Κυτταρική αύξηση και διχοτόμηση Στους περισσότερους προκαρυωτικούς μικροοργανσμούς, η ανάπτυξη ενός μεμονωμένου κυττάρου συνεχίζεται μέχρι τη διαίρεσή

Transcript

1 1

2 Κυτταρική αύξηση και διχοτόμηση Στους περισσότερους προκαρυωτικούς μικροοργανσμούς, η ανάπτυξη ενός μεμονωμένου κυττάρου συνεχίζεται μέχρι τη διαίρεσή του σε δύο νέα κύτταρα (διχοτόμηση). Τα κύτταρα επιμηκύνονται μέχρι να γίνουν περίπου διπλάσια σε μήκος και κατόπιν δημιουργείται ένα χώρισμα (διάφραγμα διάφραγμα) ) το οποίο διαιρεί σταδιακά το κύτταρο σε 2 θυγατρικά. Το διάφραγμα δημιουργείται με την επέκταση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και του κυτταρικού τοιχώματος προς το εσωτερικό του κυττάρου μέχρι τον σχηματισμό των 2 θυγατρικών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια του αυξητικού κύκλου, όλα τα κυτταρικά συστατικά πολλαπλασιάζονται, έτσι ώστε κάθε θυγατρικό κύτταρο να διαθέτει πλήρες χρωμόσωμα και επαρκή αριθμό κυτταρικών οργανιδίων. Ο χρόνος που απαιτείται για έναν πλήρη αυξητικό κύκλο στα βακτήρια ποικίλλει σημαντικά και εξαρτάται από ένα σύνολο θρεπτικών και γενετικών παραγόντων. 2

3 Σχ.72. ιαδικασία διχοτόμησης ενός ραβδόμορφου προκαρυωτικού κυττάρου. 3

4 Ο διπλασιασμός του DNA αρχίζει σε ένα σημείο της εξωτερικής πλευράς του χρωμοσώματος, ενώ όλη η διαδικασία περιλαμβάνει «σπάσιμο» της μιας αλυσίδας στο σημείο έναρξης, περιστροφή και ξετίλυγμα της διπλής αλυσίδας του DNA. Σχ.73. ιπλασιασμός κυκλικού δίκλωνου DNA. Στα προκαρυωτικά κύτταρα ο διαχωρισμός και η απομάκρυνση των θυγατρικών χρωμοσωμάτων γίνεται σύμφωνα με την υπόθεση replicon : 1. Με την έναρξη της αντιγραφής, ένα ειδικό σημείο της εξωτερικής επιφάνειας του χρωμοσώματος συνδέεται με τη θέση διπλασιασμού της κυτταρικής μεμβράνης, η οποία περιέχει τα απαραίτητα ενζυμικά συστήματα για το διπλασιασμό του DNA. 4

5 2. Η διχάλα αντιγραφής του DNA βρίσκεται πάντα στην ίδια θέση στην κυτταρική μεμβράνη και διατρέχει ολόκληρο λ το μήκος του χρωμοσώματος, λόγω περιστροφικής κίνησης του DNA, με φορά αντίθετη των δεικτών του ρολογιού. 3. Πριν την έναρξη της αντιγραφής σχηματίζεται στη μεμβράνη μμβρ ημ μια νέα θέση αντιγραφής, δίπλα στην παλιά, με την οποία συνδέεται το ελεύθερο άκρο της «σπασμένης» αλυσίδας DNA. 4. Ο διαχωρισμός των θυγατρικών χρωμοσωμάτων πραγματοποιείται με τοπική σύνθεση του τμήματος της κυτταρικής μεμβράνης που βρίσκεται μεταξύ των δύο θέσεων αντιγραφής. Συνεπώς, επιτυγχάνεται η απομάκρυνση των θυγατρικών χρωμοσωμάτων. Πρωτεΐνες Fts και το επίπεδο κυτταρικής διαίρεσης Έχουν αναγνωρισθεί πολλές πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για τη φυσιολογική κυτταρική διαίρεση των προκαρυωτών (πρωτεΐνες Fts). H FtsZ είναι μια πρωτεΐνη-κλειδί αυτής της ομάδας. Οι πρωτεΐνες Fts είναι ευρύτατα διαδεδομένες στους προκαρυώτες, συμπεριλαμβανομένων και των αρχαίων, ενώ πρωτεΐνες τύπου FtsZ έχουν βρεθεί σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες υπογραμμίζοντας την εξελεκτική τους συγγένεια με τα βακτήρια. 5

6 Σχ.74. Σχηματική παράσταση διπλασιασμού βακτηριακού χρωμοσώματος, σύμφωνα με την υπόθεση replicon. 6

7 Οι πρωτεΐνες Fts σχηματίζουν μια «συσκευή» διαίρεσης, το διαιρεσίσωμα. Ο σχηματισμός του διαιρεσισώματος αρχίζει με την πρόσδεση μορίων FtsZ σε έναν δακτύλιο γύρω από τον κυτταρικό κύλινδρο στο κέντρο του κυττάρου (επίπεδο κυτταρικής διαίρεσης). Τα μόρια της πρωτεΐνης FtsZ πολυμερίζονται και δημιουργούν ένα πλήρη δακτύλιο, ο οποίος στη συνέχεια προσελκύει άλλες πρωτεΐνες Fts. Το διαιρεσίσωμα «ενορχηστρώνει» ώ τη σύνθεση ύθ νέας μεμβράνης και κυτταρικού τοιχώματος μέχρι το κύτταρο να αποκτήσει διπλάσιο του κανονικού μέγεθος, οπότε λαμβάνει χώρα περίσφιξη, η οποία οδηγεί σε 2 θυγατρικά κύτταρα. Το διαιρεσίσωμα περιέχει μάλλον και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη σύνθεση πεπτιδογλυκάνης. Η αντιγραφή του DNA πραγματοποιείται πριν από την κατασκευή του δακτυλίου FtsZ. Η ολοκλήρωση της αντιγραφής του DNA αποτελεί μάλλον το μήνυμα για τον σχηματισμό δακτυλίου FtsZ, ο οποίος δημιουργείται στον χώρο ανάμεσα στα διπλασιασμένα πυρηνοειδή. Ο καθορισμός του μέσου του κυττάρου συντελείται με τη βοήθεια μιας σειράς πρωτεϊνών (πρωτεΐνες Min) και ιδιαίτερα της MinE. 7

8 Σχ.75.. ακτύλιος FtsZ και κυτταρική διαίρεση. 8

9 Όταν λαμβάνει χώρα η περίσφυξη, ο δακτύλιος FtsZ αποπολυμερίζεται, δίνοντας το έναυσμα για την εσωτερική αύξηση του τοιχώματος και τον διαχωρισμό των θυγατρικών κυττάρων. Η πρωτεΐνη FtsZ διαθέτει ενζυμική ενεργότητα υδρόλυσης GTP, για την παραγωγή ενέργειας που απαιτείται για τον σχηματισμό και την αποικοδόμηση του δακτυλίου FtsZ. Στους προκαρυωτικούς ρ οργανισμούς, η πρωτεΐνη-κλειδί για τον καθορισμό του κυτταρικού σχήματος είναι η πρωτεΐνη MreB,, που σχηματίζει ένα κυτταροσκελετό σε διάφορα είδη βακτηρίων, ίσως και αρχαίων. Η MreB δημιουργεί νηματοειδείς ταινίες σε μορφή σπείρας, οι οποίες περιβάλλουν το εσωτερικό του κυττάρου, κάτω από την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Ο σκελετός της MreB ενδεχομένως καθορίζει το κυτταρικό σχήμα ασκώντας κατά κάποιο τρόπο μια δύναμη αντίθετη προς την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Βακτήρια σχήματος κόκκου δεν διαθέτουν πρωτεΐνη MreB, ούτε και το γονίδιο που την κωδικοποιεί, υποδηλώνοντας ότι το «προδιαγεγραμμένο» σχήμα των βακτηρίων αυτών είναι σφαιρικό. Οι ποικίλες μορφολογικές διαφοροποιήσεις των μη σφαιρικών προκαρυωτικών κυττάρων οφείλονται σε αντίστοιχες διαφοροποιήσεις της δά διάταξης των νηματοειδών ταινιών της MreB. 9

10 Σύνθεση πεπτιδογλυκάνης και κυτταρική διαίρεση Όταν ένα κύτταρο μεγενθύνεται πριν την κυτταρική διαίρεση, συντίθεται νέο κυτταρικό τοίχωμα που προστίθεται στο προϋπάρχον, χωρίς να διαταράσσεται η δομή του τοιχώματος. Με αφετηρία τον δακτύλιο FtsZ δημιουργούνται μικρά ανοίγματα στο τοίχωμα από τις αυτολυσίνες (έχουν παρεμφερή δράση με τη λυσοζύμη), οι οποίες βρίσκονται στο διαιρεσίσωμα. Η ένωση της παλιάς και της νέας πεπτιδογλυκάνης δημιουργεί μια αναδίπλωση στην επιφάνεια του κυττάρου των Gram (+) βακτηρίων, ανάλογη μιας ουλής. Σχ.76. Η σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης σε Gram (+) βακτήρια. 10

