ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ι. (Συµπληρωµατικές σηµειώσεις σε θέµατα ιαχωρισµών) Α. Εκχύλιση κατ' αντιρροή. Β. Εκχύλιση στερεάς φάσης

Transcript

1 ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ι (Συµπληρωµατικές σηµειώσεις σε θέµατα ιαχωρισµών) Α. Εκχύλιση κατ' αντιρροή Β. Εκχύλιση στερεάς φάσης Αθήνα, Ιανουάριος 2005

2 A. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΤ' ΑΝΤΙΡΡΟΗ - ΣΥΣΚΕΥΗ CRAIG A.1 Θεωρία Η εκχύλιση κατ' αντιρροή (countercurrent extraction) αποτελεί µέθοδο πολλαπλών εκχυλίσεων υγρού-υγρού, µε την οποία πετυχαίνεται ο διαχωρισµός ουσιών, που διαφέρουν ως προς τον λόγο κατανοµής, σε ένα διφασικό σύστηµα διαλυτών, στο οποίο ο ένας διαλύτης είναι (κατά κανόνα) το νερό. Η εκχύλιση κατ' αντιρροή µπορεί να πραγµατοποιηθεί εύκολα µε µια έξυπνη κατασκευή, γνωστή ως συσκευή Craig. Η συσκευή Craig αποτελείται από µια σειρά υάλινων "σωλήνων". Ο κάθε "σωλήνας" αποτελείται από δύο θαλάµους Α και Β, που µεταξύ τους επικοινωνούν µε ένα λεπτό σωληνίσκο. Οι "σωλήνες" συνδέονται µεταξύ τους έτσι, ώστε να είναι δυνατή η µεταφορά της επάνω φάσης (ειδικώς ελαφρότερης φάσης) από τον θάλαµο Β τους ενός σωλήνα προς τον θάλαµο Α του επόµενου σωλήνα. Όλες οι εκχυλίσεις και µεταφορές γίνονται συγχρόνως σε όλους τους σωλήνες, οι οποίοι εκτελούν ένα είδος κίνησης ταλάντωσης/περιστροφής συνήθως µε ηλεκτροµηχανικά µέσα. Στο Σχήµα A1 δείχνεται µια συσκευή Craig αποτελούµενη από 20 σωλήνες, όπως επίσης και τα επιµέρους στάδια ενός κύκλου διαχωρισµού. Σχήµα A1. (Α): Συσκευή Craig αποτελούµενη από 20 σωλήνες. (Β): ιακριτά στάδια λειτουργίας της συσκευής Craig: (1) Η ελαφρότερη φάση (περιέχουσα το δείγµα) εισάγεται στον θάλαµο A από την έξοδο του προηγούµενου σωλήνα. (2) Ανάδευση: ο σωλήνας εκτελεί ταλαντώσεις υπό ολική γωνία περίπου 36 o για να αποκατασταθεί η ισορροπίας κατανοµής. (3) Εξισορρόπηση: Οι φάσεις αφήνονται σε ηρεµία για να διαχωρισθούν. (4) ιαχωρισµός φάσεων: Η επάνω φάση µεταφέρεται στον θάλαµο Β µε αργή περιστροφή του σωλήνα κατά 90 o κατά τη φορά των δεικτών ωρολογίου. (5) "Στάδιο µεταφοράς": ο σωλήνας επιστρέφει στην κάθετη θέση και η φάση από τον θάλαµο Β µεταφέρεται στον θάλαµο Α του επόµενου σωλήνα. 2

3 Σχήµα A2. Τα µαθηµατικά των τριών πρώτων κύκλων λειτουργίας της συσκευής Craig. Η κάτω φάση µε τον (ειδικώς) βαρύτερο διαλύτη (π.χ. νερό) και η οποία παραµένει σε κάθε σωλήνα, αποτελεί τη "στατική φάση", ενώ η επάνω φάση µε τον (ειδικώς) ελαφρύτερο διαλύτη (π.χ. εξάνιο) και η οποία µεταφέρεται από τον ένα σωλήνα στον άλλο αποτελεί την "κινητή φάση". Αρχικά, ο σωλήνας #0 περιέχει το µίγµα των ουσιών που πρόκειται να διαχωρισθεί διαλυµένο στον "βαρύτερο" διαλύτη και όλοι οι άλλοι σωλήνες περιέχουν τον ίδιο διαλύτη σε ίσους όγκους. Ο "ελαφρότερος" διαλύτης προστίθεται στον σωλήνα #0, πραγµατοποιείται εκχύλιση (εξισορρόπηση) και οι φάσεις αφήνονται να διαχωρισθούν. Στη συνέχεια η επάνω φάση του σωλήνα #0 µεταφέρεται (µε κατάλληλη στρέψη της συσκευής, βλέπε Σχήµα Α2) στον σωλήνα #1, καθαρός διαλύτης προστίθεται στον σωλήνα #0 και η διαδικασία της εξισορρόπησης επαναλαµβάνεται. Οι επάνω φάσεις των σωλήνων #0 και #1 µεταφέρονται συγχρόνως στους σωλήνες #1 και #2 αντίστοιχα και ο κύκλος εκχύλισης/µεταφοράς επαναλαµβάνεται κ.ο.κ. Προφανώς οι ουσίες µε τους µεγαλύτερους λόγους κατανοµής "κινούνται" ταχύτερα από τον ένα σωλήνα στο άλλο, σε σχέση µε τις ουσίες µε µικρότερους λόγους κατανοµής. Ενδιαφέρον έχει ο υπολογισµός της κατανοµής της ουσίας Α στους σωλήνες µετά από δεδοµένο αριθ- µό κύκλων εκχύλισης/µεταφοράς. Εάν υποθέσου- µε ότι οι όγκοι και των δύο διαλυτών είναι ίδιοι (V), εάν W είναι η ποσότητα της ουσίας A στο δείγ- µα και εάν µε p και q συµβολίσουµε τα κλάσµατα της ουσίας A (µε λόγο κατανοµής D) στην επάνω φάση (π.χ. οργανικό διαλύτη, ο) και στην κάτω φάση (π.χ. νερό, w), τότε ισχύει Επειδή είναι πάντοτε p + q = 1, θα είναι D = ( CA ) o ( pw ) / V p = = ( C ) ( qw ) / V q A w (A1) D p = (A2) D q = (A3) D + 1 Τα κλάσµατα της ουσίας στους διαδοχικούς σωλήνες µετά από κάθε κύκλο εκχύλισης/µεταφοράς δείχνονται στο Σχήµα A2. Μετά την πρώτη µεταφορά έχουµε τις ακόλουθες (συνολικές) ποσότητες της ουσίας Α σε κάθε σωλήνα: 3

