ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ: Υπεροξυσώματα - Λυσοσώματα

Transcript

1 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ: Υπεροξυσώματα - Λυσοσώματα Μαριάννα Χ. Αντωνέλου, Ph.D. Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Αθηνών

2 YΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ Συμμετέχουν σε οξειδωτικές διαδικασίες μεταβολισμού Προστασία έναντι επικίνδυνων μεταβολιτών πχ. H 2 O 2 Οξείδωση αλκοολών-αποτοξίνωση ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Αποικοδόμηση βιομορίων (κυτταροποσία-κυτταροφαγία-αυτοφαγία) Ανακύκλωση μεταβολιτών Κυτταρικός θάνατος 2

3 Α. Υπεροξυσώματα 3

4 Ανακαλύφθηκαν πρόσφατα (60 χρόνια πριν) Eισαγωγή Απαραίτητα κυτταρικά οργανίδια. Βρίσκονται παντού: σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα (ζωικά και φυτικά) Μέσος χρόνος ζωής: 4-5 μέρες (ηπατικά) είναι πλειομορφικά (remarkably fluid and can change dramatically in abundance, size, shape and content in response to numerous cues) Λιγότερο κατανοητά ανάμεσα στα κλασσικά κυτταρικά οργανίδια Αίνιγμα: βιογένεση, διατήρηση, αποικοδόμηση (pexophagy), the fact that they can import large protein complexes Κατανόηση ρόλου σε: 1) διατήρηση κυτταρικής ομοιόστασης και βιωσιμότητας 2) Διάφορες ασθένειες στον άνθρωπο Υ movement Υ movement-2 Υ (Ρ) σε στενή σχέση με χλωροπλάστες (C) και mit σε φυτικό κύτταρο 4

5 ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ (Peroxisomes).. Γενικά Χαρακτηριστικά Ως Κυτταρικά Οργανίδια: Rhodin, 1954, κύτταρα νεφρού Porter & Caulfield, 1958, φυτικά κύτταρα De Duve: καθιέρωση του όρου Παραγωγή και διάσπαση τοξικού Η 2 Ο 2 (υπεροξειδάση) Αρχικός (και βασικός) ορισμός: Oργανίδια που περιέχουν τουλάχιστον μία οξειδάση και μία καταλάση για την παραγωγή και αποικοδόμηση H 2 O 2, αντίστοιχα 5

6 ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ (Υπεροξειδιοσώματα) (Υ) (Peroxisomes microbodies) Κυρίως σφαιρικά (0.1 to 1 μm in diameter) (επιμηκυσμένα, δικτυωτά σε ορισμένους κυτταρικούς τύπους ή συνθήκες) Μονή λιπιδική διπλοστοιβάδα (μεμβράνη) Å πάχος με διαμεμβρανικά συστατικά Μatrix: ηλεκτρονιόπυκνο υλικό (Κρυσταλλική μορφή) ΟΥΡΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗ Χωρίς DNA Eισαγωγή 6

7 ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ (Peroxisomes).. Γενικά Χαρακτηριστικά 7

8 Απομόνωση και Ταυτοποίηση ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ (Κλασμάτωση) Βιοχημικά Ιστο- Κυτταροχημικά (enz, DAB καταλάση) Ανοσο-ιστοχημικά Μορφολογικά Η/Μ Κυτοχρωμική Οξειδάση Καταλάση, Oυρική οξειδάση 8

9 Κυτταροχημική εντόπιση ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ 9

10 Eισαγωγή COS 7 cell expressing an ER marker (red) and a peroxisomal marker (green). Bar = 10 microns (Peter Kim) 10

11 Μεμβράνη Υ Υ-ΜΕΜΒΡΑΝΗ 1. peroxisomal membrane proteins (PMPs) (κυρίως μεταφορείς μεταβολιτών) 2. Peroxins 32 γνωστές peroxins. (υπεροξίνες) (βρίσκονται επίσης και στο κυτοσόλιο εκτός από τη μεμβράνη του Υ) Εμπλέκονται σε βιογένεση Υ, διαίρεση, μεταφορά πρωτεϊνών μεμβράνης και matrix Κωδικοποιούνται από PEX genes (14 (μόνο) από αυτά έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο) και εμπλέκονται σε Ασθένειες Βιογένεσης Υπεροξυσωμάτων (Peroxisome biogenesis disorders (PBDs) ΠΑΘΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ (μέχρι μεγέθους σακχαρόζης) ΕΝΕΡΓΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΜΟΡΙΩΝ ΚΑΙ ΙΟΝΤΩΝ?? ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ (ΑΤΡ) ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ/ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ (από μελέτες σε γενετικές ασθένειες) ΑΤΡ-άση Mg με σημαντικό ρόλο στη ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ Υ Protein aggergates 11

12 Λειτουργίες Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 most notable and highly conserved found in a few organisms or cell types found in a few organisms or cell types 12

