ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: «ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ - ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: Χ. Α. ΠΑΝΑΓΙΩΤΙΔΗΣ, Αναπλ. Καθηγητής Κυτταρικής & Μοριακής Βιολογίας ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕIΝΩΝ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΟΥ ΑΠΛΟΥ ΕΡΠΗΤΑ ΤΥΠΟΥ 1 (HSV-1) ΚΑΙ ΤΟΥ ΕΡΠΗΤΑ ΖΩΣΤΗΡΑ (VZV) ΜΕ ΣΚΟΠΟ ΤΗ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΩΝ ΙΩΝ ΑΥΤΩΝ ΣΑΒΒΟΓΛΟΥ ΚΥΡΙΑΚΟΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΜΟΡ. ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΣ ΦΟΙΤΗΤΗΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 Στην οικογένειά μου 2

3 Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη του Aναπληρωτή Kαθηγητή Χ.Α. Παναγιωτίδη, τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την καθοδήγηση και τη βοήθειά του καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Τον ευχαριστώ, επίσης, θερμά και για τη διόρθωση του παρόντος κειμένου. Ευχαριστώ τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής μου, Αναπληρωτή Καθηγητή Α. Κ. Κανελλή και Επίκουρο Καθηγητή Ι. Σ. Βιζιριανάκη, για την εποικοδομητική κριτική της παρούσας εργασίας. Επίσης, ευχαριστώ την κυρία Ε. Μπούρα για τη λήψη των αιμάτων στο τελευταίο στάδιο της εργασίας, καθώς και όλους τους εθελοντές αιμοδότες. Ευχαριστώ τα μέλη του εργαστηρίου του κ. Χ. Παναγιωτίδη, Μερόπη Μάττα, Μοσχούλα Καραζαφείρη και Ιωάννα Σταυρακάκη για το φιλικό περιβάλλον, την άριστη συνεργασία και τη βοήθειά τους καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Ευχαριστώ όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψηφίους διδάκτορες του τομέα Φαρμακογνωσίας / Φαρμακολογίας για το άριστο κλίμα και τη συνεργασία. Τέλος, ευχαριστώ τους γονείς μου Ηλία και Γλυκερία, καθώς και την αδερφή μου Χρύσα για τη συμπαράστασή τους και την ψυχολογική τους υποστήριξη. 3

4 Περιεχόμενα Α. Θεωρητικό μέρος...7 Α.1. Οι ερπητοϊοι HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1) και VZV (Varicella-Zoster Virus)...7 Α.2. Η δομή των ιών HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1) και VZV (Varicella-Zoster Virus)...10 Α.3. Αναπαραγωγικός κύκλος Λυτική μόλυνση...11 Α.4. Σύνδεση του ιοσωματίου με το κύτταρο-ξενιστή και σύντηξη του ιικού φακέλου με την κυτταρική μεμβράνη...12 A.5. Ανοσοαπόκριση στον ιό HSV A.5.1. Χυμική ανοσία...15 A.5.2. Κυτταρική ανοσία...16 A.6. Ανοσοαπόκριση στον ιό VZV...17 A.6.1. Χυμική ανοσία...17 A.6.2. Κυτταρική ανοσία...18 Α.7. Αντιικά φάρμακα Α.8. Εμβόλια κατά του HSV Α.9. Εμβόλια κατά του VZV...21 Α.10. Χαρακτηριστικά των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd του ιού HSV-1 και των γλυκοπρωτεϊνών ge (ORF68) και gl (ORF60) του ιού VZV...23 Α Γλυκοπρωτεΐνη gb του ιού HSV Α Γλυκοπρωτεΐνη gd του ιού HSV Α Γλυκοπρωτεΐνη ge (ORF68) του ιού VZV...26 Α Γλυκοπρωτεΐνη gl (ORF60) του ιού VZV...27 Α.11. Μέθοδοι για την διάγνωση του ιού HSV Α.12. Μέθοδοι για την διάγνωση του ιού VZV...31 Β. Υλικά και Μέθοδοι...34 Β.1. Υλικά...34 Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια...34 Β.1.2. Ένζυμα Αντιδραστήρια Μοριακής Βιολογίας...34 Β.1.3. Βιολογικά υλικά...35 Β.2. Μέθοδοι...35 Β.2.1. Καλλιέργεια βακτηρίων Ε.coli και επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης

5 Β.2.2. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA...36 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (mini prep)...36 Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με τη χρήση στήλης...37 Β.2.3. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός του DNA ή RNA...38 Β.2.4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)...39 Β.2.5. Πέψη του DNA με ένζυμα περιορισμού...41 Β.2.6. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς...42 Β.2.7. Προετοιμασία επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων για μετασχηματισμό με DNA...47 Β.2.8. Μεταμόρφωση βακτηρίων E. coli με πλασμίδιο επιλογής...48 Β.2.9. Ηλεκτροφόρηση...49 Β Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης...49 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών...50 Β Χρώση πηκτής πολυακρυλαμιδίου με Coomassie Brilliant Blue (CBB, R-250)...52 Β Μεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη και ανοσοαποτύπωμα western...52 Β.2.12.Έλεγχος της έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε βακτήρια...54 Β.2.13.Έλεγχος για την διαλυτότητα των πρωτεϊνών εντός των βακτηρίων...55 Β Απομόνωση και καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων...55 Β Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών κατά Bradford...57 Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη χρωματογραφίας συγγένειας...57 Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης...58 Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη Ni-NTA αγαρόζης...59 Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη χρωματογραφίας μοριακής διήθησης...61 Β Πρωτεολυτική κοπή των πρωτεϊνών σύντηξης με την πρωτεάση περιορισμού παράγοντα Xa...63 Β Ανοσοποίηση κουνελιών...63 Β Συλλογή προάνοσου ορού από κουνέλια...63 Β Συλλογή ορού από κουνέλια...64 Β Παραγωγή αντιγόνου για ένεση σε κουνέλια...64 Β Έλεγχος του τίτλου των αντι-ορών...66 Γ. Πειραματικά αποτελέσματα

6 Γ.1. Απομόνωση και ενίσχυση των τμημάτων των γονιδίων των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd με τη μέθοδο PCR...67 Γ.2. Κλωνοποίηση των προϊόντων της PCR στον πλασμιδιακό φορέα pζero-2.1 A- tailed...71 Γ.3. Έλεγχος του προσανατολισμού της αλληλουχίας στους φορείς κλωνοποίησης..73 Γ.4. Πέψη των θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI με σκοπό την απομόνωση των τμημάτων DNA από αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως...75 Γ.5. Κλωνοποίηση των τμημάτων των γονιδίων gb και gd στον πλασμιδιακό φορέα pet-16b...76 Γ.6. Έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε βακτήρια...78 Γ.7. Επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης σε μεγάλη κλίμακα (500 ml)...80 Γ.8. Απομόνωση και καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων...82 Γ.9. Υπολογισμός συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα βακτηριακά έγκλειστα...82 Γ.10. Ανοσοποίηση κουνελιών...83 Γ.11. Έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-ORF60-His6 και GST- ORF68-His6 του VZV σε βακτήρια...87 Γ.12. Επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνών GST-ORF60-His6 και GST-ORF68-His6 σε μεγάλη κλίμακα (500 ml)...91 Γ.13. Απομόνωση και καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων που σχηματίζει η πρωτεΐνη GST-ORF60-His Γ.14. Καθαρισμός των πρωτεϊνών His10-gB, His10-gD, GST-ORF60-His6 και ORF68 με χρωματογραφία συγγένειας...95 Γ.15. Δημιουργία μίγματος που περιέχει και τις 4 πρωτεΐνες (GST-ORF60-His6, ORF68-His6, His10-gB, His10-gD) και δημιουργία των διαγνωστικών ταινιών (strips) Γ.16. Διαγνωστικός ορολογικός έλεγχος για την παρουσία μολύνσεων από τους ιούς HSV-1 και VZV Δ. Συζήτηση αποτελεσμάτων Ε. Βιβλιογραφία

7 Α. Θεωρητικό μέρος Α.1. Οι ερπητοϊοι HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1) και VZV (Varicella-Zoster Virus) Ο ιός του απλού έρπητα (Herpes Simplex Virus-1, HSV-1) και ο ιός του έρπητα ζωστήρα (Varicella-Zoster Virus, VZV) ανήκουν στην οικογένεια των ερπητοϊών με την ακόλουθη χαρακτηριστική δομή: α) ένα γραμμικό δίκλωνο μόριο DNA που περικλείεται εντός εικασαεδρικού νουκλεοκαψιδίου, β) έναν φάκελο που περιβάλλει το νουκλεοκαψίδιο και αποτελείται από μια λιπιδική διπλοστοιβάδα κυτταρικής προέλευσης, πάνω στην οποία βρίσκονται ενσωματωμένες και προεξέχουν οι γλυκοπρωτεΐνες του ιού και γ) το περικάλυμμα (tegument), το οποίο βρίσκεται ανάμεσα στο φάκελο και το νουκλεοκαψίδιο και αποτελείται από μία άμορφη στοιβάδα πρωτεϊνών που συμμετέχουν ενεργά, κυρίως στα πρώτα στάδια της μόλυνσης. Εκτός από τους δύο προαναφερθέντες ιούς άλλοι 130 περίπου έχουν χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα, ενώ οκτώ έχουν απομονωθεί από τον άνθρωπο. Αυτοί είναι: ο ιός του απλού έρπητα τύπου 1 (Herpes Simplex Virus 1, HSV-1 ή HHV-1) και τύπου 2 (HSV-2 ή HHV-2), ο ιός του έρπητα του ζωστήρα (Varicella-Zoster Virus, VZV ή HHV-3), ο ιός Epstein-Barr (Epstein-Barr Virus, EBV ή HHV-4), ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (Human Cytomegalovirus, HCMV ή HHV-5) και οι ανθρώπινοι ερπητοϊοί 6, 7 και 8 (Human Herpes Virus 6, 7, 8, HHV6, HHV7, HHV8). Οι ιοί HSV-1 και VZV ανήκουν στην υποοικογένεια των άλφα- ή νευροτρόπων ερπητοϊών. Οι ιοί αυτής της υποοικογένειας προσβάλλουν μία μεγάλη ποικιλία ξενιστών, παρουσιάζουν σχετικά σύντομο αναπαραγωγικό κύκλο, διαδίδονται γρήγορα σε κυτταροκαλλιέργειες, καταστρέφουν αποτελεσματικά τα κύτταρα που μολύνουν και έχουν την ικανότητα να εγκαθιδρύουν λανθάνουσα μόλυνση κυρίως στα γάγγλια των αισθητικών νευρώνων. [1] Ο ΗSV-1 χαρακτηρίζεται από την ικανότητά του να εισβάλει και να εγκαθιδρύει μία κατάσταση λανθάνουσας φάσης στο νευρικό σύστημα του ξενιστή. [1] Έτσι, παρά το γεγονός ότι ο ΗSV-1 είναι περισσότερο γνωστός για τις χαρακτηριστικές φουσκάλες που προκαλεί στο δέρμα γύρω από τα χείλη (Εικόνα 1), 7

8 έχει την ικανότητα είτε να προσβάλλει το περιφερικό νευρικό σύστημα προκαλώντας μια πληθώρα από εκφυλιστικά αποτελέσματα στα επιθηλιακά κύτταρα που νευρώνονται από αυτό, ή σπανιότερα να προσβάλλει λυτικά το κεντρικό νευρικό σύστημα, γεγονός που εκδηλώνεται με τη μορφή της θανατηφόρας εγκεφαλίτιδας.[2] Ο ιός HSV-1 αρχικά μολύνει την επιφάνεια του δέρματος ή του βλεννογόνου. Η μόλυνση του δέρματος από τον HSV-1 έχει επίσης ως αποτέλεσμα τη σύντηξη των κυτταροπλασματικών μεμβρανών, οδηγώντας έτσι στο σχηματισμό πολυπύρηνων ή πολυκαρυωτικών κυττάρων. Μετά τη λύση των μολυσμένων κυττάρων, ανάμεσα στην επιδερμίδα και τη δερμική στοιβάδα σχηματίζονται φλύκταινες, στις οποίες συσσωρεύεται υγρό που περιέχει ιoσωμάτια, κυτταρικά θραύσματα αλλά και φλεγμονώδη και πολυπύρηνα κύτταρα. Όταν η μόλυνση συμβαίνει σε βλεννώδεις μεμβράνες οι φλύκταινες είναι λιγότερο εμφανείς, ενώ εμφανίζονται κυρίως ρηχά έλκη που οφείλονται στη ρήξη των φλυκταινών αυτών, λόγω του πολύ λεπτού τοιχώματος της επιθηλιακής στοιβάδας.[3] Εικόνα 1. Επανεμφανιζόμενος χειλικός έρπητας. [4] Ο ιός VZV προκαλεί ανεμοβλογιά και έρπητα ζωστήρα. Η ανεμοβλογιά που προκύπτει από την πρωταρχική μόλυνση είναι μια παιδική ασθένεια με υψηλό πυρετό και χαρακτηριστικά κυστικά εξανθήματα σε όλο το σώμα (Εικόνα 2.α). Όπως ο HSV- 1, έτσι και ο VZV έχει την ικανότητα να εγκαθιδρύει μια κατάσταση λανθάνουσας φάσης στα οπίσθια ραχιαία γάγγλια του νωτιαίου μυελού. Ο έρπης ζωστήρ είναι ένα επίπονο τοπικό κυστικό εξάνθημα που προκαλείται από την επανενεργοποίηση του 8

9 ιού (Εικόνα 2.β). Η συχνότητα εμφάνισής του αυξάνεται ανάλογα με την ηλικία και την ανοσοκαταστολή του ατόμου. [5] Ο ιός VZV εισέρχεται στον οργανισμό μέσω της αναπνευστικής οδού. Στην πορεία της διάδοσής του, ο ιός που βρίσκεται στα σταγονίδια της αναπνοής ή σε ρευστά κυστίδια μολυσμένου ατόμου, μολύνει περιοχές του βλεννογόνου. Στη συνέχεια, επεκτείνεται σε γειτονικούς λεμφικούς αδένες και ακολουθεί η μόλυνση των κυττάρων του ήπατος ή των μονοπύρηνων κυττάρων του αίματος. Η διαδικασία αυτή της επώασης, διαρκεί 14 μέρες. Αφού περάσει αυτή η περίοδος, τα μολυσμένα μονοπύρηνα κύτταρα, τα οποία έχουν την ικανότητα να διαπερνούν τα τριχοειδή των αγγείων και να προσεγγίζουν τον δερματικό ιστό, μεταφέρονται στο δέρμα όπου μολύνουν τα επιδερμικά κύτταρα. Σε αυτό το σημείο εμφανίζονται τα χαρακτηριστικά κυστικά εξανθήματα που προκαλούνται από τη σύντηξη των κυτταροπλασματικών μεμβρανών των επιδερμικών κυττάρων και τον σχηματισμό πολυπύρηνων ή πολυκαρυωτικών κυττάρων. Επίσης, ο ιός μπορεί να προσεγγίσει τον δερματικό ιστό μέσω της εξάπλωσής του στα επιθηλιακά κύτταρα που σχηματίζουν τα τριχοειδή τοιχώματα των αγγείων. [5] Εικόνα 2. α) Χαρακτηριστικά συμπτώματα ανεμοβλογιάς κατά την πρωταρχική μόλυνση από τον ιό VZV, [6] β) Έρπητας ζωστήρας που προκαλείται από την επανενεργοποίηση του ιού VZV.[7] 9

10 Α.2. Η δομή των ιών HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1) και VZV (Varicella- Zoster Virus) Οι δύο ιοί δηλαδή ο HSV-1 και ο VZV έχουν παρόμοια δομή (Εικόνες 3, 4). Αρχίζοντας από το εσωτερικό, το γενετικό υλικό τους αποτελείται από ένα δίκλωνο γραμμικό μόριο DNA. Το γένωμα του HSV-1 αποτελείται από βάσεις και περιέχει τουλάχιστον 81 ανοικτά αναγνωστικά πλαίσια που κωδικοποιούν ιικές πρωτεΐνες. Το γένωμα του VZV έχει μέγεθος βάσεις και περιέχει τουλάχιστον 71 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης.[6] Ο VZV είναι ο μικρότερος ερπητοϊός που προσβάλλει τον άνθρωπο και στερείται γονιδίων για αρκετές πρωτεΐνες που εκφράζει ο HSV-1, όπως της γλυκοπρωτεΐνης gd. Το DNA των παραπάνω ιών περικλείεται από ένα πρωτεϊνικό εικοσαεδρικό νουκλεοκαψίδιο, το οποίο αποτελείται από έξι δομικές πρωτεΐνες που περιβάλλουν τον πυρήνα. Εξωτερικά του νουκλεοκαψιδίου βρίσκεται μια άμορφη πρωτεϊνική στοιβάδα, το περικάλυμμα, που αποτελείται και στους δύο ιούς από 19 διαφορετικές πρωτεΐνες.[1, 5] Ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι τα 2/3 του όγκου του ιοσωματίου καταλαμβάνονται από το περικάλυμμα, ενώ το νουκλεοκαψίδιο κατέχει μόλις το 1/3 του όγκου αυτού. [8] Στο εξωτερικό τμήμα των ιών υπάρχει ένας λιπιδικός φάκελος πάνω στον οποίο βρίσκονται ενσωματωμένες ιικές γλυκοπρωτεΐνες. Στην περίπτωση του HSV-1 υπάρχουν ενσωματωμένες 16 ιικές γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες προεξέχουν σχηματίζοντας 600 με 750 χαρακτηριστικές προεξοχές (spikes) σε κάθε ιοσωμάτιο. Οι γλυκοπρωτεΐνες αυτές είναι πολύ σημαντικές για την είσοδο του ιοσωματίου στο κύτταρο-ξενιστή και την αποφυγή της ανοσοαπόκρισης.[8] Ο VZV αντίθετα περιέχει ενσωματωμένες μόλις 8 ιικές γλυκοπρωτεΐνες. [6] Γλυκοπρωτεΐνη Φάκελος Περικάλυμμα Περικάλλυμα Περικάλλυμα ds DNA Νουκλεοκαψίδιο Εικόνα 3. Σχηματική χαρακτηριστική δομή των ερπητοϊών. [9] 10

11 Εικόνα 4. Αριστερά: Ιός του απλού έρπητα HSV-1 (εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο),[7] δεξιά: Ιός του έρπητα ζωστήρ VZV (εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο).[10] Α.3. Αναπαραγωγικός κύκλος Λυτική μόλυνση Η λυτική μόλυνση, ή αναπαραγωγικός κύκλος του HSV-1, αρχίζει με τη σύνδεση του ιοσωματίου στην επιφάνεια του κυττάρου και τη σύντηξη του ιικού φακέλου με την κυτταρική μεμβράνη. Ακολουθεί η είσοδος του νουκλεοκαψιδίου και των πρωτεϊνών του περικαλύμματος στο κύτταρο-ξενιστή και η μεταφορά του νουκλεοκαψιδίου προς τον πυρήνα του κυττάρου, στον οποίο εισέρχεται μόνο το ιικό DNA καθώς και κάποιες πρωτεΐνες του περικαλύμματος. Μετά την είσοδό του στον πυρήνα, το ιικό γένωμα κυκλοποιείται και γίνεται η έναρξη της γονιδιακής έκφρασης, η οποία οδηγεί στα τρία διαδοχικά κύματα έκφρασης των ιικών γονιδίων (α, β και γ). Μετά την έκφραση των α γονιδίων, που κωδικοποιούν κυρίως ρυθμιστικές πρωτεΐνες, και των β γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες απαραίτητες για την αντιγραφή του ιικού DNA, ακολουθεί ο αναδιπλασιασμός του ιικού DNA. Την αντιγραφή του ιικού DNA ακολουθεί η έκφραση των γ γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν κυρίως δομικές πρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες. Τέλος, λαμβάνει χώρα η διαδικασία του πακεταρίσματος του ιοσωματίου, δηλαδή του σχηματισμού του νουκλεοκαψιδίου, της περιβολής του με το φάκελο και της εξόδου του από το κύτταρο.[1, 11] Στην παρούσα εργασία, το στάδιο που μας ενδιαφέρει είναι αυτό της σύνδεσης του ιοσωματίου στην επιφάνεια του κυττάρου και της σύντηξης του ιικού φακέλου με την κυτταρική μεμβράνη, το οποίο θα αναλυθεί χωριστά και λεπτομερώς παρακάτω, όπου θα αναφερθεί και η επίδραση που έχουν οι ιικές πρωτεΐνες στο κύτταρο-ξενιστή. 11

12 Ακόμη και στην περίπτωση του ιού VZV, ο αναπαραγωγικός κύκλος στηρίζεται στις αλληλεπιδράσεις των γλυκοπρωτεϊνών του με υποδοχείς της επιφάνειας του κυττάρου-ξενιστή. Η βασική διαφορά είναι ότι οι γλυκοπρωτεΐνες του VZV έχουν παραλλαγμένους ρόλους, σε σχέση με τις αντίστοιχες γλυκοπρωτεΐνες του HSV-1. Λεπτομέρειες της παρακάτω διαδικασίας θα αναφερθούν στη συνέχεια. Α.4. Σύνδεση του ιοσωματίου με το κύτταρο-ξενιστή και σύντηξη του ιικού φακέλου με την κυτταρική μεμβράνη Η αρχική σύνδεση του HSV-1 με ένα κύτταρο, πιστεύεται ότι οφείλεται στη σύνδεση του ιοσωματίου με αλυσίδες γλυκοσαμινογλυκάνης των πρωτεογλυκανών στην επιφάνεια του κυττάρου. Η θειϊκή ηπαράνη, ένα από τα πολλά είδη γλυκοσαμινογλυκάνης, θεωρείται ότι είναι ένας υποδοχέας σύνδεσης αλλά όχι υποδοχέας εισόδου του ιού. Η θειϊκή ηπαράνη υπάρχει σε πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, με εξαίρεση τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Δύο από τις ιικές γλυκοπρωτεΐνες, η gb και η gc, είναι ικανές να συνδέονται με τη θειϊκή ηπαράνη και καθεμία από αυτές φαίνεται ότι μπορεί να μεσολαβήσει στη σύνδεση του ιοσωματίου με την επιφάνεια του κυττάρου. Αν και αυτή η σύνδεση του ιού ενισχύει την αποτελεσματικότητα της μόλυνσης, δεν είναι απολύτως απαραίτητη, τουλάχιστον κατά τη μόλυνση κυττάρων σε κυτταροκαλλιέργειες (in vitro). Αν η gc απουσιάζει από το ιοσωμάτιο μειώνεται ελάχιστα η μολυσματικότητα του ιού, ενώ ταυτόχρονη απουσία των gc και gb ελαττώνει αισθητά τη σύνδεση του ιοσωματίου στην επιφάνεια του κυττάρου και αναστέλλει τη μολυσματικότητα του ιού. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η gb, εκτός από τη συμμετοχή της στη σύνδεση του ιού με το κύτταρο-ξενιστή, συμμετέχει επίσης και στο στάδιο της εισόδου του ιού στο κύτταρο αυτό. Παράλληλα, αν και κύτταρα που στερούνται γλυκοσαμινογλυκανών μολύνονται δυσκολότερα από τον HSV-1, μόνο η απουσία των υποδοχέων εισόδου (αναφορά παρακάτω) αναστέλλει τελείως τη μόλυνση των κυττάρων αυτών από τον ιό.[3] Οι αλληλεπιδράσεις των γλυκοπρωτεϊνών gb και gc με τη θειϊκή ηπαράνη στην επιφάνεια του κυττάρου δεν επαρκούν για την είσοδο του ιού. Μετά τη σύνδεση του ιού στην επιφάνεια του κυττάρου, η είσοδος απαιτεί την αλληλεπίδραση της ιικής γλυκοπρωτεΐνης gd με έναν από τους εξειδικευμένους υποδοχείς εισόδου. Η σύνδεση 12

13 της gd με τον υποδοχέα προκαλεί σύντηξη του ιικού φακέλου με την κυτταροπλασματική μεμβράνη και με αυτόν τον τρόπο την είσοδο του ιικού νουκλεοκαψιδίου και των πρωτεϊνών του περικαλύμματος στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η σύντηξη απαιτεί τη δράση και άλλων γλυκοπρωτεϊνών του φακέλου, όπως της gb και του ετεροδιμερούς gh-gl, σε συνδυασμό με τη gd και τον υποδοχέα της (Εικόνα 5).[3] Οι μέχρι σήμερα γνωστοί υποδοχείς εισόδου χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες, οι οποίες περιλαμβάνουν: α) τον HVEM (Herpes Virus Entry Mediator, καθοριστής της εισόδου του έρπητα), ο οποίος είναι μέλος της οικογένειας των υποδοχέων TNF (Tumor Necrosis Factor), β) τις νεκτίνες-1 και 2 ή πλεκτίνες, οι οποίες αποτελούν μέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών και γ) ειδικές περιοχές της θειϊκής ηπαράνης που δημιουργούνται με συγκεκριμένες 3-Οθειοτρανσφεράσες. Ο υποδοχέας HVEM εκφράζεται σε πλήθος κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των Τ και Β λεμφοκυττάρων, καθώς και άλλων λευκοκυττάρων, των επιθηλιακών κυττάρων και των ινοβλαστών, αλλά όχι των νευρικών κυττάρων. Η νεκτίνη-1 εκφράζεται επίσης σε μία ποικιλία κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών κυττάρων, των ινοβλαστών και των νευρικών κυττάρων. Και οι δύο προαναφερθέντες υποδοχείς είναι εξαιρετικά σημαντικοί τόσο για την είσοδο του ιού HSV-1 όσο και για την είσοδο του ιού HSV- 2. Αντίθετα, η νεκτίνη-2 αν και συμμετέχει στην είσοδο του HSV-2, είναι ουσιαστικά ανενεργός στην είσοδο του HSV-1. Ενώ, οι περιοχές της θειϊκής ηπαράνης που δημιουργούνται με συγκεκριμένες 3-Ο-θειοτρανσφεράσες δεν συμμετέχουν στην είσοδο του HSV-2.[3] Οι γλυκοπρωτεΐνες gb, gh και gl είναι δομικά συντηρημένες σε όλους τους ερπητοϊούς και πιθανώς έχουν και και συντηρημένους ρόλους κατά την είσοδο των υπολοίπων ιών. Οι gc και gd αντίθετα, είναι συντηρημένες ανάμεσα στους περισσότερους άλφα- ή νευροτρόπους ερπητοϊούς (εξαίρεση αποτελεί ο VZV) αλλά δεν έχουν αναγνωρίσιμα δομικά ανάλογα στις άλλες υποοικογένειες των ερπητοϊών.[3] 13