4 σωλήνας 0: σωλήνας 1: q p Μετά τη δεύτερη µεταφορά θα έχουµε: σωλήνας 0: σωλήνας 1: σωλήνας 2: q 2 2qp p 2 Μετά την τρίτη µεταφορά θα έχουµε: σωλήνας 0: σωλήνας 1: σωλήνας 2: σωλήνας 3: q 2 3q 2 p 3qp 2 p 3 Παρατηρούµε ότι µετά από n κύκλους εκχύλισης/µεταφοράς και επειδή ο λόγος D = p/q πρέπει να ισχύει σε κάθε σωλήνα µετά από κάθε φάση εξισορρόπησης, τότε το ολικό κλάσµα της Α σε κάθε σωλήνα θα αντιστοιχεί στους όρους του διωνυµικού αναπτύγµατος (p + q) n. Εποµένως, το ολικό κλάσµα της Α στον σωλήνα r µετά από n µεταφορές θα παρέχεται από την εξίσωση (υπενθυµίζεται ότι 0!=1 ). n! r n r fn, r = p q (A4) r! ( n r)! Συνδυάζοντας την παραπάνω εξίσωση µε τις προηγούµενες εκφράσεις των p και q τελικά προκύπτει: f n, r r n! D = (A5) n r! ( n r)! ( D + 1) Όσο µεγαλύτερη η διαφορά στους λόγους κατανοµής των διαφόρων ουσιών, τόσο πληρέστερος θα είναι και ο διαχωρισµός τους. Για να επιτευχθεί ο διαχωρισµός ουσιών µε παραπλήσιους λόγους κατανοµής απαιτείται µεγαλύτερος αριθµός σωλήνων. Η συσκευή Craig σπάνια πλέον χρησιµοποιείται. Οι σύγχρονες χρωµατογραφικές τεχνικές είναι κατά πολύ αποτελεσµατικότερες και πιο εύχρηστες, ωστόσο κατανόηση του µηχανισµού εκχύλισης κατ' αντιρροή είναι από εκπαιδευτική άποψη εξαιρετικά χρήσιµη γιατί αποτελεί την εισαγωγή στη θεµελιώδη έννοια της εξισορρόπησης µεταξύ της στατικής και κινητής φάσης. Κάθε σωλήνας όπου πραγµατοποιείται µια πλήρης εξισορρόπηση αντιστοιχεί σε µια "θεωρητική πλάκα" (theoretical plate) µιας χρωµατογραφικής στήλης. Συσκευές Craig µε περισσότερους από 100 σωλήνες κατασκευάζονται δύσκολα και είναι σχετικά δύσχρηστες και επιπλέον θα πρέπει να συγκριθούν µε τις σύγχρονες χρωµατογραφικές στήλες µε διαχωριστικές ικανότητες αντίστοιχες προς µερικές εκατοντάδες χιλιάδες θεωρητικών πλακών. Παρατήρηση: Για πληρέστερη κατανόηση της λειτουργίας της συσκευής Craig, µπορείτε να δοκιµάσετε µια προσοµοίωση της λειτουργίας της συσκευής Craig στις "εκπαιδευτικές µικροεφαρµογές" (educational applets) που βρίσκονται στις ιστοσελίδες του Τµήµατος Χηµείας και συγκεκριµένα στη σελίδα: Από τον ορισµό του παραγοντικού (n! = 1 2 n) ισχύει η ακόλουθη αναδροµική σχέση: k! = (k 1)!k. Για k = 1, η σχέση γίνεται: 1! = 0! 1, από την οποία προκύπτει ότι 1! = 0! δηλ. 0! = 1. 4

5 Μέσω της παραπάνω µικροεφαρµογής, µπορείτε να δοκιµάσετε διάφορους λόγους κατανοµής για να κρίνετε την αποτελεσµατικότητα του διαχωρισµού δύο ουσιών. Στο Σχήµα Α3 δείχνεται η αποτελεσµατικότητα του διαχωρισµού δύο ουσιών (Α και Β) σε τρεις περιπτώσεις: α) Για D A = 2,5 και D B = 4 (κακός διαχωρισµός), β) D A = 1,2 και D B = 4 (µέτριος διαχωρισµός) και γ) D A = 0,1 και D B = 4 (άριστος διαχωρισµός). Σχήµα Α3. ιαχωρισµός δύο ουσιών (όπως προκύπτει από τη χρήση της αναφερόµενης εκπαιδευτικής µικροεφαρµογής) σε συσκευή Craig αποτελούµενη από 20 σωλήνες, για διαφορετικές τιµές λόγων κατανοµής των δύο ουσιών και µετά από 20 (= n) κύκλους εκχυλίσεων/µεταφοράς. Όσο µεγαλύτερη είναι η διαφορά στους λόγους κατανοµής, τόσο καλύτερος είναι ο διαχωρισµός. 5

