Ε.Κ.Π.Α. Βιολογίας_Τομέας Βοτανικής_Κοσμάς Χαραλαμπίδης. Ανάλυση Μοριακών Τεχνικών Γενετικής και Βιοτεχνολογίας

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Ε.Κ.Π.Α. Βιολογίας_Τομέας Βοτανικής_Κοσμάς Χαραλαμπίδης. Ανάλυση Μοριακών Τεχνικών Γενετικής και Βιοτεχνολογίας"

Ευφημία Νικολαΐδης
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Ανάλυση Μοριακών Τεχνικών Γενετικής και Βιοτεχνολογίας

2 Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση (Central Dogma) Prokaryotes Eukaryotes Replication (bp per sec) Transcription(bp per sec) Translation (aa per sec) Central Dogma

3 Απομόνωση DNA και RNA από βιολογικά δείγματα Total RNA Total DNA DNA pellet DNA

4 Exons vs. Introns

5 mrna processing (CAP & polya) The hnrna runs 5' 3' from the top left to lower right, where transcription terminates. [Right] Upon recognition of the AAUAAA signal and the e.g. GGUUUGUUGGUU signal, the 3' end is removed by an enzyme complex [CFI, II] at the cut site. Another enzyme complex [PA] synthesizes a poly(a) tail and ligates it to the free 3' of the pre-message.

6 Alternative polyadenylation 1. The poly(a) tail is important for the nuclear export, translation, and stability of mrna. 2. The tail is shortened over time, and, when it is short enough, the mrna is enzymatically degraded. 3. In a few cell types, mrnas with short tails are stored for later activation by re-polya in the cytosol. 4. In contrast, when polyadenylation occurs in bacteria, it promotes RNA degradation. 5. Polyadenylation also promotes sometimes degradation of non-coding RNAs in eukaryotic cells.

7 Τεχνικές στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Κατασκευή βιβλιοθηκών γονιδιωματικού υλικού Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών (GMPs)

8 Επιλογή μπλε-άσπρων αποικιών

9 Επιλογή μπλε-άσπρων αποικιών

10 Τεχνικές στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Κατασκευή βιβλιοθηκών γονιδιωματικού υλικού Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών (GMPs)

11 Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Πέψη του DNA με περιοριστική ενδονουκλεάση Ζωϊκό ή φυτικό DNA Εκατομμύρια τμήματα γονιδιωματικού DNA Ανασυνδυασμένοι βακτηριοφάγοι Ανασυνδυασμένα πλασμίδια Γονιδιωματική βιβλιοθήκη σε βακτηριοφάγους Εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια Πλάκες ή αποικίες Γονιδιωματική βιβλιοθήκη σε βακτήρια

12 Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε φάγους

13 Κατασκευή cdna βιβλιοθήκης Υβριδοποίηση του πρωταρχικού τμήματος (εκκινητή) Σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας με ανάστροφη μεταγραφάση Ανασυνδυασμένα πλασμίδια Εισαγωγή πλασμιδίων σε βακτήρια AscI AscI Πέψη με RNaseH για την απομάκρυνση της RNA αλυσίδας cdna βιβλιοθήκη σε βακτήρια AscI Σύνθεση της δεύτερης αλυσίδας με το Klenow fragment της DNA πολυμεράσης I Ανασυνδυασμένοι βακτηριοφάγοι AscI AscI Πέψη με τη νουκλεάση S1 NotI NotI AscI AscI cdna βιβλιοθήκη σε βακτηριοφάγους

14 Διαφορές μεταξύ γονιδιωματικής και cdna βιβλιοθήκης Όλο το γονιδίωμα Ρυθμιστικές περιοχές Τμήματα που δεν κωδικοποιούν Γονίδια που δεν εκφράζονται Μόνο τα γονίδια που εκφράζονται Άνιση αντιπροσώπευση κλώνων Απουσία ρυθμιστικών περιοχών Έκφραση σε βακτήρια και ζύμες

15 Τεχνικές στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Κατασκευή βιβλιοθηκών γονιδιωματικού υλικού Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών (GMPs)

16 Η τεχνική της PCR Kary Mullis Nobel Price Chemistry 1993

17 Η τεχνική της PCR Ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος σε > αντίγραφα dh2o Ρυθμιστικό διάλυμα Μήτρα DNA (δείγμα) Πρωταρχικά τμήματα PPP-νουκλεοτίδια Ιόντα Mg++ DNA πολυμεράση PCR

18 Η χρήση της τεχνικής PCR στη Μοριακή Βιολογία 1. Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και λειτουργίας 2. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA και γονιδίων 3. Ανίχνευση μολυσμένων με παθογόνα δειγμάτων 4. Εγκληματολογία και ταυτοποίηση πατρότητας 5. Ανίχνευση διαγονιδικών φυτών/προϊόντων

19 Η χρήση της PCR στην ανίχνευση μολυσμένων ατόμων HIV or H1N1 particles

20 Χρήση της VNTRs-PCR τεχνικής στην εγκληματολογία VNTR: διαδοχικές επαναλήψεις ποικίλου αριθμού (variable number tandem repeats)

21 Χρήση της VNTR-PCR τεχνικής στην εγκληματολογία / τεστ πατρότητας VNTR: variable number tandem repeats Ενίσχυση με PCR τριών διαφορετικών περιοχών για τη δημιουργία του DNA αποτυπώματος Probability of two persons 1 VNTR (10 alleles) = 1:65 4 VNTRs (10 alleles) > 1: VNTRs (10 alleles) > 1: Paternity = 1/ (99,9%) Guilt = 1/

22 Χρήση της VNTR-PCR τεχνικής στην εγκληματολογία

23 Detecting GMPs

24 Τεχνικές στη Μοριακή Βιολογία και Βιοτεχνολογία Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Κατασκευή βιβλιοθηκών γονιδιωματικού υλικού Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών (GMPs)

25 Agrobacterium Biolistics

26 Biolistic plant transformation methods

27 Agrobacterium tumefaciens

28 The Galls Can Be Huge Gall on stem Gall on leaf

29 Agrobacterium tumefaciens Α Χρωμοσωμικό DNA As As As vir mediated transformation F D G C Β Α LB E As As T-DNA As As RB VirG As As As As Δικοτυλήδονο φυτικό κύτταρο εκκρίνει φαινολικά παράγωγα μετά από τραυματισμό VirA As Ti-πλασμίδιο Agrobacterium tumefaciens Χημειόταξη Β As F G C Β Α VirG D E LB As As VirD As RB As Προσκόλληση Agrobacterium στην επιφάνεια του φυτικού κυττάρου VirA Agrobacterium tumefaciens Γ Αντιγραφή και μεταφορά του T-DNA Εγκοπή στο LB συνοριακό VirF Σύνθεση νέας Τ-DNA αλυσίδας Απελευθέρωση μονόκλωνης αλυσίδας T-DNA VirΕ2 VirD2 Agrobacterium tumefaciens VirB/D4 κανάλι TD N A Πυρήνας φυτικού κυττάρου

30 Agrobacterium tumefaciens mediated tranformation 1

31 Selection and plant regeneration by tissue culture

32 Ευχαριστώ

Σχετικά έγγραφα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της...

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της... ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της... Γενετική Μηχανική o Περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές με τις οποίες μπορούμε να επεμβαίνουμε στο γενετικό υλικό των οργανισμών.