11 Σχ.77. Ηλεκτρονιακή μικρογραφία Streptococcus hemolyticus. Τα βέλη δείχνουν τις ζώνες του τοιχώματος. Βιοσύνθεση πεπτιδογλυκάνης Κατά τη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης,, γίνονται ελεγχόμενες τομές μς από τις αυτολυσίνες στην προϋπάρχουσα πεπτιδογλυκάνη,, με ταυτόχρονη ένθεση πρόδρομων μορίων. Σπουδαίο ρόλο στην όλη διαδικασία παίζει ένα μόριο-φορέας λιπιδικής φύσεως, η βακτοπρενόλη. Η βακτοπρενόλη είναι μια έντονα υδρόφοβη αλκοόλη C55, που συνδέεται με το Ν- ακετυλογλυκοζαμίνη/ν-ακετυλομουραμικό οξύ/πενταπεπτίδιο,, πρόδρομο της πεπτιδογλυκάνης. 11

12 Σχ.78. Η βακτοπρενόλη. Ο ρόλος της βακτοπρενόλης είναι η μεταφορά του Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη/Ν- ακετυλομουραμικό οξύ/πενταπεπτιδίου δια μέσου της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, καθιστώντας τα πρόδρομα μόρια αρκετά υδρόφοβα, ώστε να διέλθουν ανέπαφα από το εσωτερικό της. Το τελικό στάδιο στη σύνθεση κυτταρικού τοιχώματος είναι ο σχηματισμός πεπτιδικών διασυνδέσεων δέ μεταξύ καταλοίπων μουραμικού οξέος σε παρακείμενες αλυσίδες γλυκάνης (τρανσπεπτιδίωση). Η τρανσπεπτιδίωση έχει ιδιαίτερη ιατρική σημασία, γιατί είναι η αντίδραση που παρεμποδίζεται από την πενικιλλίνη. 12

13 Σχ.79. Σύνθεση πεπτιδογλυκάνης: (α) Μεταφορά πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης δια μέσου της κυτταροπλασματικής μεμβράνης στο σημείο αύξησης του κυτταρικού τοιχώματος, (β) Αντίδραση τρανσπεπτιδίωσης. 13

14 Έχουν χαρακτηρισθεί πολλές πρωτεΐνες που δεσμεύουν την πενικιλλίνη στο περίπλασμα Gram (-) βακτηρίων (μια από αυτές είναι πρωτεΐνη Fts). Όταν η πενικιλλίνη δεσμεύεται, οι πρωτεΐνες χάνουν την καταλυτική ενεργότητά τους. Απουσία σύνθεσης νέου κυτταρικού τοιχώματος, η συνεχής δράση των αυτολυσινών οδηγεί σταδιακά σε ατροφία του κυτταρικού τοιχώματος και τελικά σε λύση. Η τρανσπεπτιδίωση περιλαμβάνει τον σχηματισμό πεπτιδικών δεσμών με ένα ή περισσότερα διαφορετικά αμινοξέα, ανάλογα με τη δομή του κυτταρικού τοιχώματος κάθε μικροοργανισμού. Στα Gram (-) βακτήρια, οι διασυνδέσεις δημιουργούνται συνήθως ανάμεσα στο DAP του ενός πεπτιδίου και στη D-αλανίνη παρακείμενου πεπτιδίου. Αρχικά, στο άκρο του πρόδρομου μορίου πεπτιδογλυκάνης υπάρχουν 2 κατάλοιπα D-αλανίνης, αλλά η μια D-αλανίνη απαμακρύνεται κατά την αντίδραση τρανσπεπτιδίωσης, παρέχοντας την απαιτούμενη ενέργεια, καθώς η τρανσπεπτιδίωση λαμβάνει χώρα έξω από την κυτταροπλασματική μεμβράνη, όπου δεν υπάρχει διαθέσιμο ΑΤΡ. 14

15 Αύξηση του πληθυσμού Οι μονοκύτταροι μικροοργανισμοί που πολλαπλασιάζονται με διχοτόμηση, αυξάνονται μέχρι διπλασιασμού του μεγέθους τους και στη συνέχεια διαιρούνται σε δύο ίσα μέρη. μρη Η αύξηση μιας καλλιέργειας είναι ανάλογη του αριθμού ή της μάζας των κυττάρων: Αύξηση καλλιέργειας=μ (αριθμός ή μάζα κυττάρων) (8) Η σταθερά μ είναι δείκτης του ρυθμού αύξησης και ονομάζεται σταθερά ρυθμού αύξησης. Η μαθηματική έκφραση της εξίσωσης (8) είναι: dn dt = μn ή dx = μx ή dz dt dt = μz (9) 15

16 Όπου: Ν: ο αριθμός κυττάρων/ml X: μάζα κυττάρων/ml Z: το μέγεθος οποιουδήποτε κυτταρικού συστατικού dt: η χρονική στιγμή στην οποία μεταβλήθηκε το μετρούμενο μέγεθος της καλλιέργειας. Ολοκλήρωση της (9) δίνει: lnz - lnz o = μ(t-t o ) (10) Η μετατροπή της (10) σε δεκαδικούς λογάριθμους δίνει: μ log 10 Z - log 10 Z o = (t-t o ) 2,303 (11) 16

17 όπου Ζ και Ζ ο αντιπροσωπεύουν τις τιμές οποιουδήποτε βακτηριακού συστατικού σε χρόνους t και t o αντίστοιχα. Μετρώντας τις τιμές Ζ και Ζ ο είναι δυνατός ο προσδιορισμός της σταθεράς ρυθμού αύξησης ης (μ), η οποία εκφράζει τον ρυθμό αύξησης ης μιας καλλιέργειας. Παράδειγμα: Μια καλλιέργεια περιέχει 10 4 κύτταρα/ml στο χρόνο t και 10 8 κύτταρα/ml 4 ώρες αργότερα, ο ρυθμός αύξησης της καλλιέργειας είναι: μ (8-4) 2,303 = = 2,303 / ώρα 4 ώρες Μια άλλη παράμετρος που καθορίζει το ρυθμό αύξησης μιας καλλιέργειας είναι ο χρόνος διπλασιασμού (g). Ορίζεται ρζ ως ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για το διπλασιασμό όλων των συστατικών μιας καλλιέργειας. Στην περίπτωση αυτή έχουμε: ln2z - lnz = μg (12) ή ln2 + lnz - lnz g ln2 0,693 = = g g = μ (13) 17

18 Έτσι ο χρόνος διπλασιασμού του προηγούμενου παραδείγματος είναι: g 0,693 = =0,30 ώρες 2,303 ώρες ρς -1 ιαγραματική απεικόνιση της (11): Σχ.80. Λογαριθμική αύξηση μιας καλλιέργειας. 18

19 Στην πραγματικότητα, οι μικροβιακοί πληθυσμοί ακολουθούν την λογαριθμική φάση ανάπτυξης για μικρό χρονικό διάστημα, αφού ένα βακτήριο με χρόνο διπλασιασμού 20min αν διατηρούσε λογαριθμική αύξηση για 48h θα δημιουργούσε απογόνους συνολικού βάρους 2.2Χ10 31 g δηλαδή φορές το βάρος της γης. Η αύξηση της καλλιέργειας περιορίζεται από εξάντληση των θρεπτικών υλικών ή/και από συσσώρευση τοξικών παραπροϊόντων του μεταβολισμού. Έτσι παρατηρείται ελλάτωση και μηδενισμός του ρυθμού αύξησης (φάση στασιμότητας) ) και στη συνέχεια έχουμε τη φάση θανάτου. Σχ.81. Φάσεις ανάπτυξης μιας μικροβιακής καλλιέργειας. 19

20 Κατά τη λανθάνουσα φάση,, η οποία προηγείται της λογαριθμικής φάσης, τα κύτταρα προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως στέρηση συγκεκριμένων συστατικών ή αντικατάσταση ορισμένων αμινοξέων με συγγενή τους, έχουμε αριθμητική και όχι λογαριθμική αύξηση: dn dt = c (14) ή N = ct (15) Καλλιέργειες που το σύνολο των κυττάρων τους βρίσκονται στην ίδια περίοδο κάθε στιγμή ονομάζονται συγχρονισμένες.. Μετρήσεις σε συγχρονισμένες καλλιέργειες είναι ισοδύναμες με μετρήσεις σε μονά κύτταρα. Ο συγχρονισμός των καλλιεργειών μπορεί να επιτευχθεί με διαδοχικές αυξομειώσεις της θερμοκρασίας, με προσθήκη σε θρεπτικό μέσο κυττάρων από φάση στασιμότητας ή με φυσικό διαχωρισμό (φιλτράρισμα), αφού κύτταρα της ίδιας φάσης έχουν το ίδιο μέγεθος. 20

21 Σύντομα, όμως, ο συγχρονισμός χάνεται. Σχ.82. Ανάπτυξη συγχρονισμένης καλλιέργειας. Η μικροβιακή αύξηση μπορεί να προσομοιωθεί με μια χημική αντίδραση, όπου τα αντιδρώντα (θρεπτικά συστατικά) μετατρέπονται σε προϊόντα (κύτταρα) μέσω των μικροβίων (καταλύτης). Ενώ η ταχύτητα των χημικών αντιδράσεων καθορίζεται από τη συγκέντρωση των αντιδρώντων, στα βακτήρια ο ρυθμός αύξησης είναι σταθερός μέχρι να εξαντληθεί σχεδόν το κύριο θρεπτικό συστατικό,, καθώς ένζυμα του κυτταρικού τοιχώματος διατηρούν σταθερή την ενδοκυττάρια συγκέντρωση των θρεπτικών υλών. 21

