιμες θέσεις σύνδεσης των αντισωμάτων. Σε αυτή την περίπτωση το αντιγόνο του ασθενούς ανταγωνίζεται άλλο αντιγόνο που φέρει σήμανση (Σχήμα 6.4). Κατά συνέπεια το παραγόμενο σήμα είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης του αντιγόνου δηλαδή αυξάνεται, όσο μειώνεται το παραγόμενο σήμα (Σχήμα 6.1β). Γενικά, οι μη ανταγωνιστικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται για αντιγόνα μεγαλύτερου μοριακού βάρους από αυτά των ανταγωνιστικών μεθόδων, αφού οι τελευταίες χρησιμοποιούνται ακόμα και για τον προσδιορισμό απτενίων, που έχουν πολύ μικρό σχετικά μοριακό βάρος. Επιπλέον, είναι ταχύτερες και με πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία. Η υψηλή τους ευαισθησία οφείλεται και στην καμπύλη αναφοράς τους, η οποία συνηθέστερα είναι ευθεία γραμμή σε αντίθεση με τις ανταγωνιστικές που συνήθως είναι σιγμοειδής (Σχήμα 6.1). ΕΙΑ SFIA Aνοσοενζυμική μέθοδος Φθορισμο-ανοσοενζυμική μέθοδος 152

154 ELISA Ανοσο-απορροφητική μέθοδος συνδεδεμένου ενζύμου RIA Ραδιοανοσολογική μέθοδος IRMA Ραδιοανοσομετρική μέθοδος RAST Ραδιοαλλεργιοαπορροφητική μέθοδος RIST Ραδιοανοσοαπορροφητική μέθοδος CIA Ανοσοχημειοφωταύγεια ICMA Ανοσοχημειοφωταυγειομετρική μέθοδος eclia/ecl Ηλεκτροχημειοφωταύγεια FPIA Ανάλυση πολωμένου φθορισμού PACIA Μικροσωματιδιακή ανοσοενζυμική ανάλυση ICIA Τεχνολογία δέσμευσης ιόντων ΕΜΙΤ Aνοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος LOCI Ανοσοχημειοφωταύγεια καναλιού οξυγόνου FETI Μέθοδος μεταφοράς φθορισμομετρικής ενέργειας TR-FIA Mέθοδος χρονικά διαχωριζομένου φθορισμού SL-FIA Ανοσοφθορισμομετρικοί προσδιορισμοί με επισημασμένο υπόστρωμα DELFIA Ανοσοφθορισμομετρική ενισχυμένη διάσταση λανθανιδών Πίνακας 6.3 Αυτοματοποιημένες ανοσοχημικές μέθοδοι. Παράμετροι απόδοσης Ανοσοχημικές μέθοδοι ΕΙΑ - ELISA RIA - IRMA CIA, CLIA Ευαισθησία Πολύ καλή Πολύ υψηλή Υψηλή Ακρίβεια Υψηλή Υψηλή Υψηλή Σταθερότητα Υψηλή Μέτρια Υψηλή αντιδραστηρίου Τεχνικός εξοπλισμός Φθορισμόμετρο Φωτόμετρο Γυμνό μάτι Αυτόματος αναλυτής Μετρητής γ ή β ακτινοβολίας Νομικές υποχρεώσεις Όχι Ναι Όχι Εξειδίκευση προσωπικού Μέτρια Υψηλή Μέτρια Χρόνος εξέτασης * ** * Αυτοματισμός Ναι Ναι Ναι Φωταυγειόμετρο Αυτόματος αναλυτής Πίνακας 6.4 Σύγκριση των τριών κατηγοριών ανοσοχημικών μεθόδων (Ρίζος, 1994). 6.4 Οι Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι, η ELISA Για να γίνουν κατανοητές οι ανοσοχημικές μέθοδοι θα περιγραφεί αναλυτικά η κυριότερη εκπρόσωπος αυτών η ELISA. Δεδομένου ότι η ELISA είναι ιδιαίτερα ασφαλής για την υγεία των χειριστών και δεν απαιτεί αυτόματο εξοπλισμό αποτελεί την καλύτερη επιλογή για τη διδασκαλία των ανοσοχημικών μεθόδων στο εργαστήριο κλινικής χημείας. Στις ανοσοενζυμικές μεθόδους ο ιχνηθέτης είναι ένζυμο. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται είναι τα HRP, ALP και β-gal (Πίνακας 6.2) και τα υποστρώματα τους μπορεί να είναι χρωμογόνα ή φθορισμογόνα. Από αυτά, τα χρωμογόνα υποστρώματα χρησιμοποιούνται τόσο σε αυτόματες, όσο και σε χειρονακτικές 153

155 μεθόδους, ενώ αντίθετα τα φθορισμογόνα υποστρώματα χρησιμοποιούνται αποκλειστικά πλέον σε αυτόματους αναλυτές. Η επιλογή κάθε ενζύμου και υποστρώματος γίνεται με βάση την προσδοκώμενη ευαισθησία, επαναληψιμότητα, ταχύτητα αντίδρασης, τυχόν παρεμβολές στην αναλυτική μέθοδο και άλλα κ.α. Για παράδειγμα τα φθορισμογόνα υποστρώματα εξασφαλίζουν μεγαλύτερη ευαισθησία από τα χρωμογόνα. Η υπεροξειδάση απαιτεί μικρότερη επώαση από τα άλλα δύο ένζυμα, ενώ η αλκαλική φωσφατάση και η β- γαλακτοσιδάση εξασφαλίζουν καλύτερη επαναληψιμότητα, μετά από μεγάλο χρόνο επώασης. Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι μπορεί να είναι ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές, ομογενείς ή ετερογενείς. Ειδικότερα εδώ θα αναφερθούμε στις ετερογενείς μεθόδους σε αυτές δηλαδή, που ένα από τα αντισώματα του αντιγόνου είναι κολλημένο πάνω σε στερεή επιφάνεια. Η προσκόλληση αυτή εξασφαλίζεται με τις παρακάτω μεθόδους (Ternynck & Avrameas, 1988): 1. Ένωση αντισώματος με πλαστική επιφάνεια. Γίνεται με ηλεκτροστατικές και κυρίως υδρόφοβες δυνάμεις. Είναι η πιο συνηθισμένη περίπτωση, αφού χρησιμοποιείται στα «πηγαδάκια» των πλακών ELISA. 2. Ένωση αντισώματος με μαγνητικά σφαιρίδια. Γίνεται με ηλεκτροστατικές δυνάμεις. Xρησιμοποιείται σε αυτόματες μεθόδους χημειοφωταύγειας κ.α. 3. Ένωση αντισώματος με σφαιρίδια πολυακρυλαμίδης, κυτταρίνης, αγαρόζης. Γίνεται με χημικό δεσμό και χρησιμοποιείται σε αυτόματες μεθόδους. 4. Ένωση αντισώματος με γυάλινα σωληνάρια. Γίνεται με ηλεκτροστατικές δυνάμεις, αλλά δεν χρησιμοποιείται ιδιαίτερα σε αντιδραστήρια IVDs. Η ένωση αντιγόνου αντισώματος γίνεται εύκολα λόγω της χημικής συγγένειας των δύο μορίων. Αντίθετα, η ένωση ενζύμου - υποστρώματος απαιτεί συγκεκριμένες χημικές συζεύξεις, δηλαδή χημικές γέφυρες. Οι συζεύξεις αυτές άλλοτε εξασφαλίζουν απλά τη σταθερή ένωση ενζύμου και αντισώματος και άλλοτε ενισχύουν σημαντικά το παραγόμενο σήμα. Αυτές οι συζεύξεις γίνονται με (Λιβανίου, 1998): Υπεριωδικό νάτριο. Χρησιμοποιείται αποκλειστικά για τη σύζευξη της υπεροξειδάσης με αντισώματα μέσω της υδατανθρακικής περιοχής του αντισώματος και της υπεροξειδάσης. Επειδή η υδατανθρακική περιοχή δεν συμμετέχει συνήθως στην ένωση ενζύμου και αντισώματος δεν επηρεάζεται η ενζυμική δραστικότητα. Γλουταλδεύδη. Εξασφαλίζει τη διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ ενζύμου και αντισώματος μέσω των ελεύθερων ε-αμινομάδων της λυσίνης. Σύμπλεγμα αβιδίνης βιοτίνης και στρεπταβιδίνης - βιοτίνης. Η βιοτίνη είναι μία μικρή πρωτεΐνη (ΜΒ = 244 D) που ανήκει στη κατηγορία των βιταμινών (βιταμίνες Η, Β7). Βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές μεταβολικές διαδικασίες. Η βιοτίνη μπορεί να ενωθεί με πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες μεταξύ των οποίων ένζυμα και αντισώματα, δημιουργώντας μεταξύ τους μία γέφυρα ανάμεσα στο ένζυμο και το αντίσωμα. Λόγω μεγέθους όμως, μπορεί να ενωθεί είτε με το ένα, είτε με το άλλο. Για να επιτελέσει επομένως τον ρόλο της χρειάζεται ένα ακόμα ενδιάμεσο μόριο. Αυτό μπορεί να είναι είτε η αβιδίνη, είτε η στρεπταβιδίνη. Η αβιδίνη είναι ένα μόριο με 4 ενεργά κέντρα (ΜΒ περίπου D) με τα οποία μπορεί να αντιδράσει με τη βιοτίνη, αλλά και πολλές άλλες πρωτεΐνες με μη ειδικό τρόπο (Σχήμα 6.8). Βρίσκεται σε πολλά κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές μεταβολικές διαδικασίες. Στην εργαστηριακή τεχνολογία χρησιμοποιείται για την ένωσή της με το μόριο της βιοτίνης, όχι όμως με τόσο ισχυρή χημική συγγένεια, όπως συμβαίνει με το μόριο της στρεπταβιδίνης. Πλεονεκτεί από τη στρεπταβιδίνη στο ότι παράγεται εύκολα από αυγά κότας. Η στρεπταβιδίνη παρόμοια με την αβιδίνη είναι ένα τετραμερές μόριο μοριακού βάρους D. Σε αντίθεση με την αβιδίνη επιτυγχάνει ειδική σύνδεση με τη βιοτίνη λόγω της διαφορετικής αμινοξικής της ακολουθίας. Η παραγωγή της όμως, είναι δυσκολότερη και μεγαλύτερου κόστους, αφού προέρχεται από τον Streptomyces avidinii. 154

156 Σχήμα 6.8 Αναπαράσταση της ένωσης των συμπλεγμάτων βιοτίνης αβιδίνης και βιοτίνης στρεπταβιδίνης. Τα δύο αυτά συμπλέγματα έχουν τη δυνατότητα να ενώνονται με πολλά ένζυμα αυξάνοντας έτσι σημαντικά το παραγόμενο σήμα Βασικά αντιδραστήρια και αναλώσιμα που περιέχονται στα kits της ELISA 1. Πηγαδάκια μικροτιτλοδότησης: Πρόκειται για πλαστική πλάκα που περιέχει 96 μικροπηγαδάκια (microwells) και είναι επικαλυμμένα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να μετρήσουμε. Ο όγκος των αντιδραστηρίων που μπορούν να χωρέσουν, είναι περίπου 300 μl (Σχήμα 6.9). Διατηρούνται στο ψυγείο και σε κάποιες περιπτώσεις και σε θερμοκρασία δωματίου. Σε κάθε όμως περίπτωση είναι απαραίτητο να παραμείνουν σε στεγνό περιβάλλον, αφού η αυξημένη θερμοκρασία θα αλλοιώσει τα προσκολλημένα σε αυτά αντισώματα. 2. Βαθμονομητές (standards ή calibrators). Για τους ποσοτικούς προσδιορισμούς χρησιμοποιούνται πολλά standards, συνήθως 1 έως 6. Πρόκειται για μικρά φιαλίδια του 1 ml έτοιμα προς χρήση. Χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία της καμπύλης αναφοράς (calibration). 3. Διαλύματα ελέγχου (control samples). Πρόκειται για μικρά φιαλίδια συνήθως των 0,5 ml με διαφορετικού χρώματος καπάκια για να ξεχωρίζουν. 4. Σύζευγμα ενζύμου (conjugate). Περιέχει αντίσωμα ενωμένο με ένζυμο. Eίναι έτοιμο προς χρήση. 5. Υπόστρωμα (substrate). Είναι η ουσία που θα αντιδράσει με το ένζυμο του conjugate. Αυτή η χημική αντίδραση θα παράγει χρώμα του οποίου η ένταση θα μετρηθεί στο φωτόμετρο. 6. Διάλυμα τερματισμού της αντίδρασης (stop solution). Πρόκειται για ένα ισχυρό οξύ (H 2SO 4), που χρησιμεύει για τη διακοπή της αντίδρασης ενζύμου και υποστρώματος. Αμέσως μετά μπορεί να γίνει η φωτομέτρηση. 7. Διάλυμα πλύσης (wash solution). Πρόκειται για ένα συμπυκνωμένο διάλυμα (π.χ. 40Χ), το οποίο πρέπει να αραιωθεί πριν τη χρήση του με απεσταγμένο νερό. Παρόλα αυτά διατηρείται στο ψυγείο για περιορισμένο χρονικό διάστημα. Συνηθισμένα απορρυπαντικά είναι τα BND (5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο) και το ΜΙΤ (2-μεθυλ-4-ισοθειαζολ-3-όνη). Σχήμα 6.9 Πλάκα μικροτιτλοδότησης της ELISA. Όλες οι πλάκες έχουν από 96 πηγαδάκια. 155

157 6.4.2 Υλικά και Εξοπλισμός που δεν παρέχονται με τα kits To εργαστήριο που εκτελεί μεθόδους ELISA χρειάζεται εξοπλισμό αναλωσίμων και ηλεκτρονικών συσκευών. Σήμερα στην αγορά κυκλοφορούν αυτόματοι αναλυτές ELISA, που μπορούν να εξυπηρετήσουν ταυτόχρονα από δύο έως πολύ περισσότερες πλάκες ELISA (Φωτογραφία 6.1). Μπορούν να πραγματοποιήσουν όλα τα στάδια, όπως προαραίωση δειγμάτων, τοποθέτηση δειγμάτων και αντιδραστηρίων, πλυσίματα, φωτομέτρηση και αυτόματο υπολογισμό των συγκεντρώσεων. Απευθύνονται όμως σε εργαστήρια που έχουν μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Φωτογραφία 6.1 Αυτόματοι αναλυτές ELISA διαφόρων εταιρειών (Human, Menarini, Biobase). Kάθε αναλυτής μπορεί να τρέχει τουλάχιστον δύο πλάκες ELISA ταυτόχρονα. Η ELISA είναι μία μέθοδος που με λίγα σχετικά όργανα μπορεί να «τρέξει» σε μικρό διαγνωστικό εργαστήριο, ερευνητικό ίδρυμα, ακόμα και σε εκπαιδευτικό. Απαραίτητα όργανα Μονή πιπέττα ενός ή ρυθμιζόμενου όγκου Διηθητικό χαρτί για το τίναγμα των πλακών ELISA Φωτόμετρο ELISA Προαιρετικά όργανα Αυτόματη πλυστική συσκευή Πιπέττα 8 ή 12 καναλιών Θάλαμο υγρασίας (όπου χρειάζεται) Πλαστικό κάλυμμα για την αποφυγή εξάτμισης (όπου χρειάζεται) Πίνακας 6.5 Βασικός και προαιρετικός εξοπλισμός για την εκτέλεση της μεθόδου ELISA Τα βασικά στάδια της μεθοδολογίας ELISA Παρακάτω θα περιγραφούν τα στάδια μιας τυπικής ELISA δύο σταδίων (Σχήμα 6.3). Η ΕLISA δύο σταδίων, σε αντίθεση με την ταχύτερη ELISA ενός σταδίου, περιλαμβάνει στάδια επώασης και πλύσης πριν την τοποθέτηση του συνδέτη. Αυτό εξασφαλίζει την απομάκρυνση ουσιών, που μπορεί να προκαλέσουν παρεμβολές στις ανοσοχημικές μεθόδους (βλ. στο τέλος του Κεφαλαίου). Το μειονέκτημα της είναι ότι απαιτεί μεγαλύτερο χρόνο επώασης από την ELISA ενός σταδίου και για αυτό επιλέγεται όπου πραγματικά χρειάζεται καλό πλύσιμο και διαχωρισμός ουσιών. 1. Απόψυξη των αντιδραστηρίων (Φωτογραφία 6.2). Δείγματα, υλικά αναφοράς, υλικά ελέγχου, αντιδραστήρια και πλάκες μικροτιτλοδότησης πρέπει να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου, πριν τη χρήση τους. Χωρίς αυτήν, μπορεί να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. 156

158 Φωτογραφία 6.2 Ένα τυπικό kit ELISA (της εταιρείας ReQuest). Φαίνεται η πλάκα μικροτιτλοδότησης ή πλάκα ELISA, τα διαλύματα των conjugate, stop, wash, enzyme και substrate, καθώς και τα μικρά σωληνάρια των controls και των calibrators. 2. Τοποθέτηση βαθμονομητών. Κατά κανόνα εισάγονται 100 μl ή και 50 μl σε κάθε πηγαδάκι. Η απόρριψη από την αυτόματη πιπέττα γίνεται προσεκτικά στα τοιχώματα του πηγαδιού, χωρίς να σχηματίζονται φυσαλίδες (Σχήμα 6.10). Οι βαθμονομητές μπαίνουν πάντα εις διπλούν, ξεκινώντας από τον βαθμονομητή με τη μεγαλύτερη ή μικρότερη συγκέντρωση και προχωρώντας στη συνέχεια κατά αύξουσα ή φθίνουσα σειρά αντίστοιχα. Σχήμα 6.10 Η σωστή απόρριψη δείγματος και αντιδραστηρίων μέσα στα πηγαδάκια της πλάκας ELISA. 3. Tοποθέτηση δειγμάτων ελέγχου. Τοποθετούνται 100 μl ή 50 μl σε κάθε πηγαδάκι και σε κάθε περίπτωση σε ίση ποσότητα με τα δείγματα. Υπάρχει θετικό και αρνητικό δείγμα ελέγχου καθένα από τα οποία έχει όρια ελέγχου, τα οποία δεν πρέπει να παραβιαστούν από τη συγκέντρωση των δειγμάτων ελέγχου που θα υπολογιστούν στην πορεία. Προτείνεται τα δείγματα ελέγχου και τα δείγματα των ασθενών να τοποθετούνται εις διπλούν. 4. Τοποθέτηση δειγμάτων. Τοποθετούνται 100 μl ή 50 μl δείγματος ασθενών σε κάθε πηγαδάκι. Αν και είναι ασφαλέστερο να τοποθετούνται επίσης εις διπλούν συνηθίζεται να μπαίνουν και μονά δείγματα. Σε πολλές περιπτώσεις τα δείγματα πρέπει να αραιωθούν πρώτα με κατάλληλο διαλύτη. Αυτό όμως δεν είναι απαραίτητο για τους βαθμονομητές και τα δείγματα ελέγχου. 5. Επώαση. Σε αυτό το στάδιο, η επώαση απαιτείται για την πρόσδεση των αντιγόνων (βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου, δειγμάτων ασθενών) στα αντισώματα που είναι ακινητοποιημένα στον πυθμένα. Γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος ποικίλει ανάλογα με το kit. Σε πολλά kits αυτή η επώαση παραλείπεται. 6. Έκπλυση. Αποσκοπεί στην απομάκρυνση των αντιγόνων που δεν προσδέθηκαν και γενικά όλων των συστατικών των δειγμάτων, που δεν χρειάζονται για τις περαιτέρω αντιδράσεις. Γίνεται με ειδικό απορρυπαντικό που έχει παρασκευαστεί σε κατάλληλη ποσότητα, πριν τη χρήση. Κατά την πλύση τοποθετούνται

159 μl wash σε κάθε πηγαδάκι. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται τουλάχιστον 3 φορές. Το πλύσιμο μπορεί να γίνει με αυτόματο μηχάνημα εκπλύσεως για ELISA (Φωτογραφία 6.3) ή χειρονακτικά χρησιμοποιώντας απλή, ηλεκτρονική ή οκτακάναλη πιπέττα (Σχήμα 6.11). Στο τέλος των πλυσιμάτων τα πηγαδάκια αποστραγγίζονται για να μην έχουν υλικό ή φυσαλίδες. Φωτογραφία 6.3 Αυτόματα πλυστικά ELISA διαφόρων εταιρειών (Biotek, Thermo). Αν και η έκπλυση των πλακών ELISA μπορεί να γίνει και χειρονακτικά με τη βοήθεια οκτακάναλης πιπέττας, το αυτόματο πλύσιμο είναι γρήγορο και αποτελεσματικό. Σχήμα 6.11 Τύποι πιπεττών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμασίες ELISA. Πιπέττες με ένα, οκτώ ακόμα και με δώδεκα ρύγχη μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν. 7. Τοποθέτηση συνδέτη. Τοποθετείται σε όλα τα πηγαδάκια ίση ποσότητα. Συνήθως τοποθετούνται 100 μl αλλά κάθε kit έχει δικές του οδηγίες. Σε πολλά kits o συνδέτης ενώνεται απευθείας με τα αντιγόνα, χωρίς να προηγείται αραίωση ή πλύση. 8. Επώαση. Γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος ποικίλει ανάλογα με το kit. Συνήθως η επώαση αυτή καταναλώνει το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, περίπου μία ώρα με ανοχή ± 5 λεπτά. 9. Έκπλυση. Γίνεται με ειδικό απορρυπαντικό, που έχει παρασκευαστεί σε κατάλληλη ποσότητα πριν τη χρήση. 10. Τοποθέτηση υποστρώματος. Τοποθετείται σε όλα τα πηγαδάκια ίση ποσότητα. Συνήθως τοποθετούνται 100 μl. Μόλις τοποθετηθεί το υπόστρωμα αρχίζουν τα δείγματα βαθμονομητών, ελέγχου και ασθενών να αλλάζουν χρώμα. Η ύπαρξη χρώματος είναι ενδεικτική θετικής αντίδρασης. 11. Επώαση. Γίνεται συνήθως σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος ποικίλει ανάλογα με το kit. Συνήθως είναι ο μικρότερος χρόνος σε διάρκεια. Αν το υπόστρωμα είναι το TMB (τρι-μεθυλο-βενζιδίνη), τότε η επώαση θα πρέπει να γίνει στο σκοτάδι. 12. Τοποθέτηση διαλύματος τερματισμού. Τοποθετείται αμέσως μετά το υπόστρωμα χωρίς ενδιάμεσο πλύσιμο. Τοποθετείται σε όλα τα πηγαδάκια ίση ποσότητα (100 μl). Μόλις τοποθετηθεί το διάλυμα τερματισμού στα πηγαδάκια, αυτά παίρνουν το τελικό τους χρώμα. 13. Υπολογισμός των απορροφήσεων. Ο προσδιορισμός γίνεται σε ειδικό φωτόμετρο για πλάκες ELISA (Φωτογραφία 6.4). Συνιστάται να γίνεται σε δύο μήκη κύματος, για να εξαλείφονται τυχόν παρεμβολές στο χρώμα από αιμοσφαιρίνη, χολερυθρίνη κ.α. Το τελικό χρώμα παραμένει σταθερό συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, που συνήθως παρατείνεται εάν διατηρηθούν στο ψυγείο. 158

160 Φωτογραφία 6.4 Φωτόμετρα για πλάκες ELISA. Διαδοχικά μοντέλα της ίδιας εταιρείας (Stat Fax), που δείχνουν και την εξέλιξη του αυτοματισμού (διαδοχικά τα μοντέλα 303+, 2100, 4300, 4400). 14. Ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων των δειγμάτων και των controls γίνεται υπολογιστικά μετά την κατασκευή πρότυπης καμπύλης. Η καμπύλη είναι σιγμοειδής ή γραμμική και οι υπολογισμοί των συγκεντρώσεων των δειγμάτων και των controls μπορούν να γίνουν είτε με γραφικό, είτε με μαθηματικό τρόπο. 6.5 Εργαστηριακό μέρος Παραδείγματα Ανταγωνιστικής και μη Ανταγωνιστικής ELISA Η ανταγωνιστική και η μη ανταγωνιστική ELISA δεν διαφέρουν τόσο στα στάδια της ανάλυσης, όσο στην φιλοσοφία τους που αντικατοπτρίζεται και στους υπολογισμούς μετατροπής της απορρόφησης σε συγκέντρωση. Η βασική πορεία εργασίας για τις μεθόδους ELISA είναι περίπου η ίδια για ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές μεθόδους. Σε αυτό το κεφάλαιο, θα δούμε δύο παραδείγματα από ανταγωνιστική και μη ανταγωνιστική ELISA από εμπορικά kit της διεθνούς αγοράς Ο προσδιορισμός της FT3 με ELISA H oρμόνη FΤ 3 προσδιορίζεται ευρέως σε νοσήματα του θυροειδούς. Οι τιμές αναφοράς της είναι 1,4 4,2 pg/ml. Έχει μοριακό βάρος 651 D. Είναι δηλαδή μια εξαιρετικά μικρή πρωτεΐνη. Προσδιορίζεται με ανταγωνιστική μέθοδο, αφού δεν διαθέτει πάνω από ένα επίτοπο για να συνδέεται με αντισώματα anti-ft 3. Για το παράδειγμα, επιλέχτηκε το αντιδραστήριο FΤ 3 της Leico technologies. Ο κατασκευαστής του ακολουθεί διαδικασία ανάλυσης παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε, με την επισήμανση ότι τοποθετούνται από 50 μl δείγματος και το διάλυμα του συνδέτη μπαίνει αμέσως μετά τα δείγματα χωρίς επώαση. Είναι δηλαδή ELISA ενός σταδίου. Χρησιμοποιεί 6 βαθμονομητές με συγκεντρώσεις 0, 0,6, 1,3, 4, 8 και 16 pg/ml. H ποιότητα της ανάλυσης ελέγχεται με δύο δείγματα ελέγχου, ένα με χαμηλή συγκέντρωση, εύρους 0,5 0,8 pg/ml (Low control) και ένα με υψηλή συγκέντρωση εύρους 8,4 12,4 pg/ml (High control). Τα προσκολλημένα αντισώματα προέρχονται από εμβολιασμό προβάτου, το ένζυμο είναι το HRP και το υπόστρωμα το TMB. Στο παράδειγμα που περιγράφουμε όλα τα δείγματα μπαίνουν εις διπλούν. Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στις δοκιμασίες ELISA, αφού δεν ιδιαίτερα επαναλήψιμες. Στην αρχή μπαίνουν οι βαθμονομητές, ακολουθεί το «χαμηλό» και μετά το «υψηλό» δείγμα ελέγχου και κατόπιν με τη σειρά τα δείγματα (Πίνακας 6.6). 159

161 Cal 1 Cal 5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts 21 Pts Cal 1 Cal 5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts 21 Pts Cal 2 Cal 6 Pts 2 Pts 6 Pts 10 Pts 14 Pts 18 Pts 22 Pts Cal 2 Cal 6 Pts 2 Pts 6 Pts 10 Pts 14 Pts 18 Pts 22 Pts Cal 3 Low Ctrl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts 23 Pts Cal 3 Low Ctrl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts 23 Pts Cal 4 High Ctrl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts 24 Pts Cal 4 High Ctrl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts 24 Pts Πίνακας 6.6 Πίνακας δειγμάτων που έχουν τοποθετηθεί στα πηγαδάκια της ELISA για τον προσδιορισμό της FT 3. Το υπόστρωμα TMB που χρησιμοποιείται στην ανάλυση παράγει μπλε χρώμα, που μετατρέπεται σε κίτρινο μετά την προσθήκη του διαλύματος τερματισμού (Σχήμα 6.12). Η απορρόφηση του τελικού διαλύματος μετριέται στα 450 nm. Η πλάκα φωτομετρήθηκε σε ειδικό φωτόμετρο για πλάκες ELISA (Φωτογραφία 6.4) και υπολογίστηκαν οι τιμές των απορροφήσεων (Πίνακας 6.7). Ως ανταγωνιστική μέθοδος η απορρόφηση μειώνεται, όσο αυξάνει η συγκέντρωση. Σχήμα 6.12 Οι χρωματικές αποχρώσεις μιας πλάκας ELISA μετά από την εκτέλεση ενός ανταγωνιστικού προσδιορισμού. Φαίνονται οι χρωματικές διαβαθμίσεις των βαθμονομητών και των δειγμάτων ελέγχου στις στήλες 1 και 2. Τα υπόλοιπα είναι δείγματα ασθενών που έχουν «τρέξει» εις διπλούν. 2,063 0,558 0,645 0,895 2,012 2,145 3,021 0,125 1, ,138 0,589 0,652 0,875 2,211 2,156 2,365 0,225 1, ,815 0,335 0,336 0,521 1,856 0,541 0,546 0,356 0, ,866 0,345 0,315 0,546 1,825 0,523 0,321 0,346 0, ,546 1,513 0,241 0,658 1,652 0,348 0,254 0,875 0, ,595 1,521 0,223 0,689 1,645 0,356 0,299 0,888 0, ,983 0,547 1,925 0,921 0,752 1,854 0,221 0,658 0, ,968 0,543 1,9 0,912 0,745 1,865 0,102 0,653 0, Πίνακας 6.7 Πίνακας υποθετικών τιμών απορρόφησης σε ανταγωνιστική μέθοδο. Oι μηδενικές τιμές αντιπροσωπεύουν την έλλειψη δείγματος σε αυτές τις θέσεις. 160

162 Βαθμονομητής Συγκέντρωση βαθμονομητή A 1 A 2 Μέση τιμή Α1, Α2 CV% A i/a 0% Cal 1 0 2,063 2,138 2,15 2,5 100 Cal 2 0,6 1,815 1,866 1,84 2,0 88 Cal 3 1,3 1,546 1,595 1,57 2,2 75 Cal 4 4 0,983 0,968 0,98 1,1 46 Cal 5 8 0,558 0,589 0,57 3,8 27 Cal ,335 0,345 0,34 2,1 16 Πίνακας 6.8 Oι τιμές συγκεντρώσεων των βαθμονομητών και των αντίστοιχων απορροφήσεων καθώς και ο υπολογισμός του λόγου Α i/α 0% στις ανταγωνιστικές μεθόδους. Χρησιμοποιώντας τις τιμές συγκέντρωσης και απορρόφησης των βαθμονομητών (Πίνακας 6.8) κατασκευάζεται η καμπύλη αναφοράς. Σχεδιάζεται για αυτό σύστημα αξόνων, όπου στον οριζόντιο άξονα τοποθετούνται οι τιμές των βαθμονομητών και στον κάθετο άξονα o λόγος %Α i/α ο. Ο λόγος αυτός εκφράζει τη μείωση της απορρόφησης σε σχέση με την απορρόφηση του μηδενικού βαθμονομητή (Cal 1) (Σχήμα 6.13). %Α i /A o = Α i Α o x100% (Εξίσωση 6.1) H τιμή A i είναι η τιμή απορρρόφησης κάθε βαθμονομητή, δείγματος ελέγχου ή ασθενούς. Στη περίπτωση όμως που χρησιμοποιούνται διπλά δείγματα, τότε η τιμή Α i είναι η μέση τιμή των δύο δειγμάτων. Τα φωτόμετρα ELISA μπορούν να προγραμματιστούν να μετρούν μονά ή διπλά δείγματα και να υπολογίζουν αυτόματα τις μέσες τιμές. Η τιμή Α ο είναι η απορρόφηση του μηδενικού βαθμονομητή, είτε η μέση τιμή των δύο μηδενικών βαθμονομητών. Σχήμα 6.13 Καμπύλη αναφοράς σε ανταγωνιστική μέθοδο. Κανονικά είναι πολυωνυμική καμπύλη, η οποία όμως μετατρέπεται συνήθως σε γραμμική μετά από λογαριθμοποίηση του ενός άξονα Η κατασκευή της Καμπύλης Αναφοράς Ανεξάρτητα από το αν το εργαστήριο θα «τρέξει» διπλά δείγματα ελέγχου ή ασθενών, οι βαθμονομητές «μπαίνουν» πάντα δύο φορές. Κατά συνέπεια, οι τιμές απορρόφησης που χρησιμοποιούνται στη κατασκευή της καμπύλης αναφοράς είναι οι μέσες τιμές των δύο απορροφήσεων κάθε βαθμονομητή. Ο λόγος που «τρέχουν» 161

163 διπλοί βαθμονομητές είναι για να μπορεί να ελεγχθεί η εγκυρότητα τους. Έτσι δεν θα πρέπει οι δύο τιμές να διαφέρουν πολύ μεταξύ τους. Το μέτρο της διαφοράς τους είναι ο συντελεστής μεταβλητότητας (CV%) ο οποίος δεν πρέπει να υπερβεί ένα συγκεκριμένο ποσοστό π.χ. 10%. Εάν οι απορροφήσεις ενός βαθμονομητή διαφέρουν πάνω από 10%, τότε θα πρέπει να αφαιρεθεί η απορρόφηση που είναι φανερό ότι δεν ταιριάζει με τις γειτονικές της. Η δυνατότητα αυτή υπάρχει σε όλα τα φωτόμετρα ELISA, πολύ δε περισσότερο αν χρησιμοποιηθεί λογιστικό φύλλο. Στο παράδειγμα μας, η καμπύλη αναφοράς έχει σχεδιαστεί σε λογιστικό φύλλο (Excel) (Σχήμα 6.14) και χαρακτηρίζεται ως πολυωνυμική. Η εξίσωση βαθμονόμησης έχει υπολογιστεί αυτόματα από το λογιστικό φύλλο και φαίνεται πάνω στο σχήμα της καμπύλης μαζί με τον συντελεστή συσχέτισης R 2. Ο συντελεστής συσχέτισης R 2 δείχνει τη συσχέτιση μεταξύ των δύο μεγεθών, της συγκέντρωσης και της απορρόφησης. Τιμές R 2 κοντά στη μονάδα (R 2 1) θεωρούνται ικανοποιητικές. Οι πολυωνυμική εξίσωση επιλύεται όμως δύσκολα. Για τον λόγο αυτό προτιμάται η μετατροπή της σε γραμμική. Η μετατροπή γίνεται με τη λογαριθμοποίηση (δεκαδικός λογάριθμος) των συγκεντρώσεων. Η γραμμική εξίσωση είναι απλούστερη εξίσωση, στην οποία η συγκέντρωση υπολογίζεται ως ακολούθως: y = αx + b (Εξίσωση 1.14) ή Α 1/Α ο = α log 10([FT 3]) + b (Εξίσωση 6.2) Σχήμα 6.14 Μετατροπή πολυωνυμικής σε γραμμική εξίσωση αναφοράς, μετά από τη λογαριθμοποίηση του οριζόντιου άξονα των συγκεντρώσεων. Σύμφωνα με την εξίσωση 6.3 και το αντίστοιχο διάγραμμα (Σχήμα 6.14) στον οριζόντιο άξονα βρίσκεται ο δεκαδικός λογάριθμος της συγκέντρωσης του FT 3 και στον κάθετο άξονα ο λόγος A 1/A ο. Ο άγνωστος στην προηγούμενη εξίσωση είναι ο log 10([FT 3]) ο οποίος ισούται με: log 10([FT 3]) = ((Α 1/Α ο) b)/a (Εξίσωση 6.3) Η συγκέντρωση του FT 3 υπολογίζεται από τη μετατροπή του λογάριθμου σε ακέραιο. Aν log 10([FT 3]) = D τότε [FT 3] = 10 D (Εξίσωση 6.4) H αξιολόγηση των Τιμών Απορρόφησης Οι τιμές απορρόφησης αξιολογούνται, με βάση τους παρακάτω κανόνες: 162

164 Καμιά τιμή συγκέντρωσης ασθενούς δεν μπορεί να δοθεί, εάν οι τιμές των δειγμάτων ελέγχου δεν βρίσκονται μέσα στα προβλεπόμενα όρια. Μειονέκτημα των αναλύσεων ELISA είναι ότι τα δείγματα ελέγχου «τρέχουν» μαζί μ εκείνα των ασθενών και σε περίπτωση αστοχίας τους δεν υπάρχει η δυνατότητα να γίνουν επιδιορθωτικές ενέργειες, πριν «τρέξουν» τα δείγματα. Δεν πρέπει οι τιμές των δύο απορροφήσεων να έχουν μεγάλη διαφορά μεταξύ τους, δηλαδή μεγάλη διασπορά. Συνήθως οι κατασκευαστές των kit αναφέρουν μέχρι πόσο επιτρέπεται να είναι αυτή η διαφορά π.χ. ο συντελεστής μεταβλητότητας των δύο τιμών να μην υπερβαίνει το 10%. Φυσικά για να γίνει αυτός ο έλεγχος θα πρέπει τα δείγματα να «μπαίνουν» διπλά. Αν αυτό γίνεται μόνο για τους βαθμολογητές, ο έλεγχος περιορίζεται σε αυτούς. Εάν οι απορροφήσεις ενός βαθμονομητή διαφέρουν υπερβολικά μεταξύ τους, τότε θα πρέπει να αφαιρεθεί η απορρόφηση που είναι φανερό ότι δεν ταιριάζει με τις γειτονικές της και η καμπύλη να ξαναυπολογιστεί. Εάν αυτό όμως συμβεί σε δείγματα ελέγχου και ασθενών, τότε θα πρέπει να αξιολογηθεί η διαφορά με γνώμονα την κλινική σημασία του αποτελέσματος. Κάθε μεθοδολογία ELISA έχει ένα συγκεκριμένο εύρος μέτρησης, που ξεκινά από την τιμή ποσοτικοποίησης και φτάνει μέχρι το όριο γραμμικότητας. Τιμές συγκέντρωσης μικρότερες από την τιμή ποσοτικοποίησης (βλ. Κεφάλαιο 1 και 9) δίνονται απλά μικρότερες από αυτήν και τιμές συγκέντρωσης μεγαλύτερες από το όριο γραμμικότητας δεν δίνονται καθόλου. Στη τελευταία περίπτωση γίνεται αραίωση του δείγματος και νέα μέτρηση. Το τελικό αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί τον συντελεστή αραίωσης. Στο παράδειγμα της FT 3 της συγκεκριμένης εταιρείας το εύρος μέτρησης ξεκινά από την τιμή του μηδενικού βαθμονομητή και εκτείνεται λίγο πάνω από την τιμή του τελευταίου βαθμομονητή (18 pg/ml). Tιμές απορρόφησης μικρότερες από το όριο ποσοτικοποίησης ή μεγαλύτερες από το όριο γραμμικότητας (βλ. Κεφάλαιο 9) δεν χρησιμοποιούνται στον υπολογισμό της συγκέντρωσης των δειγμάτων των ασθενών. Όταν η συγκέντρωση ενός δείγματος υπολογίζεται μεγαλύτερη από το όριο γραμμικότητας, τότε θα πρέπει το δείγμα αυτό να αραιωθεί και να γίνει νέος προσδιορισμός. Σύμφωνα με τα παραπάνω πριν την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (Πίνακας 6.8) θα πρέπει να γίνει αξιολόγηση των απορροφήσεων (Πίνακας 6.7) για το αν η καμπύλη αναφοράς είναι έγκυρη. Φαίνεται λοιπόν, ότι η διασπορά των απορροφήσεων είναι αποδεκτή (CV%<10%) αλλά και ότι μειώνονται με προβλεπόμενο τρόπο από την αρχική τους μέγιστη τιμή. Κατά συνέπεια, η ανάλυση μπορεί να προχωρήσει στο επόμενο στάδιο, δηλαδή στον σχεδιασμό της καμπύλης αναφοράς και στον υπολογισμό της εξίσωσης αναφοράς (Εξισώσεις 1.14, 6.2). Τα αποτελέσματα που υπολογίζονται από τις εξισώσεις 6.3 και 6.4 περιλαμβάνουν και τιμές ασθενών που δεν μπορούν να δοθούν (Πίνακας 6.9). Π.χ. ο ασθενής 3 (Pts = 3) έχει τιμή συγκέντρωσης πάνω από το όριο γραμμικότητας. Ο ασθενής αυτός θα λάβει τιμή > 18 pg/ml. Το ίδιο θα συνέβαινε και για τους ασθενείς 20, 21 και 28, εάν δεν είχαν μεγάλη διασπορά οι τιμές απορρόφησης τους (CV > 10%). Για αυτούς τους ασθενείς θα πρέπει οι μετρήσεις να επαναληφθούν και το ίδιο θα πρέπει να γίνει και για τους ασθενείς 17 και 18. To δείγμα του ασθενή 3 που ήταν πάνω από το όριο γραμμικότητας θα αραιωθεί και θα γίνει νέα ανάλυση. 163

165 Δείγμα A1 A2 Μέση τιμή Α1, Α2 CV% Ai/A0% Αποτέλεσμα CV% Low C 1,51 1, ,4 72 1,3 0,4 High C 0,55 0, ,5 26 9,7 0,5 Pts 1 0,65 0, ,8 31 7,8 0,8 Pts 2 0,34 0, , ,4 4,6 Pts 3 0,24 0, , ,7 5,5 Pts 4 1,93 1, ,9 91 0,6 0,9 Pts 5 0,90 0, ,6 42 4,8 1,6 Pts 6 0,52 0, , ,0 3,3 Pts 7 0,66 0, ,3 32 7,4 3,3 Pts 8 0,92 0, ,7 44 4,5 0,7 Pts 9 2,01 2, , ,4 6,7 Pts 10 1,86 1, ,2 88 0,7 1,2 Pts 11 1,65 1, ,3 79 1,0 0,3 Pts 12 0,75 0, ,7 36 6,4 0,7 Pts 13 2,15 2, , ,3 0,4 Pts 14 0,54 0, , ,0 2,4 Pts 15 0,35 0, , ,6 1,6 Pts 16 1,85 1, ,4 89 0,6 0,4 Pts 17 3,02 2, , ,1 17,2 Pts 18 0,55 0, , ,3 36,7 Pts 19 0,25 0, , ,1 11,5 Pts 20 0,22 0, ,1 8 21,7 52,1 Pts 21 0,13 0, ,4 8 21,1 40,4 Pts 22 0,36 0, , ,6 2,0 Pts 23 0,88 0, ,0 42 4,8 1,0 Pts 24 0,66 0, ,5 31 7,7 0,5 Pts 25 1,65 1, ,3 78 1,0 1,3 Pts 26 0,58 0, ,1 26 9,6 8,1 Pts 27 0,85 0, ,4 40 5,2 0,4 Pts 28 0,25 0, ,1 9 20,5 48,1 Πίνακας 6.9 Oι τιμές συγκεντρώσεων των ασθενών και των δειγμάτων ελέγχου. Οι γραμμικές καμπύλες αναφοράς έχουν πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία από τις μη γραμμικές, αφού μετατρέπουν το παραγόμενο σήμα του ιχνηθέτη σε συγκέντρωση με αναλογικό τρόπο. Αυτός άλλωστε είναι ο λόγος που μετατρέπεται η πολυωνυμική καμπύλη σε γραμμική (Σχήμα 6.14) Ο Προσδιορισμός της TSH με ELISA O προσδιορισμός της TSH γίνεται με μη ανταγωνιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί το ίδιο ένζυμο και υπόστρωμα με τον προσδιορισμό της FT 3, οπότε η όλη αναλυτική διαδικασία είναι παρόμοια. Δεδομένου ότι 164

166 υπάρχουν πολλές ομοιότητες με το προηγούμενο παράδειγμα, θα επικεντρωθούμε στη καμπύλη αναφοράς και στον υπολογισμό των συγκεντρώσεων των ασθενών. Οι τιμές αναφοράς για την TSH είναι 0,4 4,2 μu/ml. Χρησιμοποιούνται 6 βαθμονομητές με συγκεντρώσεις 0, 0,5, 2, 5, 10, 25 μu/ml και δύο δείγματα ελέγχου, ένα χαμηλού επιπέδου με συγκέντρωση 0,6 1,3 μu/ml και ένα υψηλού επιπέδου με συγκέντρωση 6,4 8,4 μu/ml. Στον Πίνακα 6.10 φαίνεται η σειρά τοποθέτησης βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου και δειγμάτων ασθενών. Στον Πίνακα 6.11 φαίνονται και οι απορροφήσεις όλων των δειγμάτων βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου και δειγμάτων ασθενών (Σχήμα 6.15). Σχήμα 6.15 Οι χρωματικές αποχρώσεις μιας πλάκας ELISA, μετά από την εκτέλεση ενός μη ανταγωνιστικού προσδιορισμού. Όλα τα δείγματα έχουν «τρέξει» εις διπλούν. Cal 1 Cal5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts Cal 1 Cal 5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts Cal 2 Cal 6 Pts 2 Pts 6 Pts 10 Pts 14 Pts 18 Pts Cal 2 Cal 6 Pts 2 Pts 6 Pts 10 Pts 14 Pts 18 Pts Cal 3 Low Cttl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts Cal 3 Low Cttl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts Cal 4 High Ctrl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts Cal 4 High Cttl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts Πίνακας 6.10 Πίνακας δειγμάτων που έχουν τοποθετηθεί στα πηγαδάκια της ELISA σε μη ανταγωνιστικό προσδιορισμό. 0,061 1,412 0,348 0,895 0,426 0,214 2,145 4, ,064 1,426 0,34 0,875 0,421 0,213 2,156 4, ,159 2,684 0,387 0,521 0,521 0,845 0,541 0, ,154 2,726 0,365 0,546 0,546 0,822 0,523 0, ,398 0,280 0,248 0,658 0,658 1,652 0,348 0, ,39 0,274 0,265 0,689 0,689 1,645 0,356 0, ,8 0,923 0,879 0,921 0,921 0,752 1,854 0, ,823 0,921 0,821 0,912 0,912 0,745 1,845 0, Πίνακας 6.11 Πίνακας υποθετικών τιμών απορρόφησης σε ανταγωνιστική ELISA. Για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων θα πρέπει να σχεδιαστεί καμπύλη αναφοράς. Προηγουμένως θα πρέπει να μελετηθούν οι διπλές απορροφήσεις των βαθμονομητών. Παρατηρείστε ότι η 165

167 απορρόφηση Α 2 του βαθμονομητή 5 (Πίνακας 6.12) δεν είναι σωστή για δύο λόγους. Πρώτον, ενώ η αύξηση των απορροφήσεων είναι γραμμική και αναμένεται, με βάση τη συγκέντρωση των βαθμονομητών 3 και 4, ο διπλασιασμός της απορρόφησης του βαθμονομητή 5, η τελευταία είναι πολύ μεγαλύτερη. Το πρόβλημα εντοπίζεται στην πολύ μεγάλη διασπορά των δύο απορροφήσεων του βαθμονομητή 5 (CV% = 29%). Η λύση είναι η αφαίρεση της απορρόφησης Α 2 (2,154), οπότε αντί του μέσου όρου θα χρησιμοποιηθεί μόνο η απορρόφηση Α 1 (1,419). Βαθμονομητής Συγκέντρωση Μέσος Α βαθμονομητή 1 Α 2 όρος CV% Cal 1 0 0,061 0,064 0,06 3,4 Cal 2 0,5 0,159 0,154 0,16 2,3 Cal 3 2 0,398 0,39 0,39 1,4 Cal 4 5 0,8 0,823 0,81 2,0 Cal ,419 2,154 1,783 29,4 Cal ,684 2,726 2,7 1,1 Πίνακας 6.12 Οι συγκεντρώσεις των βαθμονομητών και οι απορροφήσεις τους σε μη ανταγωνιστική ELISA. Από τους Πίνακες 6.10, 6.11 φαίνεται ότι οι βαθμονομητές, τα δείγματα ελέγχου και τα δείγματα ασθενών μπήκαν εις διπλούν, κάτι, που όπως ειπώθηκε είναι επιθυμητό στις αναλύσεις ELISA. Από τον Πίνακα 6.12 σχεδιάζεται η καμπύλη αναφοράς, η οποία τώρα είναι γραμμική (Σχήμα 6.16). Σχήμα 6.16 Η γραμμική καμπύλη αναφοράς στην μη ανταγωνιστική μέθοδο. Η καμπύλη αναφοράς στη μη ανταγωνιστική μέθοδο έχει τη μορφή: y = αx + b (Εξίσωση 1.14) ή Abs = α [TSH] + b (Εξίσωση 6.5) Σύμφωνα με την εξίσωση παλινδρόμησης που υπολόγισε το λογιστικό φύλλο ισχύει: Abs = 0,1047 [TSH] + 0,1833 (Εξίσωση 6.6) ή [TSH] = (Abs 0,1833)/0,1047 (Eξίσωση 6.7) 166

168 Είναι φανερό, ότι οι μη ανταγωνιστικές μέθοδοι έχουν απλούστερες καμπύλες και εξισώσεις αναφοράς. H γραμμική τους σχέση εξασφαλίζει μεγαλύτερη ευαισθησία από τις ανταγωνιστικές μεθόδους. Φυσικά και αυτές οι αναλύσεις έχουν τους ίδιους περιορισμούς με τις ανταγωνιστικές μεθόδους. Όπως και στις ανταγωνιστικές μεθόδους οι τιμές των δειγμάτων ελέγχου (Πίνακας 6.13) θα πρέπει να είναι μέσα στα προβλεπόμενα όρια (όπως εδώ), οι συγκεντρώσεις να μην υπερβαίνουν το εύρος μέτρησης και όταν χρησιμοποιούνται διπλές απορροφήσεις η διασπορά τους (CV%) να μην υπερβαίνει ένα συγκεκριμένο όριο (π.χ. 10%). Κατόπιν όλων αυτών αποτελεί παράδοξο η συγκέντρωση του ασθενούς 20 του οποίου οι δύο απορροφήσεις έχουν μεγάλη διαφορά μεταξύ τους (CV = 52%). Κανονικά η ανάλυση του δείγματος αυτού πρέπει να επαναληφθεί, αλλά επειδή και οι δύο απορροφήσεις είναι πολύ μικρές κάτι τέτοιο θεωρείται φυσιολογικό αφού πρόκειται για απορρροφήσεις κοντά στο τυφλό. Για τον ασθενή αυτόν η τιμή που θα δοθεί είναι συγκέντρωση μικρότερη από το όριο ποσοτικοποίησης (< 0,01 mu/μl). Δείγμα A1 A2 Μέση τιμή CV% Αποτέλεσμα Low Ctrl 0,280 0,274 0,277 1,53 0,89 High Ctrl 0,923 0,921 0,922 0,15 7,06 Pts 1 0,348 0,34 0,6485 1,64 1,53 Pts 2 0,387 0,365 0,3255 4,14 1,84 Pts 3 0,248 0,265 0,232 4,69 0,70 Pts 4 0,879 0,821 2,082 4,82 6,37 Pts 5 0,426 0,421 0,4235 0,83 2,29 Pts 6 0,521 0,546 0,5335 3,31 3,34 Pts 7 0,658 0,689 0,6735 3,25 4,68 Pts 8 0,921 0,912 0,9165 0,69 7,00 Pts 9 0,214 0,213 0,2135 0,33 0,29 Pts 10 0,845 0,822 0,8335 1,95 6,21 Pts 11 1,652 1,645 1,6485 0,30 13,99 Pts 12 0,752 0,745 0,7485 0,66 5,40 Pts 13 2,145 2,156 2,1505 0,36 18,79 Pts 14 0,541 0,523 0,532 2,39 3,33 Pts 15 0,348 0,356 0,352 1,61 1,61 Pts 16 1,854 1,865 1,8595 0,42 16,01 Pts 17 4,154 4,126 4,14 0,48 37,79 Pts 18 0,654 0,632 0,643 2,42 4,39 Pts 19 0,321 0,333 0,327 2,59 1,37 Pts 20 0,221 0,102 0, ,10-0,21 Pts 21 0,387 0,365 0,376 4,14 1,84 Pts 22 0,356 0,346 0,351 2,01 1,60 Pts 23 0,875 0,888 0,8815 1,04 6,67 Pts 24 0,658 0,653 0,6555 0,54 4,51 Πίνακας 6.13 Πίνακας απορροφήσεων και αποτελεσμάτων για τον υπολογισμό της TSH. 167

169 6.6 Παρατηρήσεις και επιπλέον πληροφορίες για τις Καμπύλες Βαθμονόμησης Μονά ή Διπλά δείγματα; Όπως αναφέρθηκε στα προηγούμενα πειράματα, είναι πολύ χρήσιμο τα δείγματα να «τρέχουν» εις διπλούν. Αυτό βοηθά πολύ στην αξιοπιστία των αποτελεσμάτων ELISA. Εάν αυτό δεν μπορεί να γίνει για πρακτικούς ή οικονομικούς λόγους, θα πρέπει τουλάχιστον να τρέχουν εις διπλούν οι βαθμονομητές (Video 6.1) H Διχρωματική Ανάλυση Η προσθήκη του διαλύματος τερματισμού (H 2SO 4) μετατρέπει το τελικό χρώμα των αντιδράσεων σε αποχρώσεις του κίτρινου. Η ένταση του κίτρινου χρώματος μπορεί να δεχτεί παρεμβολές από χημικές ουσίες ίδιου χρώματος π.χ. της χολερυθρίνης. Για τον λόγο αυτό, συνιστάται να μετρώνται δύο διαφορετικές απορροφήσεις με δύο διαφορετικά μήκη κύματος. Συνήθως, εκτός από το μήκος κύματος που συνιστάται για το συγκεκριμένο υπόστρωμα, μετράται και η απορρόφηση στα 650 nm. Σε αυτό το μήκος κύματος απορροφά η χολερυθρίνη και άλλες ουσίες ίδιου χρώματος Άλλοι τρόποι υπολογισμού των Εξισώσεων Αναφοράς Οι εξισώσεις βαθμονόμησης που παρουσιάστηκαν στα δύο προηγούμενα παραδείγματα είναι εξισώσεις παλινδρόμησης (Eνότητα 1.16) (Κουππάρης, 1994). Δεν αποτελούν όμως τον μοναδικό τρόπο υπολογισμού τους. Ένας άλλος τρόπος που προσφέρεται στα φωτόμετρα ELISA είναι η μέθοδος «σημείο προς σημείο» (point to point). Σύμφωνα με αυτή τη μέθοδο τα σημεία της καμπύλης αναφοράς ενώνονται μεταξύ τους με ευθύγραμμα τμήματα κάθε ένα από τα οποία ορίζεται με τη δική του εξίσωση της μορφής y = αx + β (Σχήμα 6.17). Tο φωτόμετρο ανάλογα με την απορρόφηση κάθε δείγματος επιλέγει την κατάλληλη εξίσωση y = αx + β. Προφανώς η μαθητική αυτή μέθοδος δεν μπορεί να εφαρμοστεί στις γραμμικές καμπύλες αναφοράς οι οποίες, ούτως ή άλλως, ορίζονται από μία εξίσωση y = αx + β. Σχήμα 6.17 Καμπύλη αναφοράς τύπου point to point για τον προσδιορισμό της FT 3. Η καμπύλη αναφοράς αποτελείται από πέντε ευθύγραμμα τμήματα που ορίζονται από πέντε εξισώσεις y = ax + b. Πολύ καλύτερες επιλογές από τις εξισώσεις regression και point to point είναι οι καμπύλες spline. H επιλογή spline υπάρχει σε πολλά φωτόμετρα ELISA και πλεονεκτεί στο ότι με τη βοήθεια συνδυασμού 168

170 εξισώσεων η καμπύλη αναφοράς περνά από τη συντομότερη απόσταση μεταξύ των σημείων των βαθμονομητών. Η μέθοδος spline μπορεί να εφαρμοστεί και σε γραμμικές και σε μη γραμμικές καμπύλες αναφοράς. Η κατασκευή των καμπύλων αναφοράς έχει σημαντικό οικονομικό κόστος, λόγω των πολλών βαθμονομητών και αναλύσεων που απαιτούνται στις περισσότερες ανοσοχημικές μεθόδους. Επιπλέον, οι πολλές αναλύσεις που απαιτούν, αυξάνουν την πιθανότητα σφάλματος που σημαίνει νέα καθυστέρηση και κόστος. Για τον λόγο αυτό, πολλοί αυτόματοι ανοσοχημικοί αναλυτές επιλέγουν να ενωματώσουν μέσα στα λογισμικά τους τα αριθμητικά δεδομένα μιας πλήρους καμπύλης (master curve), έτσι ώστε κάθε φορά ο χρήστης του αναλυτή να χρειάζεται μόνο να την προσαρμόζει στις ιδιαιτερότητες της ανάλυσης. Έτσι, αντί της κατασκευής πολύπλοκων σιγμοειδών καμπυλών μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο δύο βαθμονομητές, όπως γίνεται στις γραμμικές καμπύλες αναφοράς. Από τους δύο βαθμονομητές θα παραχθεί ένας μαθηματικός συντελεστής με τον οποίο θα πολλαπλασιάζεται το παραγώμενο σήμα κάθε δείγματος ασθενούς για να γίνει ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του. 6.7 Στοιχεία για τις άλλες Ανοσοχημικές μεθόδους Οι υπόλοιπες ανοσοχημικές μέθοδοι, ραδιοανοσοενζυμικές, χημειοφωταύγειας, ετερογενείς και ομογενείς, αν και έχουν σημαντικές διαφορές από την ELISA, αυτές περιορίζονται στο αναλυτικό στάδιο. Αντίθετα, η δημιουργία των καμπυλών αναφοράς έχει σημαντικές ομοιότητες. Ο ένας άξονας είναι πάντα οι τιμές της συγκέντρωσης των βαθμονομητών και ο άλλος οι τιμές του σήματος (Abs, RLU, cpm). Σε όλες τις ανταγωνιστικές μεθόδους η καμπύλη βαθμονόμησης αυξάνεται σε σχέση με την τιμή του σήματος και σε όλες τις μη ανταγνωνιστικές μεθόδους η καμπύλη μειώνεται. Μέθοδοι όπως regression, point-to-point και spline χρησιμοποιούνται εξίσου Χημειοφωταύγεια Η χημειοφωταύγεια αποτελεί την πλέον διαδεδομένη σήμερα ανοσοχημική μέθοδο (Γρηγόρη 2011 Ζερβού 1998; Νικολού 2000). Η δυνατότητα αυτοματισμού, ο σύντομος χρόνος απόδοσης των αποτελεσμάτων καθώς και η υψηλή ευαισθησία, την καθιστούν πρώτη επιλογή για μεγάλους κατασκευαστικούς οίκους με πολύ γνωστά μοντέλα αναλυτών (Dimension, Cobas, Elecsys, Achitect, Centaur κ.α.). Θα παρουσιαστούν εδώ λίγα στοιχεία για τις σύγχρονες παραλλαγές της βασικής μεθοδολογίας CHIA Έμμεση ή Ενισχυμένη Χημειοφωταύγεια Η έμμεση χημειοφωταύγεια βασίζεται στη παραγωγή φωτός μέσω μίας ενζυμικής αντίδρασης, κάτι που άλλωστε συμβαίνει και στη φύση και συγκεκριμένα στο έντομο της πυγολαμπίδας, η οποία χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα την λουσιφερόλη. Οι αναλυτές χρησιμοποιούν αντίστοιχα την φωσφορική διοξετάνη την οποία αποφωσφορυλιώνουν με την ALP. Μόλις η διοξετάνη χάσει τον φωσφόρο της καθίσταται ασταθής και παράγεται έτσι φως μέχρις ότου εξαντληθεί το υπόστρωμα της ALP. Λουσιφερόλη + ΑΤΡ + Ο 2 Λουσιφεράση,Μg _+2 ADP + CO 2 + hν (Αντίδραση 6.1) Έμμεση χημειοφωταύγεια χρησιμοποιούν οι αναλυτές Immulite της εταιρείας Siemens. Οι αναλυτές χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα τη φωσφορική διοξετάνη, την οποία αποφωσφορυλιώνουν με την αλκαλική φωσφατάση (ALP). Μόλις η διοξετάνη χάσει τον φωσφόρο της καθίσταται ασταθής και παράγονται φωτόνια των οποίων η ενέργεια τους είναι ανάλογη της ποσότητας της φωσφορικής διοξετάνης. Το φως παράγεται συνεχώς μέχρις ότου εξαντληθεί το υπόστρωμα της ALP. Το γεγονός ότι με τη μέθοδο αυτή παράγεται συνεχώς φως επιτρέπoνται πολλαπλές μετρήσεις στο ίδιο δείγμα αυξάνοντας την αξιοπιστία της μεθόδου Η Άμεση/Μικροσωματιδιακή Χημειοφωταύγεια Το φως στην άμεση χημειοφωταύγεια παράγεται απ ευθείας από τον ιχνηθέτη (εστέρας ακριδίνης), χωρίς τη χρήση ενζύμου (Γρηγόρη, 2011). Το γεγονός αυτό συντομεύει τον χρόνο ανάλυσης. Η τεχνολογία αυτή όπως 169

171 τουλάχιστον χρησιμοποιείται από τους αναλυτές Advia Centaur της Siemens χρησιμοποιεί τη διμεθυλική μορφή των εστέρων ακριδίνης. Για την παραγωγή φωτός οι εστέρες ακριδίνης οξειδώνονται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου και η έκλυση φωτός μεγιστοποιείται με τη μετατροπή του περιβάλλοντος από όξινο σε βασικό. Η ταχύτητα των αναλύσεων με τους εστέρες ακριδίνης οφείλεται και στο μέγεθος των εστέρων ακριδίνης που είναι κατά πολύ μικρότεροι από το μόριο της αλκαλικής φωσφατάσης. Κατά συνέπεια δεν εμποδίζονται οι γειτονικές θέσεις δέσμευσης των τμημάτων Fab των αντισωμάτων που είναι δεσμευμένα πάνω στα μαγνητικά μικροσωματίδια. Τα παραμαγνητικά σωματίδια (Paramagnetic particles ή PMP) είναι οξείδια του σιδήρου που έχουν την ιδιότητα να έλκονται από μαγνήτη. Πάνω στα PMP συγκολλούνται αντισώματα τα οποία καλούνται γενικά στερεή φάση. Κατά τη διάρκεια της επώασης το αντιγόνο που θέλουμε να μετρήσουμε συνδέεται με τα αντισώματα της στερεής φάσης. Μετά τη σύνδεση αυτή τα PMP έλκονται από μαγνήτες οι οποίοι τα ακινητοποιούν πάνω τους. Τα μόρια του διαλύματος που δεν συνδέθηκαν με τα PMP ξεπλένονται. Με τα PMP κολλημένα πάνω στους μαγνήτες προστίθεται το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ξεκινά η αντίδραση (Animation 6.1). Αnimation 6.1 Τα βασικά στάδια της χημειοφωταύγειας με παραμαγνητικά σφαιρίδια. Eδώ τa αντισώματα είναι ακινητοποιημένα πάνω σε μεταλλικές μπίλιες που αποτελούν τη στερεή φάση. Αριστερά φαίνεται η ανταγωνιστική μέθοδος, όπου το σημασμένο αντιγόνο με εστέρα ακριδίνης ανταγωνίζεται το αντιγόνο του ασθενούς. Δεξιά φαίνεται η μη ανταγωνιστική μέθοδος, όπου οι εστέρες ακριδίνης των conjugate αντισωμάτων ενώνονται με όλα τα ακινητοποιημένα αντίγονα της στερεής φάσης. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται με μικρές παραλλαγές και από τους αναλυτές Architect της εταιρείας Αbbott. Συμβολίζεται ως CMIA από τα αρχικά Chemilescence Microparticles Immunoassay. Στηρίζεται όπως και άλλες μέθοδοι στην σύνδεση αντιγόνων με συνδεδεμένα, πάνω σε μαγνητικά σφαιρίδια, αντισώματα (Animation 6.2). 170

172 Αnimation 6.2 Αναπαράσταση της μικροσωματιδιακής ανοσοχημειοφωταύγειας. Οι πρωτεΐνες που συνδέονται με παραμαγνητικά σφαιρίδια, με την επίδραση αντισωμάτων, διαχωρίζονται από τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του δείγματος. Φωτογραφία 6.1 Η φόρτωση του φωταυγειόμετρου (ή λουμινόμετρου) με φιαλίδια βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου ποιότητας (controls) και δειγμάτων ασθενών κατά τον προσδιορισμό ορμονών με ενζυμική χημειοφωταύγεια Η Ανοσοχημειοφωταύγεια Καναλιού Οξυγόνου Η ανοσοχημειοφωταύγεια καναλιού οξυγόνου (Luminescent oxygen channeling immunoassay ή LOCI) βασίζεται στην αλληλεπίδραση δύο σωματιδίων latex, τα sensibead και chemibead, που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση (Σχήμα 6.18). Το sensibead περιέχει τη βαφή φθαλοκυανίνη και φέρει αντισώματα ειδικά για το αντιγόνο που θέλουμε να προσδιορίσουμε. Τα αντισώματα του sensibead ενώνονται και με τα σωματίδια chemibead, που περιέχουν στρεπταβιδίνη και μία οργανική ένωση τύπου ολεφίνης. Η κοντινή αυτή απόσταση 171