6 B. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ B.1 Εισαγωγή Η εκχύλιση στερεάς φάσης (solid phase extraction, SPE) αποτελεί µια ευρύτατα χρησιµοποιού- µενη τεχνική προετοιµασίας του προς µέτρηση (δοκιµή ή ανάλυση) δείγµατος. Η SPE αντικαθιστά αποτελεσµατικά την εκχύλιση υγρού µε υγρό και χρησιµοποιείται κυρίως για τις ακόλουθες αναλυτικές διαδικασίες: Προσυγκέντρωση (pre-concentration) της προσδιοριζόµενης ουσίας (αναλύτη) από µεγάλους όγκους δειγµάτων. Σε πολλές περιπτώσεις η ευαισθησία των διάφορων αναλυτικών µεθόδων δεν επαρκεί για µετρήσεις σε πολλά δείγµατα στα οποία ο αναλύτης βρίσκεται σε εξαιρετικά χαµηλές συγκεντρώσεις. Επιπλέον η παρουσία διάφορων ενώσεων στο αρχικό δείγµα είναι πολύ πιθανό να παρεµποδίζει την απ'ευθείας µέτρηση (άµεση εισαγωγή του δείγ- µατος στην αναλυτική συσκευή). Στις περιπτώσεις αυτές µεγάλοι όγκοι δειγµάτων (αερίων ή υγρών) υπόκεινται σε SPE έτσι, ώστε η συνολική ποσότητα του αναλύτη να "παγιδευθεί" στον µικρό όγκο της στερεάς φάσης από την οποία µπορεί να παραληφθεί εύκολα µε µικρό όγκο διαλύτη, συγχρόνως απαλλαγµένη από άλλα συστατικά που θα παρεµπόδιζαν τη µέτρηση. Καθαρισµός δείγµατος. Με τη διαδικασία της SPE συχνά επιδιώκεται η δέσµευση ουσιών από τα δείγµατα οι οποίες παρεµποδίζουν µια διαδικασία µέτρησης και όχι ο ίδιος ο αναλύτης. Χρονοπρογραµµατιζόµενες δειγµατοληψίες πεδίου (time-programmed field sampling). Η διαδικασία της SPE είναι απλή και συχνά µπορεί να πραγµατοποιηθεί εύκολα εκτός εργαστηρίου. Έτσι, µε τη SPE µπορούν να πραγµατοποιείται αυτοµατοποιηµένη/προγραµµατισµένη δειγµατοληψία (π.χ. αέρα µιας περιοχής ή φυσικών υδάτων σε ένα ή περισσότερα σηµεία ενός ποταµού) σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Στους "σωλήνες" της SPE που τελικά συλλέγονται (ένας για κάθε δειγµατοληψία), κατακρατούνται τα υπό µέτρηση συστατικά και µετά το πέρας όλων των δειγµατοληψιών, οι σωλήνες µεταφέρονται στο εργαστήριο και µετρείται κατά µαζικό τρόπο το περιεχόµενο του κάθε σωλήνας στην υπό µέτρηση ουσία. Με την SPE επιλύονται πολλά προβλήµατα της υγρής/υγρής εκχύλισης, όπως π.χ. ο ατελής διαχωρισµός φάσεων, η µη ποσοτική ανάκτηση των διαχωριζόµενων ουσιών, η χρήση ακριβού και εύθραυστου εξοπλισµού (διαχωριστικές χοάνες), χρήση και απόρριψη µεγάλων ποσοτήτων δαπανηρών και κατά κανόνα εύφλεκτων ή/και τοξικών οργανικών διαλυτών. Η SPE είναι κατά πολύ αποτελεσµατικότερη τεχνική από αυτήν της υγρής/υγρής εκχύλισης καθώς µε αυτή πετυχαίνονται εύκολα ποσοτικοί διαχωρισµοί, είναι ταχύτατη στην εφαρµογή της και µπορεί εύκολα να αυτοµατοποιηθεί. H SPE χρησιµοποιείται κυρίως για την επεξεργασία υγρών δειγµάτων και την εκχυλιστική δέσµευση από αυτά ηµιπτητικών ή µη πτητικών ενώσεων. Επίσης, µπορεί να χρησιµοποιηθεί και για στερεά δείγµατα τα οποία προηγουµένως θα έχουν υποστεί εκχύλιση µε κατάλληλο διαλύτη. 6

7 (α) (β) Σχήµα Β1. (α) Χαρακτηριστικοί σωλήνες-στήλες SPE. (β) Συσκευή ταυτόχρονου χειρισµού πολλών στηλών SPE (η ροή επιταχύνεται µε εφαρµογή κενού). Β.2 Βασικές αρχές εκχύλισης στερεάς φάσης Β.2.1. SPE "αντίστρoφης φάσης" Οι διαχωρισµοί αντίστροφης φάσης πραγµατοποιούνται µε κατανοµή της προσδιοριζόµενης ουσίας (δηλαδή του "αναλύτη") µεταξύ ενός πολικού ή µετρίως πολικού διαλύτη (συνήθως ύδατος) ή "µήτρας" (matrix) και µίας µη πολικής στατικής φάσης *. Ο αναλύτης µπορεί να είναι ουσία µέσης πολικότητας ή µη πολική. Στον Πίνακα Β1 παρουσιάζεται µια σειρά διαλυτών κατά αυξανό- µενη πολικότητα. Από τις κυριότερες στατικές φάσεις που χρησιµοποιούνται στην εκχύλιση στερεάς φάσης είναι η πυριτία SiO 2 (silica), στην επιφάνεια της οποίας έχουν προσδεθεί µε οµοιοπολικούς δεσµούς άλκυλο- ή αρυλο- οµάδες. Η πρόσδεση πραγµατοποιείται µέσω των αρχικά ελεύθερων οµάδων σιλανόλης (Si OH) που είναι υδρόφιλες (πολικές) και βρίσκονται στην επιφάνεια του πυριτικού πληρωτικού υλικού (υλικό που "γεµίζει" τη στήλη). Οι οµάδες αυτές αντιδρούν µε κατάλληλα "σιλανοποιητικά" αντιδραστήρια και µετατρέπονται χηµικά σε υδρόφοβες αλκυλο- ή αρυλοοµάδες, όπως π.χ. µε την αντίδραση που δείχνεται στο Σχήµα Β2. Η κατακράτηση των οργανικών ενώσεων από πολικά διαλύµατα (π.χ. υδατικά) σε αυτά τα υλικά οφείλεται κυρίως στις ασθενείς ελκτικές δυνάµεις µεταξύ των δεσµών C H του αναλύτη και των αντίστοιχων δεσµών των υδρόφοβων οµάδων της σιλανοποιηµένης επιφάνειας της πυριτίας. Αυτές οι ελκτικές δυνάµεις καλούνται δυνάµεις Van der Waals ή δυνάµεις διασποράς. Στο Σχήµα Β3 δείχνεται η γενική αρχή διαχωρισµού ουσίας µε την τεχνική SPE αντίστροφης φάσης. * Οι διαχωρισµοί "αντίστροφης φάσης" (reversed phase) αποτελούν τη συνηθέστερη και πλέον προτιµού- µενη περίπτωση SPE, σε αντίθεση µε τους διαχωρισµούς "κανονικής φάσης" (normal phase), όπου η κατανοµή πραγµατοποιείται µεταξύ ενός µη πολικού (ή ελάχιστα πολικού) διαλύτη και µίας πολικής στατικής φάσης. 7