14 Εικόνα 5. Υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας και ιικοί συνδέτες που συμμετέχουν στην είσοδο του ιού HSV-1 εντός του κυττάρου. Η πρόσδεση του ιού με το κύτταρο μπορεί να γίνει μέσω της σύνδεσης της gb ή της gc στις αλυσίδες της θειικής ηπαράνης των πρωτεογλυκανών της επιφάνειας του κυττάρου, γεγονός που διευκολύνει τη σύνδεση της gd σε έναν από τους κυτταρικούς της υποδοχείς. Η σύνδεση της gd με έναν από αυτούς τους υποδοχείς οδηγεί στη σύντηξη του ιικού φακέλου και της κυτταρικής μεμβράνης. Αυτή η σύντηξη απαιτεί τη δράση των gb και gh-gl ετεροδιμερών, καθώς επίσης και του gd και ενός υποδοχέα του gd.[3] Ο ιός VZV στερείται της γλυκοπρωτεΐνης gd, η οποία παίζει βασικό ρόλο στην είσοδο του HSV-1 στα κύτταρα-ξενιστές. Οι υπόλοιπες γλυκοπρωτεΐνες είναι αυτές που κατά κάποιον τρόπο αναπληρώνουν την έλλειψη της gd. Αναλυτικά, πριν τη σύντηξη των μεμβρανών ο ιός πρέπει πρώτα να προσδεθεί στην επιφάνεια του κυττάρου-στόχου (Εικόνα 6). Αυτό πετυχαίνεται μέσω της αλληλεπίδρασης του ιού με τις αλυσίδες της θειικής ηπαράνης των πρωτεογλυκανών. Σε αυτή την αλληλεπίδραση μεσολαβούν οι γλυκοπρωτεΐνες gb, gh και gi, οι οποίες βρίσκονται στον εξωτερικό φάκελο του ιού. Δεν έχει αναφερθεί κάποιος ειδικός ρόλος για την γλυκοπρωτεΐνη gc, ενώ η γλυκοπρωτεΐνη gl λειτουργεί ως συνοδός-πρωτεΐνη της gh και βοηθά στη ωρίμανσή της.[12] Παρόλα αυτά, σύμπλοκο gh-gl δεν εντοπίζεται στην επιφάνεια του κυττάρου, αφού η ωρίμανση της gh λαμβάνει χώρα εντός του ξενιστή και η gl αποσυνδέεται από την gh πριν αυτή φτάσει στην επιφάνεια.[13] Μετά την πρόσδεση, κατάλοιπα 6-φωσφορικής μαννόζης (mannose 6- phosphate / Man-6-P) που βρίσκονται στις αλυσίδες ολιγοσακχαριτών των ιικών γλυκοπρωτεϊνών αλληλεπιδρούν με τους υποδοχείς Man-6-P στην επιφάνεια του κυττάρου και με αυτόν τον τρόπο αρχίζει η εισχώρηση του ιού. 14

15 Η σύντηξη των μεμβρανών του ιού και του κυττάρου απελευθερώνει τις πρωτεΐνες του ιικού περικαλύμματος στο κυτταρόπλασμα του ξενιστή, οι οποίες μετακινούνται προς τον πυρήνα. Στη συνέχεια, το γυμνό ιικό νουκλεοκαψίδιο συντήκεται με την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη και με αυτόν τον τρόπο απελευθερώνεται το ιικό DNA εντός του πυρήνα, όπου και κυκλοποιείται.[6] α) Πρόσδεση Θειική Ηπαράνη Ιοσωμάτιο VZV Γλυκοπρωτεΐνη β) Σύντηξη Γλυκοπρωτεΐνη Κυτταρική επιφάνεια Man-6-P υποδοχέας γ) Είσοδος στο κύτταρο δ) Είσοδος στον πυρήνα Πρωτεϊνες περικαλύμματος Νουκλεοκαψίδιο Ιικό DNA Πυρηνικός Φάκελος Εικόνα 6. Είσοδος του ιού VZV στο κύτταρο στόχο. α) Ο ιός VZV προσδένεται στην κυτταρική επιφάνεια μέσω των αλληλεπιδράσεων των ιικών γλυκοπρωτεϊνών gb, gh και gi με τις αλυσίδες θειικής ηπαράνης. β) Τα κατάλοιπα 6-φωσφορικής μαννόζης οξέος των ιικών γλυκοπρωτεϊνών συνδέονται με τους αντίστοιχους υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια. γ) Η σύντηξη των μεμβρανών οδηγεί στην είσοδο των πρωτεϊνών του περικαλύμματος στο κύτταρο. δ) Το ιικό DNA εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου όπου και κυκλοποιείται.[6] A.5. Ανοσοαπόκριση στον ιό HSV-1 A.5.1. Χυμική ανοσία Η πρωταρχική μόλυνση από τον ιό HSV-1 επάγει την παραγωγή IgG, IgM και IgA αντισωμάτων [14, 15] που αναγνωρίζουν αρκετές κατηγορίες ιικών πρωτεϊνών και περιλαμβάνουν γλυκοπρωτεΐνες, ρυθμιστικές και δομικές πρωτεΐνες και ιικά ένζυμα. Τα αντισώματα ενάντια στις πρωτεΐνες του ιού μπορούν να τον εξουδετερώσουν με ή χωρίς τη συμμετοχή του συμπληρώματος. Τα αντισώματα ενάντια στην γλυκοπρωτεΐνη gc εξουδετερώνουν τον ιό παρουσία του 15

16 συμπληρώματος,[14, 16] ενώ τα αντισώματα ενάντια στις γλυκοπρωτεΐνες gb και gd έχουν δράση ενάντια στον ιό και τον εξουδετερώνουν χωρίς την συμμετοχή του συμπληρώματος, γεγονός που ισχύει και για τις αντίστοιχες γλυκοπρωτεΐνες των άλλων ερπητοϊών.[17, 18] Επίσης, αντισώματα παράγονται και ενάντια στις γλυκοπρωτεΐνες gg[19], ge[20] και gh.[21] Τα μόρια αυτά συνεργάζονται και με άλλες ομάδες κυττάρων όπως τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα ΝΚ (Natural Killers) κύτταρα για την πρόκληση κυτταροτοξικότητας και την εξουδετέρωση του ιού.[21] Η πρωτεΐνη με τη μεγαλύτερη αντιγονική δράση είναι η gb, ενώ ακολουθούν η gd και gg. Τα αντισώματα ενάντια σε αυτές τις γλυκοπρωτεΐνες εμφανίζονται αρκετά νωρίς, συνήθως 4 ημέρες μετά τη μόλυνση, έχουν υψηλό τίτλο και διατηρούνται για αρκετά χρόνια. A.5.2. Κυτταρική ανοσία Η κυτταρική ανοσία παίζει σημαντικό ρόλο στην άμυνα εναντίον του ιού HSV-1.[22] Πειράματα σε ποντίκια έδειξαν ότι Τ κύτταρα του ανοσοποιητικού καθυστερημένου τύπου υπερευαισθησίας (DTH) και κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (CTL) εξουδετερώνουν τον ιό και προστατεύουν από την πρωταρχική μόλυνση.[23, 24] Διαφορετικές υποομάδες Τ κυττάρων φαίνεται να εμποδίζουν την εξάπλωση του ιού σε διαφορετικούς ιστούς. Τα CD4 + Τ κύτταρα ενεργούν ως τα πρωταρχικά αντιικά Τ κύτταρα στην οξεία μόλυνση του δέρματος,[25] ενώ τα CTL φαίνεται να μεσολαβούν στη μακροπρόθεσμη μνήμη της μόλυνσης [26] και στον έλεγχο της εξάπλωσης του ιού στο νευρικό σύστημα.[25] Τα προστατευτικά Τ κύτταρα φαίνεται ότι ενεργοποιούνται από διάφορες ιικές γλυκοπρωτεΐνες (gb, gc, gd, ge, gh). Η gb και η gd θεωρείται ότι επάγουν ειδικά τα CD4 + προστατευτικά Τ κύτταρα.[21] Τα κύτταρα αυτά με τη σειρά τους, παράγουν τις αντιμικροβιακές ιντερλευκίνες-2 και 3.[27] Άλλοι στόχοι των CD4 + προστατευτικών Τ κυττάρων είναι οι πρωτεΐνες του περικαλύμματος (VP16, VP22) και του νουκλεοκαψιδίου (VP5) που αναγνωρίζονται ως μη δομικές πρωτεΐνες και εντοπίζονται στα μολυσμένα κύτταρα.[21] Επίσης, κυτταροτοξικά κύτταρα (CTL) έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιούνται και από ρυθμιστικές πρωτεΐνες του HSV-1 όπως η ICP27.[28] 16

17 A.6. Ανοσοαπόκριση στον ιό VZV A.6.1. Χυμική ανοσία Κατά την εκδήλωση της ανεμοβλογιάς έχουν προσδιοριστεί αντισώματα τα οποία περιλαμβάνουν ανοσοσφαιρίνες IgG, IgM και IgA.[6] Τα αντισώματα αναγνωρίζουν μία ποικιλία ιικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών του νουκλεοκαψιδίου καθώς και των γλυκοπρωτεϊνών. Για την εξουδετέρωση του ιού, κάποιες φορές είναι αναγκαία η συμμετοχή του συμπληρώματος, όπως για τα αντισώματα που αναγνωρίζουν τις γλυκοπρωτεΐνες ge και gi, ενώ σε άλλες περιπτώσεις η συμμετοχή αυτή δεν απαιτείται, όπως για τα αντισώματα που αναγνωρίζουν τις γλυκοπρωτεΐνες gb, gh και gc.[5] Τα αντισώματα αυτά φαίνεται να εξουδετερώνουν τον ιό εμποδίζοντας το αρχικό στάδιο της εισόδου στα κύτταρα, αν δοθούν με παθητική χορήγηση.[6] Η παραγωγή αντισωμάτων είναι συνήθως ανιχνεύσιμη εντός τριών ημερών από την έναρξη των συμπτωμάτων σε υγιή άτομα. Ωστόσο ο ρόλος τους στον περιορισμό της αρχικής μόλυνσης φαίνεται να είναι μικρής σημασίας. Ακόμη κι αν χορηγηθούν σε υγιή άτομα δεν συνεπάγεται ότι τα συμπτώματα θα είναι ηπιότερα.[5] Ο τίτλος των IgM αντισωμάτων ελαττώνεται σε λίγους μήνες, ενώ τα IgG διατηρούνται για αρκετά χρόνια μετά την πρωταρχική μόλυνση. Αυτά τα αντισώματα βοηθούν στην προστασία ενάντια στην επανενεργοποίηση του ιού εξουδετερώνοντας κάθε μολυσματικό VZV ιό στην περιοχή της βλεννογόνου. Τέτοιο ρόλο έχουν κυρίως τα αντισώματα ενάντια στις γλυκοπρωτεΐνες του ιού.[5] Η γλυκοπρωτεΐνη ge είναι η πιο άφθονη και ταυτόχρονα η πιο ανοσογενής από τις υπόλοιπες γλυκοπρωτεΐνες. Μάλιστα, στη δομή της περιέχεται μία περιοχή πρόσδεσης Fc για τις ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες IgG, που οδηγεί στην προστασία των μολυσμένων κυττάρων από αυτά τα αντισώματα. Επίσης έχει αποδειχθεί ότι επάγει την ανοσία μέσω αντισωμάτων αλλά και μέσω Τ βοηθητικών κυττάρων και περιέχει επιτόπους που αναγνωρίζονται από τα CD4 + και CD8 + κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα.[29] Ακολούθως της ge, οι γλυκοπρωτεΐνες με τη μεγαλύτερη αντιγονικότητα για τον VZV είναι οι gb και gh.[30] 17

18 A.6.2. Κυτταρική ανοσία Κατά την πρωταρχική μόλυνση με VZV, ενεργοποιούνται τόσο τα CD8 + Τ κύτταρα όσο και τα CD4 + Τ κύτταρα. Τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) ενάντια στον ιό VZV φαίνεται να ενεργοποιούνται από τα CD8 + Τ κύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν ιικά πεπτίδια συνδεδεμένα με μόρια του κύριου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξεως Ι (MHC I). Ωστόσο, υπάρχουν ειδικά CTL που ενεργοποιούνται από τα CD4 + Τ κύτταρα, τα οποία αναγνωρίζουν ιικά πεπτίδια συνδεδεμένα με μόρια του κύριου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξεως ΙΙ (MHC ΙI). Τα τελευταία, αναγνωρίζουν συγκεκριμένες ιικές πρωτεΐνες, όπως τις γλυκοπρωτεΐνες ge, gh, gb και gi, τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες IE62 και IE63 και τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα ανοικτά αναγνωστικά πλαίσια 4, 10 και 29 του ιού. Η αναγνώριση αυτών των πρωτεϊνών από τα Τ λεμφοκύτταρα είναι επαρκής για να σταματήσει η πρωταρχική μόλυνση. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός της διατήρησης κυττάρων μνήμης του ανοσοποιητικού για χρόνια σε αναλογία 1 για κάθε μονοπύρηνα κύτταρα. Τα ευαισθητοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα παράγουν κυτοκίνες, όπως ιντερλευκίνη-2 και ιντερφερόνη-γ, που ενισχύουν τη χημειοταξεία των ειδικών για τον ιό Τ λεμφοκυττάρων. Τελικά, οι αποκρίσεις των Τ λεμφοκυττάρων οδηγούν στην εξάλειψη των μολυσμένων μονοκυττάρων του αίματος και με αυτόν τον τρόπο σταματά η εξάπλωση του ιού στην επιδερμίδα.[5] Εάν ενεργοποιηθεί η κυτταρική ανοσία κατά τη διάρκεια των πρώτων σταδίων της νόσου, τότε η ασθένεια χαρακτηρίζεται από ηπιότερα συμπτώματα. Καθυστέρηση της έναρξης της κυτταρικής ανοσίας, κυρίως σε άτομα με ανοσοκαταστολή, οδηγεί συνήθως σε σοβαρότερες μορφές ασθένειας συμπεριλαμβανομένης της εξάπλωσης στα σπλάχνα,[6] ενώ η μειωμένη κυτταρική ανοσία ενάντια στον VZV φαίνεται να είναι ένας από τους λόγους της εμφάνισης έρπητα ζωστήρα.[5] Τα άτομα που εμφανίζουν έρπητα ζωστήρα παρουσιάζουν μια σημαντική αύξηση των ειδικών αποκρίσεων από Τ λεμφοκύτταρα (CD4 + και CD8 + ), καθώς και μία σημαντική αύξηση των ειδικών IgG και IgM αντισωμάτων.[6] Ο αριθμός των λεμφοκυττάρων αυτών στην κυκλοφορία του αίματος που αναγνωρίζουν πρωτεΐνες του ιού αυξάνει άμεσα, ως αποτέλεσμα της επανέκθεσης στα ιικά αντιγόνα. Η 18

19 ενισχυμένη κυτταρική ανοσία για τον έρπητα ζωστήρα για παρατεταμένο χρονικό διάστημα εξηγεί γιατί ο έρπης ζωστήρ εμφανίζεται πολύ σπάνια για δεύτερη φορά.[5] Α.7. Αντιικά φάρμακα. Τα αντιικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται τοπικά ενάντια στον επιχείλιο έρπητα είναι κυρίως σε μορφές γέλης (πενκικλοβίρη, ντοκοσανόλη) και καταπολεμούν τα συμπτώματα της ασθένειας, αλλά δε μπορούν να απομακρύνουν τον ιό από τον οργανισμό.[4] Ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται τόσο στον επιχείλιο έρπητα όσο και στην ανεμοβλογιά είναι η ακυκλοβίρη. Η χορήγηση γίνεται από του στόματος και στην περίπτωση της ανεμοβλογιάς η δόση είναι δεκαπλάσια της αντίστοιχης για τον επιχείλιο έρπητα.[4, 5] Η ακυκλοβίρη αναστέλλει την δράση της ιικής DNA πολυμεράσης και κατ επέκταση τον πολλαπλασιασμό του ιού. Άλλα φάρμακα που χρησιμοποιούνται κατά της ανεμοβλογιάς είναι η φαμκυκλοβίρη, η βαλακυκλοβίρη και η φοσκαρνέτη.[6] Όπως συμβαίνει με όλους τους ερπητοϊούς, η αντιική θεραπεία δεν εξουδετερώνει τον ιό που μπορεί να επανενεργοποιηθεί μετά το πέρας της θεραπείας.[5] Το VZIG είναι σκεύασμα που περιέχει υψηλό τίτλο αντισωμάτων έναντι στον ιό VZV και χρησιμοποιείται σε ομάδες υψηλού κινδύνου, οι οποίες περιλαμβάνουν παιδιά με ανοσοκαταστολή και εγκυμονούσες γυναίκες που ήρθαν σε επαφή με ασθενή με συμπτώματα ανεμοβλογιάς η έρπητα ζωστήρα. Χορηγείται εντός 48 με 96 ωρών από τη στιγμή της επαφής. Η χορήγησή του δεν αποκλείει την επανενεργοποίηση του ιού και αν αυτή γίνει μετά την εμφάνιση των συμπτωμάτων του έρπητα ζωστήρα δεν έχει καμιά επίδραση στην κλινική εικόνα του ασθενούς. Λόγω του υψηλού κόστους, συνήθως, προτιμάται η χορήγηση ακυκλοβίρης που είναι σχετικά φθηνό φάρμακο.[5] Α.8. Εμβόλια κατά του HSV-1 Στο παρελθόν έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για τη δημιουργία εμβολίου έναντι του ιού HSV και κυρίως του HSV-2. Τα προβλήματα που υπήρχαν ήταν 19

20 πολλά, όπως: α) η λανθάνουσα φάση που εγκαθιδρύει ο ιός στους νευρώνες και τον καθιστά ανοσολογικά αδρανή, β) οι λειτουργίες του ίδιου του ιού που τον βοηθούν να καθυστερεί ή να διαφεύγει την ανοσοποίηση, όπως το σύμπλεγμα των γλυκοπρωτεϊνών ge/gi που αδρανοποιεί τα IgG αντισώματα, γ) η μη εύρεση του καλύτερου πρωτεϊνικού στόχου για την ανοσοποίηση, δ) η μη αναγνώριση των πιο σημαντικών ανοσοποιητικών μηχανισμών και οι τρόποι ενεργοποίησής τους, ε) η μη εδραίωση ενός τρόπου μεταφοράς των υποψηφίων εμβολίων στον οργανισμό και στ) η απουσία ικανοποιητικών ζωικών μοντέλων.[31] Παρόλα αυτά, έχουν γίνει προσπάθειες και δοκιμές για την ανάπτυξη εμβολίων κατά του HSV-1. Μία από αυτές τις δοκιμές αφορούσε στην χορήγηση ολόκληρου του ιού, ο οποίος κατέστη ανενεργός με τη χρήση θερμότητας. Τα αποτελέσματα αυτής της δοκιμής βρίσκονται στο στάδιο της ανάλυσης.[31, 32]. Άλλοι τρόποι απενεργοποίησης του ιού HSV-1 είναι μέσω κατεργασίας με φαινόλη ενός μολυσμένου ζωικού ιστού και η κατεργασία με υπεριώδη ακτινοβολία (UV light) μίας μολυσμένης κυτταροκαλλιέργειας.[21] Η προσπάθεια χορήγησης γλυκοπρωτεϊνών αποσπώμενων, με τη χρήση απορρυπαντικών, από τις άλλες ιικές πρωτεΐνες δεν ευδοκίμησε, αφού δεν επέφερε προστασία στην πρωταρχική μόλυνση, πιθανόν λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης των γλυκοπρωτεϊνών.[31] Οι προσπάθειες για τη δημιουργία εμβολίων με τη χρήση εξασθενημένων ιών, οι οποίοι δημιουργήθηκαν με εισαγωγή μεταλλάξεων ή με διαγραφή των μολυσματικών γονιδίων, δεν στέφθηκε με επιτυχία λόγω του κινδύνου ανασυνδυασμού των ιών αυτών με ιούς αγρίου τύπου μέσα στον οργανισμό αλλά και λόγω αστάθειας των σκευασμάτων. Επίσης, η ανοσολογική απόκριση που προκαλούσαν τα εμβόλια αυτού του τύπου ήταν ελάχιστη.[21, 31, 32] Μία άλλη προσέγγιση είναι η χορήγηση μεμονωμένων των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών gb ή gd, (GlaxoSmithKline χορήγηση μόνο της gd) ή σε συνδυασμό (Chiron).[31] Το τελευταίο σκεύασμα ήταν μη αποτελεσματικό στην παραγωγή ανοσοαπόκρισης σε ινδικά χοιρίδια και η προστασία που παρείχε ήταν χρονικά μικρότερη από 6 μήνες στους ασθενείς, ενώ για το πρώτο σκεύασμα οι δοκιμές συνεχίζονται.[32] Ακόμη μία προσέγγιση είναι τα εμβόλια που χρησιμοποιούν πεπτίδιαεπιτόπους που αναγνωρίζονται από ειδικά Τ και Β λεμφοκύτταρα. Μάλιστα, ένα πεπτίδιο που εξετάστηκε αφορούσε την gb γλυκοπρωτεΐνη και το αν μπορεί να 20

21 ενεργοποιήσει υψηλά επίπεδα CD8 + T λεμφοκυττάρων. Και αυτά τα εμβόλια βρίσκονται στο επίπεδο των κλινικών δοκιμών.[21, 31] Τελευταία, γίνεται προσπάθεια για τη χρήση ιών ή πλασμιδίων που περιέχουν γονίδια αντιγονικών πρωτεϊνών (κυρίως γλυκοπρωτεϊνών gb και gd), τα οποία θα μπορούσαν να τα εκφράσουν τις πρωτεϊνες αυτές εντός του οργανισμού και να προκαλέσουν χυμική και κυτταρική ανοσία. Μάλιστα, οι φορείς αυτοί συγχορηγούνται με άλλους που εκφράζουν χυμοκίνες όπως ιντερλευκίνη-12, ιντερλευκίνη-18 και ιντερφερόνη-γ. Η συγκεκριμένη αυτή προσέγγιση, του γονιδιακού εμβολιασμού, είναι ελπιδοφόρος και η αξία της θα εκτιμηθεί στο μέλλον.[21, 31, 33] Α.9. Εμβόλια κατά του VZV Το κύριο εμβόλιο που χρησιμοποιείται κατά του VZV αποτελείται από το ζωντανό εξασθενημένο στέλεχος Oka του ιού. Το εμβόλιο αρχικά παράχθηκε από την απομόνωση του αγρίου τύπου ιού στην Ιαπωνία, το Η απομόνωση αυτή έγινε από ένα κυστίδιο αγοριού με ανεμοβλογιά, που ονομαζόταν Oka. Η εξασθένηση του ιού έγινε από τον Takahashi [34] χρησιμοποιώντας ινοβλάστες εμβρύων ινδικών χοιριδίων και κύτταρα WI 38. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Takahashi και το στέλεχος Oka, οι εταιρίες Merck και GlaxoSmithKline κυκλοφόρησαν τα εμβόλια VARIVAX και VARILRIX το 1995 και 1999, αντίστοιχα. Τα εμβόλια αυτά ουσιαστικά περιέχουν ένα μίγμα τουλάχιστον οκτώ διαφορετικών στελεχών του ιού,[35] αφού η αλληλουχία του DNA εμφανίζει μεταλλάξεις σε βάσεις σε 42 γενετικούς τόπους σε σχέση με το πατρικό στέλεχος Oka, 11 γενετικούς τόπους με μεταλλάξεις προσθήκης νουκλεοτιδίου και 15 γενετικούς τόπους από τους 31 εναπομείναντες με αλλαγές αμινοξέων.[36] Οκτώ από τις αμινοξικές αλλαγές στο εμβόλιο έχουν γίνει στο γονίδιο ORF62, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ΙΕ62 και πιστεύεται ότι αυτό είναι ο βασικός λόγος της εξασθένησης του στελέχους του εμβολίου.[37] Κατά τη χορήγηση του εξασθενημένου ιού δεν εμφανίστηκε κανένα κλινικό σύμπτωμα, ακόμα και όταν η δόση περιείχε πάνω από 9000 PFUs μολυσματικού ιού.[38] Η προστασία που παρείχε το εμβόλιο ενάντια στην έκθεση στον ιό υπολογίστηκε πάνω από 95%.[39] Επίσης, τα αντισώματα IgG φάνηκαν να 21