173 μεταξύ των σωματιδίων sensibead και chemibead έχει σαν αποτελέσμα, όταν το sensibead διεγερθεί με κατάλληλο μήκος κύματος, η φθαλοκυανίνη που περιέχει, να εκπέμψει μονήρη οξυγόνο που αμέσως θα αντιδράσει με το γειτονικό chemibead και θα παράξει φως Ηλεκτροχημειοφωταύγεια Σχήμα 6.18 Αναπαράσταση της ανοσοχημειοφωταύγειας καναλιού οξυγόνου. Η ηλεκτροχημειοφωταύγεια (Electrochemilescence Immunoassay ή eclia) χρησιμοποιεί ως ιχνηθέτη το ρουθήνιο, το οποίο δεν ενεργοποιείται χημικά όπως τα άλλα μόρια (πχ εστέρες ακριδίνης, λουσιφερόλη), αλλά με την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού (mv). Αυτό έχει ως πλεονέκτημα τον καλύτερο έλεγχο της αντίδρασης. Η eclia θεωρείται σήμερα η πιο ευαίσθητη (δηλαδή μπορεί να μετρήσει πολύ μικρές συγκεντρώσεις) και προηγμένη αυτοματοποιημένη ανοσοχημική μέθοδος. Τα άλατα του χηλικού συμπλόκου του ρουθηνίου [τρις(διπυριδυλ)-ρουθηνίου, (Ru(bpy) 3 2+ )] έχουν τη δυνατότητα όταν ανάγονται να παράγουν φως. Η αντίδραση παραγωγής φωτός από το σύμπλοκο Ru(bpy) 3 2+ προϋποθέτει και την ταυτόχρονη χρησιμοποίηση της τριπροπυλαμίνης (ΤΡΑ). Η όλη αντίδραση λαμβάνει χώρα στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου (Σχήμα 6.19). Εκεί η ρίζα TPA + και το Ru(bpy) 3 3+ αντιδρούν μεταξύ τους και το Ru(bpy) 3 3+ μετατρέπεται σε Ru(bpy) Αυτή η μεταφορά ενέργειας δημιουργεί μία διεγερμένη κατάσταση, η οποία είναι ασταθής και επιστρέφει γρήγορα στην αρχική κατάσταση με την εκπομπή ενός φωτονίου στα 620 nm. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται συνεχώς. Η ρίζα TPA ανάγεται σε παραπροϊόντα τα οποία δεν επηρεάζουν την αντίδραση της χημειοφωταύγειας, επειδή όμως εξαντλείται θα πρέπει να βρίσκεται σε περίσσεια. Στο τέλος της αντίδρασης το ρουθήνιο αναγεννάται και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πολλούς κύκλους παραγωγής φωτονίων. Καθώς εξαντλείται η ποσότητα της TPA, που βρίσκεται στο ηλεκτρικό πεδίο, η ισχύς του φωτός (σήμα) μειώνεται με αργό ρυθμό από το μέγιστο σημείο που έφτασε αρχικά. Το σύμπλοκο ρουθηνίου αναγεννάται συνεχώς και το σύμπλοκο αντιγόνου αντισώματος παράγει στο τέλος πολλά φωτόνια. 172

174 Σχήμα 6.19 Αναπαράσταση της αρχής μεθόδου της ηλεκτροχημειοφωταύγειας (Roche diagnostics, 1998). 6.8 Οι Ομογενείς Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, ως ομογενείς ανοσοχημικοί προσδιορισμοί καλούνται εκείνοι στους οποίους δεν απαιτείται ο διαχωρισμός συνδεδεμένου και ασύνδετου με τα αντισώματα αντιγόνου. Αυτό πρακτικά σημαίνει ότι δεν χρειάζεται να γίνονται εκπλύσεις μεταξύ των διαδοχικών σταδίων της μεθόδου, χαρακτηριστικό γνώρισμα των ετερογενών μεθόδων. Στις ομογενείς μεθόδους η διάκριση μεταξύ συνδεδεμένου και ασύνδετου αντιγόνου βασίζεται στις διαφορετικές χημικές και φυσικές ιδιότητες τους και σε αυτές οφείλεται η μεγαλύτερη ποικιλία των ομογενών προσδιορισμών σε σχέση με τους ετερογενείς. Θα αναφερθούμε παρακάτω σε μερικές από τις πιο χαρακτηριστικές Η Ανοσοενζυμική Ενισχυμένη μέθοδος Η ανοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος (Enzyme Multiplied Immunoassay Τechnique ή EMIT χρησιμοποιείται ευρέως για τη μέτρηση ναρκωτικών και φαρμακευτικών ουσιών. Ο ιχνηθέτης της μεθόδου είναι το ένζυμο αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6-PD). D-γλυκόζη-6-φωσφορική + NAD(P) D-γλυκονο-δ-λακτόνη-6-φωσφορική + NAD(P)H 2 (Aντίδραση 6.2) Το ένζυμο αυτό όταν προστίθεται σε διάλυμα που περιέχει το αντιγόνο, δηλ. το φάρμακο ή τη ναρκωτική ουσία, ενώνεται μαζί του και σχηματίζει σύμπλοκο. Στο σύμπλοκο αυτό το ένζυμο είναι ενεργό, αλλά η ενεργότητα του μειώνεται, μόλις το σύμπλοκο ενζύμου-φαρμάκου ενωθεί με το ειδικό για το αντιγόνο αντίσωμα. Η μείωση της ενεργότητας οφείλεται στο γεγονός ότι το αντίσωμα δεσμεύει το ενεργό κέντρο του ενζύμου και έτσι εμποδίζεται η σύνδεση του ενζύμου με το υπόστρωμα του, την 6-φωσφορική γλυκόζη. Η μέθοδος είναι ανταγωνιστικού τύπου. Όσο περισσότερο φάρμακο υπάρχει στον ορό του ασθενούς τόσο περισσότερο από αυτό θα συνδεθεί με τα αντισώματα και άρα λιγότερο σύμπλοκο ενζύμου-φαρμάκου θα συνδεθεί με τα εναπομείναντα αντισώματα. Το φωτόμετρο του αναλυτή μετρά την απορρόφηση του NADH της οποίας η μέγιστη τιμή εμφανίζεται σε διαφορετικό μήκος κύματος από το συνένζυμο NAD Ο Πολωμένος Φθορισμός Η μέθοδος του πολωμένου φθορισμού (Fluorescence Polarization Immunoassay ή FPIA) είναι ανταγωνιστικού τύπου και χρησιμοποιεί ως ιχνηθέτη τη φθορίζουσα ουσία φλουορεσκείνη (FITC) (Λιανίδου, 1994). Εδώ το ελεύθερο αντιγόνο (Ag) και ο συνδεδεμένος ιχνηθέτης (Ag-FITC) ανταγωνίζονται για το πιο θα ενωθεί με το αντίσωμα (Ab), σύμφωνα με το παρακάτω σχήμα. 173

175 Ag Ag-FITC Ab-Ag + Ab Ab-Ag-FITC Μετά το πέρας της αντίδρασης τα μόρια που μπορούν να φθορίσουν μέσα στο διάλυμα είναι τα Ag- FITC και τα Ab-Ag-FITC. Για τη διάκριση των δύο συμπλόκων χωρίς να προηγηθεί ο διαχωρισμός τους (ομογενής προσδιορισμός) εφαρμόζεται στο διάλυμα πολωμένη ακτινοβολία διεγέρσεως. Πολωμένη ονομάζεται η ακτινοβολία της οποίας όλα τα σωματίδια ταλαντώνονται στο ίδιο επίπεδο. Η πολωμένη ακτινοβολία διεγέρσεως διεγείρει τη FITC οπότε αυτή παράγει πράσινο χρώμα. Αν το μοριακό βάρος του συμπλόκου είναι μεγάλο (Ab-Ag-FITC), τότε το φως που παράγεται από τη FITC είναι πολωμένο. Αντίθετα στο μικρό σύμπλοκο FITC (Ag-FITC) το παραγόμενο φως δεν είναι πολωμένο (Σχήμα 6.20). Κατάλληλοι ανιχνευτές μετρούν το πολωμένο φως και κατά συνέπεια και την ποσότητα του αντιγόνου. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση του Ag του δείγματος, τόσο μικρότερη είναι η ακτινοβολία φθορισμού (ανταγωνιστική μέθοδος). Σχήμα 6.20 Αναπαράσταση της ομογενούς μεθόδου του πολωμένου φθορισμού. Τα αντιγόνα του δείγματος ανταγωνίζονται όμοια αντιγόνα σημασμένα με τη φθορίζουσα ουσία FITC. Μόνο τα σημασμένα ανοσοσυμπέγματα πολώνουν το φώς που τα διεγείρει Η Μικροσωματιδιακή Ανάλυση Η μικροσωματιδιακή ανάλυση (Particle Counting Immunoassay ή PACIA) είναι μια αυτοματοποιημένη ανταγωνιστσική ανοσοχημική μέθοδος. Δεν χρησιμοποιεί ενζυμική ανάλυση, αλλά παρ όλα αυτά εξετάζεται μαζί με τις ανοσοενζυμικές μεθόδους, διότι πολλοί ανοσοενζυμικοί αναλυτές εκτελούν και τη μικροσωματιδιακή ανάλυση. Η αρχή της μεθόδου είναι παρόμοια με τις συγκολλητινοαντιδράσεις. Σε αυτή χρησιμοποιούνται μικρά σφαιρίδια latex, που είναι επικαλυμμένα με αντισώματα έναντι του αναζητούμενου αντιγόνου. Τα αντιγόνα του ορού του ασθενούς προκαλούν τη συγκόλληση των σφαιριδίων. Το πλήθος των συγκολλήσεων εκτιμάται από τη μέτρηση των μη-συγκολλημένων σφαιριδίων, που διέρχονται μέσα από συσκευή παρόμοια με τον κυτταρομετρητή ροής (Σχήμα 6.21). Είναι ανταγωνιστική μέθοδος. 174

176 Σχήμα 6.21 Αναπαράσταση των τριών σταδίων της αυτόματης μικροσωματιδιακής ανάλυσης. 6.9 Παράγοντες που επηρεάζουν τις Ανοσοχημικές αναλύσεις Είναι πολλοί οι παράγοντες που μπορούν να επιδράσουν στις ανοσοχημικές αναλύσεις και να δώσουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Άλλοι παράγοντες οφείλονται σε τεχνικά προβλήματα της ανάλυσης (Πίνακας 6.14) και άλλες φορές σε προβλήματα που σχετίζονται με τη συμπεριφορά των αντισωμάτων των αντιδραστηρίων (Δεσύμπρης, 1994) Το φαινόμενο του Αγκίστρου Το φαινόμενο του αγκίστρου (hook effect) εμφανίζεται σε δείγματα πολύ υψηλής συγκέντρωσης τα οποία ψευδώς φαίνονται με μηδενική συγκέντρωση. Σε αυτή τη περίπτωση, το αντιγόνο είναι σε τόσο υψηλή συγκέντρωση, που ο όγκος τους δημιουργεί παρεμβολές στη σύνδεση γειτονικών αντιγόνων με τα αντισώματα της αντίδρασης. Η αντιμετώπιση του προβλήματος έγκειται στη προ-αραίωση του δείγματος από τον αναλυτή, αλλά και στη γνώση του ιατρικού ιστορικού του ασθενούς. Εάν ο αναλυτής δεν μπορεί να λύσει το πρόβλημα με προαραίωση, τότε από τη γνώση του ιατρικού ιστορικού θα πρέπει να εντοπιστεί έγκαιρα το πρόβλημα και να γίνει προ-αραίωση χειρονακτικά από τον χρήστη του αναλυτή Τα Eτερόφιλα Αντισώματα Πρόκειται για αντισώματα που αναπτύσσονται στον ορό ορισμένων ανθρώπων έναντι των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται στις ανοσοχημικές τεχνικές. Τα αντισώματα αυτά παράγονται από τον εμβολιασμό ζώων με ανθρώπινα αντιγόνα. Συνήθως τα ετερόφιλα αντισώματα εμφανίζονται στον ορό ατόμων, που πάσχουν από 175

177 κάποια φλεγμονή και το ανοσοποιητικό τους σύστημα είναι εξαιρετικά διεγερμένο. Η σύνδεση των ετερόφιλων αντισωμάτων με τα αντισώματα του αντιδραστηρίου δεσμεύει τα τελευταία, οπότε δεν αντιδρά ο ιχνηθέτης και το αποτέλεσμα βγαίνει αρνητικό Τα Αυτοαντισώματα Μια πολύ σπάνια περίπτωση αναφέρεται σε ανθρώπινα αντισώματα, που δεσμεύουν τα αντιγόνα του ανθρώπου που θέλουμε να μετρήσουμε. Τα αντισώματα αυτά ονομάζονται αυτοαντισώματα και σε αυτά περιλαμβάνεται πχ η παρουσία αντιθυρεοειδικών αντισωμάτων anti-tg. Τα αντισώματα αυτά συνδέονται με τη θυρεοσφαιρίνη του ασθενούς (TG) με αποτέλεσμα αυτή να μην μπορεί να ενωθεί με τα αντισώματα του αντιδραστηρίου Τα Θεραπευτικά Αντισώματα Σήμερα όλο και περισσότερο χρησιμοποιούνται αντισώματα σε θεραπείες, κυρίως του καρκίνου. Το αποτέλεσμα είναι να αναπτύσσουν ορισμένα άτομα αντισώματα έναντι των ποντικιών (ΗΑΜΑ) από τα οποία παράγονται κυρίως τα μονοκλωνικά θεραπευτικά αντισώματα. Τα αντισώματα HAMA μπορούν να προκαλέσουν ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα Άλλοι ανοσολογικοί παράγοντες που παρεμβαίνουν στις μετρήσεις Εκτός από τις προηγούμενες ισχυρές ανοσολογικές παρεμβολές μπορούν να επιδράσουν και άλλες, έστω και με λιγότερο φανερά αποτελέσματα. Για παράδειγμα, οι ρευματοειδείς παράγοντες (RF) μπορεί να επιδράσουν με το τμήμα Fc των αντισωμάτων που περιέχονται στα αντιδραστήρια των ανοσοχημικών μεθόδων, εμποδίζοντας έτσι, τη σύνδεση του αντιγόνου. Παρόμοιες παρεμβολές μπορούν να κάνουν και οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος προς αντισώματα κονίκλου, που χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήρια. Προβλήματα Αίτια Πιθανές λύσεις Τα αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν σε λάθος σειρά ή κάποιο στάδιο δοκιμασίας παραλήφτηκε. Ελέγξτε το φύλλο οδηγιών και επαναλάβετε τη δοκιμασία. Χωρίς σήμα/μη εμφάνιση χρώματος Δεν αραιώθηκαν τα δείγματα με τον κατάλληλο διαλύτη, (εφόσον απαιτείται). Δεν παρασκευάστηκε σωστά ή δεν είχε αποθηκευτεί σωστά το αντιδραστήριο του συνδέτη (conjugate). Ελέγξτε την αραίωση των δειγμάτων πριν την έναρξη της τεχνικής. Όλα τα προϊόντα σύζευξης περιέχονται σε κάθε kit κάθε παρτίδας. Εάν απαιτείται η αραίωση του αρχικού διαλύματος, πρέπει συμπύκνωμα και διαλύτης να αναμιγνύονται σε σωστές ποσότητες. Προσθήκη μη επαρκούς ποσότητας αντισώματος ή παράληψη της προσθήκης του. Παράληψη προσθήκης διαλύματος υποστρώματος. Το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης περιέχει αζωτούχο νάτριο. Έλεγχος προσθήκης σωστής ποσότητας αντισώματος. Έλεγχος προσθήκης διαλύματος υποστρώματος κατάλληλης συγκέντρωσης. Παρασκευή φρέσκου διαλύματος έκπλύσης. 176

178 Η θερμοκρασία του εργαστηρίου είναι πολύ χαμηλή. Η θερμοκρασία του δωματίου πρέπει να είναι C. Αποφύγετε να εκτελείτε την τεχνική κάτω από αεραγωγούς κλιματισμού ή κοντά σε παράθυρα. Χαμηλής έντασης σήμα Μη σωστή παρασκευή του διαλύματος εκπλύσης (wash). Χρησιμοποιήθηκε χρόνος επωάσεων μικρότερος από το αναμενόμενο. Τα αντιδραστήρια ήταν σε πολύ χαμηλή θερμοκρασία. Τα αντιδραστήρια έχουν λήξει. Το φωτόμετρο ή άλλη αυτόματη συσκευή ήταν ρυθμισμένη σε λάθος μήκος κύματος ή δεν είχε βαθμονομηθεί σωστά. Ανεπαρκής ποσότητα αντιγόνου ασθενούς. Ανεπαρκής ποσότητα αντισώματος. Το αντιδραστήριο του υποστρώματος ήταν πολύ αραιό. Χρησιμοποιήθηκε νερό κακής ποιότητας κατά την παρασκευή του διαλύματος πλύσης. Το διάλυμα υποστρώματος έχει αλλοιωθεί. Παρασκευάστε φρέσκο διάλυμα εκπλύσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του Kit. Ακολουθείτε τους χρόνους επωάσεων, που προτείνει ο κατασκευαστής. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια είναι σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Βεβαιωθείτε για την ημερομηνία λήξης των αντιδραστηρίων, που αναγράφεται στη συσκευασία, τόσο με ανοιχτή, όσο και κλειστή συσκευασία. Έλεγχος μήκους κύματος και βαθμονόμηση εκ νέου της συσκευής. Χρήση της σωστής ποσότητας αντιγόνου, όπως προτείνει ο κατασκευαστής. Χρήση της σωστής ποσότητας αντισώματος, όπως προτείνει ο κατασκευαστής. Χρησιμοποιήστε υψηλότερη συγκέντρωση αντιδραστηρίου ανίχνευσης. Ελέγξτε την ποιότητα του νερού που χρησιμοποιείται. Βεβαιωθείτε ότι το υπόστρωμα είναι άχρωμο, πριν από την προσθήκη στην πλάκα. Υψηλής έντασης υπόβαθρο (high backround) Ανεπαρκές πλύσιμο ή κακή απόδοση πλύσης. Μικροβιακή μόλυνση του συστήματος ύδρευσης. Αυξήστε τον αριθμό των εκπλύσεων. Βεβαιωθείτε ότι παρέχονται τουλάχιστον 400 μl του διαλύματος εκπλύσης σε κάθε κυψελίδα ανά πλύση. Απομακρύνετε τη μικροβιακή μόλυνση με έκπλυση του συστήματος με αραιό διάλυμα χλωρίνης (10% κατ όγκο) που ακολουθείται από μεγάλη ποσότητα απεσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Η συσκευή ανάγνωσης των αποτελεσμάτων ήταν ρυθμισμένη σε λάθος μήκος κύματος ή δεν είχε βαθμονομηθεί σωστά. Η θερμοκρασία του εργαστηρίου ήταν πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή. Ελέγξτε το μήκος κύματος του φωτομέτρου. Βαθμονομείστε σωστά το φωτόμετρο. Η αντίδραση γίνεται συνήθως θερμοκρασία δωματίου C. Αποφύγετε την εργασία κάτω από αεραγωγούς κλιματισμού ή κοντά σε παράθυρα. 177

179 Τα αντιδραστήρια περιείχαν προσμίξεις ή δεν παρασκευάστηκαν σωστά. Τα πηγαδάκια της πλάκας ήταν μολυσμένα. Οι πλάκες δεν είναι στη σωστή θερμοκρασία. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιήθηκαν τα σωστά αντιδραστήρια, και ότι δεν έχει γίνει επιμόλυνση. Χρησιμοποιήστε πολυκάναλες πιπέτες χωρίς να αγγίξετε την πλάκα. Εξασφαλίστε ότι οι πλάκες και τα αντιδραστήρια βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Ανάπτυξη χρώματος με αργό ρυθμό. Το ανοσοσύμπλεγμα είναι αδύναμο. Τα διαλύματα των αντιδραστηρίων έχουν επιμολυνθεί. Η παρασκευή των διαλυμάτων υποστρώματος πρέπει να γίνεται αμέσως πριν από τη χρήση. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια δεν έχουν λήξει, έχουν αποθηκευτεί σωστά, και χρησιμοποιούνται στη σωστή συγκέντρωση. Παρουσία προσμείξεων, όπως αζίδιο του νατρίου και το υπεροξείδιο μπορεί να επηρεάσουν την αντίδραση υποστρώματος. Αποφύγετε τη χρήση αντιδραστηρίων που περιέχουν αυτά τα συντηρητικά. Πίνακας 6.14 Συνηθισμένα τεχνικά προβλήματα, αιτίες και λύσεις τους σε μεθόδους ELISA. 178

180 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Ο ποσοτικός προδιορισμός των αυτοαντισωμάτων anti-ds DNA με ELISA, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Παρουσίαση αυτόματου αναλυτή Human (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Μάθημα ELISA από το πανεπιστήμιο Michigan (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Τα στάδια ανταγωνιστικής και μη ανταγωνιστικής ELISA (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια της ELISA: (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια της ELISA: (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Manual τεχνική ELISA: (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια της τεχνικής DELFIA (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 20/1/2015). 179

181 Αναφορές 1. ΓΡΗΓΟΡΗ Κ. (2011) Η τεχνική της χημειοφωταύγειας. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 2. ΕΥΑΓΓΕΛΑΤΟΣ, Π. (1994) Ραδιοανοσοαναλύσεις. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 3. ΔΕΣΥΠΡΗΣ, Α. (1994) Ενδογενείς παράγοντες που παρεμβαίνουν στις ανοσοαναλύσεις. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 4. ΔΙΑΜΑΝΤΗΣ, Φ., ΣΙΣΚΟΣ, Α., ΠΑΠΑΝΑΣΤΑΣΙΟΥ-ΔΙΑΜΑΝΤΗ, Α. (1987) Μαθήματα κλινικής χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος. 5. ΖΕΡΒΟΥ, Ε. (1988) Χημειοφωταύγεια, Αθήνα: Σεμινάριο ανοσολογίας 16 ος κύκλος. 6. ΚΑΛΟΚΑΙΡΙΝΟΣ, Κ. (1994) Ανοσοχημειοφωταύγεια. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 7. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (1994) Χημειομετρία ανοσοχημικών προσδιορισμών. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 8. ΚΟΚΚΑΛΙΑΡΗΣ, Δ. (2011) Ανοσοενζυμικές δοκιμασίες. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 9. ΛΙΒΑΝΙΟΥ, Ε. (1994) Ενίσχυση σήματος στις ανοσοαναλύσεις, Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 10. ΛΙΑΝΙΔΟΥ, Σ. (1994) Εφαρμογές του φθορισμού στους ανοσοχημικούς προσδιορισμούς. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 11. ΜΟΥΡΑΤΗ, Ο. (2015) Προσδιορισμός ανασυνδυσμένης GH με χημειοφωταύγεια. Αθήνα: ΤΕΙ Αθήνας. 12. ΝΙΚΟΛΟΥ, Χ. (2000) Η χημειοφωταύγεια στις ανοσοαναλύσεις, Αθήνα: Σεμινάριο ανοσολογίας 18 ος κύκλος 13. ΠΑΥΛΑΤΟΥ, Π. (1997) Ανοσολογία. Αθήνα: Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας. 14. ΡΙΖΟΣ, Δ. (1994) Ανοσοενζυμικές τεχνικές. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ. 15. COBA CORNING (1995) Οδηγίες χρήσης του αναλυτή ACS: TERNYNCK, T. & AVRAMEAS, S. (1988) Ανοσοενζυμικές τεχνικές. Αθήνα: Ελληνικό Ινστιτούτο Pasteur. 17. ROCHE DIAGNOSTICS (1998) Οδηγίες χρήσης του αναλυτή Elecsys ROITT, I., BROSTOFF, J., MALE, D. (1995) Ανοσολογία. Αθήνα: Εκδόσεις Γρ. Παρισιάνος 180

182 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΑΥΤΟΜΑΤΟΙ ΑΝΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΣΥΓΧΡΟΝΗ BΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Σύνοψη Aπό την πρώτη επινόηση αυτόματου αναλυτή από τον Leonard Skeggs, μέχρι τα σημερινά υπεραυτόματα αρθρωτά συστήματα και από τα απλά φωτόμετρα της δεκαετίας του 50, μέχρι τα microchips του σήμερα, έχουν περάσει πολλές δεκαετίες. Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφεί η ιστορική διαδρομή των σημαντικότερων διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας που σημάδεψαν την εξέλιξη των αυτόματων αναλυτικών συστημάτων. Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στα σύγχρονα αναλυτικά συστήματα (πλατφόρμες που συνδυάζουν χρωματομετρικές και ανοσοχημικές τεχνικές), στις μικροδιατάξεις, στα εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών και στις τάσεις του μέλλοντος (βιοαισθητήρες). Προαπαιτούμενες γνώσεις Το παρόν κεφάλαιο θα αναφερθεί σε τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται στους αυτόματους αναλυτές. Δεδομένου ότι οι αναλυτές αυτοί υλοποιούν με αυτόματο τρόπο γνωστές μεθοδολογίες, που γίνονται και με ημιαυτόματες ή με μεθόδους δια χειρός, ο αναγνώστης θα πρέπει να έχει μελετήσει το Κεφάλαιο 1 (φωτομετρία) και το Κεφάλαιο 7 (ανοσοχημικές μέθοδοι). 7.1 Εισαγωγή Ο «πατέρας» του αναλυτή τυχαίας προσπέλασης ήταν αναμφισβήτητα ο Leonard T. Skeggs Jr. ( ). Στα Σχήματα 7.1, 7.2 παρουσιάζονται ορισμένα κρίσιμα σκαριφήματα από το βασικό Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας (ΔΕ) του Skeggs, στη λογική του οποίου στηρίχθηκαν σε μεγάλο βαθμό, οι πολυάριθμοι αυτόματοι αναλυτές για τις επόμενες δεκαετίες. Η αλβουμίνη προσδιορίζεται απευθείας στον αραιωμένο ορό, με τη χρήση χρώσης HABA. Το υπόλοιπο του δείγματος διέρχεται από ένα διαλύτη και το μη διαλυτό μέρος του ρεύματος χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης και του CO 2. Το διαλυτό μέρος χρησιμοποιείται για να μετρηθεί η γλυκόζη και η ουρία, καθώς και η συγκέντρωση ιόντων νατρίου και καλίου, μέσω φλογοφωτομετρίας. Οι «έγχρωμες» ροές επιβραδύνονται υδραυλικά, μέσω σπειροειδών σωλήνων διαφόρων μηκών, ώστε οι κορυφές από ένα δεδομένο δείγμα να φθάνουν στο χρωματόμετρο σε αλληλουχία και να καταγράφονται με τη σειρά άφιξής τους. O πρώτος πολλαπλός αναλυτής περιγράφεται στο περιοδικό Clinical Chemistry (Skeggs & Hochstrasser, 1964) και έδωσε εξαιρετικά αναλυτικά αποτελέσματα, με ρυθμό 20 δειγμάτων ανά ώρα. Απέδειξε την ορθότητα της ιδέας και οδήγησε στην πολύ επιτυχημένη διάταξη SMA 12/60, που χρησιμοποιήθηκε και στον πρώτο αναλυτή με ελεγχόμενη εισαγωγή φυσαλίδων, η οποία μείωσε το θόρυβο και επέτρεπε ρυθμό 60 δειγμάτων ανά ώρα. Το αποκορύφωμα της σειράς ήταν ότι ο SMAC (Sequential Multiple Analyzer Computer) πραγματοποιούσε 20 αναλύσεις για κάθε δείγμα, ανά 20 δευτερόλεπτα και ήταν ο πρόδρομος των μελλοντικών αναλυτών τυχαίας προσπέλασης (Φωτογραφίες 7.1, 7.2). 181

183 Σχήμα 7.1 Η κάτοψη του αυτόματου συστήματος τροφοδότησης δειγμάτων του πρώτου αναλυτή του Skeggs L.T. (Skeggs, 1955). Χρειάστηκαν αρκετά χρόνια και πολλές προσπάθειες για να αναπτυχθούν αυτοματοποιημένοι αναλυτές και για τις ανοσοχημικές δοκιμασίες (Σχήμα 7.3). Μια από τις πρώτες επιτυχημένες προσεγγίσεις περιγράφεται στην αίτηση Δ.Ε. JPS (A) (Σχήμα 7.4). Για να επιτευχθεί η ταχύτερη δυνατή ανοσολογική ανάλυση, με την έγχυση ενός δείγματος σε μικροπλάκες και για να μεταφερθούν αυτόματα σε τμήματα του αναλυτή, για να εγχυθούν σε κατάλληλο αντιδραστήριο, ν αναδευθούν, να επωαστούν, να πλυθούν και να ανιχνευτεί η αντίδραση, χρειάζεται ο αναλυτής να είναι εφοδιασμένος με ένα τμήμα έγχυσης δείγματος 1, ένα τμήμα έγχυσης αντιδραστηρίου 2, ένα τμήμα πλύσης 3, ένα τμήμα ανάδευσης 4, ένα τμήμα επώασης 5 και ένα τμήμα ανίχνευσης 6 (Σχήμα 7.3). 182

184 Σχήμα 7.2 Η τομή του αυτόματου συστήματος τροφοδότησης δειγμάτων του Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας (ΔΕ) του L.T. (Skeggs, 1955). Φωτογραφία 7.1 Φωτογραφία του SMAC και γράφημα τιμών από τον SMA 12/60 με όλες τις τιμές που εμπίπτουν στην σκιασμένη «κανονική» περιοχή τιμών (Skeggs, 1955). 183

185 Φωτογραφία 7.2 Ο SMAC διέθετε ήδη εκτυπωτή αποτελεσμάτων και ένα στοιχειώδες σύστημα διαχείρισης δεδομένων (Skeggs, 1955). Σχήμα 7.3 Η δομή ανοσολογικού αναλυτή, όπως περιγράφεται στην αίτηση Δ.Ε. JPS

186 Σχήμα 7.4 Αιτήσεις Δ.Ε. σχετιζόμενες με χημικούς αναλυτές ανά έτος. Ο χειριστής τοποθετεί μια μικροπλάκα για την έγχυση του δείγματος στο τμήμα 1 και το δείγμα (π.χ. ορός) εγχέεται αυτόματα στο set της μικροπλάκας. Κατόπιν, η μικροπλάκα μεταφέρεται στο τμήμα έγχυσης του αντιδραστηρίου 2, το δείγμα αναδεύεται στο τμήμα 4, επωάζεται στο τμήμα 5 για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα και στη συνέχεια, η αντίδραση μεταξύ του δείγματος και του αντιδραστηρίου ανιχνεύεται στο τμήμα ανίχνευσης 6. Οι μικροπλάκες εκπλένονται στο τμήμα. Οι δράσεις του κάθε τμήματος ελέγχονται από το τμήμα ελέγχου 8. Έτσι, η μικροπλάκα μεταφέρεται αυτόματα στους επιμέρους τομείς, επιτρέποντας στην ανοσοενζυμική αντίδραση να γίνει γρήγορα και με υψηλή ακρίβεια. Η αναλυτική ιστορική προσέγγιση όλων αυτών των καινοτομιών, δεν αποτελεί σκοπό αυτού του κεφαλαίου. Εντούτοις, από τα λίγα ζητήματα που αναφέρθηκαν, δεν μένει καμιά αμφιβολία ότι μετά την εμφάνιση των αυτόματων αναλυτών τυχαίας προσπέλασης του Skeggs, το σύγχρονο κλινικό εργαστήριο, σύμφωνα με τα λεγόμενά του, είναι: «... μια πιο ταπεινή, λιγότερο ευπροσάρμοστη και πολύ τεχνική θέση εργασίας, όμως, μέσα σ αυτό γίνονται πολύ περισσότερα πράγματα, με πολύ μικρότερο κόστος και με μεγαλύτερη ακρίβεια από ποτέ» (Skeggs, 2000). Είναι σημαντική πάντα η μελέτη της ιστορίας για να καταλάβουμε πώς φθάσαμε στο παρόν, και να προετοιμαστούμε για το μέλλον, που ήδη μας «χτυπάει την πόρτα». Έτσι, στη συνέχεια θα εξετάσουμε τις επιμέρους συνιστώσες και λειτουργικές μονάδες των σύγχρονων αυτόματων αναλυτών και συγκεκριμένα: Πλήρη οπτικά συστήματα αυτόματων αναλυτών Πηγές Φωτός (UV,VIS, NIR): λυχνίες Wo, Xe, D 2, HAL, LEDs, LASERs Κατάτμηση της φωτεινής δέσμης Φίλτρα, φράγματα, σχισμές, μηχανικά στροφεία κ.λπ. Υλικά και μορφές των κυψελίδων Ανιχνευτές (PMs, Δίοδοι, CCDs) Αναλυτικές λύσεις που συνδυάζουν χρωματομετρικές, ανοσοχημικές κ.λπ. αναλύσεις Οπτικές Μέθοδοι: χρωματομετρία, φασματοσκοπία, νεφελομετρία, κ.λπ. Ιχνηθέτες-Αντιδράσεις: κινητικές/τελικού σημείου, ανταγωνιστικές/sandwich, ανοσο-ενζυμικές φθορισμού, χημειο-φωταύγειας κ.λπ. Διαχείριση δειγμάτων, επωάσεων και χρόνου με μρ Προαναλυτική-αναλυτική και μεταναλυτική διαδικασία. Τοποθέτηση δειγμάτων 185

187 Ροή δειγμάτων Διεπαφές: Υγρή (χημεία) Οπτική (μέτρηση) Ηλεκτρική (αναλογική έξοδος) DAC Data-bus Δειγματοληψία Επεξεργασία Παρουσίαση & αρχειοθέτηση αποτελεσμάτων Απομάκρυνση αποβλήτων & προσωρινή φύλαξη δειγμάτων (επαναλήψεις) Διεπαφές Ανθρώπου Αναλυτή - Δικτύου: PC/LIS/HIS/Web Αναδυόμενες τεχνολογίες που θα επηρεάσουν σύντομα την αυτοματοποιημένη ανάλυση Μικροδιατάξεις (microarrays) για την παράλληλη ανίχνευση πολλών παραγόντων Οπτικοί, ηλεκτροχημικοί, μαγνητικοί, μικρο- και νανο- ηλεκτρομηχανικοί βιοαισθητήρες «Εξωτικές» τεχνολογίες (μαγνητοχημικές, WGM, κβαντικές κηλίδες κ.λπ.) σε νανο-επίπεδο, για την ανίχνευση βομορίων, ιών και κυττάρων 7.2 Πλήρη Οπτικά Συστήματα Αυτόματων Αναλυτών Το οπτικό σύστημα ενός σύγχρονου αυτόματου βιοχημικού αναλυτή περιλαμβάνει πάντα τις ακόλουθες συνιστώσες: 1. πηγές φωτός (UV, VIS, NIR), 2. σύστημα κατάτμησης της φωτεινής δέσμης, 3. σύστημα επιλογής του κατάλληλου μήκους κύματος (μονοχρωμάτορας), 4. μια μορφή κυψελίδας τοποθέτησης ή συνήθως ροής του προς ανάλυση δείγματος, 5. ένα σύστημα κατάλληλου ανιχνευτή ή ανιχνευτών. Πηγές φωτός (UV, VIS, NIR): Κάθε αναλυτής περιλαμβάνει πάντα μια τουλάχιστον πηγή φωτός και μια σειρά, συνήθως περιστρεφόμενων, οπτικών φίλτρων, με διαφορετικά χαρακτηριστικά μετάδοσης του φωτός. Φωτίζεται έτσι, το προς ανάλυση δείγμα, με φως κατάλληλου μήκους κύματος (λ), διαμορφούμενου κάθε φορά διαμέσου του κατάλληλου οπτικού φίλτρου. Κατά την περιστροφή του τροχού των φίλτρων, έχουμε διαδοχικά τη μεταγωγή τους στη διαδρομή του φωτός από την εν λόγω πηγή. Με τον τρόπο αυτό προσδιορίζονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά του υπό ανάλυση δείγματος, βάσει των οπτικών πληροφοριών που λαμβάνονται. Ως πηγές φωτός των αναλυτικών διατάξεων χρησιμοποιούνται: Λυχνίες ξένον (Xe). Διαθέτουν συνεχές φάσμα ( nm), ένταση ακτινοβολίας περίπου ανάλογη προς την ροή του ρεύματος μέσω της λυχνίας, απαιτούν όμως εκκινητή ιονισμού υψηλής τάσης (kv) του Xe, για τη δημιουργία τόξου (σκανδαλισμός, triggering), (Σχήμα 7.5). Λυχνίες αλογόνου-βολφραμίου (HAL-Wo). Διαθέτουν συνεχές φάσμα ( nm). Το νήμα του βολφραιμίου (Wo) (Σ.Τ C) εξαχνώνεται συνεχώς, παράγοντας ατμό Wo, που συμβάλλει στη φωτοβολία, ενώ το αλογόνο (HAL) χρησιμεύει στην ανακύκλωση του Wo, που εξατμίζεται από το νήμα, μέσω αντίστροφης χημικής αντίδρασής του με το Wo (Σχήμα 7.6). Λυχνίες δευτερίου (D 2). Διαθέτουν συνεχές φάσμα ( nm, UV). Χρησιμοποιούν νήμα και άνοδο νικελίου (Ni) για τη δημιουργία τόξου μεταξύ τους ( V εκκίνηση, V λειτουργία) που διεγείρει τα ηλεκτρόνια (e - ) των μoρίων D 2, πηγή εκπομπής UV, κατά την επιστροφή τους στην αρχική τους κατάσταση (αποδιέγερση) (Σχήμα 7.7). Πηγές μονοχρωματικού φωτός βασισμένων σε ημιαγωγούς LEDs, LASERs κ.λπ. Η δίοδος LASER (LD), είναι ένα ηλεκτρικά αντλούμενο LASER ημιαγωγών, στο οποίο το δραστικό μέσον σχηματίζεται από μία p-n επαφή μιας διόδου ημιαγωγού, παρόμοια με αυτές που βρίσκονται σε μια δίοδο εκπομπής φωτός (LED). Τα quantum dots (QDs) LASERs είναι LASER ημιαγωγών, που χρησιμοποιούν κβαντικές τελείες ως ενεργό μέσο. Λόγω του «στενού» κβαντικού περιορισμού των φορέων φορτίου σε κβαντικές τελείες, τα QDs LASERs παρουσιάζουν μια ηλεκτρονική δομή, παρόμοια με τα άτομα. Τα QDs LASERs βρίσκονται πιο κοντά στις επιδόσεις των LASERs αερίων και δεν εμφανίζουν μερικές από τις αρνητικές πτυχές των παραδοσιακών LASERs ημιαγωγών, που βασίζονται π.χ. σε χύδην ημιαγώγιμα υλικά, όπως το εύρος διαμόρφωσης, το κατώφλιο εκπομπής, τη σχέση έντασης-θορύβου κ.λπ. Η ενεργή περιοχή, μπορεί επίσης να κατασκευάζεται για να λειτουργεί σε διαφορετικά μήκη κύματος, μεταβάλλοντας το μέγεθος και τη σύνθεση του LASER κβαντικής τελείας, που δεν ήταν διαθέσιμα προηγουμένως. Αποτελούν τις αναδυόμενες εναλλακτικές και μικροσκοπικές πηγές μονοχρωματικού φωτός στο άμεσο μέλλον, στην in vitro διαγνωστική τεχνολογία (Σχήματα 7.8, 7.9). 186

188 Σχήμα 7.5 Το χαρακτηριστικό φάσμα εκπομπής λυχνίας ξένου (Xe). Σχήμα 7.6 Το χαρακτηριστικό φάσμα εκπομπής λυχνίας αλογόνου-βολφραμίου (HAL-Wo). 187

189 Σχήμα 7.7 Το χαρακτηριστικό φάσμα εκπομπής του δευτερίου (D 2) (Tokunaga, 2007). Σχήμα 7.8 Χρονική εξέλιξη των σχετιζόμενων με QD-LASERs εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας συναρτήσει της χρονολογίας προτεραιότητας ( ). 188

190 Σχήμα 7.9 Χρονική εξέλιξη των σχετιζόμενων με QDs εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας συναρτήσει της χρονολογίας προτεραιότητας ( ). Το σύστημα κατάτμησης (chopping) της φωτεινής δέσμης περιλαμβάνει συνήθως ένα μηχανικά περιστρεφόμενο δίσκο και χρησιμοποιείται ευρέως στις αναλυτικές εργαστηριακές διατάξεις, για την μεταβολή της συνεχούς φωτοβολίας μιας πηγής φωτός, σε περιοδική, επιτρέποντας έτσι την δειγματοληψία της έντασής της, συναρτήσει του χρόνου. Για να είναι αποτελεσματικό, ένα οπτικό σύστημα κατάτμησης θα πρέπει να έχει μια σταθερή και επαρκή ταχύτητα περιστροφής και αρκετές οπές, ώστε η ταχύτητα δειγματοληψίας να οδηγεί στην ελαχιστοποίηση του θορύβου (κριτήριο Nyquist Shannon). Υπάρχει και η δυνατότητα «ηλεκτρονικής» κατάτμησης με κυκλώματα χρονισμού, που ρυθμίζουν διακόπτες on-off, όταν απαιτούνται υψηλότερες συχνότητες δειγματοληψίας. Σχήμα 7.10 Δύο συνηθισμένα σχήματα περιστρεφόμενων δίσκων κατάτμησης της φωτεινής δέσμης σε οπτικές διατάξεις αναλυτικών συσκευών (λόγος κατάτμησης 1:3 για ίδια ω). Μονοχρωμάτορας: Ο αναλυτής διαθέτει ένα τμήμα φωτοανίχνευσης του μονοχρωματικού φωτός, που διέρχεται από το δείγμα και προσπίπτει στον κατάλληλο φωτοανιχνευτή, ο οποίος εξάγει σήματα που αντιστοιχούν προς το ανιχνευόμενο φως και αναλύει τα χαρακτηριστικά του εν λόγω δείγματος. Το μονοχρωματικό φως παράγεται από τις πηγές φωτός (UV, VIS, NIR), που περιγράψαμε προηγουμένως, αφού το εκπεμπόμενο φως 189

191 διέλθει από το κάθε φορά κατάλληλο για την ανίχνευση φίλτρο, μιας διάταξης μονοχρωμάτορα, το οποίο επιτρέπει την διέλευση μιας πολύ στενής περιοχής μηκών κύματος (π.χ. 340 nm +/- 3 nm) από κάθε χρησιμοποιούμενο φίλτρο. Σχήμα 7.11 Φωτοανίχνευση, ηλεκτρικά σήματα και χρονοσειρές δεδομένων οδηγούν στο καθορισμό των δειγμάτων και στο αναλυτικό αποτέλεσμα (Tokunaga et al., 2007). Το τμήμα αυτό του αναλυτή (Σχήμα 7.11) δημιουργεί αναλυτικά δεδομένα χρονοσειρών, επί τη βάσει των ειδικών σημάτων που αποκτώνται από τους κατάλληλους φωτο-ανιχνευτές, οι οποίοι μετατρέπουν την φωτεινή ροή σε ηλεκτρικά μεγέθη (τάση ή ρεύμα) και μετά από επεξεργασία των ηλεκτρικών πια σημάτων, δημιουργούνται χρονοσειρές δεδομένων, με αποτέλεσμα να καθίσταται δυνατή η ανάλυση και ο χαρακτηρισμός του υπό ανίχνευση δείγματος. Οι μονοχρωμάτορες στους σύγχρονους αυτόματους βιοχημικούς αναλυτές (Σχήμα 7.12) περιλαμβάνουν φίλτρα (όχι απορρόφησης αλλά «συμβολής»), πρίσματα (σπανίως πια), φράγματα περίθλασης, ελεγχόμενες και σταθερές σχισμές, μηχανικά στροφεία κ.λπ. 190

192 Σχήμα 7.12 Προοπτική της δομής της φωτεινής πηγής, του τροχού των φίλτρων του μονοχρωμάτορα και του λοιπού οπτικού συστήματος (ανιχνευτές, ηλεκτρονικά κ.λπ.) (Tokunaga et al., 2007). Σχήμα 7.13 Λεπτομέρεια της δομής της φωτεινής πηγής, του τροχού των φίλτρων, του μονοχρωμάτορα και του λοιπού οπτικού συστήματος (Tokunaga et al., 2007). Τα διχροϊκά φίλτρα περίθλασης (Σχήμα 7.13) είναι καθοριστικά για την ποιότητα του αναλυτή. Κατασκευασμένα από δύο ημιδιαφανείς στρώσεις, διαχωρίζονται από διηλεκτρικό υλικό. Το πάχος του διηλεκτρικού καθορίζει το μήκος κύματος του φωτός που διέρχεται και μόνο το φως που ανακλάται δύο φορές, θα είναι συμφασικό και θα βγει από το φίλτρο. Τα κύματα με διαφορά φάσης υπόκεινται σε καταστροφική περίθλαση. Η διαπερατότητα είναι συνήθως 50-90% και το τυπικό φασματικό εύρος ζώνης είναι από 3 nm, το συνηθέστερο πρότυπο 10 nm και το ευρυζωνική nm. Η κυψελίδα τοποθέτησης (17) ή συνηθέστερα, κυψελίδα ροής του προς ανάλυση δείγματος, είναι ένα μικρό μόνο μέρος ενός ολοκληρωμένου και περίπλοκου υδραυλικού συστήματος ροής, όπως φαίνεται στο διάγραμμα ροής ενός βιοχημικού αναλυτή (Σχήμα 7.14), που δείχνει τη διαδρομή του ρευστού δείγματος, μέσω 191

193 της αντλίας (65) προς τις διάφορες φυσικές συνιστώσες του συστήματος. Είναι κατασκευασμένη από πλαστικό ή χαλαζία (για να είναι διαφανής στην ακτινοβολία UV) και αποτελεί το σημείο τομής του υδραυλικού και του οπτο-ηλεκτρονικού κυκλώματος ενός σύγχρονου αυτόματου βιοχημικού αναλυτή. Τέλος, ένα σύστημα κατάλληλου Ανιχνευτή/Ανιχνευτών, συμπληρώνει/νουν το oπτικό τμήμα ενός αναλυτή. Ιστορικά έχουν χρησιμοποιηθεί φωτολυχνίες, φωτοκύτταρα, φωτοδίοδοι, φωτοκρυσταλλοτρίοδοι, φωτοπολλαπλασιαστές κ.λπ. Σήμερα χρησιμοποιούνται κυρίως συστοιχίες φωτοδιόδων σχηματισμένες πάνω σε ημιαγωγούς και διατάξεις Charge-Coupled Devices (CCDs). Σχήμα 7.14 Το διάγραμμα ροής ενός βιοχημικού αναλυτή, που δείχνει τη διαδρομή του ρευστού δείγματος, προς διάφορες φυσικές συνιστώσες του συστήματος (Ricchio & Samuel, 1993). 192

194 Σχήμα 7.15 Η δομή συστοιχίας διόδων Si ευαίσθητης στον προσδιορισμό της θέσης κάθε συμβάντος ανίχνευσης φωτονίου (Frach, 2014). Σχήμα 7.16 Μια διάταξη ανίχνευσης φωτονίων (Shah et al., 2014). 193

195 Ένας ανιχνευτής φωτονίων (10) περιλαμβάνει μία διάταξη ανιχνευτών (12) που εσωκλείει ανιχνευτές (14) μεμονωμένων φωτονίων διόδων χιονοστιβάδας (Single Photon Avalanche Diodes ή SPAD) διαμορφωμένων, ώστε να αποκρίνονται σε «πρόσκρουση» ενός φωτονίου. Το κύκλωμα ενεργοποίησης (34) είναι διαμορφωμένο έτσι, ώστε να παράγει ένα σήμα που αποκρίνεται στην χιονοστιβάδα του ανιχνευτή SPAD της συστοιχίας διόδων. Κατάλληλα κυκλώματα (20, 22) είναι διαμορφωμένα, ώστε να αποθηκεύουν τις συντεταγμένες θέσης του ανιχνευτή SPAD που ενεργοποιείται. Τα κυκλώματα έχουν ρυθμιστεί για να αποκρίνονται σε σήματα ενεργοποίησης. Ο μετατροπέας χρόνου σε ψηφιακές καταγραφές (Time to Digital Converter ή TDC) (28) μπορεί να δημιουργήσει μια ψηφιακή σφραγίδα χρόνου για το σήμα ενεργοποίησης. Σχήμα 7.17 Η δομή ενός ανιχνευτή «συζευγμένου φορτίου» (CCD). Ο ανιχνευτής συζευγμένου φορτίου (CCD), είναι ένας καταχωρητής ολίσθησης, μια πολύ μικρή πλάκα, πάνω στην οποία βρίσκονται διατεταγμένα μερικά εκατομμύρια στοιχεία ενός ημιαγώγιμου υλικού, συνήθως δίοδοι πυριτίου, ευαίσθητου στο φως, που χρησιμεύει για τη λήψη ειδώλων. Όταν ο ανιχνευτής εκτίθεται σε μια φωτεινή πηγή, σε καθένα απ' αυτά τα στοιχεία απελευθερώνονται ηλεκτρικά φορτία (ηλεκτρόνια), σε ευθεία αναλογία με τα φωτόνια που πέφτουν πάνω στο στοιχείο. Μετά την έκθεση στο φως, ο αριθμός των συγκεντρωμένων ηλεκτρονίων στο κάθε στοιχείο καθορίζει τη φωτεινότητα του αντίστοιχου σημείου, πάνω στην οθόνη του υπολογιστή με τον οποίο είναι συνδεδεμένος ο ανιχνευτής CCD και η φωτογραφημένη εικόνα ανασυντίθεται σημείο προς σημείο στην οθόνη. Στην in vitro διαγνωστική δεν χρησιμοποιείται κατά κανόνα σε αυτόματους αναλυτές, αλλά κυρίως σε διατάξεις ψηφιακών οπτικών αλλά και ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. 7.3 Αναλυτικές λύσεις που συνδυάζουν Χρωματομετρικές, Ανοσοχημικές κ.λπ. α- ναλύσεις Οι οπτικές μέθοδοι: χρωματομετρία, φασματοσκοπία, νεφελομετρία κ.λπ. χρησιμοποιούνται συχνά σε διάφορους τύπους αυτόματων αναλυτών. Στη συνέχεια θα παρουσιασθούν μερικές σύγχρονες διατάξεις, όπως αυτές περιγράφονται σε πολύ πρόσφατα δημοσιευμένες αιτήσεις χορήγησης αντίστοιχων Δ.Ε. 194

196 Μια συσκευή ή ένα τμήμα χρωματομετρίας (Σχήμα 7.18) ενός αυτόματου αναλυτή, περιλαμβάνει μια μονάδα που ακτινοβολεί την υπό εξέταση επιφάνεια με φως και μια μονάδα απεικόνισης που καταγράφει μια εικόνα της υπό εξέταση ή μέτρηση επιφάνειας. Η μονάδα περιλαμβάνει μια πηγή φωτός, φακό και κατευθυντήρα που μετατρέπει το φως που εκπέμπεται από την πηγή σε παράλληλη δέσμη και μια κινούμενη διάταξη αλλαγής της κατεύθυνσης της κίνησης της δέσμης φωτός, διατηρώντας τον παραλληλισμό της «κεφαλής» της. Η διάταξη εναλλαγής της διεύθυνσης μετακινήσεως, είναι τοποθετημένη παράλληλα προς την επιφάνεια ανίχνευσης και η κατεύθυνση του οπτικού άξονα του φακού με τον κατευθυντήρα, συμπίπτει με την κάθετο προς την επιφάνεια αυτή. Σχήμα 7.18 Μία διαγραμματική απεικόνιση, που δείχνει τη διαμόρφωση μιας συσκευής χρωματομετρίας (Funamoto & Tatsuaki, 2015). 195

197 Σχήμα 7.19 Άνω μία σχηματική προοπτική άποψη που δείχνει τη δομή ενός φίλτρου και κάτω μία διαγραμματική εγκάρσια τομή της πλάγιας όψης που δείχνει τη δομή του φίλτρου (Funamoto & Tatsuaki, 2015). Οι λεπτομέρειες για τις βασικές αρχές φωτομετρίας και χρωματομετρικών αναλύσεων, έχουν ήδη παρουσιασθεί στο Κεφάλαιο 1. Στους σύγχρονους αυτόματους αναλυτές χρησιμοποιούμε ιχνηθέτες, αντιδράσεις κινητικές ή/και τελικού σημείου, ανταγωνιστικές ή/και Sandwich, ανοσοενζυμικές, φθορισμού, χημειο-φωταύγειας κ.λπ., ώστε να επιτύχουμε την πολισχιδή λειτουργία του αναλυτή, την επιθυμητή οικονομία υλικών και την επιδιωκόμενη αναλυτική ποιότητα. Θα παρουσιάσουμε ενδεικτικά μερικές σχετικές τεχνικές λεπτομέρειες, δεδομένου ότι οι βασικές αρχές έχουν ήδη παρουσιασθεί στα Κεφάλαια 2 και 3. Παραθέτουμε στη συνέχεια μια πρόσφατα δημοσιευμένη αίτηση χορήγησης Δ.Ε. (Σχήμα 7.20), που περιγράφει μια νέα μέθοδο ανοσοανίχνευσης ηλεκτρο-χημειοφωταύγειας στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου (ΝΙR). Η εφεύρεση περιγράφει μια μέθοδο, που περιλαμβάνει: Ένα πρώτο στάδιο που συνδέει κβαντικές τελείες στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου (ΝΙR-QDs) και δευτερογενή αντισώματα. Στο δεύτερο στάδιο διεξάγεται μια ανοσολογική αντίδραση τύπου Sandwich (βλ. Κεφάλαιο 6) και συγκροτείται ένας ανοσοαισθητήρας ηλεκτρο-δημιουργούμενης χημειοφωταύγειας. Στο τρίτο στάδιο, χρησιμοποιείται ένας ανοσοαισθητήρας για να εκτελέσει ανοσοανίχνευση. Η περιγραφόμενη μέθοδος είναι απλή στα βήματα, καλή σε λειτουργικότητα και ικανή στο να αποτρέπει αποτελεσματικά, πιθανές παρεμβολές, οφειλόμενες σε ηλεκτροχημικές διαδικασίες και σε παρεμβολές φωτός προερχομένου από τους ιστούς του βιολογικού υποβάθρου και τέλος διαθέτει υψηλή ευαισθησία, ακρίβεια και καλή επαναληπτικότητα. Η χρήση κβαντικών τελειών στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου είναι μια ενδιαφέρουσα «πρόκληση από το μέλλον» και παραμένει προς διαπίστωση η αναλυτική αποτελεσματικότητα της μεθόδου στη πράξη στα επόμενα χρόνια, αν και εφ όσον η μέθοδος εφαρμοσθεί στη κλινική πράξη. 196

198 Σχήμα 7.20 Η φασματική κατανομή της εκπομπής των ΝΙR-QDs (Guizheng et al., 2012) στη περιγραφείσα μέθοδο ανοσοανίχνευσης ηλεκτρο-χημειοφωταύγειας στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου (ΝΙR). Στη συνέχεια, θα αναφερθούμε σε μια πολύ πρόσφατη εκδοχή μιας «παλιάς» μεθόδου, της νεφελομετρίας και μιας συσκευής για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αιωρούμενων σωματιδίων, σε μία συστοιχία δοχείων δειγμάτων, όπως παρουσιάζεται στην πολύ πρόσφατα δημοσιευμένη αίτηση χορήγησης Δ.Ε. WO Α1 [14] (Σχήμα 7.21). Η νεφελομετρία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στην Ανοσολογία, για τον προσδιορισμό των επιπέδων των διαφόρων πρωτεϊνών του πλάσματος στο αίμα. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μέτρηση της θολερότητας σε ένα υδατικό εναιώρημα πρωτεϊνών, με την διέλευση φωτός μέσα από το δείγμα που μετράται. Η μέτρηση γίνεται μέσω της μέτρησης του φωτός, που διέρχεται μέσω ενός δείγματος, σε μια γωνία, συνήθως 30 ο και 90 ο. Στην εν λόγω αίτηση χορήγησης Δ.Ε. περιγράφονται συσκευές, μέθοδοι και συστήματα, που είναι κατάλληλα για τον ταχύ και ταυτόχρονο προσδιορισμό της συγκέντρωσης αιωρούμενων σωματιδίων σε ένα δείγμα. Αυτές επιτρέπουν την ταχεία και ταυτόχρονη αποτίμηση μεγάλου αριθμού συστοιχιών φρεατίων με δείγματα, διαμορφωμένες σε ένα ενιαίο δοχείο. Για παράδειγμα, τα δείγματα που περιέχονται σε δισδιάστατη συστοιχία ή πλάκα μικρο-τίτλου, μπορούν να μετρηθούν, χωρίς την ανάγκη μετακίνησης των κεφαλών ανάγνωσης ή της μετακίνησης του δοχείου των δειγμάτων. Αυτό το σύστημα νεφελομετρίας επιτρέπει στο χρήστη την ταχεία και ταυτόχρονη μέτρηση της συγκέντρωσης των σωματιδίων σε πολλά δείγματα, να ρυθμίσει την συγκέντρωση των σωματιδίων στο δείγμα, με ένα σύστημα χειρισμού του δείγματος, και κατόπιν να επιτρέπει την εκ νέου μέτρηση της συγκέντρωσης των δειγμάτων, προκειμένου να επιτευχθεί μια επιθυμητή συγκέντρωση. 197

199 Σχήμα 7.21 Οι βασικές συνιστώσες του συστήματος νεφελομετρίας (Klaus, 2015) που μετράει την συγκέντρωση σωματιδίων σε όλα τα φρεάτια με το δείγμα του δοχείου (2) χωρίς μετακινήσεις. Αυτό γίνεται χάρη στην ύπαρξη των πηγών φωτός (8, 9) του κατόπτρου (12) και της συστοιχίας φωτοηλεκτρικών διατάξεων, συνήθως διόδων. Η διαχείριση δειγμάτων, αραιώσεων, αναμείξεων, επωάσεων, χρόνου κ.λπ. σε ένα σύγχρονο αναλυτή με μρs είναι η αναγκαία και ικανή προϋπόθεση για την επιτυχή εκπλήρωση της αποστολής του. Η περιγραφή όλων των σχετικών ελέγχων και τακτικών διαχείρισης αυτών των παραμέτρων, δεν αποτελεί στόχο του παρόντος εργαστηριακού συγγράμματος. Για το λόγο αυτό παρατίθεται ο έλεγχος ορισμένων παραμέτρων, όπως αντικατοπτρίζονται σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη αίτηση χορήγησης Δ.Ε. US A1 (Σχήματα 7.22, 7.23). Στο Σχήμα 7.22 το έμβολο (66) κινείται προς τα κάτω σε προκαθορισμένη απόσταση, ενώ η άκρη του καθετήρα δειγματοληψίας (15) βυθίζεται σε ένα δείγμα για να το εισάγει μέσα στον καθετήρα. Ένας αισθητήρας πίεσης (26) ανιχνεύει τη διακύμανση της πίεσης κατά τη λειτουργία της αναρρόφησης, ένας μετατροπέας A/D μετατρέπει τα αναλογικά σε ψηφιακά σήματα, για να τα στείλει σε μια μονάδα επεξεργασίας σήματος (76). Η μονάδα επεξεργασίας σήματος (76) εξάγει τα δεδομένα των μεταβλητών της κυματομορφής αναρρόφησης, για τον υπολογισμό της στατιστικής απόστασης D από την ομάδα κανονικών δεδομένων. Από τη σύγκριση κρίνεται ότι υπάρχει μια ανωμαλία στη λειτουργία αναρρόφησης, όταν η στατιστική απόσταση D είναι μεγαλύτερη ή ίση με την τιμή κατωφλίου. Όταν η στατιστική απόσταση D είναι μικρότερη από την τιμή κατωφλίου, προχωρεί η λειτουργία εκκένωσης του δείγματος. Στο Σχήμα 7.23 παρουσιάζεται το όλο σχηματικό διάγραμμα του εν λόγω αναλυτή. 198

200 Σχήμα 7.22 Σύστημα αναρρόφησης ελεγχόμενο από μικροεπεξεργαστή (Yamazaki et al., 2014). Σχήμα 7.23 Σχηματικό διάγραμμα του αναλυτή του σχήματος 7.22 (Yamazaki et al., 2014). Σχήμα 7.24 Το λεπτομερές διάγραμμα ροής του λογισμικού, που εφαρμόζει τον αλγόριθμο ελέγχου της δειγματοληψίας μέσω του μκροεπεξεργαστή (Ahmad et al., 2007). Με ανάλογους αλγορίθμους (Σχήμα 7.24) σε παρόμοιες διατάξεις αυτόματων αναλυτών, πάσης φύσεως, καθίσταται εφικτή η διαχείριση της δειγματοληψίας, των δειγμάτων, των επαναλαμβανόμενων αραιώσεων και αναμείξεων, του απαραίτητου χρόνου επώασης, ανάλογα με την εξέταση κ.λπ. με την χρήση μικροεπεξεργαστών και κατάλληλων αλγορίθμων και αντίστοιχου λογισμικού. Τα παραδείγματα που αναφέρθηκαν, περιγράφουν ειδικές περιπτώσεις της ακολουθίας ενεργειών που γίνονται μέσα σε έναν αυτόματο αναλυτή και που σχηματικά μπορεί να αποδοθούν ως ακολούθως: 199