8 Για την έκλουση µιας προσροφηµένης ουσίας από έναν σωλήνα ή δισκίο SPE αντίστροφης φάσης (βλέπε Σχήµα Β3) χρησιµοποιείται ένας µη πολικός διαλύτης τα µόρια του οποίου ανταγωνίζονται τα µόρια της προσροφηµένης ουσίας και λόγω της µεγάλης περίσσειάς τους, την "διώχνουν" από το υπόστρωµα. Τα υποστρώµατα πυριτίας C-8 και C-18 (silica C-8 και C-18) είναι από τα πλέον ευρύτερα χρησιµοποιούµενα. Σχήµα Β2. Τυπική αντίδραση σιλανοποίησης κατά την οποία οι επιφανειακές οµάδες SiOH καθαρής πυριτίας, αντικαθίστανται µε µεγάλα αλκύλια (εδώ: δεκαοκτύλια), µε αποτέλεσµα η πυριτία αυτή να καθίσταται υδρόφοβη και ως στατική φάση "µη-πολική". Η συγκεκριµένη στατική φάση συχνά αναφέρεται ως "C-18". Σχήµα Β3. ιαχωρισµός µε SPE αντίστροφης φάσης (αρχή). 8

9 ΠΙΝΑΚΑΣ Β.1. Κατάταξη ορισµένων διαλυτών κατά αυξανόµενη πολικότητα*. ιαλύτης Χηµικός Σηµείο ιπολική ροπή ιηλεκτρική τύπος ζέσεως, ο C (σε debye) σταθερά κ-εξάνιο CH 3 (CH 2 ) 4 CH ,02 τετραχλωράνθρακας CCl ,24 βενζόλιο ,28 διαιθυλαιθέρας (CH 3 CH 2 ) 2 Ο 35 1,15 4,34 µεθυλενοχλωρίδιο CH 2 Cl ,60 9,08 τετραϋδροφουράνιο (THF) 66 1,63 7,52 αιθανόλη CH 3 CH 2 OH 78 1,69 24,3 µεθανόλη CH 3 OH 68 1,70 33 οξικό οξύ CH 3 COOH 118 1,74 6,15 ύδωρ Η 2 Ο 100 1,85 80 ακετόνη CH 3 COCH ,88 20,7 φορµαµίδιο HCONH , N,N-διµεθυλοφορµαµίδιο (DMF) HCON(CH 3 ) ,82 38,3 ακετονιτρίλιο CH 3 CN 81 3,92 36,6 διµεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) CH 3 SOCH ,96 47,2 * Σηµείωση: Η πολικότητα ενός διαλύτης κρίνεται κυρίως: (α) από τη διπολική ροπή του µορίου και (β) από τη διηλεκτρική σταθερά του (η οποία συνδέεται κυρίως µε την εξασθένιση των κουλοµβικών έλξεων και µε τη δυνατότητα διάλυσης ιοντικών ενώσεων). Στον παραπάνω πίνακα η κατάταξη γίνεται µε βάση τη διπολική ροπή. Αν γινόταν µε βάση τη διηλεκτρική σταθερά η σειρά θα άλλαζε σε ορισµένα σηµεία. Αυτό είναι ενδεικτικό του ότι δεν υπάρχουν σαφή όρια µεταξύ των πολικών και µη πολικών διαλυτών. Στην SPE και γενικότερα στις χρωµατογραφικές τεχνικές συχνά η πολικότητα των διαλυτών εκφράζεται κατά εµπειρικό τρόπο και µε βάση πειραµατικά δεδοµένα. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η "εµπειρική" σειρά πολικότητας των διαλυτών εξαρτάται σε κάποιο βαθµό και από το είδος του υποστρώµατος (π.χ. πυριτία, αλουµίνα, πολυµερικό υλικό), έτσι ένας διαλύτης µπορεί να είναι πολικότερος ενός άλλου ως προς ορισµένο υπόστρωµα, ενώ σε άλλο υπόστρωµα να εµφανίζεται λιγότερο πολικός. Η χρήση πολυµερών υλικών βοηθά στην πληρέστερη κάλυψη της πυριτικής επιφάνειας και στην χωρητικότητα της στήλης (µέγιστη ποσότητα κατακρατούµενης ουσίας ανά µονάδα βάρους υλικού). Τα πολυµερή υλικά είναι ανθεκτικότερα σε ακραίες τιµές του ph και για αυτόν τον λόγο είναι περισσότερο κατάλληλα σε περιβαλλοντικές εφαρµογές για τον διαχωρισµό οργανικών ενώσεων από οξινισµένα υδατικά δείγµατα. Όλα τα υλικά τα οποία βασίζονται στην πυριτία µετά τη διαδικασία της σιλανοποίησης εξακολουθούν να περιέχουν έστω και µικρό ποσοστό ελεύθερων οµάδων υδροξυλίου (σιλανόλης) οι οποίες δρουν ως δευτερεύουσες θέσεις αλληλεπίδρασης. Αυτές οι δευτερεύουσες αλληλεπιδράσεις µπορεί να είναι χρήσιµες για τον διαχωρισµό ή την κατακράτηση ισχυρά πολικών ουσιών ή προσµίξεων, αλλά επίσης µπορεί να προκαλέσουν το ανεπιθύµητο αποτέλεσµα της µη αντιστρεπτής δέσµευσης της προσδιοριζόµενης ουσίας. Άλλα υλικά τα οποία χρησιµοποιούνται στην SPE αντίστροφης φάσης είναι ανθρακούχα υλικά καθώς και πολυµερή υλικά τα οποία συνδέονται µε το πυριτικό υπόστρωµα. Τα ανθρακούχα 9