22 διατηρούνται ακόμη και ένα χρόνο μετά τη χορήγηση,[40] ενώ ενεργοποιούνται και τα Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν αντιγόνα του VZV και επάγεται η παραγωγή ιντερφερόνης-γ από τα μονοπύρηνα του αίματος που έχουν επωαστεί με τον ιό.[41] Αυτά τα Τ λεμφοκύτταρα παραμένουν στην κυκλοφορία για 2 με 6 εβδομάδες μετά τη χορήγηση, σχεδόν στο 100% των παιδιών που χορηγήθηκε το εμβόλιο.[42] Η ανοσοποίηση με το εμβόλιο επάγει επίσης τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία καταστρέφουν κύτταρα που εκφράζουν ιικές πρωτεΐνες.[42] Η αποτελεσματική επαγωγή και διατήρηση λεμφοκυττάρων μνήμης είναι άκρως σημαντική, αφού η κυτταρική ανοσία είναι θεμελιώδης για την ανοσοαπόκριση στην φυσική μόλυνση από τον ιό. Πράγματι, έχει διαπιστωθεί ότι επάγονται Τ λεμφοκύτταρα μνήμης που πολλαπλασιάζονται και παράγουν λεμφοκίνες κατά τον ερεθισμό με ιικές γλυκοπρωτεΐνες και μάλιστα οι ανοσοαποκρίσεις είναι συγκρίσιμες με αυτές που προκαλούνται κατά την ανοσοποίηση με φυσικό τρόπο.[42] Σε κάποια άτομα που χορηγήθηκε το εμβόλιο παρουσιάστηκε νόσος ελαφριάς μορφής μετά από έκθεση στον ιό.[43] Γενικά, οι ενήλικες αντιδρούν λιγότερο αποτελεσματικά από τα παιδιά στο εμβόλιο και απαιτείται επανάληψη της δόσης μετά από 4 εβδομάδες.[44] Ωστόσο, ο αριθμός των ειδικών τους Τ λεμφοκυττάρων αυξάνει από 1 ανά μονοπύρηνα σε 1 ανά 40000, σε ηλικίες άνω των 55 ετών, που ισοδυναμεί με τον αριθμό των ειδικών Τ λεμφοκυττάρων στις μικρότερες ηλικίες. Επιπρόσθετα, έχει κυκλοφορήσει ήδη (2006) το εμβόλιο ZOSTAVAX από την εταιρία Merck, το οποίο χορηγείται αποκλειστικά σε ενήλικες και χρησιμοποιεί επίσης το στέλεχος Oka του ιού VZV.[45] Τα σημαντικότερα προβλήματα όσον αφορά στη χρήση των συγκεκριμένων εμβολίων είναι: α) η επανενεργοποίηση του ιού στο μέλλον και η εμφάνιση έρπητα ζωστήρα, αν και μελέτες δείχνουν ότι κάτι τέτοιο είναι δύσκολο να συμβεί,[46] β) οι αμφιβολίες για τη μακροπρόθεσμη δράση τους, γ) η μη χορήγησή τους σε παιδιά κάτω των 6 μηνών, λόγω της ύπαρξης μητρικών αντισωμάτων και δ) το κόστος τους.[29] 22

23 Α.10. Χαρακτηριστικά των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd του ιού HSV-1 και των γλυκοπρωτεϊνών ge (ORF68) και gl (ORF60) του ιού VZV Τμήματα των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd του ιού HSV-1, καθώς και των γλυκοπρωτεϊνών ge (ORF68) και gl (ORF60) του ιού VZV επιλέχθηκαν στην παρούσα εργασία να εκφραστούν σε βακτήρια E. coli, να καθαριστούν και λόγω της αντιγονικότητάς τους να είναι τα βασικά συστατικά ενός πρότυπου ορολογικού ελέγχου, ο οποίος ήταν και ο απώτερος σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Παρακάτω παρατίθενται τα επιμέρους χαρακτηριστικά (δομή, αντιγονικότητα, ρόλος στην εξάπλωση του ιού) για κάθε μία από τις προαναφερθείσες πρωτεΐνες. Α Γλυκοπρωτεΐνη gb του ιού HSV-1 Η γλυκοπρωτεΐνη gb είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη του ιικού φακέλου, απαραίτητη για την είσοδο του ιού στα κύτταρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η gb, ειδικότερα, επάγει τη σύντηξη του ιικού φακέλου με την κυτταρική μεμβράνη μέσω της σύνδεσής της με τις αλυσίδες της θειικής ηπαράνης των πρωτεογλυκανών της επιφάνειας του κυττάρου. Επίσης, πιθανολογείται ότι παίρνει μέρος στην εξάπλωση του ιού από κύτταρο σε κύτταρο μέσω της σύντηξης των μεμβρανών ενός μολυσμένου με ένα μη μολυσμένο κύτταρο.[47] Η πρωτεΐνη gb είναι το προϊόν του γονιδίου UL27,[48] αποτελείται από 904 αμινοξέα και στη μη γλυκοσυλιωμένη της μορφή έχει μέγεθος Da. Το μόριό της περιέχει 6 θέσεις Ν-γλυκοσυλίωσης, μετά την οποία το τελικό μέγεθος του μορίου φτάνει τα Da.[16] Η ώριμη μορφή της συναντάται στα ιοσωμάτια και στις μεμβράνες μολυσμένων κυττάρων ως ολιγομερές (συνήθως διμερές, σταθερό σε επεξεργασία με απορρυπαντικά και θερμότητα) που συγκροτείται από 5 δισουλφιδικούς δεσμούς (-S-S-) μεταξύ 10 κυστεϊνών.[49] Το αμινο-τελικό της άκρο περιέχει μία σηματοδοτική αλληλουχία 30 αμινοξικών καταλοίπων, η οποία και αποκόπτεται κατά τη διαδικασία της ωρίμανσης. Τα αμινοξέα αποτελούν μία υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή. Το καρβόξυ-τελικό άκρο της (αμινοξέα ) βρίσκεται εντός του κυτταροπλάσματος και φαίνεται να συμμετέχει στη σύντηξη των μεμβρανών. Το υπόλοιπο τμήμα (αμινοξέα ) εντοπίζεται εξωκυττάρια και 23

24 περιέχει επιτόπους που αναγνωρίζονται από αντισώματα εναντίον του ιού.[48] Έχει υπολογιστεί ότι σε κάθε ιοσωμάτιο, με βάση μελέτες με το στέλεχος KOS, υπάρχουν 3200 μόρια της συγκεκριμένης πρωτεΐνης.[49] Η gb αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα ανοσοποίησης και προκαλεί τόσο χυμική όσο και κυτταρική ανοσία. Ανοσοποίηση ανθρώπων και ζώων με καθαρή gb οδηγεί στην παραγωγή αντισωμάτων ενάντια του ιού, ενώ ανασυνδυασμένες gb πρωτεΐνες δοκιμάζονται ως εμβόλια.[50] Επίσης, στην κυτταρική ανοσία η gb φαίνεται να επάγει τα CD4 + προστατευτικά Τ κύτταρα, την παραγωγή κυτοκινών, ενώ περιέχει επιτόπους που είναι στόχοι κυτταροτοξικής απόκρισης.[27, 48] Έχει παρατηρηθεί ότι μολύνσεις από τον ιό προκαλούν την παραγωγή αντισωμάτων τύπου IgG εναντίον της συγκεκριμένης πρωτεΐνης.[51] Τα αντισώματα αυτά, εμφανίζονται σχετικά νωρίς στην οξεία μορφή της νόσου, έχουν υψηλό τίτλο και διατηρούνται για χρόνια.[52] Ειδικότερα, έχουν εντοπιστεί ως κύριες αντιγονικές περιοχές της πρωτεΐνης αυτές που αποτελούνται από τα αμινοξέα , , και [18] Είναι αξιοσημείωτο πως υπάρχουν αντισώματα εναντίον της gb του HSV-1 που αναγνωρίζουν και την gb του HSV-2 και το αντίστροφο, γεγονός που οφείλεται στη μεγάλη ομολογία των δύο πρωτεϊνών (86% σε επίπεδο αμινοξέων).[53] Συμπερασματικά, η γλυκοπρωτεΐνη gb αποτελεί έναν αντιγονικό παράγοντα για τον οποίο θα υπάρχουν, πιθανόν, αντισώματα σε άτομα που έχουν προσβληθεί από τον ιό HSV-1 ακόμη και αν αυτό συνέβη πριν από μεγάλο χρονικό διάστημα. Α Γλυκοπρωτεΐνη gd του ιού HSV-1 Η γλυκοπρωτεΐνη gd του HSV-1 είναι προϊόν του γονιδίου US5 και έχει μέγεθος 394 αμινοξέα και μοριακό βάρος Da στη μη γλυκοσυλιωμένη μορφή της. Στο μόριο της υπάρχουν 3 περιοχές Ν- γλυκοσυλίωσης καθώς και 3 περιοχές Ο- γλυκοσυλίωσης. Μετά τη γλυκοσυλίωση το μοριακό βάρος της ανέρχεται στα Da.[54] Τα πρώτα 25 αμινοξέα αποτελούν το σηματοδοτικό πεπτίδιο που αποκόπτεται από την πρωτεΐνη κατά την ωρίμανσή της από μία πεπτιδάση. Το αμινοτελικό τμήμα της πρωτεΐνης (αμινοξέα ) εντοπίζεται στο εξωκυττάριο μέρος της επιφάνειας των μολυσμένων κυττάρων, ενώ υπάρχει μία διαμεμβρανική περιοχή (αμινοξέα ) και μία κυτταροπλασματική ουρά (αμινοξέα ).[55] Όπως και στην περίπτωση της gb, η πρωτεΐνη gd σχηματίζει ολιγομερή 24

25 (διμερή και τριμερή), ενώ έχει υπολογιστεί ότι σε κάθε ιοσωμάτιο, με βάση μελέτες στο στέλεχος KOS, υπάρχουν μόρια της συγκεκριμένης πρωτεΐνης και ο μοριακός λόγος gb/gd είναι 1:11.[49] Η ομολογία με την αντίστοιχη πρωτεΐνη του HSV-2 είναι 82% σε επίπεδο αμινοξέων.[55] Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η γλυκοπρωτεΐνη gd αποτελεί βασικό παράγοντα για την είσοδο του ιού HSV-1 στο κύτταρο ξενιστή. Η πρωτεΐνη αυτή αλληλεπιδρά με τους υποδοχείς εισόδου, δηλαδή τον HVEM (Herpes Virus Entry Mediator, καθοριστής της εισόδου του έρπητα), τις νεκτίνες-1 και 2 και ειδικές περιοχές της θειϊκής ηπαράνης που δημιουργούνται με συγκεκριμένες 3-Οθειοτρανσφεράσες. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί στη σύντηξη του ιικού φακέλου και της κυτταρικής μεμβράνης και στην είσοδο του ιού εντός του κυττάρου. Στη διαδικασία αυτή συμμετέχουν όπως προαναφέρθηκε και άλλες γλυκοπρωτεΐνες.[3] Επίσης, η γλυκοπρωτεΐνη gd συμμετέχει στην εξάπλωση του ιού από κύτταρο σε κύτταρο, κυρίως μέσω της σύνδεσή της με τις νεκτίνες.[56] Η gd αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα ανοσοποίησης που επάγει τόσο την χυμική όσο και την κυτταρική ανοσία. Tα αντισώματα ενάντια σε αυτή την γλυκοπρωτεΐνη έχουν δράση ενάντια στον ιό και τον εξουδετερώνουν χωρίς να απαιτείται συμμετοχή του συμπληρώματος.[17, 18] Όπως και στην περίπτωση της gb τα αντισώματα αυτά εμφανίζονται σχετικά νωρίς στην οξεία μορφή της νόσου, έχουν υψηλό τίτλο και διατηρούνται για χρόνια. Επίσης, έχουν παρασκευαστεί και μονοκλωνικά αντισώματα ενάντια στην gd χορήγηση των οποίων αναστέλλει την εξάπλωση του ιού λόγω παρεμπόδισης της σύνδεσης της gd με τον υποδοχέα HVEM.[17] Ενδιαφέρουσα είναι η παρατήρηση ότι μία ομάδα αντισωμάτων ενάντια σε συγκεκριμένους επίτοπους της πρωτεΐνης ανέστειλε μεν την ικανότητα του ιού να προκαλεί κυτταρική σύντηξη, αλλά όχι και την ικανότητα να προσδένεται στα κύτταρα, ενώ μία ομάδα αντισωμάτων ενάντια σε διαφορετικούς επίτοπους της gd ανέστειλαν την πρόσδεση του ιού. Αυτό το γεγονός οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η συγκεκριμένη πρωτεΐνη εμπλέκεται και στις δύο αυτές διαδικασίες.[57] Ως κύριες περιοχές αντιγονικότητας έχουν εντοπιστεί αυτές που περικλείονται από τα αμινοξέα 11-19, , , και [17] Συμπερασματικά, η γλυκοπρωτεΐνη gd αποτελεί έναν αντιγονικό παράγοντα για τον οποίο θα υπάρχουν, πιθανόν, αντισώματα σε άτομα που έχουν προσβληθεί από τον ιό HSV-1 ακόμη και αν αυτό συνέβη πριν από μεγάλο χρονικό διάστημα. 25

26 Α Γλυκοπρωτεΐνη ge (ORF68) του ιού VZV Η γλυκοπρωτεΐνη ge είναι η πιο άφθονη γλυκοπρωτεΐνη στον ιικό φάκελο του ιού VZV. Κωδικοποιείται από το γονίδιο ORF68, με τη μοριακή της μάζα να υπολογίζεται με βάση την πρωτοταγή της δομή στα Da [29] και αποτελεί μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη μεγέθους 623 αμινοξέων όπου τα αμινοτελικά 24 αμινοξέα αποτελούν ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο. Η γλυκοπρωτεΐνη αποτελείται από τρεις δομικές περιοχές: μία υδρόφοβη εξωκυτταρική 544 αμινοξέων, μία υδρόφοβη διαμεμβρανική 17 αμινοξέων και μία κυτταροπλασματική ουρά 62 αμινοξέων. Ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της ge αποκάλυψε δύο περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνες, τρεις θέσεις Ν-γλυκοσυλίωσης, μία περιοχή Ο-γλυκοσυλίωσης και μία θέση φωσφορυλίωσης σερίνης/θρεονίνης στην κυτταροπλασματική περιοχή. Το μέγεθος της ώριμης πρωτεΐνης ανέρχεται στα Da και βρίσκεται συνδεδεμένη μη ομοιοπολικά με την γλυκοπρωτεΐνη gi.[5, 29] Επίσης έχει παρατηρηθεί μια θέση φωσφορυλίωσης τυροσίνης όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται σε διμερή μορφή. Ο διμερισμός μπορεί να συμβεί στο ενδοπλασματικό δίκτυο αμέσως μετά τη σύνθεση της ge ή εντός της κυτταρικής μεμβράνης μετά τη σύνδεσή της με την gi.[58] Επιπρόσθετα, υπάρχουν αναφορές ότι η ώριμη μονομερής ge είναι φωσφορυλιωμένη μετά από μετα-μεταφραστική τροποποίησή της από την κινάση της καζεΐνης τύπου ΙΙ (casein kinase II) και ότι η gi λειτουργεί ως συμπαράγοντας στην φωσφορυλίωση.[58] Η σύνδεση της gi με την ge γίνεται πριν την έξοδο της τελευταίας στην επιφάνεια του κυττάρου[59] και είναι σημαντική για την κυτταρική κατανομή της ge, αλλά και για το λόγο ότι το παραπάνω σύμπλοκο μπορεί να λειτουργήσει ως Fc υποδοχέας των μη άνοσων IgG και να προστατέψει ένα μολυσμένο κύτταρο από τη λύση.[6] Επίσης, η ge χρησιμεύει στην εξάπλωση του ιού από κύτταρο σε κύτταρο, η οποία αποτελεί βασικό τρόπο μόλυνσης των νευρικών κυττάρων από τον VZV.[58] Εκτός του γεγονότος αυτού, η ge ενεργοποιεί την gb ως παράγοντα σύντηξης των κυττάρων οδηγώντας στη δημιουργία πολυπύρηνων κυττάρων.[6] Έχει προταθεί ότι η gb δεν μπορεί να δράσει μόνη της κατά την σύντηξη αλλά μόνο μετά από σύνδεσή της με την ge.[12] Εξάλλου, η έκφραση της ge σε Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) κυτταρικές σειρές οδήγησε στη δημιουργία επιμέρους στεγανών συνδέσμων μεταξύ των κυττάρων, δείχνοντας με αυτόν τον τρόπο την ικανότητά της να ενισχύει 26

27 την κυτταρική επαφή.[60] Η ιδιότητα αυτή οφείλεται στην εξωκυττάρια δομή της ge, η οποία μοιάζει με την Ε-καντερίνη (ειδική πρωτεΐνη προσκόλλησης) και χρησιμεύει στην σύνδεσή της με έναν συνδέτη (πιθανόν νεκτίνες) στην επιφάνεια ενός μη μολυσμένου κυττάρου.[60] Η γλυκοπρωτεΐνη ge είναι η πλέον ανοσογενής πρωτεΐνη του ιού με τη μεγαλύτερη αντιγονικότητα στις περιοχές και της πρωτοταγούς δομής. Έχει αποδειχθεί ότι επάγει την ανοσία μέσω αντισωμάτων και του συμπληρώματος αλλά και μέσω Τ βοηθητικών κυττάρων και περιέχει επιτόπους που αναγνωρίζονται από τα CD4 + και CD8 + κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα.[29] Εκτός αυτού, έχουν δημιουργηθεί μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν την ge και δεν απαιτούν τη συμμετοχή του συμπληρώματος.[30] Συμπερασματικά, η γλυκοπρωτεΐνη gε αποτελεί έναν εξαιρετικά αντιγονικό και άφθονο παράγοντα για τον οποίο θα υπάρχουν, πιθανόν, αντισώματα σε άτομα που έχουν προσβληθεί από τον ιό VZV. Α Γλυκοπρωτεΐνη gl (ORF60) του ιού VZV Η γλυκοπρωτεΐνη gl κωδικοποιείται από το γονίδιο ORF60, έχει μέγεθος 159 αμινοξέων και αρχική μοριακή μάζα Da που μετά από γλυκοσυλίωση σε μία μόνο Ν- θέση φτάνει στις Da.[29, 61] Το μέγεθός της είναι περίπου το μισό σε σύγκριση με την ομόλογη πρωτεΐνη του HSV-1, ενώ δεν περιέχει σηματοδοτικό πεπτίδιο.[61] Παρά την απουσία αμινοτελικού σηματοδοτικού πεπτιδίου, η gl περιέχει μία αλληλουχία μεταξύ των αμινοξέων 71-86, που μοιάζει με μια υδρόφοβη σηματοδοτική αμινοξική αλληλουχία η οποία στοχεύει το ενδοπλασματικό δίκτυο. Αυτή η αλληλουχία δίνει τη δυνατότητα στην gl να μετακινηθεί εντελώς ανεξάρτητα προς το ενδοπλασματικό δίκτυο.[61] Ο κύριος ρόλος της είναι αυτός της συνοδού πρωτεΐνης της γλυκοπρωτεΐνης gh. Η τελευταία εμπλέκεται στην σύντηξη του ιικού φακέλου με την κυτταρική μεμβράνη και η παρουσία της gl απαιτείται για την διεκπεραίωση της παραπάνω διαδικασίας. Ωστόσο, δεν έχει ξεκαθαριστεί αν ο δεσμός τους είναι ομοιοπολικής ή μη φύσης.[61] Το παραπάνω σύμπλοκο χρησιμεύει εκτός από την είσοδο του ιού στο κύτταρο, στην έξοδό του αλλά και στην εξάπλωσή του από κύτταρο σε κύτταρο.[30] 27

28 Το σύμπλοκο gh-gl διαμορφώνεται ως εξής: οι παραγόμενες πρόδρομες μορφές των gh και gl εντοπίζονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο όπου η pre-gh παραμένει. Η pre-gl μεταφέρεται στο σύστημα Golgi, όπου και ωριμάζει. Στη συνέχεια, η ώριμη gl εισέρχεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο με ανάδρομη μετακίνηση και συνδέεται με την pre-gh. Το ετεροδιμερές εξέρχεται του ενδοπλασματικού δικτύου και εισέρχεται στο σύστημα Golgi, όπου επιτελείται η ωρίμανση της gh. Τότε, η gh απομακρύνεται από την gl και εξέρχεται στην κυτταρική μεμβράνη στην οποία και ενσωματώνεται, ενώ η gl πιθανώς αποικοδομείται.[13] Σημαντικό ρόλο στην παραπάνω διαδικασία παίζει η αλληλουχία της gl που την στοχεύει στο ενδοπλασματικό δίκτυο αλλά και βοηθά στην ανάδρομη μετακίνηση της. Σε περίπτωση έλλειψης της gl το ρόλο της μπορεί να υποκαταστήσει η ge, αλλά ακόμη κι έτσι η gh δεν θα ωριμάσει πλήρως.[12] Δεν έχουν περιγραφεί αντιγονικές θέσεις για την γλυκοπρωτεΐνη gl αν και έχουν δημιουργηθεί αντισώματα εναντίον της στο εργαστήριό μας από τον Αναπλ. Καθηγητή κ. Χ. Παναγιωτίδη. Ωστόσο, το σύμπλοκο gh-gl είναι αντιγονικό και παράγει αντισώματα που δρουν επί του ιού χωρίς την συμμετοχή του συμπληρώματος.[62] Μάλιστα, μονοκλωνικά αντισώματα ενάντια στην gh μπορούν να αναστείλουν την είσοδο, την έξοδο και την εξάπλωση του ιού από κύτταρο σε κύτταρο.[13] Συμπερασματικά, η gl φαίνεται να είναι χαμηλής αντιγονικότητας και αναμένεται να μην υπάρχουν υψηλοί τίτλοι αντισωμάτων εναντίον της στα δείγματα που θα ελεγχθούν κατά τον πρότυπο ορολογικό έλεγχο. Α.11. Μέθοδοι για την διάγνωση του ιού HSV-1 Έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία διάφοροι τρόποι ανίχνευσης του ιού HSV-1 στον άνθρωπο. Παρακάτω θα αναφερθούν οι σημαντικότεροι εξ αυτών και θα δοθεί έμφαση στους ορολογικούς ελέγχους που είναι και το αντικείμενο της παρούσας εργασίας. Εντούτοις, σημαντική στη διάγνωση του HSV είναι η διάκριση μεταξύ της μόλυνσης από HSV-1 και HSV-2, λόγω της μεγάλης ομολογίας των δύο ιών. Για τον σκοπό αυτό, στους περισσότερους ελέγχους χρησιμοποιείται η γλυκοπρωτεΐνη gg που δεν έχει μεγάλη ομολογία ανάμεσα στους δύο τύπους. 28

29 Μία συνήθης μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του ιού είναι η απομόνωσή του και η αναγνώρισή του από κυτταρικές καλλιέργειες, όπως η Human Embriyonic Lung (HeLu), η MRC-5 και η WI 38. Ουσιαστικά, προσδιορίζεται η κυτταροπάθεια που προέρχεται από την μόλυνση των κυττάρων με τον ιό. Ο ιός προέρχεται από το υπό ανάλυση δείγμα (συνήθως εκκρίματα δέρματος, επιχείλιες περιοχές ή κακώσεις λόγω του ιού) [63] και η κυτταροπάθεια χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση συσσωματωμάτων, κυττάρων που εμφανίζουν διαφορετική διάθλαση του φωτός και την δημιουργία πολυπύρηνων κυττάρων. Μετά την απομόνωση του ιού, η αναγνώρισή του πραγματοποιείται με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (antigc, anti-gg),[64] με υβριδισμό DNA:DNA και με ανάλυση με τη χρήση ενδονουκλεασών περιορισμού.[20] Η ανίχνευση με την χρήση κυτταροκαλλιεργειών είναι ευαίσθητη και ειδική όμως είναι χρονοβόρα (απαιτείται πάνω από μία εβδομάδα για να εξαχθούν αποτελέσματα) και χρειάζεται ειδικό εξοπλισμό.[65] Το ιικό DNA μπορεί να ανιχνευθεί στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή σε λευκοκύτταρα του αίματος με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR. Ως εκκινητές σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούνται αλληλουχίες συμπληρωματικές των περιοχών της DNA πολυμεράσης του ιού ή της γλυκοπρωτεΐνης gb. Η συγκεκριμένη τεχνική πάντως χαρακτηρίζεται από αρκετά υψηλό κόστος, αν και είναι υψηλής ευαισθησίας.[20] Ως επέκταση της τεχνικής PCR χρησιμοποιείται η real time PCR με εκκινητές που αναγνωρίζουν αλληλουχίες της γλυκοπρωτεΐνης gd.[65] Η μέτρηση ειδικών αντισωμάτων, IgG κυρίως και IgM, που αναγνωρίζουν πρωτεΐνες του ιού είναι επίσης εφικτή μέσω διαφόρων ανοσολογικών μεθόδων. Η μέθοδος ELISA είναι μία από αυτές που χρησιμοποιούνται συνήθως και περιλαμβάνει τη χρήση ανασυνδυασμένων γλυκοπρωτεϊνών gg των ιών HSV-1 (gg- 1) και HSV-2 (gg-2) ως αντιγόνων.[20, 66] Επίσης χρησιμοποιείται το Immunodot Enzyme Assay (IEA), στο οποίο χρησιμοποιείται ως αντιγόνο καθαρισμένη γλυκοπρωτεΐνη gg ακινητοποιημένη σε δίσκους νιτροκυτταρίνης.[67] Η τεχνική ανοσοαποτυπώματος Western Blot είναι επίσης μία πολύ ευαίσθητη μέθοδος. Έχει την ικανότητα να ανιχνεύει αντισώματα του ορού που αναγνωρίζουν πάνω από 50 ιικές πρωτεΐνες. Χρησιμοποιείται σε ευρεία κλίμακα για την διάκριση της μόλυνσης από HSV ιούς σε τύπου 1 ή τύπου 2. Ως αντιγόνα χρησιμοποιούνται διάφορες πρωτεΐνες του ιού (gg, gd, gb) και ως πρώτο αντίσωμα ο υπό εξέταση ορός. Η γλυκοπρωτεΐνη gg-1 λόγω της μικρής ομολογίας της με την γλυκοπρωτεΐνη 29