201 Διεπαφές: Υγρή (Χημεία) Οπτική (Μέτρηση) Ηλεκτρική (Αναλογική Έξοδος) ADC (Analog/Digital, Ψηφιακή) Data-bus Δειγματοληψία Επεξεργασία Παρουσίαση Αποτελέσματα Διεπαφές Ανθρώπου Αναλυτής PC LIS HIS Διαδίκτυο. Στην επόμενη ενότητα, θα παρουσιαστεί μια σημαντική κατηγορία συστημάτων, που συμπληρώνουν προαναλυτικά και μεταναλυτικά (τουλάχιστον) ολοκληρώνουν και αναβαθμίζουν ουσιωδώς την αναλυτική διαδικασία, τα εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών (Laboratory Ιnformation Systems, LIS). 7.4 Εργαστηριακά Συστήματα Πληροφοριών Tα εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών αποτελούν μια ειδική κατηγορία λογισμικού, η οποία λαμβάνει, επεξεργάζεται και αποθηκεύει πληροφορίες που προκύπτουν στα in vitro διαγνωστικά εργαστήρια. Τα συστήματα αυτά συχνά διασυνδέονται με άλλες διατάξεις, εγκαταστάσεις, συνήθως αυτόματους αναλυτές και συστήματα πληροφοριών, όπως τα νοσοκομειακά συστήματα πληροφοριών (Ηospital Ιnformation Systems, HIS). Το LIS είναι προσαρμοσμένο λογισμικό στην διευκόλυνση μιας ευρείας ποικιλίας εργαστηριακών μοντέλων ροής εργασίας. Η απόφαση επιλογής για ένα συγκεκριμένο τύπο LIS είναι ένα σημαντικό και δύσκολο εγχείρημα για όλα τα εργαστήρια. Η επιλογή προμηθευτή, συνήθως απαιτεί μήνες έρευνας και σχεδιασμού, ενώ η εγκατάσταση διαρκεί από μερικούς μήνες ως λίγα χρόνια, ανάλογα με την πολυπλοκότητα της οργάνωσης. Υπάρχουν πολλές παραλλαγές των LIS, καθώς υπάρχουν και πολλά είδη εργαστηριακής δομής και οργάνωσης, από συστήματα που προσφέρουν πλήρη λύση για να διαχειριστεί ένα μεγάλο Νοσοκομείο τις εργαστηριακές του ανάγκες, ενώ άλλες ειδικεύονται σε συγκεκριμένες ενότητες εφαρμογών, όπως: Κλινική χημεία Αιματολογία Ανοσολογία Αιμοδοσία και ιατρική των μεταγγίσεων Χειρουργική παθολογία Ανατομική παθολογία Κυτταρομετρία ροής Μικροβιολογία Τα LIS είναι εντελώς απαραίτητα στα εργαστήρια κλινικής χημείας, αιματολογίας κ.λπ. και συχνά είναι μέρος μιας ολοκληρωμένης λύσης πληροφορικής, στην οποία συμμετέχουν πολλές ανόμοιες εφαρμογές. Η χρήση ενός LIS είναι ένα ουσιώδες κομμάτι για το κλινικό φάσμα των συστημάτων πληροφορικής και συμβάλλει σημαντικά στη συνολική περίθαλψη, που παρέχεται στους ασθενείς. Το LIS χρησιμοποιείται σε ενδονοσοκομειακό περιβάλλον ή σε εξωτερικά ιατρεία και σε πολλές περιπτώσεις σχεδιάζεται, ώστε να υποστηρίζει και τις δύο περιπτώσεις. Στα εξωτερικά ιατρεία, η αλληλεπίδραση με το LIS συχνά ξεκινά από τον ιατρό, αφού αυτός έχει καταλήξει σε μια αρχική υπόθεση διάγνωσης. Όταν ένας ασθενής εισαχθεί στο νοσοκομείο, το σύστημα χρησιμοποιείται για την παραγγελία εργαστηριακών δοκιμασιών, για την παροχή υποστήριξης στην επεξεργασία των δειγμάτων, για να παραλαμβάνονται τα αποτελέσματα από τους αναλυτές και την παράδοση των εργαστηριακών εκθέσεων προς το θεράποντα ιατρό. Μια εντολή (αίτημα) εργαστηριακών δοκιμασιών τοποθετείται στο σύστημα, συνήθως από έναν ιατρό ή άλλο αρμόδιο, και περιέχει έναν κατάλογο δοκιμών που εκτελούνται σε ένα ή περισσότερα δείγματα του ασθενούς, παραδείγματος χάρη αίμα ή ούρα. Σε πολλές περιπτώσεις, κάθε εντολή εντοπίζεται με ένα μοναδικό «ταξινομητή», που είναι συνήθως ένας αριθμός και αναφέρεται συχνά ως προσθήκη. Συχνά, τα διαφορετικά δείγματα θα συλλεχθούν, σε διαφορετικούς σωλήνες, διαφορετικού χρώματος πώμα και κάτω από κατάλληλες συνθήκες, όπως π.χ. είδος αντιπηκτικού, υλικό σωλήνα κ.λπ. για κάθε συσκευή ανάλυσης που θα επεξεργαστεί τα δείγματα. Το κατάλληλο δείγμα λαμβάνεται από τον ασθενή και ταυτοποιείται με έναν μοναδικό αριθμό δείγματος, συνήθως με μια ετικέτα με γραμμικό κώδικα (bar code), που χορηγείται από το LIS. Πειραματικά ακόμα, η ανάγνωση των στοιχείων του δείγματος, γίνεται μέσω κατάλληλα συμπληρωμένου κωδικού του RFID (Radio-Frequency Identification), π.χ. σε ορισμένες αιμοδοσίες. 200

202 Το LIS μπορεί επίσης να προγραμματισθεί να τυπώνει ετικέτες με μοναδικό κωδικό κατά αιμοληψία, παρέχοντας την δυνατότητα να ακολουθηθεί, και στο επίπεδο διαδοχικών αιμοληψιών, η αλυσίδα της επιτήρησης από το σημείο λήψης από τον ασθενή, μέχρι το σημείο απόρριψης του δείγματος. Η ιεραρχία Δείγμα - Αιμοληψία Ασθενής είναι δενδροειδής ή συνδέεται η ταυτότητα του ασθενούς με την ταυτότητα του δείγματος, μέσα από το δημογραφικό ιατρικό αρχείο (φάκελο) του ασθενούς, εφ όσον αυτό είναι δυνατόν. Αφού συλλεχθεί το δείγμα, αποστέλλεται ή μεταφέρεται στο κατάλληλο εργαστήριο για την επεξεργασία του σε μια παρτίδα αναλύσεων (batch). Με την παραλαβή του στο κατάλληλο εργαστήριο, το δείγμα πρέπει πάλι να καταγραφεί, εντοπισθεί και ταυτοποιηθεί στο LIS, είτε παλαιότερα με το χέρι, είτε αυτοματοποιημένα, ώστε να αρχίσει η επεξεργασία του, συνήθως από αυτοματοποιημένους αναλυτές. Το LIS παρακολουθεί μια πύλη επικοινωνίας, για τις τυχόν ερωτήσεις και μεταφορτώνει τα αιτήματα, όταν αυτά τίθενται. Σε περιπτώσεις όπου το LIS διαβιβάζει στοιχεία, όπως οι εξατομικευμένες εκθέσεις και την ευελιξία των εργαστηρίων, σε ό,τι αφορά στους τρόπους παράδοσης των αποτελεσμάτων, είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τον καθορισμό της επιτυχία τους στην αγορά. Τα χαρακτηριστικά που υποστηρίζουν τα LIS συνήθως είναι: Έλεγχος και καταγραφή ασθενών Είσοδος εντολών Επεξεργασία δειγμάτων Λειτουργία Stat (ανάλογα με τον αναλυτή) για προτεραιότητα κάποιων δειγμάτων Είσοδος αποτελεσμάτων Δημιουργία εργαστηριακών εκθέσεων (αναφορών) Δημογραφικά στοιχεία ασθενών/ιατρών Βασισμένη στον ιστό είσοδος εντολών και αναζήτηση Αποστολή ηλεκτρονικά εκθέσεων: διεπαφές HL7- ιατρικά Αρχεία (EMRs) Πέρα από τα τυπικά LIS, υπάρχουν και τα συστήματα διαχείρισης εργαστηριακών πληροφοριών (Laboratory Ιnformation Μanagement Systems, LIMS), τα οποία χρησιμοποιoύνται σε πολύ μεγάλα διαγνωστικά και ερευνητικά εργαστήρια, στον εργαστηριακό έλεγχο φαρμακευτικών εταιρειών, στη παραγωγή και στον έλεγχο της ποιότητας της παραγωγής αντιδραστηρίων κ.λπ. Αναλυτικά καλύπτουν την διαχείριση: των δειγμάτων των εργαστηριακών χρηστών, των αναλυτών, των προτύπων. Άλλων εργαστηριακών λειτουργιών, όπως: Η τιμολόγηση, η διαχείριση υλικών, η αυτοματοποίηση της ροής εργασίας. Τα LIMS έχουν εισάγει σημαντικές αλλαγές στον βιοεργαστηριακό τομέα. Υψηλοί ρυθμοί παραγωγής εργαστηριακών αποτελεσμάτων είναι πολύ συχνά αναγκαίοι: Στον τομέα της μελέτης καταλληλότητας φαρμάκων, στη διαδικασία ελέγχου γονιδίων, στο χειρισμό δειγμάτων DNA και εντοπισμού γονοτύπου, στην διαλογή πρωτεϊνών κ.λπ. 201

203 Σχήμα 7.25 Διάγραμμα ροής του λογισμικού, που δείχνει μια υποδειγματική αρχιτεκτονική για το συντονισμό της εισόδου εργαστηριακών δοκιμών, και δρομολόγησης των αποτελεσμάτων των εργαστηριακών δοκιμών. Σχήμα 7.26 Σχηματικό διάγραμμα διασύνδεσης του συστήματος με άλλες μονάδες (δεξιά) σύμφωνα με την περιγραφή στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε. US A1 (Αhmad et al., 2007). 202

204 Σχήμα 7.27 Μια τυπική και λεπτομερή αρχιτεκτονική ενός σύγχρονου εργαστηριακού συστήματος πληροφοριών (LIS). 7.5 Αναδυόμενες εργαστηριακές τεχνολογίες Η πρόοδος στη βιοϊατρική τεχνολογία και στη μοριακή βιολογία, έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια, στην ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης και ενίσχυσης των ακολουθιών βάσεων του DNA, ιχνηθέτησης και ανίχνευσης ακολουθιών αμινοξέων των πρωτεϊνών, αλλά και στην εξερεύνηση των νανοδομών. Ξεκινώντας από τις διαθέσιμες σήμερα τεχνικές και μεθοδολογίες ανίχνευσης, θα γίνει μια προσπάθεια να ανιχνεύσουμε τι μας επιφυλάσσει η καινούργια δεκαετία, σε ό,τι αφορά στις αναδυόμενες εργαστηριακές τεχνολογίες. Οι προσδοκίες για νέες, καινοτόμες και αποτελεσματικές μεθόδους ανίχνευσης, έχουν ήδη εστιασθεί διεθνώς, σε τρεις κυρίως πολλά υποσχόμενους τομείς της Έρευνας και Ανάπτυξης (R&D), οι οποίοι περιλαμβάνουν: Μικροδιατάξεις (microarrays, biochips) για την παράλληλη ανίχνευση πολλών παραγόντων με διάφορες ανιχνευτικές διαδικασίες. Μικροσκοπικούς βιοαισθητήρες ικανούς να ανιχνεύουν παθογόνους παράγοντες. Μικρο- και νανοτεχνολογίες που αξιοποιούν φυσικά φαινόμενα σε ατομικό επίπεδο, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση βιομορίων, ιών και κυττάρων. Στη συνέχεια, στις ενότητες αυτές, θα μελετηθούν οι σημαντικότερες δημοσιευμένες εργασίες και θα γίνει προσπάθεια, αφού συνδυαστούν με τα αντίστοιχα έγγραφα βιομηχανικής ιδιοκτησίας, να εξαχθούν αξιοποιήσιμα συμπεράσματα, για το μέλλον του in vitro διαγνωστικού εργαστηριακού ελέγχου. Οι μικροδιατάξεις για την παράλληλη ανίχνευση διαφορετικών βιομορίων προσφέρουν θεωρητικά το πλεονέκτημα παράλληλης ανίχνευσης των ακολουθιών πυρηνικών οξέων ή πρωτεϊνών και συνεπώς αντιγόνων ή αντισωμάτων με διαφορετική εξειδίκευση. Έχουν σχεδιασθεί και κατασκευασθεί πολυάριθμα σχήματα microarray/chips, ανάλογα με τη φύση, το σχήμα και το μέγεθος της επιλεγμένης επιφάνειας, τις στρατηγικές ακινητοποίησης των ανιχνευτικών βιομορίων και τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους ανίχνευσης, τα οποία βρήκαν εφαρμογή κυρίως στην έρευνα για την ανάλυση του ανθρωπίνου γονιδιώματος και άλλων γονιδιωμάτων. Βρίσκουν ήδη εφαρμογές στην ανοσοαιματολογία, κυρίως με τον συνδυασμό υβριδισμού με ανιχνευτικά βιομόρια (probes), στη συνέχεια με παράλληλη πολλαπλή ενίσχυση του υπό ανίχνευση γονιδιωματικού DNA και τέλος με την αποτίμηση των αποτελεσμάτων, μέσω οπτικών μεθόδων φθορισμού ή 203

205 χημειοφωταύγειας. Το μεταβλητό επίπεδο μολυσματικότητας των γονιδιωμάτων των παθογόνων, περιπλέκει την παράλληλη ανίχνευση σε microarray. Η πολυπλεξία παράλληλων αλυσιδωτών αντιδράσεων πολυμεράσης (PCR), προερχομένων από ιικά ή βακτηριακά νουκλεοτίδια, για την ταυτόχρονη ανίχνευση διαφορετικών παθογόνων, περιορίζεται προς το παρόν, σε 2-4 το πολύ παράγοντες (π.χ. HIV 1/2, HCV και HBV). Οι τεχνικές σμίκρυνσης στη γονιδιωματική, σε συνδυασμό με την υψηλού ρυθμού απόδοσης αναγνώριση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων, που αρχικά αναπτύχθηκαν για την έρευνα, έκαναν δυνατή τη στόχευση μέχρι 1000 γονιδιωμάτων παθογόνων παραγόντων, επάνω σε μια μόνο μικροδιάταξη, η οποία φέρει μέχρι ανιχνευτικά ολιγονουκλεοτίδια. Μετά από την εξαγωγή των πυρηνικών οξέων από το δείγμα και τη τυχαία ενίσχυσή τους με PCR, ανιχνευτικές ακολουθίες επισημασμένες με ένα φθοριόχρωμα, υβριδοποιούνται επάνω στο microchip και ανιχνεύονται οπτικά οι κατανομές των φθοριζουσών «ψηφίδων». Όμως, η μέθοδος αυτή παραμένει εξαιρετικά περίπλοκη για την καθημερινή κλινική ρουτίνα και λόγω της απαίτησης προχωρημένων μεθόδων βιοπληροφορικής, για την αποτίμηση των μικροδιατάξεων. Σε επίπεδο πρωτεϊνών, όλες οι μικροδιατάξεις που προτείνονται μέχρι σήμερα, για χρήση στην in vitro διαγνωστική, αποτελούν κυρίως επίπεδα υποστηρίγματα, πάνω στα οποία έχουν συνδεθεί αντιγόνα ή αντισώματα. Αυτά τα συστήματα αντιστοιχούν σε μικρογραφημένες ανοσοχημικές δοκιμασίες και προσφέρουν το πλεονέκτημα του παραλληλισμού, του μειωμένου κόστους ανά δοκιμασία ανίχνευσης των επιμέρους πρωτεϊνών, υψηλή αναλογία σήματος προς θόρυβο, και το χαμηλό κόστος εξοπλισμού ανίχνευσης. Όμως, η χρήση χημειοφωταύγειας έχει μειονεκτήματα σε επίπεδο δυναμικής περιοχής ανίχνευσης και πολυπλεξίας, ενώ η αποτίμηση μπορεί να εκτελεσθεί μόνο μια φορά, όπως και με τη σήμανση με ραδιενεργά ισότοπα. Τέλος, οι μικροδιατάξεις για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών σε συνδυασμό με την μέθοδο φασματομετρίας μάζας SELDI- TOF-MS (Surface-Enhanced LASER Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) αποτελούν το βασικό εργαλείο έρευνας στη σύγχρονη πρωτεωμική, αλλά η χρήση τους στη κλινική πρακτική είναι προς το παρόν πολύ δύσκολη. Οι συνηθέστερα σήμερα χρησιμοποιούμενες μέθοδοι ρουτίνας για την ανίχνευση παθογόνων, στηρίζονται στη καλλιέργεια και την μέτρηση αποικιών βακτηρίων, σε ανοσοχημικές μεθόδους και σε παραλλαγές της PCR. Στη περίπτωση των ελέγχων για την ανίχνευση παθογόνων παραγόντων, οι συγκεντρώσεις του ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA, μπορεί να είναι πολλές τάξεις μεγέθους υψηλότερη από τα πυρηνικά οξέα των παθογόνων στόχων. Ενώ οι διάφορες μικροδιατάξεις, είναι χρήσιμα εργαλεία για την υψηλού ρυθμού ροής φόρτου ανάλυση βιομορίων, η χρήση τους σε επίπεδο κλινικής διαγνωστικής, περιορίζονται, προς το παρόν τουλάχιστον, από το απαγορευτικά υψηλό κόστος και το απαιτούμενο χρονικό διάστημα για την ενίσχυση και σήμανση των δειγμάτων. Οι δυσκολίες μεταφοράς της θετικής εμπειρίας της εφαρμογής μικροδιατάξεων από την έρευνα στη καθημερινή κλινική και εργαστηριακή πρακτική, για την παράλληλη ανίχνευση διαφορετικών βιομορίων, δεν σημαίνει ότι οι τεχνολογίες αυτές δεν έχουν μέλλον. Ένας τρόπος υπέρβασης αυτών των περιορισμών είναι η ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων μεθόδων για την προετοιμασία, τη σήμανση των δειγμάτων και την ανίχνευση της πληροφορίας από αυτά. Οι νέες αναδυόμενες σμικρυσμένες τεχνικές, οι οποίες βασίζονται στο συνδυασμό βιοαισθητήρων και μικρο- και νανοτεχνολογιών, ενδέχεται να προσφέρονται μεσοπρόθεσμα για εφαρμογή, στην πιο αποτελεσματική και λιγότερο δυσβάσταχτη οικονομικά, ανίχνευση μολυσματικών παραγόντων. Οι νανοτεχνολογίες περιλαμβάνουν τεχνικές, που αφορούν στη παραγωγή, στη παρατήρηση και στη μέτρηση αντικείμενων, δομών και συστημάτων διαστάσεων nm. Οι νανοτεχνολογίες φθάνουν στη κλίμακα του μεμονωμένου κυττάρου, ιού ή μεγαλο-βιομορίου (το DNA έχει περίπου 2,5 nm πλάτος, ενώ τα πρωτεϊνικά μόρια μεταξύ 1 και 20 nm), με αποτέλεσμα να υπερβαίνουν ορισμένα τρέχοντα τεχνολογικά εμπόδια και να επιτρέπουν πολλές παράλληλες και άμεσες συγκρίσεις και μετρήσεις, των υπό εξέταση βιολογικών στόχων, καθώς και την ενσωμάτωση διαφόρων αναλυτικών βημάτων, από την προετοιμασία των δειγμάτων μέχρι την ανίχνευση, μέσα σε ένα μεμονωμένο μικρογραφημένο σύστημα. 204

206 Σχήμα 7.28 Τυπική αναπαράσταση μιας μικροσυστοιχίας σε δύο μεγεθύνσεις (MacBeath, 2000). Σχήμα 7.29 Κάτοψη και τομή ενός biochip σύμφωνα με την περιγραφή στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε. WO (A1): H πλάκα (100) είναι εφοδιασμένη με συστοιχίες (120) που έχουν πλήθος εσοχών οι οποίες διαμορφώνονται με διαχωριστικά (22) τοιχώματα (Isami et al., 2015). Ο συνδυασμός νανο-αντικειμένων και νανο-συστημάτων, προσφέρει νέες προοπτικές αποφυγής των διαδικασιών πολλαπλασιασμού και σήμανσης των στόχων στην in vitro διαγνωστική και δημιουργεί βάσιμες ελπίδες στην επιστημονική κοινότητα, για την επίτευξη μιας τέτοιας δυνατότητας πολυπλεξίας στις ανιχνευτικές μεθόδους, που θα επιτρέπει την ανίχνευση ενός πλήθους βιομορίων, ιών ή βακτηρίων ταυτόχρονα, δημιουργώντας νέες δυνατότητες για τις εφαρμογές τους στην ανίχνευση μολυσματικών παραγόντων. Τα φυσικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων, συχνά εμφανίζουν νέες ιδιότητες καθώς το μέγεθος των επιμέρους συνιστωσών τους μειώνεται, πλησιάζοντας τη τάξη μεγέθους των 10-9 m, καθιστώντας τα κατάλληλα για την εφαρμογή τους στην in vitro διαγνωστική. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην αύξηση του αριθμού των επιφανειακών δραστικών ατόμων, σχετικά με το συνολικό αριθμό τους μέσα στο σωμάτιο. Έτσι, η αυξανόμενη διαθέσιμη περιοχή επιφάνειας για την ένωση μορίων-ανιχνευτών, επιτρέπει την αποδοτικότερη σύνδεση των υπό ανίχνευση στόχων και καθιστά πολλά νανοϋλικά, όπως π.χ. φθορίζοντες νανο-κρύσταλλοι ημιαγώγιμων υλικών (κβαντικές κηλίδες), νανοσωμάτια χρυσού, μαγνητικά μόρια κ.λπ. επιλέξιμα για την χρήση τους σε βιοαισθητήρες. Ένας βιοαισθητήρας μπορεί να οριστεί ως μια συμπαγής αναλυτική συσκευή, που ενσωματώνει ένα βιολογικό ή βιομιμητικό στοιχείο, και είναι συνδεμένος ή ενσωματωμένος μέσα σε έναν κατάλληλο μετατροπέα. Χρησιμοποιείται για να ανιχνεύσει, να μεταβιβάσει, και να καταγράψει ημιποσοτικές ή ποσοτικές πληροφορίες για ένα φαινόμενο που σχετίζεται με μια αντίστοιχη βιοχημική ή (παθο-) φυσιολογική αλλοίωση. 205

207 Η επιλογή του στοιχείου της «βιοαναγνώρισης» εξαρτάται από έναν μεγάλο αριθμό παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων της ειδικότητας, της ευαισθησίας, των όρων αποθήκευσης, και της λειτουργικής και περιβαλλοντικής σταθερότητας. Η επιλογή εξαρτάται επίσης, από το στόχο ενδιαφέροντος (αντιγόνο, πυρηνικό οξύ, μολυσματικός παράγοντας, πρωτεΐνη, άλλη χημική ένωση, κ.λπ.) και έχουν χρησιμοποιηθεί ως τέτοιοι βιοϋποδοχείς, διάφορα βιομόρια, ιοί, κύτταρα κ.λπ. Ανάλογα με τη μέθοδο μεταγωγής, οι βιοαισθητήρες ταξινομούνται σε: Οπτικούς, ηλεκτροχημικούς, μαγνητικούς, μικρο- και νάνο- ηλεκτρομηχανικούς κ.λπ. Στη συνέχεια, θα παρουσιασθούν επιλεκτικά, με καινοτομικά και πολλά υποσχόμενα έγγραφα βιομηχανικής ιδιοκτησίας, οι εξελίξεις στο σημαντικό αυτό τομέα, εστιασμένες κυρίως στην καταλληλότητά τους για την ανίχνευση παθογόνων παραγόντων. Οι οπτικοί βιοαισθητήρες βασίζονται στο φθορισμό ή στον επιφανειακό συντονισμό πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance ή SPR) και χρησιμοποιούνται ευρύτατα στις βιοχημικές αναλύσεις, λόγω της ευαισθησίας τους και της ειδικότητάς τους. Ο φθορισμός προσφέρεται να συνδεθεί με άλλες τεχνολογίες αναφοράς, όπως η PCR ή η ELISA. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που έχει σημειωθεί στη σμίκρυνση και την αυτοματοποίηση των μεθόδων, απαιτείται ακόμα περαιτέρω σοβαρή βελτίωση, που θα επιτρέψει την πολλαπλή ανίχνευση των μολυσματικών παραγόντων στο αίμα ή τον ορό και την αντικατάσταση της δαπανηρής και περίπλοκης ιχνηθέτησης με τις συμβατικές φθορίζουσες ουσίες. Η SPR είναι ιδιαίτερα ελκυστική ως εναλλακτική μέθοδος ανίχνευσης μορίων χωρίς ιχνηθέτη. Απαιτείται μια επιφάνεια υάλου, που καλύπτεται με μια λεπτή επίστρωση χρυσού με ακινητοποιημένα αντισώματα, η οποία φωτίζεται από την πίσω πλευρά της με το πολωμένο φως ενός LASER και μετράται το ανακλώμενο φως. Η ενέργεια των φωτονίων μεταφέρεται στα ηλεκτρόνια στην επιφάνεια του χρυσού και ως εκ τούτου, η σύνδεση μορίων-στόχων, στα αντισώματα της επιφάνειας αυτής του βιοαισθητήρα, αλλάζει τη συχνότητα συντονισμού του συμπλόκου, άρα και τη τιμή της γωνίας που πραγματοποιείται ο συντονισμός, η οποία αποτελεί τη παράμετρο αναγνώρισης των μορίων-στόχων. Τα κύρια μειονεκτήματα της μεθόδου SPR είναι η πολυπλοκότητά της, οι υψηλές δαπάνες εξοπλισμού, και η ευαισθησία σε μη εξειδικευμένη σύνδεση βιομορίων, στην επιφάνεια μέτρησης του βιοαισθητήρα. Εκτός από την SPR, υπάρχει μια σειρά αναδυόμενων μικρογραφημένων τεχνικών, όπως το ολοκληρωμένο συμβολόμετρο Mach-Zehnder (ΜΖΙ), το συμβολόμετρο Young, το συντονιζόμενο κάτοπτρο, το Δακτυλιοειδές οπτικό αντηχείο, οι φωτονικοί κρύσταλλοι κ.λπ. Αυτές οι τεχνικές επαναφέρουν «παλιές» δοκιμασμένες μεθόδους οπτικής ανίχνευσης, βασισμένες σε «κλασικά» φαινόμενα, όπως η συμβολή και η περίθλαση, η μετατόπιση του μήκους κύματος κ.λπ. προσαρμοσμένες όμως, στις νέες τεχνολογικές που μας δίδουν οι μικροσκοπικές πηγές LASER διόδων, η σμίκρυνση και μικρογράφηση «παραδοσιακών» τεχνικών. Οπτικοί βιοαισθητήρες Όριο Aνίχνευσης (pg/mm 2 ) Συντονισμού Πλασμονίων Επιφανείας 0,50 1,00 Ολοκληρωμένο Συμβολόμετρο Mach-Zehnder (ΜΖΙ) 0,06 Συμβολόμετρο Young 0,70 Συντονιζόμενο Κάτοπτρο 0,10 Δακτυλιοειδές Αντηχείο 0,50 1,00 Φωτονικοί κρύσταλλοι 0,10 Πίνακας 7.1 Οπτικοί βιοαισθητήρες και τα αντίστοιχα όρια ανίχνευσης που επιτυγχάνουν. Για παράδειγμα (Shimoyama et al., 2012), οι αισθητήρες Συντονισμού Πλασμονίων Επιφανείας (SPR) διαθέτουν μια μεταλλική δομή φράγματος, που συντονίζεται από το προσπίπτον φως (από LASER Διόδων), μέσα από ένα άνοιγμα, το οποίο μεταδίδεται μέσω ενός υποστρώματος, ώστε να επηρεάσει τον βαθμό συντονισμού του προσπίπτοντος φωτός. Το φως πέφτει πάνω στην όψη ενός φωτοηλεκτρικού μετατροπέα. Ένα 206

208 ηλεκτρόδιο εξόδου του σήματος του φωτοηλεκτρικού μετατροπέα, επιτρέπει την μέτρηση της διακύμανσης της τάσης εξόδου και τον εντοπισμό του σημείου συντονισμού, που εξαρτάται από τη γεωμετρία του ανιχνευόμενου μορίου. Σχήμα 7.30 Σχηματική απόδοση της αρχής ανίχνευσης SPR σύμφωνα με την περιγραφή στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε. JP A (Shimoyama et al., 2012). Ένα τελείως διαφορετικό δρόμο ακολουθούν τεχνικές που προτιμούν, όχι την απάλειψη της σήμανσης π.χ. του φθορισμού, αλλά την αντικατάσταση του οπτικού ιχνηθέτη, συνήθως oργανικά φθοριοχρώματα, που απαιτούν ακριβείς και χρονοβόρες διαδικασίες σήμανσης. Ακόμα διαθέτουν ευρύτατα φάσματα εκπομπής, που περιορίζουν τις δυνατότητες συνδυασμού τους, ιδιαίτερα σε μικροδιατάξεις. Τέλος, είναι ευαίσθητα στην φωτοεξασθένηση της εκπομπής τους. Η αντικατάσταση γίνεται από νέα ανόργανα νανοϋλικά, όπως οι πολλά υποσχόμενοι φθορίζοντες νανοκρύσταλλοι ημιαγώγιμων υλικών (κβαντικές κηλίδες). Μια κβαντική κηλίδα είναι ένας ημιαγωγός, του οποίου τα εξιτόνια (excitons), δηλαδή οι δεσμευμένες καταστάσεις ενός ηλεκτρονίου του και μιας θετικά φορτισμένης «οπής» του, που έλκονται μεταξύ τους με ηλεκτροστατικές δυνάμεις Coulomb, περιορίζονται και στις τρεις διαστάσεις, του εν λόγω νανοκρυστάλλου. Τα εξιτόνια είναι ηλεκτρικά ουδέτερα, οιονεί σωματίδια (ημισωμάτια), τα οποία υπάρχουν σε μονωτές, ημιαγωγούς και σε ορισμένα υγρά και θεωρούνται ως στοιχειώδεις μορφές διέγερσης της συμπυκνωμένης ύλης, που μπορούν να μεταφέρουν ενέργεια, χωρίς τη μεταφορά ηλεκτρικού φορτίου. Οι ιδιότητες της κβαντικής κηλίδας είναι ανάμεσα σε αυτές του ευμεγέθους ημιαγωγού και των διακριτών μορίων. Οι κβαντικές κηλίδες έχουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα χρησιμοποιούμενα σήμερα οργανικά φθοριοχρώματα για την επισήμανση νουκλεοτιδίων ή πρωτεϊνών, γιατί αποτελούνται από έναν πυρήνα ημιαγωγού (π.χ. CdSe) με κατάλληλη επένδυση (π.χ. ZnS), η οποία τον συνδέει με ένα περίβλημα πρωτεϊνών (π.χ. Maltose Binding Protein ή ΜBP, συνδυασμένη με Cyanine Dye ή CD) για την άμεση σύνδεση πάνω του, των υπό ανίχνευση βιομορίων. Η MBP συνδυασμένη με την CD αυτό-συναρμολογείται προκαλώντας έτσι, συντονισμό Foerster και μεταφορά ενέργειας, από τη χρωστική-δέκτη στο δότη QD. Με την σύνδεσή της με την μαλτόζη που περιέχεται στο αντιδραστήριο, η MBP υφίσταται προσαρμοστική αλλαγή της απόχρωσής της ανάμεσα στο λευκό και το κίτρινο, εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση του βιομορίου (π.χ. μια άλλη πρωτεΐνη) που ανιχνεύεται, προκαλώντας με τον τρόπο αυτό, αλλαγή της έντασης της φωτοφωταύγειας. Οι κβαντικές κηλίδες εξασφαλίζουν ένα πολύ στενό και ιδιαίτερα υψηλής φωτοβολίας φάσμα εκπομπής, με μήκος κύματος ελεγχόμενο από το μέγεθος του ημιαγωγού νανοκρυστάλλου. Παράλληλα, τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής είναι πολύ καλά διαχωρισμένα, ενώ ταυτόχρονα αυξάνουν την ευαισθησία και εξαλείφουν τα φαινόμενα του αυτο-φθορισμού. Αυτές οι αξιοπρόσεκτες ιδιότητες που οφείλονται στο νανο-μέγεθος των QDs, μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανίχνευση ιών σε οιονεί πραγματικό χρόνο, ενώ η μέθοδος προσφέρεται και για ανίχνευση σε πλήρες αίμα. Ο συνδυασμός τριών χρωμάτων και 10 διαφορετικών επιπέδων έντασης, επιτρέπει θεωρητικά την παραγωγή 103 διεγέρσιμων και ανιχνεύσιμων συμπλοκών, από μια μοναδική πηγή φωτός, δημιουργώντας εν δυνάμει μια μορφή ενός φασματικού βιο-γραμμωτού κώδικα (Spectral bio-barcoding), κατάλληλου για πολλαπλή και ταυτόχρονη 207

209 ανίχνευση βιομορίων και κατά συνέπεια ιικών σωματίων κ.λπ. Εντούτοις, στην πράξη παραμένει δύσκολη η σύνθεση των QDs και η ενσωμάτωσή τους σε μικρογραφημένα συστήματα. Σχήμα 7.31 Η εμφάνιση του κβαντικού εντοπισμού και η διαμόρφωση του ενεργειακού χάσματος, σύμφωνα με το μέγεθος του νανοκρυστάλλου της κβαντικής τελείας (Durniak et al., 2015). Η πρόοδος της έρευνας και η αναγκαιότητα λιγότερο τοξικών υλικών οδήγησαν στην ανάγκη ανάπτυξης νέων τύπων QDs και υλικών με παρόμοιες ιδιότητες. Έτσι, σήμερα έχουμε: «παραδοσιακές» κβαντικές τελείες ημιαγωγών, LASERs Διόδων και κβαντικών τελειών, QDs πυριτίου, άνθρακα και κυρίως γραφενίων, μεταλλικά νανοσυμπλέγματα (Nanoclusters ή NC), ως πηγή φωτοφωταύγειας. Ακόμα και η συνοπτική περιγραφή (Σπυρόπουλος, 2014) όλων των ανωτέρω παραλλαγών είναι πέραν των στόχων ενός εργαστηριακού συγγράμματος. Όμως, η δυναμική της έρευνας τα τελευταία 10 χρόνια, δείχνει ότι υπάρχουν δικαιολογημένες προσδοκίες, τα επόμενα χρόνια να έχουμε μια μεγάλης κλίμακας αξιοποίησης των QDs στην ΙVD, ιδιαίτερα στην κυτταρομετρία ροής, σε βιοϊατρικές πολυχρωματικές εφαρμογές και σε εφαρμογές πολυπλεξίας μικροσυστοιχιών. Σχήμα 7.32 Σχηματικά οι μέθοδοι για την παρασκευή διαφόρων τύπων (Zhu, 2013) βιοσυζυγών-qds. 208

210 Σχήμα 7.33 Ο αριθμός των Δ.Ε. (Σπυρόπουλος, 2014) που σχετίζονται με QDs & NCs. Οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες βασίζονται στις μετρήσεις αλλαγών ηλεκτρικών μεγεθών, που συνεπάγονται οι αλληλεπιδράσεις του δείγματος με την επιφάνεια του βιοαισθητήρα. Ανάλογα με τα επηρεαζόμενα ηλεκτρικά μεγέθη, ταξινομούνται σε αισθητήρες ρεύματος, τάσης, σύνθετης αντίστασης (ή εμπέδησης), χωρητικότητας, αγωγιμότητας κ.λπ. Οι βιοαισθητήρες ρεύματος είναι σήμερα οι πλέον διαδεδομένοι στο χώροι της ιατρικής, όπως π.χ. τα ηλεκτρόδια Clark για την ανίχνευση του οξυγόνου στην εντατική ιατρική, τα οξειδοαναγωγικά ηλεκτρόδια για την γλυκόζη στην εργαστηριακή ιατρική κ.λπ. Καθώς όμως οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες σμικρύνονται φθάνοντας στη περιοχή του μικρομέτρου (10-6 m) και του νανομέτρου (10-9 m), οι βιοαισθητήρες σύνθετες αντίστασης, προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα για διαγνωστική χρήση, καθώς επιτρέπουν την ανίχνευση και μέτρηση των αλληλεπιδράσεων αντιγόνων - αντισωμάτων σε οιονεί πραγματικό χρόνο και χωρίς την ανάγκη επισήμανσης ενός εξ αυτών, δεδομένου ότι το σύμπλοκο μπορεί να αναγνωρισθεί από την αλλαγή που επιφέρεται από αυτό, στη σύνθετη αντίσταση στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα και το μετρούμενο σήμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του υπό ανίχνευση μορίου. Επίσης, οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες δεν επηρεάζονται από τη θολερότητα του δείγματος, από το φυσικό φθορισμό ορισμένων βιομορίων ή από την εξασθένηση του φωτός από ορισμένες ουσίες, όπως οι οπτικοί βιοαισθητήρες. Η απαιτούμενη οργανολογία μέτρησης είναι απλή, οικονομική, και σμικρύνεται εύκολα, ενώ η μέθοδος προσφέρεται και για ηλεκτροχημική φασματοσκοπία σύνθετης αντίστασης, δηλαδή τη ταξινόμηση των βιομορίων, ανάλογα με την διαφορά της μετρούμενης σύνθετης αντίστασής τους ή αγωγιμότητας τους μέσα στο δείγμα. Τέλος, λόγω των αγώγιμων ιδιοτήτων των πυρηνικών οξέων, οι ηλεκτροχημικοί αισθητήρες προσφέρονται επίσης, και για την ανίχνευση επιλεγμένων ακολουθιών νουκλεοτιδίων γονιδιωματικού υλικού, με τη χρήση ως μοριακών ανιχνευτών, απταμερών ακινητοποιημένων σε νανοσωματίδια χρυσού, στην επιφάνεια του αισθητήρα. Η ιδιότητα αυτή μπορεί να αποδειχθεί ιδιαίτερα σημαντική για την δημιουργία στο μέλλον, μεθόδων συνδυασμένης ανίχνευσης, τόσο γονιδιωματικού υλικού, όσο και αντισωμάτων, ανάλογα με το στάδιο της λοίμωξης, για τον εντοπισμό αιματογενώς μεταδιδομένων παραγόντων, με ενιαίο και χαμηλού κόστους εξοπλισμό μέτρησης. Τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν χρησιμοποιηθεί στη βιοϊατρική τεχνολογία για μια μεγάλη χρονική περίοδο και την τελευταία δεκαετία χρησιμοποιούνται ως υπόστρωμα στη καθήλωση κατάλληλων βιομορίων για ανίχνευση νουκλεοτιδίων ή πρωτεϊνών. Τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν χρησιμοποιηθεί ως δείκτες σε πολυάριθμες ηλεκτροχημικές, αγωγιμομετρικές, αλλά και σε οπτικές τεχνικές και σε αντίστοιχους βιοαισθητήρες, στους τελευταίους σε συνδυασμό τους με ιόντα αργύρου σε διαλύματα υδροκινόνης, μιας τεχνικής που έχει τις ρίζες της στην τεχνολογία της φωτογραφίας και επανέρχεται σε αναδυόμενες νανοτεχνικές φθορισμού, που επιτρέπουν την πραγματοποίηση τεχνικών «sandwich» ELISA σε νανοκλίμακα. 209

211 Τέλος, εκτός από «ηλεκτροχημικές» προσεγγίσεις στη νανοκλίμακα, πρέπει να σημειωθεί ότι εμφανίζονται και ενδιαφέρουσες «μαγνητοχημικές» εφαρμογές, με τη χρήση μαγνητικών νανοσωματιδίων. Αυτές αξιοποιούνται τόσο για την σήμανση όσο και για τον «καθαρισμό» μέσω αυτής της σήμανσης, πυρηνικών οξέων ή πρωτεϊνών, αλλά και για την ίδια την ανίχνευσή τους, μέσα από την αξιοποίηση των παραμαγνητικών ιδιοτήτων σφαιριδίων κατάλληλου νανοϋλικού, να μεταβάλλουν το μαγνητικό πεδίο γύρω τους. Με τον τρόπο αυτό να καθίσταται δυνατός ο εντοπισμός και η ταυτοποίηση τους, μέσω μαγνητικών μετατροπέων και εφικτή η εμπλοκή τους στην «μαγνητική ιχνηθέτηση» ανοσοχημικών δοκιμασιών ή PCR. Στη συνέχεια περιγράφεται ενδεικτικά μια πολύ πρόσφατη αίτηση Δ.Ε. CN (A). Η αίτηση περιγράφει μια μέθοδο παρασκευής και εφαρμογής ενός ηλεκτροχημικού βιοαισθητήρα, με βάση τροποποιημένο με νανο-πορώδη χρυσό, τρισδιάστατο ηλεκτρόδιο αδάμαντος και με πρόσμιξη βορίου (Boron- Doped Diamond ή BDD). Περιγράφεται μέθοδος στερέωσης εστεράσης της ακετυλοχολίνης και η εφαρμογή της στην ανίχνευση υπολειμμάτων οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων, καθώς η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της επιφάνειας, επιταχύνοντας τη μεταφορά ηλεκτρονίων και βελτιώνοντας με τον τρόπο αυτό, την ηλεκτροκαταλυτική δραστηριότητα και τη βελτίωση της ευαισθησίας ανίχνευσης. Σχήμα 7.34 Μέθοδος παρασκευής και εφαρμογής ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων που βασίζονται σε ηλεκτρόδιο αδάμαντος με νανο-πορώδη χρυσό με προσμίξεις βορίου (Wei Min et al., 2014). Οι νανομηχανικοί βιοαισθητήρες είναι μια νέα αναδυόμενη κατηγορία βιοαισθητήρων υψηλής ευαισθησίας, αμέσου ανίχνευσης και ελεύθερων ιχνηθέτησης, που συνδέει την αναγνώριση βιομορίων με (νανο-)μηχανική κίνηση. Διακρίνονται σε νανομηχανικούς βιοαισθητήρες, που κατά περίπτωση μπορεί να είναι οπτο-νανομηχανικοί ή/και ηλεκτρο-νανομηχανικοί. Οι πλέον υποσχόμενες τέτοιες διατάξεις περιλαμβάνονται στο Πίνακα 7.2. Η πιεζοηλεκτρική ανίχνευση βασίζεται συνήθως στη μέτρηση των μεταβολών στη συχνότητα συντονισμού ενός κρυστάλλου χαλαζία (Quartz Crystal Microbalance ή QCM), μετά από μια αλλαγή στη μάζα του κρυστάλλου, που προκαλείται από την αλληλεπίδρασή του με ένα βιολογικό «στόχο» π.χ. ένα αντιγόνο, ένα αντίσωμα, ένα τμήμα DNA κ.λπ. Με ανάλογο τρόπο λειτουργούν, αξιοποιώντας την μεταβολή της μηχανικής συχνότητας συντονισμού μικροδοκών, μικροδιαύλων ακουστικών αντηχείων, διαμορφωμένων πάνω σε μικρο-ηλεκτρομηχανικά συστήματα κ.λπ., και οι υπόλοιποι μικρο- και νανο βιοαισθητήρες. Αυτοί οι βιοαισθητήρες εμφανίζουν προς το παρόν μικρότερη ευαισθησία από τους αντίστοιχους οπτικούς και περαιτέρω μελέτες διεξάγονται για να αξιολογηθεί η σταθερότητα της επιφάνειάς τους σε βιολογικά υγρά, για να ερευνηθούν προβλήματα σχετικά με την αναγέννηση των δραστικών τους επιφανειών, για το βαθμό ειδικότητας της σύνδεσής τους με πρωτεΐνες, και για τον απαιτούμενο αντίστοιχο χρόνο επώασης, ώστε να αποτελέσουν μια αξιόπιστη και οικονομική πλατφόρμα για την in vitro διαγνωστική. 210

212 Νανομηχανικοί Βιοαισθητήρες Όριο Aνίχνευσης (pg/mm 2 ) Μικροϊσορροπίας Χαλαζία 10,00 Συντονιζόμενοι Μικροδοκοί 0,01-10,00 Ακουστικό Αντηχείο Μικρο-Η/Μ Συστημάτων 100,00 Αναρτημένο Αντηχείο Μικροδιαύλων 0,10 Πίνακας 7.2 Οπτικοί βιοαισθητήρες και τα αντίστοιχα όρια ανίχνευσης. Ένας ιδιαίτερα «εξωτικός» βιοαισθητήρας (Whispering Gallery Mode ή WGM), έλκει τη καταγωγή του ονόματός του, από το γνωστό από πολύ παλιά ακουστικό φαινόμενο της «Στοάς που ψιθυρίζει», που γίνεται άμεσα αντιληπτό στους επισκέπτες της κυκλικής στοάς του τρούλου του Ναού του Αγίου Παύλου στο Λονδίνο. «Αν κάποιος επισκέπτης ψιθυρίσει κάτι, στραμμένος προς το τοίχο της Κυκλικής Στοάς, ένας άλλος επισκέπτης που βρίσκεται στο εκ διαμέτρου αντίθετο σημείο της στοάς, μπορεί να ακούσει τον ψίθυρο, αν πλησιάσει το αυτί του στον τοίχο, ενώ, αν ο πρώτος επισκέπτης φωνάξει δυνατά και απ ευθείας (απόσταση ~ 42 m) στον δεύτερο, η φωνή του θα εξασθενήσει από την απόσταση και θα χαθεί στην οχλαγωγία των πολλών επισκεπτών του τρούλου του Ναού». Το φαινόμενο οφείλεται στη δημιουργία από το ψίθυρο ακουστικών κυμάτων, που οδεύουν με μικρές απώλειες κατά μήκος της περιφέρειας της κυκλικής στοάς και γίνονται ευκρινώς ακουστά, εφόσον δεν συναντήσουν κάποιο εμπόδιο π.χ. κάποιους άλλους εύσωμους επισκέπτες καθισμένους κοντά στο τοίχο, οπότε η ένταση και η χροιά του ψιθύρου, μεταβάλλεται συναρτήσει του αριθμού και της σωματικής τους διάπλασης. Αν βάλουμε στη θέση του τρούλου του Ναού του Αγίου Παύλου ένα κοίλο μικροσφαιρίδιο από πυριτιούχο υλικό, στην επιφάνεια του οποίου έχουμε συνδέσει νουκλεοτίδια, πεπτίδια, πρωτεΐνες, κ.λπ. για να συνδεθεί το υπό ανίχνευση βιομόριο (στη θέση του ευτραφούς επισκέπτη!) και αντικαταστήσουμε το ψίθυρο ανάμεσα στους δύο επισκέπτες, με ένα LASER μεταβαλλόμενου μήκους κύματος και ένα κατάλληλο φωτοανιχνευτή, τότε η παραμόρφωση της έντασης και της χροιάς του ψιθύρου, μεταλλάσσεται σε αντίστοιχη μετρήσιμη μεταβολή της έντασης της δέσμης του LASER, που δημιουργεί σε νανοκλίμακα, οπτικά κύματα, τα οποία οδεύουν με μικρές απώλειες κατά μήκος της περιφέρειας του κοίλου μικροσφαιριδίου, και παρουσιάζουν βύθιση της έντασής τους, σε μια περιοχή μηκών κύματος, ανάλογα με τη γεωμετρία του συνδεδεμένου βιομορίου. Από την παραμόρφωση αυτή μπορούμε να ανιχνεύσουμε και να ταυτοποιήσουμε τα τυχόν συνδεόμενα βιομόρια και το πλήθος τους. Σχήμα 7.35 Το ακουστικό φαινόμενο WGM. 211

213 Σχήμα 7.36 Διέγερση του ισημερινού WGM μικροσφαιριδίων με εφήμερη σύζευξη με ένα κύμα κατευθυνόμενο μέσα σε μια κωνική οπτική ίνα (δεξιά). Οι θέσεις συντονισμού ανιχνεύονται ως βυθίσεις στο μεταδιδόμενο φως Τ σε συγκεκριμένα μήκη κύματος LASER (Vollmer et al., 2008 Cai et al., 2000). Η ταυτοποίηση των βιομορίων, μπορεί να ελεγχθεί ανεξάρτητα και με την σήμανση τους, στη διάρκεια της επώασης με κβαντικές κηλίδες, μια προσέγγιση που μεγιστοποιεί μεν την ευαισθησία και κυρίως την ειδικότητα της μεθόδου, αυξάνει όμως δραματικά την περιπλοκότητα και το κόστος της. Η μηχανικής (ακουστικής) προέλευσης, οπτική μέθοδος στη σημερινή εφαρμογή της, δείχνει χαρακτηριστικά την δυνατότητα απόδοσης, ποιοτικά νέου καινοτομικού περιεχομένου, σε «παλιά» φαινόμενα, στη σύγχρονη έρευνα, στον αναδυόμενο κόσμο του «πολύ μικρού». Σχήμα 7.37 Η κατανομή 1119 εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας ( ) που εντοπίσθηκαν στις τρεις σημαντικότερες ομάδες βιοαισθητήρων (οπτικοί. ηλεκτροχημικοί και νανο-αισθητήρες). 212

214 Σχήμα 7.38 Χρονική εξέλιξη του αριθμού των αιτήσεων Δ.Ε. για την ίδια χρονική περίοδο. Η ενσωμάτωση βιοαισθητήρων και μεθόδων σε μικρογραφημένες διατάξεις: Ενώ ορισμένοι τομείς της in vitro διαγνωστικής έχουν αλλάξει σημαντικά τα τελευταία 15 χρόνια, σε άλλους τομείς δεν επαληθεύθηκαν οι αναμενόμενες ριζικές αλλαγές. Πολλές από τις εξωτικές τεχνολογίες που εμφανίστηκαν (π.χ. microarrays, biomarkers, γενετικές εξετάσεις κ.λπ.), δεν χρησιμοποιούνται ακόμα ιδιαίτερα έξω από την έρευνα, παρά την ύπαρξη ορισμένων αξιοπρόσεχτων εξαιρέσεων. Σε επίπεδο αγοράς, μόνον οι in vitro διαγνωστικές δοκιμασίες στο σημείο φροντίδας (παρακλίνιες εξετάσεις ή Point of Care Techniques ή PοCΤ) και οι μοριακές μέθοδοι παρουσιάζουν συνεχή ανάπτυξη μέσα στην συνολική αγορά των IVD. Μολονότι πολλές δεκάδες εμπορικά διαθέσιμων διαγνωστικών δοκιμασιών έχουν ήδη εγκριθεί από το FDA στις ΗΠΑ, για χρήση χωρίς συνταγή και για κατ οίκον εφαρμογή, η αγορά περιορίζεται ακόμα σε μεγάλο βαθμό στις ίδιες περιοχές (διαβήτης, πηκτικότητα, εγκυμοσύνη, αέρια αίματος, καρδιακοί δείκτες κ.λπ.), οι οποίες και παράγουν τον μεγάλο όγκο των πωλήσεων. Τα ευρηματικά συστήματα Lab-on-a-Chip (LOC) φαίνεται και αυτά να μην έχουν επιτύχει ακόμα ικανοποιητικά τον συνδυασμό μικροηλεκτρονικής, μικρορευστομηχανικής, βιολογίας και χημείας, σε χαμηλό κόστος, με αξιοπιστία και επαναληπτικότητα, κατάλληλη για μεγάλης κλίμακας παραγωγή. Παρ όλα αυτά, η ανάπτυξη πολλών νέων μεθόδων, όπως φαίνεται από την αξιολόγηση των τίτλων βιομηχανικής ιδιοκτησίας που κάναμε, βασίζεται στις πολυσχιδείς υπό ανάπτυξη νανοτεχνολογίες, που ήδη περιγράφτηκε εν συντομία και μπορούν να ενσωματωθούν σε διάφορες μορφές μικροδιατάξεων, κυρίως πλευρικής μικροροής. Είναι γεγονός ότι πολλά από τα χαρακτηριστικά των αναδυομένων αυτών τεχνολογιών, δημιουργούν βάσιμες προσδοκίες για την υπέρβαση των περιορισμών, που εμπόδισαν την ταχύτερη και πληρέστερη ενσωμάτωση τους σε κατάλληλες και για την κλινική πράξη μικροδιατάξεις. Στο γράφημα του Σχήματος 7.38 παρουσιάζεται η παράλληλη εξέλιξη των εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας κατ' έτος ( ) για τις τρεις σημαντικότερες ομάδες βιοαισθητήρων (οπτικοί, ηλεκτροχημικοί και νάνο-αισθητήρες). Στα μέσα της πενταετίας , διακρίνεται μια έντονη συσσώρευση δραστηριότητας η οποία ανακόπτεται πιθανά από την οικονομική κρίση μετά το Εδώ πρέπει να ληφθεί υπ όψη και το υποχρεωτικό 18μηνο που μεσολαβεί από την ημερομηνία υποβολής της αίτησης ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας μέχρι την δημοσίευσή της. Στον Πίνακα 7.3 που ακολουθεί, παρουσιάζεται η ταυτότητα επιλεγμένων εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, τα οποία αφορούν σε ευρεσιτεχνίες σχετικές με ανοσοχημικές δοκιμασίες, ηλεκτροχημικούς βιοαισθητήρες, μεθόδους βασισμένες στο φθορισμό, μοριακά διαγνωστικά και με γενικότερα συστήματα πλευρικής ροής, περιοχές ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για την εκτίμηση των μελλοντικών εξελίξεων στην ανίχνευση αιματογενώς μεταδιδομένων παραγόντων. 213

215 Αναδυόμενες Μέθοδοι/Τεχνικές Αριθμός Εγγράφων Ταυτότητα Εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας Ιδιαιτέρου ενδιαφέροντος Ανοσοχημικές Δοκιμασίες Ηλεκτροχημικοί Βιοαισθητήρες Μέθοδοι βασισμένες στο Φθορισμό Μοριακά Διαγνωστικά Συστήματα Πλευρικής Ροής US A1 US A1 WO A1 JP A US A1 EP A2 US B1 US A1 WO A2 WO A2 US A US A1 US A1 US A1 US A1 US A1 US A1 WO US A1 US A1 US B1 US A US A1 WO A2 WO A2 WO A1 US A US A1 US A1 US A1 WO A1 US A1 US A1 WO A1 US A1 US A1 US A1 US B1 US A1 WO A1 WO A1 WO A1 US B1 US A1 US A1 US A1 WO A2 US A1 US A1 WO A2 Πίνακας 7.3 Η ταυτότητα επιλεγμένων εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας ιδιαίτερου ενδιαφέροντος. Η δεύτερη γενιά βιοαισθητήρων θα συμβάλλει στην ανάπτυξη ιδιαίτερα αποτελεσματικών μικρογραφημένων συστημάτων. Οι νέες φυσικές και χημικές αρχές σύνδεσης και ανίχνευσής που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα συστήματα, συνδυάζουν μικρο- και νανοτεχνολογίες και υπόσχονται εξαιρετικά επίπεδα ευαισθησίας φέρνοντας πιο κοντά στην ανάπτυξη λογικού κόστους δοκιμασιών, για την ανίχνευση νουκλεοτιδίων και πεπτιδίων. Εντούτοις, ακόμα δεν υπάρχει μια καθολικά αποδεκτή πλατφόρμα κλινικής αξιοποίησης των μικρογραφημένων συστημάτων, που εκμεταλλεύονται τις νανοτεχνολογίες, μολονότι τα πειραματικά ερευνητικά δεδομένα, αναδεικνύουν ότι είναι εξίσου αποτελεσματικά και ανθεκτικά, με τις χρησιμοποιούμενες πλατφόρμες, των καταξιωμένων δοκιμασιών ELISA ή PCR. Κλείνοντας, θα παρουσιάσουμε ενδεικτικά μια πολύ πρόσφατη αλλά και ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα αίτηση Δ.Ε. για ένα σχετικά «γενικευμένο» υπόδειγμα LOC, που περιλαμβάνει: Μια είσοδο δείγματος για τη λήψη ενός υγρού δείγματος και ένα τμήμα προετοιμασίας του δείγματος (Sample Preparation Module ή SPM), συζευγμένη με την είσοδο του δείγματος. Η SPM περιλαμβάνει: ένα θάλαμο ανάμειξης, ένα θάλαμο αντιδραστηρίου, που περιέχει ένα αντιδραστήριο, μια ημιπερατή μεμβράνη, προσανατολισμένη μεταξύ του θαλάμου αναμείξεως και του θαλάμου αντιδραστηρίου και μια συντονιζόμενη πηγή ενέργειας, που αναγκάζει επιλεκτικά τα περιεχόμενα του θαλάμου αντιδραστηρίου, να επεκταθούν και να περάσουν μέσα από την ημι-περατή μεμβράνη, στο θάλαμο αναμίξεως, για την ανάμιξη του αντιδραστηρίου με το υγρό δείγμα. Το LOC περιλαμβάνει περαιτέρω ένα μικροδίαυλο συζευγμένο στο SPM. Μια πηγή φωτός και μια οπτική μονάδα, πλησίον του μικροδιαύλου, καθώς και ένας αριθμό φακών, εντός της οπτικής μονάδας, που κάθε φακός έχει μια διαφορετική ενεργή εστιακή απόσταση, για τη δημιουργία μιας ενιαίας σύνθετης εικόνας, ενός αντικειμένου που διέρχεται μέσω του μικροδιαύλου. 214

216 Σχήμα 7.39 Ένα υποδειγματικά απλό Lab-on-a-chip. Σχήμα 7.40 Λεπτομερής περιγραφή ενός lab-on-a-chip. 215

217 Σχήμα 7.41 Ένα πολύ λεπτομερές σχηματικό διάγραμμα, όπως περιγράφεται στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε. US A1 (Durniak et al., 2015). Η ανασκόπηση εκατοντάδων εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας έδειξε ότι το πλήθος των διαθέσιμων καινοτόμων προσεγγίσεων είναι μεγάλο και μένει να αναπτυχθούν στην επόμενη δεκαετία, συνδυασμοί τους, ικανοί να καλύψουν με το καλύτερο δυνατό τρόπο, τις απαιτήσεις, τόσο της ποιότητας, όσο και του κόστους, της σύγχρονης IVDs τεχνολογίας. 216

218 Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/3/2015). Αναφορές 1. AHMAD, AZMAT, Z. et al. (2007) Αutomated laboratory test ordering and result tracking. US (A1), Publication Date: 20/12/2007, Assignee: Cerner Innovation Inc., Overland Park, KS, USA. 2. CAI, Μ., PAINTER, Ο., VAHALA,.J. (2000) Observation of Critical Coupling in a Fiber Taper to a Silica-Microsphere Whispering-Gallery Mode System. Phys. Review Letters, 85, p DURNIAK, Τ., FRIEDLANDER, R., KRAEMER, J.R. (2015) Lab on a chip, US A1, Publication Date: 05/02/2015, Assignee: International Business Machines Corporation. 4. FRACH, T. (2014) Position-sensitive readout modes for digital Si-Photomultiplier Arrays, MX (A). Assignee: Koninkl. Philips NV, NL. 5. FUNAMOTO, TATSUAKI (2015) Colorimetry Apparatus, US , Publication Date: 12/02/2015, Assignee: SEIKO-EPSON Corporation. 6. GUIZHENG, Z., SHUFENG, L., GUODONG, L. (2012) Near-infrared electro-generated Chemiluminescence Immuno-Detection method. CN (A) Publication Date: 24/10/2012, Assignee: Univ. Shandong. 7. ISAMI, TADAO et al. (2015) Plate, Production Method for Plate, Biochip Observation Method, and Screening Method. WO (A1), Publication Date: Assignee: Nikon Corp. JP. 8. KANAI, S., et al. (2014) Position sensitive solid-state photomultipliers, systems and methods. US Patent , Granted on November 25, 2014, Assignee: Radiation Monitoring Devices, Inc. USA. 9. ΚLAUS, W., BERND, T., TIMOTHY, R., HANSEN. (2015) Nephelometry method and apparatus for determining the concentration of suspended particles in an array of sample containers, WO (A1), Publication Date: 26/02/2015, Assignee: Becton, Dickinson & Company. 10. MACBEATH, G. & SCHREIBER L. (2000) Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination. Science 08/09/2000, Vol (τελευταία προσπέλαση 1/3/2015). 11. ΟΛΖΙΕΡΣΚΥ, Α. (2006) Μελέτη και Ανάπτυξη Συστοιχιών Νανοκρυσταλλιτών Ημιαγωγών σε Μήτρα Μονωτικού για Εφαρμογές σε Μνήμες. Αθήνα: EΚΠΑ. 12. Olympus Specialized Microscopy Techniques: Anatomy of a CCD, accessed on: (τελευταία προσπέλαση 1/3/2015). 13. RICCHIO, SAMUEL, G., et al. (1993) Automatic chemistry analyzer. US Patent , Granted on May 25/1993. Assignee: Beckman Instr. USA. 14. SHIMOYAMA, ISAO et al. (2012) SPR Sensor and inspection system mounting SPR sensor. P (A), Publication Date: 29/11/2012, Assignee: Univ. of Tokyo, Olympus Corp. 15. SKEGGS, L., & HOCHSTRASSER H. (1964) Multiple automatic sequential analysis. Clin Chem 10. p SKEGGS, L. (1955) Automatic analyzing apparatus, US Patent , Assignee: Technicon, Instr, USA. 17. SKEGGS, L. (2000) Persistence... and Prayer: From the Artificial Kidney to the Auto-Analyzer. Clin Chem, 46, p ΣΠΥΡΟΠΟΥΛΟΣ, B. (2011) Αναδυόμενες σμικρυσμένες τεχνικές στην ανίχνευση μεταδιδομένων με τη μετάγγιση παραγόντων: Μια εκτίμηση στην πορεία τους βασισμένη στην ανασκόπηση σχετικών τίτλων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας. Haema, 2(1), p ΣΠΥΡΟΠΟΥΛΟΣ, Β. (2014) Ορισμένες προοπτικές των Κβαντικών Τελειών (Quantum Dots) στην in vitro Διαγνωστική. Πρακτικά 12 ου Πανελλήνιου Συνέδριου Κλινικής Χημείας, Αθήνα, 7-8 Νοεμβρίου TAKIGUCHI, Y. (1988) Immuno Analyzer. JP S (A). Filing Date: 02/12/1988, Assignee: Toshiba Corp., Japan. 217

219 21. TZAVARAS, A, & SPYROPOULOS, B. (2013) An overview of crucial functional components of modern Clinical Chemistry automated analyzers. Regional European Congress of Biomedical Laboratory Science. p TOKUNAGA, KAZUTOSHI, YAMAMOTO, NORIMASA. (2007) Analyzer. US , Filing Date: 27/12/2007, Assignee: Sysmex Corporation Analyzer. Japan. 23. VOLLMER, F., ARNOLD, S., KENG, D. (2008) Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105(208). p WEI & MIN et al. (2014) Preparation method and application of electrochemical biosensor based on three-dimensional nano-porous gold-modified boron-doped diamond electrode. CN (A), Publication Date: 10/09/2014, Assignee: Univ. Henan Technol. 25. YAMAZAKI, I., NISHIDA, M., KAMIHARA, K., TAMEZANE, H. (2014) Automatic analyzer. US (A1), Publication Date: 07/08/2014, Assignee: Hitachi High-Technologies Corporation. 26. ZHU, J. et al. (2013) Quantum Dots for DNA Biosensing, Springer Briefs in Molecular Science, 2013 (VIII). 218

220 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (ΑΠΟΔΟΣΗΣ) (HPLC) ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό επεξηγούνται οι βασικές αρχές ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού και παρουσιάζονται οι κυριότερες έννοιες και η ορολογία με τις οποίες περιγράφεται μια χρωματογραφική ανάλυση. Μεταξύ των χρωματογραφικών τεχνικών που περιγράφονται δίνεται έμφαση στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης και στη Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας, που εφαρμόζονται περισσότερο στην κλινική ανάλυση. Η περιγραφή επικεντρώνεται στη συνέχεια στην περισσότερο χρησιμοποιούμενη υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης βασιζόμενη στη χρωματογραφία προσρόφησης, στην εφαρμογή αυτής στον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό και στη μεθοδολογία ανάπτυξης πρωτοκόλλου χρωματογραφικού διαχωρισμού. Προβάλλονται οι κύριες εφαρμογές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης στην κλινική ανάλυση και παρουσιάζεται αναλυτικά το παράδειγμα προσδιορισμού της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Το κεφάλαιο ολοκληρώνεται με πειραματικό παράδειγμα προσδιορισμού φαρμακευτικής ουσίας στον ορό. Προαπαιτούμενες γνώσεις Δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο προαπαιτούμενο κεφάλαιο σε αυτό το βιβλίο. Ως προαπαιτούμενες γνώσεις όμως, μπορούν να θεωρηθούν οι έννοιες της πολικότητας των μορίων, των χαρακτηριστικών ομάδων των οργανικών μορίων και της διαλυτότητας αυτών. 8.1 Εισαγωγή Ο όρος χρωματογραφία (chromatography) περιλαμβάνει πλήθος αναλυτικών τεχνικών που εφαρμόζονται κοινώς στον διαχωρισμό των συστατικών μιγμάτων ουσιών. Οι χρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού εφαρμόζονται ευρύτατα για τη διαπίστωση της παρουσίας ή μη συστατικών σε μίγματα τα οποία περιέχουν ένα περιορισμένο αριθμό άλλων ουσιών/προσμίξεων, γνωστής, ως επί το πλείστον, ταυτότητας. Η επιβεβαίωση της ταυτότητας των συστατικών του μίγματος προαπαιτεί τον χρωματογραφικό διαχωρισμό αυτών με σκοπό την απομόνωσή τους. Ακολουθεί ανάλυση των απομονούμενων συστατικών με χημικές ή φασματοσκοπικές τεχνικές. Πέραν των εφαρμογών της στην κλινική ανάλυση, η χρωματογραφία χρησιμοποιείται ευρύτατα στη φαρμακευτική ανάλυση, την ανάλυση τροφίμων και περιβαλλοντικών δειγμάτων, στη βιοχημική έρευνα, όπως και στην καθημερινή πρακτική ενός συνθετικού χημικού εργαστηρίου και αλλού. Σε συνδυασμό με επακόλουθη συζευγμένη τεχνική ανίχνευσης (tandem chromatography), κυρίως με φασματοσκοπικές τεχνικές όπως UV/Vis, MS ή IR, η χρωματογραφία αποτελεί το αναγκαίο προκαταρκτικό στάδιο όχι μόνο για τον ποιοτικό χαραχτηρισμό, αλλά και τον ποσοτικό προσδιορισμό των διαχωριζόμενων ουσιών μεταβολιτών φαρμάκων κ.α. Τέλος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως μέθοδος απομόνωσης των συστατικών ενός μίγματος στην φυτοχημεία, χημεία φυσικών προϊόντων κ.α. (προπαρασκευαστική χρωματογραφία, preparatory chromatography). Κάθε χρωματογραφική τεχνική περιλαμβάνει μία κινητή φάση (mobile phase), η οποία ρέει μεταφέροντας τις διαχωριζόμενες ουσίες συστατικά ενός μίγματος- μέσω μίας στατικής φάσης (static phase). Η κινητή φάση αποτελείται από ένα διαλύτη ή σύστημα διαλυτών, ενώ η στατική φάση από πορώδες στερεό υλικό ή από υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα. Ο διαχωρισμός των συστατικών στη χρωματογραφία βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό αλληλεπίδρασης του κάθε συστατικού με τις δύο φάσεις, ο οποίος καθορίζεται από την αγχιστεία (φυσικοχημική συγγένεια) του συστατικού με την κάθε φάση). Κάθε μόριο μίας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης μετακινείται πάρα πολλές φορές μεταξύ της κινητής φάσης 219