22 Οι καμπύλες που συσχετίζουν τον ρυθμό αύξησης με τη συγκέντρωση των θρεπτικών συστατικών έχουν τη μορφή: Σχ.83. Επίδραση της συγκέντρωσης θρεπτικών συστατικών στην αύξηση του E. coli:: : (α) Γλυκόζη, (β) Τρυπτοφάνη. Εκφράζονται από την εξίσωση: μ = μ max C K S +C (16) 22

23 Όπου: μ: ο ρυθμός αύξησης C: η συγκέντρωση του κύριου θρεπτικού συστατικού Κ s : μια σταθερά, αντίστοιχη των Michaelis-Menten Menten. Καλλιέργειες που αναπτύσσονται υπό περιορισμένο χώρο (κλειστές λ έ καλλιέργειες) ) διατηρούν τη λογαριθμική φάση ανάπτυξης για μικρό χρονικό διάστημα. Για να διατηρηθεί μια καλλιέργεια σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιούνται συστήματα συνεχούς καλλιέργειας. Σχ.84. Σύστημα συνεχούς ανάπτυξης μιας καλλιέργειας. 23

24 Μετρήσεις μικροβιακού πληθυσμού 1. Μέτρηση συνολικού αριθμού κυττάρων Σχ.85. Μικροσκοπική καταμέτρηση. 24

25 2. Μέτρηση δείκτη βιωσιμότητας Σχ.86. Μέθοδοι μέτρησης δί δείκτη βιωσιμότητας. 25

26 Σχ.87. Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων δείγματος. 26

27 3. Μέτρηση οπτικής πυκνότητας Σχ.88. Αρχή μεθόδου μέτρησης μικροβιακού πληθυσμού με μέτρηση οπτικής πυκνότητας. 27

28 Περιβαλλοντικές επιδράσεις στην μικροβιακή αύξηση Επίδραση της θερμοκρασίας Για κάθε μικροοργανισμό υπάρχει μια ελάχιστη θερμοκρασία, κάτω από την οποία δεν παρατηρείται αύξηση, μια άριστη θερμοκρασία στην οποία επιτυγχάνεται η μεγαλύτερη ταχύτητα αύξησης και μια μέγιστη πάνω από την οποία η ανάπτυξη είναι αδύνατη. Οι 3 τιμές αυτές ονομάζονται θεμελιώδεις θερμοκρασίες. Σχ.89. Επίδραση θερμοκρασίας στον ρυθμό αύξησης. 28

29 Όταν η θερμοκρασία αυξάνεται μέσα σε καθορισμένα όρια, επιταγχύνονται οι μεταβολικές λειτουργίες (επομένως και η αύξηση), μέχρις ενός σημείου πέραν του οποίου έχουμε αποδιάταξη δά των πρωτεϊνών και κατάρευση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Η ελάχιστη θερμοκρασία ρ ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού ργ μ οφείλεται σε «ψύξη» ψ της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, με αποτέλεσμα την μη μεταφορά θρεπτικών ουσιών και τη μη δημιουργία διαβάθμισης πρωτονίων. Οι μικροοργανισμοί είναι δυνατόν να χωριστούν σε 4 κατηγορίες με βάση την άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης: 1. Στους ψυχρόφιλους, 2. Στους μεσόφιλους, 3. Στους θερμόφιλους,, και 4. Στους υπερθερμόφιλους. Μικροοργανισμοί που διαβιούν σε υπερβολικά θερμά ή ψυχρά ενδιαιτήματα ονομάζονται ακραιόφιλοι. Μικροβιακή αύξηση σε χαμηλές θερμοκρασίες Οι μικροοργανισμοί που αυξάνονται σε χαμηλές θερμοκρασίες (0 ο C), αλλά έχουν βέλτιστο ανάπτυξης υψηλότερες θερμοκρασίες (20-40 ο C) ονομάζονται ψυχροανεκτικοί. 29

30 Σχ.90. Σχέση θερμοκρασίας και ρυθμού αύξησης ψυχρόφιλων, μεσόφιλων, θερμόφιλων και υπερθερμόφιλων μικροοργανισμών. 30

31 Μοριακές προσαρμογές στην ψυχροφιλία Τα ψυχροενεργά ένζυμα περιέχουν περισσότερες α-έλικες και λιγότερες β-πτυχωτές επιφάνειες. Καθώς η β-πτυχωτή επιφάνεια έχει την τάση να σχηματίζει περισσότερο δύσκαμπτες δομές, η ύπαρξη μεγαλύτερου ποσοστού α-ελίκων επιτρέπει στα ψυχροενεργά εργά ένζυμα μεγαλύτερη ερη ευκινησία στο σοψύχος ψύχος. Τα ψυχροενεργά ένζυμα διαθέτουν περισσότερα πολικά και λιγότερα υδρόφοβα αμινοξέα συμβάλλοντας στη διατήρηση της ευκινισίας των πρωτεϊνών σε χαμηλές θερμοκρασίες. Η κυτταροπλασματική μεμβράνη των ψυχρόφιλων μικροοργανισμών περιέχει μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε ακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία συμβάλλουν στη διατήρηση της ημίρρευστης κατάστασή της σε χαμηλές θερμοκρασίες. Κατάψυξη Παρόλο που η κατάψυξη παρεμποδίζει τη μικροβιακή αύξηση, δεν προκαλεί κατ ανάγκην και νέκρωση του κυττάρου. 31

32 Ουσίες που αναμειγνύονται με το νερό (γλυκερόλη γλυκερόλη, DMSO, κλπ) όταν προστεθούν σε κατάλληλες συγκεντρώσεις (10%) διεισδύουν στα κύτταρα και τα προστατεύουν (κρυοπροστατευτικά ά μέσα). Μικροβιακή αύξηση σε υψηλές θερμοκρασίες Υπάρχει μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των υπερθερμόφιλων οργανισμών (υπάρχουν πολλά βακτήρια και κυρίως αρχαία). Γενικά: 1. Οι προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες υψηλότερες από τους ευκαρυωτικούς, 2. Περισσότερο θερμόφιλοι από όλους τους προκαρυωτικούς είναι συγκεκριμένα είδη αρχαίων, και 3. Οι μη φωτοτροφικοί οργανισμοί μπορούν να αναπτύσσονται σε υψηλότερες θερμοκρασίες από τους φωτοτροφικούς. Μοριακές προσαρμογές στη θερμοφιλία Αρκετά θερμοσταθερά ένζυμα συχνά διαφέρουν ελάχιστα όσο αφορά την αλληλουχία αμινοξέων από ένζυμα μεσόφιλων οργανισμών. Προφανώς, μια σημαντική αντικατάσταση αμινοξέων σε μία ή μερικές θέσεις του ενζύμου επιτρέπει την αναδίπλωση κατά τρόπο που προσδίδει θερμική σταθερότητα. 32

33 Η θερμοσταθερότητα των πρωτεϊνών στους υπερθερμόφιλους μικροοργανισμούς βελτιώνεται από την παρουσία αυξημένου αριθμού ζευγών ιόντων (μεταξύ θετικού και αρνητικού φορτίου διαφόρων αμινοξέων). Επιπλέον, ο έντονα υδρόφοβος χαρακτήρας του εσωτερικού των πρωτεϊνών παρεμποδίζει την αναδίπλωσή τους στο υδατικό κυτταρόπλασμα. Οι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί έχουν λιπίδια πλούσια σε κορεσμένα λιπαρά οξέα που επιτρέπουν στις μεμβράνες ες να πραμένουν σταθερές σαθερές και λειτουργικές στις υψηλές θερμοκρασίες. Τα κορεσμένα λιπαρά οξέα δημιουργούν ένα πιο υδρόφοβο περιβάλλον που συντελεί στη σταθερότητα της μεμβράνης. Τα αρχαία δεν περιέχουν καθόλου λιπαρά οξέα στις μεμβράνες τους, αλλά υδρογονάνθρακες από επαναλαμβανόμενες μονάδες ισοπροπενίου με 5 άτομα C συνδεδεμένα με αιθερικό δεσμό σχηματίζοντας λιπιδική μονοστοιβάδα, δομή πολύ πιο θερμοανθεκτική από την διπλοστοιβάδα. Παράδειγμα βιοτεχνολογικής εφαρμογής της θερμοφιλίας Απομόνωση DNA πολυμεράσης από τον θερμόφιλο μικροοργανισμό Thermus aquaticus (Taq πολυμεράση). μρ 33

34 Μικροβιακή αύξηση σε χαμηλό και υψηλό ph Μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται καλύτερα σε πολύ χαμηλές τιμές ph ονομάζονται οξεόφιλοι,, ενώ αυτοί που αναπτύσσονται σε πολύ υψηλές τιμές μςp ph αλκαλεόφιλοι. Λιπάσες και πρωτάσες από αλκαλεόφιλα έχουν βιοτεχνολογική εφαρμογή σε απορρυπαντικά. Σχ.91. Η κλίμακα ph και η μικροβιακή ανάπτυξη. 34