30 gg-2 του ιού HSV-2 αν χρησιμοποιηθεί ως αντιγόνο αναγνωρίζει μόνο την μόλυνση από HSV-1, ενώ το αντίστροφο ισχύει για την gg-2.[14] Μία τεχνική επέκταση του ανοσοαποτυπώματος Western Blot είναι η δημιουργία ειδικών μοριακών ταινιών (strips), τα οποία αποτελούν ουσιαστικά τμήματα μεμβράνης νιτροκυτταρίνης που περιέχουν προσκολλημένες αντιγονικές πρωτεΐνες οι οποίες αναγνωρίζονται από τα αντισώματα του ανθρώπινου ορού. Και σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούνται κυρίως ως αντιγόνα οι γλυκοπρωτεΐνες gg- 1 και gg-2 και τα αποτελέσματα όσον αφορά στον τύπο του ιού 1 ή 2 είναι πολύ ενθαρρυντικά. Η μέθοδος αυτή αποτελεί μία γρήγορη και επαναλήψιμη τεχνική και μπορεί να εξετάσει μεγάλο αριθμό ορών. Οι ταινίες μπορούν να παραχθούν σε μία μόλις ημέρα και ο έλεγχος μπορεί να γίνει την επομένη, ενώ είναι πολύ χρήσιμες στην ανίχνευση μόλυνσης σε ασυμπτωματικά άτομα.[68] Η τελευταία μέθοδος είναι τόσο αποτελεσματική που οδήγησε στην εμπορευματοποίησή της με την ονομασία HerpeSelect1/2 Immunoblot (Εικόνα 7). Σε αυτή τη μορφή κάθε ταινία περιέχει προσκολλημένες τις γλυκοπρωτεΐνες gg-1 και gg-2, ένα κοινό αντιγόνο των ιών HSV-1 και HSV-2 καθώς και μια πρωτεΐνη μάρτυρα. Η ευαισθησία καθώς και η ειδικότητα της μεθόδου είναι ιδιαίτερα υψηλές σε σχέση με τις υπόλοιπες μεθόδους.[19, 66] 30

31 Ανθρώπινος Αντι-ορός Κοινό HSV αντιγόνο gg-1 gg-2 Εικόνα 7. Μοριακές ταινίες με τη χρήση του HerpeSelect1/2 Immunoblot. Κατά την εμφάνιση μπορεί να προκύψουν διπλά μολυσμένα άτομα (1 & 2 Pos), μολυσμένα μόνο με τον ιό HSV-1 (1 Pos) ή μόνο με τον ιό HSV-2 (2 Pos), διφορούμενα που έχουν αντισώματα ενάντια στο κοινό αντιγόνο αλλά όχι σε κάποια gg (Eqv), και μη μολυσμένα άτομα (Neg). Τα άτομα για να θεωρηθούν μολυσμένα πρέπει να εμφανίζουν ζώνη για το κοινό αντιγόνο των ιών, ενώ για να ισχύουν τα αποτελέσματα πρέπει να εμφανιστεί η ζώνη του ανθρώπινου αντι-ορού.[19, 66] Επίσης, υπάρχουν αναφορές στη βιβλιογραφία για τη δημιουργία μοριακών ταινιών που περιλαμβάνουν την αναγνώριση αντισωμάτων έναντι στην gd γλυκοπρωτεΐνη αλλά και έναντι στην gb γλυκοπρωτεΐνη με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία. Οι γλυκοπρωτεΐνες απομονώνονται σε αυτές τις περιπτώσεις από μολυσμένα κύτταρα, ηλεκτροφορούνται σε πηκτή ακρυλαμιδιίου και μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη χωρίζεται εν συνεχεία σε τμήματα πάχους 3mm. Η διαδικασία αυτή είναι σύντομη, όμως δεν υπάρχει δυνατότητα διάκρισης του τύπου της μόλυνσης, αφού οι δύο παραπάνω πρωτεΐνες παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία με τις αντίστοιχες του ιού HSV-1 (~85%).[69] Α.12. Μέθοδοι για την διάγνωση του ιού VZV Οι κλασικοί μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης του ιού VZV στηρίζονται στην ανίχνευση της παρουσίας του ίδιου του ιού, του ιικού DNA ή ιικών πρωτεϊνών σε κλινικά δείγματα (εκκρίματα δέρματος, επιχείλιες περιοχές ή κακώσεις λόγω του ιού).[63] Ο ανοσοφθορισμός ή η ανοσοανίχνευση με τη χρήση πολυκλωνικών ή μονοκλωνικών αντισωμάτων ενάντια σε αντιγόνα του ιού, επιτρέπει τη γρήγορη αναγνώριση των ιικών πρωτεϊνών σε δείγματα από επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από περιοχές της μόλυνσης.[5] 31

32 Γενικά, η διάγνωση μέσω κυτταροκαλλιεργειών φέρει αρκετά μειονεκτήματα στην περίπτωση του VZV. Καταρχήν, τα χαρακτηριστικά της κυτταροπάθειας εμφανίζονται σε ακόμη μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από αυτό που αντιστοιχεί στον ιό HSV-1, καθιστώντας τη μέθοδο εξαιρετικά χρονοβόρα. Ακόμα κι έτσι, μετά την εμφάνιση της κυτταροπάθειας απαιτείται ανίχνευση του ιού με ειδικά ως προς αυτόν αντισώματα. Ο ιός μπορεί να απομονωθεί από τα μονοπύρηνα του αίματος, το αρθρικό υγρό, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό και κυρίως τους πνεύμονες. Όπως και στην περίπτωση του HSV-1 η αναγνώριση του ιού μπορεί να γίνει με τη χρήση υβριδισμού ή αντίδρασης PCR. Ο υβριδισμός τελείται με τη χρήση βιοτυνυλιωμένων ή ραδιοεπισημασμένων νουκλεϊκών ανιχνευτών που υβριδίζονται στο ιικό DNA ή RNA ή in situ, ενώ στην αντίδραση PCR χρησιμοποιούνται εκκινητές συμπληρωματικοί των συντηρημένων περιοχών του ιικού DNA. Αυτοί οι μέθοδοι είναι πιο ευαίσθητοι από την κυτταρική καλλιέργεια, όμως δίνουν αρκετά ψευδώς-θετικά αποτελέσματα. Όταν είναι εφικτό, προτιμάται ο συνδυασμός των παραπάνω μεθόδων.[5, 7] Οι μέθοδοι που αναφέρθηκαν παραπάνω αφορούν την ενεργό μορφή της νόσου ως προϋπόθεση της ανίχνευσης του ιού ή του γενετικού του υλικού, ενώ οι ανοσολογικοί μέθοδοι, που θα αναφερθούν στη συνέχεια, δεν απαιτούν την ύπαρξη ενεργού ιού. Οι ορολογικοί μέθοδοι για την διάγνωση του VZV προσδιορίζουν την ύπαρξη αντισωμάτων IgG ή IgM ενάντια στον ιό, στον υπό εξέταση ορό. Γενικά η χρήση τους δεν προτιμάται στην οξεία φάση της ανεμοβλογιάς ή στον έρπητα ζωστήρα, γιατί σε αυτές τις περιπτώσεις απαιτείται πολύ γρήγορη διάγνωση. Η πιο σημαντική χρήση αυτών των ελέγχων κυρίως με IgG αντισώματα είναι στον προσδιορισμό της ανοσοποιητικής κατάστασης ατόμων, που το ιστορικό τους σχετικά με τον ιό VZV είναι άγνωστο ή ασαφές. Η γνώση της ευπάθειας ενός ατόμου στον ιό μπορεί να αποδειχθεί σημαντική για τη χορήγηση ή μη εμβολίου ή αντισωμάτων σε αυτό. Επίσης, μπορεί να προσδιοριστεί εάν κάποιο άτομο είναι ευπαθές και κινδυνεύει με επανενεργοποίηση του ιού σε περίπτωση ανοσοκαταστολής. Στο εμπόριο κυκλοφορούν διάφορες παραλλαγές της τεχνικής Enzyme Immunoassay (EIA) που προσδιορίζει την παρουσία ειδικών για τον ιό αντισωμάτων στο αίμα. Η τεχνική αυτή είναι πολύ ειδική με λίγα ψευδώς θετικά αποτελέσματα, αλλά στερείται ευαισθησίας.[5, 67] 32

33 Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκαν μοριακές ταινίες χρησιμοποιώντας ως αντιγόνα τμήματα των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd του ιού HSV-1 και τμήματα των γλυκοπρωτεϊνών ge (ORF68) και gl (ORF60) του ιού VZV. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, όλες οι πρωτεΐνες είναι εξαιρετικά αντιγονικές εκτός της γλυκοπρωτεΐνης gl. Τα συγκεκριμένα πρωτεϊνικά τμήματα κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν από βακτήρια E. coli, έτσι ώστε να αποτελέσουν τα αντιγόνα για τις μοριακές ταινίες. Η μέθοδος των μοριακών ταινιών, όπως αποδεικνύεται από τα παραπάνω, είναι ευαίσθητη, ειδική και χρησιμοποιείται ευρέως κυρίως στην περίπτωση του HSV-1. Επίσης, χρησιμοποιώντας ως αντιγόνα τα τμήματα των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd που εκφράστηκαν στα βακτήρια, παράχθηκαν αντισώματα εναντίον τους σε κουνέλια. Τα αντισώματα αυτά ελέγχθηκαν για την αναγνώριση των φυσικών γλυκοπρωτεϊνών του ιού. Επιπρόσθετα, ελέγχθηκε η πιθανότητα τα αντισώματα που αναγνωρίζουν την πρωτεΐνη gb να αναγνωρίζουν και την gd ή το αντίστροφο. Τα τμήματα των πρωτεϊνών που εκφράστηκαν, ελέγχθηκαν όσον αφορά στην ομολογία τους και προέκυψε ότι το τμήμα της γλυκοπρωτεΐνης gb έχει ομολογία αμινοξέων 88% με το αντίστοιχο τμήμα της gb του ιού HSV-2 και 49% ομολογία με το αντίστοιχο τμήμα της gb του VZV. Το τμήμα της gd έχει 88% ομολογία αμινοξέων με το αντίστοιχο τμήμα της gd του HSV-2, ενώ δεν υπάρχει gd στον VZV. Το τμήμα της ge δεν εμφανίζει ομολογία με άλλη γλυκοπρωτεΐνη, ενώ το τμήμα της γλυκοπρωτεΐνης gl του VZV έχει 29% ομολογία αμινοξέων με την gl του HSV-1 και 25% ομολογία αμινοξέων με την gl του HSV-2. 33

34 Β. Υλικά και Μέθοδοι Β.1. Υλικά Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τουλάχιστον αναλυτικής καθαρότητας των οίκων Fluka (Seelzer, Germany), Applichem GmbH (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Riedel-de Haen (Seelzer, Germany), Merck (Dramstadt, Germany), DUCHEFA (Haarlem, Nederland), Carlo Erba (Rodano, Italy), Genaxis Biotechnology (Kronberg/Taunus Germany), Kodak International Biotechnologies INC. (New Haven, USA), Cambrex (Rockland, USA), DIFCO (Detroit, USA), New England Biolabs (Hertfordshire, U.K), BioRad (Calif, USA), Macherey-Nagel GmbH & Co (Duren, Germany) Qiagen GmbH (Hilden, Germany) και Pharmacia Fine Chemicals (Upsala, Sweeden). Β.1.2. Ένζυμα Αντιδραστήρια Μοριακής Βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού NdeI, BamHI, ο παράγοντας Xa, οι μάρτυρες DNA, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια και οι έγχρωμοι μάρτυρες προσδιορισμού μοριακής μάζας πρωτεϊνών (Broad Range Prestain Protein Markers) που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών και για τα πειράματα ανοσοαποτυπώματος (western blot) προμηθεύτηκαν από την εταιρία New England Biolabs (Hertfordshire, U.K). Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoRI, XhoI, NotI και η Τ 4 DNA λιγάση προμηθεύτηκαν από την εταιρία Takara Shuzoco (Shiga, Japan). Για τις αντιδράσεις PCR, η Taq πολυμεράση που χρησιμοποιήθηκε (Taq 2) παρασκευάστηκε στο εργαστήριό μας από τη Δρ. Μερόπη Μάττα, ενώ η σύνθεση των εκκινητών έγινε από τον οίκο Biolegio BV (Nijmegen, Nederland). Τα αντισώματα ενάντια σε ουρές πολύ-ιστιδινών, αλλά και τα δεύτερα αντισώματα ενάντια στις ανοσοσφαιρίνες από ποντίκι, κουνέλι ή άνθρωπο με ομοιοπολικά δεσμευμένη υπεροξειδάση από αγριοράπανο που χρησιμοποιήθηκαν στα 34

35 πειράματα ανοσοαποτύπωσης (western blot) ήταν της εταιρίας Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Τα αντιβιοτικά (αμπικιλλίνη, καναμυκίνη, χλωραμφαινικόλη) που χρησιμοποιήθηκαν για τις καλλιέργειες των βακτηρίων προμηθεύτηκαν από τις εταιρίες Genaxis Biotechnology (Kronberg/Taunus Germany) και DUCHEFA (Haarlem, Nederland). Τα πλασμίδια pgb και pgd παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Δρ. Μ. Αρσενάκη, Καθηγητή του τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ. Τα πλασμίδια pxv60 και pxv68 παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Δρ. Χ. Παναγιωτίδη, Αναπλ. Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής του Α.Π.Θ. Το πλασμίδιο pzero 2.1 ήταν της Invitrogen (Groningen, Nederland) και το pet-16b της εταιρίας Novagen (Darmstadt, Germany). Β.1.3. Βιολογικά υλικά Για τον πολλαπλασιασμό των πλασμιδιακών φορέων χρησιμοποιήθηκαν E. coli TOP10, ενώ για τα πειράματα πρωτεϊνικής έκφρασης τα E. coli BL21[DE3] και E. coli Rosetta[DE3]. Το στέλεχος KOS του ιού HSV-1 χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα που περιγράφονται. Β.2. Μέθοδοι Β.2.1. Καλλιέργεια βακτηρίων Ε.coli και επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης Τα βακτήρια αναπτύσσονται σε θρεπτικό υπόστρωμα 2ΧΥΤ (1.0 % w/v εκχύλισμα ζύμης, 1.6 % w/v τρυπτόνη, 0.5 % w/v NaCl). [Όλα τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια βακτηρίων αποστειρώνονται στο αυτόκαυστο, στους 121 ο C, υπό πίεση 1 Atm, για 20 λεπτά.] Ανάλογα με το πλασμίδιο το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί για το μετασχηματισμό των βακτηριακών κυττάρων προστίθεται και το αντίστοιχο αντιβιοτικό επιλογής. Στην παρούσα εργασία τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι η αμπικιλλίνη σε τελική συγκέντρωση 100 μg/ml, η 35

36 καναμυκίνη σε τελική συγκέντρωση 50 μg/ml και η χλωραμφαινικόλη σε τελική συγκέντρωση 34 μg/ml. Τα 2ΧΥΤ-άγαρ τρυβλία παρασκευάζονται με τη προσθήκη 1,5% w/v άγαρ σε θρεπτικό υλικό 2ΧΥΤ μετά από θέρμανση του μίγματος στους 100 ο C μέχρι την πλήρη διάλυση του άγαρ. Το μίγμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να ψυχθεί στους ~50 ο C και κατόπιν γίνεται προσθήκη του κατάλληλου αντιβιοτικού επιλογής και απόχυση του μίγματος σε τρυβλία petri. Αρχικά, τα κύτταρα αναπτύσσονται σε στερεού θρεπτικού υλικού τρυβλία petri στους 37 ο C για ώρες. Στη συνέχεια μια αποικία μεταφέρεται σε 3 ml θρεπτικού υλικού 2ΧΥΤ, το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για ώρες σε ανακινούμενο επωαστήρα (Model 4580, εταιρία Forma Scientific). Ακολούθως, 1ml της παραπάνω καλλιέργειας προστίθεται σε 500 ml θρεπτικού υλικού τα οποία περιέχουν το κατάλληλο αντιβιοτικό (αραίωση 1:500). Η καλλιέργεια επωάζεται στους 37 C, μέχρις ότου η απορρόφηση στα 600 nm (ΟD 600 ) να φθάσει στην περιοχή τιμών 0.6 (Φασματοφωτόμετρο U-2000, Spectrophometer, Hitachi). Στο σημείο αυτό προστίθεται ο επαγωγέας ισοπροπυλοθειογαλακτοσίδιο (IPTG) σε τελική συγκέντρωση 0.5 mm και η καλλιέργεια επωάζεται για ακόμη 4 ώρες στους 37 C. Οι καλλιέργειες φυγοκεντρούνται στα 4000 rpm για 10 λεπτά, στους 4 C [ψυχόμενη φυγόκεντρος: Sorvall RC 5B Plus, εταιρία DUPONT]. Ακολουθεί απόχυση του υπερκείμενου θρεπτικού υλικού, το ίζημα επαναιωρείται σε 250 ml (V/2 αρχικής καλλιέργειας) PBS (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 8.1 mm Na 2 HPO 4, 1.5 mm KH 2 PO 4 ) και το αιώρημα φυγοκεντρείται στα 4000 rpm για 10 λεπτά, στους 4 C. Το υπερκείμενο αποχύνεται και το ίζημα ψύχεται στους -20 C. Β.2.2. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (mini prep) Σε 3 ml θρεπτικού υλικού 2XYT που περιέχουν το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, προστίθεται μια αποικία και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. 1.5 ml της καλλιέργειας μεταφέρονται σε μικροσωληνάριο Eppendorf και φυγοκεντρούνται στα rpm για 1 λεπτό. Μετά 36

37 από απόχυση του υπερκειμένου τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 400 μl διαλύματος STE (100 mm NaCl, 10 mm Tris ph 8.0, 1 mm EDTA ph 8.0), προστίθενται 35 μl διαλύματος λυσοζύμης (10 mg/ml) και ανακινούνται ήπια 4-6 φορές. Έπειτα από επώαση 5 λεπτών στους 37 ο C, τα αιωρήματα των κυττάρων βράζονται για 50 δευτερόλεπτα και κατόπιν τοποθετούνται στον πάγο για 5 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα rpm για 15 λεπτά, το υπερκείμενο μεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο όπου και ακολουθεί πρόσθεση 500 μl ισοπροπανόλης προκειμένου να γίνει ποσοτική κατακρήμνιση του πλασμιδιακού DNA. Το δείγμα επωάζεται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρείται για 5 λεπτά στα rpm. Μετά από αφαίρεση του υπερκειμένου, το ίζημα πλένεται δύο φορές με 500 μl 70% αιθανόλης, αφήνεται να στεγνώσει και τέλος διαλύεται σε 50 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl ph 7.4, 1 mm EDTA ph 8.0) ή Η 2 Ο. Το πλασμιδιακό DNA αφού απομονωθεί αποθηκεύεται στους -20 o C. Β Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με τη χρήση στήλης Ο καθαρισμός πλασμιδιακού DNA με τη χρήση του συστήματος NucleobondPC AX100 της εταιρίας Macherey-Nagel GmbH & Co (Duren, Germany) περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: Σε 30 ml θρεπτικού υλικού 2XYT παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού επιλογής, προστίθεται μια αποικία βακτηρίων και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 8000 rpm, στους 4 ο C για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνεται, στο ίζημα προστίθενται 8 ml διαλύματος S1 (50 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, 100 μg/ml RNase A, ph 8.0) και ακολουθεί ανάδευση. Έπειτα, προστίθενται 8 ml διαλύματος S2 (200 mm NaOH, 1% w/v SDS), το μίγμα αναδεύεται και επωάζεται για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Εν συνεχεία, προστίθενται 8 ml διαλύματος S3 (2.8 mm CH 3 COOK, ph 5.1) ανάδευση και επώαση στον πάγο για 8 λεπτά ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα rpm στους 4 ο C για 25 λεπτά. Το υπερκείμενο φιλτράρεται μέσα από διηθητικό χαρτί και προστίθεται σε στήλη ΑΧ 100 (midi), η οποία έχει προηγουμένως εξισορροπηθεί με 2.5 ml διαλύματος εξισορρόπησης Ν2 (100 mm Tris, 15% w/v αιθανόλη, 900 mm KCl, 0.15% v/v Triton X-100, με ph ρυθμισμένο με Η 3 PO 4 στα 6.3). Η στήλη 37

38 πλένεται 2 φορές με 6 ml διαλύματος Ν3 (100 mm Tris, 15% αιθανόλη, 1.15 Μ KCl, με ph που έχει ρυθμιστεί με Η 3 PO 4 στα 6.3) και το πλασμιδιακό DNA εκλούεται με τη χρήση 5 ml διαλύματος Ν5 (100 mm Tris, 15% αιθανόλη, 1 Μ KCl, με ph που έχει ρυθμιστεί με Η 3 PO 4 στα 8.5.). Το πλασμιδιακό DNA κατακρυμνίζεται με την προσθήκη 3 ml ισοπροπανόλης και μετά από επώαση στον πάγο για 8 λεπτά, το διάλυμα φυγοκεντρείται στα rpm στους 4 ο C για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα πλένεται με 2 ml διαλύματος 70% αιθανόλης, φυγοκεντρείται και ξηραίνεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τελικά το ίζημα που περιέχει το πλασμιδιακό DNA επαναιωρείται σε 30 μl H 2 O. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του πλασμιδιακού DNA γίνεται με φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό, όπως περιγράφεται παρακάτω. Β.2.3. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός του DNA ή RNA Η αρχή του φασματοφωτομετρικού προσδιορισμού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύματα, βασίζεται στο γεγονός ότι οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος, οπότε τα διαλύματα των νουκλεϊνικών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, με μέγιστο στα 260 nm. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων RNA ή DNA ακολουθείται η εξής διαδικασία: Μια μικρή ποσότητα (3-5 μl) του προς ανάλυση δείγματος αραιώνεται στα 1000 μl με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια μετράται η απορρόφηση του διαλύματος φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Με βάση το γεγονός ότι μια μονάδα οπτικής πυκνότητας (OD) στα 260 nm, αντιστοιχεί σε 40 μg/ml διαλύματος RNA και 50 μg/ml διαλύματος DNA προσδιορίζεται η ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεїνικού οξέος στο άγνωστο δείγμα. Ο βαθμός καθαρότητας των δειγμάτων εκτιμάται από τον λόγο των οπτικών πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm (OD 260 /OD 280 ), λόγω του γεγονότος ότι στα 280 nm τα διαλύματα πρωτεϊνών παρουσιάζουν τη μέγιστη απορρόφηση. Είναι παραδεκτό ότι δείγματα υψηλής καθαρότητας νουκλεїνiκών οξέων έχουν λόγο OD 260 /OD

39 Β.2.4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μια γρήγορη και σχετικά φθηνή, in vitro τεχνική για την ενίσχυση συγκεκριμένων περιοχών του DNA με πολλαπλούς κύκλους αντιγραφής. Οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε αυτόματη προγραμματιζόμενη συσκευή PTC-200 Peltier Thermal Cycler της εταιρείας M.J. Research Inc., Massachusetts, USA. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμο-ανθεκτικής DNA πολυμεράσης, η οποία χρησιμοποιεί DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος μονόκλωνου DNA (εκκινητή). Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλοι εκκινητές μεγέθους bp, οι οποίοι είναι συμπληρωματικοί της περιοχής έναρξης και λήξης της επιθυμητής ακολουθίας. Η τεχνική της PCR πραγματοποιείται σε τρία στάδια: Στην αρχή, το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 92 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες στις οποίες μπορούν να υβριδιστούν οι εκκινητές. Η θερμοκρασία στο δεύτερο στάδιο μειώνεται στους ο C. Τότε οι εκκινητές, που έχουν προστεθεί στο μίγμα αντίδρασης σε περίσσεια, μπορούν να υβριδιστούν με τις συμπληρωματικές προς αυτούς αλληλουχίες του DNA. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση (αναλογία GC βάσεων) καθώς και από το μήκος των εκκινητών, οι οποίοι καθορίζουν το Tm (melting temperature θερμοκρασία τήξης). Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία υβριδισμού δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα λόγω μη ειδικού υβριδισμού των εκκινητών. Η διαδικασία ολοκληρώνεται με την επιμήκυνση της ακολουθίας των εκκινητών από τη θερμο-ανθεκτική DNA πολυμεράση σε θερμοκρασία 72 ο C, παρουσία των τεσσάρων τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων και ιόντων Μg+2 που είναι απαραίτητα για τη δράση της πολυμεράσης. Στο στάδιο αυτό, η DNA πολυμεράση συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3 άκρο του εκκινητή, χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο τη μονόκλωνη αλυσίδα DNA και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ ομάδα. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμο-ανθεκτική, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων. Ο κύκλος 39