221 (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης (όπου προσροφάται ή κατανέμεται ή δεσμεύεται λόγω αγχιστείας κ.τ.λ.) και αντίστροφα (Σχήμα 8.1). Σχήμα 8.1 Αρχή διαχωρισμού συστατικών μίγματος με την τεχνική της χρωματογραφίας. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται βάσει της διαφορετικής αγχιστείας των συστατικών με την κινητή και στατική φάση. Αναπαρίσταται η πορεία μορίων δύο διαφορετικών ουσιών διαμέσου μίας στήλης. Το μπλε μόριο κατανέμεται πιο σημαντικά στην κινητή φάση και συνεπώς παρασύρεται από αυτήν ταχύτερα, διότι δεν αλληλεπιδρά ισχυρά με τη στατική φάση. Αντίθετα το κίτρινο μόριο αλληλεπιδρά ισχυρότερα με τη στατική φάση, με αποτέλεσμα να επιβραδύνεται. Κατά συνέπεια το κίτρινο συστατικό θα κινείται βραδύτερα από το μπλε, με αποτέλεσμα τον διαχωρισμό τους. Η διαφορετική αυτή αγχιστεία οφείλεται στις διαφορές των συστατικών του μίγματος σε ορισμένα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους, όπως π.χ. διαφορές στο μέγεθος του μορίου, το φορτίο, την πτητικότητα και τη διαλυτότητα. Η αγχιστεία αυτή περιγράφεται από τον συντελεστή κατανομής Κ (partition coefficient) ο οποίος ορίζεται ως: Κ=Cs/C m (Εξίσωση 8.1) όπου: C: η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στη στατική φάση και C m η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στην κινητή φάση. Ο συντελεστής κατανομής εκφράζεται δηλαδή από το λόγο της συγκέντρωσης της ουσίας στη στατική φάση προς τη συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση. Η κατανομή αυτή καθορίζεται από τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της ουσίας, αλλά και από τη φύση της κινητής, όπως και της στατικής φάσης. Η παράμετρος Κ είναι μία χαρακτηριστική σταθερά για τη δεδομένη χημική ένωση και το ζεύγος στατικής/κινητής φάσης, σε μια δεδομένη θερμοκρασία. Έτσι, μία ουσία που αλληλεπιδρά ισχυρά με τη στατική φάση «επιβραδύνεται» σε σχέση με μία ουσία που κατανέμεται πιο σημαντικά στην κινητή φάση και «παρασύρεται ταχύτερα» από αυτή. Ως αποτέλεσμα, οι δύο ουσίες διαχωρίζονται. Πρέπει να τονισθεί ότι ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός είναι το αποτέλεσµα επαναλαµβανοµένων ισορροπιών των συστατικών µεταξύ των δύο φάσεων κατά τη µετακίνησή τους. Είναι προφανές, ότι προκειμένου να διαχωριστούν δύο ουσίες θα πρέπει να διαφέρουν οι συντελεστές κατανομής αυτών. Σύνοψη: Οι χρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού εφαρμόζονται στο διαχωρισμό συστατικών μιγμάτων που περιέχουν περιορισμένο αριθμό προσμίξεων γνωστής, ως επί το πλείστον, ταυτότητας. Η επιβεβαίωση της ταυτότητας των διαχωριζόμενων ουσιών απαιτεί επακόλουθη ανάλυση των απομονούμενων συστατικών με χημικές ή φασματοσκοπικές τεχνικές. Σύνοψη: Σε ένα χρωματογραφικό διαχωρισμό οι δύο φάσεις επιλέγονται έτσι, ώστε τα συστατικά του δείγματος να κατανέμονται μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης σε διαφορετικό βαθμό και συνεπώς να καθυστερούν περισσότερο ή λιγότερο και να διαχωρίζονται. 8.2 Διάκριση Χρωματογραφικών τεχνικών Οι χρωματογραφικές τεχνικές μπορούν να ομαδοποιηθούν, με διάφορα κριτήρια. Έτσι, με βάση το μέσο στο οποίο τοποθετείται η στατική φάση, μία βασική διάκριση γίνεται με κριτήριο τη χρωματογραφία στήλης και την επίπεδη χρωματογραφία, ενώ με βάση το είδος της κινητής και στατικής φάσης, διακρίνουμε την υγρή χρωματογραφία και την αέρια χρωματογραφία. Τέλος, ανάλογα με το μηχανισμό αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και την στατική φάση, οι χρωματογραφικές τεχνικές 220

222 διακρίνονται σε χρωµατογραφία προσρόφησης, κατανοµής, ιονανταλλαγής, µοριακού αποκλεισµού και χηµικής συγγένειας Χρωματογραφία Στήλης Στη χρωματογραφία στήλης (column chromatography) η στατική φάση βρίσκεται ως πληρωτικό υλικό ακινητοποιημένη στο εσωτερικό στήλης κατασκευασµένης από αδρανές υλικό (π.χ. από ύαλο ή ανοξείδωτο χάλυβα). Η κινητή φάση διέρχεται υπό συνεχή ροή διαμέσου της στήλης. Η διέλευση της κινητής φάσης γίνεται είτε λόγω βαρύτητας, είτε υπό υψηλή πίεση, που επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλίας. Από τη στιγμή που θα εισαχθεί το δείγμα στην κορυφή της στήλης, τα επιμέρους συστατικά του δείγματος υφίστανται διαδοχικές κατανομές μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Το κλάσμα κάθε συστατικού, που βρίσκεται κάθε στιγμή στην κινητή φάση, μετακινείται υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. Για το κάθε μόριο κάθε στιγμή επέρχεται νέος καταμερισμός μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων κάθε συστατικού εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους στην στατική φάση, ως προς το χρόνο παραμονής τους στην κινητή φάση και είναι ανάλογη του συντελεστή κατανομής του συστατικού στις δύο φάσεις. Είναι ευνόητο ότι ο διαχωρισμός των επιμέρους συστατικών είναι εφικτός με την προϋπόθεση, ότι αυτά έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής. Κατά την πρόοδο της ανάλυσης, ο διαχωρισμός των συστατικών γίνεται αποτελεσματικότερος. Με την ολοκλήρωση της πορείας τους στη στήλη, τα συστατικά θα έχουν διαχωρισθεί, οπότε θα εξέλθουν σε διαφορετικούς χρόνους από τη στήλη. Ο διαχωρισμός ενός δείγματος στα επιμέρους συστατικά του υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης στη χρωματογραφία στήλης παρουσιάζεται υπό τη μορφή επίδειξης στο Animation 8.1. Animation 8.1 O διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος (εδώ σημειώνονται με κίτρινο και μπλε χρώμα) σε χρωματογραφία στήλης. Σύνοψη: Στη χρωματογραφία στήλης ορισμένη ποσότητα δείγματος ενίεται στην κινητή φάση στην αρχή της στήλης. Το δείγμα μετακινείται στη στήλη υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. Τα επιμέρους συστατικά του δείγματος, με την προϋπόθεση, ότι έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής, μετακινούνται με διαφορετική μέση ταχύτητα μέσα στη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες Επίπεδη Χρωματογραφία Στην επίπεδη χρωματογραφία (planar chromatography) η στατική φάση εμφανίζεται ως επίπεδη επιφάνεια π.χ. τμήμα γυαλιού ή φύλλου αλουμινίου επικαλυμένο με προσροφητικό υλικό στην χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography ή TLC), ή φύλλο κελουλόζης στην χρωματογραφία χάρτου (paper chromatography). Και στα δύο αυτά είδη χρωματογραφίας, η κινητή φάση κινείται διαμέσου της στατικής φάσης, λόγω τριχοειδών φαινομένων και βαρύτητας. Στην TLC, (Animation 8.2) η στατική φάση συνηθέστερα αποτελείται από μία λεπτή στοιβάδα πηκτής διοξείδιου του πυριτίου (silica gel) η οποία επικαλύπτει στερεό επίπεδο υλικό, όπως πλάκα γυαλιού ή φύλλο 221

223 αλουμινίου. Το διάλυμα του υπό εξέταση δείγματος και οι κατάλληλοι μάρτυρες τοποθετούνται ως κηλίδες στη γραμμή εκκίνησης, κοντά στο κατώτερο άκρο της πλάκας. Η πλάκα στη συνέχεια τοποθετείται μετά σε θάλαμο ανάπτυξης, στον πυθμένα του οποίου βρίσκεται το σύστημα των διαλυτών της κινητής φάσης, ενώ ο υπερκείμενος χώρος είναι κορεσμένος σε ατμούς των διαλυτών. Με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων η πλάκα διαβρέχεται από την κινητή φάση, μέχρι το μέτωπο του διαλύτη να φθάσει λίγα εκατοστά πριν το άνω άκρο της. Επειδή η στατική φάση αποτελείται από πηκτή οξειδίου του πυριτίου διαθέτει επιφανειακές υδροξυλομάδες που της προσδίδουν πολικό χαρακτήρα. Κατά την ανάλυση η στοιβάδα οξειδίου του πυριτίου κορέννυται με νερό. Κατά συνέπεια αλληλεπιδρά ισχυρότερα με πολικές ενώσεις. Έτσι, οι ουσίες που περιέχονται στο υπό εξέταση δείγμα, μετακινούνται στην πλάκα με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με την πολικότητα τους, με τις λιγότερο πολικές ουσίες να κατανέμονται σημαντικότερα στην λιγότερο πολική κινητή φάση και να προπορεύονται. Με τον τρόπο αυτό τα συστατικά ενός μίγματος διαχωρίζονται και σχηματίζουν αυτόνομες κηλίδες επάνω στην πλάκα. Είναι προφανές ότι τα συστατικά του μίγματος θα έχουν διανύσει ίση απόσταση από τη γραμμή εκκίνησης με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Οι κηλίδες γίνονται διακριτές είτε στο υπεριώδες φως (Φωτογραφία 8.1), είτε μετά από ψεκασμό με ειδικά αντιδραστήρια (Φωτογραφία 8.2). Αυτά αντιδρώντας με την προς ανίχνευση ουσία δίνουν χαρακτηριστικές αντιδράσεις, κατά τις οποίες παράγεται έγχρωμο προϊόν. Συχνά απαιτείται και θέρμανση της πλάκας για την επιτάχυνση της αντίδρασης ανίχνευσης. Εναλλακτικά, γίνεται εμβάπτιση της πλάκας σε διάλυμα που περιέχει τα κατάλληλα αντιδραστήρια ανίχνευσης. Η ταυτοποίηση των συστατικών ενός μίγματος βασίζεται λοιπόν στην απόσταση που έχουν διανύσει μάρτυρες, που αναπτύσσονται παράλληλα με το προς διαχωρισμό μίγμα, σε συνδυασμό με τις χαρακτηριστικές αντιδράσεις που δίνουν οι διαχωριζόμενες ουσίες. Animation 8.2 Επιμέρους στάδια ανάπτυξης και συνακόλουθης ταυτοποίησης τριών άγνωστων δειγμάτων παράλληλα με δύο μάρτυρες με χρωματογραφία TLC. Φωτογραφία 8.1 Θάλαμος υπεριώδους (στην φωτογραφία αυτή από τον οίκο CAMAG) για την παρατήρηση των κηλίδων των δειγμάτων πάνω σε πλάκα TLC. Υπό το υπεριώδες φως οι ουσίες διακρίνονται ως έγχρωμες κηλίδες κατά την εξέταση της πλάκας. 222

224 Φωτογραφία 8.2 Σύστημα ψεκασμού χρωστικής σε πλάκα TLC (στη φωτογραφία αυτή από τον οίκο Labfriend. Κατά τον ψεκασμό πραγματοποιείται χαρακτηριστική αντίδραση ανίχνευσης οπότε οι ουσίες διακρίνονται πλέον ως έγχρωμες κηλίδες. Σύνοψη: Στην TLC η στατική φάση συνηθέστερα αποτελείται από μία λεπτή στοιβάδα πηκτής διοξείδιου του πυριτίου (silica gel) η οποία επικαλύπτει στερεό επίπεδο υλικό. Η ανάπτυξη γίνεται κατακόρυφα, όπου με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων, η πλάκα διαβρέχεται από την κινητή φάση, H ταυτοποίηση των συστατικών ενός μίγματος γίνεται με βάση την ίση απόσταση που έχουν διανύσει μάρτυρες που αναπτύσσονται παράλληλα με το προς διαχωρισμό μίγμα, σε συνδυασμό με τις χαρακτηριστικές αντιδράσεις που δίνουν οι διαχωριζόμενες ουσίες Αέρια Χρωματογραφία Στην αέρια χρωματογραφία (Gas Chromatography ή GC) χρησιμοποιείται αέρια κινητή φάση και ως στατική φάση χρησιμοποιείται είτε στήλη με στερεό πληρωτικό υλικό, είτε τριχοειδής στήλη (capillary column). Συχνά υπάρχει λεπτή στοιβάδα υγρού υψηλού σημείου ζέσεως, ακινητοποιημένου στην επιφάνεια του αδρανούς στερεού υποστρώματος. Πάνω από αυτήν ρέει αδρανές αέριο (φέρον αέριο, carrier gas) το οποίο αποτελεί την κινητή φάση. Στην περίπτωση αυτή μιλάμε για χρωματογραφία αερίου-υγρού. Η αέρια χρωματογραφία έχει σχετικά περιορισμένη εφαρμογή, διότι είναι κατάλληλη για την ανάλυση μιγμάτων πτητικών μόνο ουσιών (όπως αρωμάτων). Επίσης εφαρμόζεται στην ανάλυση ουσιών που καθίστανται πτητικές - χωρίς όμως να διασπώνται - με σημαντική άνοδο της θερμοκρασίας (Σχήμα 8.2). Το δείγμα ενίεται στον εισαγωγέα, όπου εξατμίζεται ταχύτατα και εισάγεται σε χρωματογραφική στήλη (στατική φάση) καθώς παρασύρεται από το αδρανές φέρον αέριο (κινητή φάση). Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με κατανομή του αναλύτη μεταξύ της αέριας κινητής και της υγρής ή στερεής στατικής φάσης. O διαχωρισμός πραγματοποιείται σε υψηλές θερμοκρασίες και γι αυτό το λόγο η στήλη είναι εγκλεισμένη σε φούρνο. Συνέπεια των παραπάνω είναι ότι η εφαρμογή της GC περιορίζεται στο διαχωρισμό σχετικά μικρού μοριακού βάρους ουσιών (εφόσον η πτητικότητα μειώνεται στις μεγαλύτερου μοριακού βάρους ενώσεις). Σχήμα 8.2 Σχηματική αναπαράσταση της βασικής διάταξης ενός αερίου χρωματογράφου (από την ιστοσελίδα του εμπορικού οίκου Agilent. 223

225 8.2.4 Υγρή Χρωματογραφία Στην υγρή χρωματογραφία (Liquid Chromatography ή LC) η κινητή φάση είναι υγρή, ενώ η στατική φάση μπορεί να είναι στερεή ή υγρή. Η LC βρίσκει ευρύτατη εφαρμογή, σε αντίθεση με την αέρια χρωματογραφία, με μοναδικό περιορισμό τη δυνατότητα διαλυτοποίησης των αναλυόμενων ουσιών στην κινητή φάση. Μη πτητικές και θερμοευαίσθητες ενώσεις διαχωρίζονται αποκλειστικά με υγρή χρωματογραφία. Παρακάτω, θα αναπτυχθεί εκτενώς η θεωρία και μεθοδολογία της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης Άλλες Χρωματογραφικές τεχνικές Aνάλογα με το μηχανισμό αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και την στατική φάση, οι χρωματογραφικές τεχνικές διακρίνονται σε χρωµατογραφία προσρόφησης, κατανοµής, ιονανταλλαγής, µοριακού αποκλεισµού και χηµικής συγγένειας. Στη χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησής τους στη στατική φάση. Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα ανάμεσα στον αναλύτη και τη στατική φάση οφείλονται κυρίως σε αλληλεπιδράσεις διπόλουδιπόλου, van der Waals και σε δεσμούς υδρογόνου (Σχήμα 8.3). Σχήμα 8.3 Χρωματογραφία προσρόφησης: O κόκκινος αναλύτης προσροφάται ισχυρότερα στην στατική φάση σε σχέση με τον μπλε, οπότε καθυστερεί να εξέλθει. Η χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό μη ιοντικών πολικών ενώσεων. Στην επιφάνεια του αδρανούς στερεού υποστρώματος υπάρχει ακινητοποιημένη λεπτή στοιβάδα υγρού (υψηλού σημείου ζέσεως). Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μείγματος μεταξύ της υγρής κινητής και της υγρής στατικής φάσης (Σχήμα 8.4). Σχήμα 8.4 Χρωματογραφία κατανομής: O κόκκινος αναλύτης κατανέμεται ισχυρότερα στην στατική φάση σε σχέση με τον μπλε, οπότε καθυστερεί να εξέλθει. 224

226 Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (size exclusion chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ενώσεων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από Da. Eφαρμόζεται συνεπώς στην ανάλυση και το χαρακτηρισμό των πολυμερών ενώσεων (συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών). Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το μέγεθος (και το σχήμα) των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων: ενώ τα μικρά μόρια καθυστερούν εισερχόμενα στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, τα μεγάλα μόρια δεν εισέρχονται στους πόρους της στατικής φάσης. Έτσι, τα τελευταία εξέρχονται πρώτα από τη στήλη (Σχήμα 8.5). Σχήμα 8.5 Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού: ο κόκκινος αναλύτης εισχωρώντας στους πόρους της στατικής φάσης καθυστερεί να εξέλθει σε σχέση με τους υπόλοιπους. Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion exchange chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ιοντικών ενώσεων. Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης (Σχήμα 8.6). Σχήμα 8.6 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής: Ο αρνητικά φορτισμένος κόκκινος αναλύτης αλληλεπιδρά με ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με τις θετικά φορτισμένες ομάδες της στατικής φάσης, οπότε καθυστερεί να εξέλθει. Η χρωματογραφία χημικής συγγένειας (affinity chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό εναντιομερών ενώσεων. Οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι ακινητοποιημένοι στη στατική φάση (Σχήμα 8.7). 225

227 Σχήμα 8.7 Χρωματογραφία χημικής συγγένειας: Ο κόκκινος αναλύτης δεσμεύεται από τη στατική φάση στην οποία υπάρχει ακινητοποιημένος υποκαταστάτης με εκλεκτική συγγένεια για τον κόκκινο αναλύτη. Κατά συνέπεια, καθυστερεί να εξέλθει σε σχέση με τους υπόλοιπους Χρωματογραφία HPLC H χρωματογραφία HPLC (High Pressure Liquid Chromatography ή High Performance Liquid Chromatography Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης ή Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης) αποτελεί σημαντικά εξελιγμένη μορφή της χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή φάση πλέον δεν ρέει υπό την επίδραση της βαρύτητας, αλλά με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και επιτρέπει τη χρήση χρωματογραφικών στηλών με μικρό μέγεθος σωματιδίων υλικού πλήρωσης. Η χρήση μικρoύ μεγέθους σωματιδίων υλικού πλήρωσης αυξάνει το εμβαδόν της επιφάνειας της στατικής φάσης, που είναι διαθέσιμο να αλληλεπιδράσει με τα μόρια που μεταφέρονται μέσω της κινητής φάσης. Κατά συνέπεια, βελτιώνεται ο διαχωρισμός των αναλυόμενων μορίων και μειώνεται σημαντικά το μέγεθος της στήλης που απαιτείται για έναν διαχωρισμό. Στη συνέχεια θα επικεντρωθούμε στην εφαρμογή της HPLC στη χρωματογραφία προσρόφησης, που είναι και η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη. Ανάλογα με τη σχέση της πολικότητας μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης υψηλής πίεσης: HPLC κανονικής φάσης και HPLC αντίστροφης φάσης. Σύνοψη: H χρωματογραφία HPLC αποτελεί παραλλαγή της κλασικής χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή φάση ρέει με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και μειώνει πολύ σημαντικά το μέγεθος της στήλης που απαιτείται για έναν διαχωρισμό. Τα δείγματα που αναλύονται με HPLC βρίσκονται αποκλειστικά σε υγρή μορφή Η HPLC Κανονικής Φάσης Στην HPLC κανονικής φάσης ως πληρωτικό υλικό χρησιμοποιείται κάποιο πολικό υλικό, όπως οξείδιο του πυριτίου (SiO 2) ή οξείδιο του αργιλίου (Al 2O 3). Η πολικότητα των υλικών αυτών οφείλεται στις υδροξυλομάδες που περιέχουν. Αντίθετα, η κινητή φάση είναι μειωμένης πολικότητας. Κοινώς χρησιμοποιούνται μη πολικοί διαλύτες, όπως εξάνιο ή χλωροφόρμιο, ενώ δεν περιέχεται στην κινητή φάση νερό. Έτσι, οι πολικές ενώσεις στο διαχωριζόμενο μίγμα αλληλεπιδρούν ισχυρότερα με την πολική στατική φάση, σε σύγκριση με τις άπολες ενώσεις (Σχήμα 8.8). Συνεπώς, οι λιγότερο πολικές ενώσεις διασχίζουν τη στήλη ταχύτερα και εκλούονται από αυτήν νωρίτερα. Η κατακράτηση ενός πολικού μορίου από τη στατική φάση οφείλεται στη προσρόφηση αυτού. Η έκλουση των πολικών μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται με την αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την πορεία της ανάλυσης. Με την αύξηση της πολικότητας της, περισσότερα μόρια διαλύτη αλληλεπιδρούν με τη στατική φάση ανταγωνιζόμενα τις προσροφημένες ουσίες για θέσεις πρόσδεσης. Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική (με προγραμματισμένη μεταβολή της πολικότητας της κινητής φάσης) έκλουση των προσροφημένων πολικών μορίων. 226

228 Η HPLC κανονικής φάσης χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό χημικών ενώσεων που δεν διαλύονται στο νερό ή που υδρολύονται (και συνεπώς δε συνιστάται η παραμονή τους σε υδατικό περιβάλλον). Επίσης, βρίσκει μεγάλη εφαρμογή στον διαχωρισμό ισομερών ουσιών. Στο Σχήμα 8.8 φαίνεται ο χρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC κανονικής φάσης, μίγματος αποτελούμενου από τριών τύπων μόρια, που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Εφόσον η στατική φάση είναι πολική, η κατακράτηση των κίτρινων μορίων θα είναι ισχυρότερη. Αντίθετα, η μπλε ουσία θα κατακρατείται λιγότερο ισχυρά από τη στατική φάση. Μέτριας ισχύος θα είναι η κατακράτηση των μορίων της κόκκινης ουσίας. Η μπλε ουσία επίσης θα συναγωνίζεται εντονότερα με τα μόρια της επίσης άπολης κινητής φάσης για θέσεις πρόσδεσης στη στατική φάση. Έτσι τα μόρια της μπλε ουσίας θα προπορεύονται στο διαχωρισμό. Προκειμένου να επιτευχθεί η έκλουση της κόκκινης και στη συνέχεια και της κίτρινης ουσίας σε εύλογο χρονικό διάστημα, αυξάνεται η πολικότητα της κινητής φάσης, αμέσως μετά την έκλουση της μπλε ουσίας. Ένας απλός κανόνας που ισχύει είναι: Σε οποιοδήποτε διαχωρισμό προπορεύονται τα μόρια ουσιών με πολικότητα αντίστοιχης της κινητής φάσης, ενώ καθυστερούν αυτά με πολικότητα αντίστοιχης της στατικής φάσης. Σχήμα 8.8 Xρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC κανονικής φάσης, μίγματος αποτελούμενου από τριών τύπων μόρια που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες, κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Σύνοψη: Στην HPLC κανονικής φάσης η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο του πυριτίου και είναι πολική, ενώ η κινητή φάση είναι μη πολική. Οι πολικές ενώσεις θα προσροφούνται ισχυρότερα στη στατική φάση και συνεπώς οι άπολες ενώσεις θα εκλούονται πρώτες από τη στήλη. Σύνοψη: Σε οποιοδήποτε διαχωρισμό προπορεύονται τα μόρια ουσιών με πολικότητα αντίστοιχης της κινητής φάσης, ενώ καθυστερούν αυτά με πολικότητα αντίστοιχης της στατικής φάσης. Στη χρωματογραφία ισχύει η αρχή «τα όμοια διαχωρίσουν τα όμοια», που εφαρμόζεται εδώ με την έννοια ότι πολικές στήλες απαιτούνται για το διαχωρισμό πολικών ενώσεων και το αντίστροφο Η HPLC Αντίστροφης Φάσης Το αντίστροφο της HPLC κανονικής φάσης, είναι η HPLC αντίστροφης φάσης (reversed phase HPLC ή RP- HPLC) (Σχήμα 8.9). Εδώ ο διαχωρισμός οφείλεται στην προσρόφηση υδρόφοβων μορίων σε υδρόφοβη στατική φάση, υπό την ροή κινητής φάσης αυξημένης πολικότητας. Η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες, όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο, οκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.α., οι οποίες προσδίδουν στη στατική φάση ιδιαίτερα άπολο χαρακτήρα. Η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή με νερό. Η έκλουση των προσροφημένων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται με τη μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την αύξηση του περιεχόμενου σε αυτή ποσοστού του οργανικού διαλύτη. Η μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ελαττώνει την υδρόφοβη αλληλεπίδραση 227

229 μεταξύ των προσροφημένων μορίων και της στατικής φάσης: είναι προφανές ότι όσο πιο άπολο είναι ένα διαχωριζόμενο μόριο, τόσο περισσότερο χρόνο θα αλληλεπιδράσει με την άπολη στατική φάση και τόσο υψηλότερη θα είναι η συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, που θα απαιτείται για να επιτευχθεί η αποδέσμευσή του. Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική έκλουση των άπολων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη (Σχήμα 8.9). Είναι προφανές ότι με αντιστροφή της πολικότητας της κινητής και της στατικής φάσης, αντιστρέφεται και η σειρά έκλουσης των τριών συστατικών του μίγματος (Σχήματα 8.8 και 8.9). Σχήμα 8.9 Xρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC αντίστροφης φάσης, μίγματος αποτελούμενου από μόρια τριών τύπων που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες, κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Όπως αναφέρθηκε, στη χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης, η επιφάνεια του προσροφητικού μέσου έχει τροποποιηθεί με την πρόσδεση μακριών αλυσίδων υδρόφοβων μορίων (Σχήμα 8.10). Πολύ κοινώς τέτοια μόρια είναι υδρογονάνθρακες τυπικά αποτελούμενοι από 4 ή 8 ή 18 άτομα άνθρακα - μετατρέποντας την στατική φάση σε άπολη. Οι στήλες με τα παραπάνω προσροφητικά μέσα ονομάζονται C4 ή C8 ή C18, αντίστοιχα. Περισσότερες εφαρμογές στο διαχωρισμό μικρών μορίων με RP-HPLC βρίσκουν οι στήλες C18. Σχήμα 8.10 Σχηματική αναπαράσταση της στατικής φάσης από την οποία αποτελείται μία στήλη RP-HPLC C18. Μη πολικά μόρια στο διαχωριζόμενο δείγμα προσροφούνται ισχυρά στις αλυσίδες υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC και γενικότερα η περισσότερο κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού ουσιών για αναλυτικούς σκοπούς. Σύνοψη: Στη χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης, στην επιφάνεια του προσροφητικού υλικού βρίσκονται προσδεμένες μακριές αλυσίδες υδρογονάνθρακα. Η κινητή φάση είναι πολική. Μη πολικά μόρια στο διαχωριζόμενο δείγμα προσροφούνται ισχυρά στις αλυσίδες υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται 228

230 ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC. Περισσότερες εφαρμογές στο διαχωρισμό μικρών μορίων με RP- HPLC βρίσκουν οι στήλες C Οργανολογία HPLC Μία βασική εργαστηριακή διάταξη υγρής χρωματογραφίας περιλαμβάνει τα παρακάτω επιμέρους μέρη και φαίνεται στη Φωτογραφία 8.3 και στο Σχήμα 8.11: Περιέκτες διαλυτών: Οι διαλύτες που θα αποτελέσουν την κινητή φάση βρίσκονται αποθηκευμένοι σε ειδικές φιάλες. Η κινητή φάση είναι απαραίτητη για τη μεταφορά των δειγμάτων μέσα από το σύστημα της υγρής χρωματογραφίας. Απαερωτής κενού: Ο απαερωτής εξασφαλίζει την απαέρωση της κινητής φάσης, ώστε να είναι εφικτός ο έλεγχος της πίεσης στη χρωματογραφική στήλη. Αντλία (pump): Η αντλία εξασφαλίζει τη συνεχή άντληση και προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου του συνόλου του συστήματος, από τους περιέκτες των διαλυτών μέχρι το δοχείο συλλογής των αποβλήτων του συστήματος, υπό ρυθμιζόμενη υψηλή πίεση και ροή. Σύστημα εισαγωγής δείγματος (injection system/ injector valve): περιλαμβάνει βρόγχο σταθερού όγκου ή αυτόματο σύστημα εισαγωγής, μεταβλητού (προεπιλεγμένου) όγκου έγχυσης. Βρίσκεται πριν τη χρωματογραφική στήλη και επιτρέπει την εισαγωγή του δείγματος στη ροή της κινητής φάσης. Χρωματογραφική στήλη (column): στη στήλη επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός του μίγματος στα συστατικά του. Εφόσον ο διαχωρισμός καθορίζεται και από τη θερμοκρασία, η στήλη εμπεριέχεται σε θερμοστατούμενο κλίβανο (column oven). Ανιχνευτής (detector): Η ανίχνευση των ουσιών που εξέρχονται της στήλης γίνεται συνεχώς, κυρίως με φασματομετρία UV/Vis, όπου το παραγόμενο από τον ανιχνευτή φως προσπίπτει σε κυψελίδα συνεχούς ροής από χαλαζία και μετριέται η απορρόφηση του φωτός. Οι ανιχνευτές που κυρίως χρησιμοποιούνται στην HPLC είναι οι παρακάτω: ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους (UV/Vis Detector), ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων (Diode Array Detector ή DAD), αγωγιμομετρικοί ανιχνευτές (Conductivity Detector), ανιχνευτές δείκτη διάθλασης (Refractive Index Detector) φασματογράφοι μάζας MS (Mass Spectroscopy Detector ή MS Detector) ανιχνευτής Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Ανιχνευτής ΝΜR) (Nuclear Magnetic Resonance Detector, NMR Detector), ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές (Electrochemical Detector), φθορισμομετρικοί ανιχνευτές (Fluorescence Detector). Oι ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους και οι ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων, που είναι και οι πιο συχνά απαντούμενοι, έχουν περιγραφεί στην Ενότητα 7.2. Επίσης, αρκετά συχνά χρησιμοποιούνται και φασματογράφοι μάζας. Καταγραφικό: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης στέλνεται στη συνέχεια σε κάποιον υπολογιστή που παράγει το χρωματογράφημα της ανάλυσης. Δεξαμενή αποβλήτων: Είναι η δεξαμενή όπου συλλέγεται η κινητή φάση μαζί με τα περιεχόμενα συστατικά του δείγματος. Όταν είναι επιθυμητή η συλλογή κλασμάτων της κινητής φάσης, (όπως στην προπαρασκευαστική HPLC), χρησιμοποιείται αυτόματος κλασματοσυλλέκτης (fraction collector). 229

231 Φωτογραφία 8.3 Τυπική εργαστηριακή διάταξη χρωματογραφίας HPLC (του οίκου Dionex). Σχήμα 8.11 Διάγραμμα εργαστηριακής διάταξης υγρής χρωματογραφίας HPLC. Σύνοψη: Η διέλευση των εκλουόμενων ουσιών ανιχνεύεται με τη βοήθεια ανιχνευτή που βρίσκεται αμέσως μετά τη χρωματογραφική στήλη. Συνηθέστερα πρόκειται για ανιχνευτή UV/Vis, που σε μία κυψελίδα συνεχούς ροής, η ποσότητα του απορροφούμενου φωτός θα εξαρτάται από την ουσία που διέρχεται διαμέσου της ακτίνας της προσπίπτουσας ακτινοβολίας κάθε στιγμή. Οι διαλύτες της κινητής φάσης δε θα πρέπει να απορροφούν στο μήκος κύματος, όπου παρακολουθείται η έκλουση της ουσίας που μας ενδιαφέρει. 8.4 Σύνοψη των βασικών σταδίων της Χρωματογραφίας Στήλης Τα βασικά στάδια που περιγράφηκαν για το διαχωρισμό και την ανίχνευση των συστατικών ενός μίγματος κατά την ανάλυση του με χρωματογραφία στήλης συνοψίζονται στα παρακάτω: 1. Kαθορισμένη ποσότητα δείγματος ενίεται στην κινητή φάση στην αρχή της στήλης. 2. Το δείγμα μετακινείται στη στήλη υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. 3. Τα επιμέρους συστατικά του δείγματος κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. 4. Το κλάσμα κάθε συστατικού που βρίσκεται στην κινητή φάση μετακινείται υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. 5. Για το κάθε μόριο την κάθε στιγμή επέρχεται νέος καταμερισμός μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. 230

232 6. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων κάθε συστατικού εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους στην κινητή φάση ως προς το χρόνο παραμονή τους στην στατική φάση και είναι ανάλογη του συντελεστή κατανομής του συστατικού στις δύο φάσεις. 7. Tα επιμέρους συστατικά, με την προϋπόθεση ότι έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής, μετακινούνται με διαφορετική μέση ταχύτητα μέσα στη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες. 8. Τα συστατικά εξέρχονται από τη στήλη και ανιχνεύονται από κατάλληλο ανιχνευτή που βρίσκεται στην έξοδο της στήλης Σύγκριση HPLC/TLC Στον Πίνακα 8.1 σημειώνονται τα κυριότερα συγκριτικά πλεονεκτήματα / μειονεκτήματα της TLC σε σχέση με την HPLC, των δύο χρωματογραφικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται περισσότερο στην κλινική ανάλυση. Κριτήριο TLC LC Κόστος εργαστηριακού εξοπλισμού Χαμηλό Υψηλό Κατανάλωση διαλύτη Χαμηλή Υψηλή Ευελιξία σε σχέση με ποικιλία αναλυόμενων ουσιών, συμβατότητα με ph και διαλύτες Μεγάλη Πιο περιορισμένη Δυνατότητα εφαρμογής των δειγμάτων χωρίς προηγούμενη κατεργασία Ναι Όχι Ικανότητα παράλληλης ανάλυσης περισσότερων δειγμάτων Ναι Όχι Δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού Ευαισθησία Ημιποσοτική μέθοδος Κατά κανόνα χαμηλότερη Ποσοτική μέθοδος Κατά κανόνα υψηλότερη Επαναληψιμότητα Χαμηλότερη Υψηλή Ταχύτητα ανάλυσης ανά δείγμα Χαμηλή Υψηλή Διαχωριστική ικανότητα Χαμηλή Υψηλή Πίνακας 8.1 Κυριότερα συγκριτικά πλεονεκτήματα / μειονεκτήματα της TLC σε σχέση με την HPLC. Με έντονο χρώμα είναι σημειωμένα τα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα μειονεκτήματα. Ο πίνακας αναφέρεται στη συζευγμένη με (φασματοσκοπικές κυρίως) μεθόδους ανίχνευσης HPLC. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι είναι σημαντικό να γνωρίζει ο κλινικός επιστήμονας και τις δύο αυτές κύριες χρωματογραφικές τεχνικές ανάλυσης. Η δε χρωματογραφία HPLC είναι η κατεξοχήν χρωματογραφική αναλυτική τεχνική, που χρησιμοποιείται σήμερα στην κλινική (κι όχι μόνο) έρευνα. 8.5 Βασικές έννοιες που περιγράφουν μία Xρωματογραφική ανάλυση Παρακάτω παρουσιάζονται σύντομα οι σημαντικότερες έννοιες, που περιγράφουν μία χρωματογραφική ανάλυση: Χρωματογράφημα Όπως ήδη αναπτύχθηκε, σε κάθε χρωματογραφικό διαχωρισμό μια διαχωριζόμενη ουσία κατανέμεται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης, κινούμενη ταυτόχρονα προς την έξοδο της στήλης (ή γενικότερα προς το άκρο της στατικής φάσης) υπό την ροή της κινητής φάσης. Έτσι, κατά τον διαχωρισμό δημιουργούνται μετακινούμενες ζώνες μέσα στη στήλη, οι οποίες τελικά ανιχνεύονται κατά τη δίοδο τους από τον ανιχνευτή και καταγράφονται ως διακριτές κορυφές. Η γραφική παράσταση του μετρούμενου από τον ανιχνευτή μεγέθους προς το χρόνο μετά την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη, καλείται χρωματογράφημα (chromatograph). 231

233 Κάθε μόριο μίας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης μετακινείται «ανταλλασσόμενο» πάρα πολλές φορές μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης (όπου προσροφάται ή κατανέμεται ή δεσμεύεται λόγω αγχιστείας κ.λπ.) και αντίστροφα (Σχήμα 8.1). Μερικά μόρια της ίδιας ουσίας κινούνται με λίγο διαφορετική ταχύτητα, επειδή τυχαία περνούν στην κινητή φάση λίγο περισσότερο χρόνο από τον μέσο χρόνο παραμονής, αλλά και λόγω της πολλαπλότητας των διαδρομών, που μπορεί να ακολουθήσει ένα μόριο μέσα στη στήλη (Σχήμα 8.12). Ως αποτέλεσμα παρατηρείται μια συμμετρική διασπορά της κατανομής των μορίων γύρω από μια μέση τιμή, που αποδίδει τη μέση συμπεριφορά των μορίων της ουσίας. Η κατανομή αυτή προσεγγίζει μία κατανομή κατά Gauss δίνοντας το γνωστό κωδωνοειδές σχήμα των κορυφών σε ένα χρωματογράφημα (Σχήμα 8.13). Το εύρος της ζώνης αυξάνεται καθώς αυτή κινείται προς την έξοδο της στήλης, διότι παρέχεται περισσότερος χρόνος κατά τον οποίο λαμβάνουν χώρα περισσότερες μετακινήσεις μορίων μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Το εύρος της ζώνης λοιπόν είναι ανάλογο προς τον χρόνο παραμονής της ουσίας στη στήλη (Σχήμα 8.14) και αντιστρόφως ανάλογο προς την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης. Σχήμα 8.12 Σχηματική αναπαράσταση της πορείας δύο διαφορετικών μορίων της ίδιας ουσίας διαμέσου της χρωματογραφικής στήλης. Καθώς οι πορείες που ακολουθούν έχουν λίγο διαφορετικά μήκη, το ένα μόριο θα προπορεύεται ελαφρώς του άλλου, με αποτέλεσμα μία συμμετρική διασπορά της κατανομής των μορίων γύρω από μια μέση τιμή. Σχήμα 8.13 Χρωματογράφημα (χρωματογράφημα) που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC). Η κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε διαφορετικό συστατικό του μίγματος. 232

234 Σχήμα 8.14 Χρωματογραφικό προφίλ του ίδιου μίγματος ουσιών α, β, γ μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α) και αντίστροφης φάσης (Β). Η σχέση της πολικότητας των διαχωριζόμενων ουσιών είναι α>β>γ, ενώ κατά τον διαχωρισμό η κινητή φάση είναι χαμηλής πολικότητας για το Α και υψηλής πολικότητας για το Β. Παρατηρούμε ότι το εύρος της κορυφής είναι ανάλογο προς τον χρόνο παραμονής της κάθε ουσίας στη στήλη. Αυτό είναι περισσότερο διακριτό στο συγκεκριμένο χρωματογράφημα για τα συστατικά α και γ. Σύνοψη: Η γραφική παράσταση της απόκρισης του ανιχνευτή συναρτήσει του χρόνου μετά την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη καλείται χρωματογράφημα. Στο χρωματογράφημα η κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε διαφορετική ουσία. Το σύνολο των μορίων κάθε διαχωριζόμενης ουσίας εξέρχονται από τη χρωματογραφική στήλη σε μικρό εύρος χρόνων, δίνοντας διευρυμένες κωδωνοειδείς κορυφές με κατανομή κατά Gauss. Χρόνος κατακράτησης ή χρόνος ανάσχεσης, t R Ο χρόνος κατακράτησης (retention time) t R, είναι ο χρόνος που απαιτείται, ώστε μία συγκεκριμένη ουσία να «ταξιδέψει» διαμέσου της στήλης από την είσοδο αυτής μέχρι τον ανιχνευτή. Η εκκίνηση μέτρησης του χρόνου κατακράτησης γίνεται την στιγμή που το δείγμα εισάγεται με ένεση στη στήλη. Το χρονικό διάστημα μετά την ένεση και μέχρι το μέγιστο της κορυφής έκλουσης μίας ουσίας ονομάζεται χρόνος κατακράτησης (Σχήμα 8.15). Ο χρόνος κατακράτησης αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά μιας ουσίας, υπό αυστηρά καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Έτσι, για μία συγκεκριμένη ουσία ο χρόνος κατακράτησης καθορίζεται από: - την πίεση που ασκείται στη στήλη (η οποία με τη σειρά της καθορίζει την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης), - την φύση της στατικής φάσης (υλικό πληρώσεως και μέγεθος σωματιδίων αυτού), - την ακριβή σύσταση της κινητής φάσης (διότι η σύσταση καθορίζει το συντελεστή κατανομής μεταξύ κινητής και στατικής φάσης), - τη θερμοκρασία της στήλης (καθότι ο συντελεστής κατανομής εξαρτάται από τη θερμοκρασία του διαχωρισμού). Σύνοψη: Σε μία χρωματογραφική ανάλυση οι παράμετροι ταχύτητα ροής κινητής φάσης, υλικό πληρώσεως και μέγεθος σωματιδίων στήλης, διαστάσεις στήλης, θερμοκρασία στήλης πρέπει να ορίζονται επακριβώς, προκειμένου μία χρωματογραφική ανάλυση να είναι επαναλήψιμη. Ο χρόνος παραµονής των µορίων του δείγµατος στην κινητή φάση είναι ο ίδιος για όλα τα συστατικά του δείγµατος και ονοµάζεται νεκρός χρόνος, t 0. Ο νεκρός χρόνος είναι ο χρόνος που απαιτείται για ένα µη κατακρατούµενο από τη στατική φάση συστατικό να διέλθει από τη στήλη, δηλαδή με άλλα λόγια είναι ο χρόνος κατακράτησης ενός συστατικού που δεν αλληλεπιδρά καθόλου με τη στατική φάση της στήλης. Προφανώς η ταχύτητα μετανάστευσης της μη κατακρατούμενης ουσίας είναι ίση προς τη μέση ταχύτητα των μορίων της κινητής φάσης. Σε ένα χρωματογράφημα, όπως αυτό του Σχήματος 8.15, ένα µη κατακρατούµενο από τη στατική φάση συστατικό αποτυπώνεται ως μία κορυφή, που εξέρχεται πολύ σύντομα μετά την ένεση του δείγματος. Είναι προφανές ότι ο καθαρός χρόνος παραμονής ενός συστατικού στη στατική φάση για ένα συστατικό που αλληλεπιδρά σε κάποιο βαθμό με αυτήν (ανηγµένος χρόνος κατακράτησης [t R ]) ισούται µε τη διαφορά του χρόνου κατακράτησης και του νεκρού χρόνου, δηλαδή: 233

235 t R = t R-t 0 (Εξίσωση 8.2). Σύνοψη: Υπό καθορισμένες χρωματογραφικές συνθήκες ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά της ουσίας και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίησή της. Σχήμα 8.15 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού φαρμάκου το οποίο περιέχει παρακεταμόλη (ακεταμινοφαίνη), καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη. Σημειώνονται η ταυτότητα της κάθε κορυφής και οι χρόνοι κατακράτησης της κάθε ουσίας-δραστικού συστατικού (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC. Σημειώνεται επίσης, ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης t 0. Συντελεστής κατακράτησης ή παράγοντας κατακράτησης ή παράγοντας χωρητικότητας Ο συντελεστής κατακράτησης k (retention factor ή capacity factor) επίσης, περιγράφει τη μετανάστευση των διαλυμένων ουσιών στη στήλη και αποτελεί ποσοτικό μέτρο της τάσης ενός συγκεκριμένου είδους μορίων να προσροφάται στη στατική φάση. Χρησιμοποιείται πολλές φορές αντί του χρόνου ανάσχεσης, διότι εξαρτάται λιγότερο από τις πειραματικές συνθήκες της ανάλυσης. Ο παράγοντας κατακράτησης ισούται µε τον λόγο του χρόνου που παραµένει η ουσία Α στη στατική φάση προς τον χρόνο που αυτή παραµένει στην κινητή φάση: k = t R t 0 = t R t o t o (Εξίσωση 8.3) Όπου t R ο χρόνος κατακράτησης της προσδιοριζόμενης ουσίας, t R ο ανηγμένος χρόνος κατακράτησης και t 0 είναι ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης. Στο Σχήμα 8.16 φαίνεται ο τρόπος υπολογισμού του παράγοντα κατακράτησης δύο ουσιών. 234

236 Σχήμα 8.16 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη. Σημειώνονται ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας η οποία αντιστοιχεί στις κορυφές 1 και 4 και ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης t 0 (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC). Ενδεικτικά, σημειώνεται επίσης, ο τρόπος υπολογισμού του παράγοντα κατακράτησης των ουσιών που αντιστοιχούν στις κορυφές 1 και 4. Κατά την ανάπτυξη χρωματογραφικών μεθόδων, στοχεύουμε να εξασφαλίσουμε παράγοντες κατακράτησης με τιμές μεταξύ 5 και 20 για καθένα από τα διαχωριζόμενα συστατικά. Τέτοιοι παράγοντες κατακράτησης εγγυώνται καλό διαχωρισμό κι όχι πολύ μεγάλους χρόνους ανάλυσης. Για τιµές k < 5, η έκλουση είναι αρκετά ταχεία και δεν επιτρέπει ακριβή προσδιορισµό του t R. Για τιµές k > 20, η ουσία κατακρατείται πολύ ισχυρά από τη στατική φάση, µε αποτέλεσµα πιθανότατα µη ικανοποιητικό διαχωρισµό και μεγάλους χρόνους ανάλυσης. Στο χρωματογράφημα του Σχήματος 8.16 ο παράγοντας κατακράτησης για την ταχύτερα εκλουόμενη κορυφή (Kορυφή 1) είναι 6,4 (> 5), ενώ για την κορυφή που εκλούεται βραδύτερα (Kορυφή 4) είναι 28,44 (> 20). Στην περίπτωση της κορυφής 4, εφόσον δεν υπάρχει στη στήλη άλλος αναλύτης, εξίσου ισχυρά κατακρατούμενος, ώστε να παρατηρείται αλληλεπικάλυψη κορυφών, ο μεγάλος παράγοντας κατακράτησης δεν εμποδίζει την ανάλυση. Ο μεγάλος όμως χρόνος ανάλυσης που απαιτείται είναι ανεπιθύμητος λόγω της καθυστέρησης της ανάλυσης, αλλά και της μεγαλύτερης κατανάλωσης διαλυτών (και συνεπώς της αύξησης του κόστους) που αυτός συνεπάγεται. Με βάση τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, ο παράγοντας κατακράτησης µπορεί να µεταβληθεί κυρίως µε µεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης, της θερµοκρασίας της στήλης και του συστήματος των διαλυτών. Έτσι, μεταβάλλοντας τις χρωματογραφικές συνθήκες στην περίπτωση της ανάλυσης του Σχήματος 8.16 θα μπορούσαμε να επιτύχουμε εξίσου ικανοποιητικό διαχωρισμό με μικρότερους όμως παράγοντες κατακράτησης, κυρίως για τους ισχυρά κατακρατούμενους αναλύτες, δηλ. με μεγαλύτερη οικονομία χρόνου και διαλυτών. Εύρος κορυφής (peak width), W Κατά το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος μέσω μίας στήλης συμβαίνει αραίωση του δείγματος που ενέθηκε. Ως αποτέλεσμα, η ζώνη που περιέχει το καθένα από τα διαχωρισμένα συστατικά διευρύνεται διαρκώς κατά την εξέλιξη του διαχωρισμού. Έτσι η κάθε κορυφή που καταγράφεται από τον ανιχνευτή έχει ένα συγκεκριμένο εύρος, που καλείται εύρος κορυφής (peak width), W. Το εύρος της κορυφής υπολογίζεται 235

237 γραφικά, όταν οι κορυφές αποδοθούν κατά προσέγγιση ως τρίγωνα. Ο τρόπος υπολογισμού του εύρους της κορυφής για τα συστατικά 3 και 4 του αναλγητικού που αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Σχημάτων 8.13, 8.15 και 8.16, φαίνεται στο Σχήμα Διαχωριστική ικανότητα στήλης (Resolution), Rs Η διαχωριστική ικανότητα (resolution), Rs, αποτελεί ποσοτικό μέτρο της ικανότητας μίας στήλης να διαχωρίσει δύο προσδιοριζόμενες ουσίες (που αναλύονται υπό ένα συγκεκριμένο πρωτόκολλο). Δύο ουσίες θεωρείται ότι διαχωρίζονται πλήρως, όταν το Rs είναι ίσο τουλάχιστον με 1,5. Υπολογίζεται από τη σχέση: R s = t R2 t R1 (Εξίσωση 8.4) 0,5 (W 2 +W 1 ) Όπου t R2 είναι ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας και t R1 ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας που εκλούεται αμέσως πριν στο χρωματογράφημα. W 2 και W 1 είναι το εύρος της αντίστοιχης κορυφής (προπορευόμενης και επακόλουθης) στη βάση της κορυφής. Σχήμα 8.17 Γραφικός υπολογισμός του εύρους των κορυφών σε χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP- HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC, και υπολογισμός της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης για τα συστατικά 3 και 4. Στo Σχήμα 8.18 φαίνεται η μεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών (συστατικών) σε χρωματογράφημα μίγματος τους, με μεταβολή της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης κατά την αλλαγή των χρωματογραφικών συνθηκών. 236

238 Σχήμα 8.18 Mεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών σε χρωματογράφημα μίγματός τους, με μεταβολή της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης από Rs=0,5 (Α) σε Rs=1,0 (Β) και Rs=1,5 (Γ), κατά την αλλαγή των χρωματογραφικών συνθηκών. Σε ένα διαχωρισμό όπου η διαχωριστική ικανότητα μεταξύ δύο αναλυτών είναι ίση με 1,0, υπάρχει 4% αλληλεπικάλυψη των κορυφών. Σε μικρότερες τιμές διαχωριστικής ικανότητας η αλληλεπικάλυψη είναι σημαντική, ενώ πρακτικά δύο κορυφές θεωρείται ότι διαχωρίζονται πλήρως όταν Rs 1,5. Βλέπουμε ότι στο χρωματογραφικό διαχωρισμό του Σχήματος 8.18, η διαχωριστική ικανότητα της στήλης είναι πολύ ικανοποιητική, όταν Rs 1,5. Σύνοψη: Η διαχωριστική ικανότητα Rs μιας στήλης αποτελεί ένα ποσοτικό μέτρο της ικανότητάς της να διαχωρίσει δύο αναλύτες. Πρακτικά ο διαχωρισμός δύο ουσιών θεωρείται πλήρης όταν Rs 1,5. Αριθμός θεωρητικών πλακών και ύψος θεωρητικής πλάκας Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών (plate number), N, και το ύψος της θεωρητικής πλάκας (plate height), H, είναι καθαρά θεωρητικά μεγέθη. Χρησιμοποιούνται προκειμένου να συγκριθεί η αποδοτικότητα χρωματογραφικών στηλών. Το μοντέλο των θεωρητικών πλακών κάνει την υπόθεση ότι μία χρωματογραφική στήλη αποτελείται από έναν μεγάλο αριθμό ξεχωριστών πλακών (μικρών τμημάτων στήλης). Η είναι το μήκος της στήλης που αντιστοιχεί σε μία θεωρητική πλάκα, το οποίο καλείται ύψος της θεωρητικής πλάκας. Ν είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών που υπάρχουν σε μία στήλη, όπως φαίνεται στο Σχήμα Όσο περισσότερο πακτωμένο είναι το πληρωτικό υλικό στη στήλη και όσο μικρότερη είναι η διάμετρος των σωματιδίων του, τόσο μικρότερο είναι το ύψος μίας θεωρητικής πλάκας. Κάθε μόριο μιας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης, μετακινείται όντας σε ισορροπία μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης της κάθε θεωρητικής πλάκας με την οποία αλληλεπιδρά. Είναι προφανές ότι όσο μικρότερη είναι η τιμή του μεγέθους Η, τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών Ν που εμπεριέχονται σε μία στήλη και συνεπώς τόσο αποτελεσματικότερος είναι ο διαχωρισμός. Είναι σημαντικό να έχει κανείς κατά νου ότι οι θεωρητικές πλάκες δεν υπάρχουν στην πραγματικότητα μέσα σε μία στήλη, απλώς βοηθούν στην κατανόηση των διεργασιών σε αυτή. Τα μεγέθη Ν και Η σχετίζονται επίσης με τη διεύρυνση των κορυφών (δηλαδή με το εύρος W) και συνδέονται με τις σχέσεις: H = L N = L 16 W 2 Ν= L Η = 16 t R 2 t R 2 (Εξίσωση 8.5) W2 (Εξίσωση 8.6) όπου L το μήκος της στατικής φάσης και W το εύρος της κορυφής. 237

239 Με βάση τις παραπάνω εξισώσεις, τα μεγέθη Ν και Η μπορούν να υπολογισθούν για το κάθε συστατικό από το χρωματογράφημα της ανάλυσης. Από τις παραπάνω σχέσεις διαπιστώνεται ότι όσο μεγαλύτερο είναι το ύψος μίας θεωρητικής πλάκας, τόσο πιο διευρυμένες εμφανίζονται οι κορυφές κατά το διαχωρισμό. Εφόσον η αποδοτικότητα μίας στήλης είναι ανάλογη του Ν και αντιστρόφως ανάλογη του Η, αλλά και η διεύρυνση των κορυφών είναι ανάλογη του Η, τότε, είναι επιθυμητή η χρήση στηλών με μικρό Η και μεγάλο Ν. Σχήμα 8.19 Σχηματική απόδοση της έννοιας των χρωματογραφικών θεωρητικών πλακών. Οι χρωματογραφικές στήλες έχουν διαφορετικό αριθμό θεωρητικών πλακών για διαφορετικούς αναλύτες σε ένα μείγμα. Τα μεγέθη Ν και Η είναι αυτά που κατεξοχήν αναφέρονται από τους οίκους χρωματογραφικού εξοπλισμού, ως μέτρα αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας μίας στήλης να διαχωρίζει συγκεκριμένη ομόλογη σειρά αναλυτών. Ως παράδειγμα, μια αναλυτική χρωματογραφική στήλη με Ν = πλάκες/ m προτιμάται σε σχέση με αυτή με N = πλάκες/m. Η πρώτη παράγει επίσης στενότερες κορυφές για το ίδιο συστατικό, υπό τις ακριβώς ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Θα πρέπει όμως να σημειωθεί ότι, εάν μία στήλη διαχωρίζει αποτελεσματικά μία συγκεκριμένη ομόλογη σειρά χημικών ενώσεων (π.χ. τα αμινοξέα), δεν σημαίνει ότι είναι εξίσου καλή στο διαχωρισμό άλλης ομόλογης σειράς χημικών ενώσεων, όπως π.χ. τις αλκοόλες. Σύνοψη: Μέτρο της αποδοτικότητας μίας στήλης αποτελούν τα θεωρητικά μεγέθη N και H. Η αποδοτικότητα μίας στήλης είναι ανάλογη του αριθμού των πλακών που θεωρητικά περιέχει η στήλη (Ν) και αντιστρόφως ανάλογη του θεωρητικού ύψους της κάθε πλάκας (Η). Επίσης, η διεύρυνση των χρωματογραφικών κορυφών είναι ανάλογη του θεωρητικού ύψους της κάθε πλάκας (Η). Οι χρωματογραφικές στήλες έχουν διαφορετικό αριθμό θεωρητικών πλακών για διαφορετικούς αναλύτες σε ένα μίγμα. 8.6 Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός με Χρωματογραφία HPLC Ποιοτικός προσδιορισμός Ο ποιοτικός προσδιορισμός έχει ως σκοπό να διερευνήσει και πιστοποιήσει την ταυτότητα μίας ουσίας που διαχωρίζεται με HPLC από τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος. Υπάρχουν δύο διακριτές περιπτώσεις: 1. Όταν είναι γνωστή η ταυτότητα του συστατικού του δείγματος που θέλουμε να διακρίνουμε, οπότε η κορυφή του συστατικού που μας ενδιαφέρει πρέπει να ταυτοποιηθεί. Στην περίπτωση αυτή η ταυτοποίηση γίνεται με βάση το χρόνο ανάσχεσης της κορυφής (ή καλύτερα τον συντελεστή κατακράτησης) που λαμβάνεται κατά την ανάλυση δείγματος και προτύπου της καθαρής ουσίας (Σχήμα 8.20). Είναι απαραίτητο, προκειμένου η αντιστοίχιση να είναι έγκυρη, η ανάλυση δείγματος και προτύπου να διεξαχθεί υπό τις ακριβώς ίδιες πειραματικές συνθήκες. Αυτό σημαίνει χρησιμοποιώντας την ίδια στήλη (σε ό, τι αφορά στα τεχνικά χαρακτηριστικά της, συμπεριλαμβανομένου και του πληρωτικού υλικού), ίδια σύσταση και ροή κινητής φάσης, καθώς και ίδια θερμοκρασία ανάλυσης. Επίσης, τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά των δύο 238

240 κορυφών θα πρέπει να είναι όμοια, προκειμένου η αντιστοίχιση να είναι ασφαλής, και γι αυτό το λόγο το συστατικό ενδιαφέροντος στο πρότυπο και στο δείγμα θα πρέπει να βρίσκεται σε παρόμοια συγκέντρωση. Εάν το χρωματογραφικό σύστημα έχει έναν επιλεκτικό ανιχνευτή, όπως ανιχνευτή συστοιχίας διόδων ή ανιχνευτή φθορισμού, το λαμβανόμενο φάσμα της κορυφής ενδιαφέροντος ή το μετρούμενο σήμα επιβεβαιώνουν την ταυτοποίηση, σε συνδυασμό με τον συντελεστή κατακράτησης. Για μεγαλύτερη ασφάλεια στην αντιστοίχιση, ιδίως όταν το χρωματογραφικό σύστημα δεν συνδυάζεται με κάποιον επιλεκτικό ανιχνευτή, θα πρέπει το δείγμα και το πρότυπο να αναλυθούν σε μία παράλληλη ανάλυση υπό διαφορετικές χρωματογραφικές συνθήκες, σε σχέση με την πρώτη ανάλυση. Και στη δεύτερη ανάλυση ο χρόνος ανάσχεσης προτύπου και κορυφής ενδιαφέροντος θα πρέπει να συμπίπτουν απόλυτα. Τέλος, μια άλλη μεθοδολογία που εφαρμόζεται κοινώς για την ταυτοποίηση κορυφής, όταν είναι γνωστή η ταυτότητα του συστατικού που μας ενδιαφέρει, είναι ο εμβολιασμός του δείγματος με το γνωστό πρότυπο. Σ αυτή τη μεθοδολογία η απουσία εμφάνισης νέας κορυφής, και παράλληλα η ενίσχυση της υπάρχουσας κορυφής του συστατικού με διατήρηση της συμμετρίας της, επιβεβαιώνει την ταυτότητα της κορυφής. 2. Όταν δεν είναι γνωστή η ταυτότητα των συστατικών του δείγματος. Στην περίπτωση αυτή ενδείξεις για την ταυτότητα της κορυφής λαμβάνονται με σύζευξη του διαχωρισμού με HPLC με κάποιον ανιχνευτή που βοηθάει στην ταυτοποίηση, όπως ανιχνευτή NMR ή MS. Θα πρέπει να τονισθεί ότι επιβεβαίωση της ταυτότητας με τουλάχιστον δύο ή συνήθως περισσότερες χημικές τεχνικές είναι απαραίτητη. Σύνοψη: Ο ποιοτικός προσδιορισμός γνωστής ουσίας που διαχωρίζεται με HPLC γίνεται με βάση τον κοινό χρόνο ανάσχεσης και τη κοινή συμμετρία της κορυφής αυτής στο δείγμα και πρότυπο, που αναλύονται υπό τις ίδιες συνθήκες. Η ταυτοποίηση μπορεί να επιβεβαιωθεί με διατήρηση της σύμπτωσης των χρόνων ανάσχεσης και της συμμετρίας των κορυφών, είτε σε παράλληλη ανάλυση δείγματος και προτύπου υπό άλλες χρωματογραφικές συνθήκες, είτε υπό τον εμβολισμού του δείγματος με πρότυπο. Σχήμα 8.20 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση προτύπου καφεϊνης, σύμφωνα με τις χρωματογραφικές συνθήκες του Σχήματος Η ταυτοποίηση της κορυφής της καφεϊνης στο χρωματογράφημα του φαρμάκου του Σχήματος 8.16 γίνεται με βάση το χρόνο ανάσχεσης της κορυφής της καφεϊνης που λαμβάνεται κατά τις δύο αναλύσεις (t R = 6,19 min και 6,24 min για το μείγμα και το πρότυπο αντίστοιχα) Ποσοτικός προσδιορισμός Αναφέρθηκε ήδη ότι ο χρόνος ανάσχεσης αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά μίας ουσίας, υπό αυστηρά καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Προκειμένου, λοιπόν, να ταυτοποιηθούν οι αναλύτες στους οποίους οφείλονται οι κορυφές ενός χρωματογραφήματος, είναι απαραίτητο να συγκριθεί το χρωματογράφημα που προκύπτει κατά την ανάλυση ενός δείγματος με αυτό που λαμβάνεται κατά την ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων, τα οποία περιέχουν γνωστούς αναλύτες. Είναι απαραίτητο να αναλυθεί το δείγμα και τα πρότυπα υπό τις ακριβείς ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Είναι επίσης σημαντικό να έχουμε μία γενική γνώση των αναμενόμενων αναλυτών στο δείγμα μας ήδη πριν την ανάλυση, προκειμένου να επιλεγούν τα κατάλληλα πρότυπα. 239