35 Ο πιο σημαντικός παράγοντας στην υποχρεωτική οξεοφιλία είναι η σταθερότητα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης σε χαμηλό ph. Η κυτταροπλασματική μεμβράνη των υποχρεωτικά οξεόφιλων ουσιαστικά διαλύεται σε ουδέτερο ph, γεγονός που σημαίνει ότι απαιτούνται υψηλές συγκεντρώσεις H + για να διασφαλιστεί η σταθερότητά της. Τα αλκαλεόφιλα παρουσιάζουν πρόσθετο ενδιαφέρον λόγω των βιοενεργειακών προβλημάτων που αντιμετωπίζουν: Είναι δυνατόν να αναπτυχθεί πρωτονιοκίνητη δύναμη όταν η εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης είναι τόσο αλκαλική? Η απαιτούμενη ενέργεια προέρχεται από διαβάθμιση ιόντων Na +, αλλά και πρωτονιοκίνητης δύναμης. Η άριστη τιμή ph ανάπτυξης αναφέρεται στο εξωτερικό ph (του περιβάλλοντος). Το εσωτερικό ph στους περισσότερους μικροοργανισμούς παραμένει σχεδόν σταθερό, κοντά στην τιμή 7. Στα ακραία οξεόφιλα και ακραία αλκαλεόφιλα, το εσωτερικό ph μπορεί να διαφέρει αρκετά από την ουδετερότητα. 35

36 Ωσμωτικά φαινόμενα και μικροβιακή αύξηση Η διαθεσιμότητα του νερού εκφράζεται από την ενεργότητα νερού. Ως ενεργότητα νερού a w ορίζεται το πηλίκο της τάσης ατμών του νερού στο δείγμα προς την τάση ατμών του καθαρού νερού στην ίδια θερμοκρασία. a w = P P o (17) Οι τιμές της a w κυμαίνονται στο εύρος 0-1. Οι μικροοργανισμοί που διαβιούν σε ενδιαιτήματα υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων ονομάζονται αλόφιλοι. λ Οι αλοανεκτικοί μικροοργανισμοί μπορούν να ανεχθούν μείωση στην a w του περιβάλλοντός ρβ τους, αλλά γενικά αναπτύσσονται καλύτερα απουσία αλάτων (ή διαλυμένων ουσιών που οδηγούν σε μείωση της a w ). Οι μικροοργανσμοί που αναπτύσσονται σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων ονομάζονται ακραίοι αλόφιλοι. 36

37 Μικροοργανισμοί που διαβιούν σε υψηλές συγκεντρώσεις σακχάρων ονομάζονται ωσμόφιλοι και αυτοί που αναπτύσσονται σε συνθήκες έλλειψης νερού ξηρόφιλοι. Σχ.92. Επίδραση της συγκέντρωσης Na + στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών. 37

38 Όταν ένας μικροοργανισμός αναπτύσσεται σε περιβάλλον με χαμηλή ενεργότητα νερού, αυξάνει την εσωτερική συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών με στόχο την πρόσληψη νερού. Αύξηση η της εσωτερικής συγκέντρωσης διαλυμένων ουσιών μπορεί να επιτευχθεί είτε μέσω άντλησης ανόργανων ιόντων μέσα στο κύτταρο από το περιβάλλον, είτε μέσω πρόσληψης ή σύνθεσης οργανικών διαλυτών ουσιών. Η διαλυμένη ουσία που χρησιμοποιείται στο εσωτερικό του κυττάρου για τη ρύθμιση της ενεργότητας νερού του κυτταροπλάσματος πρέπει να μην αναστέλλει τις βιολογικές διεργασίες (συμβατές διαλυμένες ουσίες). Τέτοιες ουσίες είναι σάκχαρα, σακχαροαλκοόλες ή K + (σε ορισμένα ακραία αλόφιλα αρχαία και βακτήρια). Οξυγόνο και μικροβιακή αύξηση η Οι αερόβιοι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε περιβάλλον πλήρους οξυγόνωσης. Οι μικροαερόφιλοι μικροοργανισμοί είναι αερόβιοι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούν οξυγόνο σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από αυτές του αέρα (λόγω της μειωμένης ικανότητάς τους για αναπνοή ή επειδή περιέχουν κάποια μόρια ευαίσθητα στο οξυγόνο). 38

39 Οι προαιρετικά (ή δυνητικά) αερόβιοι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτυχθούν σε κατάλληλα θρεπτικά υποστρώματα είτε υπό αερόβιες, είτε υπό αναερόβιες συνθήκες. Οι μικροοργανισμοί που δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν οξυγόνο ονομάζονται αναερόβιοι. Υπάρχουν 2 τύποι αναερόβιων μικροοργανισμών: 1. Οι αερανεκτικοί αναερόβιοι,, οι οποίοι ανέχονται την παρουσία οξυγόνου και αναπτύσσονται, αν και δεν μπορούν να το χρησιμοποιήσουν, και 2. Οι υποχρεωτικά αναερόβιοι,, οι οποίοι παρουσία οξυγόνου αναστέλλουν την ανάπτυξή τους ή θανατώνονται. Κατά την ανάπτυξη αναερόβιων καλλιεργειών είναι δυνατόν να προστεθεί ένας αναγωγικός παράγοντας (ουσία που αντιδρά με το οξυγόνο και το ανάγει προς Η 2 Ο), π.χ. το θειογλυκολικό. λ Στο θρεπτικό μέσο μπορούμε να προσθέσουμε ρεσαζουρίνη,, η οποία παρουσία οξυγόνου αλλάζει χρώμα,, υποδεικνύοντας τον βαθμό οξυγόνωσης του θρεπτικού. Τοξικές μορφές οξυγόνου Κατά την αναπνοή, παράγονται έντονα τοξικές μορφές οξυγόνου, όπως ανιόν υπεροξειδίου Ο 2-, υπεροξείδιο του υδρογόνου Η 2 Ο 2 και υδροξυλική ρίζα ΟΗ.. 39

40 Σχ.93. Μικροβιακή ανάπτυξη (α) Αερόβιων, (β) Αναερόβιων, (γ) Προαιρετικά αερόβιων, (δ) Μικροαερόβιων και (ε) Αερανεκτικών αναερόβιων. Στο θρεπτικό μέσο (θειογλυκολικό ζωμό) έχει προστεθεί λίγο agar, για να διατηρείται το υγρό σε ηρεμία, και ρεσαζουρίνη. 40

41 Σχ.94. Σχηματισμός τοξικών μορφών οξυγόνου κατά την αναπνοή. 41

42 Οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει ένζυμα που καταστρέφουν τις τοξικές μορφές οξυγόνου. Τα πιο κοινά ένζυμα είναι η καταλάση,, η υπεροξειδάση,, η δισμουτάση υπεροξειδίου και η αναγωγάση υπεροξειδίου (βρίσκεται σε ορισμένους υποχρεωτικά αναερόβιους προκαρυώτες). Η δισμουτάση υπεροξειδίου είναι απολύτως απαραίτητη στα αερόβια κύτταρα, ενώ στην απουσία αυτού του ενζύμου οφείλεται μάλλον η τοξικότητα του Ο 2 στους υποχρεωτικώς αναερόβιους μικροοργανισμούς. Η δισμουτάση απουσιάζει και από ορισμένους αερανεκτικούς αναερόβιους οργανισμούς (όπως από τα οξυγαλακτικά βακτήρια), αλλά οι οργανισμοί αυτοί χρησιμοποιούν Μn 2+ ανεξάρτητα από πρωτεΐνες για να πραγματοποιούν την μετατροπή του Ο 2- σε Η 2 Ο 2 και Ο 2. Μια τέτοια αντίδραση θα μπορούσε να λειτουργεί ως πρόδρομη μορφή δισμουτάσης υπεροξειδίου στους αρχέγονους οργανισμούς. Αυτή η άποψη υποστηρίζεται ακόμα από το γεγονός ότι όλες οι γνωστές δισμουτάσες υπεροξειδίου περιέχουν έναν μεταλλικό συμπαράγοντα, συνήθως Mn αλλά και Fe 2+, Cu 2+,Zn 2+ στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Mn 2+ 2+, 42

43 Σχ.95. Καταστροφή τοξικών μορφών οξυγόνου. 43

44 44

45 Εξέλιξη της γης και οι πρώτες μορφές ζωής Η γη έχει ηλικία 4.6 δισεκατομμύρια έτη περίπου. Ορισμένα αρχέγονα πετρώματα περιέχουν μικροαπολιθώματα με σχήμα βακτηρίων. Οι στρωματόλιθοι είναι απολιθωμένα μικροβιακά στρώματα που αποτελούνται από στοιβάδες νηματοειδών προκαρυωτικών ρ κυττάρων και εγκλωβισμένα ιζήματα. Η ατμόσφαιρα στην πρώιμη γη είχε ελάχιστες ποσότητες οξυγόνου (αναγωγικό περιβάλλον). Εκτός από νερό, υπήρχε ποικιλία αερίων (CH 4, CO 2, N 2, NH 3, Η 2 S και μικροποσότητες CO και Η 2 ) και σημαντικές ποσότητες FeS. Eίναι επίσης πιθανόν να συντέθηκαν σημαντικές ποσότητες HCN από NH 3 και CH 4. Eπιπλέον,, η επιφάνεια της γης ήταν πολύ θερμότερη από ότι σήμερα (εικάζεται ότι τα πρώτα 500 εκατομμύρια χρόνια η θερμοκρασία ήταν >100 o C). Σήμερα, είναι γνωστό ότι η σύνθεση των βιολογικά σημαντικών μορίων είναι δυνατόν να συμβεί σε αναγωγικές ατμόσφαιρες που περιέχουν τα παραπάνω μόρια παρουσία πλούσιων πηγών ενέργειας. 45