10 υλικά αποτελούνται από µη πορώδη γραφίτη ο οποίος παρουσιάζει υψηλή εκλεκτικότητα σε πολικές και µη πολικές οργανικές ενώσεις οι οποίες βρίσκονται σε πολικές ή µη πολικές µήτρες. Η επιφάνεια του γραφιτικού άνθρακα αποτελείται από άτοµα C τα οποία είναι διατεταγµένα σε δοµές εξαγωνικού δακτυλίου διασυνδεδεµένες µεταξύ τους. Η δοµή εξαγωνικού δακτυλίου παρουσιάζει υψηλή εκλεκτικότητα προς επίπεδες αρωµατικές ενώσεις, µόρια µε αντίστοιχη δοµή δακτυλίου καθώς και προς ανθρακικές αλυσίδες οι οποίες παρουσιάζουν τάση ταυτόχρονης πρόσδεσης σε πολλά σηµεία της επιφάνειας. Η κατακράτηση των προσδιοριζόµενων συστατικών βασίζεται κυρίως στη δοµή τους (µέγεθος και δοµή), παρά στην ύπαρξη αλληλεπιδράσεων µεταξύ των δραστικών οµάδων του αναλύτη µε την επιφάνεια του προσροφητικού. Η έκλουση στην περίπτωση αυτή πραγµατοποιείται µε διαλύτες µέσης πολικότητας ή µη πολικούς. Αντί πυριτίας είναι εξίσου συνηθισµένη η χρήση πολυµερών υλικών ως υποστρωµάτων στήριξης των χαρακτηριστικών οµάδων κατά την SPE αντίστροφης φάσης. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί το συµπολυµερές στυρολίου/διβινυλοβενζολίου (Σχήµα Β4) το οποίο χρησιµοποιείται για την κατακράτηση υδρόφοβων ενώσεων οι οποίες παρουσιάζουν µερικώς υδρόφιλο χαρακτήρα και ιδιαίτερα για αρωµατικές οργανικές ενώσεις. Τυπική εφαρµογή αποτελεί η κατακράτηση των φαινολών οι οποίες κατακρατούνται δύσκολα σε χηµικώς τροποποιηµένη πυριτία C-18 σε συνθήκες αντίστροφης φάσης κυρίως λόγω της µεγαλύτερης διαλυτότητά τους στο νερό. Από αυτήν παραλαµβάνονται εύκολα µε οργανικούς διαλύτες. Η έκλουση µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε τη χρήση διαλυτών µέσης πολικότητας ή µη πολικών, επειδή το πολυµερές πληρωτικό υλικό είναι σταθερό σε σχεδόν σε κάθε σύστηµα διαλύτη. Μια άλλη περίπτωση εφαρµογής πολυµερών υλικών αποτελεί η χρήση των υλικών µε εµπορική ονοµασία Hisep όπου αποτελούνται από υδρόφοβη τροποποιηµένη πυριτία η οποία επικαλύπτεται από υδρόφιλο πολυµερές. Το πορώδες πολυµερές το οποίο επικαλύπτει την πυριτία αποτρέπει την προσρόφηση µεγάλων ανεπιθύµητων µορίων και δρα σαν "µοριακό κόσκινο". Οι πόροι του πολυµερούς έχουν µέγεθος, που επιτρέπει την επιλεκτική διέλευση µικρών οργανικών µορίων (π.χ. ναρκωτικών ουσιών) προς την επιφάνεια της πυριτίας, ενώ αποκλείει τα µεγάλα µόρια (π.χ. πρωτεΐνες) τα οποία δεν κατακρατούνται και εκλούονται κατά το στάδιο της φόρτισης της στήλης. Σχήµα Β4. Τµήµα "σκελετού" συµπολυµερούς στυρολίου-διβινυλοβενζολίου. B.2.2. SPE "κανονικής φάσης" Η πορεία αυτή περιλαµβάνει µία πολική προσδιοριζόµενη ουσία, µία µέσης πολικότητας ή µη πολική µήτρα (π.χ. ακετόνη, χλωριωµένοι διαλύτες, εξάνιο κ.α.) και µία πολική στατική φάση. Ως πληρωτικά υλικά χρησιµοποιείται οξείδιο του πυριτίου µε προσδεµένες πολικές οµάδες (π.χ. LC-CN, LC-NH2, και LC-Diol) δηλαδή αντί απλών αλκυλοµάδων, περιέχουν οµάδες όπως: CH 2 CH 2 CN, CH 2 CH 2 NH 2, CH 2 CH(OH)CH 2 OH, 10