241 Οι μετρήσεις σε μια οποιαδήποτε χρωματογραφική τεχνική ανάλυσης είναι σχετικές και απαιτούν τη βαθμονόμηση των χρωματογράφων με διαλύματα προτύπων παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα. Οι κυριότερες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση αναφέρθηκαν στο Kεφάλαιο 1. Είναι προφανές ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας, τόσο μεγαλύτερο θα είναι το εμβαδό της προκύπτουσας κορυφής (εφόσον περισσότερα μόρια της ουσίας θα ανιχνεύονται από τον ανιχνευτή). Μάλιστα η σχέση αυτή είναι ανάλογη. Η ποσοτικοποίηση, λοιπόν, σε μια χρωματογραφική ανάλυση γίνεται βάσει του εμβαδού της επιφάνειας της κορυφής, το οποίο είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση της ουσίας, μετά την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς. Τέτοιο παράδειγμα ποσοτικοποίησης περιλαμβάνεται στο πειραματικό μέρος (βλ. Ενότητα 8.9) που ακολουθεί. Στο Σχήμα 8.21 φαίνεται η υπέρθεση δύο χρωματογραφημάτων διαφορετικών συγκεντρώσεων μιας ουσίας. Και στις δύο περιπτώσεις η ουσία αναλύθηκε υπό τις ακριβώς όμοιες χρωματογραφικές συνθήκες. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής, το οποίο υπολογίζεται αυτόματα από το λογισμικό που υποστηρίζει το σύστημα της χρωματογραφίας, φαίνεται στο ένθετο. Εκεί, φαίνεται και η συγκέντρωση της ουσίας που έδωσε την κάθε κορυφή. Από τα δεδομένα του ένθετου είναι φανερό ότι το εμβαδόν αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη. Είναι επίσης λογικό και εμφανές από το γράφημα, ότι ο χρόνος έκλουσης δεν μεταβάλλεται με τη μεταβολή της συγκέντρωσης της ουσίας. Σημειώνεται ότι μονάδα μέτρησης του εμβαδού στην περίπτωση ανιχνευτή UV/Vis είναι η μονάδα mau min. Σχήμα 8.21 Υπέρθεση δύο χρωματογραφημάτων συγκεντρώσεων C A και C B μίας ουσίας. Και στις δύο περιπτώσεις η ουσία αναλύθηκε υπό τις ακριβώς όμοιες χρωματογραφικές συνθήκες. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής σημειώνεται στο ένθετο. Επίσης, ισχύει και η αναλογία του ύψους της κορυφής με την ποσότητα του αναλύτη. Θα πρέπει να γίνει κατανοητό ότι κατά την ποσοτικοποίηση δύο ουσιών που περιέχονται σε ένα μίγμα, είναι απαραίτητο να κατασκευαστεί καμπύλη αναφοράς για καθένα από τα συστατικά του μίγματος, χρησιμοποιώντας για κάθε καμπύλη αναφοράς την αντίστοιχη πρότυπη ουσία. Αυτό θα πρέπει να γίνει, διότι δεν υπάρχει αναλογία μεταξύ του εμβαδού της κορυφής της μίας ουσίας και της συγκέντρωσης της δεύτερης ουσίας. Αυτό οφείλεται στο ότι η κάθε ουσία απορροφάει στο συγκεκριμένο μήκος κύματος στο UV/Vis (όπου ελέγχεται η απορρόφηση) έχοντας διαφορετικό συντελεστή μοριακής απόσβεσης. Έτσι, παρατηρώντας απλώς το χρωματογράφημα π.χ. του Σχήματος 8.13 δεν είναι δυνατόν να αποφανθούμε, εάν η ουσία 1 βρίσκεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση σε σχέση με την ουσία 2 και το αντίθετο. Προκειμένου να γίνει σύγκριση της συγκέντρωσης των δύο ουσιών θα πρέπει να κατασκευασθούν δύο καμπύλες αναφοράς, μία για την κάθε ουσία. Σύνοψη: Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης μιας αναλυόμενης ουσίας σε μία χρωματογραφική ανάλυση, γίνεται βάσει του εμβαδού της επιφάνειας της χρωματογραφικής κορυφής της ουσίας. Αυτό είναι ανάλογο της συγκέντρωσης της ουσίας. Ο ποσοτικός προσδιορισμός είναι δυνατός μετά την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς, χρησιμοποιώντας πρότυπα της ουσίας διαφορετικής συγκέντρωσης. 240

242 8.6.3 Οι προδιαγραφές μίας αναλυτικής Χρωματογραφικής στήλης HPLC Οι κύριες παράμετροι που χαρακτηρίζουν μία αναλυτική χρωματογραφική στήλη αναφέρονται παρακάτω. Οι βέλτιστες τιμές των παραμέτρων αυτών είναι διαφορετικές ανάλογα με την τάξη της ουσίας που μας ενδιαφέρει να προσδιορίσουμε. Ο κάθε εμπορικός οίκος προτείνει στήλες με συγκεκριμένες προδιαγραφές, ανάλογα με τις ανάγκες του αναλυτή. 1. Διαστάσεις της στήλης. Καθώς οι στήλες είναι σωληνοειδείς, οι διαστάσεις μιας στήλης δίνονται υπό την μορφή (εσωτερική διάμετρος στήλης x μήκος στήλης). Π.χ. στήλη (4,6 x 250 mm) σημαίνει στήλη εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm και μήκους καλυμένου με πληρωτικό υλικό, 250 mm. 2. Μέγεθος σωματιδίων υλικού και μέγεθος πόρων υλικού. Το πιο κοινό πληρωτικό υλικό είναι το οξείδιο του πυριτίου, συνήθως χημικά τροποποιημένο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Το μέγεθος σωματιδίων του οξειδίου του πυριτίου κυμαίνεται μεταξύ 3 και 50 µm. Το μικρότερο μέγεθος των σωματιδίων του πληρωτικού υλικού γενικά δίνει καλύτερους διαχωρισμούς. Το μέγεθος των πόρων (διάμετρος των πόρων) του πληρωτικού υλικού κυμαίνεται γενικά μεταξύ Å. Για το διαχωρισμό σχετικά μικρών μορίων περισσότερο κοινή είναι η διάμετρος πόρων 100 Å. 3. Είδος στατικής φάσης. Προδιαγραφές της στήλης που αναφέρονται είναι: - το διάστημα των τιμών ph, όπου η στήλη λειτουργεί αποτελεσματικά, χωρίς φθορά του πληρωτικού. υλικού. - η μέγιστη πίεση στην οποία μπορεί να υποβληθεί μια στήλη χωρίς αλλαγή στο ύψος της θεωρητικής πλάκας και τον αριθμό των θεωρητικών πλακών για έναν διαχωρισμό. Στην πειραματική άσκηση που περιγράφεται πιο κάτω η χρωματογραφική στήλη που θα χρησιμοποιηθεί είναι η Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex. Αυτό σημαίνει ότι πρόκειται για στήλη αντίστροφης φάσης C18, εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm, μήκους 150 mm με μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού 3 μm και με διάμετρο πόρων σωματιδίων πληρωτικού υλικού 120 Å. 8.7 Παραδείγματα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Προκειμένου να εντοπιστούν οι βέλτιστες συνθήκες ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού, ο αναλυτής καλείται να επιλέξει καταρχήν την περισσότερο κατάλληλη στατική φάση και κατόπιν την βέλτιστη κινητή φάση και το πρωτόκολλο διαχωρισμού Η επιλογή της Στατικής Φάσης Στην επιλογή της στατικής φάσης (συνεπώς της αναλυτικής στήλης) λαμβάνονται υπ όψη τα παρακάτω χαρακτηριστικά/προδιαγραφές της στήλης σε συνδυασμό με τη μοριακή δομή (δηλ. την ομόλογη σειρά, την πολικότητα, το μέγεθος μορίου κ.α.) της προσδιοριζόμενης ουσίας αλλά και των προσμίξεων που αναμένονται στο αναλυόμενο δείγμα: το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως, τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης, η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης, η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως, η σταθερότητα της στήλης στη μεταβολή του ph, η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους τόσο πιο πολική είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων. Όλοι οι εμπορικοί οίκοι χρωματογραφικών στηλών παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις παραπάνω προδιαγραφές της στήλης, αλλά και αναλυτικές μελέτες της απόδοσης της στήλης σε σχέση με τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του αναλυόμενου μορίου και των αναμενόμενων προσμίξεων. 241

243 Ένας γενικός κανόνας που πρέπει να ακολουθείται από τον αναλυτή είναι ότι «η στατική φάση πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με την(ις) προσδιοριζόμενη(ες) ένωση(εις)». Στο Σχήμα 8.22 που ακολουθεί φαίνεται το διαφορετικό χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση του ίδιου μίγματος ουσιών, όταν χρησιμοποιούνται στήλες αντίστροφης φάσης C8 ή C18. Για τη συγκεκριμένη ανάλυση η χρήση της στήλης C18 προσφέρει καλύτερο διαχωρισμό των κορυφών 3 και 4. Σχήμα 8.22 Επίδραση του μήκους της αλυσίδας που είναι προσδεμένη στο προσροφητικό υλικό στηλών αντίστροφης φάσης στον διαχωρισμό μίγματος θειαμίνης (1), νικοτιναμίδιου (2), νικοτινικού οξέος (3), οροτικού οξέος (4), αμινοβενζοϊκού οξέος (5). Στο ανώτερο χρωματογράφημα χρησιμοποιήθηκε στήλη C8, ενώ στο κατώτερο στήλη C18. Και στις δύο αναλύσεις οι στήλες είχαν τις ίδιες διαστάσεις, ίδιο μέγεθος σωματιδίων προσροφητικού υλικού και ίδιο μέγεθος πόρων. Επίσης, και στις δύo περιπτώσεις η ίδια κινητή φάση και ταχύτητα ροής χρησιμοποιήθηκαν (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου ARC Sciences Η επιλογή της Κινητής Φάσης Όπως αναφέρθηκε, η διαχωριστική ικανότητα Rs εξαρτάται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών Ν της στήλης και τον παράγοντα συγκράτησης k. Μετά την επιλογή της στατικής φάσης (συνεπώς και την επιλογή του αριθμού θεωρητικών πλακών Ν), επιλέγεται η κινητή φάση, έτσι ώστε ο παράγοντας k' να είναι μεταξύ 5 και 20. Η βελτιστοποίηση της παραμέτρου k επιτυγχάνεται κυρίως με αλλαγές στη σύσταση και ταχύτητα ροής της κινητής φάσης και δευτερευόντως με αλλαγές στη θερμοκρασία της ανάλυσης. Σε μία χρωματογραφική ανάλυση εφαρμόζονται κυρίως δύο διαφορετικές τεχνικές έκλουσης: η ισοκρατική έκλουση (isocratic elution) και η βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Στην ισοκρατική έκλουση η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση καθ όλη τη διάρκεια της ανάλυσης, ενώ στη βαθμιδωτή έκλουση η σύσταση της κινητής φάσης έχει προγραμματιστεί να μεταβάλλεται κατά την ανάλυση είτε γραμμικά (linear gradient), είτε σε διακριτά βήματα (step gradient). To Σχήμα 8.23 παρουσιάζει βασικά πρωτόκολλα βαθμιδωτής και ισοκρατικής έκλουσης και τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε κάθε περίπτωση κατά την ανάλυση του ίδιου μίγματος. Είναι φανερό ότι στη συγκεκριμένη ανάλυση η μεταβολή του πρωτοκόλλου έκλουσης από ισοκρατική σε βαθμιδωτή είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του εύρους των κορυφών, αλλά και τη σημαντική μείωση του χρόνου της ανάλυσης. Το τελευταίο έχει ιδιαίτερη σημασία, επειδή οι διαλύτες υψηλής καθαρότητας που απαιτούνται στην υγροχρωματογραφία είναι ιδιαίτερα υψηλού κόστους. 242

244 Σχήμα 8.23 Χρωματογραφήματα που λήφθηκαν κατά την ισοκρατική (Α) και βαθμιδωτή (Β) έκλουση μίγματος ουσιών 1-9 που αναλύθηκαν σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας. Τα αντίστοιχα πρωτόκολλα έκλουσης φαίνονται στα Α και Β. Η ισοκρατική ανάλυση και βαθμιδωτή ανάλυση έδωσαν συγκρίσιμη διαχωριστική ικανότητα κρίσιμου ζεύγους, αλλά η βαθμιδωτή έκλουση υπερτερεί στη συγκεκριμένη ανάλυση στο ότι απαιτείται πολύ μικρότερος χρόνος ανάλυσης και στο ότι δίνει κορυφές μικρότερου εύρους (Schellinger & Carr, 2006). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλογή του βέλτιστου πρωτόκολλου διαχωρισμού επιτυγχάνεται μόνο μετά από πολλαπλές διαδοχικές δοκιμές. Στις δοκιμές αυτές, κάθε προηγούμενο πρωτόκολλο δίνει τις κατευθυντήριες αρχές, για την επιλογή του επόμενου πρωτόκολλου. Έχοντας αλλάξει τις χρωματογραφικές συνθήκες, η βελτίωση του χρωματογραφικού διαχωρισμού διαπιστώνεται με υπολογισμό της μεταβολής της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης, σε ό, τι αφορά ένα κρίσιμο ζεύγος αναλυτών. Ως κρίσιμο ζεύγος αναλυτών χαρακτηρίζεται το ζεύγος αυτό για το οποίο καταγράφεται η χαμηλότερη διαχωριστική ικανότητα. Π.χ. για τον διαχωρισμό, που φαίνεται στο Σχήμα 8.23 και για το πρωτόκολλο Α, το κρίσιμο ζεύγος είναι το ζεύγος των αναλυτών 3-4, ενώ για το πρωτόκολλο Β, κρίσιμο ζεύγος είναι το ζεύγος των αναλυτών 8-9. Άλλες παράμετροι που εξετάζονται προκειμένου να διαπιστωθεί η καταλληλότητα ενός πρωτοκόλλου είναι ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης και κυρίως η επαναληψιμότητα της ανάλυσης, σε ό, τι αφορά στο εμβαδό/ύψος των κορυφών, καθώς και το εύρος της γραμμικής περιοχής της καμπύλης αναφοράς. Στο Σχήμα 8.24 φαίνεται το χρωματογραφικό προφίλ του μίγματος ουσιών α, β, γ των Σχημάτων 8.8 και 8.9, μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α) όπως στο Σχήμα 8.8 και αντίστροφης φάσης (Β), όπως στο Σχήμα 8.9. Η μεταβολή της πολικότητας της κινητής φάσης μειώνει τη διαχωριστική ικανότητα (σε Rs < 1,5), αλλά και το χρόνο της ανάλυσης. Προκειμένου να εντοπιστεί το βέλτιστο πρωτόκολλο διαχωρισμού θα πρέπει ο αναλυτής να πειραματισθεί με την πολικότητα της κινητής φάσης μεταβάλλοντας την 243

245 διαδοχικά μεταξύ των δύο ακραίων τιμών του Σχήματος Οι βέλτιστες συνθήκες θα είναι αυτές που θα δώσουν Rs 1,5 σε συνδυασμό με τον ελάχιστο χρόνο ανάλυσης. Σχήμα 8.24 Χρωματογραφικό προφίλ του ίδιου μίγματος ουσιών α, β, γ μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α και Α ) και αντίστροφης φάσης (Β και Β ). Η σχέση της πολικότητας των διαχωριζόμενων ουσιών είναι α>β>γ, ενώ κατά τον διαχωρισμό η κινητή φάση είναι χαμηλής πολικότητας για το Α και υψηλής πολικότητας για το Β. Μεταβάλλοντας την πολικότητα της κινητής φάσης σε μέση πολικότητα (στα Α και Β ) η διαχωριστική ικανότητα της στήλης μειώνεται. Ταυτόχρονα όμως μειώνεται και ο χρόνος της ανάλυσης Παράδειγμα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Σιμβαστατίνης σε ορό Στο παρακάτω παράδειγμα παρουσιάζεται η πορεία που ακολουθήθηκε προκειμένου να γίνει δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός σιμβαστατίνης (αντιλιπιδικός παράγοντας), που προστέθηκε εξωγενώς σε ορό. Ο προσδιορισμός της περιγράφεται στο πειραματικό μέρος (Ενότητα 8.9) που ακολουθεί. 1. Εφόσον η σιμβαστατίνη είναι ένα μόριο χαμηλής πολικότητας, επιλέχθηκε η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης για τον διαχωρισμό της. Αρχικά «έτρεξαν» πρότυπα διαλύματα σιμβαστατίνης σε διαφορετικές συνθήκες σύστασης κινητής φάσης και ταχύτητας ροής αυτής (Φωτογραφίες ). Τα πρότυπα αναλύθηκαν σε στήλη Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex. Φωτογραφία 8.4 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 70:30 και ταχύτητα ροής αυτής 0,7 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 12,62 min. 244

246 Φωτογραφία 8.5 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 80:20 και ταχύτητα ροής αυτής 0,7 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 8,68 min. Φωτογραφία 8.6 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 80:20 και ταχύτητα ροής αυτής 0,9 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 5,75 min. 245

247 Φωτογραφία 8.7 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 70:30 και ταχύτητα ροής αυτής 0,9 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 10,60 min. 2. Στη συνέχεια έτρεξε ορός ελεύθερος σιμβαστατίνης σε κάθε μία από τις πειραματικές συνθήκες που εφαρμόστηκαν, προκειμένου να διαπιστωθεί ποιες συνθήκες είναι οι καταλληλότερες, δηλαδή υπό ποιες συνθήκες οι ενδογενείς κορυφές του ορού δεν συνεκλούονται με την κορυφή της σιμβαστατίνης. Φωτογραφία 8.8 Χρωματογραφικό προφίλ ορού χωρίς την προσθήκη εξωγενούς σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ευθεία δηλώνει τη θέση, όπου θα εκλούονταν η σιμβαστατίνη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 80:20, ταχύτητα ροής 0,9 ml/min), σύμφωνα με τα πρότυπα των προηγούμενων φωτογραφιών. 246

248 Φωτογραφία 8.9 Χρωματογραφικό προφίλ ορού χωρίς την προσθήκη εξωγενούς σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ευθεία δηλώνει τη θέση όπου θα εκλούονταν η σιμβαστατίνη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 70:30, ταχύτητα ροής 0,9 ml/min), σύμφωνα με τα πρότυπα των προηγούμενων φωτογραφιών. Φωτογραφία 8.10 Xρωματογράφημα ορού μετά την εξωγενή προσθήκη σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ένδειξη υποδεικνύει την κορυφή της σιμβαστατίνης. Η ανάλυση έγινε με κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 70:30 και ταχύτητα ροής 0,9 ml/min. 247

249 Στην Φωτογραφία 8.8 φαίνεται ότι υπάρχει μία ενδογενής κορυφή του ορού που εκλούεται στο χρόνο έκλουσης της σιμβαστατίνης. Κατά συνέπεια, δεν θα ήταν δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης υπό τις συνθήκες αυτές. Αντίθετα, όπως φαίνεται στο χρωματογράφημα της Φωτογραφίας 8.9 δεν υπάρχει ενδογενής κορυφή του ορού που να εκλούεται στο χρόνο έκλουσης της σιμβαστατίνης, οπότε γίνεται δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης, υπό τις συνθήκες του χρωματογραφήματος της Φωτογραφίας 8.9. Σύνοψη: Στην ανάπτυξη του βέλτιστου πρωτόκολλου διαχωρισμού ένας πρώτος κανόνας που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη είναι ότι «η στατική φάση πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με την προσδιοριζόμενη ένωση». Η επιλογή του πρωτόκολλου μεταβολής της κινητής φάσης γίνεται με πολλαπλές δοκιμές και με κριτήρια πρωτίστως το διαχωρισμό της κορυφής ενδιαφέροντος από προσμίξεις αλλά και το συνδυασμό μέγιστου εύρους γραμμικής περιοχής της καμπύλης αναφοράς, την επαναληψιμότητα του εμβαδού/ύψους των κορυφών και τον απαιτούμενο χρόνο της ανάλυσης. Σύνοψη: Σε μια χρωματογραφική ανάλυση οι παράμετροι ταχύτητα ροής κινητής φάσης, υλικό πληρώσεως και μέγεθος/διάμετρος πόρων σωματιδίων στήλης, διαστάσεις στήλης και θερμοκρασία στήλης πρέπει να ορίζονται επακριβώς προκειμένου η ανάλυση να είναι επαναλήψιμη. 8.8 Εφαρμογές της HPLC στην Κλινική Ανάλυση Τα πιο κοινά πεδία εφαρμογών της χρωματογραφίας HPLC στη κλινική ανάλυση αποτελούν: Η τοξικολογική ανάλυση. Η HPLC χρησιμοποιείται συχνά στην ιατροδικαστική και στην εγκληματολογική έρευνα και ιδιαίτερα στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων (επιπέδων) ουσίων ή μεταβολιτών τους, ναρκωτικών, δηλητηρίων και φαρμάκων σε τοξικές δόσεις, στα βιολογικά υγρά. Η θεραπευτική παρακολούθηση φαρμάκων (φαρμακοκινητικός έλεγχος). Ο προσδιορισμός των επιπέδων ενός φαρμάκου στον ορό έχει νόημα στην θεραπευτική παρακολούθηση της επίδρασης ή της συγκέντρωσης αυτού, με στόχο την προσαρμογή μιας μεμονωμένης δόσης του φαρμακευτικού προϊόντος. Η ανάλυση κλινικών αναλυτών με διαγνωστικό ενδιαφέρον, για τους οποίους οι φωτομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού παρουσιάζουν μικρή εκλεκτικότητα. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η περίπτωση της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης Προσδιορισμός των επιπέδων της Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης και άλλων Αιμοσφαιρινικών κλασμάτων με HPLC Ο ευρύτερα αποδεκτός δείκτης για την παρακολούθηση της νόσου του σακχαρώδη διαβήτη και την αξιολόγηση της μεσοπρόθεσμης αποτελεσματικότητας της εφαρμοζόμενης θεραπείας, αποτελούν τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης A 1c (HbA 1c). Η HbA 1c αποτελεί το κυριότερο κλάσμα της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη είναι το ποσοστό της αιμοσφαιρίνης που έχει υποστεί γλυκοζυλίωση. Η παρουσία HbA 1c σε ποσοστό μεγαλύτερο του 6,5% της ολικής αιμοσφαιρίνης αποτελεί ένδειξη διαβήτη. Σύμφωνα με την Αμερικανική Διαβητολογική Εταιρεία (American Diabetes Association ή ADA), η προδιαβητική κατάσταση χαρακτηρίζεται από την παρουσία HbA 1c μεταξύ 5,7-6,4%. Δεδομένου ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια (με μέση διάρκεια ζωής περί των ημερών) που περιέχουν την αιμοσφαιρίνη, συνεχώς ανανεώνονται, το ποσοστό γλυκοζυλίωσης της αιμοσφαιρίνης μεταβάλλεται κι αυτό, ανάλογα με τη γλυκόζη του αίματος. Καθώς η γλυκοζυλίωση της αιμοσφαιρίνης είναι μη αναστρέψιμη, η τιμή της HBA 1c ενσωματώνει τις διακυμάνσεις του σακχάρου του αίματος στο διάστημα των τελευταίων 2-3 μηνών και αντανακλά τη μέση τιμή του τελευταίου. Σήμερα, τα επίπεδα της HbA 1c θεωρούνται ως το πιο αξιόπιστο κριτήριο μεταβολικού ελέγχου. Έχει αποδειχθεί η συσχέτιση μεταξύ επιπέδων HbA 1c και μακροχρόνιου κινδύνου πιθανών επιπλοκών του σακχαρώδη διαβήτη, όπως και του τακτικού ελέγχου των επιπέδων HbA 1c με την αποτελεσματικότητα του γλυκαιμικού ελέγχου των ασθενών (Delamater, 2006). Επιπλέον, ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιμέρους αιμοσφαιρινικών κλασμάτων έχει κλινικό ενδιαφέρον στη διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθείων, σε περιπτώσεις θαλασσαιμίας ή άλλων αναιμιών (Clarke & Higginsa, 2000). Παλαιότερα, η κλασική ηλεκτρόφορηση εφαρμόζονταν πολύ συχνά στην κλινική ανάλυση HbA 1c. Η τεχνική αυτή έχει πλέον αντικατασταθεί είτε από τη χρωματογραφία HPLC είτε από την τριχοειδική 248

250 ηλεκτροφόρεση, είτε από ανοσομεθόδους. Τα πλεονεκτήματα της HPLC έναντι της κλασικής ηλεκτροφόρησης συνοψίζονται κυρίως στην μεγαλύτερη ταχύτητα ανάλυσης της πρώτης, τη δυνατότητα ανίχνευσης περισσότερων παθολογικών αιμοσφαιρινικών κλασμάτων και τον μεγαλύτερο αυτοματισμό της. Επίσης, η χρήση φωτομετρικών μεθόδων προσδιορισμού αιμοσφαιρίνης έχει πλέον εκλείψει στην κλινική βιοχημική ανάλυση. Η Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής (IFCC, 2002) ενέκρινε το 2002 δύο εναλλακτικές μέθοδους αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της HbA 1c στα πλαίσια του γλυκαιμικού ελέγχου. Και οι δύο μέθοδοι βασίζονται στην ενζυματική πρωτεόλυση της αιμοσφαιρίνης που οδηγεί στην αποκοπή ενός εξαπεπτιδίου από το άμινο-τελικό άκρο της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης. Τα γλυκοζυλιωμένα εξαπεπτίδια διαχωρίζονται στη συνέχεια από τα μη γλυκοζυλιωμένα εξαπεπτίδια με χρωματογραφία RP-HPLC. Στην πρώτη μεθοδολογία χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής φασματογράφος μάζας με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (HPLC-ESI/MS). Στη δεύτερη μεθοδολογία η RP-HPLC στήλη συνοδεύεται από ανιχνευτή UV και είναι συζευγμένη με σύστημα τριχοειδικής ηλεκτροφόρεσης, επίσης με ανιχνευτή UV (HPLC-CE). Οι υψηλές τεχνικές απαιτήσεις, σε συνδυασμό με το κόστος και τη μεγάλη διάρκεια των αναλύσεων με τις παραπάνω μεθόδους, απέτρεψε την ευρεία υιοθέτησή τους από τα κλινικά εργαστήρια ανά τον κόσμο. Σήμερα, τα κλινικά εργαστήρια παγκοσμίως που μετρούν τα επίπεδα HbA 1c στα πλαίσια γλυκαιμικού ελέγχου ασθενών, χρησιμοποιούν μεθόδους εγκεκριμένες κατά το NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program, Εθνικό Πρόγραμμα Προτυποποίησης Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης) των ΗΠΑ. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται είτε στη χρωματογραφία HPLC, είτε στην τριχοειδική ηλεκτροφόρηση, είτε σε ανοσομεθόδους. Οι εγκεκριμένες μέθοδοι HPLC χρησιμοποιούν κυρίως τη χρωματογραφία κατιοντικής ανταλλαγής. Πολύ συχνά χρησιμοποιούνται οι στήλες κατιοντικής ανταλλαγής PolyCAT A. Σε αυτές, η στατική φάση είναι οξείδιο του πυριτίου, όπου έχουν συζευχθεί αλυσίδες πολυασπαρτικού οξέος. Οι μέθοδοι αυτοί επιτρέπουν το διαχωρισμό της HbA 1c και τον εκλεκτικό ποσοτικό προσδιορισμό αυτής. Παράλληλα, είναι κατάλληλες για τον ποσοτικό προσδιορισμό των διαφόρων άλλων αιμοσφαιρινικών κλασμάτων, για τη διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών. Συνήθως τα σύγχρονα διαγνωστικά εργαστήρια διαθέτουν πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα HPLC, που χρησιμοποιούνται αποκλειστικά ως αναλυτές αιμοσφαιρινοπαθειών. Αυτά διαθέτουν ολοκληρωμένα συστήματα βαθμονόμησης και ποιοτικού ελέγχου, προκατεργασίας δείγματος με αιμόλυση ολικού αίματος και αυτόματο δειγματολήπτη. Τέτοια είναι τα συστήματα του οίκου Bio-Rad (California, USA). Οι αναλυτές αιμοσφαιρίνης της Biorad, Variant II (Turbo) και D-10 Hemoglobin Testing System ως παράδειγμα, διαθέτουν ενσωματωμένα προγράμματα ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού HbA 1c και θαλασσαιμίας (Wajcman, 2003). Πριν τη χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιείται από το αυτοποιημένο σύστημα αιμόλυση ολικού αίματος με χρήση αιμολυτικού αντιδραστηρίου. Το πρωτόκολλο HbA 1c χρησιμοποιεί στήλη κατιοντικής ανταλλαγής και η έκλουση επιτυγχάνεται με χρήση βαθμίδας ιοντικής ισχύος. Η ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός στηρίζονται σε διχρωματική ανάλυση στα 415 nm και 690 nm (βλ. Ενότητα ). Στον υπολογισμό του εμβαδού της επιφάνειας της κορυφής που αντιστοιχεί στην HbA 1c εξαιρείται η συνδρομή της ασταθούς HbA 1c (labile HbA 1c) και καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινών. Με το ενσωματωμένο πρόγραμμα θαλασσαιμίας επιτυγχάνεται ο καθορισμός μέσα σε λίγα λεπτά του ποσοστού των HbA 2 και HbF και η προκαταρκτική ανίχνευση άλλων κοινώς απαντούμενων, μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Το πρωτόκολλο χρησιμοποιεί στήλη κατιοντικής ανταλλαγής 3,0 0,46 cm και η έκλουση πραγματοποιείται στους 32 ± 1 C, με ταχύτητα ροής 2 ml/min, με χρήση βαθμίδας ph και ιοντικής ισχύος που επιτυγχάνεται με δύο φωσφορικά ρυθμιστικά διαλύματα (Wajcman, 2003). 8.9 Πειραματικό μέρος Προσδιορισμός συγκέντρωσης Σιμβαστατίνης σε ορό Αρχή της μεθόδου Η σιμβαστατίνη συνταγογραφείται για την μείωση των επιπέδων της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων στο αίμα. Πρόκειται για μια λακτόνη η οποία στον οργανισμό μετατρέπεται πολύ εκτενώς στο αντίστοιχο υδροξυοξύ, που αποτελεί και τη φαρμακολογικά ενεργή μορφή. Σε μοριακό επίπεδο δρα αναστέλλοντας το ένζυμο της αναγωγάσης του 3-υδροξυ-3-μεθυλογλουταρικού συνενζύμου Α. Ο φαρμακοκινητικός προσδιορισμός των επιπέδων ενός φαρμάκου στον ορό, παίζει σημαντικό ρόλο στην θεραπευτική παρακολούθηση της δράσης του φαρμάκου, με στόχο τον καθορισμό της ιδανικής 249

251 δοσολογίας του συγκεκριμένου ασθενή. Στην περίπτωση της σιμβαστατίνης, λόγω της εκτενούς μετατροπής της στο υδροξυοξύ, τα επίπεδα του προφαρμάκου δεν ανιχνεύονται στον ορό, ενώ ανιχνεύονται τα επίπεδα της φαρμακολογικά ενεργής μορφής (υδροξυοξύ) (Bews et al., 2014). Για καθαρά διδακτικούς λόγους, στην άσκηση αυτή επιχειρείται ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης σε δείγμα ορού όπου αυτή έχει προστεθεί εξωγενώς. O χρόνος ανάσχεσης t R αποτελεί το κριτήριο ταυτοποίησης των ουσιών που αναλύονται χρωματογραφικά. Για σταθερές παραμέτρους ανάλυσης (υλικό πλήρωσης και διαστάσεις στήλης, ταχύτητα ροής κινητής φάσης, θερμοκρασία και σύσταση του συστήματος έκλουσης) ο χρόνος ανάσχεσης είναι σταθερός και χαρακτηρίζει την εκλουόμενη ουσία. Το εμβαδόν της χρωματογραφικής κορυφής της αναλυόμενης ουσίας ή το μέγιστο ύψος αυτής χρησιμοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της, διότι αυτά είναι ανάλογα της συγκέντρωσης της αναλυόμενης ουσίας. Τα δείγματα που αναλύονται με HPLC πρέπει να βρίσκονται αποκλειστικά σε υγρή μορφή. Συνήθης προκατεργασία αυτών αποτελούν η αραίωση και η διήθηση. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του αναλύτη στα δείγματα γίνεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που κατασκευάζεται ενίοντας πρότυπα διαλύματα της καθαρής ουσίας. Αν είναι δυνατόν, τα πρότυπα παρασκευάζονται στο ίδιο μητρικό υλικό με τα δείγματα. Στο συγκεκριμένο προσδιορισμό, προκειμένου να ληφθούν υπ όψη οι όποιες απώλειες σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και εκχύλιση αυτών με ακετονιτρίλιο, ακριβώς όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου Σκεύη αντιδραστήρια - όργανα Φίλτρα σύριγγας Millipore (0,22 µm), σύριγγες ινσουλίνης, μικροσύριγγα ακριβείας Hamilton 100 μl, χρωματογραφική Στήλη Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex, ογκομετρικές φιάλες, γυάλινοι δοκιμαστικοί σωλήνες, ακετονιτρίλιο HPLC grade, υπερκάθαρο νερό (HPLC grade). Πρότυπη ουσία: European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard Σιμβαστατίνης (CAS Number , ΜB = 418,57) από οίκο Sigma. Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (Ultimate 3000, Dionex), που περιλαμβάνει αντλία παλινδρόμησης τεσσάρων διαλυτών Ultimate 3000 Pump (Pump LPG-3400 A), θερμοστατούμενο χώρο Column Compartment (TCC-3100) και ανιχνευτή Συστοιχίας φωτοδιόδων UV-Vis (PDA 3000) από τον οίκο Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA. Στήλη αντίστροφης φάσης Acclaim 120 C18 (Dionex), εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm, μήκους 150 mm με μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού 3 μm και με διάμετρο πόρων σωματιδίων πληρωτικού υλικού 120 Å. Σύνοψη: Τα σκεύη θα πρέπει να είναι πολύ καθαρά, γεγονός που εξασφαλίζεται με τον περιοδικό καθαρισμό τους με 2% w/v διχρωμικό κάλιο (όταν διαπιστωθεί ότι υπάρχουν προσμίξεις στα αναλυόμενα πρότυπα). Καθημερινά πλένονται με ακετονιτρίλιο ή υπερκαθαρό νερό, ανάλογα με το προηγούμενο περιεχόμενο τους. Οι διαλύτες της κινητής φάσης θα πρέπει να έχουν απαερωθεί (π.χ με συνεχή διοχέτευση αδρανούς αερίου, ή με διήθηση τους μέσα από ειδικές μεμβράνες, είτε με χρήση υπερήχων) και να είναι ελεύθεροι μικροβιακού φορτίου (π.χ. με τη διοχέτευσή τους μέσω φίλτρου με διάμετρο πόρων 0,22 μm). Συνήθως τα συστήματα HPLC διαθέτουν απαερωτές κενού, αμέσως μετά τους περιέκτες των διαλυτών, που απαερώνουν την κινητή φάση Παράμετροι της ανάλυσης Σύστημα έκλουσης: Ισοκρατική έκλουση με κινητή φάση 70% v/v ακετονιτρίλιο: 30 % v/v νερό Πίεση κινητής φάσης: psi Ταχύτητα ροής κινητής φάσης: 0,9 ml/min 250

252 Θερμοκρασία έκλουσης: 25 C Χρόνος ανάλυσης: 15 min Ενέσιμη ποσότητα δείγματος: 20 μl (χρησιμοποιείται βρόγχος χωρητικότητας 20 μl στο σύστημα εισαγωγής δείγματος) Καταγραφή απορρόφησης: στα 237 nm επί 15 min Παρασκευή και έγχυση των πρότυπων διαλυμάτων Παρασκευάζουμε έξι πρότυπα διαλύματα σιμβαστατίνης συγκεντρώσεως 0 μμ, 1,25 μμ, 2,5 μμ, 5,0 μμ, 10 μμ και 12,5 μμ. Για τη διάλυση της σιμβαστατίνης χρησιμοποιείται υπερκάθαρο ακετονιτρίλιο (HPLC grade), που έχει υποβληθεί σε απαέρωση. Για την κάθε ανάλυση, εισάγουμε με έγχυση 20 μl κάθε προτύπου στη στήλη, εκτελώντας τουλάχιστον δύο επαναλήψεις ανά πρότυπο. Ξεκινο ύμε από το πρότυπο μικρότερης συγκέντρωσης και αναλύουμε διαδοχικά τα υπόλοιπα πρότυπα, κατά σειρά αυξανόμενης συγκέντρωσης. Μετρούμε την απορρόφηση στα 237 nm επί 15 min. Υπό το επιλεγμένο πρωτόκολλο ανάλυσης η κορυφή της σιμβαστατίνης εκλούεται στα 10,60 min. Σύνοψη: Απαιτείται μεγάλη προσοχή στην καθαριότητα της μικροσύριγγας Hamilton. Η σύριγγα εκπλένεται αρχικά επανειλημμένα με τον διαλύτη, στον οποίο βρίσκεται διαλυμένο το πρότυπο και στη συνέχεια με το πρότυπο διάλυμα ή το δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί. Πρέπει να αποφεύγονται οι φυσαλίδες κατά την εισαγωγή του δείγματος. Επίσης, ο βρόγχος ανάλυσης θα πρέπει να έχει πληρωθεί με όγκο μεγαλύτερο από το τριπλάσσιο της χωρητικότητας του βρόγχου με το πρότυπο ή δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί, προκειμένου ο περιεχόμενος σε αυτόν όγκος να είναι ο προδιαγραφόμενος. Ο όγκος του δείγματος που υπερβαίνει την χωρητικότητα του βρόγχου απορρίπτεται στη δεξαμενή αποβλήτων Προετοιμασία του άγνωστου δείγματος Σε 200 μl πλάσματος προσθέτουμε εξωγενώς σιμβαστατίνη (κατά βούληση σε τελική συγκέντρωση 1,25-10 μm) και στη συνέχεια 400 μl ακετονιτρίλιο. Αναδεύουμε στο vortex, αφήνουμε το διάλυμα σε ηρεμία στους 2 8 C επί 30 min και φυγοκεντρούμε στα x g επί 10 min. Το υπερκείμενο υγρό αναρροφάται με πλαστική σύριγγα και διοχετεύεται μέσω κατάλληλου φίλτρου σύριγγας (0,22 µm, Millipore) σε καθαρό δοκιμαστικό σωλήνα. Ακολουθεί η εισαγωγή 20 μl του «άγνωστου» δείγματος στη στήλη. Γίνονται δύο εγχύσεις (ενέσεις) από το κάθε άγνωστο. Μεταξύ του τελευταίου αναλυόμενου προτύπου και του πρώτου αναλυόμενου αγνώστου πρέπει να παρεμβληθεί ένεση καθαρού ακετονιτριλίου, προκειμένου να διαπιστωθεί ότι στη στήλη δεν παραμένουν υπολείμματα προτύπου. Σύνοψη: Προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι όποιες απώλειες σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και η εκχύλιση αυτών να γίνεται με διπλάσιο όγκο ακετονιτριλίου, όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου Επεξεργασία αποτελεσμάτων Όπως αναφέρθηκε, κάνουμε δύο εγχύσεις από το κάθε πρότυπο διαλύματα και το δείγμα. Σημειώνουμε τους χρόνους ανάσχεσης (t R), για κάθε επανάληψη και κάθε συγκέντρωση πρότυπης ουσίας. Ταυτοποιούμε την σιμβαστατίνη στον ορό συγκρίνοντας τον χρόνο ανάσχεσης της σιμβαστατίνης των προτύπων με τους χρόνους ανάσχεσης των χρωματογραφικών κορυφών στο χρωματογράφημα του ορού. Ολοκληρώνουμε τις αντίστοιχες κορυφές, σημειώνουμε το εμβαδόν τους (ή το μέγιστο ύψος), υπολογίζουμε τον μέσο όρο των εμβαδών (ή του μέγιστου ύψους) των χρωματογραφικών κορυφών των δύο επαναλήψεων για κάθε πρότυπο και δείγμα, και κατασκευάζουμε καμπύλη αναφοράς. Στον Πίνακα 8.2 σημειώνονται οι τιμές εμβαδού των χρωματογραφικών κορυφών της σιμβαστατίνης που λήφθηκαν κατά τη χρωματογραφική ανάλυση των προτύπων της σιμβαστατίνης, σύμφωνα με τις παραπάνω συνθήκες. 251

253 [Σιμβαστατίνη] μμ Μέσο εμβαδόν κορυφής (mau min) 0 0,002 1,25 1,627 2,5 3, , ,164 12,5 17,846 Πίνακας 8.2 Μέσο εμβαδόν των κορυφών της σιμβαστατίνης κατά τη χρωματογραφική ανάλυση δύο επαναλήψεων των προτύπων. Από τις τιμές του πίνακα κατασκευάστηκε η παρακάτω καμπύλη αναφοράς (Σχήμα 8.25): Σχήμα 8.25 Καμπύλη αναφοράς ποσοτικού προσδιορισμού σιμβαστατίνης. Σημειώνεται η εξίσωση της ευθείας (εξίσωση παλινδρόμησης) και o συντελεστής συσχέτισης R 2. Με βάση την καμπύλη αναφοράς, υπολογίζεται η συγκέντρωση σιμβαστατίνης του «άγνωστου» δείγματος ορού. Έτσι, εάν το δείγμα ορού έδωσε κορυφή σε χρόνο που ταυτίζεται με το t R της σιμβαστατίνης μέσου εμβαδού 2 mau min, αντικαθιστώντας όπου y = 2,0 λαμβάνουμε χ = 1,48 μμ. Επειδή όμως το δείγμα αραιώθηκε 1:3 κατά τη διαδικασία της εκχύλισης η συγκέντρωση της σιμβαστατίνης σε αυτό θα είναι 3 x 1,48 = 4,44 μμ. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι λόγω απωλειών σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, η υπολογιζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου είναι ψευδώς χαμηλότερη της πραγματικής. Προκειμένου να ληφθούν υπ όψη οι όποιες απώλειες, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και εκχύλιση αυτών με ακετονιτρίλιο, ακριβώς όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου. Σύνοψη: Στη χρωματογραφία HPLC ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του αναλύτη στα δείγματα γίνεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που κατασκευάζεται ενίοντας πρότυπα διαλύματα της καθαρής ουσίας. Τα πρότυπα παρασκευάζονται αν είναι δυνατόν στο ίδιο μητρικό υλικό με τα δείγματα. Προκειμένου μάλιστα να ληφθούν υπόψη οι όποιες απώλειες του αναλύτη κατά την προκατεργασία των δειγμάτων πριν την 252

254 υγχροχρωματογραφική ανάλυσή τους, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων στη μήτρα και υποβολή αυτών στην προκατεργασία,να γίνεται ακριβώς, όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου Παράδειγμα προσδιορισμού HbA1c με HPLC Άλλο εξελιγμένο αυτοματοποιημένο σύστημα γλυκαιμικού ελέγχου είναι το HPLC HA-8140 της εταιρίας Menarini Diagnostics (Florence, Italy) (John et al., 1997). Ο αναλυτής αιμοσφαιρίνης HA 8140 διαθέτει σύστημα αυτόματης τροφοδοσίας δειγμάτων και ανάγνωσης bar code. Το σύστημα παραλαμβάνει αυτόματα 3 μl ολικού αίματος από το φιαλίδιο που περιέχει το προς ανάλυση δείγμα και ακολουθεί η αιμόλυση του δείγματος με προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος τετραπυροφωσφορικού, ph 6,0. Το αιμολυμένο δείγμα διατηρείται για 2 min στους 48 C, προκειμένου να απομακρυνθεί η ασταθής HbA 1c (labile HbA 1c). Στη συνέχεια το αιμόλυμα εισάγεται με ένεση σε στήλη αντίστροφης φάσης κατιοντικής ανταλλαγής, όπου υπάρχει καθηλωμένο συμπολυμερές μεθακρυλικού οξέος και μεθακρυλικού εστέρα (Micronex A 1c-HSII στήλη, Sekisui Chemical Co., Tokyo, Japan). Η στήλη θερμοστατείται στους 40 C. Η έκλουση πραγματοποιείται με ταχύτητα ροής 2 ml/min κι ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βαθμίδα ιοντικής ισχύος/ ph. Η ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός στηρίζονται σε διχρωματική ανάλυση στα 415 nm και 500 nm (βλ. Ενότητα ). O συνολικός χρόνος ανάλυσης είναι μόνο 4 min. Μειονέκτημα του αναλυτή αιμοσφαιρίνης HA 8140 είναι η παρεμβολή καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινικών κλασμάτων στην HbA 1c κορυφή (Meijs, 2008). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως εκατοστιαίο ποσοστό της ολικής αιμοσφαιρίνης. Στη Φωτογραφία 8.11 παρουσιάζεται το χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση αιμολύματος ασθενούς με το σύστημα HPLC HA-8140 και η ολοκλήρωση των λαμβανόμενων κορυφών. Εκεί φαίνεται ότι το κλάσμα ΗbΑ 1c αντιστοιχεί στις κορυφές P4 και P5. Η παρουσία μικρής κορυφής υπό τη μορφή «ώμου» (shoulder, κορυφή P4) στη βασική κορυφή της ΗbΑ 1c είναι κοινή σε πολλά πρωτόκολλα διαχωρισμού αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Το σχετικό εκατοστιαίο ποσοστό της HbA 1c (% HbA 1c) δίνεται από το άθροισμα της σχετικής εκατοστιαίας περιεκτικότητας που αντιστοιχεί στις κορυφές 4 και 5. Το ποσοστό %ΗbΑ 1c στη συγκεκριμένη ανάλυση είναι 6,6% και υποδεικνύει κακή ρύθμιση του διαβήτη. Το συνολικό ποσοστό της ολικής γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (%HbA 1) προέρχεται από το άθροισμα της σχετικής εκατοστιαίας περιεκτικότητας που αντιστοιχεί στις κορυφές P1 μέχρι και P5, ενώ στη μη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA 0) αντιστοιχεί η κορυφή P6. Το άθροισμα HbA 1 + HbA 0 δίνει την ολική αιμοσφαιρίνη. Φωτογραφία 8.11 Χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση αιμολύματος ασθενούς με το σύστημα HPLC HA Αναγράφεται και η ολοκλήρωση των λαμβανόμενων κορυφών. 253

255 Ένα πιο σύγχρονο αυτοματοποιημένο σύστημα γλυκαιμικού ελέγχου του ίδιου εμπορικού οίκου (Menarini Diagnostics, Florence, Italy) είναι ο αναλυτής αιμοσφαιρίνης Hb Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός εδώ βασίζεται στη μέθοδο χημικής συγγένειας βορονικού οξέος. Η στήλη που χρησιμοποιείται έχει καθηλωμένα σε στερεό υπόστρωμα παράγωγα του βορονικού οξέος, με τα οποία δίνουν ενώσεις συναρμογής οι ομάδες 1,2-cis-διόλης της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Ομάδες 1,2-cis-διόλης δεν υπάρχουν στη μη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη. Έτσι όταν αιμόλυμα διέρχεται διαμέσου της στήλης, μόνο τα κλάσματα της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης αλληλεπιδρούν με αυτήν, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται. Η έκλουσή τους επιτυγχάνεται στη συνέχεια με χρήση κατάλληλου αντιδραστηρίου έκλουσης που συναγωνίζεται τη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη για τις θέσεις πρόσδεσης. Η έκλουση του γλυκοζυλιωμένου κλάσματος ανιχνεύεται με φωτομέτρηση στα 413 nm. Η εφαρμοζόμενη μέθοδος αποτρέπει κάθε παρεμβολή στο αποτέλεσμα των κύριων παθολογικών αιμοσφαιρινών, της ασταθούς HbA 1c και καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινών και συνεπώς πλεονεκτεί σε σχέση με το αναλυτή HA

256 Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο Σύντομη παρουσίαση χρήσης αυτόματου αναλυτή HPLC για τον προσδιορισμό της σιμβαστατίνης, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Aρχή μεθόδου χρωματογραφίας στήλης: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου ΤLC (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Διαχωρισμός μίγματος φαινόλης (C 6H 5OH)/τολουολίου (C 6H 5CH 3) με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Η φαινόλη είναι πιο πολική από το τολουόλιο, λόγω της παρουσίας του υδροξυλίου στο μόριο της και αλληλεπδρά ισχυρότερα με την πολική στατική φάση. Κατά συνέπεια θα καθυστερεί σε σχέση με το μόριο του τολουολίου, το οποίο θα προπορεύεται: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου χρωματογραφίας χάρτου. Στην παρουσίαση αυτή, παρουσιάζεται προσομοίωση του διαχωρισμού μίγματος αποτελούμενου από μία μπλε και μία κίτρινη ουσία. Στην επίδειξη παρέχεται η δυνατότητα της προσομοίωσης του διαχωρισμού μεταβάλλοντας το βαθμό προσρόφησης των διαχωριζόμενων ουσιών στο χαρτί καθώς και τη διαλυτότητα αυτών στην κινητή φάση: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου χρωματογραφικού διαχωρισμού με HPLC αντίστροφης φάσης: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Παρουσίαση του βρόγχου εισαγωγής του δείγματος σε διάταξη: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Αρχή μεθόδου και βασική οργανολογία της τεχνικής HPLC: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). 255

257 Χρωματογραφικός διαχωρισμός μπλε και κόκκινης ουσίας με HPLC: μόλις κάθε ουσία εξέρχεται από τη στήλη, διέρχεται από τον ανιχνευτή και το σήμα που μετράται από αυτόν καταγράφεται σε συνάρτηση με το χρόνο που μεσολάβησε από την ένεση του δείγματος. Η γραφική παράσταση που προκύπτει, το χρωματογράφημα, περιέχει για το συγκεκριμένο διαχωρισμό δύο κορυφές έκλουσης, καθεμία για κάθε εκλουόμενη ουσία: (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Φωτογραφία (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Σχήμα son-uk_c8_c18_phenyl.pdf (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015). 256

258 Αναφορές 1. ΣΟΥΛΙΟΥ, Ε., ΣΥΜΕΩΝΙΔΗΣ, Γ., ΜΟΥΣΛΕΧ, Τ., ΑΡΧΑΝΙΩΤΑΚΗ, Μ., ΔΙΖΑ, Ε., ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥ- ΛΟΥ, Β. (1998) Σύγκριση μεθόδων προσδιορισμού της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης, Ελληνικά Διαβητολογικά Χρονικά, 11, p BEWS, H. et al. (2014) Simultaneous quantification of simvastatin and simvastatin hydroxy acid in blood serum at physiological ph by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC/MS/MS). J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. p CLARKE, M. & HIGGINSA, N. (2000) Laboratory Investigation of Hemoglobinopathies and Thalassemias: Review and Update. Clin Chem, 46, p DELAMATER, Μ. (2006) Clinical Use of Hemoglobin A1c to Improve Diabetes Management, Clin Diabetes, 24, p GREILING, H. & RUEDIGER R. (1991) HPLC in clinical chemistry: Selected topics and clinical applications Microchim. Chim Acta, 104, p HEFTMANN, E. (2004) Chromatography, Part A: Fundamentals and Techniques, Part B: Applications. 6 th ed. Amsterdam: Elsevier. 7. INTERNATIONAL FEDERATION OF CLINICAL CHEMISTRY AND LABORATORY MEDICINE (IFCC) (2002) Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood. Clin Chem Lab Med, 40, p JOHN, G., BRACONNIER, F., MIEDEMA, K., AULESA, C., PIRAS, G. (1997) Evaluation of the Menarini-Arkray HA 8140 hemoglobin A1c analyzer. Clin Chem, 43, p KAZAKEVICH, V. & LOBRUTTO, R. (2007) HPLC for pharmaceutical scientists. New Jersey: John Wiley & Sons Inc. 10. MEIJS, L., DIJKHORST-OEI, T., VAN LOO, R., BOSMA, J., WEYKAMP, W., WIELDERS J. P.M. (2008) Does carbamylated hemoglobin still affect the analysis of HbA1c in uremic and hyperglycemic patients? Clin Chem Lab Med, 46, p NEUE, D. (1997) HPLC Columns Theory, Technology, and Practice. New York: Wiley-VCH. 12. POOLE, F. (2002) The Essence of Chromatography. Amsterdam: Elsevier. 13. SCHELLINGER, P. & CARR, W. (2006) Isocratic and gradient elution chromatography: A comparison in terms of speed, retention reproducibility and quantitation. J Chromatogr A, 1109, p SNYDER, R., KIRKLAND, J., GLAJCH, L. (1997) Practical HPLC Method Development, 2nd ed. New York: Wiley-Interscience. 15. SPANGENBERG, Β., POOLE, F., WEINS, C. (2011) Quantitative Thin-Layer Chromatography: A Practical Survey. New York: Springer. 16. WAJCMAN, H. (2003) Analysis of Hemoglobins and Globin Chains by High-Performance Liquid Chromatography. In: Methods in Molecular Medicine, vol. 82: Hemoglobin Disorders: Molecular Methods and Protocols. Totowa: Humana Press Inc (τελευταία προσπέλαση 1/1/2015) (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015) on-uk_c8_c18_phenyl.pdf (τελευταία προσπέλαση 1/4/2105) (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). 257

259 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο IVD ΠΡΟЇΟΝΤΑ-ΕΣΩΚΛΕΙΣΤΑ ΦΥΛΛΑΔΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΥΝ Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι απαιτήσεις της αγοράς και της διεθνούς Επιστημονικής κοινότητας για τα in vitro διαγνωστικά προϊόντα και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια Κλινικής Χημείας: ποιες πληροφορίες πρέπει να περιλαμβάνονται στα εσώκλειστα φυλλάδια τους που αφορούν στη σωστή φύλαξη και χρήση τους και ποιες πρέπει να είναι οι ιδιότητές τους. Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στα κλινικά και αναλυτικά χαρακτηριστικά τους που πρέπει να ελεγχθούν και να αναφερθούν από τους κατασκευαστές. Ανάμεσά τους και ο προσδιορισμός των τιμών αναφοράς που είναι και το χαρακτηριστικό που χρησιμοποιείται περισσότερο από τους κλινικούς ιατρούς ώστε να πάρουν τη ορθή απόφαση για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση του ασθενούς. Προαπαιτούμενες γνώσεις Στο παρόν κεφάλαιο θα διδαχθούν γνώσεις χρήσιμες για την καθημερινότητα του κλινικού εργαστηρίου. Δεν υπάρχουν προαπαιτούμενες γνώσεις από άλλα κεφάλαια. Γνώσεις από τη Στατιστική και τη Χημειομετρία θα ήταν χρήσιμες για την κατανόηση βασικών αρχών του κεφαλαίου. Μικρή εισαγωγή σε αυτό το κεφάλαιο γίνεται και στο δεύτερο μέρος του Κεφαλαίου 1 όπου γίνεται αναφορά στα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των αναλυτικών μεθόδων. 9.1 Εισαγωγή για τα IVDs Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται από τα Κλινικά εργαστήρια οφείλουν να πληρούν συγκεκριμένες προδιαγραφές πριν κυκλοφορήσουν στην αγορά, ενώ η χρήση και η παραγωγή τους πρέπει να τελεί κάτω από συνεχή παρακολούθηση από τις αρμόδιες αρχές (Regulatory authorities) και από τους αρμόδιους κοινοποιημένους οργανισμούς (Notified Bodies) αντίστοιχα. Είναι πολύ σημαντικό να υπάρχει αποτελεσματικός μηχανισμός επαγρύπνησης (vigilance), ώστε να προληφθούν η λανθασμένη χρήση τους αλλά και οι λανθασμένες ιατρικές επιλογές που μπορούν να οδηγήσουν σε σοβαρές επιπλοκές ή ακόμη και σε θάνατο του ασθενούς. Για την Ελλάδα ισχύει η Οδηγία 98/79/EC που αφορά στη διακίνηση και τον έλεγχο των in vitro διαγνωστικών ιατροτεχνολογικών προϊόντων (IVD, βλ. Κεφάλαιο 7) στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Directive, 1998). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν όλα τα προϊόντα που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια: τα εμπορικά διαθέσιμα διαγνωστικά kits των κατασκευαστών (manufacturers), αλλά και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για τις εσωτερικές μεθόδους του εργαστηρίου (in-house tests ή αλλιώς LTDs, laboratory-developed tests) μόνο για διαγνωστική χρήση (και όχι για ερευνητικούς σκοπούς). Ουσιαστικά στην κατηγορία αυτή ανήκουν όλα τα αντιδραστήρια ή τα αναλώσιμα ή ο εξοπλισμός τα οποία χρησιμοποιούνται για τη διενέργεια εργαστηριακών εξετάσεων που καλύπτονται οικονομικά μερικώς ή ολικώς από τα συστήματα υγείας ανά τον κόσμο (κρατικούς και ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς). Τα αντιδραστήρια τα οποία συμμορφώνονται με την οδηγία αυτή κυκλοφορούν στα κράτη-μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης με το χαρακτηριστικό σήμα CE (Conformité Europeéne) για IVD (Σχήμα 9.1). Η οδηγία αυτή οδήγησε σε αύξηση της ασφάλειας της χρήσης των συγκεκριμένων αντιδραστηρίων αλλά και της καινοτομίας για τα προϊόντα που είτε παράγονται είτε εισάγονται στην Ευρωπαϊκή Ένωση κατ αντιστοιχία με άλλες περιοχές του πλανήτη όπως π.χ. στις ΗΠΑ όπου ισχύουν οι οδηγίες του FDA (Food and Drug Administration). Ωστόσο, είναι γεγονός ότι από την υιοθέτηση της Οδηγίας 98/79/EC το 1998 έως τώρα, έχουν προκύψει καινούργια δεδομένα καθώς έχουν εισαχθεί πολλές νέες εργαστηριακές παράμετροι αλλά και υπάρχει αυξημένη 258

260 πίεση από ευρωπαϊκές ενώσεις ασθενών και Οργανισμούς Υγείας για βελτιωμένη ποιότητα και ασφάλεια όλων αυτών των αντιδραστηρίων Στην ισχύουσα οδηγία προβλέπονται απαιτήσεις επικύρωσης της χρήσης και αυξημένου στατιστικού ελέγχου της παραγωγής μόνο όσων αντιδραστηρίων χρησιμοποιούνταν για την ανάλυση παραμέτρων κυρίως της Λίστας Α (HIV1/2, HTLV, HBV, HCV, HDV, ABO, Rhesus) και κατά δεύτερο λόγο της Λίστας Β (TORCH panel, HLA A/B/DR, τρισωμία 21, φαινυλοκετονουρία, PSA, παρακλίνια ανίχνευση γλυκόζης). Πολλές επιστημονικές ενώσεις - ανάμεσά τους και η IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) και η EFLM (European Federation of Laboratory Medicine) - βοήθησαν μέσω συμμετοχών μελών τους σε ομάδες εργασίας, επιτροπές και διεθνή φόρα στο να ζητηθεί η αναθεώρηση της οδηγίας 98/79/EC και μάλιστα να αναβαθμισθεί πλέον σε Κανονισμό (Regulation), κάτι που θα έχει ως αποτέλεσμα την αυστηροποίηση του θεσμικού πλαισίου. Μετά από δημόσια διαβούλευση με τους ενδιαφερόμενους φορείς που διήρκεσε περίπου 2 χρόνια, η Ευρωπαϊκή επιτροπή (Commission) στις 26/09/2012 δημοσίευσε προτεινόμενο Κανονισμό και ξεκίνησαν οι διαδικασίες για την ψήφισή του. Στο Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο (Europarliament) ψηφίστηκε με σημαντικές τροποποιήσεις στις 24 Οκτωβρίου 2013 και έκτοτε γίνεται διαπραγμάτευση με το Ευρωπαϊκό συμβούλιο (council) που αντιπροσωπεύεται από τις εκάστοτε Προεδρίες ώστε τα 3 μέρη (trilogue) να καταλήξουν σε συμφωνία για το τελικό κείμενο. Έχουν ήδη συμφωνηθεί τα ακόλουθα: Ο προτεινόμενος κανονισμός θα στηρίζει την προτεινόμενη από την GHTF (Global Harmonization Task Force, πλέον το νέο όνομα της είναι International Medical Device Regulators Forum) ορθολογική κατάταξη των αντιδραστηρίων σε 4 κατηγορίες (από το A έως το D) με βάση 7 κανόνες (rules-based classification) που αξιολογούν τον ατομικό και δημόσιο κίνδυνο του νοσήματος που ελέγχει το υπό εξέταση αντιδραστήριο. Η κατάταξη αυτή θα αντιστοιχεί σε αυξανόμενες απαιτήσεις τόσο στον κατασκευαστή για τη διατήρηση συστημάτων ολικής διαχείρισης ποιότητας (total quality management system ή TQM) και για την υποβολή πλήρους φακέλου (Summary Technical Documentation ή STED) με τη σχετική τεκμηρίωση για την αναλυτική και κλινική επικύρωση των παραγόμενων αντιδραστηρίων όσο και στην εκάστοτε ελέγχουσα Αρχή για επιτόπιους ελέγχους της συμμόρφωσης του κατασκευαστή (Conformity assessment). Η αλυσίδα παραγωγής και διακίνησης θα μπορεί να ελέγχεται και με μη-προγραμματισμένες επιθεωρήσεις (unannounced audits). Το κάθε αντιδραστήριο θα φέρει μοναδιαίο αριθμό UDI (unique device identification) με το οποίο θα ταυτοποιείται τόσο το είδος του όσο και η παρτίδα παραγωγής. Η παρακολούθηση προβλημάτων που απορρέουν από τη χρήση των IVD αντιδραστηρίων (post-market surveillance), μέσω του αριθμού UDI θα καταχωρείται στην εξειδικευμένη βάση δεδομένων EudaMed. Επίσης αναφορικά με τα in-house tests που χρησιμοποιούνται για διαγνωστική χρήση κυριαρχεί η ά- ποψη ότι θα επιτρέπονται για όλες τις κατηγορίες αντιδραστηρίων, αρκεί να εκτελούνται από κλινικά εργαστήρια διαπιστευμένα σύμφωνα με το πρότυπο ISO15189 το οποίο απαιτεί πλήρη επικύρωση των in-house μεθόδων που χρησιμοποιούν (EN ISO 15189: 2012). Συμπερασματικά, η προτεινόμενη κατάταξη θα πολλαπλασιάσει σημαντικά τον αριθμό των εργαστηριακών παραμέτρων με αυξημένες απαιτήσεις και κατά συνέπεια και το τελικό κόστος σε κατασκευαστές και εργαστήρια. Στόχος βέβαια του νέου κανονισμού θα πρέπει να είναι ο συγκερασμός των απόψεων του κοινού για αυξημένη ασφάλεια αλλά και των κατασκευαστών, ώστε να συνεχίσουν να παράγουν και να προσφέρουν αντιδραστήρια στην Ευρωπαϊκή αγορά καθώς επίσης και να βελτιώνουν τα προϊόντα τους ή να αναζητούν λύσεις σε σπάνια νοσήματα (Favaloro et al., 2011). 259