46 Πηγές ενέργειας στην πρωτόγονη γη αποτελούσαν η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) του ήλιου, οι ηλεκτρικές εκκενώσεις των κεραυνών, η ραδιενέργεια, η εκλυόμενη θερμότητα από την πρόσκρουση μετεωριτών και η θερμική ενέργεια από την ηφαιστειακή δράση. Αν μίγματα αερίων παρόμοια με εκείνα που πιστεύεται ότι υπήρχαν στην πρωτόγονη γη δεχθούν ηλεκτρικές εκκενώσεις στο εργαστήριο, μπορεί να προκύψει πληθώρα βιοχημικά σημαντικών μορίων (σάκχαρα, αμινοξέα, πουρίνες, νουκλεοτίδια, θειοεστέρες,, λιπαρά οξέα). Βιοχημικά μόρια με κρίσιμο ρόλο (π.χ. πυροσταφυλικό οξύ) έχουν παραχθεί σε υψηλές πιέσεις και θερμοκρασίες που χαρακτηρίζουν υποθαλάσσιες υδροθερμικές πηγές. Ορισμένες από αυτές τις βιοχημικές δομικές μονάδες πολυμερίζονται σχηματίζοντας πολυπεπτίδια, πολυνουκλεοτίδια,, και άλλα σημαντικά μακρομόρια. Άνυδρες εκτεθειμένες επιφάνειες πυλού, πυρίτη, κλπ, λειτούργησαν πιθανόν ως υπόβαθρα για αντιδράσεις πολυμερισμού βιολογικών μακρομορίων παρέχοντας ένα σταθερό, σχετικά ξηρό περιβάλλον για τη σύνθεση και συσσώρευση μακρομορίων. 46

47 Πρωτόγονη ζωή: Ο κόσμος του RNA Βασιζόμενοι στην ανακάλυψη ότι ορισμένα είδη RNA έχουν καταλυτική δράση, πολλοί επιστήμονες πιστεύουν σήμερα ότι οι πρώτες μορφές ζωής δεν διέθεταν καθόλου DNA. Σε έναν κόσμο με βάση το RNA, τα μόρια RNA θα λειτουργούσαν απλώς για να αναπαράγουν τον εαυτό τους και μάλλον θα εκτελούσαν τον ελάχιστο αριθμό απαραίτητων για αυτό το σκοπό καταλυτικών αντιδράσεων. Οι μελέτες διάφορων καταλυτικών RNA έδειξαν ότι είναι δυνατόν να καταλυθούν διάφορες αντιδράσεις, όπως της σύνθεσης νουκλεοτιδίων από σάκχαρα και αζωτούχες βάσεις. Οι πρώτες κυτταρικές μορφές ζωής εξελίχθηκαν όταν αυτοαντιγραφόμενα μόρια RNA βρέθηκαν εγκλωβισμένα σε λιποπρωτεϊνικά κυστίδια. Καθώς οι πρωτεΐνες επιδεικνύουν πολύ μεγαλύτερο βαθμό καταλυτικής εξειδίκευσης, οι πρωτόγονοι οργανισμοί ωθήθηκαν προς τις πρωτεΐνες ως κύριους βιοκαταλύτες. Η καθιέρωση του DNA ως γονιδιώματος του κυττάρου πιθανόν προέκυψε από την εξελικτική πίεση προς την κατεύθυνση της μεγαλύτερης αποδοτικότητας και πιστότητας της αντιγραφής, καθώς οι DNA πολυμεράσες είναι πιο ακριβείς από τις RNA πολυμεράσες. 47

48 Σχ.96. Πιθανό σενάριο για την εξέλιξη της κυτταρικής μορφής ζωής. 48

49 Οι πρωτόγονοι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούσαν πιθανόν την παρακάτω εξώθερμη αντίδραση για την παραγωγή ενέργειας: FeS + H 2 S FeS 2 +H 2 Go = o = -42 KJ/αντίδραση (18) Τα πρωτόγονα κύτταρα χρησιμοποίησαν πιθανόν το παραγόμενο Η 2 για να δημιουργήσουν την πρωτονιοκίνητη δύναμη για την παραγωγή ΑΤΡ από μια πρωτόγονη ΑΤΡ συνθάση. Αποφασιστική καμπή στην ιστορία της γης αποτέλεσε η εξέλιξη ξ της οξυγονοπαραγωγικής φωτοσύνθεσης στα κυανοβακτήρια. Οι οργανισμοί αυτοί εμφανίστηκαν πριν από 3 δισεκατομμύρια χρόνια,, αλλά το Ο 2 που παρήγαγαν δεν συσσωρεύθηκε στην ατμόσφαιρα καθώς οι αναγωγικές ουσίες (π.χ. FeS) που υπήρχαν στην ατμόσφαιρα αντιδρούσαν αυθόρμητα με το Ο 2. Σταδιακά με την συσσώρευση Ο 2, η ατμόσφαιρα άλλαξε από αναγωγική σε οξυγονούχο και σχηματίστηκε Ο 3, το οποίο απορροφά ισχυρά σε μήκη κύματος μέχρι 300nm, προστατεύοντας το DNA από την υπεριώδη ακτινοβολία. 49

50 Σχ.97. Υποθετικός μηχανισμός παραγωγής ενέργειας από πρωτόγονο κύτταρο. 50

51 Σχ.98. Σταθμοί βιολογικής εξέλιξης. 51

52 Ευκαρυώτες και οργανίδια: Ενδοσυμβίωση Η ενδοσυμβιωτική θεωρία υποστηρίζει ότι ένα αερόβιο βακτήριο παγίωσε τη θέση του στο κυτταρόπλασμα κάποιου πρωτόγονου ευκαρυώτη προμηθεύοντάς του ενέργεια, διασφαλίζοντας ως αντάλλαγμα ένα προστατευτικό περιβάλλον και την απρόσκοπτη παροχή θρεπτικών υλικών. Παρόμοια, η ενδοσυμβιωτική ενσωμάτωση ενός φωτοτροφικού παραγωγού οξυγόνου θα προσέδιδε φωτοσυνθετικές ικανότητες σε ένα πρωτόγονο ευκαρυώτη, έτσι ώστε αυτός να πάψει να εξαρτάται από οργανικές ενώσεις για παραγωγή ενέργειας. Αδιάσειστα στοιχεία στηρίζουν την άποψη ότι τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες ήταν άλλοτε βακτήρια: 1. Οι χλωροπλάστες και τα μιτοχόνδρια περιέχουν ριβοσώματα προκαρυωτικού τύπου, 2. Ορισμένα ριβοσώματα των χλωροπλαστών και μιτοχονδρίων διαθέτουν αλληλουχίες RNA που χαρακτηρίζουν ηρζ συγκεκριμένα ρμ βακτήρια,, και η λειτουργία τους παρεμποδίζεται από τα ίδια αντιβιοτικά που επιδρούν στα ριβοσώματα αυτόνομων βακτηρίων, και 3. Τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες περιέχουν μικρές ποσότητες κυκλικού DNA, χαρακτηριστικού των προκαρυωτών. 52

53 Σχ.99. Θεωρία της ενδοσυμβίωσης. 53

54 Συστήματα βιολογικής ταξινόμησης Τα πρώτο σύστημα βιολογικής ταξινόμησης προτάθηκε από τον Linnaeus στα μέσα του 18 ου αιώνα. Ονόμαστηκε φυσικό σύστημα ταξινόμησης και σύμφωνα με αυτό η ταξινομική θέση ενός οργανισμού αποτελούσε πηγή πληροφοριών για τις ιδιότητές του, π.χ. ένα ζώο που τοποθετείται στα σπονδυλωτά, τάξη θηλαστικά, έχει όλες τις ιδιότητες που διακρίνουν συνολικά όλα τα θηλαστικά από τα άλλα σπονδυλωτά. Αργότερα προτάθηκε το φυλογενετικό σύστημα ταξινόμησης,, σύμφωνα με το οποίο οι οργανισμοί ταξινομούνται σύμφωνα με τις εξελικτικές τους σχέσεις. Το σύστημα αυτό εφαρμόζεται επιτυχώς στα ανώτερα ζώα και φυτά, όπου υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με τις φυλογενετικές τους σχέσεις από συλλογή απολιθωμάτων, δεν μπορεί όμως να εφαρμοστεί στους μικροορογανισμούς. Στη συνέχεια ο Adanson πρότεινε την αριθμητική ή Adansonian ταξινόμηση. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην υπόθεση ότι αν σε όλους τους φαινοτυπικούς χαρακτήρες δοθεί το ίδιο βάρος είναι δυνατόν να αποδοθούν αριθμητικά οι ταξινομικές αποστάσεις δύο οργανισμών. Έτσι ορίστηκε ο συντελεστής ομοιότητας Sj (similarity coefficient): 54