40 (αποδιάταξης, υβριδισμού, πολυμερισμού) επαναλαμβάνεται φορές. Η ποσότητα του προϊόντος αυξάνεται λογαριθμικά για κάθε έναν από τους επόμενους κύκλους, οπότε n κύκλοι ισοδυναμούν με 2 n-2 ενίσχυση ενός τμήματος DNA. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 C για 10 λεπτά, ώστε να διορθωθούν πιθανά λάθη της Taq πολυμεράσης. Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR απαιτούνται τα ακόλουθα συστατικά: - DNA (εκμαγείο) ng - Εκκινητής νοηματικός (πρόσθιος) 1.6 μμ - Εκκινητής αντινοηματικός (ανάστροφος) 1.6 μμ - Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 0.25 mm - Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10 x 5 μl - Πολυμεράση (Taq 2) 1 μl - MgCl 2 2 mm Ο τελικός όγκος της αντίδρασης είναι συνήθως 50 μl και προκύπτει με την πρόσθεση κατάλληλης ποσότητας αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού. Σε αυτή τη διπλωματική εργασία ενισχύθηκαν με PCR τμήματα των γονιδίων των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd του ιού του απλού έρπητα τύπου 1 (HSV-1). Οι παρακάτω εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση τμήματος του γονιδίου της γλυκοπρωτεΐνης gb του HSV-1 στον pzero A-tailed πλασμιδιακό φορέα και περιέχουν ενσωματωμένες θέσεις κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα NdeI (CATATg) και BamHI (ggatcc) αντίστοιχα. gb_n_sense: 5 -ggcatatg gacccgaaaccgaagaagaac-3 gb_nas: 5 -ggggatccg gttgtacttgaggtcggtgg-3 Οι παρακάτω εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση τμήματος του γονιδίου της γλυκοπρωτεΐνης gd του HSV-1 στον pzero A-tailed πλασμιδιακό φορέα και περιέχουν ενσωματωμένες θέσεις κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα NdeI (CATATg) και BamHI (ggatcc) αντίστοιχα. gd_sense: 5 -CCCATATgg AATATgCCTTggTggATgCC-3 gd_as: 5 -ggggatcc TATgTgCCAgTTTggTggg-3 40

41 Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις PCR ήταν οι παρακάτω: Θερμοκρασία αποδιάταξης: 94 ο C Χρόνος αποδιάταξης: 1 λεπτό Θερμοκρασία υβριδισμού: 58 ο C Χρόνος υβριδισμού: 1 λεπτό Θερμοκρασία πολυμερισμού: 72 ο C Χρόνος πολυμερισμού: 1 λεπτό Ο αριθμός των κύκλων των αντιδράσεων ήταν 30. Στις παραπάνω περιπτώσεις ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε DNA από τον HSV-1, το οποίο είναι πλούσιο σε GC και γι αυτό το λόγο χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της θερμής εκκίνησης (Hot start). Η τεχνική αυτή αυξάνει σημαντικά τόσο την απόδοση όσο και την εξειδίκευση της αντίδρασης PCR. Κατά τη θερμική εκκίνηση η Taq DNA πολυμεράση προστίθεται αφού το DNA έχει αποδιαταχθεί πριν από τον πρώτο κύκλο. Με αυτόν τον τρόπο αποφεύγεται η ασθενής δράση της Taq πολυμεράσης που εμφανίζεται ακόμη και σε θερμοκρασία δωματίου, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται μη ειδικά προϊόντα καθώς οι εκκινητές υβριδίζονται σε περιοχές χαμηλής συμπληρωματικότητας και τα μη ειδικά αυτά προϊόντα ενισχύονται στη συνέχεια κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Ωστόσο, το παραπάνω φαινόμενο αποφεύγεται με την προσθήκη της Taq DNA πολυμεράσης 5 λεπτά μετά την πρώτη θέρμανση των αντιδρώντων στους 94 ο C. Β.2.5. Πέψη του DNA με ένζυμα περιορισμού Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι βακτηριακά ένζυμα, τα οποία πέπτουν δίκλωνα μόρια DNA σε συγκεκριμένες ακολουθίες τους, που καλούνται θέσεις αναγνώρισης-πέψης. Ως 1 μονάδα (1 unit) περιοριστικού ενζύμου ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την πλήρη πέψη 1 μg υποστρώματος DNA σε τελικό όγκο αντίδρασης 50 μl μετά από επώαση για 1 ώρα. Προκειμένου να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει: το DNA, το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση τους, τα ένζυμα περιορισμού και αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε τελική συγκέντρωση 100 μg/ml. Ο συνολικός όγκος του μίγματος κυμαίνεται από 20 έως 50 μl. Τυπικά, η αντίδραση πραγματοποιείται για δύο ώρες στους 37 ο C. 41

42 Η ποσότητα των ενζύμων, τα οποία συντηρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει και 50% v/v γλυκερόλη, δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, γιατί υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη (star activity), εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης (>5%). Η προσθήκη των περιοριστικών ενζύμων πραγματοποιείται είτε ταυτόχρονα όταν τα ένζυμα έχουν συμβατά ρυθμιστικά διαλύματα, είτε διαδοχικά όταν η απόδοσή τους διαφέρει σημαντικά κατά την προσθήκη του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος. Πολλές φορές μετά την ολοκλήρωση της επώασης, το DNA πρέπει να καθαριστεί από τα ένζυμα. Ο καθαρισμός πραγματοποιείται με τη χρήση μίγματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης. Αρχικά, προστίθεται ίσος όγκος μίγματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης, σε αναλογία 25:24:1, το μίγμα αναδεύεται ισχυρά και ακολούθως φυγοκεντρείται για 1 λεπτό στα rpm. Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε νέο σωληνάριο όπου εκχυλίζεται με ίσο όγκο διαλύματος SEVAG (96% v/v χλωροφόρμιο, 4% v/v ισοαμυλική αλκοόλη). Ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα rpm. Το υπερκείμενο (υδατική φάση) μεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο και προστίθεται μικρή ποσότητα γλυκογόνου (~1 μl, 20 mg/ml), έτσι ώστε το πλασμιδιακό DNA να είναι ορατό κατά την καταβύθιση, 1/10 όγκου CH 3 COONa 3M, και 2.5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% ή 0.6 όγκοι ισοπροπανόλης. Το περιεχόμενο αφήνεται στους 20 ο C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το μίγμα φυγοκεντρείται στα rpm για 10 λεπτά και το ίζημα πλένεται με 70% αιθανόλη. Η διαδικασία ολοκληρώνεται με τη φυγοκέντρηση του μίγματος στα rpm για 5 λεπτά και την επαναδιάλυση του ιζήματος σε κατάλληλο διάλυμα ή αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Β.2.6. Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Με τον όρο κλωνοποίηση αναφερόμαστε στον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA που μπορεί να πραγματοποιηθεί σε οποιοδήποτε αυτόνομο γενετικό στοιχείο. Το πρώτο βήμα στην κλωνοποίηση είναι η απομόνωση, ο χαρακτηρισμός και η ανάλυση του τμήματος DNA. Το δεύτερο βήμα είναι η επιλογή του φορέα της κλωνοποίησης, συνήθως πλασμιδίου. Τα πλασμίδια είναι μικρά κυκλικά μόρια DNA που αποτελούν αυτόνομα εξωχρωμοσωμικά στοιχεία. Τα πλασμίδια που 42

43 χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης έχουν τρεις βασικές χαρακτηριστικές ιδιότητες: α) τη θέση έναρξης της αντιγραφής (ORI), β) ένα γονίδιο-μάρτυρα για την επιλογή (ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικό), και γ) θέσεις περιοριστικών ενζύμων που απαντώνται μόνο μία φορά στην περιοχή πολλαπλής κλωνοποίησης (MCS). Το τμήμα DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί προέρχεται είτε από την πέψη DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού είτε από την ενίσχυση μιας ακολουθίας με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Το παραπάνω τμήμα μπορεί να έχει συμπληρωματικά ή τυφλά άκρα, ανάλογα με την ενδονουκλεάση περιορισμού ή τη θερμο-ανθεκτική DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται. Π.χ. Η Τaq πολυμεράση κατά την PCR δημιουργεί 3 προεξοχές βάσης Α. Η κλωνοποίηση στηρίζεται στη σύνδεση των συμβατών άκρων του φορέα και του τμήματος του DNA, τα οποία επανακυκλοποιούνται συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, αντίδραση που καταλύεται από την Τ 4 DNA λιγάση. Αποτέλεσμα της κλωνοποίησης είναι η δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου πλασμιδίου. Ο μοριακός λόγος των δύο αντιδρώντων δεν είναι συγκεκριμένος, αν και γενικότερα συνιστάται μοριακός λόγος 1:3 πλασμιδιακού φορέα και DNA αντίστοιχα. Κατά την πορεία αυτή, αρχικά, αναμιγνύονται για 5 λεπτά το DNA του τμήματος που θα ενσωματωθεί, το DNA (50 ng) του πλασμιδιακού φορέα που επιλέχθηκε για την κλωνοποίηση, το ρυθμιστικό διάλυμα της Τ 4 DNA λιγάσης 1x (50 mm Tris-HCl ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 1mM ATP, 25 μg/ml αλβουμίνης βόειου ορού) και Η 2 Ο, ώστε ο συνολικός όγκος της αντίδρασης μετά την προσθήκη και της λιγάσης να είναι 20 μl. Στη συνέχεια, προστίθεται 1 μl Τ 4 DNA λιγάσης (350 units/μl) και ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 2 ώρες ή στους 4 ο C για ώρες. Στην παρούσα εργασία τα προϊόντα των αντιδράσεων PCR των γονιδίων gb και gd κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pzero A-tailed (Εικόνα 8). Ο φορέας αυτός προκύπτει έπειτα από τροποποίηση του πλασμιδιακού φορέα pzero Αρχικά, ο pzero-2.1 επωάστηκε με την ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRV, έτσι ώστε να δημιουργηθούν τυφλά άκρα. Στη συνέχεια, ακολούθησε μία αντίδραση προσθήκης βάσης Τ, ώστε ο γραμμικός φορέας να έχει Τ άκρα. Το όφελος από τα παραπάνω προκύπτει από το γεγονός ότι η Taq2 πολυμεράση που χρησιμοποιήθηκε για τη γενετική ενίσχυση των τμημάτων των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν, δημιουργεί κατά τον πολλαπλασιασμό Α άκρα στα προϊόντα της PCR. Με την 43

44 παραπάνω τροποποίηση του πλασμιδιακού φορέα προκύπτουν συμπληρωματικά άκρα που χρησιμοποιούνται για να επιτευχθεί ΤΑ κλωνοποίηση (ΤΑ cloning). Εικόνα 8. Χάρτης πλασμιδίου pzero-2.1.[70] Ο φορέας έχει μέγεθος 3297 ζεύγη βάσεων. Τα επιμέρους δομικά στοιχεία του είναι τα ακόλουθα: 1. Lac προαγωγέας/περιοχή χειριστή (βάσεις ). Επιτρέπει την in vitro μεταγραφή με νοηματικό προσανατολισμό. 2. Περιοχή θέσεων κλωνοποίησης γονιδίων (multiple cloning sites) (βάσεις ). Επιτρέπει την κλωνοποίηση / εισαγωγή τμήματος DNA 3. Γονίδιο αντίστασης στην καναμυκίνη (βάσεις ). Εξασφαλίζει την επιλογή του πλασμιδίου που έχει ενσωματώσει το τμήμα DNA ενδιαφέροντος στα βακτήρια Ε.coli. 4. Γονίδιο θανάτου ccdb (control of cell death) (βάσεις ). Εξασφαλίζει την επιλογή του πλασμιδίου που έχει ενσωματώσει το τμήμα DNA ενδιαφέροντος στα βακτήρια Ε.coli. Η ένθεση ενός τμήματος DNA στην περιοχή κλωνοποίησης εμποδίζει την έκφραση της συντηγμένης laczα-ccdb πρωτεΐνης, επιτρέποντας την ανάπτυξη μόνο των θετικά μετασχηματισμένων βακτηρίων. Για την πρωτεϊνική έκφραση των τμημάτων των γονιδίων gb και gd επιλέχθηκε η κλωνοποίησή τους στον πλασμιδιακό φορέα pet-16b που έχει μέγεθος 5711 ζεύγη βάσεων (Εικόνα 9). Η ενσωμάτωση των τμημάτων πραγματοποιήθηκε μετά από αντίδραση λιγάσης. Τόσο ο φορέας, όσο και τα τμήματα των γονιδίων είχαν 44

45 επωαστεί με τα περιοριστικά ένζυμα BamHI και NdeI, ώστε να προκύψουν κολλώδη άκρα. Εικόνα 9. Χάρτης πλασμιδίου pet-16b.[71] Τα επιμέρους δομικά στοιχεία του πλασμιδιακού φορέα pet-16b είναι τα ακόλουθα (Εικόνα 10): 1. T7 προαγωγέας/θέση εκκινήσεως (promoter/priming site) (βάσεις ). Επιτρέπει την in vitro μεταγραφή με νοηματικό προσανατολισμό. 2. Περιοχή θέσεων κλωνοποίησης γονιδίων (multiple cloning sites) (βάσεις ). Επιτρέπει την κλωνοποίηση / εισαγωγή του τμήματος DNA. 3. Γονίδιο αντίστασης στην αμπικιλλίνη (β-λακταμάση) (Αmpicillin resistance gene) (βάσεις ). Εξασφαλίζει την επιλογή του πλασμιδίου που έχει ενσωματώσει το τμήμα DNA ενδιαφέροντος στα βακτήρια Ε.coli. 4. Γονίδιο laqi q (βάσεις ). Προάγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης. 5. Θέση ori (βάση 3885). Αντιπροσωπεύει τη θέση έναρξης της αντιγραφής. 6. Περιοχή κοπής από τον παράγοντα Xa. 7. Περιοχή σύντηξης 10 His-tag, που διευκολύνει την ανίχνευση και τον καθαρισμό της πρωτεΐνης-στόχου. 45

46 Εικόνα 10. Περιοχή κλωνοποίησης-έκφρασης του πλασμιδιακού φορέα pet-16b.[71] Για την έκφραση των πρωτεϊνών ORF60 και ORF68 χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας palex μεγέθους 6150 ζεύγη βάσεων (Εικόνα 11). Εικόνα 11. Χάρτης πλασμιδίου palex.[72] Τα επιμέρους δομικά στοιχεία του πλασμιδιακού φορέα palex είναι τα ακόλουθα (Εικόνα 12): 1. T7 προαγωγέας/θέση εκκινήσεως (promoter/priming site). Επιτρέπει την in vitro μεταγραφή με νοηματικό προσανατολισμό. 2. Περιοχή θέσεων κλωνοποίησης γονιδίων (multiple cloning sites). Επιτρέπει την κλωνοποίηση / εισαγωγή του τμήματος DNA. 46

47 3. Γονίδιο αντίστασης στην αμπικιλλίνη (β-λακταμάση) (Αmpicillin resistance gene). Εξασφαλίζει την επιλογή του πλασμιδίου που έχει ενσωματώσει το τμήμα DNA ενδιαφέροντος στα βακτήρια Ε.coli. 4. Γονίδιο laqi q. Προάγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης. 5. Θέση ori. Αντιπροσωπεύει τη θέση έναρξης της αντιγραφής. 6. Περιοχή κοπής από τον παράγοντα Xa. 7. Περιοχή σύντηξης 6 His-tag που διευκολύνει την ανίχνευση και τον καθαρισμό της πρωτεΐνης-στόχου. 8. Περιοχή σύντηξης GST (Glutathione S-Transferase)-tag που διευκολύνει την ανίχνευση και τον καθαρισμό της πρωτεΐνης-στόχου. Εικόνα 12. Περιοχή κλωνοποίησης-έκφρασης του πλασμιδιακού φορέα palex.[72] Β.2.7. Προετοιμασία επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων για μετασχηματισμό με DNA Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την «επιδεκτικότητα» των βακτηριακών κυττάρων, ούτως ώστε να πραγματοποιηθεί εισαγωγή πλασμιδιακού DNA. Αρχικά εμβολιάζονται 3 ml θρεπτικού υλικού TYM (0.5 % w/v εκχύλισμα ζύμης, 2.0 % w/v τρυπτόνη, % w/v NaCl, 10 mm MgSO 4 ) με βακτηριακά κύτταρα. Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για ώρες στους 37 C, υπό ανάδευση. Ακολούθως, εμβολιάζονται 3ml θρεπτικού υλικού, με 30 μl από την παραπάνω καλλιέργεια (αραίωση 1:100) και ακολουθεί επώαση για 2 με 3 ώρες στους 37 C, και 2.5 ml της καλλιέργειας αυτής προστίθενται σε 500 ml θρεπτικού υλικού (αραίωση 1:200). Ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, μέχρις ότου η απορρόφηση 47

48 στα 600 nm (ΟD 600 ) να φθάσει σε περιοχή τιμών Στη συνέχεια, η καλλιέργεια ψύχεται στον πάγο για 5 λεπτά και φυγοκεντρείται στα 4000 rpm για 10 λεπτά, στους 4 C. Το υπερκείμενο αποχύνεται και τα κύτταρα αιωρούνται σε 250 ml (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας) διαλύματος TFB1 ph 7.0 (30mM KOAc, 50mM MnCl 2, 100mM KCl, 10mM CaCl 2, 15 % v/v γλυκερόλη) και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για 10 λεπτά στα 4000 rpm και τα κύτταρα αιωρούνται τελικά σε 25 ml διαλύματος TFB2 ph 7.0 (10mM MOPS, 75mM CaCl 2, 10mM KCl, 20 % v/v γλυκερόλη). Ακολουθεί επώαση για 1 ώρα στον πάγο οπότε και το αιώρημα που προκύπτει, χωρίζεται σε μικροσωληνάρια Eppendorf, σε κλάσματα των 200 μl τα οποία ψύχονται απότομα στους 70 C, όπου και διατηρούνται. Β.2.8. Μεταμόρφωση βακτηρίων E. coli με πλασμίδιο επιλογής Επιδεκτικά βακτήρια Ε.coli 200 μl αναμιγνύονται με ποσότητα διαλύματος πλασμιδιακού DNA ή προϊόντος αντίδρασης λιγάσης, του οποίου ο όγκος δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10 μl. Το μίγμα των κυττάρων επωάζεται στον πάγο για 30 λεπτά και έπειτα υπόκειται σε θερμικό σοκ στους 42 ο C για 90 δευτερόλεπτα. Αμέσως μετά ψύχεται στον πάγο για 1-2 λεπτά. Έπειτα, στο μίγμα προστίθενται 800 μl 2XYT και ακολουθεί επώαση για 45 λεπτά στους 37 ο C προκειμένου τα κύτταρα να αναλάβουν από τη θερμική καταπόνηση. 100 μl του μίγματος επιστρώνονται σε τρυβλίο άγαρ που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής και επωάζεται στους 37 ο C για ώρες περίπου. Σκοπός της πειραματικής διαδικασίας είναι η φαινοτυπική επιλογή των βακτηρίων που μετασχηματίστηκαν και εκφράζουν το γονίδιο της αντίστασης. 48

49 Β.2.9. Ηλεκτροφόρηση Β Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης, βασίζεται στην εφαρμογή του ηλεκτρικού ρεύματος υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες, οπότε τα νουκλεϊκά οξέα κινούνται προς την άνοδο λόγω του αρνητικού τους φορτίου τους που προέρχεται από τις φωσφορικές ομάδες του μορίου τους. Η μετακίνησή τους εξαρτάται από το μέγεθός τους, τη διαμόρφωσή τους, τη συγκέντρωση της πηκτής, τη διαφορά δυναμικού που εφαρμόζεται και τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιείται για την ηλεκτροφόρηση. Η εμφάνιση των ζωνών των μορίων του DNA στην αγαρόζη επιτυγχάνεται με την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης και στο διάλυμα της πηκτής. Πρόκειται για μια φθορίζουσα ένωση που παρεμβάλλεται στα ζεύγη του DNA, απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 και 366 nm και την επανεκπέμπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσματος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA. Αρχικά ζυγίζεται η κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης και προστίθεται στο ρυθμιστικό διάλυμα ΤBΕ 0.5x (0.5 mm Na 2 EDTA, 44.5 mm βορικό οξύ, 44.5 mm Tris, ph 8.0) που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml. Ακολουθεί θέρμανση του αιωρήματος στους 100 ο C για 3-4 λεπτά οπότε και επιτυγχάνεται η τήξη της αγαρόζης. Αφού η θερμοκρασία κατέλθει στους 60 ο C περίπου, το μίγμα αποχύνεται στην συσκευή ηλεκτροφόρησης, σε ειδικό καλούπι στο οποίο έχουν προηγουμένως τοποθετηθεί ειδικά χτενάκια προκειμένου να σχηματισθούν οι θέσεις επιστοίβαξης. Το διάλυμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 45 περίπου λεπτά και αφού σχηματισθεί η πηκτή αφαιρούνται τα χτενάκια και προστίθεται το διάλυμα ηλεκτροφόρησης (0.5Χ ΤΒΕ με 0,5 μg/ml EtBr). Τα τμήματα DNA που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν, αναμιγνύονται με 1/10 του όγκου τους διαλύματος επιστοίβαξης (5% v/v γλυκερόλη, 0.01% w/v κυανούν του ξυλενίου, 0.01% w/v μπλε της βρωμοφαινόλης). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται στα Volt, για όσο χρονικό διάστημα χρειάζεται ώστε να διαχωριστούν τα διαφορετικά τμήματα DNA με βάση το μέγεθός τους. 49

50 Στην περίπτωση που απαιτείται παραλαβή και καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού ή κατόπιν γονιδιακής ενίσχυσης με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), χρησιμοποιείται η αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως, η οποία τήκεται σε θερμοκρασία άνω των 65 ο C. Ακολουθείται η ίδια διαδικασία όπως περιγράφηκε παραπάνω, με τις διαφορές ότι η συσκευή ηλεκτροφόρησης φυλάσσεται στους 4 ο C πριν την απόχυση του μίγματος της αγαρόζης αλλά και κατά την πήξη του και η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σταθερά στα 60 Volt. Τα τμήματα DNA, όπως αυτά εμφανίζονται, μετά την ηλεκτροφόρηση, κάτω από την υπεριώδη ακτινοβολία, αποκόπτονται προσεκτικά με αποστειρωμένο νυστέρι και μεταφέρονται σε σωληνάρια Eppendorf που φυλάσσονται στους -20 ο C. Τα στερεά αυτά τμήματα τήκονται με θέρμανση στους 65 ο C και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για κλωνοποίηση. Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Κατά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες κινούνται με την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου μέσα από τους πόρους μιας πηκτής. Ο σχηματισμός της πηκτής πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO- NH 2 ) και του Ν,Ν-μεθυλενοδισακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH- CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα, το οποίο διαθέτει πόρους. Το μέγεθος των πόρων είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης του μονομερούς ακρυλαμιδίου. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη του υπερθειϊκού αμμωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8, το οποίο κατά τη διάλυσή του στο νερό δίνει ελεύθερες ρίζες, και του φωτοχημικού καταλύτη Ν,Ν,Ν,Ν τετραμεθυλενοδιαμίνη (TEMED) που χρησιμοποιείται ως πολλαπλασιαστής των ελευθέρων ριζών. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει παρουσία ή απουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS ή ουρία), να είναι μονοδιάστατη ή δισδιάστατη, συνεχής ή ασυνεχής ανάλογα με τις απαιτήσεις του πειράματος. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε η ασυνεχής, μονοδιάστατη ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες. 50

51 Η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών σε αποδιατακτικές συνθήκες, παρουσία SDS, επιτυγχάνει τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS, εκτός του ότι αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες, δεσμεύεται επάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους. Κατά την ασυνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιούνται δύο πηκτές, η πηκτή επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνη για τη συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα και η πηκτή διαχωρισμού που είναι υπεύθυνη για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνησή τους μέσα σε αυτή. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται οι δύο πηκτές είναι διαφορετικά ως προς τη σύστασή τους. Το εύρος διαχωρισμού εξαρτάται από την περιεκτικότητα της πηκτής σε ακρυλαμίδιο. Στη συγκεκριμένη εργασία, η συνήθης περιεκτικότητα της πηκτής ήταν 12% με εύρος διαχωρισμού kda και σύσταση (για όγκο 50 ml): 20 ml ακρυλαμίδιο (30% w/v), 8 ml δις-ακρυλαμίδιο (2% w/v), 10 ml 5x running gel buffer (1.875 Μ Tris, ph 8.8), 0.5 ml 10% w/v SDS, ml H 2 O, 100 μl 30% υπερθειϊκού αμμώνιου (APS), 30 μl TEMED. Ο πολυμερισμός πραγματοποιείται σε ειδική συσκευή, για περίπου λεπτά. Ακολούθως, παρασκευάζεται η πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), η οποία αφήνεται να πολυμεριστεί για 20 λεπτά. Η περιεκτικότητά της σε ακρυλαμίδιο είναι 4% και η σύστασή της (για όγκο 30 ml): 4 ml ακρυλαμίδιο (30% w/v), 2 ml δις-ακρυλαμίδιο (2% w/v), 17.5 ml H 2 O, 6 ml 5x stacking gel buffer (ph 6.8), 0.3 ml 10% w/v SDS, 200 μl 30% υπερθειϊκού αμμώνιου (APS), 25 μl TEMED. Οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας, η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό της πηκτής επιστοίβαξης. Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 25 mm Tris-HCl, M γλυκίνη και 0.1% w/v SDS, ph 8.3. Στα δείγματα πριν την ηλεκτροφόρηση προστίθεται διάλυμα επιστοίβαξης SDS που περιέχει 62.5 mm Tris-HCl ph 6.8, 2% w/v SDS, 10% γλυκερόλη, 0.05% w/v 51