261 Σχήμα 9.1 Χαρακτηριστικό σήμα για CE marking που πρέπει να υπάρχει στην ετικέτα και τα εσώκλειστα ενός IVD αντιδραστηρίου (πρέπει να έχει μέγεθος μικρότερο των 5 mm). 9.2 Γενικές προδιαγραφές των IVDs Τα ΙVD προϊόντα πρέπει να έχουν σχεδιασθεί και κατασκευασθεί με τέτοιο τρόπο ώστε, εφ όσον χρησιμοποιηθούν για την ενδεικνυόμενη χρήση και με τρόπο σύμφωνο με τις οδηγίες του κατασκευαστή, να μη θέτουν σε κίνδυνο ούτε τους ασθενείς αλλά ούτε και το εργαστηριακό προσωπικό που τα χειρίζεται. Εάν υπάρχουν κίνδυνοι για τους ανωτέρω χρήστες αυτοί πρέπει να ελαχιστοποιηθούν και οι χρήστες να ενημερωθούν για τυχόν υπολειπόμενο κίνδυνο ή άλλους περιορισμούς (limitations) στη χρήση τους. Η επίδοση τους δεν πρέπει να επηρεάζεται από τις συνθήκες μεταφοράς και αποθήκευσης (σύμφωνα πάντα με τις οδηγίες του κατασκευαστή). Πρέπει να είναι κατάλληλα προς κλινική χρήση, συνεπώς πρέπει να πληρούν τις προδιαγραφές που έχουν τεθεί για τη διαγνωστική ευαισθησία και τη διαγνωστική ειδικότητα. Πρέπει να επιτυγχάνουν τα αναλυτικά χαρακτηριστικά τα οποία έχει υπολογίσει και έχει αναφέρει ο κατασκευαστής στον φάκελο STED, ώστε να εκδώσει το πιστοποιητικό συμμόρφωσης και να πάρει το σήμα CE για IVD (Declaration of conformity). Τα χαρακτηριστικά αυτά πρέπει να αναφέρονται στα εσώκλειστα φυλλάδια των προϊόντων αυτών με τις οδηγίες χρήσης (θα αναφερθούν εκτενέστερα στις επόμενες Ενότητες ). Η ιχνηλασιμότητα τους (όπου υπάρχει μετρητική ιδιότητα) πρέπει να αναφέρεται σε πρότυπες μεθόδους ή υλικά αναφοράς υψηλής τάξης, όπου υπάρχουν (οι έννοιες αυτές θα αναφερθούν εκτενέστερα στο επόμενο Κεφάλαιο 10). Πιο ειδικά τα ΙVD προϊόντα πρέπει: Να είναι σχεδιασμένα ώστε να φέρουν κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες κατά την παραγωγή τους για να μη διαρρέουν και να μην επιμολύνουν τους μεταφορείς και το προσωπικό που τα αποθηκεύει και τα χειρίζεται. Όταν περιέχουν μικροοργανισμούς ή άλλα βιολογικά υλικά, να έχουν ελάχιστο κίνδυνο μετάδοσης λοίμωξης. Πρέπει να κατασκευάζονται με ελεγχόμενες περιβαλλοντικά συνθήκες σε καθαρές εγκαταστάσεις. Να χρησιμοποιούνται επικυρωμένες μέθοδοι για την αποστείρωση όσων ΙVD προϊόντων έχουν χαρακτηρισθεί ανάλογα και φέρουν την αντίστοιχη σήμανση. Πρέπει να είναι εργονομικά κατασκευασμένα και να μην επηρεάζεται η απόδοσή τους από εξωτερικούς παράγοντες όπως πίεση, ηλεκτρομαγνητικά πεδία, υγρασία και θερμοκρασία. Να είναι, κατά το δυνατόν, φιλικά προς το περιβάλλον κατά την ασφαλή απόρριψή τους. Όταν είναι κατασκευασμένα να εκπέμπουν ραδιενέργεια, η ποσότητα αυτής πρέπει να είναι ελεγχόμενη και οι χρήστες να είναι ενήμεροι για το είδος της και τους τρόπους προστασίας τους. Πρέπει τα ΙVD προϊόντα με ραδιενεργά υλικά να φέρουν εμφανώς την ειδική σήμανση. Να είναι ασφαλή, όταν συνδέονται με το ηλεκτρικό ρεύμα (για την αποφυγή ηλεκτροπληξιών) ή με το υ- δραυλικό δίκτυο ή με αέριο (όπου χρειάζεται). Ιδιαίτερη φροντίδα πρέπει να υπάρχει, ώστε να μην επηρεάζονται ηλεκτρομαγνητικά άλλες συσκευές στον ίδιο χώρο. Οι δονήσεις και ο θόρυβος που προκαλούν πρέπει να είναι ο ελάχιστος δυνατός. Εάν αποτελούνται από κινητά μέρη και υπάρχουν μηχανικοί κίνδυνοι κατά τη συναρμολόγηση ή την αποσυναρμολόγηση τους (πχ. κατά τη συντήρησή τους), οι κατάλληλες προφυλάξεις πρέπει να είναι γνωστές. 260

262 9.3 Ετικέτα και εσώκλειστα φυλλάδια των IVDs Κάθε ΙVD προϊόν πρέπει να συνοδεύεται από επαρκείς πληροφορίες εκ μέρους του κατασκευαστή η οποία να εμπεριέχεται στην ετικέτα και στα εσώκλειστα φυλλάδια με τις οδηγίες χρήσης. Η χρήση συμβόλων, σημάτων κινδύνου ή/και χρωματικής επισήμανσης είναι υποχρεωτική και γίνεται με βάση σχετικά εναρμονισμένα πρότυπα (harmonized standards). Η ετικέτα ενός ΙVD προϊόντος πρέπει να περιέχει τα ακόλουθα: όνομα και διεύθυνση του κατασκευαστή και, εάν πρόκειται για εισαγόμενο είδος στην Ευρωπαϊκή Ένωση, να περιλαμβάνει επιπλέον και το όνομα και τη διεύθυνση του εξουσιοδοτημένου αντιπροσώπου, ταυτοποίηση του είδους και του περιεχομένου, ένδειξη STERILE για αποστειρωμένο είδος ή αναφορά σε μικροβιολογικό φορτίο (όπου απαιτείται), αριθμό παρτίδας παραγωγής του αντιδραστηρίου (lot number) ή τον σειριακό αριθμό (serial number) του εξοπλισμού, ημερομηνία λήξεως ασφαλούς χρήσης του, συνθήκες χειρισμού και αποθήκευσής του, τυχόν προειδοποιητικά σύμβολα ή ενδείξεις χρήσης. Οι οδηγίες χρήσης στο εσώκλειστο φυλλάδιο ενός ΙVD προϊόντος πρέπει να περιλαμβάνουν τα κάτωθι: δεδομένα από την ετικέτα εκτός του αριθμού παρτίδας ή εξοπλισμού και της ημερομηνία λήξεως, ημερομηνία και αριθμό έκδοσης (version) της οδηγίας χρήσης, σκοπό χρήσης και περιορισμούς (όπου υπάρχουν), κατάλογο περιεχομένων με αναφορά σε συγκεντρώσεις ουσιών, (όπου χρειάζεται), συνθήκες αποθήκευσης και χρόνο σταθερότητας, όταν ανοιχθεί η συσκευασία, προφυλάξεις από μηχανικούς ή βιολογικούς ή ραδιενεργούς κινδύνους, τι άλλο είδος εξοπλισμού ή τι άλλα αντιδραστήρια απαιτούνται, είδος των δειγμάτων για τα οποία είναι κατάλληλο, αρχή της μεθόδου, τον τρόπο συναρμολόγησης ή ελέγχου του εξοπλισμού ή της ανασύστασης διαλυμάτων ή της αραίωσης των δειγμάτων ή της αποστείρωσης υλικών (όπου απαιτούνται), πρωτόκολλο εργασίας, τυχόν μαθηματική σχέση που απαιτείται για την εξαγωγή του αναλυτικού αποτελέσματος ή τυχόν λογισμικό το οποίο απαιτείται, εάν απαιτείται ειδική εκπαίδευση για το προσωπικό που θα το χειρισθεί, τρόπο και συχνότητα βαθμονόμησης, ιχναλησιμότητα της μεθόδου με πιστοποιημένο υλικό αναφοράς ή σύγκριση με μέθοδο αναφοράς (θα αναφερθεί στο Kεφάλαιο 10), αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου (θα αναφερθούν στην Ενότητα 9.4), οδηγία για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας, τιμές αναφοράς (θα αναφερθούν στην Ενότητα 9.5), τρόπο ασφαλούς απόρριψης των αποβλήτων ή και ανακύκλωσης, όπου είναι αυτό δυνατό, προφυλάξεις για τυχόν έκθεση σε εξωτερικούς παράγοντες, όπως πίεση, ηλεκτρομαγνητικά πεδία, υγρασία και θερμοκρασία, οδηγίες για το τι χρειάζεται να γίνει σε περίπτωση που η συσκευασία έχει πειραχθεί ή αλλοιωθεί, συχνότητα συντήρησης. Αυξημένες απαιτήσεις υπάρχουν για τα ΙVD προϊόντα αυτοεξέτασης (self-testing) καθώς αποτελούν μια ιδιαίτερη κατηγορία των παρακλίνιων (POCT βλ. Κεφάλαιο 7) προϊόντων: εκτελούνται από τον κοινό άνθρωπο στην οικία του και όχι από εκπαιδευμένο εργαστηριακό προσωπικό. Συνεπώς πρέπει να είναι σχεδιασμένα έτσι, ώστε η επίδοσή τους να μην εξαρτάται ιδιαίτερα από την τεχνική και το περιβάλλον του χρήστη. 261

263 Πρέπει να είναι επισημασμένα με ανάλογη ετικέτα και οι οδηγίες χρήσης να είναι απλές και ξεκάθαρες ώστε να αποφεύγονται λάθη στο χειρισμό και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Όπου είναι εφικτό, πρέπει να υπάρχουν τρόποι ελέγχου από το χρήστη, ώστε να εξασφαλιστεί ότι εκτελεί κατάλληλα τη διαδικασία ανάλυσης. Οι οδηγίες χρήσης πρέπει να ερμηνεύουν ένα αποτέλεσμα ως θετικό ή αρνητικό ή απροσδιόριστο και να υποδεικνύουν τη πιθανότητα ψευδώς αρνητικού ή θετικού αποτελέσματος. Πρέπει να είναι σαφές στον χρήστη ότι δεν μπορεί να λάβει ιατρικές αποφάσεις, εάν δεν επικοινωνήσει με τον θεράποντα ιατρό και ότι, εάν το προϊόν χρησιμοποιείται για παρακολούθηση θεραπείας, ότι δεν πρέπει να αλλάξει το θεραπευτικό του σχήμα, εάν δεν είναι κατάλληλα εκπαιδευμένος. 9.4 Αναλυτικά χαρακτηριστικά των ΙVD αντιδραστηρίων Τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των IVD προϊόντων που έχουν μετρητική ιδιότητα (measuring function) όπως π.χ. τα kit αντιδραστηρίων, λαμβάνονται από δεδομένα επικύρωσης (validation) η οποία εκτελείται από τους κατασκευαστές. Ελέγχονται δε, σύμφωνα με τις διεθνείς ισχύουσες προδιαγραφές. Είναι τα ακόλουθα τα οποία πρέπει και να αναφέρονται στα εσώκλειστα φυλλάδια (Λειμονή, 2006 Κουππάρης, 2008 EURACHEM/LGC, 1998 Μητρόπουλος, 2003 Thompson et al., 2002 Παναγιωτάκης, 2003): 1) Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά (methodology characteristics): - Αναλυτική ευαισθησία (analytical sensitivity): να μην συγχέεται με το όριο ανίχνευσης, είναι ουσιαστικά η κλίση της καμπύλης αναφοράς σήματος (signal) προς συγκέντρωση C (ds/dc) ή μάζα μετρούμενης ουσίας. - Αναλυτική ειδικότητα (analytical specificity): τα αντιδραστήρια ανιχνεύουν μόνο τη ζητούμενη παράμετρο και δεν έχουν διασταυρούμενη δραστικότητα (cross reactivity) με άλλες παρεμφερείς ή όχι ουσίες. Εάν υπάρχει παρεμβολή (interference) με ουσίες παρεμποδιστές, αυτή πρέπει να αναφέρεται. 2) Χαρακτηριστικά επίδοσης (performance characteristics): Πιστότητα (precision): μετράει τη διασπορά επαναλαμβανόμενων αποτελεσμάτων σε ένα δείγμα και α- ντανακλά το τυχαίο σφάλμα της μεθόδου (random error) όταν η μέθοδος εκτελείται κάτω από ρητά προκαθορισμένες συνθήκες. Μέτρα της μη-πιστότητας (imprecision) αποτελούν η τυπική απόκλιση SD (Standard Deviation) και η σχετική τυπική απόκλιση RSD (Relative Standard Deviation) ή αλλιώς, ο συντελεστής μεταβλητότητας CV (Coefficient of Variation) όπως αυτός ορίζεται στην Εξίσωση 9.1: CV = SD 100 Μέσος όρος μετρήσεων (Εξίσωση 9.1) Υποσύνολα αποτελούν: α) η επαναληπτικότητα r (repeatability) που εκτελείται σε βραχύ χρονικό διάστημα συνήθως εντός της ίδιας αναλυτικής σειράς (within-run) ή τουλάχιστον εντός της ίδιας ημέρας (within-day) και β) η ενδιάμεση αναπαραγωγιμότητα R (intermediate reproducibility) που εκτελείται μεταξύ διαφορετικών αναλυτικών σειρών ή ημερών (between-run, between days). Αναμένεται ότι SD R>SD r. Συστήνεται να εκτελείται σε βάθος χρόνου (έως 3-6 μήνες) εντός του ίδιου εργαστηρίου με διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίου και διαφορετικούς χρήστες. Για τη λήψη δεδομένων πιστότητας χρησιμοποιούνται 2 ή 3 επίπεδα συγκεντρώσεων της υπό εξέταση εργαστηριακής παραμέτρου (φυσιολογικό, άνω- ή κάτω του φυσιολογικού) σε συνθετικά δείγματα ελέγχου (synthetic controls) ή/και σε πραγματικά δείγματα ασθενών ή υγιών μαρτύρων. Με στατιστική ανάλυση ANOVA από τα δεδομένα σε διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεων μπορεί να ληφθεί μια μόνο τιμή πιστότητας, η συνδυασμένη πιστότητα (combined precision). Με την αναπαραγωγιμότητα σχετίζεται και το χαρακτηριστικό της αντοχής (ruggedness) της μεθόδου, όταν εκτελείται η μέτρηση με διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίου σε διαφορετικά αναλυτικά συστήματα ή/και εργαστήρια με διαφορετικούς χειριστές. Επίσης όταν λαμβάνονται δεδομένα πιστότητας με μικρές προσχεδιασμένες μεταβολές του πρωτοκόλλου εργασίας (π.χ. μεταβολή στις συνθήκες αποθήκευσης, ph, θερμοκρασίας, χρόνου επώασης κλπ.) τότε έχουμε εικόνα της ανθεκτικότητας (robustness) της μεθόδου. Ως προδιαγραφή αποδοχής της πιστότητας του αντιδραστηρίου, συνήθως χρησιμοποιείται, εάν υπάρχει, η βιολογική μεταβλητότητα (biological variation) η οποία εκφράζει την περιοδική και τυχαία διακύμανση γύρω από μια πραγματική τιμή in vivo. Τέτοια δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας μπορούν να ανευρεθούν 262

264 στη βιβλιογραφία (Ricos et al., 1999) ή στο διαδίκτυο (π.χ. στον διαδικτυακό τόπο Έτσι ορίζεται ότι η μέγιστη μη-πιστότητα πρέπει να είναι CV max 0,5 CV bw όπου bw είναι η ενδο-ατομική βιολογική μεταβλητότητα (inter-individual, b w) στο ίδιο άτομο με τη πάροδο του χρόνου. Όταν δεν υπάρχουν δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η εξίσωση Horwitz (Εξίσωση 9.2) όπου C είναι η συγκέντρωση της μετρούμενης ουσίας: CV 2 (1 0,5logC) (Εξίσωση 9.2) Ορθότητα (trueness): είναι η διαφορά του μέσου όρου των μετρήσεων από την αληθή τιμή λόγω συστηματικού σφάλματος της μεθόδου (systematic error) όταν αυτή εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες εργασίας. Μέτρα της μη-ορθότητας αποτελούν συνήθως η απόλυτη διαφορά ή αλλιώς μεροληψία (bias) ή η εκατοστιαία διαφορά (Β%). Ιδανικά λαμβάνεται με πιστοποιημένα υλικά αναφοράς ειδάλλως με κατάλληλα δείγματα εσωτερικού ελέγχου controls -είτε εμπορικώς διαθέσιμα είτε του ίδιου του kit αντιδραστηρίων- που διαθέτουν τιμή στόχο. Το z-score ορίζεται με βάση την Εξίσωση 9.3 ως: z = Αποτέλεσμα μεθόδου Τιμή στόχος control SDμετρήσεων (Εξίσωση 9.3) Επίσης εκτίμηση της ορθότητας λαμβάνεται και από την επίδοση της μεθόδου σε συμμετοχή σε ενδοεργαστηριακές συγκρίσεις (ring trials, interlaboratory comparisons) και σχήματα ικανότητας (proficiency testing) ή εξωτερικού ελέγχου ποιότητας (EQAs, external quality assessments). Στην περίπτωση αυτή, ορίζεται αντίστοιχα ο δείκτης SDI (standard deviation index), όπου στην εξίσωση 9.2 αντί της τιμής στόχου χρησιμοποιείται η τιμή consensus, που λαμβάνεται από στατιστική επεξεργασία του συνόλου των εργαστηρίων (μετά την αφαίρεση των ακραίων τιμών, outliers). Και οι δύο δείκτες υποδεικνύουν το ίδιο: την απόσταση σε τιμές τυπικής απόκλισης που φέρει το αποτέλεσμα της μεθόδου από την εκάστοτε ιδανική (ή αληθή) τιμή. Η μέθοδος που χρησιμοποιεί το IVD αντιδραστήριο είναι άριστη όταν οι δείκτες z ή SDI είναι < 1, ενώ είναι οριακή καλή, όταν είναι μεταξύ 2 και 3 και μη αποδεκτή, όταν υπερβαίνει το 3. Ένας άλλος τρόπος ελέγχου της ορθότητας είναι η ανάκτηση (recovery) όταν προστίθεται μικρή ποσότητα μετρούμενης ουσίας σε υψηλή συγκέντρωση σε ένα λευκό (τυφλό) ή θετικό δείγμα (spiking). Συνίσταται η ανάμειξη 9:1 ενός δείγματος χαμηλής συγκέντρωσης και ενός βαθμονομητή υψηλής συγκέντρωσης καθώς με τον τρόπο αυτό ελέγχεται και η ύπαρξη επίδρασης του υποστρώματος (αλλιώς, της μήτρας) του δείγματος (matrix effect). Η ανάκτηση είναι άριστη όταν είναι μεταξύ %, ενώ είναι πολύ καλή, όταν είναι μεταξύ %. Ως προδιαγραφή για την αποδοχή της ορθότητας του αντιδραστηρίου (εφ όσον υπάρχουν δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας) ορίζεται το μέγιστο bias (%) στην εξίσωση 9.4 όπου bg είναι η διατομική βιολογική μεταβλητότητα (intra-individual, b g) μεταξύ διαφόρων ατόμων: Max Bias (%) < 0,25 (CVbw) 2 + (CVbg) 2 (Εξίσωση 9.4) Ακρίβεια (accuracy): είναι το άθροισμα της ορθότητας και της πιστότητας της μεθόδου που θα ληφθεί από μία μόνο μέτρηση και ουσιαστικά δείχνει την αξιοπιστία της. Στο Σχήμα 9.2 δίνονται παραδείγματα: α) ορθής μεθόδου χωρίς όμως καλή πιστότητα β) μη ορθής μεθόδου χωρίς καλή πιστότητα γ) μη ορθής μεθόδου με καλή πιστότητα και τέλος δ) αξιόπιστης μεθόδου με καλή ακρίβεια: ορθή και με καλή πιστότητα. 263

265 Σχήμα 9.2 Παραδείγματα μεθόδων με διαφορετική ακρίβεια σε σχέση με την ορθότητα και την πιστότητα. Μέτρο της ανακρίβειας (inaccuracy) είναι το μέγιστο ολικό αναλυτικό σφάλμα που ισούται με το άθροισμα του συστηματικού και του τυχαίου σφάλματος. Στο Σχήμα 9.3 φαίνονται διαγραμματικά όλες οι τιμές που μπορεί να πάρει το σφάλμα σε μέτρηση παραμέτρου όπου το τυχαίο σφάλμα διαθέτει κανονική κατανομή κατά Gauss: τότε το μέγιστο τυχαίο σφάλμα για διάστημα εμπιστοσύνης 95% είναι δύο φορές η τυπική απόκλιση και εάν προσθέσουμε και το συστηματικό σφάλμα λαμβάνουμε το ολικό αναλυτικό σφάλμα (συμβαίνει όταν οι δύο συνιστώσες του σφάλματος δρουν προς την αντίθετη κατεύθυνση). Σχήμα 9.3 Ολικό σφάλμα σε μετρήσεις με κανονική κατανομή. 264

266 Έχει ορισθεί ως προδιαγραφή για την αποδοχή της ακρίβειας ότι το αποδεκτό ολικό σφάλμα TE a (Total allowable error) πρέπει να πληροί την Εξίσωση 9.5: ΤΕa < μέγιστο επιτρεπτό συστηματικό σφάλμα + 1,65 (μεγίστο επιτρεπτό τυχαίο σφάλμα) (Εξίσωση 9.5) Όριο ανίχνευσης (limit of detection ή LOD) Μπορεί να ορισθεί με στατιστικό τρόπο μετά από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ενός λευκού (τυφλού, blank) δείγματος και ενός πολύ αραιού δείγματος (ή control) με πείραμα επαναληπτικότητας. Στην αρχή υπολογίζεται το LOB (limit of blank) με μετρήσεις του λευκού (Εξίσωση 9.6): LOB = Μέσος όρος μετρήσεων (blank) + 1,645 SDblank (Εξίσωση 9.6) Κατόπιν στην Εξίσωση 9.7 υπολογίζεται το LOD με αντικατάσταση από την Εξίσωση 9.6 και λόγω του ότι SD blank SD αραιού προκύπτει: LOD = LOB + 1,645 SDαραιού Μέσος όρος μετρήσεων (blank) + 3,3 SDαραιού (Εξίσωση 9.7) Για ευκολία ορίζουμε LOD = 3,3 SD αραιού, καθώς ο μέσος όρος του λευκού δείγματος μπορεί να θεωρηθεί μηδέν. Εναλλακτικά, με εμπειρικό τρόπο και με μέτρηση πολύ αραιών δειγμάτων ορίζεται το LOD ως η συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου η οποία μπορεί να ανιχνευθεί στο ~95% των μετρήσεων (π.χ. 19 στις 20 προσπάθειες) ή ακόμη καλλίτερα, με στατιστική probit ανάλυση. Το όριο ανίχνευσης είναι ένα πολύ χρήσιμο αναλυτικό χαρακτηριστικό στη σύγκριση ικανότητας διαφορετικών μεθόδων και ιδιαίτερα σε αυτές τις παραμέτρους όπου υπάρχει μεγάλη κλινική σημασία. Απαιτείται η αναφορά του από τον κατασκευαστή και στις ποιοτικές ή ημιποσοτικές μεθόδους. Όριο ποσοτικοποίησης (limit of quantification ή LOQ ή Lower limit of quantification ή LLQ): Ορίζεται με στατιστικό τρόπο ως 3,3 LOD (συνεπώς με βάση τα ανωτέρω: LOQ = ~10 SD αραιού) Εναλλακτικά, ορίζεται ως η χαμηλότερη συγκέντρωση της παραμέτρου όπου η μέθοδος ακόμη διαθέτει ικανοποιητικό CV (π.χ. 20% στις ανοσοχημικές δοκιμασίες). Γραμμικότητα (linearity) μεθόδου και αναλυτικό εύρος μέτρησης (measuring range) Εκτελείται με τουλάχιστον 6 πρότυπα διαλύματα ή βαθμονομητές (calibrators) ή δείγματα σε σειριακή αραίωση πυκνού βαθμονομητή, εις τριπλούν (σε τουλάχιστον 5 καμπύλες αναφοράς). Αφού αποκλεισθούν οι ακραίες τιμές, γίνεται έλεγχος με γραμμική παλινδρόμηση (linear regression simple ή κατά Deming). Όταν r 2 0,99 το μοντέλο γραμμικότητας είναι καλό και γίνονται αποδεκτά όλα τα σημεία της καμπύλης αναφοράς και ορίζεται το αναλυτικό εύρος μέτρησης (measuring range ή αλλιώς, analytical measuring interval, AMR ή απλά measuring interval) ως: LOQ όριο γραμμικότητας (μέγιστος αποδεκτός βαθμονομητής). Διαφορετικά, γίνεται απόρριψη των σημείων μη-γραμμικότητας και μικραίνει το εύρος μέτρησης. Σημειώνεται ότι, όταν γίνεται αραίωση των δειγμάτων, προκύπτει και το αναφερόμενο εύρος (reportable range) το οποίο θα είναι πάντοτε ευρύτερο του AMR. Για τα τελευταία αυτά αναλυτικά χαρακτηριστικά συνήθως δεν υπάρχουν προδιαγραφές, όμως οι κατασκευαστές των IVD αντιδραστηρίων οφείλουν να τα μετρήσουν και να τα αναφέρουν. Επίσης αναφέρουν και τη σύγκριση της μεθόδου (method comparison) τους με πρότυπη μέθοδο αναφοράς ή με άλλη παλαιότερη διαθέσιμη και αποδεκτή διεθνώς μέθοδο. Όταν η νέα μέθοδος είναι ποσοτική με ευρύ πεδίο τιμών μετράται ένας μεγάλος αριθμός δειγμάτων (> 40, εις διπλούν) και με τις δύο μεθόδους και γίνεται συγκριτικό διάγραμμα και στατιστική ανάλυση με γραμμική παλινδρόμηση (κατά Deming ή Passing-Bablock) (Linnet, 1998 Passing 265

267 Bablok, 1984). Καταρχήν, ελέγχεται εάν υπάρχει αποδεκτό εύρος τιμών (r > 0,975). Η συμφωνία των μεθόδων ελέγχεται ως εξής: δεν υπάρχει αναλογική μεροληψία όταν η κλίση (slope) της παλινδρόμησης είναι μεταξύ 0,95-1,05 ενώ δεν υπάρχει σταθερή μεροληψία όταν εκτελώντας t-test της τεταγμένης του κάθετου άξονα (intercept) με το μηδέν υπολογίζεται ότι το p > 0,5. Εναλλακτικά, μπορεί να γίνει και διάγραμμα διαφοράς τιμών (Difference plot κατά Bland-Altman) μεταξύ των δύο μεθόδων (Bland Altman, 1986). Όταν η νέα μέθοδος είναι ποσοτική με μικρό εύρος τιμών, μπορεί και να γίνει απλά ένα t-test κατά ζεύγη (paired). Όταν η νέα μέθοδος είναι ποιοτική, τότε μπορεί να υπολογιστεί το ποσοστό συμφωνίας θετικών/αρνητικών (% Concordance) και να υπολογισθεί ο συντελεστής kappa (> 0,8 όταν υπάρχει μεγάλη συμφωνία) ή να γίνει Mc Nemar s στατιστικό τεστ. 9.5 Προσδιορισμός τιμών αναφοράς Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων των κλινικών εργαστηρίων υποβοηθείται σημαντικά από την ύπαρξη τιμών αναφοράς (reference values) ανά παράμετρο. Τα όρια των τιμών αναφοράς (reference limits) είναι συνήθως δύο και το διάστημα μεταξύ τους καλείται διάστημα ή εύρος τιμών αναφοράς (reference interval ή range). Σε ορισμένες παραμέτρους δεν υπάρχουν τιμές αναφοράς αλλά όρια αποφάσεων (decision limits) για τη λήψη θεραπείας (π.χ. στη χοληστερόλη, στη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη κ.λπ.). Δεν πρέπει να παραβλεφθεί το γεγονός ότι η παρακολούθηση σημαντικών μεταβολών μιας παραμέτρου ακόμη και εντός του διαστήματος αναφοράς μπορεί να υποδηλώνει αρχή νοσήματος (συνεπώς παλαιότερα καλούνταν λανθασμένα φυσιολογικές τιμές). Προκύπτουν από στατιστική επεξεργασία των μετρήσεων της παραμέτρου σε «φαινομενικά υγιή» πληθυσμό αναφοράς (reference population) ο οποίος είναι κατάλληλα επιλεγμένος (Dybkaer, 1982). Ο προσδιορισμός τους ακολουθεί τα παρακάτω βήματα: 1. Απαριθμούνται όλοι οι παράγοντες βιολογικής και αναλυτικής μεταβλητότητας για την υπό μέτρηση παράμετρο με βάση τη βιβλιογραφία. 2. Με βάση την ανωτέρω λίστα καθορίζονται κριτήρια αποκλεισμού (exclusion criteria) και κριτήρια διαχωρισμού του πληθυσμού αναφοράς (partition criteria). Στα πρώτα μπορεί να ανήκουν π.χ. μια οξεία ή χρόνια παθολογική κατάσταση, η χρόνια λήψη φαρμάκων, η παχυσαρκία, η εγκυμοσύνη, το κάπνισμα, η μακροχρόνια κατανάλωση αλκοόλ ή ναρκωτικών, η εντατική άσκηση κλπ. Τα δεύτερα είναι συνήθως το φύλο, η ηλικία, η φυλή κ.λπ. καθώς αυτά αποτελούν συνήθως παράγοντα για διαφορετικά όρια τιμών αναφοράς ή ακόμη και για αποκλεισμό των συγκεκριμένων ατόμων. 3. Έγγραφη συγκατάθεση των συμμετεχόντων στον προσδιορισμό των τιμών αναφοράς και συμπλήρωση κατάλληλου ερωτηματολογίου. 4. Με βάση τα κριτήρια αποκλεισμού και τις απαντήσεις στο ερωτηματολόγιο, αποκλεισμός ορισμένων συμμετεχόντων και προετοιμασία των υπολοίπων για τη σωστή δειγματοληψία. 5. Λήψη των δειγμάτων και απαρέγκλιτη τήρηση των κατάλληλων προαναλυτικών συνθηκών για τη συλλογή, το χειρισμό, τη μεταφορά και την αποθήκευσή τους. 6. Ανάλυση των δειγμάτων και έλεγχος του ιστογράμματος των αποτελεσμάτων ώστε να απαλειφθούν τυχόν ακραίες τιμές. 7. Στατιστική ανάλυση είτε α) με παραμετρικό τρόπο όταν η κατανομή των μετρούμενων τιμών ακολουθεί την κανονική κατανομή (ή την ακολουθεί μετά από κατάλληλο μετασχηματισμό) και χρήση του μέσου όρου και της τυπικής απόκλισης για την εύρεση του εύρους των τιμών αναφοράς με κάλυψη του 95% του πληθυσμού, είτε β) με μη-παραμετρικό τρόπο. Στη δεύτερη περίπτωση απαιτούνται τουλάχιστον 120 δείγματα (όμως σε μερικές περιπτώσεις όπως π.χ. σε παιδιατρικό πληθυσμό ή σε ιδιαίτερα ακριβές εξετάσεις ή σε ιδιαίτερα δύσκολες ως προς τη δειγματοληψία εξετάσεις, ο αριθμός αυτός δεν είναι δυνατόν να συμπληρωθεί, οπότε συνίσταται να είναι τουλάχιστον 40). Με αυτόν τον τρόπο ευρίσκεται η διάμεσος τιμή και ορίζεται το διάστημα τιμών αναφοράς ως το διάστημα μεταξύ 2,5 ου και 97,5 ου εκατοστημορίου. Για ορισμένες παραμέτρους όπως π.χ. τους καρκινικούς ή τους καρδιακούς δείκτες το διάστημα αυτό μπορεί να διευρυνθεί π.χ. μεταξύ 1 ου και 99 ου εκατοστημορίου. Το διάστημα εμπιστοσύνης (confidence interval) για κάθε όριο αναφοράς δεν πρέπει να ξεπερνάει το 1/5 του διαστήματος των τιμών αναφοράς. Η μεταφορά τιμών αναφοράς για την ίδια παράμετρο από μια αναλυτική μέθοδο σε μια άλλη ή σε άλλο αναλυτικό σύστημα στο εργαστήριο μπορεί να γίνει με ένα από τους ακόλουθους δύο τρόπους: 266

268 Α) Ουσιαστικά με σύγκριση μεθόδων ή αναλυτικών συστημάτων με μετρήσεις ίδιων δειγμάτων (όχι απαραίτητα δειγμάτων από πληθυσμό αναφοράς) και με τον τρόπο που προαναφέρθηκε στο 9.4: επισκοπείται η γραμμική παλινδρόμηση και εάν η κλίση είναι κοντά στο 1 και εντός προκαθορισμένων ορίων, τότε μπορεί να εκληφθεί ως συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει συστηματική διαφορά. Συνεπώς μπορεί να γίνει η μεταφορά των τιμών αναφοράς. Β) με σύγκριση των πληθυσμών αναφοράς είτε με βιβλιογραφικά και γεωγραφικά, εθνολογικά κλπ. κριτήρια είτε με επαλήθευση των τιμών αναφοράς ως εξής: γίνεται επιλογή 20 δειγμάτων πληθυσμού αναφοράς με ίδια κριτήρια αποκλεισμού και διαχωρισμού και, εάν μετά την απαλοιφή ακραίων τιμών 2 τιμές μετρήσεων εντοπίζονται εκτός του διαστήματος αναφοράς, τότε η μεταφορά των τιμών αναφοράς γίνεται αποδεκτή. Εάν είναι 3 ή 4 τα δείγματα εκτός του διαστήματος αναφοράς, τότε επαναλαμβάνεται η διαδικασία για άλλα 20 δείγματα. Εάν είναι πάνω από 4, τότε πρέπει να ξεκινήσει από την αρχή η πλήρης διαδικασία προσδιορισμού των τιμών αναφοράς. 267

269 Αναφορές 1. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (2008) Σημειώσεις Χημειομετρίας. Αθήνα: Πανεπιστήμιο Αθηνών. 2. ΛΕΪΜΟΝΗ, Ε. (2006; pp ) Επαλήθευση Αναλυτικών Μεθόδων Κλινικών Εργαστηρίων. In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 3. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, Σ. (2003; pp.86-98) Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων. In: Αναλυτική Αξιολόγηση Εργαστηριακών Μετρήσεων 1 ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο, Ed. Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 4. ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΚΗΣ, Ο. (2003; pp.52-85) Αναλυτικά σφάλματα και υπολογισμός τους. In: Αναλυτική Αξιολόγηση Εργαστηριακών Μετρήσεων. 1 ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο. Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 5. FAVALORO, E., PLEBANI, M., LIPPI, G. (2011) Regulation of in vitro diagnostics (IVDs) for use in clinical diagnostic laboratories: towards the light or dark in clinical laboratory testing? Clin Chem Lab Med, 49, p RICOS, C., ALVAREZ, V., CAVA F. et al. (1999) Current databases on biological variation: pros, cons and progress. Scand J Clin Lab Invest, 59, p THOMPSON, M., ELLISON, SL., WOOD, R. (2002) Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl Chem, 74, p Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. Official Journal of the European Communities 1998; L331: EN ISO 15189: 2012 Medical laboratories Requirements for quality and competence. 3rd ed. 10.EURACHEM/LGC. (1998) The fitness for purpose of analytical methods. 11.PASSING, H., BABLOK, W. (1984) Comparison of several regression procedures for method comparison studies and determination of sample sizes. Application of linear regression procedures for method comparison studies in Clinical Chemistry, Part II. J.Clin Chem Clin Biochem., 22, p LINNET, K. (1998) Performance of Deming regression analysis in case of misspecified analytical error ratio in method comparison studies. Clin Chem, 44, p BLAND, J.M., ALTMAN, D.G. (1986) Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet, 1, p DYBKAER, R. (1982) International federation of clinical chemistry (IFCC) the theory of reference values. Part 6. Presentation of observed values related to reference values. J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 20, p

270 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ο ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ - ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ ΔΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφεί η χρήση των υλικών αναφοράς, από τους κατασκευαστές και τα εργαστήρια, ώστε να εξασφαλισθούν η τυποποίηση και η ιχνηλασιμότητα των μεθόδων και των αντιδραστηρίων που παράγουν ή χρησιμοποιούν αντίστοιχα. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν υλικά αναφοράς για όλες τις παραμέτρους της εργαστηριακής ιατρικής, σε ορισμένες δε μόνο, υπάρχει διαθεσιμότητα για την ανώτερη τάξη αυτών των υλικών, τα ονομαζόμενα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς. Πρόκειται για υλικά τα οποία είναι παγκοσμίως αναγνωρισμένα, διαθέτουν πιστοποιητικό και τιμή αβεβαιότητας. Θα εξηγηθεί η έννοια της αβεβαιότητας και θα δοθεί σχετικό παράδειγμα προσδιορισμού της σε ποσοτική μέτρηση παραμέτρου κλινικής χημείας. Η ιχνηλασιμότητα με υλικά αναφοράς, η διακρίβωση του εξοπλισμού και η εκτίμηση της αβεβαιότητας είναι ιδιαίτερα σημαντικές απαιτήσεις για την εκπλήρωση των προαπαιτούμενων και για τη διαπίστευση των κλινικών εργαστηρίων κατά ISO Όλα τα κλινικά εργαστήρια πρέπει να προσπαθήσουν προς αυτή την κατεύθυνση καθώς η διαπίστευση αποτελεί την ισχυρότερη απόδειξη ότι ένα εργαστήριο διαθέτει ποιότητα και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα. Προαπαιτούμενες γνώσεις Στο παρόν κεφάλαιο θα διδαχθούν γνώσεις χρήσιμες για την καθημερινότητα στο κλινικό εργαστήριο. Υπάρχουν προαπαιτούμενες γνώσεις από τα Kεφάλαια 1 και 9. Οι γνώσεις από τη Στατιστική και τη Χημειομετρία θα ήταν επίσης χρήσιμες για την κατανόηση βασικών αρχών του κεφαλαίου Υλικά αναφοράς Ιχνηλασιμότητα Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια οφείλουν να διαθέτουν ιχνηλασιμότητα (traceability), όπου βέβαια αυτό είναι δυνατόν: η ιχνηλασιμότητα ορίζεται ως η ιδιότητα του αποτελέσματος μιας μέτρησης ή της τιμής ενός βαθμονομητή (calibrator) να συσχετισθεί με γνωστά υλικά αναφοράς (reference materials), συνήθως εθνικά ή διεθνή πρότυπα, μέσω μιας άρρηκτης αλυσίδας συγκρίσεων που έ- χουν όλα γνωστές αβεβαιότητες (EURACHEM/CITAC, 2003; Ευαγγελόπουλος et al., 2006; Λειμονή, 2008). Θα πρέπει να γίνει η διευκρίνιση ότι ο όρος ιχνηλασιμότητα ενίοτε χρησιμοποιείται και για τη δυνατότητα που υπάρχει στο εργαστήριο, όταν μέσω του συστήματος ποιότητας μπορεί να ανευρεθεί ανά πάσα στιγμή το ποιος, που, πότε, έκανε κάτι κατά την προ-αναλυτική, αναλυτική και μετα-αναλυτική φάση μιας κλινικής δοκιμής (sample, document, instrument, material traceability). Επίσης, αναφορικά με την έννοια της αβεβαιότητας (uncertainty) απαιτείται να αναφερθεί ήδη από αυτή την Ενότητα, ότι συνδέεται με το αποτέλεσμα μιας μέτρησης και είναι η διασπορά των τιμών, που λογικά μπορούν να αποδοθούν στη προσδιοριζόμενη παράμετρο (JCGM 100:2008, 2008 Λυκόκα et al., 2006). Ιδανικά για κάθε μια μετρήσιμη εργαστηριακή παράμετρο (measurand), αφού ορισθεί το συστατικό που μας ενδιαφέρει (component) και το είδος της ποσότητας (kind of quantity π.χ. συγκέντρωση, ενεργότητα, αριθμός σωματιδίων κ.λπ.) που πρέπει να μετρηθεί σε ένα ορισμένο υπόστρωμα (π.χ. ορός), καθώς και η μονάδα μέτρησης, απαιτούνται πρότυπη μέθοδος μέτρησης, που θα μπορεί να εφαρμόζεται σε εξειδικευμένα εργαστήρια αναφοράς, και πρότυπο υλικό αναφοράς. Ωστόσο είναι λίγες οι παράμετροι που διαθέτουν πλήρες σύστημα αναφοράς: και πρότυπη μέθοδο και πρότυπο υλικό (περίπου 65) (Panteghini, 2009). Τα υλικά αναφοράς ανήκουν στη μεγάλη οικογένεια των υλικών ελέγχου ποιότητας (quality control materials ή QCM) μαζί με τους βαθμονομητές και τα controls: είναι υλικά που ελέγχονται για την ομοιογένεια και σταθερότητα τους (π.χ. ακόμη και μετά από 6 μήνες σε συνθήκες επιταχυνόμενης αποικοδόμησης στους 45 C ή/και 65 C, και ενίοτε με ανοιχτά σωληνάρια) (Emons et al., 2006 Emons, 2006). 269

271 Σχήμα 10.1 Οικογένεια υλικών ελέγχου ποιότητας (με μπλε χρώμα οι βαθμονομητές και οι ιδιότητες τους και με κόκκινο χρώμα τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και οι ιδιότητες τους) από (Emons et al., 2006 Emons, 2006). Τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς (certified reference materials ή CRMs ή αλλιώς standard reference materials ή SRMs) είναι τα ανώτερα ιεραρχικά υλικά αναφοράς και διαθέτουν πιστοποιητικό, το οποίο αναφέρει τη ταυτότητα (με βάση τη δομή ή τη λειτουργία) και την ποσότητα του μετρούμενου συστατικού μαζί με δηλωμένη αβεβαιότητα, την ιχνηλασιμότητα του στο διεθνές SI σύστημα ή σε άλλη πρότυπη μέθοδο και τις οδηγίες ανασύστασης, εάν π.χ. είναι λυοφιλοποιημένο στερεό ή τις οδηγίες αποθήκευσης, εάν είναι υγρό. Επίσης, αναφέρει την καθαρότητά του ή το ποσοστό υγρασίας, (εάν υπάρχει) και τις αντίστοιχες μεθόδους ελέγχου, αλλά και όταν δεν είναι καθαρή ουσία, σε τι υπόστρωμα εντοπίζεται (καθαρό διαλύτη ή ανθρώπινο ορό ή οτιδήποτε άλλο) (Dybkaer, 1991 European co-operation for Accreditation, 2003a Μητρόπουλος, 2003). Τα υλικά αυτά παρασκευάζονται από διεθνείς οργανισμούς ή συμπράξεις επιστημονικών ενώσεων ή εμπορικές εταιρείες όπως οι JRC-IRMM, NIST, WHO, NIBSC, CDC, ATCC/Coriell, NGRL, LGC, Acrometrix, Advanced Biotechnologies, MMQCI κ.λπ. Στο τέλος του κεφαλαίου υπάρχουν παραπομπές για εύρεση υλικών αναφοράς μέσω διαδικτύου. Τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς είναι κατάλληλα για την επικύρωση της ορθότητας μιας μεθόδου, τη βαθμονόμηση, τον έλεγχο γραμμικότητας, την εύρεση του ορίου ανίχνευσης (κεφάλαιο 9) και ενίοτε, όταν το υπόστρωμα προσομοιάζει το αντίστοιχο του δείγματος των ασθενών και για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας. Όταν πιστοποιημένα υλικά αναφοράς δεν είναι διαθέσιμα για τη μέθοδο που το εργαστήριο επιθυμεί να επικυρώσει ή επαληθεύσει, τότε μπορεί να χρησιμοποιήσει υλικά από εργαστήρια αναφοράς ή από διεργαστηριακά σχήματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Εάν και τέτοια υλικά δεν υπάρχουν, τότε μόνο το εργαστήριο θα στραφεί στα εμπορικά διαθέσιμα control (π.χ. από τον κατασκευαστή ή καλύτερα, εάν υπάρχουν, από άλλη εταιρεία που παρασκευάζει controls και είναι ανεξάρτητη από τον κατασκευαστή του αντιδραστηρίου). Για να γίνουν περισσότερο αντιληπτά τα ανωτέρω, παρατίθεται ως παράδειγμα στο Σχήμα 10.2 το πλήρες σύστημα αναφοράς για την ποσοτική παράμετρο της γλυκόζης με δύο πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και δύο μεθόδους αναφοράς (primary, secondary) και το οποίο είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στους κατασκευαστές σχετικών αντιδραστηρίων αλλά και στα εργαστήρια για την ιχνηλασιμότητα της μεθόδου που παράγουν ή χρησιμοποιούν. 270

272 Σχήμα 10.2 Σύστημα αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γλυκόζης με δύο πρότυπες μεθόδους αναφοράς (σταθμική ανάλυση και φασματοσκοπία μάζας με τεχνική αραίωσης ισοτόπου ID-MS), που εκτελούνται από εργαστήρια αναφοράς και δύο πιστοποιημένα υλικά αναφοράς: ένα πρωτοταγές (primary), το οποίο αποτελείται από καθαρή κρυσταλλική γλυκόζη και ένα δευτεροταγές (secondary) που χρησιμοποιεί υπόστρωμα ίδιο με τα δείγματα των ασθενών. Αφού υπάρχει ιχνηλασιμότητα με πρότυπο υλικό ή/και πρότυπη μέθοδο, στη συνέχεια αναλαμβάνει ο κάθε κατασκευαστής να παρασκευάσει τους δικούς του βαθμονομητές: αρχικά τον master βαθμονομητή εργασίας για τη βαθμονόμηση της εσωτερικής μεθόδου που έχει επιλέξει (μπορεί να διαθέτει περισσότερες από μία) και στη συνέχεια το βαθμονομητή του προϊόντος (product) του αντιδραστηρίου που διαθέτει στα εργαστήρια («πελάτες») για συγκεκριμένη μέθοδο και για συγκεκριμένο αναλυτή που διαθέτουν. Όπως παρατηρούμε στο Σχήμα 10.3, η ιχνηλασιμότητα της μεθόδου είναι μέγιστη στα αρχικά στάδια, ενώ η αβεβαιότητα της μέτρησης είναι αντιστρόφως ανάλογη και μεγαλύτερη στα τελικά στάδια όταν παραλαμβάνεται και το τελικό αποτέλεσμα από τον ασθενή από το εργαστήριο ρουτίνας. 271

273 Σχήμα 10.3 Αλυσίδα της ιχνηλασιμότητας μιας μεθόδου από το εργαστήριο αναφοράς στον κατασκευστή και κατόπιν στον «καταναλωτή» που είναι το εργαστήριο ρουτίνας (Berding et al., 2010). Η παρασκευή του master βαθμονομητή είναι πολύ κρίσιμη για τη διαχρονική ακρίβεια της μεθόδου που προσφέρει ο κατασκευαστής, καθώς ο κατασκευαστής οφείλει να ελέγχει σε τακτά χρονικά διαστήματα την ιχνηλασιμότητα. Μόνο με αυτόν τον τρόπο, δηλαδή με συνεχείς βαθμονομήσεις, αποδόσεις τιμών και ε- σωτερικό έλεγχο ποιότητας, όπως φαίνεται στη στρατηγική που ακολουθείται στο Σχήμα 10.4Α, διασφαλίζεται η τυποποίηση (standardization) της μεθόδου (Berding et al., 2010 Panteghini, 2009). Ο master βαθμονομητής μπορεί να είναι είτε ένα πιστοποιημένο (εάν υπάρχει) υλικό αναφοράς και οι αραιώσεις του, είτε ένα σετ δειγμάτων ασθενών τα οποία έχουν μετρηθεί με πρότυπη μέθοδο και διαθέτουν ένα ευρύ εύρος τιμών. Συνεπώς αυτά τα δείγματα χρησιμοποιεί ο κατασκευαστής για τη βαθμονόμηση της επιλεγμένης μεθόδου του (Σχήμα 10.4Β). Ο master βαθμονομητής διαμοιράζεται σε ισομερίδια (aliquots) σε βαθιά κατάψυξη για όσο χρονικό διάστημα θεωρείται ότι είναι σταθερός. Παράλληλα φυλάσσονται με ανάλογο τρόπο άλλα δείγματα ασθενών που χρησιμοποιούνται για τη σύγκριση μεταξύ της επιλεγμένης μεθόδου του κατασκευαστή και της πρότυπης μεθόδου. Για την ισοδυναμία των μεθόδων πρέπει να ισχύουν τα προαναφερθέντα στην Ενότητα 9.4, δηλαδή η κλίση του διαγράμματος σύγκρισης να μην διαφέρει στατιστικά από το 1 και η τεταγμένη στον κάθετο άξονα από το 0 (Σχήμα 10.4C). 272

274 Α Β C Σχήμα 10.4 Τυποποίηση της μεθόδου ενός κατασκευαστού (έχει αφαιρεθεί το όνομά του για ευνόητους λόγους) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της τεστοστερόνης: Α) διαδοχική σειρά τεσσάρων βαθμονομήσεων (Cal 0-Cal 3) και πέντε αποδόσεων τιμών (value assignments I-V) με χρήση δύο προτύπων μεθόδων της σταθμικής ανάλυσης και του ID-MS σε ζυγισμένη καθαρή ουσία (δεν υπάρχει πιστοποιημένο υλικό αναφοράς), Β) βαθμονόμηση Cal 1 με τη βοήθεια δειγμάτων μετρημένων με ID-MS και C) σύγκριση της επιλεγμένης από τον κατασκευαστή και της ID-MS μεθόδου με άλλα δείγματα ασθενών τα οποία χρησιμοποιούνται ως εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (QC R1) (Berding, et al., 2010). 273

275 Πρέπει να τονισθεί ότι, όταν χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση μιας μεθόδου, τα υλικά αναφοράς ή οι βαθμονομητές πρέπει να συμπεριφέρονται εναλλάξιμα (commutable) με τα κλινικά δείγματα δηλαδή να συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο (να συνδέονται με το σήμα της μεθόδου με την ίδια μαθηματική σχέση) (Miller et al., 2011). Η έννοια αυτή μπορεί να γίνει καλύτερα αντιληπτή εάν παρατηρήσουμε προσεκτικά στο διάγραμμα σύγκρισης της μεθόδου του κατασκευστού με μια άλλη (κατά προτίμηση πρότυπη) μέθοδο που εντοπίζονται οι τιμές των συγκεκριμένων υλικών (Σχήμα 10.5). Σχήμα 10.5 Στο αριστερό σχήμα, τα υλικά αναφοράς ή οι βαθμονομητές συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο όπως τα κλινικά δείγματα γι αυτό και συνεντοπίζονται στη γραμμή παλινδρόμησης της σύγκρισης δύο μεθόδων ενώ το ίδιο δεν συμβαίνει στο δεξιό σχήμα: εδώ υπάρχει πρόβλημα εναλλαξιμότητας (commutability) (Miller et al., 2011). Σε παραμέτρους όπου δεν υπάρχουν ούτε πιστοποιημένα υλικά αναφοράς ούτε πρότυπες μέθοδοι υ- πάρχει πραγματικά διεθνές πρόβλημα, καθώς ο κάθε κατασκευαστής παράγει τους δικούς του βαθμονομητές χωρίς να υπάρχει ιχνηλασιμότητα, με συνέπεια να μην μπορεί να υπάρξει αξιόπιστη φορητότητα των αποτελεσμάτων των ασθενών. Απαιτείται ιδιαίτερη προσπάθεια από τις επιστημονικές εταιρείες για τη δημιουργία κατάλληλων υλικών αναφοράς, ώστε να υπάρχει τουλάχιστον διεθνώς μια εναρμόνιση των μεθόδων (harmonization) Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων Το ακρωνύμιο της παγκόσμιας οργάνωσης-δικτύου για την τυποποίηση (International Organization for Standardization) είναι για όλες τις γλώσσες το ίδιο και είναι το ISO, το οποίο προήλθε από την ελληνική λέξη «ίσος». Είναι δε ενδεικτικό του στόχου αυτού του παγκόσμιου φορέα, ο οποίος ιδρύθηκε το 1946 και έχει ως μέλη εθνικούς οργανισμούς τυποποίησης, να εκδίδει - μέσω τεχνικών επιτροπών - πρότυπα για την εναρμόνιση των προϊόντων και υπηρεσιών σε διάφορους τομείς της οικονομίας σε όλα τα κράτη-μέλη. Την Ελλάδα αντιπροσωπεύει σε αυτόν τον οργανισμό ο Ελληνικός Οργανισμός Τυποποίησης (ΕΛ.Ο.Τ.). Η εφαρμογή προτύπων και στα κλινικά εργαστήρια προέκυψε από την ανάγκη για τεκμηρίωση και αμοιβαία αναγνώριση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων, που διακινούνται και παρέχονται παγκοσμίως. Αυτό οδηγεί σε μια ελεύθερη διακίνηση των υπηρεσιών των κλινικών εργαστηρίων διεθνώς, ισοδυναμία ελέγχων σε όλα τα κράτη-μέλη, εναρμόνιση μέσω ομοιόμορφης εφαρμογής οδηγιών, αποδοχή της αξιοπιστίας αποτελεσμάτων και δημόσιων πιστοποιητικών από όλα τα κράτη και υγιή ανταγωνισμό, ο οποίος αποβαίνει τελικά προς όφελος του «πελάτη-ασθενή» (Μπακέας, 2006). Στη σύγχρονη ιατρική πρακτική, ο ρόλος του κλινικού εργαστηρίου γίνεται ολοένα και πιο σημαντικός για τη διάγνωση, πρόγνωση, παρακολούθηση και θεραπευτική αγωγή των ασθενών. Η απαίτηση συνεπώς για εργαστηριακά αποτελέσματα ακριβή και αξιόπιστα είναι προφανής και αναγκαία (Βογιατζάκης, 2007). 274

276 Ένα κλινικό εργαστήριο πέραν της φήμης του, που ασφαλώς δεν αποτελεί μετρήσιμη και αντικειμενική ιδιότητα, μπορεί να επιδείξει κάποια από τα ακόλουθα επίσημα έγγραφα σε ιατρούς ή ασθενείς, τα οποία θα αποδεικνύουν την αξία του: Αδειοδότηση (licensing): επίσημη άδεια λειτουργίας από το κράτος σε ένα εργαστήριο ότι με βάση τη νομοθεσία μπορεί να διεξάγει εργαστηριακές μετρήσεις. Πιστοποίηση (certification): γραπτή βεβαίωση από διαπιστευμένο φορέα πιστοποίησης ότι το εργαστήριο «συμμορφώνεται» σε ένα Πρότυπο ή σε μια Οδηγία με την εφαρμογή συστήματος διαχείρισης ποιότητας. Διαπίστευση (accreditation): επίσημη αναγνώριση από τον αρμόδιο Εθνικό φορέα ότι ένα εργαστήριο είναι «τεχνικά επαρκές» να διεξάγει συγκεκριμένες δοκιμασίες. Μερικά από τα ανωτέρω έγγραφα είναι υποχρεωτικά ανάλογα με τη νομοθεσία κάθε κράτους, ενώ άλλα αναμένεται να γίνουν με τη πάροδο του χρόνου, π.χ. στην Ευρώπη είναι υποχρεωτική η διαπίστευση στη Γαλλία και στη Ρουμανία σε όλα τα κλινικά εργαστήρια, στο Βέλγιο και στη Γερμανία μόνο σε εκείνα που παρέχουν γενετικά αποτελέσματα ή/και νεογνικό έλεγχο. Σε άλλα κράτη η κάλυψη ή η αποζημίωση από δημόσιους ή ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς για εκτέλεση παραπεμπτικών με εργαστηριακές εξετάσεις, γίνεται μόνο όταν αυτές διενεργούνται από διαπιστευμένα εργαστήρια. Φορείς πιστοποίησης μπορεί να υπάρχουν πολλοί, ωστόσο μόνο ένας αρμόδιος φορέας διαπίστευσης λειτουργεί ανά χώρα. Στην Ελλάδα είναι το Ε.ΣΥ.Δ (Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης) το οποίο έχει ενταχθεί μαζί με τον ΕΛ.Ο.Τ. και το Ε.Ι.Μ. (Ελληνικό Ινστιτούτο Μετρολογίας) στο Εθνικό Σύστημα Υποδομών Ποιότητας (Ε.Σ.Υ.Π.). Το Ε.ΣΥ.Δ συμμετέχει σε συμφωνίες αμοιβαίας αναγνώρισης με πολλούς αντίστοιχους εθνικούς φορείς άλλων χωρών, αλλά και με ανώτερους διακρατικούς οργανισμούς, όπως η EA (European cooperation for Accreditation) και η ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation). Οι φορείς πιστοποίησης διαπιστεύονται για πιστοποίηση σε διάφορους τομείς, από τον φορέα διαπίστευσης. Το κατάλληλο πρότυπο για τα κλινικά εργαστήρια είναι το ISO 15189, το οποίο αρχικά συντάχθηκε το 2003 από την τεχνική επιτροπή TC 212 για να αναθεωρηθεί στη συνέχεια το 2007 και προσφάτως το 2012 (Huisman, 2012 International Standards Organisation, 2012). Το πρότυπο έχει και διοικητικές και διαχειριστικές απαιτήσεις, οι οποίες είναι παρόμοιες με αυτές του προτύπου πιστοποίησης ISO 9001:2000 και από το Σεπτέμβριο του 2009 υπάρχει διεθνή συμφωνία με βάση την οποία θεωρείται ότι τα διαπιστευμένα εργαστήρια πληρούν ταυτόχρονα τις απαιτήσεις πιστοποίησης κατά ISO Τα οφέλη της διαπίστευσης ενός κλινικού εργαστηρίου κατά ISO είναι πολλά για το εργαστήριο, τους ασθενείς και το κράτος. Για το εργαστήριο είναι η απόδειξη ότι εφαρμόζει σύστημα ποιότητας, είναι τεχνικά επαρκές και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα, σύμφωνα με διεθνή πρότυπα. Η κάλυψη των απαιτήσεων του προτύπου επιφέρει αρχικά οικονομικό «κόστος ποιότητας» στο εργαστήριο, ωστόσο εκτιμάται ότι μέσω των μειωμένων επαναλήψεων των εργαστηριακών εξετάσεων, των μειωμένων άστοχων ενεργειών του εργαστηρίου, αλλά και της αυξημένης ικανοποίησης των ιατρών και των ασθενών, η οποία δημιουργεί αυξημένο κύρος στο εργαστήριο, μακροπρόθεσμα δημιουργούνται οικονομικά οφέλη. Για τους ασθενείς διασφαλίζει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων τους και οδηγεί σε μικρότερη ανάγκη για επανέλεγχο (ειδικά, όταν πρέπει να μεταβούν στο εξωτερικό). Για τους κρατικούς φορείς, υπάρχει αυξημένη εμπιστοσύνη για τη λήψη αποφάσεων στον τομέα της Υγείας με βάση τεκμηριωμένα δεδομένα, μείωση της «αβεβαιότητας» και αύξηση της αποτελεσματικότητας των ελέγχων. Οι κυριότερες από τις διοικητικές απαιτήσεις που εξετάζει το πρότυπο ISO 15189:2012 αναφέρονται στη συνέχεια επιγραμματικά (International Standards Organisation, 2012 Μπακέας, 2006): α) οργανόγραμμα ορισμός υπευθύνου ποιότητας, β) σύστημα ποιότητας και εγχειρίδιο ποιότητας, γ) συμβάσεις-υπηρεσίες και προμήθειες, δ) τήρηση και έλεγχος αρχείων, ε) αρχείο παραπόνων, στ) καταγραφή και έλεγχος μη συμμορφώσεων (non-conformities), ζ) διορθωτικές και προληπτικές ενέργειες (corrective and preventive actions), η) διεξαγωγή εσωτερικών επιθεωρήσεων (internal audits), θ) θέσπιση δεικτών ποιότητας (quality indicators) και ι) ανασκόπηση από τη διοίκηση (management review). Η λειτουργία ενός συστήματος ποιότητας ασφαλώς απαιτεί γραφειοκρατική εργασία κατά την εγκατάστασή του, αλλά και τη διατήρησή του, ωστόσο τα 275

277 πέντε σημεία στα οποία πρέπει να επικεντρωθούν οι εργαστηριακοί επιστήμονες και είναι και τα πιο δύσκολα, αλλά και τα πιο σημαντικά για την αναγνώριση της «τεχνικής επάρκειας» ενός κλινικού εργαστηρίου κατά ISO15189 είναι τα ακόλουθα (Κρούπης, 2008 Κρούπης, 2009 Σταθάκη-Φερδερίγου et al., 2006): Α) Υποδομή εργαστηρίου: Το προσωπικό πρέπει να είναι επαρκές σε αριθμό και γνώσεις και να ακολουθεί πρόγραμμα συνεχιζόμενης εκπαίδευσης. Οι εγκαταστάσεις πρέπει να είναι άριστες ως προς την άνεση και την ασφάλεια χώρου και φιλικές ως προς το περιβάλλον (κατάλληλη διαχείριση βιολογικών αποβλήτων). Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για την ασφάλεια του προσωπικού από δυνητικά επικίνδυνα δείγματα και αντιδραστήρια. Ο κρίσιμος μετρητικός εξοπλισμός για τη λειτουργία ενός εργαστηρίου πρέπει να διακριβώνεται για την ορθή λειτουργία του ως προς τα διεθνή πρότυπα όταν υπάρχουν ή να γίνεται έλεγχος καλής επίδοσης (performance check), όταν αυτά δεν υπάρχουν. Ψυγεία, καταψύκτες, φυγόκεντροι, vortex, ζυγοί και πεχαμετρικές συσκευές πρέπει να καθαρίζονται και να συντηρούνται. Β) Επιλογή των κατάλληλων εργαστηριακών μεθόδων για τις υπό διαπίστευση παραμέτρους με βάση τη βιβλιογραφία και συγκεκριμένους στόχους (π.χ. ελάττωση του εργαστηριακού σφάλματος, κλινική χρησιμότητα) και τα πρακτικά χαρακτηριστικά της εφαρμογής της (application characteristics): είδος και ποσότητα δείγματος, ταχύτητα προσδιορισμού και χρόνος απόκρισης του εργαστηρίου, είδος δοκιμασίας (π.χ. screening test), απαιτούμενοι χειρισμοί του δείγματος, απαιτούμενες γνώσεις από το προσωπικό, κόστος, συχνότητα βαθμονόμησης εξοπλισμού και μεθόδου, διαθεσιμότητα υλικών ελέγχου ποιότητας, δυνατότητα αποθήκευσης του δείγματος κ.λπ. (Κρούπης, 2008 Κρούπης, 2009). Οι παράμετροι για τις οποίες διαπιστεύεται το εργαστήριο και οι αντίστοιχοι μέθοδοι και υποστρώματα περιγράφονται πλήρως στο επίσημο πεδίου διαπίστευσης, ΕΠΕΔ (scope of accreditation) το οποίο αναρτάται στο διαδίκτυο. Υπάρχει σύσταση και οδηγία, ώστε στο μέλλον τα εργαστήρια να διαπιστεύονται σε πιο «ευέλικτο πεδίο» (flexible scope) και με τον τρόπο αυτό να διευκολυνθεί η ταχεία εισαγωγή καινοτόμων μεθοδολογιών από το εργαστήριο (Thelen et al., 2015). Οι μέθοδοι πρέπει να περιγράφονται επαρκώς στο εγχειρίδιο των μεθόδων και να ακολουθεί η σύνταξη τυποποιημένων οδηγιών (Standard Operating Procedures ή SOPs) για την κατάλληλη εφαρμογή τους από το προσωπικό του εργαστηρίου. Η πιστή εκτέλεση των ανωτέρω μεθόδων, αλλά και των κανόνων της ορθής εργαστηριακής πρακτικής (Good Laboratory Practice ή GLP), πρέπει να είναι αντικείμενο συχνών εσωτερικών επιθεωρήσεων. Πρέπει να γίνεται προσπάθεια μείωσης της προ-αναλυτικής διακύμανσης με κατάλληλες οδηγίες προς το προσωπικό, τους «χρήστες» (ιατρούς) και τους «πελάτες» (ασθενείς) για τη σωστή προετοιμασία του ασθενούς, για τη δειγματοληψία στο σωστό χρονικό σημείο αναφορικά με τη πορεία της νόσου (specimen timing), τη σωστή επιλογή αντιπηκτικού για το σωληνάριο δειγματοληψίας, τη σωστή ταυτοποίηση του δείγματος, το σωστό χειρισμό και την ταχεία μεταφορά του δείγματος, τη θερμοκρασία μεταφοράς και αποθήκευσής του έως την ώρα του προσδιορισμού, τη σωστή φυγοκέντρηση κ.λπ. (Guder et al., 2003). Επίσης πρέπει να ελέγχονται και οι μετα-αναλυτικές διαδικασίες, που αφορούν την τήρηση των χρονικών διαστημάτων για τη φύλαξη των δειγμάτων, τη σωστή μεταφορά των ληφθέντων δεδομένων και των αποτελεσμάτων (π.χ. ιδανικά μέσω Laboratory Information System ή LIS) και τέλος το σωστό τρόπο παρουσίασης στην έκθεση των αποτελεσμάτων (report). Το πρότυπο περιλαμβάνει επίσης, μέριμνα για την ασφάλεια του εργαστηριακού υπολογιστικού συστήματος καθώς και για τον κώδικα Δεοντολογίας στην εργαστηριακή Ιατρική (αναφορικά με τη συλλογή προσωπικών δεδομένων και δειγμάτων, το ιατρικό απόρρητο, την πρόσβαση και την διατήρηση αρχείων με εργαστηριακά αποτελέσματα και τις οικονομικές συναλλαγές του εργαστηρίου). Γ) Επικύρωση ή επαλήθευση μεθόδων. Το εργαστήριο καλείται απλά να επαληθεύσει (verification) τις μεθόδους που επιλέγει όταν αυτές είναι πρότυπες μέθοδοι αναφοράς ή αποδεκτές τυποποιημένες (π.χ. εγκεκριμένες από το FDA ή IVD-CE αντιδραστήρια ή kits), καλείται δηλαδή να αποδείξει ότι στα «δικά του χέρια», στις δικές του εργασιακές συνθήκες, με το δικό του προσωπικό και εξοπλισμό, μπορεί να επιτύχει τα ίδια ή καλύτερα αποτελέσματα στα χαρακτηριστικά επίδοσης από αυτά που αναφέρει ο κατασκευαστής. Εάν επιλέξει να αναπτύξει δική του εσωτερική in-house μέθοδο, τότε πρέπει να διεξάγει πειράματα βελτιστοποίησης (optimization), να τα καταγράψει κατάλληλα (documentation) και στη συνέχεια να επικυρώσει τη μέθοδο ως προς: α) τα αναλυτικά χαρακτηριστικά που περιγράφηκαν στην Ενότητα 9.4 και β) τα κλινικά χαρακτηριστικά (clinical validation). Η μέθοδος προς διαπίστευση πρέπει να δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα για τον ενδεικνυόμενο σκοπό (fit for purpose), ο οποίος είναι η ανίχνευση ενός νοσήματος (πρέπει λοιπόν η μέθοδος να διαθέτει ικανοποιητική διαγνωστική κλινική ευαισθησία και ειδικότητα, αρνητική 276

