Αποχύνουμε σε 20 τρυβλία LB θρεπτικού άγαρ περίπου 12 ml στο καθένα και τα ονομάζουμε LB.

Transcript

1

2 1 η ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ / ΗΜΕΡΑ 1 η Τα τρυβλία με το άγαρ προετοιμάζονται 3-7 μέρες νωρίτερα Για το άγαρ προσθέτουμε 500ml απιονισμένο νερό σε 2 φιάλες (Erlenmeyer) 250mL και προσθέτουμε σε κάθε μία τη μισή ποσότητα του περιεχόμενο του LB θρεπτικού άγαρ πακέτου. Ανακινούμε καλά και θερμαίνουμε σε σημείο βρασμού στο φούρνο μικροκυμάτων ή σε ηλεκτρικό μάτι. Με την χυτρα ταχύτητος αποστειρώνουμε το LB θρεπτικό άγαρ (μεγιστή θερμοκρασία μέχρι να σφυρίξει και μετά 20min σε χαμηλή θερμοκρασία) (7,5gr agar+12,5gr LB σε 500ml) ή 1,5gr agar+2,5gr LB σε 100ml Αποχύνουμε σε 20 τρυβλία LB θρεπτικού άγαρ περίπου 12 ml στο καθένα και τα ονομάζουμε LB.

3 Η αραβινόζη ειναι σε στερεή μορφή και με την βοήθεια πιπέτας προσθέτουμε στο φιαλίοδιο της 3ml διαλύματος μετασχηματισμού (50mM CaCl2 ph6,1) ή απιονισμένου αποστειρωμένου νερού Το ιδιο κάνουμε και στο φιαλίδιο της αμπικιλίνης Στο υπόλοιπο LB θρεπτικό άγαρ προσθέτουμε την αμπικιλίνη και αποχύνουμε σε 20 τριβλία περίπου 12 ml και τα ονομάζουμε LB/amp Στο υπόλοιπο LB θρεπτικό άγαρ+αμπικιλίνη προσθέτουμε την αραβινόζη και αποχύνουμε σε 10 τριβλία περίπου 12 ml στο καθένα και τα ονομάζουμε LB/amp/ara

4 2 η ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ / ΗΜΕΡΑ 2 η (3-7 μέρες μετά) Με μία αποστειρωμένη πιπέτα προσθέτουμε 300 μl διάλυμα ματασχηματισμού στην στεροποιημένη E.coli. Ανακινούμε το φιαλίδιο και το αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για 5min. Aποθηκεύουμε την E.coli στο ψυγείο για 24 ώρες και μετά συνεχίζουμε το πείραμα. ΗΜΕΡΑ 3 η Φτιάχνουμε 10 καλλιέργιες Ε.coli επιμολύνοντας 10 τρυβλία LB με ενυδατομένη E.coli που παρασκευάσαμε την προηγουμένη. Η επιμόλυνση του θρεπτικού υλικού γίνεται όπως στην εικόνα δίπλα. Μπορούμε να τοποθετήσουμε 20μl βακτηρίου με μικροπιπέτα και στη συνέχεια να απλώσουμε όπως στις εικόνες και τα video

5 οι εικόνες δίπλα σας δείχνουν πως να απλώσετε τα βακτήρια στο τρυβλίο για καλλιέργεια με σκοπό να πετύχετε ανάπτυξη αποικιών κλώνων. Χρησιμοποιόντας αποστειρωμένη πιπέτα ρίχνουμε 300μl διαλύματος μετασχηματισμού στο φιαλίδιο που περιέχει σε στερεή μορφή το pglo plasmid DNA Χωρίζουμε το υπόλοιπο διάλυμα μετασχηματισμού σε 5 φιαλίδια (ένα για κάθε ομάδα) 3 η ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ / ΗΜΕΡΑ 4 η (2-3 μέρες μετά) Χαρακτηρίζουμε 2 κλειστά microtubes +pglo και pglo Τοποθετούμε τα microtubes σε στατό Ανοίγουμε τα 2 microtubes και με αποστειρωμένη πιπέτα βάζουμε 250μl διαλύματος μετασχηματισμού σε κάθε φιαλίδιο. Και τα τοποθετούμε στον πάγο