13 Γλυοξυσώματα (glyoxysomes) φυτών και μυκήτων (παραγωγή ηλεκτρικού οξέος) Γλυκοσώματα (glycosomes): trypanosomes Woronin-bodies, filamentous fungi (1 function: plug septal pores in case of hyphal injury) Υπεροξυσώματα (peroxisomes) Φύλλα Ανώτερων Φυτών:Οξείδωση υποστρωμάτων, Διάσπαση Η 2 Ο 2 από Καταλάση, Φωτοαναπνοή (mit, χλωροπλάστες) OIKOΓΕΝΕΙΑ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ Overview of peroxisome functions in different organisms and tissues. Peroxisomes display a great variety in metabolic pathways as defined by their respective enzymatic content. Most eukaryotes share peroxisomal enzymes for fatty-acyl-coa metabolism (α- and β-oxidation) and detoxification of hydrogen peroxide by catalase. 13

14 Ορισμένα πρωτόζωα (πχ. Dictyostelium discoideum) έχουν τυπικά Υ Ποικιλότητα Υ Άλλα (ανάμεσα στα οποία τα παθογόνα για τον άνθρωπο μαστιγοφόρα πρωτόζωα Leishmania (Λεϊσμανίαση) and Trypanosoma spp, Ασθένεια του Ύπνου) έχουν εξειδικευμένα Υ: Γλυκοσώματα Έχουν τους ίδιους μηχανισμούς βιογένεσης και πρωτεϊνικής στόχευσης αλλά ΔΕΝ περιέχουν καταλάση (κύριο χαρακτηριστικό κλασσικών Υ) Αντίθετα, περιέχουν γλυκολυτικά ένζυμα (καταβολισμός γλυκόζης) (Στους περισσότερους οργανισμούς η γλυκόλυση συμβαίνει στο cyt κι όχι σε οργανίδια) ΠΑΡΟΥΣΙΑ Ο 2 (αερόβιες συνθήκες) Παραγωγή ΑΤΡ (μαζί με το ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟ) ΑΠΟΥΣΙΑ Ο 2 (αναερόβιες συνθήκες) Παραγωγή ΑΤΡ: ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΗ κάλυψη ενεργειακών αναγκών κυττάρου από γλυκόσωμα Electron micrograph of Trypansoma brucei 14

15 ΥΔΡΟΓΟΝΟΣΩΜΑΤΑ Πρωτόζωα γένους Trichomonas (χωρίς mit) με Ένζυμα για ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ πυροσταφυλικό οξύ οξικό οξύ + CO 2 + ΑΤΡ Παρουσία Ο 2 Μεταφορά απελευθερωμένων e - (μέσω φερεδοξίνης) στο Ο 2 : σχηματισμός Η 2 Ο Απουσία Ο 2 (αναερόβιες συνθήκες) Μεταφορά απελευθερωμένων e - στο Η + : σχηματισμός μοριακού Η 2 15

16 Ποικιλότητα Υ ΜΙΚΡΟ-ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ μικρότερα οργανίδια Ένζυμα Διάσπασης Η 2 Ο 2 Μεταβολισμός Μεταφορά / Αποθήκευση Λιπιδίων 16

17 Ποικιλότητα Υ Γλυοξυσώματα Φυτά και filamentous fungi περιέχουν ένζυμα β-oxidation, σύνθεσης και αποικοδόμησης H2O2 αλλά και σημαντικά ένζυμα του ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ (λίπη σε σάκχαρα) Woronin bodies Εξειδικευμένα Υ των filamentous fungi Εμπλέκονται σε διατήρηση κυτταρικής ακεραιότητας (επούλωση πληγών) Woronin bodies in a septum of Fusarium oxysporum. (Wergin, W.P Protoplasma 76: Â Springer-Verlag). 17

18 Ποικιλότητα λειτουργιών Σε ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Διαφορετικές, ποικίλουσες και σύμπλοκες λειτουργικότητες Στον άνθρωπο: Γενετικές ασθένειες Σύνθεση πλασμαλογόνων (ether phospholipids, plasmenylethalomines, plasmenylcholines): εμπλουτισμένα στο νευρικό, ανοσοποιητικό και καρδιαγγειακό σύστημα. Εμπλέκονται σε σηματοδότηση και προστασία κυττάρων από ROS Υ=Πλατφόρμες σηματοδότησης σε κύτταρα θηλαστικών: Σε περιπτώσεις μόλυνσης από ιούς η Υ- πρωτεΐνη-προσαρμοστής MAVS (mitochondrial antiviral signalling) επάγει την έκφραση αντι-ιικών παραγόντων βραχυπρόθεσμης άμυνας Η MAVS μεσολαβεί την ενεργοποίηση ενός σηματοδοτικού μονοπατιού που ενισχύει και σταθεροποιεί την αντι-ιική απόκριση Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec

19 Ποικιλία βιοχημικών λειτουργιών Λειτουργίες Εμπλέκονται σε: biosynthesis of plasmalogens (essential lipids for the brain, heart and muscles), cholesterol and bile acids (salts necessary for lipid digestion) Οξείδωση αλκοολών catabolism of purines and polyamines metabolism of prostaglandins photorespiration in plants (Παραγωγή αμινοξέων) Penicillin synthesis in fungi Μεταβολικές λειτουργίες (cyt, mit) (οξειδωτικές διαδικασίες μεταβολισμού, β-οξείδωση λιπαρών οξέων) Προστατευτικός Μηχανισμός έναντι: H 2 O 2 (υπεροξείδιο του υδρογόνου) Επικίνδυνοι μεταβολίτες 19