278 και θετική προβλεπτική αξία). Επίσης πρέπει να έχει κλινική αξία (clinical utility), δηλαδή, να είναι χρήσιμη στη διάγνωση και στη θεραπεία του ασθενούς και όχι να έχει απλά ερευνητική χρήση. Οπου είναι δυνατόν, πρέπει να αποδεικνύεται η ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων με σύγκριση με μεθόδους αναφοράς και η χρήση πιστοποιημένων υλικών αναφοράς, όπως προαναφέρθηκε στην Ενότητα 10.1 (Panteghini, 2009). Στις ποσοτικές μεθόδους οφείλει να εκτιμήσει την αβεβαιότητά τους (Ενότητα 10.3) Δ) Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (βλ. Κεφάλαιο 11). Ε) Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας (βλ. Κεφάλαιο 11). Η μη επιτυχής επίδοση του εργαστηρίου σε οποιονδήποτε από τους ανωτέρω πέντε τομείς οι οποίοι αποτελούν τους «πυλώνες της ποιότητας» αποτελεί σοβαρή μη συμμόρφωση (non conformity) και μπορεί να αποτελέσει αιτία για τη μη απονομή ή για την απώλεια της διαπίστευσης του, είτε κατά την αρχική αξιολόγηση, είτε και κατά την ετήσια επιτήρηση ή την επαναξιολόγηση ανά τετραετία, αντίστοιχα (Κρούπης, 2014) Αβεβαιότητα Η έννοια της αβεβαιότητας αντιμετωπίστηκε παγκοσμίως αρχικά με σκεπτικισμό από τα κλινικά εργαστήρια, καθώς είχαν συνηθίσει στη χρήση του ολικού σφάλματος. Όμως το ολικό σφάλμα αθροίζει δύο ποσότητες, εκ των οποίων η μία - η μεροληψία - έχει πρόσημο και αυτό αποτελεί πρόβλημα στον ακριβή υπολογισμό του (Kallner, 2013). Η αβεβαιότητα ορίζεται ως η διασπορά των τιμών που λογικά μπορούν να αποδοθούν στη προσδιοριζόμενη παράμετρο (Ευαγγελόπουλος et al., 2006 CLSI, 2012 Λεϊμονή, 2008 Λυκόκα et al., 2006 EURACHEM/CITAC CG4, 2000 JCGM 100:2008, 2008 JCGM 200:2008, 2008). Η εκτίμηση της αβεβαιότητας εκτός από το ότι πλέον αποτελεί απαίτηση της διαπίστευσης κατά ISO είναι πολύ χρήσιμη: α) στην εκτίμηση της ορθότητας της μεθόδου, εάν μετρηθεί ένα πιστοποιημένο υλικό αναφοράς και συγκριθεί η τιμή μέτρησης με την πιστοποιημένη τιμή, β) στη σύγκριση δύο τιμών που προέρχονται από το ίδιο εργαστήριο με την ίδια μέθοδο, γ) στη σύγκριση δύο μεθόδων και την επιλογή αυτής με τη μικρότερη αβεβαιότητα και δ) στη λήψη θεραπείας σε σχέση με ένα κλινικό όριο απόφασης ή μια κρίσιμη τιμή (Σχήμα 10.6). Συνεπώς, η αβεβαιότητα δεν υπονοεί την αμφιβολία για την αξιοπιστία του αποτελέσματος, αντίθετα μας δίνει αυξημένη σιγουριά για το εύρος στο οποίο βρίσκεται η πραγματική τιμή. Σχήμα 10.6 Η χρήση της αβεβαιότητας μιας μέτρησης σε σχέση με ένα ανώτερο όριο λήψης θεραπευτικής απόφασης: οι περιπτώσεις I και IV είναι με βεβαιότητα πάνω και κάτω από το κρίσιμο αυτό όριο ενώ το ίδιο δεν ισχύει για τις περιπτώσεις II και III (EURACHEM/CITAC, 2007). Μία μέθοδος για τη γραφική απεικόνιση των πηγών αβεβαιότητας στο αποτέλεσμα μίας μέτρησης είναι το διάγραμμα Ishikawa ή διάγραμμα αιτίας και αποτελέσματος (cause and effect diagram) ή διάγραμμα ψαροκόκαλο (fish-bone diagram), καθώς μοιάζει με τον σκελετό ψαριού (Σχήμα 10.7). Δημιουργήθηκε από 277

279 τον καθηγητή χημικής μηχανικής του Πανεπιστημίου του Τόκιο Kaoru Ishikawa το 1968, αρχικά για την μέθοδο της ανάλυσης αιτίας και αποτελέσματος (Cause and Effect Analysis) και ως ένα εργαλείο για τον έλεγχο ποιότητας, αλλά στη συνέχεια άρχισε να χρησιμοποιείται και για άλλες μεθόδους. Σχήμα 10.7 Το διάγραμμα ψαροκόκαλο καταδεικνύει τις πιθανές πηγές αβεβαιότητας στο αποτέλεσμα μιας μετρούμενης ποσότητας (Καπετανστρατάκη, 2015). Παρ όλο που είναι πολύ σημαντικό να ελαχιστοποιούμε τις αβεβαιότητες που σχετίζονται με την προ-αναλυτική και τη μετα-αναλυτική φάση πριν και μετά τη μέτρηση, η αβεβαιότητα της μέτρησης που μπορεί πιο εύκολα να υπολογίσει το κλινικό εργαστήριο αφορά μόνο τις αβεβαιότητες που προκύπτουν από το σύστημα της μέτρησης, δηλαδή από την προετοιμασία του δείγματος έως και τη λήψη του αποτελέσματος της μέτρησης. Ο καθορισμός των μεταβλητών από τις οποίες αποτελείται η συνάρτηση μέτρησης (measurement function) y = f(x 1, x 2, x 3, x n), της επιρροής τους και ο υπολογισμός των τυπικών τους αβεβαιοτήτων και των αλληλεπιδράσεών τους στο μοντέλο καλείται προϋπολογισμός αβεβαιότητας (uncertainty budget). Η αβεβαιότητα συνήθως, εκφράζεται μαθηματικά ως τυπική απόκλιση ή ως σχετική τυπική απόκλιση (βλ. Ενότητα 2.1) και οι αβεβαιότητες που σχετίζονται με τις επί μέρους ποσότητες, όταν είναι εκφρασμένες ως τυπικές αποκλίσεις ονομάζονται τυπικές αβεβαιότητες (standard uncertainties) και συμβολίζονται ως u(x) ή u x. Οι τυπικές αβεβαιότητες μπορούν να εκτιμηθούν είτε πειραματικά με στατιστική ανάλυση μίας σειράς από μετρήσεις (Τύπου Α), είτε από άλλες πηγές πληροφόρησης (Τύπου Β, π.χ. δεδομένα κατασκευαστών, βιβλιογραφία, προηγούμενη εμπειρία κ.λπ.), είτε από έναν συνδυασμό των δύο αυτών μεθόδων. Η επιλογή εξαρτάται από την φύση της μέτρησης και την διαθεσιμότητα της απαιτούμενης πληροφορίας. Στη συνέχεια οι τυπικές αυτές αβεβαιότητες συνδυάζονται, για να δώσουν τη συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα u c(y) (combined standard uncertainty) της μέτρησης με τη χρήση των κανόνων μετάδοσης σφάλματος (error propagation rules). Οι ακόλουθοι κανόνες είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι (Καπετανστρατάκη, 2015): 1) Όταν η συνάρτηση μέτρησης έχει τη μορφή y = x 1 ± x 2 και τα x 1 και x 2 είναι ανεξάρτητα μεταξύ τους (δηλαδή η συμμεταβλητότητα cov(x 1, x 2) = 0), τότε η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα του y δίνεται από την Εξίσωση 10.1: u c (y) = u(x 1 ± x 2 ) = u 2 (x 1 ) + u 2 (x 2 ) (Εξίσωση 10.1) 2) Όταν η συνάρτηση μέτρησης έχει τη μορφή y = x 1 x 2 ή y = x 1/x 2 και τα x 1 και x 2 είναι ανεξάρτητα (δηλαδή cov(x 1, x 2) = 0), τότε η σχετική συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα (relative combined uncertainty) του y δίνεται από την Εξίσωση 10.2: u c (y) = u(x 1 x 2 ) y (ή = u(x 1 x 2 ) ) = ( u(x 1) ) 2 + ( u(x 2) ) 2 (Εξίσωση 10.2) x 1 x 2 x 1 x 2 x 1 x 2 278

280 όπου το y αντιστοιχεί στην απόλυτη τιμή της συνάρτησης και επομένως η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα δίνεται από την εξίσωση 10.3: u c (y) = y ( u(x1) x1 )2 + ( u(x2) x2 )2 (Εξίσωση 10.3) Όταν τα x 1 και x 2 δεν είναι ανεξάρτητα [cov(x 1, x 2) 0] ή υπάρχει ύψωση σε δύναμη ή λογαρίθμηση ισχύουν άλλοι κανόνες. Για να υπάρχει ένα επίπεδο εμπιστοσύνης που αντιστοιχεί σε μία καθορισμένη πιθανότητα, η συνδυασμένη αβεβαιότητα πολλαπλασιάζεται με έναν συντελεστή κάλυψης k (coverage factor): U(y) = ±k u c (y) (Εξίσωση 10.4) Επομένως, η αβεβαιότητα που προκύπτει μετά από τον πολλαπλασιασμό με τον συντελεστή αυτό ονομάζεται διευρυμένη αβεβαιότητα U(y) (expanded uncertainty) της μέτρησης. Το διάστημα που προκύπτει με τη χρήση k = 2 δίνει 95% εμπιστοσύνη ότι η πραγματική τιμή βρίσκεται εντός του διαστήματος, ενώ για k = 3 το επίπεδο εμπιστοσύνης είναι 99%. Αυτές οι τιμές όμως προϋποθέτουν ότι η κατανομή των ποσοτήτων επιρροής y είναι κανονική και ότι ο υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας έγινε με την εκτίμηση ενός ικανοποιητικού αριθμού παρατηρήσεων n (συνήθως n > 10). Η αβεβαιότητα μέτρησης μπορεί να εκτιμηθεί με δύο διαφορετικές προσεγγίσεις: Bottom up modeling approach: Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην πλήρη κατανόηση των αιτιών από τις οποίες εξαρτάται η αβεβαιότητα ενός αποτελέσματος και της επιρροής τους στη συνάρτηση μέτρησης. Η μέθοδος αυτή συνήθως αναφέρεται ως μέθοδος GUM (Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement) (JCGM 100:2008, 2008). Top down modeling approach: Η μέθοδος αυτή που χρησιμοποιείται συνηθέστερα από τα κλινικά εργαστήρια και περιγράφεται με ένα παράδειγμα στη συνέχεια. Χρησιμοποιεί στατιστικές αρχές για να εκτιμήσει απευθείας την συνολική αβεβαιότητα ενός συστήματος μέτρησης, συνήθως με την εκτίμηση πειραματικών δεδομένων από ειδικά πρωτόκολλα, από έλεγχο ποιότητας (Quality Control ή QC data) ή από επαλήθευση μίας μεθόδου. Ιδανικά οι αβεβαιότητες που εκτιμώνται από τις δύο μεθόδους θα πρέπει να είναι παρόμοιες. Σύνοψη των βημάτων με τη μέθοδο top down Βήμα 1: Προσδιορισμός της μετρούμενης ποσότητας. Βήμα 2: Υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας (u prec ). Βήμα 3: Υπολογισμός της μεροληψίας της μέτρησης (u bias ) με χρήση των u(c ref ) και u rep. Βήμα 4: Υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας. Εάν η τιμή της μεροληψίας δεν είναι στατιστικά σημαντική τότε u c = u prec, αλλιώς: u c = u bias 2 + u prec 2 (Εξίσωση 10.5) Επανεξέταση και αν είναι απαραίτητο, επαναξιολόγηση των πηγών με μεγάλη αβεβαιότητα. Βήμα 5: Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας- Παρουσίαση των αποτελεσμάτων. 279

281 Παράδειγμα: Εκτίμηση της αβεβαιότητας μέτρησης για την κρεατινίνη στον ανθρώπινο ορό με τη μέθοδο top down (Καπετανστρατάκη, 2015). Βήμα 1: Προσδιορισμός της μετρούμενης ποσότητας (συγκέντρωσης) Μετρούμενη ποσότητα Μονάδες Διαδικασία μέτρησης Ιχνηλασιμότητα Ποσό της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ανθρώπινο ορό mmol/l Φασματοφωτομετρική διαδικασία Jaffe με αλκαλικό διάλυμα πικρικού οξέος NIST SRM 967a Βήμα 2: Υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας Τα δεδομένα για την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα για ορό ελέγχου ποιότητας λήφθηκαν για τουλάχιστον 6 μήνες και έδωσαν μέση τιμή 0,4041 mmol/l και τυπική απόκλιση 0,01136 mmol/l με CV 2,81%. Στο διάστημα αυτό οι συνθήκες αναπαραγωγιμότητας περιλάμβαναν διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίων και βαθμονομητών, αρκετές αλλαγές στους χειριστές καθώς και συντήρηση ρουτίνας στα όργανα. Βήμα 3: Υπολογισμός της μεροληψίας Η πιστοποιημένη τιμή της συγκέντρωσης για το υγρό υλικό αναφοράς για την κρεατινίνη που αποκτήθηκε από το NIST (National Institute of Standards and Technology) με κωδικό SRM 967a 0,3427 ± 0,0072 mmol/l. Η αβεβαιότητα της πιστοποιημένης τιμής είναι μία διευρυμένη αβεβαιότητα για επίπεδο εμπιστοσύνης 95%. Επομένως, για τον υπολογισμό της τυπικής αβεβαιότητας του πιστοποιημένου δείγματος u (Cref) αρκεί να διαιρέσουμε τη διευρυμένη του αβεβαιότητα με k = 2: u (Cref) = U/2 = 0,0072/2 = 0,0036 mmol/l και να την εκφράσουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα: u(c ref ) = 0, % = 1,05% 0,3427 Για να ελεγχθεί η ορθότητα της μεθόδου του εργαστηρίου, εκτελούνται 10 μετρήσεις του υλικού αναφοράς κρεατινίνης κάτω από συνθήκες επαναληψιμότητας και υπολογίζεται η τυπική αβεβαιότητα επαναληψιμότητας, u rep. Από τις μετρήσεις, λαμβάνεται μέση τιμή 0,3518 mmol/l και υπολογίζεται η τυπική απόκλιση 0,0076 mmol/l. Επομένως, μπορούμε τώρα να υπολογίσουμε την αβεβαιότητα επαναληψιμότητας, από τη σχέση: u rep = SD n = 0,0076 = 0,0024 mmol/l 10 Και να την εκφράσουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα: u rep = 0, % = 0,68% 0,3518 Τέλος, υπολογίζουμε την τιμή και την αβεβαιότητα της μεροληψίας, σύμφωνα με την Εξίσωση 10.5: 280

282 b = x x ref = 0,3518 0,3427 = 0,0091 mmol/l u bias = u(c ref ) 2 + u rep 2 = 0, , = 0,0043 mmol/l και την εκφράζουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα: u bias = u(c ref ) 2 + u rep 2 = 1, ,68 2 = 1,25% Βήμα 4: Υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας Αρχικά θα πρέπει να εκτιμηθεί εάν η μεροληψία είναι στατιστικά σημαντική και αυτό μπορεί να γίνει με ένα από τους κάτωθι τρόπους: α) Με σύγκριση της μεροληψίας (0,0091 mmol/l) με τη διευρυμένη U bias = 2 * u bias = 2 * 0,0043 = 0,0086 mmol/l (k = 2). Εφ όσον η απόλυτη τιμή της μεροληψίας είναι μεγαλύτερη της αβεβαιότητας, τότε η μεροληψία είναι σημαντική και το αποτέλεσμα της μέτρησης του υλικού αναφοράς από το εργαστήριο διαφέρει στατιστικά από την πιστοποιημένη του τιμή. β) Με t-test: σύγκριση της μέσης τιμής των μετρήσεων επαναληψιμότητας με την πιστοποιημένη τιμή του υλικού αναφοράς και έλεγχο εάν το p < 0,05. γ) Πιο απλά όμως με εμπειρικό τρόπο, το u bias μπορεί να συγκριθεί με την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα u prec και να ελεγχθεί εάν υπερβαίνει το 10%: u bias = 1,25% u prec 2,81% = 0,445 => u bias = 44,5% u prec Από τη στιγμή λοιπόν που η αβεβαιότητα της μεροληψίας με όλους τους ανωτέρω τρόπους είναι σημαντική σε σχέση με την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, πρέπει να συμπεριληφθεί στην εκτίμηση της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας u c μιας μέτρησης: u c = u bias 2 + u prec 2 = 1, ,81 2 = 3,075% Βήμα 5: Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας Για τον υπολογισμό της διευρυμένης αβεβαιότητας U θα χρησιμοποιήσουμε για συντελεστή κάλυψης το 2 έτσι ώστε να έχουμε 95% επίπεδο εμπιστοσύνης: U = k x u c = 2 x 3,075% = 6,15% Παρουσίαση των αποτελεσμάτων: Έστω ότι η τιμή της συγκέντρωσης της κρεατινίνης ενός ασθενούς με την ανωτέρω μέθοδο στον αναλυτή (μοναδιαία μέτρηση) του εργαστηρίου ευρέθη 0,1453 mmol/l. Η διευρυμένη αβεβαιότητα της τιμής αυτής με k = 2, είναι 6,15% x 0,1453 = 0,0089 mmol/l. Το μετρούμενο αποτέλεσμα της κρεατινίνης για το δεδομένο άτομο είναι: 0,1453 ± 0,0089 mmol/l. Η αληθής τιμή με επίπεδο εμπιστοσύνης της τάξης του 95% εντοπίζεται στο διάστημα [0,1453-0,0089 έως 0, ,0089] ή αλλιώς [0,1364 0,1542] mmol/l. Σχόλια: Συνήθως στα κλινικά εργαστήρια δεν χρησιμοποιούνται περισσότερα από δύο σημαντικά ψηφία, συνεπώς το αποτέλεσμα κρεατινίνης του ασθενούς με την αβεβαιότητα αναγράφεται ως 0,15 ± 0,01 mmol/l (European co- 281

283 operation for Accreditation, 2003b). Το γεγονός ότι η μεροληψία είναι σημαντική σε μια μέθοδο που είναι ιχνηλάσιμη, πρέπει να οδηγήσει το εργαστήριο σε διορθωτικές ενέργειες για την εξάλειψη ή τη μείωση του λάθους π.χ. με διόρθωση τιμής μέσω λογισμικού, με επαναβαθμονόμηση κ.λπ. (EURACHEM/CITAC CG4, 2000 JCGM 100:2008, 2008). Πηγές από το διαδίκτυο για εύρεση υλικών αναφοράς (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) Αναφορές 1. ΒΟΓΙΑΤΖΑΚΗΣ, Ε.Δ. (2007) Αξιολόγηση της ποιότητας των εργαστηριακών εξετάσεων. Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 24, p ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΣ, Α.Α., ΘΩΜΑΪΔΗΣ, Ν.Σ., ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (2006) Αβεβαιότητα και ιχνηλασιμότητα στο βιοχημικό εργαστήριο: νέα θεώρηση κλασικών όρων. Δελτίον Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, 51, p ΚΑΠΕΤΑΝΣΤΡΑΤΑΚΗ, Μ. (2015) Στατιστικές μέθοδοι για την επαλήθευση και τον έλεγχο ποιότητας εργαστηριακών μεθόδων. ΜΠΣ Βιοστατιστική, Ιατρική Σχολή και Τμήμα Μαθηματικών Πανεπιστημίου Αθηνών. 4. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2014) Διαπίστευση, πιστοποίηση, έλεγχος ποιότητας κλινικών εργαστηρίων. Ελληνικά Αρχεία AIDS, 22, p ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2009; pp ) Διαπίστευση εργαστηρίων Μοριακής Διαγνωστικής κατά ISO 15189, 8o Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, ed., Πάτρα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 6. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2008; pp ) Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων κατά ISO 15189: εφαρμογή στις δοκιμές κυτταρομετρίας ροής, 5o Πανελλήνιο Συνέδριο Κυτταρομετρίας, ed., Ολυμπία: Ελληνική Εταιρεία Κυτταρομετρίας. 7. ΛΕΪΜΟΝΗ, Ε.Δ. (2008) Διακρίβωση εξοπλισμού-ιχνηλασιμότητα, In: Πιστοποίηση και Διαπίστευση εργαστηρίων: πρακτικές διαδικασίες και οδηγίες εφαρμογής, Αθήνα: Ελληνική Αιματολογική Εταιρεία. 8. ΛΥΚΟΚΑ, Ε. Χ., ΠΟΥΛΑΚΗ, Ε., ΠΡΙΓΚΟΣ, Ν., ΠΙΠΕΡΑΚΗ, Κ., ΣΤΑΘΑΚΗ-ΦΕΡΔΕΡΊΓΟΥ, Α. (2006; pp ) Αβεβαιότητα μετρήσεων στην Κλινική Χημεία, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1 ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας- Κλινικής Βιοχημείας. 9. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, Σ. (2003; pp ) Πρότυπα υλικά και μέθοδοι - Οροί ελέγχου, In: Ο έλεγχος ποιότητας στο εργαστήριο Κλινικής Χημείας, 2ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 10. ΜΠΑΚΕΑΣ, Ε. Β. (2006; pp. 7-11) Διαπίστευση Εργαστηρίων Δοκιμών, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 11. ΣΤΑΘΑΚΗ-ΦΕΡΔΕΡΙΓΟΥ, Α., ΠΟΥΛΑΚΗ, Ε., ΠΡΙΓΚΟΣ, Ν., ΛΥΚΟΚΑ, Ε. Χ., ΠΙΠΕΡΑΚΗ, Κ. (2006; pp. 53-6) Οδηγίες διασφάλισης ποιότητας κλινικών εργαστηρίων, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 12. BERDING, C., CIESIOLKA, T., FISCHER, A., & EHRHARDT, V. (2010) Procedures of Standardization of Clinical Chemistry and Immuno Assays from Roche Diagnostics Roche Diagnostics AG. 13. DYBKAER, R. (1991) Reference materials--a main element in a coherent reference measurement system. Eur.J.Clin Chem Clin Biochem, 29, p CLSI (2012) C51-A Expression of measurement uncertainty in Laboratory Medicine; Approved Guideline Wayne, PA, Clinical and Laboratory Standards Institute. 282

284 15. EMONS, H., FAJGELJ, A., VAN DER VEEN, A.M.H. et al., (2006) New definitions on reference materials. Accred Qual Assur, 10, p EMONS, H. (2006) The 'RM family' Identification of all of its members. Accred.Qual Assur, 10, p EUROPEAN CO-OPERATION FOR ACCREDITATION (EA) (2003a) EA 4/14: The Selection and Use of Reference Materials. 18. EURACHEM/CITAC (2003) Traceability in Chemical Measurement. A guide to achieving comparable results in chemical measurement. 19. EURACHEM/CITAC CG4 (2000) Quantifying uncertainty in analytical measurement, 2nd ed. 20. EURACHEM/CITAC (2007) Use of uncertainty information in compliance assessment. 21. EUROPEAN CO-OPERATION FOR ACCREDITATION (EA) (2003b) EA-4/16: EA guidelines on the expression of uncertainty in quantitative testing. 22. GUDER, W.G., NARAYANAN, S., WISSER, H., & ZAWTA, B. (2003) Samples: from the patient to the laboratory. The impact of preanalytical variables on the quality of laboratory results, 3rd ed. Weinheim, Wiley-VCH. 23. HUISMAN, W. (2012) European medical laboratory accreditation. Present situation and steps to harmonisation. Clin Chem Lab Med, 50, p KALLNER, A. (2013) Estimation of uncertainty in measurements in the clinical laboratory. Clin.Chem.Lab Med., 51, p MILLER, G.W., MYERS, G.L., LOU, G.M. et al., (2011) Roadmap for harmonization of clinical laboratory measurement procedures. Clin Chem, 57, p PANTEGHINI, M. (2009) Traceability as a unique tool to improve standardization in laboratory medicine. Clin Biochem, 42, p INTERNATIONAL STANDARDS ORGANISATION (2012) ISO 15189: Medical Laboratories-particular requirements for quality and competence. 28. THELEN, M.H., VANSTAPEL, F.J., KROUPIS, C. et al., (2015) Flexible scope for ISO accreditation: a guidance prepared by the European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) Working Group Accreditation and ISO/CEN standards (WG-A/ISO). Clin Chem Lab Med, 53, p JCGM 200:2008 (2008) International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and associated terms (VIM), 3rd ed. 30. JCGM 100:2008 (2008) Evaluation of measurement data-guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM), 1st ed. 283

285 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ο Ο ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΙΣ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Σύνοψη Βασικό καθήκον κάθε αναλυτή στο κλινικό εργαστήριο είναι εκτός των άλλων και ο έλεγχος ποιότητας των αποτελεσμάτων που εξάγει. Ο έλεγχος ποιότητας προϋποθέτει πολλές γνώσεις στατιστικής, οι οποίες ποικίλουν ανάλογα με τις αναλύσεις που αναφέρονται (ποσοτικές, ημιποσοτικές, ποιοτικές). Το κεφάλαιο αυτό θα εστιάσει στον έλεγχο της ποιότητας των ποσοτικών αναλύσεων, που αποτελούν την πλειοψηφία στα κλινικά εργαστήρια. Θα αναφερθούν επίσης, τα είδη των σφαλμάτων και λαθών που γίνονται στα εργαστήρια και θα κατηγοριοποιηθούν στις επιμέρους κατηγορίες τους (τυχαία, συστηματικά). Ειδικότερα, τα αναλυτικά σφάλματα θα αναλυθούν σε σχέση με την έλλειψη ακρίβειας και πιστότητας που προκαλούν και θα περιγραφούν οι μαθηματικοί τρόποι υπολογισμού και των δύο. Σε ό, τι αφορά στις μεθόδους στατιστικού ελέγχου ποιότητας, θα περιγραφούν χωριστά ο εσωτερικός και ο εξωτερικός έλεγχος ποιότητας που χρησιμεύουν αντίστοιχα για τον υπολογισμό της έλλειψης επαναληψιμότητας (ή επαναληπτικότητας) και ακρίβειας της αναλυτικής μεθόδου. Προαπαιτούμενες γνώσεις Το παρόν κεφάλαιο βασίζεται στις γνώσεις όλων των προηγούμενων κεφαλαίων, ειδικά όσων αφορούν αναλύσεις και αρχές μεθόδου. Προαπαιτούμενα κεφάλαια είναι το Κεφάλαιο 9 (τα εσώκλειστα φυλλάδια των αντιδραστηρίων) και 10 (πιστοποιημένα υλικά αναφοράς) Βασικές έννοιες Τα διαγνωστικά εργαστήρια, σε καθημερινή βάση, φροντίζουν για τη διασφάλιση της ποιότητας (Quality Assurance) των αποτελεσμάτων τους. Συχνά στα διαγνωστικά εργαστήρια παρατηρούνται σφάλματα που αφορούν τις αναλυτικές μεθόδους και την ποιότητα των υλικών - αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται, καθώς και λάθη ως αποτέλεσμα ανθρώπινης απροσεξίας του επιστημονικού εργαστηριακού προσωπικού. Συνήθως, ο έλεγχος αξιοπιστίας των εργαστηριακών αποτελεσμάτων σχετίζεται ή ταυτίζεται με τον αναλυτικό έλεγχο ποιότητας. Όμως, ο αναλυτικός έλεγχος ποιότητας θα πρέπει να αποτελεί τμήμα ενός ευρύτερου συστήματος διαχείρισης της ποιότητας, που ονομάζεται διαχείριση ολικής ποιότητας (Total Quality Management). Η διαχείριση ολικής ποιότητας περιλαμβάνει όλες τις φάσεις λειτουργίας ενός εργαστηρίου, που διασφαλίζουν την ακρίβεια (accuracy) και την πιστότητα (precision) σε όλα τα βήματα των διαδικασιών, από την αρχική παραγγελία μιας εξέτασης (προ-αναλυτικό στάδιο) μέχρι την ανάλυση (αναλυτικό στάδιο) και τη τελική διανομή των αποτελεσμάτων (μετα-αναλυτικό στάδιο). Οι παράγοντες, στους οποίους πιθανόν να οφείλονται διακυμάνσεις ή τα σφάλματα στα αποτελέσματα των αναλύσεων μπορούν να διακριθούν σε τρεις κατηγορίες: προ-αναλυτικής φάσης (pre-analytical errors), αναλυτικής φάσης (analytical errors) και μετα-αναλυτικής φάσης (post-analytical errors) Προ-αναλυτικοί παράγοντες Σχετίζονται με την μη αλλοίωση της δομής και της συγκέντρωσης της υπό προσδιορισμό ένωσης ή στοιχείου στο βιολογικό δείγμα, προηγούνται της εργαστηριακής ανάλυσης και κυρίως αφορούν: την κατάσταση του ασθενούς (βιολογικοί και μη βιολογικοί παράγοντες), 284

286 την προετοιμασία του ασθενούς πριν τη δειγματοληψία, τη δειγματοληψία, την εσφαλμένη ταυτοποίηση του δείγματος (π.χ. αναγραφή λανθασμένου ονόματος), τη συλλογή, μεταφορά και φύλαξη του βιολογικού δείγματος, τον χειρισμό του δείγματος (π.χ. αραίωση του δείγματος), τη φυγοκέντρηση, την κατάσταση του δείγματος (ορός αιμολυμένος ή λιπαιμικός), τις αντιπηκτικές ουσίες, τις ιδιότητες της προσδιοριζόμενης ουσίας, κ.α Αναλυτικοί παράγοντες Αφορούν στην εργαστηριακή ανάλυση και σχετίζονται με τη λειτουργία των οργάνων και των αυτόματων αναλυτών. Η αναλυτική διαδικασία ξεκινά από τη στιγμή που φτάνει στο εργαστήριο το προς ανάλυση δείγμα και τελειώνει με την αποστολή της έκθεσης των αποτελεσμάτων. Ενδεικτικά, οι αναλυτικοί παράγοντες σχετίζονται με: λανθασμένη επιλογή μεθόδου ανάλυσης, μη σωστή λειτουργία των οργάνων, κακή βαθμονόμηση, κακή συντήρηση βαθμονομητών, ορών ελέγχου, αντιδραστηρίων και άλλων χημικών, λανθασμένη εκτέλεση του πρωτοκόλλου της μεθόδου προσδιορισμού, τη καθαρότητα των σκευών και των οργάνων (π.χ. κυψελίδων), την ελλιπή εκπαίδευση του προσωπικού, κ.α Μετα-αναλυτικοί παράγοντες Περιλαμβάνουν κυρίως γραφειοκρατικά λάθη, όπως: λάθος αναγραφή των αποτελεσμάτων στα απαντητικά δελτία, απόδοση αποτελεσμάτων σε λάθος ασθενή, καθυστέρηση της απάντησης, κ.α. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων μετρήσεων από μεγάλα νοσοκομεία έχει δείξει, πως η πλειοψηφία των λαθών και σφαλμάτων (περίπου 90%) αφορούν κύρια τη προ-αναλυτική και τη μετα-αναλυτική φάση και οφείλονται στον ανθρώπινο παράγοντα. Τα λάθη στις δύο αυτές φάσεις ονομάζονται gross errors. Τα λάθη αυτά σήμερα έχουν ελαχιστοποιηθεί σημαντικά, λόγω της μηχανογράφησης των εργαστηρίων και της χρήσης πολύτιμων στατιστικών εργαλείων Διαχείριση ολικής ποιότητας Η διαχείριση ολικής ποιότητας περιλαμβάνει όλες εκείνες τις δραστηριότητες του εργαστηρίου που μπορούν να εκφράσουν την ποιότητά του (Σχήμα 11.1), όπως: σχεδιασμό της ποιότητας (Quality Planning), εργαστηριακές διαδικασίες (Quality Laboratory Processes), έλεγχο ποιότητας (Quality Control), αποτίμηση της ποιότητας (Quality Assessment), βελτίωση της ποιότητας (Quality Improvement), πρότυπα ποιότητας (Quality Standards). 285

287 Σχήμα 11.1 Διαγραμματική απεικόνιση της «διαχείρισης ολικής ποιότητας». Με βάση τα παραπάνω ο σχεδιασμός και η παρακολούθηση της αναλυτικής ποιότητας συμβάλλει στον εντοπισμό και στη λήψη μέτρων για τη διόρθωση των σφαλμάτων και λαθών που εμφανίζονται κατά τη διάρκεια των αναλύσεων. Ο αναλυτικός έλεγχος ποιότητας περιλαμβάνει δύο παράλληλους και συμπληρωματικούς μηχανισμούς ελέγχου: τον ενδο-εργαστηριακό, εσωτερικό έλεγχο (Internal Quality Control), τον δι-εργαστηριακό (εξωτερικό) έλεγχο (External Quality Assessment). Ο εσωτερικός έλεγχος ποιότητας εφαρμόζεται σε καθημερινή βάση και έχει ως στόχο την πιστοποίηση της επαναληπτικότητας και της ακρίβειας της μεθόδου ως προς ένα εσωτερικό πρότυπο (standard). Τα αποτελέσματα των ελέγχων αυτών επεξεργάζονται στατιστικά με διάφορες μεθόδους για: τον εντοπισμό των σφαλμάτων σε πραγματικό χρόνο και τη λήψη διορθωτικών μέτρων, τη διαπίστευση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων. Ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος (External Quality Control) είναι προαιρετικός, εφαρμόζεται ως προς ένα εξωτερικό πρότυπο από έναν εξωτερικό φορέα και βασίζεται στα αποτελέσματα της ανάλυσης του ίδιου δείγματος, σε τακτά χρονικά διαστήματα από έναν μεγάλο αριθμό εργαστηρίων. Η σύγκριση και η σύγκλιση των επιδόσεων μεταξύ των εργαστηρίων αποτελεί έναν από τους δύσκολους στόχους του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Κατά κανόνα, ο εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος (Σχήμα 11.2) αφορά κυρίως την επαναληπτικότητα (τυχαία σφάλματα), ενώ ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος σχετίζεται με την ακρίβεια (συστηματικά σφάλματα). 286

288 Σχήμα 11.2 Οι βασικοί ορισμοί και κατευθύνσεις του ελέγχου ποιότητας στα κλινικά εργαστήρια. Ο εντοπισμός και η λήψη διορθωτικών μέτρων για την αποφυγή ή την εξάλειψη λαθών αποτελεί καθημερινή απασχόληση του επιστημονικού προσωπικού των εργαστηρίων. Προς αυτή τη κατεύθυνση συμβάλλουν συγκεκριμένα διεθνή πρότυπα (π.χ. ISO/IEC 15189: 2012) Ταξινόμηση Λαθών και Σφαλμάτων Στην κλινική χημεία ο όρος σφάλμα (Error ή Ε) αποτυπώνει τη διαφορά μεταξύ του αποτελέσματος της εργαστηριακής μας ανάλυσης και της πραγματικής τιμής της συγκέντρωσης μιας ουσίας που προσδιορίζεται. Ο προσδιορισμός ενός σφάλματος προσδιορίζεται σύμφωνα με τη σχέση: Ε = μ - xi (Εξίσωση 7.1) Όπου Ε το σφάλμα, μ η πραγματική τιμή και x i η εργαστηριακή τιμή. Τα σφάλματα διακρίνονται σε: τυχαία σφάλματα, συστηματικά σφάλματα, λοιπά σφάλματα. Τα τυχαία σφάλματα σχετίζονται με την επαναληπτικότητα (repeatability), ή και την αναπαραγωγιμότητα (reproducibility), ενώ τα συστηματικά σφάλματα σχετίζεται με την έννοια ακρίβεια (accuracy). Μέτρο της επαναληπτικότητας αποτελεί η τυπική απόκλιση (Standard Deviation, SD ή s), η οποία μπορεί να υπολογιστεί από την παρακάτω σχέση: SD ή s = 1 N (x i x ) 2 N 1 (Εξίσωση 7.2) όπου: SD ή s η τυπική απόκλιση, Ν ο αριθμός των παρατηρήσεων, x i η εκάστοτε τιμή, x η μέση τιμή. 287

289 Επειδή η τυπική απόκλιση έχει μονάδες (αυτές των μετρήσεων), πολλές φορές, για την αποφυγή λαθών, υπολογίζεται ένα άλλο μέγεθος, ο συντελεστής απόκλισης (coefficient of variation, CV). Αυτός δίνεται από τη σχέση: CV% = SD x 100 x (Εξίσωση 7.3) Όπως βλέπουμε από την παραπάνω σχέση, ο συντελεστής μεταβλητότητας δίνει το μέτρο της αναλυτικής διακύμανσης των μετρήσεων, δηλαδή τη σταθερή απόκλιση προς τη μέση τιμή των μετρήσεων, επί τοις %. Είναι συνεπώς ανεξάρτητος από τις μονάδες μέτρησης και αντιπροσωπεύει ένα μέτρο σχετικής διασποράς των τιμών Εσωτερικός Έλεγχος Ποιότητας Ακρίβεια και Ολικό Σφάλμα (Total Error) Η ακρίβεια (βλ. Ενότητα 9.2) χρησιμοποιείται πλέον ως γενικός όρος και αντιπροσωπεύει την εγγύτητα (συμφωνία, closeness) του αποτελέσματος ενός προσδιορισμού από τη πραγματική ή αληθή τιμή (true ή correct) της ουσίας που υπάρχει στο δείγμα (αποδεκτής τιμής αναφοράς) ή με άλλα λόγια τον βαθμό ταύτισης της προσδιοριζόμενης και της πραγματικής τιμής. Η ακρίβεια δεν εκφράζεται με τιμές. Το μαθηματικό μέτρο της ακρίβειας προσδιορίζεται με την ανακρίβεια ή έλλειψη ακρίβειας (inaccuracy), η οποία αποτελεί μέτρο του ολικού σφάλματος, συμπεριλαμβάνοντας το συστηματικό και τυχαίο σφάλμα (βλ. Σχήμα 9.3). Oλικό σφάλμα (Total Error) = Συστηματικό Σφάλμα + Z Τυχαίο Σφάλμα (Εξίσωση 7.4) όπου Z ο συντελεστής με βάση το διάστημα εμπιστοσύνης (Δ.Ε.) (π.χ. για Δ.Ε. 95%, ο Ζ έχει τιμή 1,96). Η ακρίβεια αποτελεί κριτήριο για τα λεγόμενα «συστηματικά σφάλματα», δηλαδή σφάλματα που οφείλονται στα όργανα μέτρησης, στα αντιδραστήρια, κ.α. και ειδικά για τα ένζυμα, λάθη στη θερμοκρασία επώασης (υψηλότερες ή χαμηλότερες), με αποτέλεσμα καλή επαναληπτικότητα και κακή ακρίβεια. Τα συστηματικά σφάλματα είναι μιας «κατεύθυνσης» (Σχήμα 11.3). Σχήμα 11.3 Επαναληπτικότητα και ακρίβεια μετρήσεων (Aaser Abdealazim, 2012). Μέτρο των συστηματικών σφαλμάτων - ακρίβειας αποτελεί το μέγεθος Βias, που υπολογίζεται από την σχέση: Bias = x i - x (Εξίσωση 7.5) 288

290 Στα κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούνται συνήθως επικυρωμένες μέθοδοι από τις κατασκευάστριες εταιρείες. Το σφάλμα της μέτρησης μπορεί να είναι τυχαίο (x i- ) ή συστηματικό ( -μ). Ελλείψει συστηματικού σφάλματος η ακρίβεια εκφράζεται μόνο από το τυχαίο σφάλμα, δηλαδή το συντελεστή διακύμανσης CV (πιστότητα). Παρουσία συστηματικού σφάλματος, δηλαδή ( -μ) >> SD, το σφάλμα αποδίδει το μέτρο της ορθότητας (truness) της μεθόδου. Έτσι, το ( -μ) εκφράζει την ορθότητα της μεθόδου και το (x i- μ) την ακρίβεια. Δηλαδή: Σφάλμα μέτρησης = Συστηματικό σφάλμα + τυχαίο σφάλμα (Εξίσωση 7.6) ή (x i μ) = (x μ) + (x i - x ) (Εξίσωση 7.7) ή Ακρίβεια = Ορθότητα + Πιστότητα (Εξίσωση 7.8) Η ακρίβεια έχει πολύ μεγάλη σημασία διότι τα συστηματικά σφάλματα των μετρήσεων, πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερα, ώστε τα αποτελέσματα: να είναι συγκρίσιμα με την πάροδο του χρόνου, να είναι συγκρίσιμα μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, νοσοκομείων, να μπορούν να αξιολογηθούν με βάση εθνικά ή διεθνή πρότυπα και κριτήρια αξιολόγησης Μέθοδοι ελέγχου ακρίβειας H στατιστική δοκιμασία t-student Πρώτη περίπτωση Ανάλυση ενός μόνο δείγματος (π.χ. ανάλυση υλικού αναφοράς (CRM) ή ορού ελέγχου (QC), με γνωστή τιμή αναφοράς (μ). Πραγματοποιείται μέτρηση του δείγματος Ν φορές και από τις λαμβανόμενες μετρήσεις υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση. Στη συνέχεια εφαρμόζεται η δοκιμασία t (t-student test) για τον έλεγχο ύπαρξης στατιστικά σημαντικής διαφοράς μεταξύ της μέσης τιμής (Χ mean) και της τιμής αναφοράς (μ), ως εξής: Υπολογίζεται μία τιμή για την παράμετρο t με τη βοήθεια της σχέσης: μ - x N t mean (Εξίσωση 7.9) exp S όπου t exp η προσδιοριζόμενη τιμή t και s η τυπική απόκλιση. Η τιμή t exp συγκρίνεται με μία θεωρητική τιμή του t (t theor), η οποία βρίσκεται με τη βοήθεια πίνακα, για συγκεκριμένη στάθμη εμπιστοσύνης (π.χ. στάθμη εμπιστοσύνης 95%) και βαθμούς ελευθερίας f, όπου f = Ν-1. Αν t exp < t theor τότε συμπεραίνεται ότι δεν υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής που υπολογίσαμε και της τιμής αναφοράς, και συνεπώς η μέθοδος είναι ακριβής. Παράδειγμα Υλικό αναφοράς για την εξέταση γλυκόζη, έχει τιμή αναφοράς μ = 150 mg/dl. Πραγματοποιείται προσδιορισμός της γλυκόζης εις 5-πλουν (Ν = 5) με μέση τιμή της X mean = 158 mg/dl και τυπική απόκλιση S = 7,8 mg/dl. Να αξιολογηθεί η ακρίβεια της μεθόδου. Υπολογίζουμε την τιμή t μέσω της σχέσης: t exp 150-7, ,

291 Από κατάλληλο πίνακα βρίσκουμε την θεωρητική τιμή του t, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και για 4 βαθμούς ελευθερίας, t theor = 2,776. Στη συνέχεια συγκρίνουμε την υπολογιζόμενη τιμή του t με την θεωρητική και παρατηρούμε ότι t exp = 2,293 < t theor = 2,776. Συνεπώς, δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής και της τιμής αναφοράς και άρα η μέθοδος στερείται συστηματικού σφάλματος. Το παρατηρούμενο σφάλμα [( ) / 150] x 100 = 5,3% είναι τυχαίο, ίδιας τάξης μεγέθους με τη %RSD = (7,8/158) x 100 = 4,9%. Δεύτερη Περίπτωση Ανάλυση ενός δείγματος με γνωστή τιμή αναφοράς (Χ αναφ) που συνοδεύεται από τυπική απόκλιση (S αναφ), η οποία υπολογίστηκε από αριθμό Ν αναφ αναλύσεων, μέσω άλλης πρότυπης μεθόδου. Στην περίπτωση αυτή, πρώτα ελέγχουμε, εάν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων των δύο συγκρινόμενων μεθόδων, με τη βοήθεια της δοκιμασίας F, ως εξής: Υπολογίζεται η τιμή F exp μέσω της σχέσης: F exp = S 2 1 / S 2 2 (Εξίσωση 7.10) όπου S 1 η μεγαλύτερη τυπική απόκλιση. Ακολούθως, βρίσκουμε τη θεωρητική τιμή του F (F theor), για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και f = N 1 + N 2-2 βαθμούς ελευθερίας. Στη συνέχεια συγκρίνουμε την υπολογιζόμενη τιμή του F exp με τη θεωρητική F theor και αν F exp < F theor τότε συμπεραίνεται ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των συγκρινόμενων τυπικών αποκλίσεων των δύο μεθόδων, ενώ, εάν συμβαίνει το αντίθετο, τότε η διαφορά είναι σημαντική. Σημείωση: Για να προχωρήσουμε στην εξέταση ύπαρξης συστηματικού σφάλματος, θα πρέπει να μην υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων των δύο συγκρινόμενων μεθόδων. Αν ισχύει η ανωτέρω προϋπόθεση, τότε: Αναλύεται το δείγμα με την υπό αξιολόγηση μέθοδο Ν μεθ - φορές και βρίσκεται η μέση τιμή X mean και η τυπική απόκλιση S μεθ. Εφαρμόζεται η δοκιμασία t (t-student test) για τον έλεγχο ύπαρξης στατιστικά σημαντικής διαφοράς μεταξύ Χ mean και τιμής αναφοράς Χ αναφ, με τη βοήθεια της σχέσης: t exp X αναφ S X 1 2 mean N1N2 N N 1 2 (Εξίσωση 7.11) Όπου S 1-2 η συνδυασμένη τυπική απόκλιση, η οποία υπολογίζεται μέσω της σχέσης: 2 S1 (N1 1) S2 (N 2 1) S1 2 (Εξίσωση 7.12) N N 2 Παράδειγμα Δείγμα ουσίας Α με τιμή αναφοράς Χ αναφ = 216 mg/dl και τυπική απόκλιση S αναφ = 6,4 mg/dl (Ν αναφ = 5) αναλύεται με την υπό αξιολόγηση μέθοδο εις 7-πλουν (Ν 2 = 7). Βρέθηκε μέση τιμή X mean = 196 mg/dl και τυπική απόκλιση S = 5,8 mg/dl. Να αξιολογηθεί η ακρίβεια της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε. Πρώτα εξετάζουμε, εάν υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων των δύο μεθόδων. Υπολογίζεται η τιμή του F exp: F exp = S 2 1 / S 2 2 = 6,4 2 / 5,8 2 = 1,

292 Η θεωρητική τιμή του F theor = 6,89 (95%, f = 10). Επειδή F test < F theor συνεπάγεται ότι δεν υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων των δύο μεθόδων. Άρα, οι δύο επαναληπτικότητες είναι στατιστικά ισοδύναμες και μπορούμε να προχωρήσουμε στην εξέταση της ακρίβειας της μεθόδου που εφαρμόσαμε. Για το σκοπό αυτό: Υπολογίζεται η συνδυασμένη τυπική απόκλιση: S ,9(4) 33,6(6) ,0 mg/dl Υπολογίζεται η τιμή του t: t exp = 5,66. Από κατάλληλο πίνακα ανευρίσκεται η θεωρητική τιμή του t, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και 10 βαθμούς ελευθερίας,: t theor = 2,228 Επειδή t exp = 5,66 > t theor = 2,228, συνεπάγεται ότι υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ της τιμής αναφοράς και της υπολογιζόμενης μέσης τιμής. Συνεπώς, η διαφορά δεν είναι τυχαία και υπάρχει συστηματικό σφάλμα ίσο με [( )/216] x 100 = - 9,2% που είναι μεγαλύτερο από την %RSD = (5,8/196) x 100 = 3,0%. Τρίτη Περίπτωση Μέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας σε άγνωστο θετικό δείγμα και υπολογισμός ανάκτησης. Αναλύεται άγνωστο δείγμα ουσίας Α και προσδιορίζεται η συγκέντρωσή του C 0. Στο δείγμα γίνεται προσθήκη γνωστής μικρής ποσότητας ουσίας Α (ώστε να μην επέλθει μεταβολή του όγκου) και επαναπροσδιορίζεται η συγκέντρωση C 1 του ενισχυμένου δείγματος. Η ανάκτηση (Recovery, R) ως μέτρο της ακρίβειας δίνεται από τη σχέση: C1 C0 %R 100 (Εξίσωση Αυστηρός τύπος) ΔC ή C1 %R x100 (Εξίσωση Ελαστικός τύπος) C ΔC 1 ο Παράδειγμα 0 Άγνωστο δείγμα ουσίας Α αναλύθηκε με την μέθοδο προς αξιολόγηση και βρέθηκε η συγκέντρωση της ουσίας Α ίση με C 0 = 106 mg/dl. Στη συνέχεια, στο δείγμα έγινε προσθήκη γνωστής ποσότητας ουσίας Α, ΔC = 100 mg/dl (θεωρώντας ότι δεν έχει μεταβληθεί σημαντικά ο όγκος του δείγματος). Κατά τον επαναπροσδιορισμό της ουσίας Α, βρέθηκε συγκέντρωση ίση με C 1 = 195 mg/dl. Να υπολογισθεί η % ανάκτηση της ουσίας Α. Με χρήση της σχέσης: C1 C0 % R 100 (Εξίσωση 7.15) C Βρίσκουμε: %R ,0% 100 Ενώ, με χρήση της σχέσης: C1 %R x100 (Εξίσωση 7.16) C ΔC Βρίσκουμε: %R x100 94,7% ο Παράδειγμα

293 Κατά την αξιολόγηση μίας μεθόδου που χρησιμοποιείται σε εργαστήριο κλινικής βιοχημείας, αναλύθηκε ορός αίματος ασθενούς και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της γλυκόζης, ίση με C ο = 150 mg/dl. Στη συνέχεια, ο ορός αίματος αραιώθηκε σε αναλογία 1:1 με ορό ελέγχου, ο οποίος είχε τιμή αναφοράς για τη γλυκόζη ίση με 250 mg/dl. Το διάλυμα που προέκυψε αναλύθηκε και έδωσε τιμή συγκέντρωσης γλυκόζης ίση με 207 mg/dl. Να υπολογισθεί η ανάκτηση της μεθόδου: Με βάση τη δεύτερη σχέση για τον προσδιορισμό του ποσοστού ανάκτησης έχουμε: 207 %R x ,5% (150/2) (250/2) Σημείωση: Παρατηρείστε ότι στον τύπο υπολογισμού του ποσοστού ανάκτησης έχουμε χρησιμοποιήσει τις νέες συγκεντρώσεις της γλυκόζης στο αραιωμένο διάλυμα. Τέταρτη Περίπτωση. Με προσδιορισμό μεγάλου αριθμού (N) αγνώστων δειγμάτων με την υπό αξιολόγηση μέθοδο και με μια μέθοδο αναφοράς και αξιολόγηση των διαφορών με κατά ζεύγη με τη δοκιμασία t. Χρησιμοποιείται ο τύπος: d N texp (Εξίσωση 7.17) S d Όπου d η μέση τιμή των διαφορών (με χρήση προσήμου +/-) και S d η τυπική απόκλιση των διαφορών. Παράδειγμα Για την αξιολόγηση μιας αναλυτικής μεθόδου αναλύθηκαν 20 άγνωστα δείγματα: α) με την υπό αξιολόγηση μέθοδο και β) με μια μέθοδο αναφοράς. Τα αποτελέσματα των δύο μεθόδων παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Να αξιολογήσετε την ακρίβεια της μεθόδου. Α/Α Αξιολογούμενη Μέθοδος Μέθοδος Αναφοράς (mg/l) (mg/l) d Μέση διαφορά (d ): - 7,25 Τυπική απόκλιση (S d) 10,8 292

294 t exp 7, ,8 3,00 Η τιμή t ther (για f = 20-1 και 95%) είναι ίση με 2,10 < t exp και επομένως, υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων και η ελεγχόμενη μέθοδος δεν είναι ακριβής Ορθότητα (Trueness) και Συστηματικό σφάλμα (Systematic error) Η ορθότητα είναι ένας νέος όρος που εισήχθη για τα συστηματικά σφάλματα. Η ορθότητα είναι η ταύτιση (εγγύτητα συμφωνίας) μεταξύ της μέσης εργαστηριακής αριθμητικής τιμής και της πραγματικής τιμής του ίδιου δείκτη (ή της αποδεκτής τιμής αναφοράς). Δεν έχει αριθμητική έκφραση και εξαρτάται από τα συστηματικά σφάλματα. Από τα συστηματικά σφάλματα, ιδιαίτερη σημασία για τη διασφάλιση της ορθότητας των αποτελεσμάτων, έχει η βαθμονόμηση, η οποία θα πρέπει να εξασφαλίζει τη μετρήσιμη (μετρολογική) ιχνηλασιμότητα του τελικού αποτελέσματος, με επαναλαμβανόμενη μη διακοπτόμενη αλυσίδα αναλύσεων και συγκρισιμότητα με πρότυπα υλικά βαθμονόμησης υψηλής ποιότητας. Η μέτρηση ικανού αριθμού δειγμάτων με γνωστή συγκέντρωση ή ποσότητα του προσδιοριζόμενου συστατικού δίνει τη δυνατότητα να προσδιορίσουμε το είδος του συστηματικού σφάλματος. Η διαδικασία πραγματοποιείται με θεώρηση του διαγράμματος συσχέτισης (correlation plot) πραγματικών μετρούμενων τιμών χημικών μονάδων (συγκέντρωσης ή μάζας). Τα συστηματικά σφάλματα ταξινομούνται σε τέσσερεις βασικές κατηγορίες, ανάλογα με τη μορφή της καμπύλης του διαγράμματος συσχέτισης. Μπορεί να παρατηρηθούν τεσσάρων ειδών συστηματικά σφάλματα: Σταθερό σφάλμα (constant error). H καμπύλη συσχέτισης είναι παράλληλη προς την ιδανική και δεν διέρχεται από την αρχή των αξόνων. Οδηγεί σε μονοκατευθυνόμενο (θετικό ή αρνητικό) αναλυτικό σφάλμα (Σχήμα 11.4Α). Αναλογικό σφάλμα (proportional error). H καμπύλη συσχέτισης διέρχεται από την αρχή των αξόνων. Οδηγεί σε μονοκατευθυνόμενο (θετικό ή αρνητικό) αναλυτικό σφάλμα, με αυξανόμενο μέγεθος, όσο αυξάνει η περιεκτικότητα του δείγματος στο προσδιοριζόμενο συστατικό, ενώ το σχετικό σφάλμα παραμένει σταθερό (Σχήμα 11.4Β). Συνδυασμός σταθερού - αναλογικού σφάλματος (combined error). Οδηγεί σε σφάλματα μονοκατευθυνόμενα ή μία μόνο χαρακτηριστική αλλαγή προσήμου του σφάλματος (Σχήμα 11.4Γ). Περίπλοκο/μεικτό σφάλμα. Αποτελεί μερική περίπτωση του προηγούμενου τύπου και αποδίδεται από μη ευθύγραμμες καμπύλες συσχέτισης. Συνήθως οφείλεται στη χημεία της μέτρησης (π.χ. μικρές σταθερές ισορροπίας, βραδεία αποκατάσταση ισορροπίας) και σε οργανολογικά προβλήματα. Τα σφάλματα μπορεί να είναι μονοκατευθυνόμενα ή να ομαδοποιούνται σε περιορισμένο αριθμό ομάδων με το ίδιο πρόσημο (Σχήμα 11.4Δ). 293

295 Σχήμα 11.4 Σταθερό σφάλμα (Α), αναλογικό σφάλμα (Β), συνδυασμός σταθερού αναλογικού σφάλματος (Γ) και περίπλοκο μεικτό σφάλμα (Δ) Πιστότητα Η πιστότητα αντιπροσωπεύει τη ταύτιση μεταξύ ανεξάρτητων αποτελεσμάτων δοκιμασιών, επαναλαμβανόμενων προσδιορισμών ενός δείγματος κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες (βλ. Ενότητα 9.2). Διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: την επαναληπτικότητα (repeatability), που αναφέρεται σε πειράματα εντός της σειράς (within run) ή εντός της ημέρας (within day) και την αναπαραγωγιμότητα (reproducibility) σε μεταβαλλόμενες συνθήκες, που αναφέρεται σε πειράματα μεταξύ ημερών (between days). Η αναπαραγωγιμότητα μπορεί να είναι ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (intralaboratory), ή διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (interlaboratory) Η Αβεβαιότητα της ανάλυσης Η αβεβαιότητα της ανάλυσης (Uncertainty of measurment) αποτελεί δείκτη, ο οποίος χαρακτηρίζει το διάστημα των τιμών, στο οποίο βρίσκεται η «πραγματική» τιμή της αναλυόμενης ποσότητας, ή καθορίζει τα όρια, στα οποία ένα αποτέλεσμα εξετάζεται ως ακριβές, δηλαδή αναπαραγώγιμο και ορθό. Συμπεριλαμβάνει όλες τις πηγές τυχαίων και συστηματικών λαθών της αναλυτικής διαδικασίας, οι οποίες είναι δυνατό να μετρηθούν. Κάποιες από τις πηγές σφαλμάτων μπορούν να αξιολογηθούν με στατιστική κατανομή σε σειρά και να χαρακτηριστεί με πειραματική SD ή με άλλες πηγές πληροφόρησης για τα συστηματικά σφάλματα. Σημαντικό είναι να διαχωρίζεται το σφάλμα από την αβεβαιότητα, καθώς το σφάλμα προσδιορίζεται ως διαφορά μεταξύ μετρήσιμης και πραγματικής τιμής, ενώ η αβεβαιότητα σχετίζεται με το αποτέλεσμα της μέτρησης και χαρακτηρίζει τη διασπορά των τιμών, που μπορούν λογικά να αποδοθούν στο μετρούμενο. Η αβεβαιότητα μπορεί να διακριθεί σε τυπική, σχετική τυπική, συνδυασμένη τυπική και διευρυμένη αβεβαιότητα (Σχήμα 11.5). 294

296 Σχήμα 11.5 Η αβεβαιότητα τα συστατικά της Υπολογισμός Αβεβαιότητας τύπου Α Η αβεβαιότητα τύπου Α εκτιμάται από την τυπική απόκλιση 10 τουλάχιστον μετρήσεων, υπό συνθήκες ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας, σε όλα τα επίπεδα συγκέντρωσης που εξετάσθηκαν κατά την επαλήθευση και από την τυπική απόκλιση 6 μετρήσεων κάθε παραμέτρου από τα πειράματα ανάκτησης [Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης Α.Ε.: Κατευθυντήρια Οδηγία για τη Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων κατά ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 15189] Υπολογισμός Αβεβαιότητας τύπου Β Η αβεβαιότητα τύπου Β δεν στηρίζεται σε αυστηρά στατιστικά δεδομένα, αλλά σε παράπλευρη πληροφόρηση. Εκτιμάται συνήθως από πηγές αβεβαιότητας για χρησιμοποιούμενους βαθμονομητές του αυτόματου αναλυτή. Εφόσον πραγματοποιείται ανασύσταση του βαθμονομητή, μπορεί να εκτιμηθεί και η συνεισφορά από την αβεβαιότητα του χρησιμοποιούμενου ογκομετρικού εξοπλισμού. Εν γένει, όλες οι πηγές αβεβαιότητας καταγράφονται και δίνονται οδηγίες για τον περιορισμό της συνεισφοράς τους στο τελικό αποτέλεσμα (διακριβωμένες αυτόματες πιπέττες και θερμόμετρα ψυγείων, σωστή δειγματοληψία, μεταφορά και προαναλυτική ετοιμασία του δείγματος, κ.α.) [Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης Α.Ε.: Κατευθυντήρια Οδηγία για τη Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων κατά ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 15189] Υπολογισμός Συνδυασμένης Αβεβαιότητας Υπολογίζεται από το νόμο διάδοσης των αβεβαιοτήτων. Για την εκτίμηση καταλληλότητας εφαρμογής της μεθόδου από το εργαστήριο, η συνδυασμένη αβεβαιότητα συγκρίνεται με τις τιμές που δίνονται από τον κατασκευαστή της συσκευής ή και από τις τιμές που δίνονται από τη βιβλιογραφία. [Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης Α.Ε.: Κατευθυντήρια Οδηγία για τη Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων κατά ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 15189] Ιχνηλασιμότητα Ιχνηλασιμότητα (Traceability) είναι η ικανότητα παρακολούθησης (track) και ανίχνευσης της προέλευσης (trace) ενός προϊόντος κατά την διάρκεια της παραγωγής και διακίνησής του (βλ. Κεφάλαιο 10). Η ιχνηλασιμότητα μας δίδει τη δυνατότητα να έχουμε άμεσα διαθέσιμες πληροφορίες που σχετίζονται με το προϊόν. Έτσι, στην περίπτωση που κάτι στο προϊόν δεν είναι αποδεκτό, δίδεται στην εταιρεία η δυνατότητα να εντοπίσει την πηγή του προβλήματος, να το διορθώσει, ενώ παράλληλα μπορεί να ανιχνεύσει και τα υπόλοιπα 295

297 προϊόντα της ίδιας παρτίδας, που ενδεχομένως πρέπει να αποσυρθούν. Παράλληλα, δίδει τη δυνατότητα καλύτερης κοστολόγησης του προϊόντος, μια και μετρώνται με ακρίβεια όλες οι παράμετροι που σχετίζονται με το προϊόν (ISO 17511) Ολικό Εργαστηριακό Σφάλμα (Total Laboratory Error) Τόσο η ακρίβεια όσο και η επαναληπτικότητα μπορεί να εκτιμηθούν μέσα από ένα σύνολο μετρήσεων (αποτελεσμάτων). Η εκτίμηση της ακρίβειας μπορεί να εκτμηθεί σωστά εφόσον η επαναληπτικότητα παραμένει σταθερή και το αντίθετο. Διαφορετικά, μεταβολές στην ακρίβεια θα συμβάλουν σε έλλειψη επαναληπτικότητας, ενώ μεταβολές στην επαναληπτικότητα θα οδηγήσουν σε ανακρίβεια. Ο συνδυασμός των δύο αποτελεί την αναλυτική διακύμανση ή μεταβλητότητα (analytical variation) που εκφράζει το ολικό εργαστηριακό σφάλμα (total laboratory error ή TLE ή TE), (Σχήμα 11.6). Το ολικό σφάλμα για διάστημα εμπιστοσύνης 95% ισούται με: Ολικό εργαστηριακό σφάλμα (ΤΕ) = συστηματικό σφάλμα (bias μ) + τυχαίο σφάλμα (± 2sd) (Εξίσωση 7.18) ή ΤΕ = bias + 1,68 SD, για διάστημα εμπιστοσύνης 95% (Εξίσωση 7.19) Ανεξάρτητα του διαστήματος εμπιστοσύνης το ολικό εργαστηριακό σφάλμα ισούται με: Ολικό εργαστηριακό σφάλμα (ΤΕ) = Bias ± z SD (Εξίσωση 7.20) Όπου z ο συντελεστής που εξαρτάται από το διάστημα εμπιστοσύνης. Σχήμα 11.6 Το ολικό εργαστηριακό σφάλμα (συστηματικό σφάλμα [bias μ] + τυχαίο σφάλμας [± 2SD]) O Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας της πιστότητας (τυχαία σφάλματα) Ένα πρόγραμμα εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου πρέπει να πραγματοποιείται για όλες τις εργαστηριακές διεργασίες. Οι λειτουργίες, οι οποίες πρέπει να εκτελεί περιλαμβάνουν τον έλεγχο: 296