55 a S j = (19) a+b+c όπου: a: ο αριθμός των χαρακτήρων που απαντάται και στους δύο οργανισμούς, b: ο αριθμός των χαρακτήρων που απαντάται στον πρώτο οργανισμό και απουσιάζει από τον δεύτερο, και c: ο αριθμός των χαρακτήρων που απουσιάζει από τον πρώτο και απαντάται στον δεύτερο οργανισμό. Επίσης, ορίστηκε ο συντελεστής ταιριάσματος S s (matching coefficient): a+d S s = (20) a+b+c+d όπου: d: ο αριθμός των χαρακτήρων που εξετάζονται και οι οποίοι απουσιάζουν και από τους δύο οργανισμούς. Η εφαρμογή της αριθμητικής ταξινόμησης προϋποθέτει προσδιορισμό μεγάλου αριθμού χαρακτήρων. 55

56 Νέες μέθοδοι ταξινόμησης: Εξελικτικά χρονόμετρα Επιλέγοντας το σωστό χρονόμετρο Η εξελικτική απόσταση μεταξύ 2 οργανισμών μπορεί να υπολογισθεί από τις διαφορές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων ή των αμινοξέων σε ομόλογα μακρομόρια. Πρέπει όμως να επιλεγούν τα κατάλληλα μόρια, τα οποία θα πρέπει: 1. Να έχουν μια οικουμενική διασπορά στην ομάδα που θα μελετήσουμε, 2. Να είναι λειτουργικώς ομόλογα σε κάθε μικροοργανισμό, δηλαδή οι φυλογενετικές συγκρίσεις πρέπει να βασίζονται σε μόρια με πανομοιότυπη λειτουργία, 3. Να είναι δυνατή η επακριβής αντιστοίχιση των 2 μορίων, έτσι ώστε να αναγνωρίζονται περιοχές αλληλουχιών που είναι όμοιες και άλλες που διαφέρουν, και 4. Η αλληλουχία του επιλεγμένου μορίου να μεταβάλλεται με κατάλληλο ρυθμό για τη μετρούμενη μ εξελικτική απόσταση (οι πολλές αλλαγές γς καθιστούν δυσανάγνωστο το εξελικτικό αρχείο). Πολλά μόρια έχουν δοκιμαστεί ως μοριακά χρονόμετρα (κυτοχρώματα, φερρεδοξίνες, διάφορα γονίδια, ριβοσωματικά RNAs, κλπ). 56

57 Τα ριβοσωματικά RNA, όμως, αποτελούν εξαιρετικά μόρια για την εξακρίβωση σχέσεων μεταξύ ζωντανών οργανισμών, καθώς: 1. Έχουν σταθερή λειτουργικότητα, 2. Είναι οικομενικώς κατανεμημένα, και 3. Έχουν μετρίως διατηρημένη αλληλουχία σε ένα ευρύ φάσμα φυλογενετικών αποστάσεων. Εφόσον ο αριθμός των διαφορετικών δυνατών αλληλουχιών σε μεγάλα μόρια, όπως στο rrna, είναι τεράστιος, η ομοιότητα μεταξύ 2 αλληλουχιών αποτελεί ένδειξη φυλογενετικής σχέσης. Ένδειξη για την σχετική εξελικτική απόσταση αποτελεί ο βαθμός ομοιότητας των αλληλουχιών των rrnas 2 οργανισμών. Το 16S rrna (18S για τα ευκαρυωτικά) περιέχει αρκετές περιοχές με εκτενώς συντηρημένες αλληλουχίες και επίσης χαρακτηρίζεται από σημαντική μεταβλητότητα σε άλλες περιοχές. Συνεπώς, έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα για την ανάλυση της φυλογένεσης. 57

58 Σχ.100. Μέρη ριβοσώματος. 58

59 Μεθοδολογία προσδιορισμού αλληλουχιών Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό αλληλουχιών rrnas είναι πλέον μέθοδοι ρουτίνας. Οι αλληλουχίες συγκρίνονται με τις υπάρχουσες στη βάση δεδομένων (Ribosomal Database Project-RDP) RDP). Για την ενίσχυση γονιδίων που κωδικοποιούν το rrna χρησιμοποιείται η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR και στη συνέχεια προσδιορίζεται η αλληλουχία του προϊόντος PCR (αλληλούχιση κατά Sanger). H παραπάνω μέθοδος είναι ταχεία και παρουσιάζει εξειδίκευση με τη χρήση εκκινητών PCR, οι οποίοι είναι συμπληρωματικοί προς τις διατηρημένες αλληλουχίες στα rrnas. Αλληλουχίες υπογραφή Οι αλληλουχίες υπογραφή είναι μικρές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που απαντούν αποκλειστικά σε ορισμένες ομάδες μικροοργανισμών. Οι αλληλουχίες υπογραφή μας βοηθούν να τοποθετήσουμε στη σωστή φυλογενετική ομάδα οργανισμούς που απομονώθηκαν για πρώτη φορά ή άλλους που προηγουμένως είχαν ταξινομηθεί εσφαλμένα. Η πιο διαδεδομένη χρήση τους, όμως, είναι στον σχεδιασμό εξειδικευμένων ανιχνευτών νουκλεϊκών οξέων (φυλογενετικοί ανιχνευτές). 59

60 Σχ Προσδιορισμός αλληλουχίας rrna με τη χρήση PCR. 60

61 Φυλογενετικοί ανιχνευτές και FISH Οι ανιχνευτές μπορεί να είναι περισσότερο ή λιγότερο εξειδικευμένοι, π.χ. υπάρχουν «καθολικοί» ανιχνευτές που υβριδοποιούνται με αλληλουχίες rrna οποιουδήποτε οργανισμού και ανιχνευτές κατάλληλης εξειδίκευσης που υβριδοποιούνται με rrna συγκεκριμένων ειδών. Αν στον ανιχνευτή προσδεθεί μια φθορίζουσα χρωστική, η υβριδοποίηση των ανιχνευτών με κυτταρικά rrnas μπορεί να παρατηρηθεί με μικροσκόπιο. Η επίδραση κατάλληλων αντιδραστηρίων στα κύτταρα καθιστά τις μεμβράνες διαπερατές και επιτρέπει τη διείσδυση δ του μίγματος ανιχνευτή/χρωστικής. ή Μετά την υβριδοποίηση του ανιχνευτή με το rrna, τα κύτταρα φθορίζουν ομοιόμορφα μ και εξετάζονται με μικροσκόπιο φθορισμού (φθορίζουσα ρζ υβριδοποίηση η in situ, FISH). H τεχνολογία FISH χρησιμοποιείται ευρέως στην μικροβιακή οικολογία και στην κλινική διαγνωστική, παρακάμπτοντας την καλλιέργεια μικροοργανισμών στο εργαστήριο (άμεσα αποτελέσματα). 61

62 Σχ.102. Οικουμενικό φυλογενετικό δέντρο ύστερα από συγκριτική ανάλυση αλληλουχιών rrna. 62

63 Χαρακτηριστικά των πρωταρχικών «χώρων» της ζωής Αν και οι πρωταρχικοί «χώροι» (βακτήρια, αρχαία και ευκάρυα) καθορίζονται με βάση τις αλληλουχίες του rrna, κάθε «χώρος» χαρακτηρίζεται από έναν αριθμό φαινοτυπικών ιδιοτήτων. Ορισμένα από τα χαρακτηριστικά είναι μοναδικά για έναν δεδομένο «χώρο», ενώ άλλα απαντούν σε δύο από τους τρεις «χώρους». Κυτταρικά τοιχώματα Σχεδόν όλα τα βακτήρια έχουν κυτταρικά τοιχώματα που περιέχουν πεπτιδογλυκάνη (εξαιρέσεις είναι μέλη των Planctomyces-Pirellula,, των οποίων τα κυτταρικά τοιχώματα αποτελούνται από πρωτεΐνη και μέλη των Μycoplasma- Clamydia,, που στερούνται κυτταρικών τοιχωμάτων). Η πεπτιδογλυκάνη θεωρείται, συνεπώς, ως «μόριο-υπογραφή» για πολλά είδη βακτηρίων (ουσιαστικά ανιχνεύεται το μουραμικό οξύ που εμφανίζεται αποκλειστικά στην πεπτιδογλυκάνη). Τα αρχαία και τα ευκάρυα στερούνται πεπτιδογλυκάνης. Στα αρχαία υπάρχουν διάφοροι τύποι κυτταρικών τοιχωμάτων, αποτελούμενοι από ψευδοπεπτιδογλυκάνη (ανάλογο της πεπτιδογλυκάνης), ενώ σε μερικά είδη τα τοιχώματα αποτελούνται από πολυσακχαρίτες, πρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες. 63

64 Στα ευκάρυα,, όταν υπάρχουν κυτταρικά τοιχώματα αποτελούνται συνήθως από κυτταρίνη ή χιτίνη. Λιπίδια Τα λιπίδια των βακτηρίων και ευκαρύων αποτελούνται από λιπαρά οξέα συνδεδεμένα με εστερικό δεσμό με το μόριο γλυκερίνης. Αντιθέτως, στα λιπίδια των αρχαίων απαντώνται αιθερικοί δεσμοί. Στα βακτήρια και ευκάρυα,, στα λιπίδια υπάρχουν λιπαρά οξέα με ευθείες αλυσίδες, ενώ στα αρχαία υδρογονάνθρακες με διακλαδισμένες αλυσίδες (φυτανύλια). Σχ.103. Λιπίδια στα βακτήρια, αρχαία και ευκάρυα. 64