6 Χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη ράβδο με loop στη άκρη πέρνουμε απο μία αποικία βακτηρίων απο το τρυβλίο με την E.coli και την τοποθετούμε μέσα σε κάθε microtube και με περιστροφικές κινήσεις ανακατέβουμε στο διάλυμα μετασχηματισμού την αποικία σε κάθε microtube. Τοποθετείστε τους microtubes πίσω στο πάγο Με μία νέα αποστειρωμένη ράβδο με loop απο το φιαλίδιο του πλασμιδίου πέρνουμε διάλυμα του πλασμιδίου που εμφανίζεται σαν φουσκάλα στο δακτύλιο της ράβδου. Αναμειγνύετε το διάλυμα του πλασμιδίου στα κύτταρα του microtube +pglo. Αν χρειαστεί βάλτε 20μl διαλύματος πλασμιδίου με τη βοήθεια μικροπιπέτας Δεν βάζουμε διάλυμα πλασμιδίου στο microtube pglo Βάλτε βαθία μέσα στον πάγο τα microtubes Και επωάστε για 10 min Ενω επωάζονται τα δείγματα μας, τιτλοδοτούμε τα τρυβλία με το άγαρ όπως φαίνεται δίπλα στη εικόνα

7 Θερμικό σοκ. Με την βοήθεια του στατό μεταφέρετε και τα δύο microtubes (+pglo και pglo ) στο υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 42 ο C για ακριβώς 50 sec στη συνέχεια τοποθετείστε πολύ γρήγορα ξανά το στατό στον πάγο και επωάστε για 2min. Το LB-Broth χωρίζετε σε 5 φιαλίδια (ένα για κάθε ομάδα) Με δύο νέες αποστειρωμένες πιπέτες αποχύστε 250 μl διάλυμα LB ανάπτυξης σε κάθε microtube αφού τα έχετε αφαιρέσει απο τον πάγο και το στατό Στη συνέχεια επωάστε για 10 min σε συνθήκες δωματίου τα δείγματα σας Χρησιμοποιώντας μία νέα αποστειρωμένη πιπέτα για κάθε τρυβλίο βάλτε 100μl απο κάθε microtube με βάση το περιεχόμενο κάθε τρυβλίου, απλώστε το δείγμα σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού υλικού. Στοιβάξτε τα τρυβλία σας ανα ομάδα βαζοντας τα αναποδα και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για ώρες.

8 Τι περιέχει το κιτ της BIORAD 1. E. coli HB101 K 12, λυοφιλιοποιημένα βακτήρια (1 φιαλίδιο). 2. Πλασμίδιο (pglo), λυοφιλιοποιημένα, 20 µg, (1 φιαλίδιο). 3. Αμπικιλίνη, λυοφιλιοποιημένη, 30 mg, (1 φιαλίδιο). 4. L (+) Αραβινόζη, λυοφιλιοποιημένη, 600 mg (1 φιαλίδιο). 5. Διάλυμα μετασχηματισμού (50 mm CaCl 2, ph 6.1), αποστειρομένο, 15 ml, 1 μπουκάλι. 6. LB θρεπτικό υλικό, αποστειρομένο, 10 ml, 1 μπουκάλι. 7. LB θρεπτικό άγαρ σκόνη, αποστειρομένο (to make 500 ml) 1 σακκουλάκι. 8. Πιπέτες, αποστειρομένες, σε ξεχωριστή συσκευασία η κάθε μία (50). 9. Ραβράκια εμβολιασμού (inoculation loops), αποστειρομένa, 10 µl, πακέττα των 10, 8 πακέτα. 10. Τρυβλία Petri, 60 mm, αποστειρομένες σακκούλες των 20, 2 σακκούλες. 11. Μικροδοκιμαστικοί σωλήνες των 2.0 ml (eppendorfs) (10 από κάθε χρώμα: κίτρινο, πράσινο, μπλε, πορτοκαλί, μώβ, ροζ) 60 κομμάτια. 12. Στατώ από αφρολέξ για την τοποθέτηση των μικροδοκιμαστικών σωλήνων (8). Υλικά κάθε ομάδας Επιπλεον υλικά πειράματος Αρχικό τρυβλίο E.coli (LB) 1 DNA Πλασμίδιο pglo 1 Τρυβλία agar (1 LB, 2 LB/amp, 1LB/amp/ara 4 Υδατόλουτρο 42 ο C 1 Διάλυμα μετασχηματισμού 1 Λάμπα UV 1-8 LB θρεπτικό αναπτυξης 1 Επωαστής ή ηλεκτρικό υπόστρωμα 1 Ράβδακια εμβολιασμού 7 Χύτρα ταχύτητος 1 Πιπέτες ή tips μικροπιπέτας 6 Ηλεκτρικό μάτι 1 Microtubes 2 κωνικές φιάλες 250ml 2-3 Στατό 1 Προαιρετικά μικροπιπέτα μl 1 Δοχείο πάγου 1 Προαιρετικά μικροπιπέτες 20μl & 50μl 2

9