Περιγραφή και βασικός χειρισµός του οπτικού µικροσκοπίου.

Transcript

1 Περιγραφή και βασικός χειρισµός του οπτικού µικροσκοπίου. Κατά τη µικροσκοπική παρατήρηση η θέση του οργάνου πρέπει να παραµένει σταθερή. Πατήστε το διακόπτη λειτουργίας του µικροσκοπίου και ρυθµίστε την ένταση του φωτός. Η φωτεινή δέσµη που φτάνει στο παρασκεύασµα είναι αντιστρόφως ανάλογη µε τη µεγέθυνση που εξασφαλίζει ο αντικειµενικός φακός. Κατά τη µικροσκοπική παρατήρηση η αντικατάσταση ενός φακού από κάποιον άλλον µεγαλύτερης µεγέθυνσης (µεγαλύτερης ισχύος) ελαττώνει τη φωτεινή δέσµη. Στην παραπάνω περίπτωση, ο οµοιόµορφος φωτισµός του οπτικού πεδίου εξασφαλίζεται µε κατάλληλη ρύθµιση (αύξηση) της διαµέτρου του διαφράγµατος. Τοποθετείστε το παρασκεύασµα στην τράπεζα µικροσκόπησης. Το παρασκεύασµα συγκρατείται µε το άγκιστρο του οδηγητή. Μετακινώντας κατάλληλα τους κοχλίες του οδηγητή, φέρτε το παρασκεύασµα πάνω από το άνοιγµα της τράπεζας µικροσκόπησης. Στρέφοντας το περίστρεπτο σύστηµα, φέρτε στον οπτικό σωλήνα τον αντικειµενικό φακό που προσφέρει τη µικρότερη µεγέθυνση. Χρησιµοποιήστε αρχικά τον κοχλία µακροµετρικής κίνησης της τράπεζας και στη συνέχεια τον κοχλία µικροµετρικής κίνησης µέχρις ότου να είστε σε θέση να διακρίνετε το είδωλο του αντικειµένου παρατήρησής σας. Η ευκρίνεια του ειδώλου εξασφαλίζεται µε µικρές παλινδροµικές κινήσεις του µικροµετρικού κοχλία. Εάν θέλετε να παρατηρήσετε το αντικείµενο µε µεγαλύτερη µεγέθυνση, στρέφοντας το περίστρεπτο σύστηµα, φέρτε στον οπτικό σωλήνα τον αντικειµενικό φακό που εξασφαλίζει την αµέσως επόµενη µεγαλύτερη µεγέθυνση σε σχέση µε τον αρχικό φακό που χρησιµοποιήσατε. Επειδή η επιφάνεια του παρασκευάσµατος δεν είναι επίπεδη σε όλη την έκτασή της, είναι απαραίτητο να χρησιµοποιείτε συνεχώς τον κοχλία µικροµετρικής κίνησης της τράπεζας, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η ευκρίνεια της παρατήρησής σας. Στο τέλος της κάθε παρατήρησης πρέπει να επαναφέρετε στον οπτικό σωλήνα τον αντικειµενικό φακό µε τη µικρότερη µεγέθυνση.

2 Μεταφορά µικροοργανισµών από υγρή σε επίσης υγρή καλλιέργεια (ζωµό). 1. Ο κρίκος αποστειρώνεται σε φλόγα 2. Η καλλιέργεια ανακινείται ελαφρά 3. Το καπάκι της καλλιέργειας αφαιρείται και το χείλος του σωλήνα το αγγίζουµε στην φλόγα για 1 sec 4. Εµβαπτίζεται ο κρίκος µέσα στην καλλιέργεια 5. Το χείλος του σωλήνα καίγεται στην φλόγα για 1 sec 6. Εφαρµόζουµε πάλι το καπάκι του σωλήνα

3 1. Το καπάκι της νέας καλλιέργειας αφαιρείται και το χείλος του σωλήνα καίγεται στην φλόγα για 1 sec 2. Εµβαπτίζεται ο κρίκος µέσα στην καλλιέργεια 3. Το χείλος του σωλήνα καίγεται στην φλόγα για 1 sec 4. Εφαρµόζουµε πάλι το καπάκι του σωλήνα 5. Ο κρίκος του στυλεού αποστειρώνεται στην φλόγα