52 κυανούν της βρωμοφαινόλης και 2% v/v β-μερκαπτοαιθανόλη. Τα δείγματα πριν την επιστοίβαξή τους θερμαίνονται για 5 λεπτά στους 100 ο C, για την πλήρη αποδιάταξη των πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, τα δείγματα τοποθετούνται στις θέσεις εισαγωγής εντός της πηκτής επιστοίβαξης. Αρχικά, εφαρμόζεται σταθερή τάση 60 V, μέχρι τα δείγματα να εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού και κατόπιν σταθερή τάση 120 V μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Β Χρώση πηκτής πολυακρυλαμιδίου με Coomassie Brilliant Blue (CBB, R- 250) Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στη δημιουργία συμπλόκου κυανού χρώματος, μεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής CBB R-250. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή πολυακρυλαμιδίου εμβαπτίζεται σε διάλυμα χρώσης (0.1% w/v Coomassie Brilliant Blue (R), 40% v/v μεθανόλη, 10 % v/v οξικό οξύ) για 60 λεπτά με αργή ανακίνηση (Συσκευή ανακίνησης: Gyro-Rocker, STR9 εταιρία Bioline Scientific). Κατόπιν, αφαιρείται το διάλυμα χρώσης και η πηκτή ξεπλένεται 3-4 φορές σε διάστημα 2 ωρών με διάλυμα σταθεροποίησης (40% v/v μεθανόλη, 10 % v/v οξικό οξύ) για την απομάκρυνση της περίσσειας της χρωστικής και την εμφάνιση των διακριτών πρωτεϊνικών ζωνών. Ακολούθως η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα αποχρωματισμού (10% v/v μεθανόλη, 5% v/v οξικό οξύ), όπου μπορεί να συντηρηθεί για μεγάλο χρονικό διάστημα. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση μέχρι και 0.1 μg πρωτεΐνης. Β Μεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη και ανοσοαποτύπωμα western Η μεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης βασίζεται στην ηλεκτροφορετική μετακίνηση των πρωτεϊνών από την πηκτή προς τη μεμβράνη. Η κίνηση επιτυγχάνεται με την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού. Οι πρωτεΐνες βρίσκονται σε μορφή συμπλόκου με το SDS, οπότε το σύμπλοκο είναι αρνητικά φορτισμένο. Επομένως, με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου, το σύμπλοκο κινείται προς την άνοδο, εξέρχεται από την πηκτή και τελικά 52

53 καθηλώνεται στο πλέγμα της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης εξαιτίας των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την ανίχνευση των καθηλωμένων πρωτεϊνών με τη χρήση κατάλληλων πολυκλωνικών ή μονοκλωνικών αντισωμάτων. Αρχικά μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ίδιων διαστάσεων προς την πηκτή, κόβεται προσεκτικά και εξισορροπείται αρχικά σε H 2 O, επιπλέοντας για 2 λεπτά και ακολούθως βυθιζόμενη για 5 λεπτά. Στη συνέχεια μεταφέρεται για 10 λεπτά στο διάλυμα μεταφοράς (25 mm Tris, M γλυκίνη και 20% v/v μεθανόλη), στο οποίο εμβαπτίζονται επίσης η πηκτή για λεπτά και 4 χαρτιά τύπου Whatmann 3MM ίσου μεγέθους. Κατόπιν στη συσκευή της ηλεκτρομεταφοράς (Συσκευή western Blot: TE22, εταιρία Pharmacia Biotech.), τοποθετούνται με την ακόλουθη σειρά: δύο υγρά χαρτιά Whatmann, η πηκτή πολυακρυλαμιδίου που φέρει τις πρωτεΐνες, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ακόμη δύο υγρά χαρτιά Whatmann, έτσι ώστε να δημιουργηθεί η διάταξη ηλεκτροφορητικής μεταφοράς. Η μεμβράνη τοποθετείται προς την πλευρά της ανόδου και η πηκτή προς την πλευρά της καθόδου, ούτως ώστε οι πρωτεΐνες να κινηθούν προς την μεμβράνη. Δίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων, που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται στα 36 Volt για 3 ώρες. Μετά το τέλος της ηλεκτροφορητικής μεταφοράς των πρωτεϊνών, η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε διάλυμα μη ειδικής δέσμευσης πρωτεϊνών (Blocking solution) (1x PBS, 0.1% v/v Tween-20, 5% w/v nonfat dry milk) και ανακινείται για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν, η μεμβράνη επωάζεται με το πρωτεύον αντίσωμα που αναγνωρίζει την καθηλωμένη πρωτεΐνη, για 1 ώρα και 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το αντίσωμα προστίθεται αραιωμένο σε διάλυμα μη ειδικής δέσμευσης πρωτεϊνών (1x PBS, 0.1% v/v Tween-20, 0.5% w/v nonfat dry milk) σε αραίωση που ποικίλλει αναλόγως το αντίσωμα. Στη συγκεκριμένη εργασία, η συνήθης αραίωση των αντι-ορών ήταν 1:2000. Μετά την επώαση με το αντίσωμα, η μεμβράνη ξεπλένεται τρεις φορές με διάλυμα 1x PBSΤ (1x PBS, 0.1% v/v Tween-20), για 5 λεπτά κάθε φορά, και κατόπιν ακολουθεί επώαση της μεμβράνης για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με το δεύτερο αντίσωμα σε αραίωση 1:2000, που αναγνωρίζει και δεσμεύεται με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του πρώτου αντισώματος, και είναι συζευγμένο με την υπεροξειδάση από αγριοράπανο,. Στη συνέχεια, η μεμβράνη ξεπλένεται αρχικά τρεις φορές (5 λεπτά κάθε φορά) με διάλυμα 1x PBST και στη συνέχεια δύο φορές (5 λεπτά κάθε φορά) με 1x PBS. 53

54 Τελικά, η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε διάλυμα 3,3 -διαμινοβενζιδίνης (DAB) σε PBS (1x PBS, 0.05% w/v DAB) που δίνει χαρακτηριστική χρωμο-αντίδραση που αντιστοιχεί στη ζώνη της πρωτεΐνης - αντιγόνου του ενδιαφέροντός μας. Πριν την εμβάπτιση στο διάλυμα έχει προστεθεί 2% v/v διαλύματος 0.05% H 2 O 2. Ακολουθεί ανάδευση για 5 λεπτά και στη συνέχεια διήθηση του διαλύματος μέσω ενός πτυχωτού διηθητικού ηθμού. Το διάλυμα προστίθεται στη μεμβράνη και αναδεύεται ήπια μέχρι την εμφάνιση των ζωνών. Η εμφάνιση των ζωνών οφείλεται στο γεγονός ότι η υπεροξειδάση χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το H 2 O 2 οξειδώνει τη DAB και τη μετατρέπει σε ένα αδιάλυτο καφέ ίζημα που επικάθεται στις περιοχές που είναι συνδεδεμένο το δεύτερο αντίσωμα. Μετά το τέλος της αντίδρασης η μεμβράνη ξεπλένεται με απιονισμένο απεσταγμένο νερό και αφήνεται να στεγνώσει ανάμεσα σε διηθητικά χαρτιά και τέλος φυλάσσεται μακριά από το φως και τον αέρα. Β.2.12.Έλεγχος της έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε βακτήρια Η παρακάτω διαδικασία χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της έκφρασης της επιθυμητής πρωτεΐνης σε καλλιέργεια βακτηρίων μικρής κλίμακας. Σε 3 ml θρεπτικού υλικού 2XYT, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού επιλογής, προστίθεται μία αποικία και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. 200 μl του παραπάνω μίγματος εμβολιάζονται σε 1.8 ml θρεπτικού υλικού 2ΧΥΤ (αραίωση 1:10) που περιέχει και την κατάλληλη ποσότητα αντιβιοτικού. Η καλλιέργεια επωάζεται για 1 ώρα και 30 λεπτά υπό ανάδευση (180 rpm) στους 37 ο C και κατόπιν προστίθεται 1 mm IPTG για να επάγει την έκφραση της πρωτεΐνης. Ακολουθεί επώαση για 1 ώρα και 30 λεπτά υπό ανάδευση (180 rpm) στους 37 ο C, τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα rpm και αιωρούνται σε 300 μl 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS και το μείγμα βράζεται για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα δείγματα παγώνουν στους -20 ο C και οι πρωτεΐνες τους μπορούν να αναλυθούν αργότερα με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου. 54

55 Β.2.13.Έλεγχος για την διαλυτότητα των πρωτεϊνών εντός των βακτηρίων Η πρωτεΐνη μέσα σε ένα βακτήριο μπορεί να έχει παραχθεί σε διαλυτή μορφή, ή να δημιουργεί αδιάλυτες μάζες που ονομάζονται βακτηριακά έγκλειστα. Για να προσδιοριστεί η διαλυτότητα ή μη της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει αναπτύσσεται μια καλλιέργεια βακτηρίων, που εκφράζουν την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος, όγκου 50 ml. Επίσης, αναπτύσσεται και καλλιέργεια μάρτυρας στην οποία τα βακτήρια δεν είναι μεταμορφωμένα. Μετά την παραλαβή των βακτηρίων κατόπιν φυγοκέντρησης, ακολουθεί επαναιώρηση σε 3 ml διαλύματος 1x PBS που περιέχει 0.5 mm PMSF, 5 mm β- μερκαπτοαιθανόλη και 1mM EDTA. Ακολούθως, προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 0.2 mg/ml και το μίγμα επωάζεται για 30 λεπτά στους 4 C υπό ανάδευση. Ακολουθεί προσθήκη Triton X-100 σε τελική συγκέντρωση 1% v/v και ανάδευση για 5 λεπτά στους 4 C. Στη συνέχεια, εφαρμόζονται υπέρηχοι 3x20 δευτερόλεπτα, στον πάγο, με 1 λεπτό κενό ανά εφαρμογή. Ένα μέρος του ολικού εκχυλίσματος (~50 μl) κρατείται και αναμιγνύεται με διάλυμα επιστοίβαξης SDS (σε τελική συγκέντρωση 1.5x). Το υπόλοιπο εκχύλισμα φυγοκεντρείται στα rpm για 10 λεπτά στους 4 C. Ένα μέρος του υπερκειμένου (~50 μl) κρατείται και αναμιγνύεται με διάλυμα επιστοίβαξης SDS (σε τελική συγκέντρωση 1.5x). Το ίζημα που αποτελείται κυρίως από βακτηριακά έγκλειστα, επαναδιαλύεται σε 3 ml (όγκος αρχικού διαλύματος) διαλύματος επιστοίβαξης SDS (σε τελική συγκέντρωση 1.5x). Όλα τα δείγματα βράζονται για 5 λεπτά και μπορούν να αναλυθούν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου με βαφή με Coomassie ή να μεταφερθούν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και να ακολουθήσει ανοσοαποτύπωμα western, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Β Απομόνωση και καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων Στην περίπτωση που η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος βρίσκεται σε βακτηριακά έγκλειστα, πρέπει να προηγηθεί ένα επιπλέον στάδιο καθαρισμού των βακτηριακών εγκλείστων πριν τον καθαρισμό και την παραλαβή της πρωτεΐνης από αυτά. Αρχικά, τα παγωμένα κύτταρα επαναδιαλύονται σε διάλυμα που περιέχει 1x PBS,1 mm dithiothreitol (DTT), 1 mm PMSF και 0.2 mg/ml λυσοζύμη. Ο όγκος του 55

56 διαλύματος που χρησιμοποιείται είναι 5 ml ανά γραμμάριο κυττάρων. Το DTT είναι αναγωγικός παράγοντας που ανάγει τις δισουλφιδικές ομάδες των πρωτεϊνών. Το PMSF είναι αναστολέας πρωτεασών σερίνης: π.χ. χυμοτρυψίνης, τρυψίνης και ελαστάσης. Ακολουθεί επώαση για 20 λεπτά στους 4 C υπό ανάδευση. Στη συνέχεια, προστίθεται Triton X-100, 1% v/v τελική συγκέντρωση και ακολουθεί ανάδευση για 5 λεπτά στους 4 C. Το Triton X-100 είναι μη ιονικό απορρυπαντικό που βοηθά στη διάλυση των μεμβρανικών δομών. Έπειτα, εφαρμόζονται υπέρηχοι στον πάγο 3 φορές για 30 δευτερόλεπτα, με 1 λεπτό κενό ανά εφαρμογή. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 25 λεπτά στα rpm στους 4 C. Το υπερκείμενο αφαιρείται και το ίζημα επαναιωρείται σε ίσο όγκο διαλύματος με το αρχικό που περιέχει 50 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.1 % δεοξυχολίνη και 0.2 mg/ml λυσοζύμη. Το μίγμα που προκύπτει, αναδεύεται για 30 λεπτά στους 4 o C. Ακολουθεί προσθήκη 8 mm ΜgCl2 και μg/ml DNaseI για την υδρόλυση τυχόν μορίων DNA και ανάδευση για 1-2 ώρες στους 4οC. Στη συνέχεια πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 25 λεπτά στα rpm και το υπερκείμενο αφαιρείται. Το ίζημα επαναιωρείται σε διάλυμα ίσου όγκου με το αρχικό που περιέχει 50 mm Tris-HCl, ph 8.0, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA και 1% NP-40. Το NP-40 είναι μη ιονικό απορρυπαντικό και απομακρύνει άλατα, καρβονυλικές ομάδες και υπεροξείδια που προέρχονται από τα απορρυπαντικά. Το νέο διάλυμα ανακινείται για 15 λεπτά στους 4οC. Ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση για 25 λεπτά στα rpm στους 4οC. Κατόπιν, το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα επαναιωρείται σε ίσο όγκο διαλύματος που περιέχει 50 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm NaCl και 1 mm EDTA. Ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση για 25 λεπτά στα rpm στους 4οC και το υπερκείμενο απομακρύνεται. Τελικά, το ίζημα που προκύπτει αντιπροσωπεύει τα καθαρισμένα βακτηριακά έγκλειστα. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στα βακτηριακά έγκλειστα πραγματοποιείται με παράλληλη ηλεκτροφόρηση διαλυτοποιημένων εγκλείστων και γνωστών ποσοτήτων μίας πρωτεΐνης-μάρτυρα (συνήθως BSA) σε πηκτή SDSπολυακρυλαμιδίου και μετέπειτα σύγκριση της έντασης των ζωνών που εμφανίζονται μετά από χρώση με διάλυμα Coomassie. 56

57 Β Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών κατά Bradford Η μέθοδος προσδιορισμού των πρωτεϊνών κατά Bradford, στηρίζεται στην ποσοτικοποίηση της δέσμευσης της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 στην πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος, υπό όξινες συνθήκες και τη σύγκριση αυτής της δέσμευσης με τις τιμές μιας πρότυπης καμπύλης αναφοράς που κατασκευάζεται χρησιμοποιώντας γνωστές συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης BSA. Όταν η χρωστική αυτή δεσμεύεται σε μία πρωτεΐνη, τότε το μέγιστο της απορρόφησης εντοπίζεται στα 595 nm. Η χρωστική δεσμεύεται σε βασικά και αρωματικά αμινοξέα και ιδιαίτερα στην αργινίνη. Με τη μέθοδο αυτή μπορούν να ποσοτικοποιηθούν διαλύματα που περιέχουν από 1-20 μg πρωτεΐνης. Αναλυτικά, από κάθε δείγμα μεταφέρεται μία μικρή ποσότητα της πρωτεΐνης 5-30 μl σε ένα σωληνάριο και στη συνέχεια ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τα 800 μl με απεσταγμένο νερό. Προστίθενται 200 μl του Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad), που περιέχει τη χρωστική, φωσφορικό οξύ και μεθανόλη, και το μίγμα αναδεύεται. Ακολουθεί παραμονή του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου για 2-20 λεπτά και μέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm. Η ποσοτικοποιήση γίνεται με τη σύγκριση της παραπάνω τιμής με την πρότυπη καμπύλη αναφοράς. Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη χρωματογραφίας συγγένειας Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός είναι εκλεκτικός και στηρίζεται στην ικανότητα των μορίων πρωτεϊνών να αναγνωρίζουν και να συνδέονται με μεγάλη χημική συγγένεια και αντιστρεπτά με τον συνδέτη (ligand), δηλαδή με το μόριο εκείνο το οποίο είναι καθηλωμένο σε κάποιο αδρανές υλικό και το οποίο παράλληλα διατηρεί την εξειδικευμένη του αγχιστεία με τα μόρια πρωτεΐνες. Τα μόρια που θα αναγνωρίσουν τον συνδέτη θα συνδεθούν μαζί του, ενώ τα υπόλοιπα μόρια θα περάσουν αδέσμευτα μέσα από τη στήλη χωρίς καθυστέρηση και θα εκλουσθούν άμεσα. Η εκλεκτική έκλουση των συνδεδεμένων πάνω στη στήλη μορίων επιτυγχάνεται είτε με την προσθήκη στο διάλυμα έκλουσης του ίδιου του συνδέτη ή αναλόγου του, είτε με αλλαγή του ph και της ιονικής ισχύος του ρυθμιστικού διαλυματος έκλουσης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικοί 57

58 τρόποι καθαρισμού πρωτεϊνών: α) με τη χρήση στήλης γλουταθειόνης-αγαρόζης και β) με τη χρήση στήλης Ni-NTA αγαρόζης. Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται όταν η πρωτεΐνη ενδιαφέροντος εκφράζεται συντηγμένη με την πρωτεΐνη GST (Glutathione S-Transferase). Η τελευταία έχει ενζυμική δράση και συνδέεται εκλεκτικά με την γλουταθειόνη, η οποία βρίσκεται δεσμευμένη στη χρωματογραφική στήλη. Επομένως, στη χρωματογραφική στήλη θα συνδεθεί και η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος. Η έκλουση της συντηγμένης πρωτεΐνης επιτυγχάνεται με τη χρήση ανηγμένης γλουταθειόνης. Η διαδικασία εκτελείται κάτω από μη μετουσιωτικές αποδιατακτικές συνθήκες. Τα λεπτομερή στάδια είναι τα εξής: 1. Επαναιώρηση των κυττάρων με τη χρήση διαλύματος PBS (3 ml/gr κυττάρων) που περιέχει 0.5 mm PMSF, 1 mm EDTA, 10 mm β-μερκαπτοαιθανόλη. 2. Λύση των κυττάρων με τη χρήση λυσοζύμης 0.2 mg/ml. Επώαση 30 λεπτά στους 4οC, υπό ανάδευση. 3. Προσθήκη Triton X-100 σε τελική συγκέντρωση 1%. Ανάδευση 5 λεπτά στους 4oC. 4. Εφαρμογή υπερήχων (3 x 30 ). 5. Φυγοκέντρηση στα rpm, για 15 λεπτά στους 10οC. 6. Το υπερκείμενο αναμιγνύεται με 1 ml 50% διαλύματος γλουταθειόνηςαγαρόζης που έχει εξισορροπηθεί με διάλυμα PBS-Triton X-100 1% για κάθε 4 ml εκχυλίσματος. Ακολουθεί ανάδευση για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 7. Μεταφορά στη στήλη (Econo-column, Biorad). Ακολουθεί πακετάρισμα στη στήλη για 5 λεπτά μέσω βαρύτητας και στη συνέχεια αρχίζει η ροή. Το δείγμα επανατοποθετείται στη στήλη και η ροή συνεχίζεται κανονικά. 8. Ακολουθεί πλύση με 10 ml PBS-Triton X-100 1%. 9. Πλύση με 10 ml PBS/ml πακεταρισμένης στήλης. 10. Πλύση με 10 ml 50 mm Tris-HCl, ph 8.0/ml πακεταρισμένης στήλης. 11. Έκλουση με 10 ml 5 mm ανηγμένης γλουταθειόνης σε 50 mm Tris-HCl, ph 8.0. Συλλογή κλασμάτων όγκου ml. 58

59 12. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με τη μέθοδο κατά Bradford. 13. Ολονύκτια διαπίδυση σε διάλυμα 20 mm Tris-HCl, ph 8.0, 100 mm NaCl, 0.5 mm PMSF, 0.5 mm DTT, 10% γλυκερόλη. Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη Ni-NTA αγαρόζης Ο καθαρισμός με τη χρωματογραφική μέθοδο IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1972, ενώ το πρώτο χηλικό πρόσδεμα ήταν το ιμινο-διοξικό οξύ (IDA, iminodiacetic acid) το οποίο συνδέονταν με τα μεταλλικά ιόντα, Cu +2, Zn +2, Ni +2. Το IDA είναι ένα τριδοτικό πρόσδεμα το οποίο συνδέεται ασθενώς με τα μεταλλικά ιόντα, με αποτέλεσμα ο καθαρισμός των πρωτεϊνών να καταλήγει σε χαμηλές αποδόσεις και μη καθαρές πρωτεΐνες που περιέχουν προσμίξεις μετάλλων. Σήμερα, το πρόβλημα έχει ξεπεραστεί με το νιτριλο-τριοξικό οξύ (NTA, nitrilo-triacetic acid), το οποίο είναι ένα τετραδοτικό χηλικό πρόσδεμα που χρησιμοποιεί τις τέσσερις από τις έξι μονάδες συναρμογής του για τη σύνδεση με το ιόν του νικελίου και τις υπόλοιπες δύο για τη σύνδεσή του με την ουρά των 6 ή 10 ιστιδινών της πρωτεΐνης (Εικόνα 13). Το ΝΤΑ δεσμεύει τα μεταλλικά ιόντα πολύ πιο σταθερά σε σχέση με άλλες χηλικές ρητίνες και διατηρεί τα ιόντα κάτω από ένα μεγάλο εύρος συνθηκών πλύσης. Το υλικό χρωματογραφίας ΝΤΑ δεσμεύει τις πρωτεΐνες που έχουν ουρά 6 ή 10 ιστιδινών πολύ πιο σταθερά σε σύγκριση με το υλικό IDA και επιτρέπει τον καθαρισμό πρωτεϊνών από εκχυλίσματα συνολικής πρωτεΐνης τα οποία βρίσκονται σε ποσοστό <1% σε 95% καθαρά παρασκευάσματα. Η έκλουση της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος γίνεται με τη χρήση αυξημένης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου, το οποίο αποτελεί μέρος της δομής της ιστιδίνης, και λειτουργεί ανταγωνιστικά προς το Ni-ΝΤΑ. Η χρήση μικρής συγκέντρωσης ιμιδαζολίου στις πλύσεις βοηθά στη μη ειδική σύνδεση πρωτεϊνών στην χρωματογραφική στήλη.[73] 59

60 Εικόνα 13. Αλληλεπίδραση δύο μορίων της ουράς των πολυ-ιστιδινών και του υλικού χρωματογραφίας Νi-NTA.[73] Ο καθαρισμός μπορεί να γίνει σε μετουσιωτικές (παρουσία υδροχλωρικής γουανιδίνης, ουρίας) ή μη συνθήκες. Αναλυτικά, τα στάδια που ακολουθούνται είναι τα εξής: 1. Καθαρισμός εγκλείστων σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφθηκε παραπάνω. 2. Διαλυτοποίηση του ιζήματος σε 2 ml Solubilization Buffer (6 M υδροχλωρική γουανιδίνη, 20 mm Tris-HCl, ph 8.0, 150 mm NaCl, 5 mm ιμιδαζόλιο) ανά γραμμάριο αρχικής καλλιέργειας των βακτηρίων. Ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. 3. Φυγοκέντρηση στα rpm για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ανάμιξη του υπερκειμένου με Νi-NTA αγαρόζη, η οποία έχει προηγουμένως εξισορροπηθεί σε Solubilization Buffer. Χρησιμοποιείται 1 ml 50% αιωρήματος Ni-NTA αγαρόζης για κάθε 4 ml εκχυλίσματος. Ανάδευση για 30 λεπτά. 5. Μεταφορά στη στήλη (Econo-column, Biorad). Ακολουθεί πακετάρισμα στη στήλη για 5 λεπτά μέσω βαρύτητας και στη συνέχεια αρχίζει η ροή. Το δείγμα επανατοποθετείται στη στήλη 2 φορές και η ροή συνεχίζεται κανονικά. 6. Πλύση με 3 όγκους στήλης Solubilization Buffer. 7. Πλύση με 10 όγκους στήλης Wash Buffer (8 Μ ουρία, 20 mm Tris-HCl, ph 8.0, 150 mm NaCl, 20 mm ιμιδαζόλιο). 60