20 Λειτουργίες Μεταβολισμός: οξειδώσεις Αποτοξίνωση (απαλλαγή κυττάρου από τοξικές ουσίες) κυρίως H 2 O 2 (κοινό παραπροϊόν κυτταρικού μεταβολισμού) (περιέχουν ένζυμα μετατροπής H 2 O 2 σε νερό). Ορισμένοι τύποι Υ (πχ. αυτά στα ηπατικά κύτταρα) αποτοξινώνουν την αλκοόλη και άλλες επιβλαβείς ουσίες μεταφέροντας hydrogen από τις ουσίες αυτές στο Ο2 (oxidation). Peroxisomes carry out various oxidative reactions that are tightly regulated to adapt to the changing needs of the cell and varying external environments Χρησιμοποιούν σημαντικές ποσότητες Ο2 20

21 Αυτά τα χαρακτηριστικά των Υ στάθηκαν ιδιαίτερα σημαντικά εκατομμύρια χρόνια πριν όταν ακόμα τα κύτταρα δεν περιείχαν mit Γήινη ατμόσφαιρα: συσσώρευε τεράστια ποσά Ο 2 λόγω της δράσης των φωτοσυνθετικών βακτηρίων. Λειτουργίες Τα Υ τότε: πρωταρχικώς υπεύθυνα για την αποτοξίνωση των κυττάρων μειώνοντας τα επίπεδα του Ο 2 στα κύτταρα (δηλητήριο για τις περισσότερες μορφές ζωής). Αργότερα που προέκυψαν τα mit, τα Υ κατέστησαν λιγότερο σημαντικά (κατά κάποιο τρόπο) καθώς τα νέα οργανίδια χρησιμοποιούσαν Ο 2 για να διεκπεραιώσουν πολλές από τις λειτουργίες των Υ κι επιπρόσθετα, μπορούσαν να παράγουν ενέργεια (ATP). Eξελικτικά: στους πρώτους αερόβιους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, το Υ ήταν η βασική θέση διεξαγωγής των αναπνευστικών αντιδράσεων 21 Όταν αργότερα επεκράτησε η αερόβια ανάπτυξη: ο ρόλος πέρασε στα μιτοχόνδρια

22 Ασθένειες Η σημασία των Υ για την σωστή κυτταρική λειτουργία αποτυπώνεται σε μία σειρά κληρονομικών ασθενειών (Ασθένειες βιογένεσης Υ, peroxisomal biogenesis disorders) (Απουσία/Ανεπάρκεια Υ) Σύνδρομο Zellweger Νεογνική Αδρενο-λευκοδυστροφία (Neonatal Adrenoleucodystrophy) Infantile Refsum's disease Μεταλλαγές: 1. ένζυμα Υ 2. σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη συγκρότηση των Υ 22

23 ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ.... ΠΛΗΘΟΣ ΚΑΙ ΤΟΠΟΛΟΓΙΑ οργανίδια / κύτταρο (Ηπατοκύτταρα) Αύξηση αριθμού κατά την εμβρυική και μετεμβρυϊκή ανάπτυξη και κατά την αναγέννηση του ήπατος Τοπολογία: κοντά σε μεμβράνες Σχέση με Μεμβρανικό Δίκτυο (ΕΔ, Βιογένεση??) «ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΙΚΟ ΔΙΚΤΥΟ» (σύνδεση Υ με μεμβρανική σύντηξη) 23

24 Λειτουργίες ΕΤΕΡΟΓΕΝΗ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ με διαφορετικές λειτουργίες στους διάφορους οργανισμούς Ποικιλία Ενζύμων με δράση σε διάφορες Μεταβολικές Οδούς ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ & ΚΑΤΑΛΑΣΗ Η 2 Ο 2 ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ακυλο-coa ΚΛΠ Οξειδωτική διάσπαση λιπαρών οξέων ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ Μεταβολισμός αλκοόλης ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ (φυτά) ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΠΟΥΡΙΝΩΝ 24

25 Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Λειτουργίες ΦΛΑΒΙΝΟ-ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ & ΚΑΤΑΛΑΣΗ Η 2 Ο 2 οξειδώσεις Οξειδάση RH 2 + O 2 R + H 2 O 2 10% κατανάλωση Ο 2 στα ηπατικά κύτταρα απορροφάται από ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ Τα Υ έχουν όλα τα ένζυμα για το σχηματισμό και την αποικοδόμηση του Η 2 Ο 2 R: Υδρογονάνθρακας οξειδώσεις H 2 O 2 + RH 2 Καταλάση Καταλάση H 2 O 2 H 2 O + ½O 2 2Η 2 Ο + R Άμεση διάσπαση του τοξικού μορίου Η2Ο2 Η 2 Ο 2 : οξείδωση βιομορίων διάσπαση από καταλάση ΚΑΤΑΛΑΣΗ: 33% σε υπεροξυσώματα ηπατοκυττάρων Το Η 2 Ο 2 είναι τοξικό προϊόν του μεταβολισμού-η τοξικότητά του σχετίζεται άμεσα με την παραγωγή ελεύθερων ριζών 25