4 Μεταφορά µικροοργανισµών από τρυβλίο Petri σε υγρή καλλιέργεια. 1. Ο κρίκος του στυλεού αποστειρώνεται σε φλόγα 2. Ανασηκώνουµε ελαφρά το καπάκι του τρυβλίου και προσεκτικά «µαζεύουµε» το υλικό µιας καθαρής αποικίας στον κρίκο του στυλεού. 3. Το καπάκι του σωλήνα µε τον ζωµό αφαιρείται και το χείλος του σωλήνα καίγεται στην φλόγα για 1 sec. Εµβαπτίζεται ο κρίκος µέσα στον ζωµό. 4. Το χείλος του σωλήνα καίγεται στην φλόγα για 1 sec και τοποθετούµε πάλι το καπάκι του σωλήνα της υγρής καλλιέργειας. 5. Ο κρίκος αποστειρώνεται σε φλόγα.

5 Παρασκευή επιχρίσµατος σε αντικειµενοφόρο πλάκα Από ζωµό (δεν χρειάζεται νερό) Από Petri (+ 1 σταγόνα νερό)

6 οκιµασία κινητικότητας µικροοργανισµού 1. Ο στυλεός µε την ακίδα (όχι τον κρίκο) εισέρχεται στον σωλήνα µε το agar χωρίς να αγγίξει τα τοιχώµατα 2. Η ακίδα του στυλεού βυθίζεται κατά τα 4/5 στην µάζα του τροφικού υλικού 3. Ο στυλεός αποµακρύνεται σταθερά και µε µια κίνηση από τον σωλήνα. Μέθοδοι ενοφθαλµισµού σε τρυβλίο για την αποµόνωση καθαρής καλλιέργειας µικροοργανισµών.

7 Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων για την καταµέτρηση του αριθµού των µικροοργανισµών. Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Από αρχική καλλιέργεια CFU/ml = (αριθµός αποικιών) x (την αραίωση) Μέθοδος δίσκων διάχυσης για τον έλεγχο της αντιβιοαντοχής των µικροοργανισµών. 1. Επιστρώνουµε πλήρως την επιφάνεια ενός τρυβλίου µε τον µικροοργανισµό από µια φρέσκια υγρή καλλιέργεια µε την βοήθεια αποστειρωµένης µπατονέτας. 2. Τοποθετούµε άσηπτα δύο η περισσότερους δίσκους απορροφητικού χαρτιού εµβαπτισµένους σε αντιβιοτικά (προσοχή στην µεταξύ τους απόσταση) 3. Επωάζουµε και µετά από ώρες µετράµε το πλάτος της ζώνης ανάσχεσης της ανάπτυξης όπως στην παρακάτω εικόνα.

8 οκιµασία χρώσης Gram. Η δοκιµασία κατατάσσει τους µικροοργανισµούς ανάλογα µε τις δοµικές διαφορές του κυτταρικού τους τοιχώµατος. Αποτελείται από δύο φάσεις: αρχικά την χρώση όλων των µικροοργανισµών µε κάποια µορφή ιωδίου, στην συνέχεια τον αποχρωµατισµό µόνο των Gram αρνητικών και τελικά τον επαναχρωµατισµό µόνο των Gram αρνητικών µε άλλη χρωστική (σαφρανίνη, βασική φουξίνη κλπ). Η διαδικασία της χρώσης περιγράφεται στα παρακάτω δύο σχήµατα: Όλα τα σχήµατα είναι από το βιβλίο του Osborne Microbiological Applications: A Laboratory Manual in General Microbiology 8th Ed. MCGraw-Hill