61 8. Έκλουση με 10 όγκους στήλης Elution Buffer (8 Μ ουρία, 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 300 mm ιμιδαζόλιο). Συλλογή κλασμάτων ml. 9. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με τη μέθοδο κατά Bradford. 10. Ολονύκτια διαπίδυση σε διάλυμα 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.5 mm PMSF, 1 mm DTT, 0.1% NP-40, 2 M ουρία. 11. Για να απομακρυνθεί τελείως η ουρία, ακολουθεί νέα διαπίδυση για 4 ώρες σε διάλυμα 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.5 mm PMSF, 1 mm DTT, 0.1% NP-40, 10 % γλυκερόλη. Β Καθαρισμός πρωτεϊνών με στήλη χρωματογραφίας μοριακής διήθησης Η χρωματογραφία μοριακής διήθησης αποτελεί μία μέθοδο διαχωρισμού πρωτεϊνών ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Sephadex G-75, ύψους 37 εκατοστών και συνολικού όγκου 74 ml. Το Sephadex είναι μία πηκτή που περιέχει πορώδεις σφαίρες και δημιουργείται από την σταυροσύνδεση μορίων δεξτράνης και επιχλωροϋδρίνης. Οι διαφορετικοί G τύποι Sephadex διαφέρουν στον βαθμό σταυροσύνδεσης και στη διαχωριστική τους ικανότητα. Η διαχωριστική ικανότητα του Sephadex G-75 είναι Da. Μόρια με μέγεθος μεγαλύτερο από Da δεν μπορούν να εισέλθουν στην πηκτή και να υποστούν διαχωρισμό. Τα υπόλοιπα μόρια συνήθως εκλούονται σε όγκο ίσο με τον όγκο της στήλης, ανάλογα με το μέγεθός τους. Τα μεγαλύτερα δεν μπορούν να εισέλθουν στις πορώδεις σφαίρες της πηκτής και εκλούονται πρώτα, ενώ τα μικρότερα καθυστερούν λόγω της εισόδου τους στις σφαίρες (Εικόνα 14). 61

62 Εικόνα 14. Χρωματογραφία Μοριακής Διήθησης [74] Αρχικά, τo Sephadex G-75 ενυδατώθηκε σε απιονισμένο νερό και εξισορροπήθηκε σε διάλυμα που περιείχε 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm NaCl, 0.5 mm PMSF και 0.5 mm DTT. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκε σε κατακόρυφη στήλη όπου και πακεταρίστηκε. Το δείγμα όγκου 1 ml τοποθετήθηκε άνωθεν της στήλης και στη συνέχεια ξεκίνησε η έκλουση με διάλυμα έκλουσης που περιείχε 20 mm Tris- HCl ph 8.0, 100 mm NaCl, 0.5 mm PMSF και 0.5 mm DTT. Συλλέχθηκαν 30 κλάσματα των 2 ml. Τα πρώτα 10 κλάσματα (περίπου 30% του όγκου της στήλης) αποτελούν τον νεκρό όγκο και δεν περιείχαν πρωτεΐνες. Τα υπόλοιπα κλάσματα ελέγχθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western για το περιεχόμενό τους. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, σαν πρώτο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα που αναγνωρίζει την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-ORF68-His 6. 62

63 Β Πρωτεολυτική κοπή των πρωτεϊνών σύντηξης με την πρωτεάση περιορισμού παράγοντα Xa Ο ενεργοποιημένος παράγοντας X είναι μία πρωτεάση του συμπληρώματος πήξης του αίματος που μπορεί και ενεργεί σε καθορισμένη αλληλουχία αμινοξέων Ile-(Glu ή Asp)-Gly-Arg δημιουργώντας πεπτιδικά θραύσματα. Συνήθως οι πρωτεΐνες που εκφράζονται στους πλασμιδιακούς φορείς παράγονται συντηγμένες με μία δεύτερη πρωτεΐνη (π.χ. GST), γεγονός που διευκολύνει τον καθαρισμό τους. Στην περίπτωση που η αλληλουχία που αναγνωρίζει ο παράγοντας Xa βρίσκεται μεταξύ της δεύτερης πρωτεΐνης και της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος, επώαση της συντηγμένης πρωτεΐνης με τον παράγοντα θα οδηγήσει στη δημιουργία δύο ξεχωριστών θραυσμάτων. Βέβαια, μπορεί να υπάρχουν εσωτερικές θέσεις κοπής στην πρωτεΐνη ενδιαφέροντος, οπότε τα θραύσματα είναι περισσότερα. Το διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία ήταν όγκου 1.5 ml και σύστασης: 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm NaCl, 2 M CaCl 2, 2 μg παράγοντα Xa. Η επώαση έγινε στην χρωματογραφική στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης που περιείχε συνδεδεμένη την πρωτεΐνη GST-ORF68-His 6 για 3 και 18 ώρες. Β Ανοσοποίηση κουνελιών Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματόζωα δύο κουνέλια ηλικίας 8 εβδομάδων που στο κάθε ένα ενέθηκε τμήμα μίας εκ των δύο γλυκοπρωτεϊνών gb και gd, οι οποίες εκφράστηκαν σε βακτήρια με σκοπό την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Β Συλλογή προάνοσου ορού από κουνέλια Η παρακάτω διαδικασία τελέστηκε για τη συλλογή ορού από τα πειραματόζωα πριν από την ένεση των αντιγόνων. Ο ορός που συλλέχθηκε χρησιμοποιήθηκε αργότερα ως αρνητικός μάρτυρας στη διαδικασία ελέγχου (ανοσοαποτύπωμα western blot) των αντισωμάτων που παράχθηκαν. 63

64 Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά, δημιουργείται μία τομή στην φλέβα του κουνελιού στην περιοχή του αυτιού, με αποστειρωμένο νυστέρι. Στη συνέχεια, το αίμα συλλέγεται προσεκτικά, αυξάνοντας τη ροή με τη χρήση βαζελίνης. Για τη συγκεκριμένη διαδικασία συλλέγονται 3-4 ml αίματος. Ακολουθεί ήπια ανάδευση στα τοιχώματα με μία πιπέτα Pasteur με κλειστό άκρο και το δείγμα αφήνεται ολονύκτια να πήξει στους 4οC. Στη συνέχεια, ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 4000 rpm για 10 λεπτά, στους 4οC. Το υπερκείμενο (ορός) χωρίζεται σε 2 σωληνάρια Eppendorf και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα rpm για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα υπερκείμενα ενώνονται σε ένα σωληνάριο Eppendorf και προστίθεται γλυκερόλη σε τελική συγκέντρωση 10%. Ακολουθεί αποθήκευση στους -20οC. Β Συλλογή ορού από κουνέλια Η διαδικασία αυτή τελείται για την συλλογή ποσότητας αίματος που περιέχει, ενδεχομένως, τα αντισώματα που παράχθηκαν εναντίον της αντιγονικής πρωτεΐνης που ενέθηκε στα πειραματόζωα. Η διαδικασία είναι παρόμοια με την προηγούμενη όσον αφορά τη συλλογή του αίματος, με τη διαφορά ότι η ποσότητα που συλλέγεται είναι μεγαλύτερη ml. Στη συνέχεια, το αίμα αφήνεται να πήξει για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 4000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο (ορός) μεταφέρεται σε νέο σωληνάριο των 12 ml και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα rpm για 10 λεπτά. Στο υπερκείμενο προστίθεται γλυκερόλη σε τελική συγκέντρωση 10%. Ο ορός μοιράζεται σε 2 σωληνάρια των 15 ml και 2 σωληνάρια Eppendorf των 1.5 ml. Τα παραπάνω αποθηκεύονται στους -20οC. Ακολουθεί έλεγχος με ανοσοαποτύπωμα western που θα περιγραφεί στη συνέχεια. Β Παραγωγή αντιγόνου για ένεση σε κουνέλια Ποσότητα από καθαρισμένα βακτηριακά έγκλειστα, στα οποία έχει προσδιοριστεί η συγκέντρωση πρωτεΐνης με τη συγκριτική μέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω, διαλύεται σε 600 μl 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS. Κατόπιν, η ποσότητα αυτή ηλεκτροφορείται σε πηκτή SDS-PAGE 13%. Στα πηγαδάκια της πηκτής φορτώνονται κατάλληλοι όγκοι δείγματος, έτσι ώστε οι ποσότητες της 64

65 πρωτεΐνης να αντιστοιχούν σε μg για την 1 η δόση-1 ο πηγαδάκι, μg για τις επόμενες. Αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, η πηκτή εμβαπτίζεται σε 0.25 Μ παγωμένου KCl. Με αυτόν τον τρόπο, πραγματοποιείται ανταλλαγή των ιόντων Na + που υπάρχουν στο σύμπλοκο SDS-πρωτεΐνης με ιόντα Κ +, γεγονός που συμβάλλει στην αύξηση της δυσδιαλυτότητας της πρωτεΐνης και στην εμφάνισή της ως σκούρης ζώνης. Η εμφάνιση σταματά μετά από πλύση με παγωμένο νερό. Οι ζώνες που περιέχουν το αντιγόνο αποκόπτονται από την πηκτή και φυλάσσονται χωριστά στους -20οC. Για την ετοιμασία της ένεσης, τα παραπάνω τμήματα της πηκτής τοποθετούνται σε μικροσωληνάριο Eppendorf των 0.5 ml που περιέχει μία οπή στο κάτω μέρος του. Στη συνέχεια το σωληνάριο τοποθετείται σε μεγαλύτερο σωληνάριο Eppendorf των 2 ml. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα rpm. Έτσι, επέρχεται μία αρχική διάσπαση της πηκτής που περιέχει το αντιγόνο σε μικρότερα θραύσματα τα οποία κατόπιν μεταφέρονται σε σύριγγα όγκου 3 ml όπου και προστίθενται εντός 0.65 ml PBS. Το μίγμα αναμιγνύεται με διαδοχικά «περάσματα» από σύριγγα με βελόνα και εκ νέου συλλογής του περιεχομένου στη σύριγγα. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 3-4 φορές και το μίγμα αφήνεται στο σωληνάριο. Με νέα σύριγγα λαμβάνεται ποσότητα 0.5 ml ανοσοενισχυτικό του Freund (πλήρες, που περιέχει νεκρά βακτήρια Mycobacterium Tuberculosis, για την 1 η ένεση ή μη πλήρες, που δεν περιέχει νεκρά βακτήρια Mycobacterium Tuberculosis, για τις υπόλοιπες). Το ανοσοενισχυτικό του Freund προστίθεται και αυτό στο σωληνάριο και ακολουθεί ανάδευση με τα υπόλοιπα συστατικά με τη χρήση της σύριγγας. Το ανοσοενισχυτικό αυτό είναι από τα καλύτερα ανοσοενισχυτικά για τη διέγερση έντονων και παρατεταμένων ανοσοαποκρίσεων. Ωστόσο, έχει το μειονέκτημα ότι προκαλεί τη δημιουργία επίμονων μαζών από κόκκους πληγής (granuloma) και προκειμένου να αποφευχθούν οι παραπάνω παρενέργειες, η πλήρης μορφή χρησιμοποιείται μόνο στην πρώτη δόση ανοσοποίησης, ενώ οι υπόλοιπες γίνονται με τη μη πλήρη. Το μίγμα που προκύπτει όγκου ~1 ml χορηγείται στα κουνέλια σε 3 δόσεις, υποδόρια. Το πρωτόκολλο χορήγησης που ακολουθήθηκε ήταν το εξής: Ημέρα 0 Ημέρα 1 Ημέρα 15 Λήψη προάνοσου ορού 1 η ένεση αντιγόνου 2 η ένεση αντιγόνου 65

66 Ημέρα 29 Ημέρα 43 Ημέρα 50 Ημέρα 57 Ημέρα 64 Ημέρα 71 Ημέρα 78 Ημέρα 85 3 η ένεση αντιγόνου 4 η ένεση αντιγόνου 1 η συλλογή ορού 5 η ένεση αντιγόνου 2 η συλλογή ορού 6 η ένεση αντιγόνου 3 η συλλογή ορού Τελική συλλογή ορού Β Έλεγχος του τίτλου των αντι-ορών Η διαδικασία αυτή στηρίζεται στην αναγνώριση, από τα παραγόμενα αντισώματα, των φυσικών γλυκοπρωτεϊνών του ιού HSV-1. Για το λόγο αυτό, προετοιμάζεται εκχύλισμα του ιού. Αρχικά, παραλαμβάνονται 100 μl του HSV-1 (στέλεχος KOS, 2x10 10 PFUs/ml). Σ αυτά προστίθενται 100 μl 5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS και 100 μl Η 2 Ο. Ακολουθεί βρασμός για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, φορτώνονται σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS-PAGE 10% εναλλάξ 6 μl μαρτύρων μοριακού βάρους πρωτεΐνης και 6 μl εκχυλίσματος ιού (2x10 5 PFUs) στις 14 διαδρομές της πηκτής. Αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, ακολουθεί μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά τη μεταφορά, δημιουργούνται τομές ανάμεσα στο εκχύλισμα του ιού και στους μάρτυρες προκειμένου να προκύψουν 7 μοριακές ταινίες (strips), κάθε μία από τις οποίες περιέχει μία διαδρομή με μάρτυρες μοριακού βάρους και μία διαδρομή με εκχύλισμα του ιού. Κάποια από αυτά τα ζεύγη μπορούν να αποθηκευτούν στους 4οC για μελλοντική χρήση, αφού προηγουμένως εμβαπτιστούν σε διάλυμα μη ειδικής δέσμευσης πρωτεϊνών για 2 ώρες. Τα υπόλοιπα ζεύγη μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα στο ανοσοαποτύπωμα western που περιγράφηκε παραπάνω. Στη συγκεκριμένη περίπτωση ως πρωτεύον αντίσωμα χρησιμοποιείται ο αντι-ορός που συλλέχθηκε από τα κουνέλια σε διάφορες αραιώσεις (1:200, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:10000). Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιείται ο προάνοσος αντι-ορός σε αραίωση 1:200. Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιείται αντίσωμα ενάντια στις ανοσοσφαιρίνες του κουνελιού σε αραίωση 1:2000. Η υπόλοιπη διαδικασία ακολουθείται όπως περιγράφηκε παραπάνω. 66

67 Γ. Πειραματικά αποτελέσματα Γ.1. Απομόνωση και ενίσχυση των τμημάτων των γονιδίων των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd με τη μέθοδο PCR Κεντρικός στόχος της παρούσας ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε η βιοτεχνολογική παραγωγή τμημάτων των γλυκοπρωτεϊνών gb και gd του απλού έρπητα HSV-1, με σκοπό τη δημιουργία πρότυπου ορολογικού διαγνωστικού ελέγχου, δεδομένου ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες περιέχουν αντιγονικές περιοχές. Επιπρόσθετα, στον έλεγχο αυτό συμπεριλαμβάνονται και οι αντίστοιχες γλυκοπρωτεΐνες του ιού του έρπητα ζωστήρα VZV, ORF60 και ORF68. Επίσης, χρησιμοποιούνται ως θετικοί μάρτυρες αντισώματα που παράχθηκαν σε κουνέλια ενάντια στις αντιγονικές περιοχές των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών gb και gd. Αρχικά, εφαρμόστηκε η τεχνολογία PCR με τη χρήση ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών για την απομόνωση των γενετικών περιοχών που αντιστοιχούν σε τμήματα του DNA, με μεγέθη 569 και 886 ζεύγη βάσεων, για τα γονίδια gb και gd, αντίστοιχα. Ως εκμαγεία χρησιμοποιήθηκαν τα πλασμίδια pgb και pgd που παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον κ. Μ. Αρσενάκη, Καθηγητή του τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. Παρακάτω, σημειώνονται οι αλληλουχίες των εκκινητών που σχεδιάστηκαν, οι περιοχές ενίσχυσης και οι περιοχές της πρωτοταγούς δομής των δύο γλυκοπρωτεϊνών που έχουν αναφερθεί να εμφανίζουν αυξημένη αντιγονικότητα.[17, 18] Εκκινητές για το γονίδιο gb: gb_n_sense (πρόσθιος) που περιέχει θέση κοπής για το περιοριστικό ένζυμο NdeI: 5 -ggcatatg gacccgaaaccgaagaagaac-3 gb_nas (ανάστροφος) που περιέχει θέση κοπής για το περιοριστικό ένζυμο BamHI: 5 -ggggatccg gttgtacttgaggtcggtgg-3 cdna της γλυκοπρωτεΐνης gb. Περιοχή ενίσχυσης bp, aa. Αντιγονική περιοχή aa.[18] 1 atgcgccagg gcgcccccgc gcgggggcgc cggtggttcg tcgtatgggc tacgcggtcc cgcgggggcg cgcccccgcg gccaccaagc agcatacccg 51 gctcttgggg ttgacgctgg gggtcctggt ggcgtcggcg gctccgagtt cgagaacccc aactgcgacc cccaggacca ccgcagccgc cgaggctcaa 101 cccccggcac gcctggggtc gcggccgcga cccaggcggc gaacgggggc 67

68 gggggccgtg cggaccccag cgccggcgct gggtccgccg cttgcccccg 151 cctgccactc cggcgccgcc cgcccctggc gcccccccaa cgggggaccc ggacggtgag gccgcggcgg gcggggaccg cgggggggtt gccccctggg 201 gaaaccgaag aagaacagaa aaccgaaacc cccaaagccg ccgcgccccg ctttggcttc ttcttgtctt ttggctttgg gggtttcggc ggcgcggggc 251 ccggcgacaa cgcgaccgtc gccgcgggcc acgccaccct gcgcgagcac ggccgctgtt gcgctggcag cggcgcccgg tgcggtggga cgcgctcgtg 301 ctgcgggaca tcaaggcgga gaacaccgat gcaaactttt acgtgtgccc gacgccctgt agttccgcct cttgtggcta cgtttgaaaa tgcacacggg 351 accccccacg ggcgccacgg tggtgcagtt cgagcagccg cgccgctgcc tggggggtgc ccgcggtgcc accacgtcaa gctcgtcggc gcggcgacgg 401 cgacccggcc cgagggtcag aactacacgg agggcatcgc ggtggtcttc gctgggccgg gctcccagtc ttgatgtgcc tcccgtagcg ccaccagaag 451 aaggagaaca tcgccccgta caagttcaag gccaccatgt actacaaaga ttcctcttgt agcggggcat gttcaagttc cggtggtaca tgatgtttct 501 cgtcaccgtt tcgcaggtgt ggttcggcca ccgctactcc cagtttatgg gcagtggcaa agcgtccaca ccaagccggt ggcgatgagg gtcaaatacc 551 ggatctttga ggaccgcgcc cccgtcccct tcgaggaggt gatcgacaag cctagaaact cctggcgcgg gggcagggga agctcctcca ctagctgttc 601 atcaacgcca agggggtctg tcggtccacg gccaagtacg tgcgcaacaa tagttgcggt tcccccagac agccaggtgc cggttcatgc acgcgttgtt 651 cctggagacc accgcgtttc accgggacga ccacgagacc gacatggagc ggacctctgg tggcgcaaag tggccctgct ggtgctctgg ctgtacctcg 701 tgaaaccggc caacgccgcg acccgcacga gccggggctg gcacaccacc actttggccg gttgcggcgc tgggcgtgct cggccccgac cgtgtggtgg 751 gacctcaagt acaacccctc gcgggtggag gcgttccacc ggtacgggac ctggagttca tgttggggag cgcccacctc cgcaaggtgg ccatgccctg 801 gacggtaaac tgcatcgtcg aggaggtgga cgcgcgctcg gtgtacccgt ctgccatttg acgtagcagc tcctccacct gcgcgcgagc cacatgggca 851 acgacgagtt tgtgttggcg actggcgact ttgtgtacat gtccccgttt tgctgctcaa acacaaccgc tgaccgctga aacacatgta caggggcaaa 901 tacggctacc gggaggggtc gcacaccgaa cacaccagct acgccgccga atgccgatgg ccctccccag cgtgtggctt gtgtggtcga tgcggcggct 951 ccgcttcaag caggtcgacg gcttctacgc gcgcgacctc accaccaagg ggcgaagttc gtccagctgc cgaagatgcg cgcgctggag tggtggttcc 1001 cccgggccac ggcgccgacc acccggaacc tgctcacgac ccccaagttc gggcccggtg ccgcggctgg tgggccttgg acgagtgctg ggggttcaag 1051 accgtggcct gggactgggt gccaaagcgc ccgtcggtct gcaccatgac tggcaccgga ccctgaccca cggtttcgcg ggcagccaga cgtggtactg 1101 caagtggcag gaggtggacg agatgctgcg ctccgagtac ggcggctcct gttcaccgtc ctccacctgc tctacgacgc gaggctcatg ccgccgagga 1151 tccgattctc ttccgacgcc atatccacca ccttcaccac caacctgacc aggctaagag aaggctgcgg tataggtggt ggaagtggtg gttggactgg 1201 gagtacccgc tctcgcgcgt ggacctgggg gactgcatcg gcaaggacgc ctcatgggcg agagcgcgca cctggacccc ctgacgtagc cgttcctgcg 1251 ccgcgacgcc atggaccgca tcttcgcccg caggtacaac gcgacgcaca ggcgctgcgg tacctggcgt agaagcgggc gtccatgttg cgctgcgtgt 1301 tcaaggtggg ccagccgcag tactacctgg ccaatggggg ctttctgatc agttccaccc ggtcggcgtc atgatggacc ggttaccccc gaaagactag 1351 gcgtaccagc cccttctcag caacacgctc gcggagctgt acgtgcggga cgcatggtcg gggaagagtc gttgtgcgag cgcctcgaca tgcacgccct 1401 acacctccgc gagcagagcc gcaagccccc aaaccccacg cccccgccgc tgtggaggcg ctcgtctcgg cgttcggggg tttggggtgc gggggcggcg 1451 ccggggccag cgccaacgcg tccgtggagc gcatcaagac cacctcctcc ggccccggtc gcggttgcgc aggcacctcg cgtagttctg gtggaggagg 1501 atcgagttcg ccaggctgca gtttacgtac aaccacatac agcgccatgt tagctcaagc ggtccgacgt caaatgcatg ttggtgtatg tcgcggtaca 1551 caacgatatg ttgggccgcg ttgccatcgc gtggtgcgag ctgcagaatc gttgctatac aacccggcgc aacggtagcg caccacgctc gacgtcttag 1601 acgagctgac cctgtggaac gaggcccgca agctgaaccc caacgccatc tgctcgactg ggacaccttg ctccgggcgt tcgacttggg gttgcggtag 68

69 1651 gcctcggcca ccgtgggccg gcgggtgagc gcgcggatgc tcggcgacgt cggagccggt ggcacccggc cgcccactcg cgcgcctacg agccgctgca 1701 gatggccgtc tccacgtgcg tgccggtcgc cgcggacaac gtgatcgtcc ctaccggcag aggtgcacgc acggccagcg gcgcctgttg cactagcagg 1751 aaaactcgat gcgcatcagc tcgcggcccg gggcctgcta cagccgcccc ttttgagcta cgcgtagtcg agcgccgggc cccggacgat gtcggcgggg 1801 ctggtcagct ttcggtacga agaccagggc ccgttggtcg aggggcagct gaccagtcga aagccatgct tctggtcccg ggcaaccagc tccccgtcga 1851 gggggagaac aacgagctgc ggctgacgcg cgatgcgatc gagccgtgca ccccctcttg ttgctcgacg ccgactgcgc gctacgctag ctcggcacgt 1901 ccgtgggaca ccggcgctac ttcaccttcg gtgggggcta cgtgtacttc ggcaccctgt ggccgcgatg aagtggaagc cacccccgat gcacatgaag 1951 gaggagtacg cgtactccca ccagctgagc cgcgccgaca tcaccaccgt ctcctcatgc gcatgagggt ggtcgactcg gcgcggctgt agtggtggca 2001 cagcaccttc atcgacctca acatcaccat gctggaggat cacgagtttg gtcgtggaag tagctggagt tgtagtggta cgacctccta gtgctcaaac 2051 tccccctgga ggtgtacacc cgccacgaga tcaaggacag cggcctgctg agggggacct ccacatgtgg gcggtgctct agttcctgtc gccggacgac 2101 gactacacgg aggtccagcg ccgcaaccag ctgcacgacc tgcgcttcgc ctgatgtgcc tccaggtcgc ggcgttggtc gacgtgctgg acgcgaagcg 2151 cgacatcgac acggtcatcc acgccgacgc caacgccgcc atgtttgcgg gctgtagctg tgccagtagg tgcggctgcg gttgcggcgg tacaaacgcc 2201 gcctgggcgc gttcttcgag gggatgggcg acctggggcg cgcggtcggc cggacccgcg caagaagctc ccctacccgc tggaccccgc gcgccagccg 2251 aaggtggtga tgggcatcgt gggcggcgtg gtatcggccg tgtcgggcgt ttccaccact acccgtagca cccgccgcac catagccggc acagcccgca 2301 gtcctccttc atgtccaacc cctttggggc gctggccgtg ggtctgttgg caggaggaag tacaggttgg ggaaaccccg cgaccggcac ccagacaacc 2351 tcctggccgg cctggcggcg gccttcttcg cctttcgcta cgtcatgcgg aggaccggcc ggaccgccgc cggaagaagc ggaaagcgat gcagtacgcc 2401 ctgcagagca accccatgaa ggccctgtac ccgctaacca ccaaggagct gacgtctcgt tggggtactt ccgggacatg ggcgattggt ggttcctcga 2451 caagaacccc accaacccgg acgcgtccgg ggagggcgag gagggcggcg gttcttgggg tggttgggcc tgcgcaggcc cctcccgctc ctcccgccgc 2501 actttgacga ggccaagcta gccgaggccc gggagatgat acggtacatg tgaaactgct ccggttcgat cggctccggg ccctctacta tgccatgtac 2551 gccctggtgt ctgccatgga gcgcacggaa cacaaggcca agaagaaggg cgggaccaca gacggtacct cgcgtgcctt gtgttccggt tcttcttccc 2601 cacgagcgcg ctgctcagcg ccaaggtcac cgacatggtc atgcgcaagc gtgctcgcgc gacgagtcgc ggttccagtg gctgtaccag tacgcgttcg 2651 gccgcaacac caactacacc caagttccca acaaagacgg tgacgccgac cggcgttgtg gttgatgtgg gttcaagggt tgtttctgcc actgcggctg 2701 gaggacgacc tgtga ctcctgctgg acact Εκκινητές για το γονίδιο gd: gd_sense (πρόσθιος) που περιέχει θέση κοπής για το περιοριστικό ένζυμο NdeI: 5 -CCCATATgg AATATgCCTTggTggATgCC-3 gd_as (ανάστροφος) που περιέχει θέση κοπής για το περιοριστικό ένζυμο BamHI: 5 -ggggatcc TATgTgCCAgTTTggTggg-3 69