65 Σε ορισμένα αρχαία, η μεμβρανική δομή των λιπιδίων είναι μονοστοιβάδα, αντί διπλοστοιβάδας. RNA πολυμεράση Τα βακτήρια περιέχουν έναν απλό τύπο RNA πολυμεράσης με απλή τεταρτοταγή δομή (α 2 ββ σ), ενώ οι RNA πολυμεράσες των αρχαίων είναι πιο πολύπλοκες, μοιάζοντας με αυτές των ευκαρύων. Χαρακτηριστικά της πρωτεϊνοσύνθεσης Αν και τα ριβοσώματα των βακτηρίων και των αρχαίων έχουν το ίδιο μέγεθος (70S σε σχέση με το μέγεθος των ριβοσωμάτων των ευκαρύων 80S) S), αρκετά βήματα στην πρωτεϊνοσύνθεση των αρχαίων μοιάζουν περισσότερο με αυτά των ευκαρύων. Στα βακτήρια, το κωδικόνιο έναρξης (AUG) ενσωματώνει φορμυλομεθειονίνη, ενώ αντίθετα στα αρχαία και τα ευκάρυα μεθειονίνη (μη τροποποιημένη). Τα περισσότερα αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση των βακτηρίων, δεν επιδρούν στην πρωτεϊνοσύνθεση των αρχαίων ή ευκαρύων. Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες των αρχαίων και ευκαρύων μοιάζουν περισσότερο μεταξύ τους από λειτουργική άποψη, σε σχέση με αυτές των βακτηρίων. 65

66 Άλλα χαρακτηριστικά Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός χαρακτηριστικών που μπορεί να χρησιμεύσει για τη διαφοροποίηση των οργανισμών σε επίπεδο «χώρων». Μικροβιακή ταξινομία: Η σχέση της με την φυλογενετική Ταξινομία είναι η επιστήμη της ταξινόμησης αποτελούμενη από την ταυτοποίηση και την ονοματολογία. Η βακτηριακή ταξινομία στηρίζεται παραδοσιακά σε φαινοτυπικές αναλύσεις (πως μοιάζει ένας μικροοργανισμός, ενεργειακός μεταβολισμός, τα ένζυμα του, κλπ), έτσι ώστε αυτές να αποτελέσουν τη βάση για την ταξινόμησή του. Όμως, επειδή τα βακτήρια έχουν μικρό μέγεθος, η μελέτη της φυλογένεσης των προκαρυωτών προκύπτει από γονοτυπικές αναλύσεις. Παρόλ αυτά, οι φαινοτυπικές αναλύσεις έχουν διαδραματίσει δ σημαντικό ρόλο στην ταυτοποίηση και κατάταξη των βακτηρίων. Στην κλασική βακτηριακή ταξινομία μετρούνται αρκετά χαρακτηριστικά και τα γνωρίσματα αυτά χρησιμοποιούνται για την ομαδοποίηση των οργανισμών. Χαρακτηριστικά με μεγάλη ταξινομική αξία που χρησιμοποιούνται ευρέως είναι διάφορες πλευρές της μορφολογίας, της βιοχημείας, της διατροφής και φυσιολογίας και των ενδιαιτημάτων. 66

67 Σχ.104. Παράδειγμα φαινοτυπικής ταυτοποίησης μικροοργανισμού. 67

68 Ο καθορισμός της αναλογίας G+C του γονιδιωματικού DNA ενός οργανισμού αποτελεί μέρος της κλασικής βακτηριακής ταξινομίας. G+C A+T+G+C (21) Τα μόρια του DNA διαχωρίζονται με φυγοκέντριση σε συστήματα διαβαθμισμένης πυκνότητας CsCl. Η πυκνότητα του DNA είναι ανάλογη της % περιεκτικότητας σε G+C. Η περιεκτικότητα του DNA σε G+C μπορεί να υπολογιστεί και από τη θερμοκρασία τήξης του, η οποία εξαρτάται από την περιεκτικότητα σε G+C. H γνώση της αναλογίας G+C ενός οργανισμού είναι χρήσιμη για την ταυτοποίησή του, αλλά σπάνια καθοριστική, καθώς είναι δυνατόν δύο οργανισμοί να έχουν την ίδια αναλογία G+C και να είναι άσχετοι μεταξύ τους (τόσο ταξινομικά όσο και φυλογενετικά). 68

69 Σχ.105. Περιεκτικότητα του DNA σε G+C των κύριων ομάδων οργανισμών. 69

70 Μοριακή ταξινομία Η μοριακή ταξινομία (χημειοταξινομία χημειοταξινομία) ) χρησιμοποιεί μοριακές αναλύσεις (υβριδοποίηση DNA:DNA, καθορισμός ριβοτύπου και λιπιδική ανάλυση). Υβριδοποίηση DNA:DNA H αναλογία G+C δεν παρέχει καμία απολύτως πληροφορία για την αλληλουχία των γονιδίων. Οι αλληλουχίες λ έχουν μεγάλη σημασία, γιατί αν δύο οργανισμοί έχουν τις ίδιες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων,, τότε είναι πιθανόν να περιέχουν παραπλήσια, αν όχι πανομοιότυπα γονίδια. Η γονιδιωματική υβριδοποίηση μετρά τον βαθμό ομοιότητας αλληλουχιών και είναι χρήσιμη για τη διάκριση οργανισμών με στενή συγγένεια μεταξύ τους. Στην πράξη, το DNA που απομονώθηκε από κάποιο οργανισμό ραδιοσημαίνεται με 32 Ρ ή 3 Η 2, τεμαχίζεται σε μικρά κομμάτια, μετουσιώνεται με θέρμανση και αναμειγνύεται με περίσσεια μη σημασμένου DNA που έχει παρασκευαστεί με τον ίδιο τρόπο από άλλο οργανισμό. Στη συνέχεια, το DNA ψύχεται για να επανέλθει επανασύζευξη και το δίκλωνο DNA διαχωρίζεται από το DNA που δεν έχει υβριδοποιηθεί. Κατόπιν, μετράται η ποσότητα ραδιενέργειας στο υβριδοποιημένο DNA και συγκρίνεται με το δείγμα ελέγχου (θεωρείται ως 100%). 70

71 Σχ.106. Η γονιδιωματική υβριδοποίηση ως ταξινομικό εργαλείο. 71

72 Αν και δεν υπάρχει καμία, κατά σύμβαση, αποδεκτή τιμή βαθμού υβριδοποίησης μορίων DNA για να τοποθετηθούν στην ίδια ταξινομική βαθμίδα, για να θεωρηθούν 2 οργανισμοί ως ίδια είδη, συνίσταται τιμή υβριδοποίησης 70% τουλάχιστον και 25-30% για το ίδιο γένος. Υβριδοποίηση εντελώς άσχετων οργανισμών είναι <10%. Στο προσεχές μέλλον, οι πλήρεις προσδιορισμοί των γονιδιωματικών αλληλουχιών θα καταστήσουν άχρηστες τις αναλύσεις υβριδοποίησης. Καθορισμός ριβοτύπου Ο καθορισμός ριβοτύπου στηρίζεται σε αναλύσεις rrna, αλλά δεν περιλαμβάνει προσδιορισμό αλληλουχιών. Βασίζεται στο πρότυπο ζωνών ηλεκτροφόρησης, όταν DNA ενός συγκεκριμένου οργανισμού υφίσταται τη δράση περιοριστικών ενζύμων. Τα θραύσματα διαχωρίζονται και υβριδοποιούνται με ανιχνευτή rrna (μοριακό δακτυλικό αποτύπωμα). Μεγάλη ποσότητα DNA ή DNA που κωδικοποιεί rrna 16S και τα σχετικά με αυτό γονίδια στο οπερόνιο rrna, το οποίο ενισχύεται με PCR, υφίσταται πέψη με ένα ή περισσότερα ένζυμα περιορισμού και τα προϊόντα της πέψης υβριδοποιύνται με ειδικό ανιχνευτή, αφού πρώτα διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση. 72

73 Στη συνέχεια, η εικόνα που σχηματίζουν τα θραύσματα DNA στα πηκτώματα συγκρίνεται με αντίστοιχους τύπους πέψης από οργανισμούς αναφοράς σε μια βάση δεδομένων. Επειδή οι διαφορές στις αλληλουχίες rrna μεταξύ δύο οργανισμών μεταφράζονται σε παρουσία ή απουσία σημείων δράσης των ενζύμων περιορισμού, το συνολικό πρότυπο των θραυσμάτων δεδομένου βακτηριακού είδους είναι μοναδικό για το είδος αυτό. Ο καθορισμός ριβοτύπου είναι μια γρήγορη (καθώς δεν απαιτείται καθορισμός αλληλουχιών) και εξειδικευμένη μέθοδος. Σχ.107. Καθορισμός ριβοτύπου. 73