9 ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ Η καταλάση είναι το ένζυµο που διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), το γνωστό µας οξυζενέ, σε Η 2 Ο και Ο 2. Το Η 2 Ο 2 είναι οξειδωτικός παράγοντας ο οποίος µπορεί να καταστρέψει την κυτταρική µεµβράνη των µικροοργανισµών και για τον λόγο αυτό χρησιµοποιείται στην ιατρική σαν απολυµαντικό των τραυµατισµών. Κάποιοι από τους µικροοργανισµούς που χρησιµοποιούν το οξυγόνο ή επιβιώνουν παρουσία οξυγόνου, είναι υποχρεωµένοι να φέρουν ένα προστατευτικό σύστηµα αδρανοποίησης του H 2 O 2 το οποίο υπό ορισµένες συνθήκες παράγεται σαν παραπροϊόν της αναπνευστικής τους λειτουργίας. Ένας από αυτούς τους τρόπους προστασίας είναι η παραγωγή του ενζύµου καταλάση. ιαδικασία 1. Παρασκευάζουµε ένα φρέσκο διάλυµα 3% H 2 O 2 2. Με την βοήθεια µιας αποστειρωµένης µπατονέτας συλλέγουµε µια καλά αποµονωµένη αποικία από την επιφάνεια του τρυβλίου µας και κάνουµε ένα µικρό επίχρισµα σε µια καθαρή επιφάνεια (στο εσωτερικό από το καπάκι του τρυβλίου ή σε µια αντικειµενοφόρο πλάκα κλπ). 3. Ρίχνουµε επάνω στο επίχρισµα 3-4 σταγόνες από το 3% διάλυµα του H 2 O 2 4. Παρατηρούµε για 1-2 λεπτά την µαζική εµφάνιση (ή όχι) φυσαλίδων οξυγόνου και σηµειώνουµε ανάλογα την δοκιµασία σαν θετική ή αρνητική. Θετικές αντιδράσεις δίνουν τα Staphylococcus, Citrobacter, E.coli, Enterobacter, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Proteus, Salmonella, Serratia (κ.α.) Αρνητικές αντιδράσεις δίνουν τα Streptococcus spp, Enterococcus spp. (κ.α.) ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΟΞΕΙ ΑΣΗΣ Η δοκιµασία της οξειδάσης είναι στην ουσία µια δοκιµασία για τον έλεγχο του αερόβιου ή αναερόβιου χαρακτήρα των µικροβίων και ανιχνεύει την παρουσία της αναπνευστικής αλυσίδας µεταφοράς των ηλεκτρονίων µε τελικό αποδέκτη το οξυγόνο. Στην δοκιµασία της οξειδάσης χρησιµοποιείται ένας εναλλακτικός δέκτης ηλεκτρονίων (υδροχλωρική - π τετραµέθυλ φαινυλενοδιαµίνη) αντί του οξυγόνου. Ο δέκτης αυτός αλλάζει χρώµα σε γίνεται σκούρο µπλε όταν δεχθεί ηλεκτρόνια από το τελευταίο στοιχείο της αλυσίδας που είναι η κυτταροχρωµοξειδάση. ιαδικασία 1. Για τον έλεγχο χρησιµοποιούµε ειδικές ταινίες από χαρτί εµποτισµένες σε υδροχλωρική - π τετραµέθυλ φαινυλενοδιαµίνη. 2. Με την βοήθεια µιας αποστειρωµένης µπατονέτας συλλέγουµε µια καλά αποµονωµένη αποικία από την επιφάνεια του τρυβλίου µας και κάνουµε ένα µικρό επίχρισµα επάνω στην επιφάνεια του δοκιµαστικού χαρτιού. 3. Η εµφάνιση µπλε σκούρου χρώµατος στο χαρτί και στην περιοχή του επιχρίσµατος µέσα σε 2-3 λεπτά είναι ένδειξη θετικής αντίδρασης, η οποία και καταγράφεται. Θετικές αντιδράσεις δίνουν τα είδη Pseudomonas, Aeromonas, Plesiomonas (κ.α.) Αρνητικές αντιδράσεις δίνουν τα είδη E. coli, Streptococcus, Shigella (κ.α.)

10 Αποτελέσµατα θετικών και αρνητικών δοκιµασιών σε σύστηµα API.

11 Θετικές δοκιµασίες Αρνητικές δοκιµασίες.

12 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΆΣΚΗΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ (ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ 2011) Ονοµατεπώνυµο: Αριθµός Μητρώου Σχολής: Έτος σπουδών: Α: Περιγράψτε µε λίγα λόγια από πού και πώς συλλέξατε τον µικροοργανισµό: Β. Περιγράψτε µε ποιόν τρόπο ελέγξατε την κινητικότητα του µικροοργανισµού καθώς και το αποτέλεσµα της δοκιµασίας: Γ. Περιγράψτε συνοπτικά τις δοκιµασίες καταλάσης, οξειδάσης και χρώσης Gram καθώς και το αποτέλεσµα άλλης βιοχηµικής δοκιµασίας.. Περιγράψτε συνοπτικά την δοκιµασία αντιβιοαντοχής, τα αντιβιοτικά που χρησιµοποιήθηκαν καθώς και το αποτέλεσµα.:

13 Μικροσκοπική παρατήρηση (σκίτσο) Φωτογραφία παρασκευάσµατος Υπογραφή Φοιτητού/Φοιτήτριας Ορεστιάδα : / /2011. Βαθµός Εργαστηρίου :