26 ΚΑΤΑΛΑΣΗ Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Λειτουργίες 3 τύποι: Α (Υπεροξυσωμάτων: kda) Τ (Κυτοσολίου: kda) Μ (Μιτοχονδρίων: 240 kda) ΚΑΤΑΛΑΣΗ Α 4 Πολυπεπτιδικές Αλυσίδες 4 Μόρια Αίμης (1 μόριο αίμης / αλυσίδα) Κυτταροπλασματική Σύνθεση Ελεύθερα Ριβοσώματα Αυτοσυγκρότηση Τετραμερούς Ενζύμου: Σύνδεση Μονομερών (χωρίς Αίμη ΑΠΟΚΑΤΑΛΑΣΗ) με Αίμη 26

27 Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Βιογένεση Υ ΔΙΑΛΟΓΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΣΤΟ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ Κυτοσολικός Υποδοχέας PT-S1R (Pex5p) Αναγνώριση & Δέσμευση ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ σύνδεση με την KANL αλληλουχία (COOH-άκρο ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ) Στόχευση ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ στο ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ (& μηχανισμός ΕΙΣΟΔΟΥ) μέσω ειδικών μεμβρανικών υποδοχέων (Pex14p) οργανιδίου 27

28 Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Βιογένεση Υ ΔΙΑΛΟΓΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΣΤΟ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ 28

29 Η διαδικασία εισαγωγής πρωτεϊνών στο Υ είναι μοναδική γιατί τα Υ έχουν την ικανότητα να εισάγουν διπλωμένες στην τελική τους μορφή matrix πρωτεΐνες ή ακόμα και ευμεγέθη ολιγομερή πρωτεϊνών (vs. mit, chloroplasts και ΕΔ which only import unfolded polypeptides) Πώς???? Βιογένεση Υ Ο μηχανισμός παραμένει αίνιγμα 1. η Υ μεμβράνη δεν είναι διαπερατή παρά μόνο σε μικρούς μεταβολίτες. 2. Υδάτινος πόρος την Υ-μεμβράνη? δεν έχει βρεθεί ακόμα κάποια δομή πόρου που θα μπορούσε να μεσολαβεί αυτήν την εισαγωγή Αρκετές θεωρίες: transient import structures (transient pore hypothesis, membrane invagination model κλπ) Παροδικοί πόροι μεταφοράς εισαγόμενων πρωτεϊνών (κανάλια). Οι μεμβρανικοί υποδοχείς εισαγωγής πρωτεϊνών φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό του In fact, the PTS1 receptor Pex5p proved to have many properties expected for a transient-pore-forming protein. A considerable portion of the membrane-bound fraction of Pex5p behaves as an intrinsic membrane protein and forms a stable complex with components of the docking complex Rucktäschel et al., Biochimica et Biophysica Acta 1808: , 2011) Erdmann, R. & Schliebs, W. Peroxisomal matrix protein import: the transient pore model. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6, (2005). 29

30 Βιογένεση Υ Γιατί???? Τα μοντέλα προτείνουν ότι ο ολιγομερισμός της μεταφερόμενης Υ-πρωτεΐνης στο cyt : 1. ενδέχεται να βελτιώνει την αποδοτικότητα της εισαγωγής εξασφαλίζοντας την εγγύτητα πολλών υποδοχέων οι οποίοι μπορούν να σχηματίσουν ένα κανάλι μεταφοράς στην Υ μεμβράνη 2. είναι ίσως σημαντικός για πρωτεΐνες οι οποίες δεν μπορούν να διπλωθούν σωστά στο matrix των Υ Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec

31 Λειτουργίες ΑΛΛΕΣ ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ (οξειδώνουν τα αντίστοιχα βιομόρια) ΠΟΛΥ-ΑΜΙΝΟ-ΟΞΕΙΔΑΣΗ α-υδροξυ-οξινη ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΑΚΥΛΟ-CoA ΟΞΕΙΔΑΣΗ D-ΑΜΙΝΟΞΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ ΗΠΑΤΟΣ ΣΕ: Βιοσύνθεση ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ Βιοσύνθεση ΧΟΛΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Βιοσύνθεση ΠΛΑΣΜΑΛΟΓΟΝΩΝ (Φωσφολιπίδια εγκεφαλικού ιστού / μυός) 31

32 β-οξειδωση ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ (25-50% οξειδωτικής διάσπασης λ.ο. στα Υ (mit)) Η πλειονότητα των Υ αποικοδομεί τα λιπαρά οξέα, ιδιαίτερα αυτά που έχουν μακριά αλυσίδα ENΕΡΓΕΙΑ: Ελευθερώνεται ως ΘΕΡΜΟΤΗΤΑ (δεν αποθηκεύεται ως ΑΤΡ) ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΑΚΥΛΟ-CoA ΘΕΡΜΟΓΕΝΕΣΗ Λειτουργίες 32