11 που προσδίδουν στην πυριτία διάφορους βαθµούς πολικότητας. Έτσι, τα υλικά αυτά λόγω της παρουσίας των πολικών οµάδων, είναι περισσότερο υδρόφιλα από τα αντίστοιχα υλικά που χρησιµοποιούνται στους SPE "αντίστροφης φάσης". Οµοίως µε τα πυριτικά υλικά που χρησιµοποιούνται στην εκχύλιση κανονικής φάσης αυτά τα πληρωτικά υλικά µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την προσρόφηση πολικών ενώσεων από µη πολικές µήτρες. Τέτοια υλικά έχουν χρησιµοποιηθεί για την προσρόφηση και εκλεκτική έκλουση ενώσεων παρόµοιας δοµής (π.χ. ισοµερή) ή πολύπλοκων µιγµάτων ή κατηγοριών ενώσεων όπως φάρµακα και λιπίδια. Τα υλικά αυτά επίσης µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε συνθήκες "αντίστροφης φάσης" (µε υδατικά δείγµατα) λόγω των υδρόφοβων ιδιοτήτων των µικρών αλειφατικών αλυσίδων στις συνδεδεµένες δραστικές οµάδες. Ανάλογα µπορούν να χρησιµοποιηθούν και αρκετά πολικά προσροφητικά ανόργανα υλικά (π.χ. LC-Si, LC-Florisil, ENVI-Florisil και LC-Alumina). Ακόµη και η µη τροποποιηµένη πυριτία χρησιµοποιείται ευρύτατα ως υποστηρικτικό υλικό στις προσδεµένες φάσεις, λόγω των ελεύθερων πολικών οµάδων σιλανόλης ( SiOH) που βρίσκονται στην επιφάνειά της. Το υλικό αυτό είναι εξαιρετικά υδρόφιλο και πρέπει να φυλάσσεται ξηρό. Όλα τα δείγµατα τα οποία χρησιµοποιούνται πρέπει να είναι ελεύθερα ύδατος. Υλικά όπως το LC-Si µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την προσρόφηση πολικών ενώσεων από µη πολικές µήτρες. Οι προσροφηµένες ενώσεις εκλούονται στη συνέχεια µε τη χρήση οργανικού διαλύτη ο οποίος είναι πολικότερος της αρχικής µήτρας του δείγµατος. Στις περισσότερες των περιπτώσεων υλικά LC-Si χρησιµοποιούνται ως προσροφητικά µέσα στα οποία αποτίθεται το οργανικό εκχύλισµα, ο αναλύτης διέρχεται µέσω του πληρωτικού υλικού και οι ανεπιθύµητες παρεµποδίσεις κατακρατούνται από το πληρωτικό υλικό και έτσι αποµακρύνονται. Η πορεία αυτή συνήθως ονοµάζεται "καθαρισµός του δείγµατος". Η κατακράτηση του αναλύτη υπό συνθήκες "κανονικής φάσης" οφείλεται κυρίως στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πολικών δραστικών οµάδων του αναλύτη και των πολικών οµάδων της επιφάνειας του προσροφητικού. Μεταξύ άλλων, στις ελκτικές αυτές αλληλεπιδράσεις αυτές περιλαµβάνονται δεσµοί υδρογόνου, αλληλεπιδράσεις διπόλου-διπόλου και αλληλεπιδράσεις διπόλουεπαγόµενου διπόλου. Μία ουσία η οποία κατακρατείται µε αυτούς τους µηχανισµούς εκλούεται µε τη διαβίβαση από το προσροφητικό ενός διαλύτη ο οποίος αναστέλλει τον µηχανισµό διασύνδεσης εξασθενίζοντας τις ελκτικές αλληλεπιδράσεις. Ο διαλύτης αυτός κατά κανόνα πρέπει να είναι πολικότερος της µήτρας (του διαλύτη στο οποίο είναι διαλυµένο) του δείγµατος. Για τον καθαρισµό οργανικών εκχυλισµάτων χρησιµοποιούνται πληρωτικά υλικά όπως το LC- Florisil και η LC-Alumina. Στην περίπτωση του LC-Florisil το πληρωτικό υλικό είναι πυριτικό µαγνήσιο το οποίο είναι ισχυρά πολικό και προσροφά πολικές ενώσεις από µη πολική µήτρα. Στην περίπτωση χρήσης αλούµινας (Al 2 Ο 3 ) το υλικό µπορεί να έχει όξινο (Alumina-A, ph ~5), βασικό (Alumina-B, ph~8,5), ή ουδέτερο (Alumina-N, ph ~6,5) ph και κατατάσσονται ως να έχουν "ενεργότητα Brockmann I". Ο βαθµός ενεργότητας της αλουµίνας µπορεί να ποικίλει από βαθµό I µέχρι βαθµού IV µε την ελεγχόµενη προσθήκη ύδατος πριν ή µετά την πλήρωση του σωλήνα. Σύνοψη: SPE "αντίστροφης φάσης": Μη πολικές ή ελάχιστα πολικές ενώσεις διαλυµένες σε πολικό διαλύτη (µήτρα δείγµατος) κατακρατούνται από τη στατική φάση, η οποία περιέχει µη πολικές οµάδες. Εκλούονται από αυτήν µε χρήση µη πολικών διαλυτών. SPE "κανονικής φάσης": Πολικές ή µετρίως πολικές ενώσεις διαλυµένες σε µη πολικό διαλύτη (µήτρα δείγµατος) κατακρατούνται από στατική φάση που περιέχει πολικές οµάδες. Εκλούονται από αυτήν µε χρήση πολικών διαλυτών. Σε κάθε περίπτωση ο διαλύτης έκλουσης ανταγωνίζεται την προσροφηµένη ουσία και την αποµακρύνει από τη στήλη. 11

12 Β.3. SPE µε ιονανταλλαγή Η εκχύλιση στερεάς φάσης µε ιονανταλλαγή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για ουσίες οι οποίες σε διάλυµα (συνήθως υδατικό, σπανιότερα σε οργανικό διαλύτη) διαθέτουν ηλεκτρικό φορτίο, είναι δηλαδή ιόντα. Ο κύριος µηχανισµός κατακράτησης της ουσίας βασίζεται στην ηλεκτροστατική έλξη της φορτισµένης δραστικής οµάδας της ουσίας προς την φορτισµένη οµάδα η οποία είναι συνδεδεµένη στο πυριτικό υπόστρωµα. Για την κατακράτηση µιας ουσίας στον ιονανταλλάκτη από ένα υδατικό διάλυµα πρέπει το ph του δείγµατος να είναι τέτοιο, ώστε και η προσδιοριζό- µενη ουσία και η δραστική οµάδα που είναι προσδεµένη στην πυριτία να είναι φορτισµένες. Για την έκλουση της προσδιοριζόµενης ουσίας χρησιµοποιείται διάλυµα ph τέτοιου, ώστε να καταργεί τον ιοντισµό της δραστικής οµάδα της ουσίας ή της δραστικής οµάδας του πυριτικού υποστρώµατος ή και των δύο. Εναλλακτικά χρησιµοποιείται είτε διάλυµα υψηλής ιοντικής ισχύος είτε διάλυµα το οποίο περιέχει ιόντα τα οποία αντικαθιστούν (ανταγωνιστικά) την κατακρατού- µενη ουσία. Β.3.1. Ανιονανταλλακτική εκχύλιση στερεάς φάσης. Στην ανιονανταλλακτική εκχύλιση στερεάς φάσης χρησιµοποιούνται ως ιοντογόνες (ionogenic) οµάδες, είτε αλειφατικές τεταρτοταγείς οµάδες του αµµωνίου ( NR + 3 ), είτε αλειφατικές αµινοπρόπυλο οµάδες ( CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ), οι οποίες είναι προσδεµένες στην επιφάνεια της πυριτίας. Μία τεταρτοταγής αµίνη είναι ισχυρή βάση και υφίσταται υπό τη µορφή θετικά φορτισµένου ιόντος το οποίο έλκει ανιόντα από το διάλυµα επαφής δρώντας ως ισχυρός ανιονανταλλάκτης. Το pk a βάσης τεταρτοταγούς αµίνης είναι υψηλό (>14) *, µε αποτέλεσµα η ιοντογόνος οµάδα να είναι φορτισµένη σε όλες τις τιµές ph ευρισκόµενη σε υδατικά διαλύµατα. Ως αποτέλεσµα αυτού ο ισχυρός ανιονανταλλάκτης χρησιµοποιείται για την κατακράτηση ισχυρώς όξινων (pk a <1) ή ασθενώς όξινων ουσιών (pk a > 2), στην περίπτωση εκείνη όπου το ph του δείγµατος έχει τέτοια τιµή ώστε η προσδιοριζόµενη ουσία βρίσκεται υπό τη φορτισµένη µορφή της. Για µια ανιοντική ουσία, το ph της µήτρας του δείγµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερο του pk a κατά 2 µονάδες ph για να βρίσκεται πρακτικά στο σύνολό της υπό τη φορτισµένη µορφή. Οι ισχυροί ανιονανταλλάκτες χρησιµοποιούνται στην περίπτωση εκείνη κατά την οποία δεν απαιτείται η ανάκτηση ή η έκλουση ανιόντων ισχυρών οξέων. Χρησιµοποιούνται κυρίως για την έκλουση και ανάκτηση ανιόντων ασθενών οξέων τα οποία εκλούονται µε τη χρήση διαλύµατος µε τιµή ph τέτοια ώστε να εξουδετερώνεται το ανιόν, δηλαδή να µεταπίπτει σε µη ιοντισµένο οξύ (2 µονάδες ph µικρότερο της τιµής pk a ). έσµευση ανιόντος Α, (ασθενούς οξέος ΗΑ), π.χ. Α = CH 3 COO ): (oλική αντίδραση σε ph > pk HA + 2): ρητίνη R 3 N + X + HA ρητίνη R 3 N + A + X + H + Αποδέσµευση ανιόντος Α : (oλική αντίδραση σε ph < pk HA 2): ρητίνη R 3 N + Α + X + H + ρητίνη R 3 N + Χ + ΗΑ Για την περίπτωση ανάκτησης ανιόντων ισχυρών οξέων χρησιµοποιούνται ασθενείς ανιονανταλλάκτες οι οποίοι φέρουν ως ιοντογόνες οµάδες αλειφατικές αµινο-προπυλο-οµάδες συνδεµένες στην πυριτική επιφάνεια. Η τιµή pk a της πρωτοταγούς αυτής αµίνης είναι περίπου 9,8 και για να χρησιµοποιηθεί ως ανιονανταλλάκτης το ph του δείγµατος πρέπει να έχει τιµή µικρότερη κατά τουλάχιστον 2 µονάδες ph. Επίσης η τιµή ph του δείγµατος πρέπει να είναι τέτοια έτσι, ώστε και η προσδιοριζόµενη ουσία να βρίσκεται στην ιοντική µορφή της (2 µονάδες ph υψηλότερη από την τιµή pk a της ουσίας). * οι τεταρτοταγείς αµµωνιοβάσεις του τύπου R 4 N + OH είναι εξίσου ισχυρές, αν όχι και ισχυρότερες από τις κοινές ισχυρές ανόργανες βάσεις, όπως π.χ. το NaOH. 12