74 Ανάλυση λιπαρών οξέων: FAME Mια άλλη μέθοδος ταυτοποίησης βακτηρίων στηρίζεται στον χαρακτηρισμό των τύπων και των αναλογιών λιπαρών οξέων στα λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών. εδομένου ότι η σύνθεση των λιπαρών οξέων στους προκαρυώτες μπορεί να ποικίλλει σημαντικά (διαφορές στο μήκος της αλυσίδας και την παρουσία ή απουσία ακόρεστων ομάδων,, διακλαδισμένων αλυσίδων,, υδροξυλομάδων,, κλπ), το συνολικό πρότυπο λιπαρών οξέων έχει διαγνωστική χρησιμότητα. Στην πράξη, τα λιπαρά οξέα που απομονώνονται από κύτταρα που έχουν καλλιεργηθεί σε πρότυπες συνθήκες μετατρέπονται σε μεθυλεστέρες, οι οποίοι ανιχνεύονται με αέρια χρωματογραφία. Το χρωματογράφημα που λαμβάνεται συγκρίνεται με βάση δεδομένων, η οποία περιέχει τα πρότυπα των λιπαρών οξέων χιλιάδων βακτηρίων που έχουν καλλιεργηθεί στις ίδιες συνθήκες. Οι αναλύσεις FAME απαιτούν αυστηρή προτυποποίηση, αφού η σύνθεση των λιπαρών οξέων ενός οργανισμού ποικίλλει με τη θερμοκρασία, τη φάση ανάπτυξης (εκθετική ή στάσιμη), και σε μικρότερο βαθμό, το υγρό καλλιέργειας. 74

75 Σχ.108. Ανάλυση FAME για την ταυτοποίηση βακτηρίων. 75

76 Η έννοια των ειδών Στον κόσμο των φυτών και των ζώων, είδος θερωρείται ένας πληθυσμός από άτομα που μπορούν να διασταυρωθούν υπό φυσιολογικές συνθήκες και να παράγουν γόνιμους απογόνους. Ο πληθυσμός αυτός πρέπει να είναι απομονωμένος ως προς την δυνατότητα αναπαραγωγής από άλλους πληθυσμούς. Καθώς οι προκαρυώτες είναι απλοειδείς οργανισμοί που αναπαράγονται αφυλετικά,, η έννοια «παράγουν γόνιμους απογόνους» δεν έχει νόημα. Για τη διάκριση των βακτηριακών ειδών, τόσο σε γενετική όσο και σε φαινοτυπική βάση, χρησιμοποείται σήμερα ένας συνδυασμός μεθόδων (πολυφασική ταξινομία). Η πολυφασική ταξινομία περιλαμβάνει κυρίως ανάλυση αλληλουχιών rrna SSU (small subunit) και γονιδιωματική υβριδοποίηση. Ισχύει ότι ένας προκαρυώτης του οποίου η αλληλουχία rrna 16S διαφέρει τουλάχιστον κατά 3% από εκείνη άλλων μικροοργανισμών θα πρέπει να θεωρείται ως νέο είδος. Η παραπάνω πρόταση στηρίζεται από την παρατήρηση ότι DNA από 2 βακτήρια των οποίων οι αλληλουχίες των rrna 16S είναι όμοιες σε ποσοστό <97%, κατά κανόνα υβριδοποιούνται σε ποσοστό <70% (ελάχιστη τιμή ένδειξης ότι οι 2 μικροοργανισμοί ανήκουν στο ίδιο είδος). 76

77 Ωστόσο, κάποιοι μικροοργανισμοί με παραπλήσιες αλληλουχίες rrna έχουν γονιδιώματα αρκετά διαφορετικά μεταξύ τους. Κατά συνέπεια, διάφορα νέα είδη δεν θα γίνονταν αντιληπτά αν στηριζόμασταν αποκλειστικά στην αλληλουχία rrna SSU. Eπομένως, σε επίπεδο ειδών είναι συχνά απαραίτητη η πολυφασική ταξινομία. Για ταξινόμηση σε ανώτερο όμως επίπεδο, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας rrna είναι συνήθως αρκετός. Σχ.109. Συσχετισμός μεταξύ ομοιότητας αλληλουχιών rrna 16S και υβριδοποίησης γονιδιωματικού DNA σε διάφορα ζεύγη οργανισμών. 77

78 Ένα είδος συνήθως ορίζεται από χαρακτηριστικά αρκετών στελεχών. Ομάδες ειδών ομαδοποιούνται σε γένη. Με βάση τα μοριακά κριτήρια, διαφορές >5-7% στην αλληλουχία rrna 16S υποδεικνύουν ένα νέο γένος. Ομάδες από γένη ομαδοποιούνται σε οικογένειες,, ομάδες οικογενειών σε τάξεις, κλπ. Έτσι έχουμε: είδος, γένος, οικογένεια, τάξη, ομοιοταξία, φύλο, «χώρος». Κατά την ταυτοποίηση ενός άγνωστου οργανισμού, είναι απαραίτητο ο οργανισμός να ικανοποιεί όλα τα ταξινομικά κριτήρια των διάφορων επιπέδων, π.χ. όλα τα είδη του γένους Allochromatium πρέπει να είναι ραβδόμορφα, πορφυρά, Gram (-) θειοβακτήρια. Με άλλα λόγια, όσο «κατεβαίνουμε» από τον «χώρο» στο είδος, τα κριτήρια γίνονται λιγότερο γενικά και περισσότερο εξειδικευμένα. Βακτηριακή ειδογένεση Ως οικότυπος ονομάζεται ο πληθυσμός κυττάρων που προέρχεται από ένα και μόνο κύτταρο, ο οποίος καταλαμβάνει έναν συγκεκριμένο ρμ οικολογικό θώκο. 78

79 Στο εσωτερικό ενός οικότυπου,, είναι δυνατόν να εμφανιστεί μια προσαρμοστική ρμ μετάλλαξη που θα οδηγήσει σε περιοδική επιλογή, με συνέπεια ο παλαιός οικότυπος να εξαλείφεται από τον νέο. Με τον τρόπο αυτό, οι πληθυσμοί των κυττάρων απομακρύνονται ο ένας από τον άλλον και επαναλαμβανόμενοι κύκλοι μεταλλάξεων και φυσικής επιλογής οδηγούν τελικά σε έναν νέο οικότυπο, αρκετά διαφορετικό γενετικά από τον αρχικό, έτσι ώστε να αναγνωρίζεται τώρα ως νέο είδος. Η βακτηριακή ειδογένεση επηρεάζεται και από την οριζόντια γονιδιακή ροή (μεταφορά γονιδίων μεταξύ ειδών με σύζευξη, μεταγωγή και μετασχηματισμό), μάλλον όχι όμως σε σημαντικό βαθμό, καθώς τα γονίδια που αποκτώνται με οριζόντια μεταφορά είναι συνήθως αριθμητικά λίγα και προσφέρουν μόνο ένα παροδικό πλεονέκτημα. Ονοματολογία και το εγχειρίδιο του Bergey Aκολουθώντας το διωνυμικό σύστημα,, οι μικροοργανισμοί έχουν επίθετα είδους και γένους. Τα ονόματα είναι συνήθως λατινικά ή εκλατινισμένα ελληνικά (Bacillus subtilis, B. cereus, κλπ) περιγράφοντας κάποια ιδιότητά τους. 79

80 Σχ.110. Πιθανός μηχανισμός βακτηριακής ειδογένεσης. 80

81 Όταν ένας μικροοργανισμός απομονώνεται και θεωρείται ως μοναδικός, πρέπει να ληφθεί μια απόφαση για το αν είναι αρκούντως διαφορετικός από άλλα είδη, ώστε να περιγραφεί ως νέος ή ίσως ακόμη και ως νέο γένος (οπότε αυτόματα γενάται και νέο είδος). Για να αποκτήσει επίσημη ταξινομική υπόσταση το νέο γένος ή είδος, δημοσιεύεται μια λεπτομερής περιγραφή του απομονωμένου μικροοργανισμού, καθώς και η προτεινόμενη ονομασία του, ενώ μια βιώσιμη καλλιέργειά του κατατίθεται σε δύο συλλογές καλλιεργειών εργεώ [ΑΤ ΑΤCC (American Type Culture Collection) o ή DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorgansismen und Zellkuturen)]. Οι συλλογές διατηρούνται υπό κατάψυξη (-80 έως -196 o C) ή σε λυοφιλιωμένη μορφή. Αν η περιγραφή ενός μικροοργανισμού δημοσιευθεί σε άλλο περιοδικό εκτός από το International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM) της επίσημης έκδοσης του αρχείου για την ταξινομία και την κατάταξη των προκαρυωτών και ζυμομυκήτων, τότε ένα αντίγραφο του δημοσιευμένου άρθρου πρέπει να υποβληθεί σε αυτό το περιοδικό και η ονομασία να επικυρωθεί πριν γίνει δεκτή ως νέα μικροβιολογική ταξινομική μονάδα. Αν και καμία πηγή δεν αναγνωρίζεται ως επίσημη στο πεδίο της μικροβιακής ταξινομίας, ας, το Εγχειρίδιο Συστηματικής Βακτηριολογίας ογ ας του Bergey egeyα αποτελεί ε αναφορά πρώτης επιλογής. 81

82 Το Εγχειρίδιο Συστηματικής Βακτηριολογίας του Bergey είναι ένας κατάλογος πρότυπων και μοριακών πληροφοριών για όλα τα αναγνωρισμένα είδη προκαρυωτών κατά τον χρόνο δημοσιευσής του. Ένα δεύτερο έργο αναφοράς είναι μια πολύτομη εργασία με το όνομα The Prokaryotes. Συλλογικά, το Εγχειρίδιο Συστηματικής Βακτηριολογίας του Bergey και το The Prokaryotes προσφέρουν θεμελιώδεις πληροφορίες της μικροβιακής φυλογενετικής και ταξινομίας. Σχ.111. Η δεύτερη έκδοση του Εγχειριδίου Συστηματικής Βακτηριολογίας του Bergey. 82