33 β-οξειδωση ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ (25-50% οξειδωτικής διάσπασης λ.ο. στα Υ (mit)) Λειτουργίες β-οξειδωση ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ (οξειδωτική διάσπαση) Παραγωγή Ακετυλο-CoA Κύκλος Krebs Παραγωγή Η 2 Ο 2 Παραγωγή ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ (ΘΕΡΜΟΓΕΝΕΣΗ) Έκθεση αρουραίων σε ΨΥΧΟΣ Αύξηση Οξείδωσης Λιπαρών Οξέων στο ΛΙΠΩΔΗ ΙΣΤΟ Ανάπτυξη / Βιογένεση ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ 33

34 ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ Κύρια Πηγή Ενέργειας Ζωικών Κυττάρων (εξαίρεση ερυθροκύτταρα & νευρικά κύτταρα) Λειτουργίες β-οξειδωση =Αποικοδόμηση/Διαδοχική ΑΠΟΚΟΠΗ ΑΚΕΤΥΛΟΜΑΔΩΝ Lazarow & de Duve: ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ & ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ 1. ΜΕ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ ΕΝΔΙΑΜΕΣΟΥ ΜΗΚΟΥΣ (10 20 C) Εστεροποίηση με CoA στο Κυτταρόπλασμα Διαδοχική Μεταφορά στο Υ διαμέσου Διαμεμβρανικών Υποδοχέων 2. ΜΕ ΜΑΚΡΙΕΣ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ Αρχική ΕΙΣΟΔΟΣ στο ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ Ένωση με CoA εντός ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΟΣ (Υ) Ειδική Άκυλο-CoA Συνθετάση (Υ) για ΜΑΚΡΙΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ Άκυλο-CoA Συνθετάση των Υ Λιπαρά Οξέα Άκυλο-συνένζυμο Α* 34

35 ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ Λειτουργίες ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΟΣ: Διαφορετικά ένζυμα από εκείνα μιτοχονδρίων (πχ. εξειδικευμένη ακυλο- CoA συνθετάση για αναγνώριση επιμηκυμένων αλειφατικών αλυσίδων λιπαρών οξέων) Χρησιμοποιείται παράλληλα και κυρίως για αποικοδόμηση VLCFAs (> 20 C) (δεν οξειδώνονται στα Mit) Προετοιμασία μορίων (ελάττωση αριθμού ατόμων C) για διάσπαση στα Μιτοχόνδρια Μεταφορά μορίων από Υ Mit με ΔΙΑΧΥΣΗ (ΓΕΙΤΝΙΑΣΗ ΟΡΓΑΝΙΔΙΩΝ) 35

36 ΟΡΜΟΝΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΣΤΑ Υ???? Λειτουργίες Κύκλος Krebs Δυσλειτουργία β-οξείδωσης Λιπαρών Οξέων στα ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ: Συσσώρευση Λιπαρών Οξέων Μακριών Αλειφατικών Αλυσίδων Ανεπάρκεια λειτουργίας κυττάρων Μιτοχόνδριο Υ Γλυοξυλικός 36 Κύκλος

37 ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Τα Υ των ηπατικών και νεφρικών κυττάρων είναι σημαντικοί τόποι αποτοξίνωσης MetOH, αλκοόλης, φαινολών κλπ Κύτταρα Μαγιάς σε ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕΘΑΝΟΛΗΣ Υπερτροφικά Υ με ΑΛΚΟΟΛΙΚΕΣ ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ (οξείδωση αλκοόλης) ΚΑΤΑΛΑΣΗ (διάσπαση Η 2 Ο 2 που παράγεται από την οξείδωση) Στόχος: Αποικοδόμηση ΑΛΚΟΟΛΗΣ Συμμετοχή Υ σε ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟ ΑΛΚΟΟΛΗΣ: Σακχαρομύκητας (!) 1.τρομακτική αύξηση #Υ (αλκοολική οξειδάση και καταλάση) 2. Παραγωγή Φορμαλδεΰδης 3. Μεταβολισμός φορμαλδεϋδης (Cyt/Mit) για παραγωγή ΑΤΡ Λειτουργίες 37

38 ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Οι τοξικές ενώσεις αδρανοποιούνται υφιστάμενες οξείδωση από την ΚΑΤΑΛΑΣΗ Η 2 Ο + 1/2Ο 2 Καταλάση οξείδωση αλκοόλης CH 3 OH + O 2 HCHO + H 2 O 2 Διάσπαση Η 2 Ο 2 CH 3 OH + H 2 O 2 Μεθυλική Οξειδάση Καταλάση HCHO + 2H 2 O ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ 2HCHO + 2NAD + O 2 Αφυδρογονάση Φορμαλδεΰδης 2CO 2 + 2NADH ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ NADH + ADP + Pi NADH Αφυδρογονάση ATPάση NAD + ATP ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟ 38