13 έσµευση ανιόντος Χ (ισχυρού οξέος Η + Χ ), π.χ. X = Cl : (oλική αντίδραση σε ph < pk a, RNH2 2): ρητίνη NH 2 + H + + X Αποδέσµευση ανιόντος Χ : (oλική αντίδραση σε ph > pk a, RNH2 + 2): ρητίνη ΝΗ 3 + Χ ρητίνη ΝΗ 3 + Χ ρητίνη NH 2 + H + + X Β.3.2. Κατιονανταλλακτική εκχύλιση στερεάς φάσης Στην κατιονανταλλακτική εκχύλιση στερεάς φάσης ως πληρωτικά υλικά χρησιµοποιούνται οξείδιο του πυριτίου (silica) στο οποίο βρίσκονται προσδεµένες αλειφατικές σουλφονικές οµάδες ή αλειφατικές καρβοξυλικές οµάδες. Η ενωµένη µε τη ρητίνη σουλφονική οµάδα ( SO 3 H + ) είναι ισχυρά όξινη (pk a <1) και µπορεί να χρησιµοποιηθεί για το διαχωρισµό κατιόντων ισχυρών βάσεων (pk a >14) ή µετρίως ισχυρών βάσεων (pk a <12) ενώσεων µε την προϋπόθεση ότι το διάλυµα έχει τέτοια τιµή ph στην οποία η προσδιοριζόµενη ένωση είναι φορτισµένη. Για µία βασική ένωση η τιµή ph της µήτρας πρέπει να είναι 2 τουλάχιστον µονάδες ph µικρότερη της τιµή του pk a της για να βρίσκεται στην ιοντισµένη µορφή της. έσµευση κατιόντος Μ + (ασθενούς βάσης ΜΟΗ), π.χ. M + = CH 3 NH + 3 : (oλική αντίδραση σε ph < pk a,moh 2): ρητίνη SO 3 H + + MOH ρητίνη SO 3 M + + H 2 O Αποδέσµευση κατιόντος Μ + : (oλική αντίδραση σε ph > pk a,moh + 2): ρητίνη SO 3 M + + H 2 O ρητίνη SO 3 H + + MOH Αντίθετα, η ενωµένη µε τη ρητίνη καρβοξυλοµάδα ( COOH) είναι ασθενώς όξινη και θεωρείται ασθενής κατιονανταλλάκτης. Η τιµή pk a της καρβοξυλοµάδας είναι 4,8 και µπορεί να χρησιµοποιηθεί για το διαχωρισµό και την ανάκτηση και ισχυρών και ασθενών κατιόντων. Έτσι σε σχετικά αλκαλικό ph δεσµεύει κατιόντα (αφού ιοντίζεται), τα οποία αποδεσµεύει µε µείωση του ph: έσµευση κατιόντος Μ + (ισχυρής βάσης M + OH ), π.χ. M + = Na + : (oλική αντίδραση σε ph > pk a, RCOOH + 2): ρητίνη COOH + M + ρητίνη COO M + + H + Αποδέσµευση ανιόντος M + : (oλική αντίδραση σε ph < pk a, RCOOH 2): ρητίνη COO M + + H + ρητίνη COOH + M + Σύνοψη: Οι διαχωρισµοί στην SPE ιονανταλλαγής πετυχαίνονται "ρυθµίζοντας" το ph των διαλυµάτων, τόσο κατά την δέσµευση, όσο και κατά την έκλουση (όπως για τη SPE µη ιοντικών ενώσεων "ρυθµίζουµε" την πολικότητα των διαλυτών). Για να γίνει δέσµευση πρέπει το ph να είναι τέτοιο που να ευνοεί τον ιοντισµό τόσο των οµάδων της ρητίνης όσο και της οµάδας της προς κατακράτηση ουσίας (αντίθετου φορτίου σε σχέση µε το φορτίο των οµάδων της ρητίνης). Εάν οι ρητίνες είναι "ισχυρές", τότε σε κάθε τιµή ph υπάρχουν ιοντισµένες οµάδες σε αυτές και µας απασχολεί µόνο το ph που θα προκαλέσει τον ιοντισµό της προς κατακράτηση ουσίας. Η έκλουση γίνεται διαβιβάζοντας διάλυµα µε ph τέτοιο που θα καταργεί τον ιοντισµό των οµάδων της ρητίνης ή της οµάδας της προς έκλουση ουσίας ή και των δύο. Εάν η ρητίνη είναι "ισχυρή", τότε σε κάθε τιµή ph υπάρχουν ιοντισµένες οµάδες σε αυτές και µας απασχολεί µόνο το ph που θα καταργεί τον ιοντισµό της προς έκλουση ουσίας. 13