298 για τυχαία σφάλματα, δηλαδή της πιστότητας, για συστηματικά σφάλματα, δηλαδή της ορθότητας, της επίδρασης του matrix (βασικών ουσιών) στην πιστότητα, την ορθότητα και την εξειδίκευση, των τάσεων (trends) Υλικά ελέγχου Η εφαρμογή ενός προγράμματος εσωτερικού ελέγχου ποιότητας απαιτεί τη χρησιμοποίηση υλικών που ονομάζονται υλικά ελέγχου. Τα υλικά ελέγχου πρέπει να διαθέτουν προκαταβολικά τις παρακάτω απαιτήσεις: πρέπει να μοιάζουν όσο γίνεται περισσότερο προς τα δείγματα των ασθενών, σε ό, τι αφορά στη χημική σύσταση και τα φυσικά χαρακτηριστικά, πρέπει η συγκέντρωση των συστατικών τους να είναι σταθερή, η συγκέντρωση των συστατικών να βρίσκεται στην περιοχή αναφοράς ή στα όρια σημαντικότητας της κλινικής παθολογίας. Τα εμπορικά υλικά ελέγχου μπορούν να παρασκευαστούν στη βάση των παρακάτω βασικών ουσιών (matrix): βιολογική βασική ουσία: χρησιμοποιούνται επιμέρους κλάσματα ανθρώπινου ορού, διαλυμένα σε φυσιολογικό ορό, ημισυστηματική βασική ουσία: απομονώνονται ένζυμα σε καθαρό διάλυμα αλβουμίνης, ή καθαρά υποστρώματα διαλυμένα σε συστατικά ορού, ή συνδυασμός κλασμάτων ορού, καθαρά υποστρώματα, διαλυμένα σε φυσιολογικό ορό. Από άποψη προέλευσης τα υλικά ελέγχου μπορεί να είναι ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης (από βοοειδή, ή χοίρους, ή από ορό αλόγου). Για το μεγαλύτερο μέρος των κλινικοχημικών εργαστηριακών αναλύσεων χρησιμοποιούνται υλικά ελέγχου ανθρώπινης προέλευσης, λόγω της μεγαλύτερης συγγένειάς τους με τη βασική ουσία των δειγμάτων των ασθενών. Τα υλικά ελέγχου που χρησιμοποιούνται είναι: πρότυποι οροί ή υλικά βαθμονόμησης (standards ή calibrators), οροί ελέγχου (Quality Controls ή QC) Χάρτες ή Διαγράμματα Ελέγχου Μεγάλη εφαρμογή βρίσκουν στα κλινικοχημικά εργαστήρια η χρήση των χαρτών ελέγχου, οι οποίοι αντιπροσωπεύουν τη διαγραμματική απεικόνιση (Σχήμα 11.7) των αποτελεσμάτων ελέγχου (Shewhart, Σε κάθε εργαστήριο για κάθε εργαστηριακό ποσοτικό δείκτη κατασκευάζεται χάρτης ελέγχου (control chart). Λόγω των τυχαίων σφαλμάτων, ένα σωστό αποτέλεσμα δεν είναι μία και μόνο τιμή, αλλά ένα αποδεκτό εύρος τιμών. Για το λόγο αυτό χρειάζεται να γίνεται σύγκριση του αποτελέσματος της ανάλυσης με αυτό που αναμένεται σύμφωνα με τη συμπεριφορά του δείγματος κατά το παρελθόν. Τη δυνατότητα αυτή την παρέχουν τα διαγράμματα ή χάρτες ελέγχου. 297

299 Σχήμα 11.7 Γενική διαγραμματική απεικόνιση ενός χάρτη ελέγχου Κατασκευή Χαρτών Ελέγχου Levey Jennings Η κατασκευή του χάρτη ελέγχου Levey Jennings (Levey & Jennings, 1951) βασίζεται στην υπόθεση ότι οι τιμές υπόκεινται σε μια τυχαία διακύμανση, η οποία ακολουθεί την κατανομή κατά Gauss, δηλαδή αναμένεται ότι το 68,2% των τιμών θα βρεθεί εντός του διαστήματος ±1 SD, τo 95,5% των τιμών θα βρεθεί εντός του διαστήματος ± 2 SD και το 99,7% εντός του ±3 SD. Στο Σχήμα 11.8 δίνεται ένας κλασικός χάρτης ελέγχου Shewart (Levey Jennings), που λειτουργεί μόνο με δύο είδη ορίων: ± 2 SD από τη μέση τιμή, τα οποία ονομάζονται προειδοποιητικά, και ±3SD από τη μέση τιμή, τα οποία ονομάζονται ελέγχου. Στον οριζόντιο άξονα καταγράφονται οι ημέρες του μήνα και στον κάθετο άξονα οι συγκεντρώσεις της ουσίας σε κατάλληλες μονάδες. Όταν το αναλυτικό σύστημα είναι υπό έλεγχο, τα καθημερινά αποτελέσματα ελέγχου κατανέμονται ομοιόμορφα των δύο πλευρών της ευθείας της μέσης τιμής. Σχήμα 11.8 Διάγραμμα Levey Jennings. 298

300 Κριτήρια Westgard Από το 1981 στα κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούνται ευρέως τα κριτήρια του J. O. Westgard (ή κανόνες ελέγχου), με βάση τα οποία αυξάνεται η ευαισθησία του κλασικού χάρτη ελέγχου για την ανίχνευση τυχαίων και συστηματικών σφαλμάτων, χωρίς να αυξάνονται οι περιπτώσεις ψευδούς απόρριψης. Χρησιμοποιείται ο κλασικός χάρτης ελέγχου, ο οποίος αξιολογείται με δύο είδη κριτηρίων του Westgard (Westgard Multirules) (Westgard et al., 1981): προειδοποιητικά κριτήρια (warning rules), κριτήρια για απόρριψη (rejection rules). Ουσιαστικά, τα κριτήρια αυτά καθορίζουν κατά πόσο η ανάλυση βρίσκεται «υπό έλεγχο» (αποδεκτή) ή εκτός ελέγχου (μη αποδεκτή). Σήμερα χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο η διαδικασία πολλαπλών κανόνων (multirule) του Westgard. Στη καθημερινή πρακτική είναι δυνατή η εφαρμογή τους, τόσο κατά τη χρήση ενός ορού ελέγχου, όσο και δύο ή και περισσότερων. Στο Σχήμα 11.9 απεικονίζεται η διαδοχικότητα των κριτηρίων Westgard, βάσει της οποίας η αξιολόγηση ξεκινά από το 1 2SD κριτήριο, ενώ μετά από αυτό το κριτήριο, εφαρμόζονται διαδοχικά οι υπόλοιποι κανόνες και λαμβάνονται ανάλογα αποφάσεις για απόρριψη της αναλυτικής σειράς και για απομάκρυνση των πηγών σφαλμάτων. Σχήμα 11.9 Διάγραμμα για τη διαδικασία λήψης αποφάσεων με βάση τα κριτήρια (κανόνες) Κριτήρια χρήσης ενός Υλικού Ελέγχου Κριτήριο 1 2SD Εάν ένα αποτέλεσμα ελέγχου βρίσκεται εκτός των ορίων x ± 2SD (Σχήμα 11.10) θεωρείται ως προειδοποιητικό κριτήριο. Απαραίτητο είναι να ελεγχθούν τα υπόλοιπα δείγματα ελέγχου στις προηγούμενες αναλυτικές σειρές, καθώς χρησιμοποιούνται τα υπόλοιπα κριτήρια ελέγχου: 1 3SD, 2 2SD, 10x. 299

301 Σχήμα Κανόνας 1 2SD : αποτέλεσμα ελέγχου εκτός των ορίων x ± 2SD. Κριτήριο 1 3SD Εάν μία τιμή ελέγχου βρίσκεται εκτός των ορίων ± 3SD (Σχήμα 11.11), η αναλυτική σειρά απορρίπτεται, επειδή και αυτή είναι εκτός ελέγχου. Εφαρμόζεται μόνο σε μία αναλυτική σειρά. Αυτό το κριτήριο είναι ευαίσθητο για τυχαίο σφάλμα, αλλά μπορεί επίσης να δείξει και την ανάδειξη συστηματικού σφάλματος με ιδιαίτερα μεγάλο μέγεθος. Σχήμα Κανόνας 1 3SD : αποτέλεσμα ελέγχου εκτός των ορίων x ± 3 SD. Κριτήριο 2 2SD Εάν δύο διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου βρίσκεται εκτός των ίδιων ορίων ± 2SD (Σχήμα 11.12), η αναλυτική σειρά απορρίπτεται. Με αυτό το κριτήριο ανιχνεύεται τυχαίο σφάλμα. Μέση Τιμή Σχήμα Κανόνας 2 2SD : δύο διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου εκτός των ορίων x ± 2SD. Επάνω με ένα δείγμα ελέγχου και κάτω με δύο. 300

302 Κριτήριο 4 1SD Τα τελευταία τέσσερα διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου ενός και αυτού υλικού ελέγχου βρίσκονται εκτός των ορίων ± 1SD (Σχήμα 11.13). Το κριτήριο είναι ευαίσθητο για συστηματικά σφάλματα. Με αυτό το κριτήριο η αναλυτική σειρά δεν απορρίπτεται. Το κριτήριο προειδοποιεί για την δημιουργία συστηματικού σφάλματος, για το οποίο είναι απαραίτητο να ελεγχθεί η βαθμονόμηση του οργάνου και η αναλυτική μέθοδος. Αυτό συνεπάγεται ότι πρέπει να γίνει και στο κριτήριο 1 3SD. Σχήμα Κανόνας 4 1SD : τέσσερα διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου εκτός των ορίων x - 1SD. Επάνω με ένα δείγμα ελέγχου και κάτω με δύο. Κριτήριο 10x Δέκα διαδοχικές τιμές ελέγχου από τη μια και αυτή πλευρά της μέσης αριθμητικής (Σχήμα 11.14), χωρίς άλλες απαιτήσεις για το μέγεθος της απόκλισης. Το κριτήριο είναι ευαίσθητο για συστηματικό σφάλμα. Με βάση αυτό το κριτήριο η αναλυτική διαδικασία μπορεί να απορριφθεί. Απαιτείται άμεσος έλεγχος της βαθμονόμησης, καθώς και της υποστήριξης του οργάνου. Εφαρμόζονται ποικίλες παραλλαγές ορίων ελέγχου: 7, 8, 9 ή 12 τιμές μιας και αυτής πλευράς της μέσης αριθμητικής, τα οποία διαθέτουν διαφορετική ευαισθησία για τα συστηματικά σφάλματα. 301

303 Σχήμα Κανόνας 10x : δέκα διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου βρίσκονται από τη μία πλευρά της x Ο Εσωτερικός Ποιοτικός Έλεγχος της Ορθότητας (ακρίβειας) (Συσσωρευτικό Αθροιστικό Διάγραμμα (Cusum chart, CUSUM) Η χρήση της μεθόδου των συσσωρευτικών σφαλμάτων CUSUM, (CUMmulative Sum) δίνει τη δυνατότητα γρήγορης ανίχνευσης συστηματικών λαθών (ακόμη και μικρών), σε αντίθεση με το διάγραμμα Levey-Jennings που ανιχνεύει τυχαία και συστηματικά σφάλματα (Westgard et al., 1977). Οι καθημερινές διαφορές του υλικού ελέγχου από τη μέση τιμή της προηγούμενης περιόδου αθροίζονται, καθώς διατηρείται το αλγεβρικό πρόσημο. Με άλλα λόγια, το συσσωρευτικό άθροισμα είναι η τρέχουσα ολική τιμή που προκύπτει από το αλγεβρικό άθροισμα των τιμών, που λαμβάνονται από τη διαφορά των καθημερινών τιμών προσδιορισμού του υλικού ελέγχου από τη μέση τιμή του. Προτείνεται το όριο ελέγχου +2,7SD. Πάνω από αυτή τιμή θεωρείται ότι υπάρχει συστηματικό σφάλμα με βαθμό σημαντικότητας υπολογίσιμο στατιστικά (Σχήμα 11.15). Σχήμα Διάγραμμα CUSUM. 302

304 Παράδειγμα Στο Πίνακα 11.1 δίνονται οι υπολογισμοί, απαραίτητοι για τη μέθοδο αυτή. Ημέρα Ληφθείσα τιμή (xi) xi -x CUSUM Πίνακας 11.1 CUSUM έλεγχος των αποτελεσμάτων προσδιορισμού του ουρικού οξέος (ενδεικτικά αποτελέσματα προηγούμενης περιόδου x = 340 μmol/l, SD = 15,7 μmol/l). Σχολιασμός: Την 12 η ημέρα τίθεται σε ενέργεια το CUSUM: το σωρευτικό άθροισμα των διαφορών (47,00 μmol/l) είναι πάνω από το 2,7 SD (42,39 μmol/l) είναι εμφανής η ύπαρξη συστηματικού σφάλματος, όταν στο ίδιο χρονικό διάστημα η ληφθείσα τιμή μmol/l, εκτιμώμενη με το κλασικό χάρτη ελέγχου είναι «υπό έλεγχο», γιατί βρίσκεται στο διάστημα μmol/l (x + 2SD). Στο Σχήμα 11.16, η απόκλιση από το στόχο απεικονίζεται γραφικά με τέτοιο τρόπο, ώστε κάθε σημείο που σημειώνεται να αντιστοιχεί στο σύνολο όλων των αποκλίσεων από την τιμή στόχο. Στον οριζόντιο άξονα καταγράφονται οι ημέρες, ενώ στον κάθετο το αθροιστικό ποσό της απόκλισης, π.χ. αν τα καθημερινά αποτελέσματα ενός ορού ελέγχου για μια ουσία είναι x 1, x 2, x 3 και x η τιμή στόχος θα είναι C 1 = x 1 x, C 2 = C 1 + (x 2 x ), C 3 = C 2 + (x 3 x ). 303

305 Σχήμα Διάγραμμα αθροιστικών συνόλων (CUSUM chart) με βάση τις τιμές του Πίνακα Με το διάγραμμα CUSUM (CUSUM chart) μεγιστοποιούνται οι τάσεις που δημιουργούνται από τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από ανάλυση σε ανάλυση και γίνονται πολύ πιο εμφανείς οι αποκλίσεις από τη τιμή στόχο. Με το διάγραμμα CUSUM ανιχνεύεται είτε μια εκτροπή, είτε μια μετατόπιση O Eξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας Ορισμός του Εξωτερικού ελέγχου Ποιότητας O εξωτερικός ή διεργαστηριακός έλεγχος ποιότητας αποτελεί έναν αποτελεσματικό τρόπο παρακολούθησης της επίδοσης του εργαστηρίου και ελέγχου της εγκυρότητας του συνολικού ποιοτικού συστήματος. Εφαρμόζεται από ένα κεντρικό φορέα κρατικό ή ιδιωτικό επιτρέποντας την αντικειμενική εκτίμηση της απόδοσης όλων των εργαστηρίων που συμμετέχουν στο πρόγραμμα με αποστολή των ίδιων δειγμάτων έλεγχου στα ενδιαφερόμενα εργαστήρια, τα οποία προσδιορίζουν προκαθορισμένες εξετάσεις ή παραμέτρους και αποστέλλουν τα αποτελέσματα πίσω στον φορέα Βασικοί στόχοι του Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας Οι βασικοί στόχοι του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας είναι: ο έλεγχος της ακρίβειας των αποτελεσμάτων, η αναβάθμιση της εργασίας και της ποιότητας τον εργαστηρίων, η εξασφάλιση επαναληπτικότητας των αποτελεσμάτων, ο εκσυγχρονισμός και η ευθυγράμμιση με τα υπόλοιπα εργαστήρια και τα παγκόσμια πρότυπα. Ο εξωτερικός έλεγχος ποιότητας είναι προαιρετικός, εφαρμόζεται ως προς ένα εξωτερικό πρότυπο από έναν εξωτερικό φορέα και βασίζεται στα αποτελέσματα της ανάλυσης του ίδιου δείγματος σε τακτά χρονικά διαστήματα από έναν μεγάλο αριθμό εργαστηρίων. Η σύγκριση και η σύγκλιση των επιδόσεων μεταξύ των εργαστηρίων αποτελεί έναν από τους δύσκολους στόχους του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Κατά κανόνα, ο εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος αφορά κυρίως την επαναληπτικότητα (τυχαία σφάλματα), ενώ ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος σχετίζεται με την ακρίβεια (συστηματικά σφάλματα). 304

306 Ο εντοπισμός και η λήψη διορθωτικών μέτρων για την αποφυγή ή την εξάλειψη λαθών αποτελεί καθημερινή απασχόληση του επιστημονικού προσωπικού των εργαστηρίων. Προς αυτή τη κατεύθυνση συμβάλλουν συγκεκριμένα διεθνή πρότυπα (π.χ. ISO/IEC 15189: 2012) Διεργαστηριακά Προγράμματα ELQA (Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας Διαγνωστικών και Βιοαναλυτικών Εργαστηρίων Στο ΤΕΙ Θεσσαλίας, με φορέα υλοποίησης το Ερευνητικό Εργαστήριο Ελέγχου Ποιότητας Υπηρεσιών Υγείας, σχεδιάζονται, οργανώνονται και υλοποιούνται διεργαστηριακά προγράμματα για ιατρικά και βιοαναλυτικά εργαστήρια, με την επωνυμία «Προγράμματα ELQA». Τα Προγράμματα ELQA πραγματοποιούνται στο σύνολό τους διαδικτυακά, μέσω του πληροφοριακού συστήματος τους, στην ηλεκτρονική διεύθυνση: Τα προσφερόμενα διεργαστηριακά προγράμματα είναι: Α. Για τα ιατρικά εργαστήρια: Πρόγραμμα Κλινικής Βιοχημείας Πρόγραμμα Ανοσολογίας Πρόγραμμα Αιματολογίας Πρόγραμμα HbA 1c Πρόγραμμα Πήξης Πρόγραμμα Καρδιακών Δεικτών Β. Για τα βιοαναλυτικά εργαστήρια: Πρόγραμμα Φυσικοχημικών Παραμέτρων Ύδατος Πρόγραμμα Μικροβιολογικών Παραμέτρων Ύδατος Πρόγραμμα για Λύματα Τα Διεργαστηριακά Σχήματα Ελέγχου Ικανότητας ELQA ικανοποιούν πλήρως τις απαιτήσεις του ΕΛΟΤ ΕΝ ISO/IEC 17043:2011, παρέχοντας στα ενδιαφερόμενα εργαστήρια τις πληροφορίες που αναφέρονται στο έγγραφο του ΕΣΥΔ ΠΔΙ/02/02/ Αξιολόγηση των επιδόσεων των εργαστηρίων σε προγράμματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας Στα Διεργαστηριακά Προγράμματα ELQA, το ίδιο δείγμα ελέγχου διανέμεται στα συμμετέχοντα εργαστήρια, τα οποία το αναλύουν ταυτόχρονα μέσα σε προκαθορισμένα χρονικά όρια. Στη συνέχεια, τα εργαστήρια καταχωρούν τα αποτελέσματά τους στο/στα προγράμματα που συμμετέχουν. Τα αποτελέσματα από τα συμμετέχοντα εργαστήρια υποβάλλονται ηλεκτρονικά σε κατάλληλες φόρμες μέσω του πληροφοριακού συστήματος του προγράμματος. Τα Προγράμματα ELQA - Διεργαστηριακά Σχήματα Ελέγχου Ικανότητας για Διαγνωστικά & Βιοαναλυτικά Εργαστήρια αναλύουν τα αποτελέσματα των συμμετεχόντων εργαστηρίων σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα (βλέπε ISO/IEC 13528:2005). Τα αποτελέσματα αναλύονται συνήθως μαζί (λαμβάνοντας υπόψη τη διακύμανση της κάθε χρησιμοποιούμενης μεθόδου ανάλυσης), ώστε να υπολογιστεί η τιμή στόχος για κάθε ελεγχόμενη εξέταση παράμετρο. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τα συμμετέχοντα εργαστήρια αναλύονται από το εκάστοτε διεργαστηριακό πρόγραμμα το συντομότερο δυνατό, έτσι ώστε η τελική έκθεση αξιολόγησης να μπορεί να κοινοποιηθεί στα συμμετέχοντα εργαστήρια, το αργότερο, μέσα σε 4 εβδομάδες από την ημερομηνία λήξης της προθεσμίας υποβολής των αποτελεσμάτων. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων πραγματοποιείται με τον υπολογισμό των SDI ή των z-scores, για τα Διαγνωστικά και τα Βιοαναλυτικά Εργαστήρια, αντίστοιχα, τα οποία χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό τυχόν ακραίων τιμών. Για την περαιτέρω βοήθεια της ερμηνείας των αποτελεσμάτων δίνονται συνοπτικά στατιστικά στοιχεία και διαγράμματα. 305

307 Μετά την ολοκλήρωση του εκάστοτε διεργαστηριακού προγράμματος, συντάσσεται μία Έκθεση Αξιολόγησης, που αξιολογεί τις επιδόσεις του κάθε εργαστηρίου, ανά ελεγχόμενη εξέταση παράμετρο. Η Έκθεση Επίδοσης συνήθως περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: Εισαγωγή γενικά στοιχεία Κύρια χαρακτηριστικά του προγράμματος Συγκεντρωτικό πίνακα με τις επιδόσεις του εργαστηρίου ανά ελεγχόμενη εξέταση - παράμετρο Αναλυτική στατιστική ανάλυση ανά εξέταση - παράμετρο, η οποία περιλαμβάνει περιγραφικά στατιστικά στοιχεία και διαγράμματα Τα ακραία αποτελέσματα (ακραία αποτελέσματα είναι αυτά που κρίνονται ασυμβίβαστα σύμφωνα με τις εκάστοτε τιμές στόχους) Σχόλια και παρατηρήσεις των τεχνικών συμβούλων (σχετικά με τις πιθανές αιτίες εμφάνισης ακραίων αποτελεσμάτων, επίδραση των μεθόδων ανάλυσης των δειγμάτων ελέγχου στην συνολική απόδοση, κ.α.) Δείγματα των εκθέσεων επίδοσης για διαγνωστικά και για βιοαναλυτικά Εργαστήρια υπάρχουν στην ηλεκτρονική διεύθυνση: (αριστερό κάθετο menu > επιλογή «Εκθέσεις Επίδοσης Εργαστηρίων». Συνοπτικά, αξιολογείται η επίδοση των εργαστηρίων με υπολογισμό κατάλληλων παραμέτρων, όπως των SDI ή των z-score, σύμφωνα με την εξίσωση: z-score = (X i Median) / normiqr (Εξίσωση 7.15) όπου: X i το αποτέλεσμα του εργαστηρίου, Median η διάμεση τιμή και normiqr το τυποποιημένο ενδοτεταρτημοριακό εύρος. Τα αποτελέσματα των οποίων οι απόλυτες τιμές z-score που είναι μεγαλύτερες του 3 θεωρούνται μη ικανοποιητικά. Αποτελέσματα με απόλυτες τιμές z-score μεταξύ 2 και 3 πρέπει να ελεγχθούν. Στα Προγράμματα ELQA, η επίδοση των εργαστηρίων με βάση τις απόλυτες τιμές των z-score κρίνεται ως ακολούθως: αν z-score 0,25 τότε η επίδοση είναι εξαιρετική, αν 0,25 < z-score 0,68 τότε η επίδοση είναι καλή, αν 0,68 < z-score 2,0 τότε η επίδοση είναι ικανοποιητική, αν 2,0 < z-score 3,0 τότε η επίδοση είναι ελεγχόμενη, αν z-score > 3,0 τότε η επίδοση είναι μη ικανοποιητική. Για τις παραμέτρους με αποτελέσματα με απόλυτη τιμή z-score > 3 συνιστάται στα εργαστήρια να πάρουν διορθωτικά μέτρα για τον προσδιορισμό τους, με βάση το σύστημα ποιότητάς τους Διαγράμματα Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων επιδόσεων των εργαστηρίων, εκτός από τα z-scores και τα συνοπτικά στατιστικά στοιχεία, πραγματοποιείται και με τη βοήθεια διαγραμμάτων. Τα δύο διαγράμματα που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι το διάγραμμα τύπου Levey-Jennings των z-scores του εργαστηρίου και όλων των εργαστηρίων, το ιστόγραμμα των z-scores σε διάταξη, το διάγραμμα Youden, κ.α. Τα διαγράμματα αυτά βοηθούν τον συντονιστή και τους τεχνικούς συμβούλους του προγράμματος στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων και είναι πολύ χρήσιμα για τα συμμετέχοντα εργαστήρια, τα οποία μπορούν πολύ εύκολα να δουν αν έχουν ακραίες τιμές στα αποτελέσματά τους και αν διαφέρουν τα αποτελέσματά τους από τα αποτελέσματα των άλλων εργαστηρίων. Α. Το ιστόγραμμα Κατανομής Συχνοτήτων Το ιστόγραμμα κατανομής συχνοτήτων (Σχήμα 11.17) αποτελεί την απεικόνιση των τιμών όλων των εργαστηρίων και δημιουργείται από ένα κάθετο άξονα στον οποίο περιέχεται ο αριθμός των συμμετεχόντων 306

308 εργαστηρίων και ένα οριζόντιο άξονα στον οποίο περιέχονται ομάδες συγγενών τιμών και τα όρια ελέγχου (μέση τιμή ± 2SD). Το ύψος κάθε στήλης αντιπροσωπεύει τη συχνότητα με την οποία εμφανίζονται οι τιμές κάθε ομάδας. Η τιμή που αντιστοιχεί στη κορυφή είναι η μέση τιμή όλων των εργαστηρίων, αυτή αντιστοιχεί με τη τιμή στόχο και εκφράζει τη μέγιστη ακρίβεια. Σχήμα Ιστόγραμμα κατανομής συχνοτήτων. Στη περίπτωση που τα δεδομένα για τα εργαστήρια ομαδοποιούνται με βάση την αναλυτική μεθοδολογία και το είδος του αναλυτή, μπορεί στο ίδιο ιστόγραμμα να αναπαρασταθούν δύο ή περισσότερες διαφορετικές κατανομές με διαφορετική μέση τιμή και εύρος τιμών. Β. Ραβδόγραμμα Z-score σε διάταξη Στο διάγραμμα αυτό παρουσιάζεται το z-score κάθε εργαστηρίου με μπάρες κατά σειρά μεγέθους (Σχήμα 11.18). Από αυτό, κάθε εργαστήριο μπορεί εύκολα να συγκρίνει τις επιδόσεις του σε σχέση με τα άλλα εργαστήρια. Σχήμα Ραβδόγραμμα Z-score. 307

309 Το διάγραμμα αυτό έχει όρια γραμμές (επάνω και κάτω) στις τιμές ±3, έτσι ώστε οι ακραίες τιμές να είναι αναγνωρίσιμες με σαφήνεια (τα εργαστήρια των οποίων η μπάρα επεκτείνεται πέρα από τις cut-off γραμμές). Τα πλεονεκτήματα αυτών των διαγραμμάτων είναι ότι μέσω αυτών για κάθε εργαστήριο προσδιορίζονται με σαφήνεια οι ακραίες τιμές του. Γ. Διάγραμμα Youden Στις περιπτώσεις που χρησιμοποιούνται δύο δείγματα ελέγχου διαφορετικών συγκεντρώσεων υπολογίζονται δύο τιμές SDI, μία για κάθε δείγμα ελέγχου (Youden, 1959). Η απεικόνιση των δύο τιμών SDI δίνεται με το διάγραμμα Youden. Αυτό χρησιμοποιεί τη γραφική αναπαράσταση των δύο διαφορετικών δειγμάτων ελέγχου για να απεικονίσει την ακρίβεια και την επαναληπτικότητα. Το διάγραμμα Υouden είναι ένα τετράγωνο διάγραμμα του οποίου οι τέσσερις πλευρές περιέχουν ανά δύο τα όρια τιμών -4 SDΙ έως +4 SDΙ για κάθε ένα από τα δύο δείγματα ελέγχου (Σχήμα 11.19). Η τιμή κάθε εργαστηρίου συμβολίζεται με μία κουκίδα (σημείo). Οι κουκίδες στο κέντρο αντιστοιχούν στα εργαστήρια με την μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια. Οι κουκίδες που βρίσκονται συγκεντρωμένες σε κάθε μία από τις δύο διαγώνιους του τετραγώνου αντιστοιχούν σε εργαστήρια με την καλύτερη μεταξύ τους αναπαραγωγιμότητα. Σχήμα Διάγραμμα Υouden. Ως οδηγός για την ερμηνεία των διαγραμμάτων Youden: σημεία (τελείες) που βρίσκονται κοντά στην διαγώνιο (45 ο ) και μέσα στο τετράγωνο με όρια ±2SD δείχνουν αποδεκτά αποτελέσματα, σημεία (τελείες) που βρίσκονται κοντά στην διαγώνιο (45 ο ), αλλά έξω από το τετράγωνο με όρια ±2SD δείχνουν συστηματικό σφάλμα, σημεία που βρίσκονται μακριά από τη διαγώνιο (45 ο ) δείχνουν τυχαίο σφάλμα. 308

310 Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Σχήμα (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Aναφορές 1. ΓΑΛΑΝΗΣ, Π. (2009) Πολυμεταβλητή ανάλυση επιδημιολογικών δεδομένων. Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 26(3), p ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2007) Τα διαγράμματα ελέγχου στο εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Ιατρική επιθεώρηση ΙΚΑ, 11(7), p ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2007) Εφαρμογή της μεθόδου Delta Check σε διάφορους τύπους αναλυτών. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, 52(4), p ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Εξειδικευμένα Θέματα Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 5. YOUDEN, W. (1959) Graphical diagnosis of interlaboratory test results. Industrial Quality Control, 1, KLAUS, D. & LLOYD, C. (1998) Guidelines for calibration in analytical chemistry. Pure & Appl Chem, 70(4), p KANAGASABAPATHY, Α. & KUMARI, S. (2000) Guidelines on Standard Operating Procedures for Clinical Chemistry. New Delhi: WHO. 8. KARKALOUSOS, P. & EVANGELOPOULOS, A. (2011) Quality control in clinical laboratories. In: Applications and Experiences of Quality Control. Zagreb: Intech Books. 9. KARKALOUSOS, P. (2007) The schemes of External quality control in laboratory medicine in Balkans. Journal of Medical Biochemistry, 26(3), p SHEWHART, W. (1931) Economic control of quality of manufactured product. New York: Van Nostrand- Reinhold. 11. SYNDERMAN, W. (1992) The history of proficiency testing/quality control. Clin Chem, 38(7), p WESTGARD, J., GROTH, T., ARONSON, T. DE VERDIER, C. (1977) A multirule Shewhart chart for quality control in clinical chemistry. Clin Chem, 23(10), p WESTGARD, J., GROTH, T., HAINLINE, A. (1981) A multirule Shewhart chart for quality control in clinical chemistry. Clin Chem, 27(3), p (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). 309

311 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 o Η ΑΤΟΜΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι βασικές ιδιότητες των ιχνοστοιχείων και θα εκτεθεί η αναγκαιότητα του ποσοτικού προσδιορισμού τους σε βιολογικά υγρά. Πιο συγκεκριμένα θα παρουσιαστεί η ατομική απορρόφηση ως μέθοδος αναφοράς με τις σημαντικότερες τεχνικές: την φλόγα ακετυλενίου - αέρα και τον φούρνο γραφίτη. Ειδικότερα θα περιγραφούν η θεωρητική αρχή της μεθόδου, τα μέρη και ο τρόπος λειτουργίας και των δύο τύπων των φασματοφωτομέτρων ατομικής απορρόφησης. Θα αναπτυχθεί η προαναλυτική και η αναλυτική διαδικασία και θα δοθούν στοιχεία για την ευαισθησία και την ακρίβεια των μεθόδων αυτών. Ακόμη, θα αναλυθεί ο τρόπος υπολογισμού των αποτελεσμάτων με παραδείγματα και θα δοθούν στοιχεία για τις τιμές αναφοράς. Τέλος, θα παρουσιαστούν οι απαραίτητες προδιαγραφές ασφαλούς εγκατάστασης αερίων για τη λειτουργία των φασματοφωτομέτρων ατομικής απορρόφησης. Προαπαιτούμενες γνώσεις Σε ότι αφορά το παρόν βιβλίο θα απαιτηθούν γνώσεις που αφορούν το Κεφάλαιο 1 (φωτομετρία) και το Κεφάλαιο 11 (έλεγχος ποιότητας). Χρήσιμες θα είναι και οι βασικές γνώσεις ανόργανης χημείας Εισαγωγή Τα Χημικά Στοιχεία του ανθρώπινου οργανισμού Μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί 81 στοιχεία στους ζωντανούς οργανισμούς από τα 92 συνολικά που φυσιολογικά συναντώνται στην επιφάνεια της γης. Από αυτά τα πέντε θεωρούνται βασικά δομικά υλικά. Αυτά είναι το άζωτο (Ν), το υδρογόνο (Η), ο άνθρακας (C), το οξυγόνο (O) και το θείο (S). Όλα αυτά μαζί με άλλα έξι όπως το κάλιο (K), το νάτριο (Na), το χλώριο (Cl), το ασβέστιο (Ca), το μαγνήσιο (Mg) και τον φώσφορο (P) αποτελούν το 99% της σύνθεσης των ζωντανών οργανισμών, κρατώντας σημαντικό ρόλο στην κυτταρική λειτουργία. Η συγκέντρωση τους στα βιολογικά υγρά προσδιορίζεται σε μονάδες g/l επιτρέποντας έτσι τον ακριβή προσδιορισμό τους. Πολλά όμως από τα υπόλοιπα στοιχεία όπως το σελήνιο (Se), ο ψευδάργυρος (Zn), το κοβάλτιο (Co), το μαγγάνιο (Mn) και το χρώμιο (Cr) υπάρχουν στον ανθρώπινο οργανισμό σε πολύ μικρές ποσότητες οι οποίες προσδιορίζονται σε μονάδες μg/l, ng/l κ.α. Επειδή στο παρελθόν δεν υπήρχε κατάλληλη μέθοδος για τον προσδιορισμό τόσο χαμηλών συγκεντρώσεων θεωρούσαμε ότι «συναντώνται σε ίχνη», οπότε και επικράτησε ο όρος ιχνοστοιχεία (Iyengar, 1997) H προέλευση των Ιχνοστοιχείων Η αρχική προέλευση των ιχνοστοιχείων ανάγεται στην παρουσία τους στα πετρώματα του φλοιού της γης, απ όπου περνούν στη διατροφική αλυσίδα του ανθρώπου. Η δράση των ηφαιστείων, η διαβρωτική ικανότητα του νερού και, κυρίως η επίδραση του ανθρώπου στη φύση, έχουν προκαλέσει ανακατανομή των ιχνοστοιχείων, έτσι ώστε όλα να συναντώνται σχεδόν παντού. Σε αυτό συνετέλεσε και η ανάπτυξη της χημικής βιομηχανίας, η ρύπανση του περιβάλλοντος, η χρήση λιπασμάτων, το διεθνές εμπόριο τροφίμων, και οι αλλαγές στις διατροφικές συνήθειες των λαών. Τα μέταλλα, σε αντίθεση με τις περισσότερες τοξικές οργανικές ενώσεις, δεν αποικοδομούνται, αλλά συσσωρεύονται στο έδαφος, τα νερά και τους βιολογικούς ιστούς. Σήμερα τα ιχνοστοιχεία μετρώνται τακτικά σε άτομα, που εκτίθενται σε αυτά μέσω της εργασίας τους (π.χ. εργάτες βιομηχανίας, μεταλλουργίας) και γι αυτό οι μέθοδοι ανάλυσης που θα περιγραφούν σε αυτό το κεφάλαιο αφορούν κυρίως βιολογικά δείγματα επαγγελματικά εκτεθειμένων ατόμων. Μετρώνται όμως και σε 310

312 παιδιατρικά δείγματα (π.χ. για την διάγνωση μεταβολικών νοσημάτων π.χ. νόσο Wilson) αλλά και σε ενήλικες για δερματολογικές (Cr, Ni), νεφρολογικές παθήσεις (π.χ. Al) κ.α. (WHO, 2003 Tietz, 1995) Ο ρόλος των Ιχνοστοιχείων Ο ανθρώπινος οργανισμός χρειάζεται καθημερινά ιχνοστοιχεία για την πέψη, την αναπνοή, τον μεταβολισμό, την αποτοξίνωση, την αποκατάσταση βλαβών και μεταλλάξεων όπως τα: Fe, Cu, Co, Zn, Se κ.α. Τα ιχνοστοιχεία που έχουν αναγνωρισμένο βιολογικό ρόλο, είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού, και η έλλειψη τους προκαλεί νόσο και ορίζονται με τον Aγγλικό όρο «essential», δηλαδή «απαραίτητα» (Iyengar, 1997). Για τα ιχνοστοιχεία αυτά υπάρχουν στον ανθρώπινο οργανισμό διάφοροι μεταβολικοί δρόμοι για την συντήρηση των απαραίτητων αποθεμάτων (Πίνακας 12.1). Κατηγορία ιχνοστοιχείων Μεταλλοένζυμα Ενεργοποιητές ενζύμων Άλλες φυσιολογικές λειτουργίες Φάρμακα Βαρέα μέταλλα Παραδείγματα και δράση στον οργανισμό Σταθεροποιούν τη στερεοχημική δομή της αποπρωτεϊνης των ενζύμων. Διευκολύνουν την αναγνώριση του κατάλληλου υποστρώματος, την ένωση υποστρώματος ενεργού κέντρου, και τη χημική μετατροπή. Η έλλειψή τους οδηγεί στην απώλεια της ενζυμικής δράσης. Π.χ. Fe στην αιμοσφαιρίνη, Ι 2 στο θυρεοειδή και Co στη βιταμίνη B 12. Π.χ. λίθιο (Li), χρυσός (Au) και πλατίνα (Pt). Π.χ. μόλυβδος (Pb), υδράργυρος (Hg), κάδμιο (Cd), αλουμίνιο (Al) και αρσενικό (As). Πίνακας 12.1 Δράσεις των ιχνοστοιχείων στον ανθρώπινο οργανισμό 12.2 Η δράση των τοξικών Ιχνοστοιχείων Τα τοξικά μέταλλα (Πίνακες 12.1, 12.2) δεν μπορούν να εκπληρώσουν τον ίδιο ρόλο, όπως τα διατροφικά μεταλλικά στοιχεία. Ως εκ τούτου, η παρουσία τους αποδιοργανώνει την ενζυμική δραστηριότητα (Agency for toxic substances, 2008). Τα βαρέα μέταλλα διαταράσσουν το μεταβολισμό με δύο κύριους τρόπους: συσσωρεύονται και διαταράσσουν τη λειτουργία ζωτικών οργάνων, όπως τη καρδιά, τον εγκέφαλο, τα νεφρά, τα οστά και το ήπαρ, κ.λπ., εκτοπίζουν ζωτικής σημασίας ιχνοστοιχεία από ενεργές θέσεις. Η περίσσεια των τοξικών μετάλλων συγκεντρώνεται αθροιστικά σε διάφορους ιστούς, αν και υπάρχει επιλεκτική προτίμηση σε ορισμένα όργανα (Πίνακας 12.2). Όργανο Εγκέφαλος Θυρεοειδής Καρδιά Αναπνευστικές Οδοί Ήπαρ Νεφροί Λίπος Οστά Μέταλλο Μόλυβδος, υδράργυρος, μαγγάνιο, αλουμίνιο Κοβάλτιο, ιώδιο, σελήνιο Ασβέστιο, μαγνήσιο, νικέλιο Αρσενικό, κάδμιο, νικέλιο, χρώμιο Σελήνιο, νικέλιο, χρώμιο, αρσενικό Υδράργυρος, κάδμιο, αρσενικό Κάδμιο Κάδμιο, μόλυβδος, υδράργυρος Πίνακας 12.2 Περιοχές παρουσίας τοξικών μετάλλων στον ανθρώπινο οργανισμό. Στο σύγχρονο αστικό και βιομηχανικό περιβάλλον συναντάται σημαντική διασπορά τοξικών ιχνοστοιχείων. Το σύνολο της έκθεσης αυτής ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ ανθρώπου και περιβάλλοντος καθώς και η βιολογική τους διακύμανση καθορίζουν τα όρια της συνήθους συγκέντρωσης των ιχνοστοιχείων στο γενικό πληθυσμό (Πίνακας 12.3). Θα πρέπει να τονιστεί ότι επειδή τα τοξικά μέταλλα δεν 311

313 έχουν βιολογικό ρόλο και η έλλειψη τους δεν προκαλεί νόσο, τα όρια των συγκεντρώσεων τους στα βιολογικά υγρά στον γενικό πληθυσμό δεν μπορούν να χαρακτηρίζονται ως «φυσιολογικές τιμές». Σωστότερος είναι ο όρος «όρια αναφοράς» που υπολογίζονται στατιστικά σε υγιή, μη επαγγελματικά εκτεθειμένα άτομα (ACGIH, 1996). Όρια αναφοράς Μέταλλο Άνδρες Γυναίκες Pb Ολικό αίμα 106 μg/l 60 μg/l Cd - Ολικό αίμα Μη καπνιστές Καπνιστές Cr Ολικό αίμα (Cr III+VI) Ορός αίματος (Cr III) Ούρα 24 h Ni Ορός αίματος Ούρα As Ούρα Χρόνια δηλητηρίαση Οξεία δηλητηρίαση Hg Ολικό αίμα Ούρα 24 h 0,8 μg/l 1.6 μg/l 0,7-28 μg/l 0,05-0,5 μg/l 0,1-2 μg/l 0,1-1 μg/l 0,1-1 μg/l μg/l μg/l μg/l 6-60 μg/l < 20 μg/l 312 0,9 μg/l 1,4 μg/l 0,7-28 μg/l 0,05-0,5 μg/l 0,1-2 μg/l 0,1-1 μg/l 0,1-1 μg/l μg/l μg/l μg/l 6-60 μg/l < 20 μg/l Πίνακας 12.3 Όρια αναφοράς σημαντικών τοξικών ιχνοστοιχείων σε βιολογικά υγρά. Στην επαγγελματική έκθεση ως δείκτης ασφαλούς έκθεσης χρησιμοποιείται η «οριακή τιμή έκθεσης» και για την εκτίμηση της νόσου συνυπολογίζονται και άλλοι βιοχημικοί δείκτες Μέθοδοι προσδιορισμού Ιχνοστοιχείων Ορισμένα μέταλλα, όπως ο σίδηρος και ο χαλκός σχηματίζουν έγχρωμα σύμπλοκα και έτσι είναι εφικτός ο χρωματομετρικός προσδιορισμός τους (Κεφάλαιο 1). Τα περισσότερα ιχνοστοιχεία όμως δεν έχουν αυτή τη δυνατότητα και επιπλέον βρίσκονται στα βιολογικά υγρά σε συγκεντρώσεις περίπου 6 φορές χαμηλότερες από αυτές των άλλων δεικτών της κλινικής χημείας (π.χ. γλυκόζη, ουρία, ηλεκτρολύτες). Η ανάγκη προσδιορισμού συνεχώς χαμηλότερων τιμών συγκεντρώσεων των ιχνοστοιχείων απαιτεί αναλυτικές μεθόδους υψηλής ευαισθησίας με χαμηλά όρια ανίχνευσης (Georgiou et al., 1994). Μια από τις πιο αξιόπιστες μεθόδους που χρησιμοποιούνται σήµερα είναι η φασματοσκοπία ατοµικής απορρόφησης (Atomic Absorption Spectroscopy). Στα πλεονεκτήματα της, περιλαμβάνονται η ταχύτητα, η καλή επαναληψιμότητα και η δυνατότητα αυτοματοποίησης. Μειονέκτημα της είναι η αδυναµία ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλών ιχνοστοιχείων ταυτόχρονα. Το πρόβλημα αυτό προσπάθησε να επιλύσει μια άλλη τεχνική η φασματομετρία μάζας με επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα (ICP-MS) στην οποία όμως, τα όρια ανίχνευσης δεν είναι τόσο χαμηλά, ώστε να μπορεί να εφαρμοστεί σε βιολογικά δείγματα Δειγματοληψία Για τον προσδιορισμό των ιχνοστοιχείων απαιτείται συνήθως αίμα ή ούρα. Για το μόλυβδο, το κάδμιο, το αρσενικό και τον υδράργυρο, τα οποία βρίσκονται μέσα στα ερυθρά αιμοσφαίρια, απαιτείται η λήψη ολικού αίματος με αντιπηκτικό EDTA (σωληνάριο γενικής αίματος), ενώ για τα υπόλοιπα ιχνοστοιχεία απαιτείται ορός αίματος. Ο χρόνος της δειγματοληψίας και η λήψη τροφής δεν επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης. Συνήθως για να έχουμε ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό μιας ουσίας στα ούρα χρειάζεται να προηγηθεί συλλογή ούρων 24 ώρου. Αντίθετα, στις αναλύσεις ιχνοστοιχείων στα ούρα αυτό δεν είναι απαραίτητο, διότι ο ρυθμός

314 αποβολής τους είναι σταθερός. Έτσι, αρκεί ένα μέρος των ούρων από τα πρώτα πρωινά ούρα, τα οποία συλλέγονται σε καθαρό ουροσυλλέκτη. Εναλλακτικά μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε οποιοδήποτε τυχαίο δείγμα ούρων. Όμως σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούμε την τιμή της κρεατινίνης του τυχαίου δείγματος ως δείκτη πυκνότητας των ούρων, και το αποτέλεσμα εκφράζεται ανά γραμμάριο κρεατινίνης. Π.χ. έστω ότι η τιμή νικελίου στα ούρα είναι 1,8 μg/l και η τιμή κρεατινίνης 0,9 g/l. Διαιρούμε 1,8/9 = 0,2, απλοποιούμε τις μονάδες του κλάσματος και το αποτέλεσμα εκφράζεται σε μg Νικελίου/γραμμάριο κρεατινίνης. Η συντήρηση και η μεταφορά των δειγμάτων γίνεται με πωματισμένα σωληνάρια, σε ψύξη 2-8 ο C. Τα δείγματα είναι σταθερά για 5-7 μέρες, ενώ η φύλαξή τους για μεγαλύτερο διάστημα απαιτεί κατάψυξη (-18 ο C). Ο σημαντικότερος παράγοντας λάθους κατά τη δειγματοληψία είναι η πιθανή επιμόλυνση των δειγμάτων, ιδιαίτερα αν η λήψη γίνεται μέσα στο χώρο εργασίας. Για το λόγο αυτό δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στον καλό καθαρισμό του δέρματος πριν την φλεβοκέντηση, και στη χρήση κλειστού συστήματος αιμοληψίας με πωματισμένα ειδικά σωληνάρια. Τα περισσότερα μέταλλα είναι δυνατόν να προσδιοριστούν και σε πιο σπάνια δείγματα όπως μαλλιά, νύχια, οστά και παρασκευάσματα βιοψιών. Οι αναλύσεις τριχών και νυχιών αποκαλύπτουν την συνολική έκθεση στην πάροδο του χρόνου ή προηγούμενες εκθέσεις, αλλά δεν δείχνουν τις πρόσφατες εκθέσεις. Οι συγκεντρώσεις των ιχνοστοιχείων στο αίμα και στα ούρα αντικατοπτρίζουν τόσο χρόνιες εκθέσεις αλλά και εκείνες που προέκυψαν τις τελευταίες μέρες. Τα δείγματα προσδιορισμού ιχνοστοιχείων απαιτούν ιδιαίτερη κατεργασία (βλ. παρακάτω) και προσοχή στη συλλογή τους. Μερικά δείγματα συλλέγονται δύσκολα, ενώ πολλές φορές υπάρχει ο κίνδυνος επιμόλυνσης. Η επιμόλυνση καθιστά πολλά δείγματα ακατάλληλα για τη διάγνωση των επαγγελματικών παθήσεων (Georgiou et al., 1991 Tietz, 1995) Επεξεργασία Δειγμάτων Σε πολλές περιπτώσεις απαιτείται η αραίωση των δειγμάτων, έτσι ώστε να μειωθούν πιθανές παρεμβολές κατά την ανάλυση. Π.χ. για τον προσδιορισμό κάποιων μετάλλων (όπως χρώμιο, νικέλιο) στον ορό του αίματος, απαιτείται αραίωση του δείγματος με απεσταγμένο νερό, ενώ για τον προσδιορισμό άλλων μετάλλων που βρίσκονται μέσα στα ερυθρά αιμοσφαίρια (π.χ. μόλυβδος, κάδμιο), απαιτείται η αραίωση του με χηλικούς παράγοντες (Triton X-100). Οι χημικοί παράγοντες καταστρέφουν τις μεμβράνες των αιμοσφαιρίων και απελευθερώνουν τα βαρέα μέταλλα από αυτά. Για την αύξηση της αναλυτικής ευαισθησίας εφαρμόζεται επίσης η χημική μετατροπή του υποστρώματος χρησιμοποιώντας ειδικό διάλυμα (modificator), διαφορετικό για κάθε δείγμα και μέταλλο. Ιδιαίτερη κατεργασία των δειγμάτων προς σχηματισμό υδριδίων απαιτείται για τον προσδιορισμό του υδραργύρου και του αρσενικού (Πίνακας 12.4). Μέταλλο Δείγμα/ Αραίωση Υλικό Αραίωσης & Modificator Τύπος Ατοµοποιητή Μόλυβδος & Κάδμιο Ολικό αίμα 1/20 Triton X-100 & Φούρνος γραφίτη NH 4H 2PO 4 Αρσενικό & Υδράργυρος Ολικό αίμα 1/3 Triton X-100 & Φούρνος γραφίτη Ni(NO 3) 2 6H 2O Γεννήτρια Υδριδίων Χαλκός & Ψευδάργυρος Ορός αίματος 1/10 Ούρα 1/1 Υπερκαθαρό νερό & K 3PO 4, NH 4NO 3 Φλόγα Φλόγα Χρώμιο & Νικέλιο Ορός αίματος 1/10 Υπερκαθαρό νερό Φούρνος γραφίτη Αλουμίνιο Ορός αίματος Mg(NO 3) 26H 2Ο & Ca(NO 3) 24H 2Ο Φούρνος γραφίτη Πίνακας 12.4 Προαναλυτική κατεργασία δειγμάτων για τον προσδιορισμό ιχνοστοιχείων σε βιολογικά υγρά με τεχνικές ατομικής απορρόφησης. Αν στις ήδη πολύ μικρές, συγκεντρώσεις των ιχνοστοιχείων στα βιολογικά δείγματα, προστεθούν και οι μικροποσότητες ιχνοστοιχείων από τα χρησιμοποιούμενα υλικά της ανάλυσης (π.χ. σωληνάρια ρύγχη πιπετών, νερό και αραιωτικά διαλύματα), η ακρίβεια των αναλύσεων και η ορθότητα των αποτελεσμάτων θα μεταβληθεί δραματικά. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται επιμόλυνση. Μόνο τα εργαστήρια που διαθέτουν υψηλή καθαρότητα (Class 100, κατά τα διεθνή πρότυπα) μπορούν να εξασφαλίσουν τον έλεγχο της επιμόλυνσης σε ικανοποιητικό βαθμό. Για τον λόγο αυτό συνιστάται η τοποθέτηση συστημάτων καθαρισμού 313

315 του ατμοσφαιρικού αέρα του εργαστηρίου, η χρήση χημικώς καθαρών αντιδραστηρίων (HPLC grade), υπερκαθαρού νερού (< 18 μω) και το σχολαστικό πλύσιμο όλων των χρησιμοποιούμενων εργαστηριακών σκευών (Georgiou, 1992) H αρχή λειτουργίας Φασματοσκοπίας Ατοµικής Απορρόφησης Τα άτομα κάθε μετάλλου έχουν ένα κεντρικό πυρήνα και ένα αριθμό ηλεκτρονίων γύρω από αυτόν κατανεμημένα σε στοιβάδες. Η πιo σταθερή κατάσταση των ατόμων είναι αυτή για την οποία απαιτείται η μικρότερη δυνατή ενέργεια και ονομάζεται βασική κατάσταση. Αν σε κάποιο άτομο προσπέσει εξωτερική ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος (το οποίο θα είναι διαφορετικό για το κάθε μέταλλο), τότε τα ηλεκτρόνια της εξωτερικής του στοιβάδας θα μετακινηθούν σε ανώτερες ενεργειακά στοιβάδες απορροφώντας την προσπίπτουσα ενέργεια. Η ποσότητα ενέργειας που απαιτείται για την μετάβαση αυτή, είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης του μετάλλου (Pecsok et al., 1980). Η νέα αυτή κατάσταση των ατόμων ονομάζεται διεγερμένη κατάσταση και είναι εξαιρετικά ασταθής. Τα άτομα τείνουν να αποβάλλουν την ενέργεια που απορρόφησαν για να επανέλθουν στη βασική τους κατάσταση (Σχήμα 12.1). Σχήμα 12.1 Οι ενεργειακές μεταβολές των ατόμων. Όπου ΔΕ η ενέργεια που απορροφάται, Ε 1 η ενέργεια των ηλεκτρονίων στη βασική κατάσταση, Ε 2 η ενέργεια των ηλεκτρονίων στην διεγερμένη κατάσταση, h η σταθερά Max Planck, ν η συχνότητα του φωτός, e - το ηλεκτρόνιο. Επειδή τα ιχνοστοιχεία στα βιολογικά υγρά βρίσκονται ενωμένα με πρωτεΐνες, προκειμένου να τα απελευθερώσουμε καταφεύγουμε στην καύση της οργανικής ύλης (πυρόλυση). Κατόπιν με τη βοήθεια επιπλέον θερμικής ενέργειας τα μόρια του μετάλλου μετατρέπονται σε άτομα (ατομοποίηση), τα οποία απορροφούν την προσπίπτουσα ειδική ακτινοβολία και ανεβαίνουν σε ανώτερη ενεργειακή στοιβάδα. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ιχνοστοιχείων γίνεται με την μέτρηση της ακτινοβολίας που απορροφήθηκε, σύμφωνα με το νόμο Lambert-Beer (βλ. Ενότητα 1.1, Εξίσωση 1.1) με μικρή τροποποίηση: Α = -log 10(I 0/I) = k L C (Εξίσωση 12.1) όπου: I o η ένταση της αρχικής ακτινοβολίας (μετράται στην έξοδο της ειδικής λάμπας), I η ένταση της τελικής ακτινοβολίας (μετράται στον φωτοπολλαπλασιαστή), K ο συντελεστής απορρόφησης, L το μήκος της πορείας διέλευσης της ακτίνας του φωτός από τον ατοµοποιητή, C η συγκέντρωση του υπό ανάλυση μετάλλου Τα βασικά τμήματα των συστημάτων Ατομοποίησης Η φασματοσκοπία ατοµικής απορρόφησης είναι ακόµα και σήμερα η περισσότερο ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για τον προσδιορισµό των ιχνοστοιχείων και αποτελεί τη μέθοδο αναφοράς. Τα όρια ανίχνευσης στην AAS εξαρτώνται από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου ατοµοποιητή και το χηµικό υπόβαθρο του δείγματος. Υπάρχουν δύο βασικές μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται στην ατομική απορρόφηση, οι οποίες βασίζονται στην διαφορετική τεχνική ατομοποίησης, ο φούρνος γραφίτη και η φλόγα. Οι δύο μέθοδοι 314

316 μπορούν να καλύψουν ένα μεγάλο εύρος μέτρησης, ξεκινώντας από συγκεντρώσεις μικρότερες του 1 ng/l για το φούρνο γραφίτη μέχρι δεκάδων mg/l για τη φλόγα Οι πηγές Ακτινοβολίας για την Ατομική Απορρόφηση Η απαραίτητη ειδική ακτινοβολία µπορεί να παραχθεί είτε από λυχνίες κοίλης καθόδου (Hollow Cathod Lamp ή HCl), είτε από λυχνίες εκκένωσης χωρίς ηλεκτρόδια (Electrodeless Lamp ή EDL). Στις λυχνίες κοίλης καθόδου τα θετικά φορτισμένα ιόντα του αδρανούς αερίου, που βρίσκεται στο εσωτερικό της λάμπας, βομβαρδίζουν το ηλεκτρόδιο καθόδου. (Σχήμα 12.2) Τότε αποσπώνται από αυτό άτομα ίδια με το στοιχείο που πρόκειται να αναλυθεί. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή ακτινοβολίας συγκεκριμένης συχνότητας. Η ενέργεια της ακτινοβολίας ισούνται με ΔΕ = hv. Σχήμα 12.2 Λυχνία κοίλης καθόδου (Pecsok et al., 1980). Οι λυχνίες εκκένωσης χωρίς ηλεκτρόδια αποτελούνται από ένα µικρό σφραγισμένο σωλήνα από χαλαζία, που περιέχει το προς ανάλυση μέταλλο ή άλας αυτού και αδρανές αέριο αργό (Ar) σε χαμηλή πίεση μερικών mm Hg. Ο σωλήνας περιβάλλεται από ένα σπείραµα συνδεδεμένο µε γεννήτρια ραδιοσυχνοτήτων για τον ιονισµό του Ar. Τα ιόντα του αερίου συγκρούονται µε το μέταλλο και αποσπούν τα άτοµά του, που στη συνέχεια εκπέμπουν ακτινοβολία χαρακτηριστικού µήκους κύµατος. Κάθε αναλυτής έχει 4 8 λυχνίες εκκένωσης χωρίς ηλεκτρόδια (Φωτογραφία 12.1) που έχουν τη δυνατότητα να παράγουν φάσµα μεγαλύτερης έντασης και ευαισθησίας απ ό, τι οι λυχνίες κοίλης καθόδου. Χρησιμοποιούνται κυρίως για τον προσδιορισµό πτητικών στοιχείων όπως: As, Se, Te, Sn, Pb, Hg, κ.α. Οι λυχνίες επιλέγονται αυτόματα και υπάρχει η δυνατότητα αυτόματης προθέρμανσης της επόμενης λυχνίας για οικονομία χρόνου και αυξημένη αναλυτική αξιοπιστία, καθώς και δυνατότητα αυτόματου σβησίματος αυτών στο τέλος της ανάλυσης για παράταση του χρόνου ζωής τους (Pecsok et al., 1980). 315

317 Φωτογραφία 12.1 Υποδοχέας 4 θέσεων για λάμπες ατομικής απορρόφησης, Το σύστηµα Ατοµοποίησης (Καύσης και Εκνέφωσης) Ο ατομοποιητής είναι στην πραγματικότητα μια πηγή θερμικής ενέργειας, που παράγει ένα νέφος ατόμων το οποίο περνά μέσα από μία δέσμη φωτός και απορροφά ακτινοβολία. Οι σημαντικότερες τεχνολογίες ατοµοποίησης είναι ο καυστήρας φλόγας και το ηλεκτροθερµαινόµενο σύστηµα ατοµοποίησης, δηλαδή ο φούρνος γραφίτη (καθαρός άνθρακας) Σύστηµα Ατοµοποίησης µε Φλόγα Η «φλόγα» είναι ένας απλός, φθηνός και εύχρηστος ατομοποιητής, που δημιουργεί ένα σταθερό περιβάλλον για την ατοµική απορρόφηση. Αποτελείται από ένα εκνεφωτή, στον οποίο γίνεται αρχικά η εισρόφηση του δείγματος και στη συνέχεια η διασπορά του ως ένα νέφος μικρών σταγονιδίων περίπου 10 μm. Το ψεκαζόμενο αυτό νέφος αναμιγνύεται με ένα καύσιμο (μίγμα ακετυλενίου και αέρα) και εισέρχεται στην κεφαλή του καυστήρα, όπου ακολουθεί η καύση. Στην κεφαλή του καυστήρα δημιουργείται μία φλόγα στην οποία τα μικρά σταγονίδια του δείγματος καίγονται και τα άτομα που δημιουργούνται απορροφούν ακτινοβολία και διεγείρονται. Συνήθως χρησιμοποιείται φλόγα αέρα ακετυλενίου, με θερμοκρασία 2125 ως 2400 ο C (Φωτογραφία 12.2). Συνήθως μέσα στα βιολογικά υγρά υπάρχουν και άλλα μέταλλα, όπως και άλλες ουσίες, οι οποίες απορροφούν ή διαθλούν την ακτινοβολία που παράγει η λυχνία του συστήματος παρεμβαίνοντας στην ανάλυση. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιείται και μία δεύτερη λυχνία δευτερίου. Έτσι, κατά τη στιγμή της ατομοποίησης παρέχεται πάνω από το νέφος του δείγματος μία διπλή δέσμη φωτός, που αποτελείται από την δέσμη του δείγματος και τη δέσμη αναφοράς (από την λάμπα δευτερίου). Με τον τρόπο αυτό γίνονται δύο μετρήσεις σε ταυτόχρονο χρόνο, γίνεται δηλαδή ένα είδος διχρωματικής ανάλυσης, όπως και στα φωτόμετρα με δύο μήκη κύματος (Pecsok et al., 2010). 316

318 Φωτογραφία 12.2 Σύστημα ατομικής απορρόφησης με καυστήρα φλόγας Το ηλεκτροθερµαινόµενο σύστηµα Ατοµοποίησης (Εξαχνωτής ή Φούρνος Γραφίτη) Ο φούρνος γραφίτη είναι ένας μικρός κύλινδρος με μια μικρή οπή στο κέντρο για την είσοδο του δείγματος (Φωτογραφία 12.3). Ο γραφίτης είναι καθαρός άνθρακας ο οποίος ως αδρανές υλικό δεν επιδρά στις μετρήσεις. Όμως ο καθαρός άνθρακας παρουσία οξυγόνου καίγεται και καταστρέφεται, οπότε για την προστασία του γραφίτη όλη η κεφαλή του καυστήρα βρίσκεται μέσα σε ατμόσφαιρα ευγενούς αερίου (Αργό, Ar) (Σχήμα 12.3) Επειδή στην αρχή κάθε νέας μέτρησης η θερμοκρασία του συστήματος πρέπει να επανέλθει από πολύ υψηλές θερμοκρασίες (> 2500 ο C) ξανά στους 40 C, μέσα στον εξαχνωτή υπάρχει κατάλληλο κλειστό σύστημα ψύξης που στηρίζεται στη κυκλοφορία του νερού. Σε κάποια δε συστήματα υπάρχει κάμερα στο εσωτερικό του συστήματος για την παρακολούθηση on-line της ανάλυσης. Φωτογραφία 12.3 Κύλινδροι γραφίτη για ατομική απορρόφηση (Perkin Elmer Catalog). 317

319 Σχήμα 12.3 Σύστημα ατοµοποίησης με φούρνο γραφίτη (Pecsok et al.,1980). Κατά την καύση (Φωτογραφία 12.4) αναπτύσσονται θερμοκρασίες C (Πίνακας 12.5) με μέγιστη ταχύτητα ανόδου 2000 C/sec. Ο συνολικός χρόνος ανάλυσης ενός δείγματος είναι λίγο μεγαλύτερος από εκείνο της φλόγας. Πλεονέκτημα της μεθόδου όμως είναι ο μικρότερος όγκος δείγματος που απαιτείται και η μεγαλύτερη αναλυτική ευαισθησία που εξασφαλίζει. Στάδια Θερμοκρασία Διαδικασίες Ξήρανση ο C Εξάτμιση των υγρών του δείγματος. Πυρόλυση ο C Καύση της οργανικής ύλης και απελευθέρωση του μετάλλου από τις πρωτεΐνες του αίματος. Ατομοποίηση ο C Παραγωγή ατόμων του μετάλλου, διέγερσή τους και απορρόφησης της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Καθαρισμός ο C Καύση των υπολειμμάτων του δείγματος. Πίνακας 12.5 Τα στάδια της ατομοποίησης. Φωτογραφία 12.4 Πυράκτωση του γραφίτη κατά την ατομοποίηση. Ο γραφίτης στηρίζεται πάνω σε δύο δακτυλίους μέσα από τους οποίους διέρχεται ηλεκτρικό ρεύμα (Philips Pye Unicam). 318