39 ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Το περιεχόμενο αυτών των Υ του σακχαρομύκητα έχει κρυσταλλική δομή λόγω της αλκοολικής οξειδάσης Τα μόρια της καταλάσης μπορούν να κινούνται ελεύθερα μέσα σε αυτό το πλέγμα 39

40 Λειτουργίες Υ 40

41 ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Λειτουργίες Υ Πείραμα: ΧΡΗΣΗ ΟΙΝΟΠΝΕΥΜΑΤΟΣ σε πειραματόζωα: Αυξημένη παρουσία ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ στα κύτταρα μυοκαρδίου Μηχανισμός προστασίας (μέσω δράσης ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ στα μόρια της αλκοόλης) ΑΜΙΝΟΤΡΙΑΖΟΛΗ: Αναστολέας ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ: Καρδιακές Διαταραχές Υ σε ΗΠΑΤΟΚΥΤΤΑΡΑ: Αποτοξίνωση 50% ποσότητας αλκοόλης στο αίμα Αλκοόλη οξειδώνεται σε ακεταλδεϋδη CH 3 CHO (από την Καταλάση παρουσία H 2 O 2) 41

42 ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Πείραμα: Καλλιέργεια ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΑΓΙΑΣ παρουσία ΑΖΩΤΟΥΧΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Ανάπτυξη ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ με ΑΜΙΝΟ-ΟΞΕΙΔΑΣΗ (αντί για ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ) & ΚΑΤΑΛΑΣΗ Τα κύτταρα «εξοπλίζουν» τα Υ με διαφορετικά ένζυμα ανάλογα με τις ανάγκες τους 42

43 Γλυοξυσώματα Ποικιλότητα Υ Φυτά και filamentous fungi περιέχουν ένζυμα β-oxidation, σύνθεσης και αποικοδόμησης H 2 O 2 αλλά και σημαντικά ένζυμα του ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ (μετατροπή λιπών σε σάκχαρα, σε συνδυασμό με τα mit) Συχνά συνυπάρχουν στα φυτά με τα κλασσικά Υ (εντοπισμός με διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης). Περιέχουν και αυτά κρυσταλλικά έγκλειστα 43

44 ΓΛΥ(Κ)ΟΞΥΣΩΜΑΤΑ= εξειδικευμένα Υ Λειτουργίες Υ Φυτικοί Ιστοί (ιδιαίτερα σε σπόρους φυτών, ενδοσπέρμιο, κοτυληδόνες που αποταμιεύουν λίπη) Ενδοκάρπιο Βλαστάνοντα Σπέρματα Μετατροπή Λιπιδίων σε Υδατάνθρακες Ένζυμα Μαλεϊκή Συνθετάση Ισοκιτρική Λυάση Οξειδάση Παραγωγή Η 2 Ο 2 : COOH.CH 2 OH + O 2 COOH.CHO + H 2 O 2 (Γλυκολικό) Οξειδάση (Γλυοξυλικό) 44

45 ΓΛΥ(Κ)ΟΞΥΣΩΜΑΤΑ= εξειδικευμένα Υ Λειτουργίες Υ β-οξείδωση λιπαρών οξέων + Κύκλος γλυοξυλικού οξέος υδρόλυση Τριγλυκερίδια Λιπαρά οξέα Παραγωγή σακχάρων: γλυκονεογένεση Είσοδος λιπαρών οξέων σε Γλυοξυσώματα β-οξείδωση Λιπαρά οξέα ακέτυλο CoA Κύκλος γλυοξυλικού οξέος ακέτυλο CoA ηλεκτρικό οξύ produce intermediate products for the synthesis of sugars Μεταφορά ηλεκτρικού οξέος σε Mit Κύκλος Krebs Ηλεκτρικό οξύ οξαλοξικό οξύ To οξαλοξικό οξύ δια του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος παράγει σάκχαρα στο κυτταρόπλασμα 45

46 ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ (ΓΚ): Λειτουργίες Υ Δευτερεύουσα Μεταβολική οδός ευκαρυωτικών κυττάρων Χρήση ποικιλίας καυσίμων για ΑΝΑΠΤΥΞΗ & ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ Κornberg & Krebs, 1957 ΚΥΚΛΟΣ Krebs: Οξείδωση Ακετυλο-CoA σε 2 μόρια CO 2 ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ: Συμπύκνωση 2 μορίων Ακετυλο-CoA σε ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΟΞΥ Κιτρική Συνθετάση ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ Ακονιτάση Κοινά Ένζυμα Κύκλου Krebs (Μιτοχόνδριο) Μαλεϊκή Αφυδρογονάση Μαλεϊκή Συνθετάση Ισοκιτρική Λυάση Αποκλειστικά Ένζυμα ΓΚ (Υ) 46

47 ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ (ΓΚ): Λειτουργίες Υ 2x Κιτρική Συνθετάση Ακονιτάση Μαλεϊκή Αφυδρογονάση Μαλεϊκή Συνθετάση Ισοκιτρική Λυάση Τα σπέρματα των φυτών περιέχουν και τα 5 ένζυμα του κύκλου Σε άλλες περιπτώσεις το Υ περιέχει μόνο 2/5 ένζυμα πραγματοποιείται μόνο τμήμα του ΓΚ 47