14 Β.4 Γενικοί παράγοντες που επιδρούν στην πληρότητα των διαχωρισµών µε SPE Η επιλογή του διαλύτη επηρεάζει σηµαντικά την κατακράτηση του αναλύτη στο προσροφητικό και την εν συνεχεία έκλουσή του. Η πολικότητα του διαλύτη καθορίζει την ικανότητά του να εκλούει τον αναλύτη από το προσροφητικό υλικό σε µικρότερο όγκο από αυτόν ενός ασθενέστερου διαλύτη. Σε αρκετές περιπτώσεις απαιτείται η χρήση µίγµατος διαλυτών. Πρέπει να σηµειωθεί ότι για έναν διαλύτη για SPE κανονικής φάσης η πολικότητα και η ικανότητά του συµπίπτουν. Το ίδιο δεν ισχύει για την περίπτωση SPE αντίστροφης φάσης και γι αυτό οι διαλύτες οι οποίοι χρησιµοποιούνται σε προσροφητικά αντίστροφης φάσης πρακτικά περιορίζονται στο ύδωρ, τη µεθανόλη, την ισοπροπυλική αλκοόλη και το ακετονιτρίλιο. Η τιµή ph του δείγµατος καθώς και του εκχυλιστικού επηρεάζει αναλόγως τη χρησιµοποιούµενη τεχνική SPE. Τα πληρωτικά υλικά που βασίζονται στην πυριτία (SiO 2 ) έχουν µία σταθερή περιοχή τιµών ph χρήσης 2-7,5. Σε τιµές εκτός αυτής της περιοχής µπορεί να παρατηρηθεί υδρόλυση της συνδεµένης φάσης ή διαλυτοποίηση του πυριτικού υποστρώµατος. Στην περίπτωση κατά την οποία η σταθερότητα του πληρωτικού υλικού είναι κρίσιµη σε ακραίες τιµές ph µπορούν να χρησιµοποιηθούν πολυµερή ή ανθρακούχα υλικά τα οποία παρουσιάζουν σταθερότητα σε περιοχή ph Στην SPE αντίστροφης φάσης εάν είναι επιθυµητή η κατακράτηση του αναλύτη τότε το ph του δείγµατος και του διαλύτη εξισορρόπησης πρέπει να ρυθµισθούν για τη βέλτιστη κατακράτηση. Εάν ο αναλύτης είναι όξινη ή βασική ένωση το ph ρυθµίζεται έτσι, ώστε αυτή να µην βρίσκεται σε ιοντισµένη µορφή. Η κατακράτηση ουδέτερων ενώσεων δεν επηρεάζεται από την τιµή του ph. Για τα προσροφητικά υλικά τα οποία χρησιµοποιούνται στην SPE αντίστροφης φάσης το ph οµοίως πρέπει να ρυθµίζεται για τη βέλτιστη κατακράτηση. Κατά την έκλουση του αναλύτη η οποία πραγµατοποιείται µε οργανικό διαλύτη το ph δεν είναι σηµαντικός παράγοντας. Στην SPE κανονικής φάσης το ph συνήθως δεν αποτελεί κρίσιµο παράγοντα διότι χρησιµοποιούνται µη πολικοί οργανικοί διαλύτες. Η κατακράτηση στην SPE ιονανταλλαγής εξαρτάται σηµαντικά από την τιµή του ph του δείγµατος και των διαλυµάτων εξισορρόπησης. Για την κατακράτηση το ph του δείγµατος πρέπει να λαµβάνει τέτοια τιµή ώστε ο αναλύτης και οι δραστικές οµάδες οι οποίες είναι προσδεµένες στο πυριτικό υπόστρωµα να είναι αντιθέτως φορτισµένες. Η επιλογή του πληρωτικού υλικού αποτελεί επίσης σηµαντικό παράγοντα µε κύριο χαρακτηριστικό την χωρητικότητα (εκφραζόµενη συνήθως σε mmol κατακρατούµενης ουσίας ανά g υλικού), επειδή προφανώς εάν η χωρητικότητα είναι µικρή δεν θα κατακρατηθεί η συνολική ποσότητα του αναλύτη. Επιπλέον η ταχύτητα ροής του δείγµατος καθώς και του εκλουστικού µέσου µέσω του πληρωτικού υλικού αποτελούν σηµαντικούς παράγοντες στην αποτελεσµατικότητα της τεχνικής αυτής λόγω του ότι απαιτείται καθορισµένος ελάχιστος χρόνος αλληλεπίδρασης αναλύτη και πληρωτικού υλικού (οι ετερογενείς χηµικές ισορροπίες δεν αποκαθίστανται ακαριαίως). Συνήθεις ταχύτητες ροής για την περίπτωση όπου το πληρωτικό βρίσκεται σε σωλήνα είναι 3 10 ml/min, ενώ στην περίπτωση κατά την οποία το πληρωτικό υλικό βρίσκεται σε δίσκο είναι ml/min. Σε κάθε περίπτωση για να είναι επαναλήψιµα τα αποτελέσµατα ενός διαχωρισµού (έστω και ατελούς) µε SPE είναι κρίσιµο να χρησιµοποιούνται πάντοτε οι ίδιες ροές. Για τον λόγο αυτό στο εµπόριο διατίθενται συστήµατα που ελέγχουν επακριβώς τις ροές αυτές (π.χ. µε έλεγχο της ταχύτητας κίνησης του εµβόλου σύριγγας που χορηγεί τα εκάστοτε διαλύµατα ή µε εφαρµογή της ίδιας υποπίεσης -κενού- σε µια οµάδα στηλών, βλέπε Σχήµα Β1β). 14