48 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΣΧΕΣΗ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΙ ΚΥΚΛΟΥ KREBS Λειτουργίες Υ Succinate travels from the glyoxysomes to the mitochondria, where it is converted to oxaloacetate Βακτήρια ΚΑΙ σε ανώτερους ΖΩΙΚΟΥΣ οργανισμούς Σε ορισμένους ιστούς σε συγκεκριμένη αναπτυξιακή φάση διαμέσου ΓΚ των Υ: ΓΛΥΚΟΝΕΟΓΕΝΕΣΗ (Βιοσύνθεση ΓΛΥΚΟΖΗΣ / ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ) (Έμβρυο Όρνιθας, Ήπαρ Ινδικού Χοιριδίου κλπ) 48

49 Λειτουργίες Υ ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ: Φυτικά κύτταρα (Εντός του ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΗ) Επαγωγή από ΦΩΣ Διαφορετική από τη συνήθη ΑΝΑΠΝΟΗ: Πρόσληψη Ο 2 Αποβολή CO 2 Δεν παράγεται ΑΤΡ Παράγεται ΓΛΥΚΟΛΙΚΟ ΟΞΥ 49

50 ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Υ: μεταβολισμός γλυκολικού οξέος (παραπροϊόν φωτοσύνθεσης) Διάχυση στο cyt και εισαγωγή στο Υ Μεταφορά γλυκολικού οξέος στο ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ οξειδάση Γλουταμινική-γλυοξυλική αμινοτρανσφεράση 50

51 Λειτουργίες Υ 51

52 Λειτουργίες Υ ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΤΟΠΟΛΟΓΙΚΗ ΓΕΙΤΝΙΑΣΗ ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΗ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΟΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Η γειτνίαση επιβεβαιώνει τη λειτουργική τους σχέση και αλληλεπίδραση 52

53 Λειτουργίες Υ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ (ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ) ΠΟΥΡΙΝΩΝ ΑΔΕΝΟΣΙΝΗΣ ΚΑΙ ΓΟΥΑΝΙΝΗΣ ΟΥΡΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ 53

54 ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ Βιογένεση Υ Τα Υ δε διαθέτουν DNA, transcription/translation machineries Όλες οι πρωτεΐνες τους κωδικοποιούνται από το πυρηνικό DNA κι άρα εισάγονται στα Υ από το cyt Πρωτεΐνες Υ για: 1. Χυμό Υ (peroxisomal matrix, ένζυμα) 2. Μεμβράνη Υ 1. Εισαγωγή ενζύμων στο Υ (matrix proteins) 20min Σύνθεση Υ-ενζύμων: στο cyt (στα ελεύθερα πολυριβοσώματα) Μετα-ΜΦΡ εισαγωγή στο αναπτυσσόμενο Υ Αναγνώριση από κυτοσολικούς υποδοχείς Στόχευση συμπλόκου σε μεμβρανικό υποδοχέα Υ (docking complex, σύμπλοκο αγκύρωσης) Eισαγωγή στο Υ matrix (via a translocation pore) Ανακύκλωση υποδοχέα (από την Υ μεμβράνη στο cyt) 54

55 Βιογένεση Υ Perοxins (υπεροξίνες) (βρίσκονται στο κυτοσόλιο ή στη μεμβράνη Υ) 1. Εισαγωγή ενζύμων στο Υ (matrix proteins) Peroxisomal Targeting Signals-PTSs Διαλογή πρωτεϊνών για είσοδο στο Υ: Αλληλουχία στόχευσης: PTS1: SKL tripeptide (Ser-Lys-Leu) (COOH-terminal, used by the majority of Y matrix proteins, +/- targeting experiments, πχ. οξειδάσες, λουσιφεράση κλπ). Αναγνωρίζεται από τον cyt υποδοχέα εισαγωγής PEX5 PTS2: 26-aa peptide (NH2-terminal, πχ. Θειολάση. While in mammals only a few proteins are targeted to Y via the PTS2-pathway, in plants, approximately one third of Y proteins harbor a PTS2) Αναγνωρίζεται από τον cyt υποδοχέα εισαγωγής PEX7 55

56 O μηχανισμός εισαγωγής μεμβρανικών πρωτεϊνών (peroxisome membrane proteins (PMPs) στο Υ είναι εντελώς διαφορετικός και λειτουργικά ανεξάρτητος σε σχέση με αυτόν της εισαγωγής των ενζύμων του Υ χυμού. 2. Εισαγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών στο Υ Most PMPs are synthesized on free polysomes in the cytosol and post-translationally inserted into peroxisomal membranes by one of two pathways: 1) direct targeting to Y (class I proteins) 2) or targeting via the ER (class II proteins) CLASS-I proteins (most of the PMPs) 1. The peroxisomal membrane protein (PMP) is targeted directly to Y through the interaction of its membrane PTS (mpts) with the cytoplasmic receptor Pex19 2. PEX19 cargo complexes are then recruited to Y by membrane-bound PEX3 (or PEX16 in mammalian cells) 3. cargo PMPs are inserted into the membrane and assembled into complexes by mechanisms that are mediated by the chaperone activity of PEX19 Pex19 then mediates the assembly of PMPs into complexes. CLASS-II proteins PMPs can also be targeted to peroxisomes by insertion into the endoplasmic reticulum (ER) membrane followed by vesicular transport to Y Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 Βιογένεση Υ 56

57 Βιογένεση Καθώς όλο και περισσότερες πρωτεΐνες εισέρχονται στο matrix του Υ ή στη μεμβράνη του, το οργανίδιο μεγαλώνει και τελικά φτάνει στο σημείο που διασπάται σε δύο θυγατρικά Υ Πάντα??? 57

58 growth and division pathway: Οι περισσότερες Υ-πρωτεΐνες συντίθενται σε ελεύθερα ριβοσώματα στο Cyt και εισάγονται στο Υ από το cyt. Από προϋπάρχοντα Υ με διάσπαση (fission), χρησιμοποιώντας νέες πρωτεΐνες και λιπίδια που παρέχονται από το ΕΔ με τη μορφή κυστιδίων (κλασσικά κυστίδια, μπορούν να ενσωματωθούν σε ώριμα Υ, στη ζύμη περιέχουν PEX3). Η διάσπαση ευνοείται από την αύξηση του μεγέθους του Υ και μεσολαβείται από τις πρωτεΐνες: PEX11 Ρυθμιστικοί παράγοντες: φωσφορυλίωση, ολιγομερισμός PEX11 (redox-sensitive) κλπ) Βιογένεση Υ de novo biogenesis pathway: Τα Υ μπορούν να εξαφανίζονται από ένα κύτταρο και στη συνέχεια να ξαναγίνονται de novo (unlike mitochondria). Προ-Υ κυστίδια εκβλαστάνουν από το ΕΔ και ακολούθως συγχωνεύονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν ώριμα Υ (αυτά τα Υ περιέχουν all new material) Τα κυστίδια είναι διαφορετικά μεταξύ τους (ως προς τη σύσταση των Υ πρωτεϊνών), δεν έχουν δυνατότητα συγχώνευσης με ώριμα Υ και δεν περιέχουν matrix proteins μέχρι να ολοκληρωθεί ο σχηματισμός τους Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec

59 Αποικοδόμηση Υ Mechanism of Pexophagy Pexophagy: στόχευση Υ στο μονοπάτι αυτοφαγίας. Τα Υ σημαίνονται προς αποικοδόμηση διαμέσου της συσσώρευσης ubiquitinated membrane proteins. Η ουμπικουιτίνη στην επιφάνεια των Υ στρατολογεί διάφορες πρωτεΐνες που προσδένονται ειδικά σε ubiquitin (όπως οι p62 και NBR1) κι έτσι στοχεύονται τα Υ προς έγκλειση σε αυτοφαγοσώματα για αποικοδόμηση. Ο μηχανισμός της ουμπικουιτινιλίωσης των Υ είναι άγνωστος. Kim P.K., Hailey D.W., Mullen R.T., Lippincott-Schwartz J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. (2008) PNAS. 105 (52):

60 Βιογένεση Υ Πώς αποδεικνύεται η λειτουργικότητα αυτών των πρωτεϊνών????? 1. Έλλειψή τους σε μεταλλαγμένα στελέχη μικροοργανισμών συσσώρευση Υ πρωτεϊνών σε cyt και ΕΔ και ghosts-y (άδεια Υ) 2. Κληρονομικές ασθένειες στον άνθρωπο- Ασθένειες βιογένεσης Υ Απουσία/Ανεπάρκεια λειτουργικών Υ, πολυάριθμα Υ με έλλειψη πρωτεϊνών Υ χυμού και αδυναμία βιογένεσης μεμβράνης Υ κλπ Βλάβες στα γονίδια PEX At present, 32 different PEX genes have been discovered which are required for the biogenesis and maintenance of functional peroxisomes Παρότι οι επιδράσεις αυτών των μεταλλαγών στη λειτουργικότητα/συγκρότηση των Υ μπορούν να αφορούν σε διάφορα όργανα (ήπαρ, νεφροί, αίμα, καρδιά) όλες οι Υ ασθένειες επιδρούν στην ανάπτυξη και λειτουργικότητα του εγκεφάλου 60

61 Ασθένειες Υ Σύνδρομο Ζellweger (εγκεφαλο-ηπατο-νεφρικό σύνδρομο) Νεανική ασθένεια Βαριά κλινικά συμπτώματα (πνευματική υστέρηση, νευρολογικά, δυσμορφίες, ηπατοσπληνομεγαλία ) Ανωμαλίες σε όλα τα οργανικά συστήματα και τους ιστούς Έλλειψη Υ ή ghosts-y Συσσώρευση λιπαρών οξέων μακριάς αλυσίδας (σε ορό και ιστούς) Μεταλλαγές σε γονίδια Pex-2 (PAF-1, peroxisomal assembly factor), Pex-1, Pex-3, Pex-5, Pex-6, Pex-12 (παράγοντες βιογένεσης Υ) 61