70 cdna της γλυκοπρωτεΐνης gd. Περιοχή ενίσχυσης bp, aa. Αντιγονικές περιοχές , , , aa.[17] 1 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat tacccccccc gacggcggtc caacccccgg cactaaaaca aacagcagta 51 agtgggcctc catggggtcc gcagcaaata tgccttggtg gatgcctctc tcacccggag gtaccccagg cgtcgtttat acggaaccac ctacggagag 101 tcaagatggc cgaccccaat cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcctg agttctaccg gctggggtta gcgaaagcgc cgtttctgga aggccaggac 151 gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg cgcgtgtacc acatccaggc ctggtcgact ggctgggagg cccccaggcc gcgcacatgg tgtaggtccg 201 gggcctaccg gacccgttcc agccccccag cctcccgatc acggtttact cccggatggc ctgggcaagg tcggggggtc ggagggctag tgccaaatga 251 acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg tgcggcacaa cctcgcgcgg acggcgtcgc acgaggattt gcgtggcagc 301 gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctccgggggg tctaacaggc gccccggagg cttctgcagg cctttgttgg 351 ctacaacctg accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc gatgttggac tggtagcgaa ccaaagccta ccctccgttg acacgatagg 401 ccatcacggt catggagtac accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg ggtagtgcca gtacctcatg tggcttacga ggatgttgtt cagagacccc 451 gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg aactactatg acagcttcag cggacagggt aggcttgcgt cggggcgacc ttgatgatac tgtcgaagtc 501 cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc cccgcgtttg gcggcagtcg ctcctattgg accccaagga ctacgtgcgg gggcgcaaac 551 agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag tctggcggcc gtgcatggac gccgagcact tctatttgct gacctgcctc 601 attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc taatgtgtca aataggacct cgtggctcgg ttcccgagga cattcatgcg 651 cctcccgctg cgcatccccc cgtcagcctg cctctccccc caggcctacc ggagggcgac gcgtaggggg gcagtcggac ggagaggggg gtccggatgg 701 agcagggggt gacggtggac agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc tcgtccccca ctgccacctg tcgtagccct acgacggggc gaagtagggg 751 gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc ttgaagatcg ccgggtggca ctcttggtcg cgtggcagcg gcatatgtcg aacttctagc ggcccaccgt 801 cgggcccaag gccccataca cgagcaccct gctgcccccg gagctgtccg gcccgggttc cggggtatgt gctcgtggga cgacgggggc ctcgacaggc 851 agacccccaa cgccacgcag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat tctgggggtt gcggtgcgtc ggtcttgagc ggggccttct ggggctccta 901 tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg gtggcgccgc aaatcccacc agccgggaga acctcctggg gcacccctgc caccgcggcg tttagggtgg 951 aaactggcac ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct taccatcccc tttgaccgtg tatggcagct aggtcctgcg gcgctgcgga atggtagggg 1001 cggccacccc gaacaacatg ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt gccggtgggg cttgttgtac ccggactagc ggccgcgcca cccgccgtca 1051 ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt gtgtactgga tgcgccgcca gaggaccgtc gggaccagta aacgccttaa cacatgacct acgcggcggt 1101 cactcaaaaa gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc cgggaagacg gtgagttttt cggggtttcg cgtatgcgga gggggtgtag gcccttctgc 1151 accagccgtc ctcgcaccag cccttgtttt actag tggtcggcag gagcgtggtc gggaacaaaa tgatc Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης PCR σε πηκτή αγαρόζης 1.8 % με την ταυτόχρονη χρήση μαρτύρων DNA για τον προσδιορισμό του μοριακού μεγέθους των τμημάτων που ενισχύθηκαν γενετικά. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1, τα προϊόντα της PCR που ενισχύθηκαν και αντιστοιχούν στο DNA των 70

71 gb και gd έχουν μεγέθη που συνάδουν με τα αναμενόμενα δηλαδή των 569 και 886 ζεύγη βάσεων, αντίστοιχα bp 564 bp 886 bp 569 bp Σχήμα 1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.2% της γενετικής περιοχής που αντιστοιχεί στα τμήματα των DNA των γονιδίων gb, gd μετά από αντίδραση PCR με τους εκκινητές gb_n_sense - gb_nas και gd_sense - gd_as, αντίστοιχα. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομή 2: προϊόν PCR του γονιδίου gd Διαδρομή 3: προϊόν PCR του γονιδίου gβ. Γ.2. Κλωνοποίηση των προϊόντων της PCR στον πλασμιδιακό φορέα pζero-2.1 A-tailed Ακολούθησε κλωνοποίηση των προϊόντων της PCR στον γενετικά τροποποιημένο πλασμιδιακό φορέα pζero-2.1 A-tailed. Η γενετική τροποποίηση του πλασμιδιακού φορέα pzero-2.1 περιγράφεται στο κεφάλαιο των υλικών και μεθόδων. Ο πλασμιδιακός φορέας pζero-2.1 A-tailed (50 ng/μl) επωάστηκε με τα προϊόντα της PCR σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις λιγάσης για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα προϊόντα της αντίδρασης PCR περιέχουν 3 προεξοχές βάσης Α ενώ ο φορέας pζero-2.1 A-tailed συμπληρωματικές προεξοχές βάσης Τ οπότε το τμήμα DNA μπορεί να εισέλθει στον φορέα με κατεύθυνση 5 3 ή 3 5. Ακολούθησε μεταμόρφωση των επιδεκτικών E. coli TOP10 και τα επιμολυσμένα βακτηριακά κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία που περιείχαν καναμυκίνη ως αντιβιοτικό επιλογής και IPTG ως επαγωγέα, επωάστηκαν στους 37 o C, για ώρες και αναπτύχθηκαν αποικίες. Επτά αποικίες επελέγησαν για 71

72 απομόνωση θετικού κλώνου για το γονίδιο gb και 6 για το γονίδιο gd και αναπτύχθηκαν στους 37 ο C για ώρες, σε 4 ml θρεπτικό υγρό 2XYT, που περιείχε αντιβιοτικό επιλογής (καναμυκίνη) και τον επαγωγέα IPTG. Στη συνέχεια, απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA, σε μικρή κλίμακα (mini prep) και έγινε έλεγχος ενσωμάτωσης των αλληλουχιών των γονιδίων gb και gd με τη χρήση των ενζύμων περιορισμού EcoRI και XhoI. Το ένζυμο EcoRI κόβει το πλασμίδιο pζero-2.1 στα 325 bp και το ένζυμο XhoI στα 358 bp. Εσωτερικές θέσεις κοπής για τα παραπάνω ένζυμα στις αλληλουχίες των γονιδίων gb και gd που ενσωματώθηκαν δεν υπάρχουν. Έτσι, στην πηκτή ηλεκτροφόρησης αγαρόζης θα εμφανιστούν: Στην περίπτωση αρνητικού κλώνου εμφανίζεται μία ζώνη στα = 3264 bp και μία ζώνη στα 33 bp (δεν παρατηρείται), αφού η απόσταση των θέσεων κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI είναι 33 bp. Στην περίπτωση ενός θετικού κλώνου θα εμφανιστούν δύο ζώνες. Μία στα 3264 bp και μία στα 569 (ένθεμα-insert) + 33= 602 bp (gb) ή μία στα 886 (ένθεμαinsert) + 33= 919 bp (gd). Από επιτυχημένη κλωνοποίηση ταυτοποιήθηκαν 6 θετικοί κλώνοι για το γονίδιο gb [gbn1, gbn2, gbn1(2), gbn3, gbn4, gbn5] και 3 θετικοί κλώνοι για το γονίδιο gd [gd, gd3, gd4], όπως απεικονίζεται στα Σχήματα 2 και 3, με τη βοήθεια μαρτύρων DNA γνωστού μοριακού βάρους και την ταυτόχρονη παρουσία αρνητικών κλώνων bp 919 bp 564 bp 602 bp Σχήμα 2. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομή 2: θετικός κλώνος gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI Διαδρομές 3,4: θετικοί κλώνοι gbn1 και gbn2 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI. 72

73 2027 bp 919 bp 564 bp 602 bp Σχήμα 3. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομές 2,4,7: αρνητικοί κλώνοι gd μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI Διαδρομές 5,6: θετικοί κλώνοι gd3 και gd4 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI Διαδρομή 9: αρνητικός κλώνος gb μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI Διαδρομές 8,10,11,12: θετικοί κλώνοι gbn1(2), gbn3, gbn4, gbn5 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και XhoI. Γ.3. Έλεγχος του προσανατολισμού της αλληλουχίας στους φορείς κλωνοποίησης Οι θετικοί κλώνοι εξετάστηκαν ως προς τον προσανατολισμό με τον οποίο ενσωματώθηκαν εντός του πλασμιδιακού φορέα pζero-2.1a-tailed. Ο προσανατολισμός μπορεί να είναι πρόσθιος (forward) ή ανάστροφος (reverse) ανάλογα με το εάν το τμήμα του DNA εισήλθε με κατεύθυνση 5 3 ή 3 5. Ο έλεγχος γίνεται μέσω κοπής με το περιοριστικό ένζυμο BamHI, το οποίο έχει μία θέση περιορισμού στον πλασμιδιακό φορέα pζero-2.1a-tailed στα 294 bp και μία θέσης κοπής στο 3 άκρο των κλωνοποιημένων τμημάτων. Στην περίπτωση πρόσθιου κλώνου θα εμφανιστούν δύο ζώνες. Μία στα 3266 bp και μία στα 569 (ένθεμα-insert) + 31= 600 bp (gb) ή μία στα 886 (ένθεμα-insert) + 31= 917 bp (gd), αφού η απόσταση της θέσης κλωνοποίησης και της θέσης κοπής από την BamHI είναι 31 bp. Στην περίπτωση ανάστροφου κλώνου εμφανίζεται μία ζώνη στα 3866 (φορέας + insert)-31= 3835 bp και μία ζώνη στα 31 bp (gb) (δεν παρατηρείται) ή μία ζώνη στα 4183(φορέας + insert)-31= 4152 bp και μία ζώνη στα 31 bp (gd) (δεν παρατηρείται). 73

74 Με αυτόν τον τρόπο ταυτοποιήθηκαν 2 πρόσθιοι κλώνοι [gbn2, gbn5] και 4 ανάστροφοι [gbn1, gbn1(2), gbn3, gbn4] για το γονίδιο gb και 2 πρόσθιοι κλώνοι [gd3, gd4] και ένας ανάστροφος [gd] για το γονίδιο gd, όπως απεικονίζεται στα Σχήματα 4 και 5, με τη βοήθεια μαρτύρων DNA γνωστού μοριακού βάρους bp 564 bp 3266 bp 600 bp Σχήμα 4. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για τον έλεγχο του προσανατολισμού των θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd, μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομή 2: ανάστροφος κλώνος gd μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI Διαδρομή 3: ανάστροφος κλώνος gbn1 μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI Διαδρομή 4: πρόσθιος κλώνος gbn2 μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI bp 2027 bp 917 bp 564 bp 3266 bp 600 bp Σχήμα 5. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για τον έλεγχο του προσανατολισμού των θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd, μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομές 2,3: πρόσθιοι κλώνοι gd3, gd4 μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI Διαδρομή 4,5,6: ανάστροφοι κλώνοι gbn1(2), gbn3, gbn4 μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI Διαδρομή 7: πρόσθιος κλώνος gbn5 μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο BamHI. 74

75 Γ.4. Πέψη των θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI με σκοπό την απομόνωση των τμημάτων DNA από αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως Τα απομονωμένα πλασμιδιακά DNA υπόκεινται σε πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI, των οποίων οι θέσεις κοπής βρίσκονται στα άκρα του κάθε ενθέματος (insert) λόγω του σχεδιασμού των εκκινητών της αντίδρασης PCR οι οποίοι περιείχαν αυτές τις θέσεις κοπής. Η αντίδραση για τους κλώνους gd, gbn1 και gbn2 είχε όγκο 150 μl (115 μl διάλυμα πέψης + 35 μl miniprep), ενώ για τους κλώνους gd3, gd4, gbn1(2), gbn3, gbn4 και gbn5 είχε όγκο 100 μl (70 μl διάλυμα πέψης + 30 μl miniprep). 10 μl από την 1 η αντίδραση και 5 μl από τη 2 η ηλεκτροφορήθηκαν διαγνωστικά σε πηκτή αγαρόζης 1%. Τα μεγέθη των θραυσμάτων των θετικών κλώνων είναι 3297 bp και 569 bp (gb) και 3297 bp και 886 bp (gd). Τα αποτελέσματα φαίνονται στα Σχήματα 6 και bp 569 bp 2027 bp 564 bp Σχήμα 6. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI.Διαδρομή 1: θετικός κλώνος gd μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Διαδρομές 2,3: θετικοί κλώνοι gbn1 και gbn2 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI Διαδρομή 4: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII. 75

76 2027 bp 886 bp 564 bp 3297 bp 569 bp Σχήμα 7. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pζero-2.1a-tailed-gb και pζero-2.1a-tailed-gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομές 2,3: θετικοί κλώνοι gd3 και gd4 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI Διαδρομές 4,5: θετικοί κλώνοι gβν1(2) και gbn5 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Στη συνέχεια, ακολούθησε κατεργασία των προϊόντων της κοπής με μίγμα φαινόλης/χλωροφόρμιου/ισοαμυλικής αλκοόλης, σύμφωνα με την διαδικασία που περιγράφηκε στο κεφάλαιο των μεθόδων και ακολούθησε κατακρήμνιση του DNA με ισοπροπανόλη. Έπειτα, ακολούθησε επαναδιάλυση των ιζημάτων που προέκυψαν σε 30 μl Η 2 Ο, 3.5 μl ρυθμιστικό διάλυμα όμοιο αυτού στο οποίο έγινε η πέψη και 3.5 μl χρωστικής επιστοίβαξης. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως 1% και αφαίρεση των τμημάτων DNA από την πηκτή με τη χρήση ενός αποστειρωμένου νυστεριού. Τα τμήματα αυτά μεταφέρθηκαν σε σωληνάρια eppendorf και φυλάχθηκαν στους -20 ο C. Επιπροσθέτως, τα τμήματα αυτά περιέχουν κολλώδη άκρα λόγω της πέψης με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Γ.5. Κλωνοποίηση των τμημάτων των γονιδίων gb και gd στον πλασμιδιακό φορέα pet-16b Έγινε προσπάθεια κλωνοποίησης των τμημάτων των γονιδίων του ενδιαφέροντός μας στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης pet-16b της Novagen. Ο τελευταίος, περιείχε κολλώδη άκρα μετά από πέψη του με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI, οι θέσεις κοπής των οποίων απεικονίζονται στο χάρτη του, όπως περιγράφηκε στο κεφάλαιο των μεθόδων. 76

77 Κατόπιν, πραγματοποιήθηκαν οι αντιδράσεις λιγάσης μεταξύ του επεξεργασμένου με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI pet-16b και των τμημάτων DNA των γονιδίων gb και gd που παραλήφθηκαν από αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως, υγροποιήθηκαν στους 65 ο C και περιέχουν επίσης κολλώδη άκρα λόγω της πέψης με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Μετά από την αντίδραση λιγάσης, ακολούθησε μεταμόρφωση των επιδεκτικών E. coli TOP10 και τα επιμολυσμένα βακτηριακά κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία που περιείχαν καναμυκίνη ως αντιβιοτικό επιλογής και IPTG ως επαγωγέα, επωάστηκαν στους 37 o C για ώρες και αναπτύχθηκαν αποικίες. Κατόπιν, επελέγησαν 3 και 3 από αυτές, για κάθε γονίδιο, για την απομόνωση θετικού κλώνου και αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υγρό 2ΧΥΤ και αντιβιοτικό επιλογής (αμπικιλλίνη) στους 37 o C για ώρες. Στη συνέχεια, απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA σε μικρή κλίμακα (mini prep) και έγινε έλεγχος ενσωμάτωσης των αλληλουχιών των γονιδίων gb και gd με τη χρήση των ενζύμων περιορισμού NdeI και BamHI. Το ένζυμο NdeI κόβει στο 5 άκρο κάθε ενθέματος και όχι σε άλλη περιοχή του πλασμιδιακού φορέα, ενώ το ένζυμο BamHI κόβει επίσης μία φορά στo 3 κάθε ενθέματος και όχι σε άλλη περιοχή του πλασμιδιακού φορέα. Έτσι, στην πηκτή ηλεκτροφόρησης αγαρόζης θα εμφανιστούν: Στην περίπτωση αρνητικού κλώνου εμφανίζεται μία ζώνη στα 5711 (μέγεθος πλασμιδιακού φορέα) 12= 5699 bp και μία ζώνη στα 12 bp (δεν παρατηρείται), αφού η απόσταση των θέσεων κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI είναι 12 bp. Στην περίπτωση ενός θετικού κλώνου θα εμφανιστούν δύο ζώνες. Μία στα 5711 bp (μέγεθος πλασμιδιακού φορέα) και μία στα 569 bp (ένθεμα-insert) (gb) ή μία στα 886 (ένθεμα-insert) (gd). Μετά από επιτυχημένη κλωνοποίηση ταυτοποιήθηκαν 3 θετικοί κλώνοι για το γονίδιο gb [gbn1, gbn1(2), gbn5] και 3 θετικοί κλώνοι για το γονίδιο gd [gd, gd1, gd2], όπως απεικονίζεται στα Σχήματα 8 και 9, με τη βοήθεια μαρτύρων DNA γνωστού μοριακού βάρους. Οι κλώνοι ελέγχηκαν περαιτέρω με αλληλούχιση. 77

78 2027 bp 886 bp 564 bp 569 bp Σχήμα 8. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pet-16b-gb και pet-16b-gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομή 2: θετικός κλώνος gd μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI Διαδρομή 3: θετικός κλώνος gβν1 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI bp 886 bp 564 bp 569 bp Σχήμα 9. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pet-16b-gb και pet-16b-gd, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομές 2,3: θετικοί κλώνοι gd1 και gd2 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI Διαδρομές 4,5: θετικοί κλώνοι gβν1(2) και gbn5 μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και BamHI. Γ.6. Έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε βακτήρια Τα απομονωμένα πλασμιδιακά DNA των ταυτοποιημένων θετικών κλώνων χρησιμοποιήθηκαν για τη μεταμόρφωση των επιδεκτικών κυττάρων E. coli BL21[DE3], προκειμένου να πραγματοποιηθεί επαγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μικρή κλίμακα. Η επαγωγή σε όλες τις περιπτώσεις έγινε στους 37 ο C 78

79 με 1 mm IPTG για 1 ώρα και 30 λεπτά. Ο έλεγχος της επαγωγής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την μέθοδο ελέγχου έκφρασης πρωτεϊνών που περιγράφηκε στη μεθοδολογία και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 12% με ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE). Τα αποτελέσματα από την βαφή με Coomassie της πηκτής πολυακρυλαμιδίου 12% SDS PAGE απεικονίζονται στο Σχήμα 10. Τα προσδοκώμενα μεγέθη των υπό έκφραση πρωτεϊνών, με υπολογιστικές μεθόδους, είναι Da για το τμήμα της gb και Da για το τμήμα της gd. Οι κλώνοι του ενδιαφέροντός μας ταυτοποιήθηκαν περαιτέρω και με τη βοήθεια της τεχνικής του ανοσοαποτυπώματος κατά western. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his που αναγνωρίζει εκλεκτικά το δεκαπεπτίδιο His, το οποίο εμπεριέχεται στον πλασμιδιακό φορέα pet-16b και εκφράζεται συντηγμένο μαζί με τις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος (Σχήμα 10). kda His 10 -gd His 10 -gb

80 kda His 10 -gd His 10 -gb Σχήμα 10. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για την επιβεβαίωση της έκφρασης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών His 10 -gb και His 10 -gd και μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για την ανίχνευση των πρωτεϊνών His 10 -gb και His 10 -gd με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his.. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομές 2,3,4: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd (θετικοί κλώνοι gd, gd1, gd2) Διαδρομές 5,6,7: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ [θετικοί κλώνοι gbn1, gbn1(2), gbn5]. Γ.7. Επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης σε μεγάλη κλίμακα (500 ml) Ακολούθησε επαγωγή της έκφρασης των πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα (500 ml) όπως περιγράφηκε στις μεθόδους. Η επαγωγή έγινε με χρήση IPTG σε τελική συγκέντρωση 0.5 mm για 4 ώρες στους 37 C. Ο προσδιορισμός της διαλυτότητας των πρωτεϊνών που μας ενδιαφέρουν πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε στη μεθοδολογία. Τα αποτελέσματα από τη βαφή με Coomassie της πηκτής πολυακρυλαμιδίου 12% SDS PAGE απεικονίζονται στο Σχήμα 11. Γίνεται αντιληπτό πως οι πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος σχηματίζουν κυρίως βακτηριακά έγκλειστα, ενώ ένα μέρος της His 10 -gb είναι διαλυτό και εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα. Ως μάρτυρες χρησιμοποιούνται βακτηριακά εκχυλίσματα από μη μεταμορφωμένα βακτήρια BL21[DE3] που υπέστησαν την ίδια επεξεργασία με τα μεταμορφωμένα. Οι κλώνοι του ενδιαφέροντός μας ταυτοποιήθηκαν περαιτέρω και με τη βοήθεια της τεχνικής του ανοσοαποτυπώματος κατά western. Για το σκοπό αυτό 80

81 χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his που αναγνωρίζει εκλεκτικά το δεκαπεπτίδιο His, το οποίο εμπεριέχεται στον πλασμιδιακό φορέα pet-16b και εκφράζεται συντηγμένο μαζί με τις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος (Σχήμα 11). kda Ολικό Κυτταροπλασματικό Έγκλειστα His 10 -gd His 10 -gb kda Ολικό Κυτταροπλασματικό Έγκλειστα Σχήμα 11. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της διαλυτότητας των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών His 10 -gb και His 10 -gd και μέθοδος ανοσοαποτυπώματος με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα Διαδρομή 3: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 4: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd Διαδρομή 5: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα Διαδρομή 6: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 7: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd Διαδρομή 8: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από μη μεταμορφωμένα κύτταρα Διαδρομή 9: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 10: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd. 81

82 Γ.8. Απομόνωση και καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων Ακολούθησε καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων που περιέχουν τις πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφηκε στο κεφάλαιο των μεθόδων. Ένα τμήμα των καθαρισμένων εγκλείστων διαλυτοποιήθηκε σε 1.5x διάλυμα επιστοίβαξης SDS και τα εκχυλίσματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12 % για να διαπιστωθεί η καθαρότητά τους. Η πηκτή μετά από χρώση με Coomassie απεικονίζεται στο Σχήμα 12. kda His 10 -gd His 10 -gb Σχήμα 12. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της καθαρότητας των βακτηριακών εγκλείστων των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών His 10 -gb και His 10 -gd. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από μη μεταμορφωμένα κύτταρα Διαδρομή 3: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων (11/4) από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 4: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων (23/5) από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 5: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων (11/4) από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd Διαδρομή 6: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων (23/5) από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd. Γ.9. Υπολογισμός συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα βακτηριακά έγκλειστα Ακολούθησε υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών που σχηματίζουν τα βακτηριακά έγκλειστα. Η μέθοδος βασίζεται στη σύγκριση των ζωνών πρωτεΐνης γνωστής περιεκτικότητας (BSA) με τις αντίστοιχες της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος, που εμφανίζονται μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 82

83 ακρυλαμιδίου SDS-PAGE 12%. Οι συγκεντρώσεις που υπολογίστηκαν ήταν 3 mg/ml για την His 10 -gb και 1 mg/ml για την His 10 -gd. Η πηκτή απεικονίζεται στο Σχήμα 13. BSA (1mg/ml) His 10 -gd His 10 -gb kda Σχήμα 13. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της συγκέντρωσης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών His 10 -gb και His 10 -gd των βακτηριακών εγκλείστων. Διαδρομή 1: 6μl βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd Διαδρομή 2: 4μl βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd Διαδρομή 3: 2μl βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd Διαδρομή 4: 6μl βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 5: 4μl βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 6: 2μl βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gβ Διαδρομή 7: 10μl BSA (1mg/ml) Διαδρομή 8: 6μl BSA (1mg/ml) Διαδρομή 9: 4μl BSA (1mg/ml) Διαδρομή 10: 2μl BSA (1mg/ml) Διαδρομή 11: μάρτυρες μοριακής μάζας. Γ.10. Ανοσοποίηση κουνελιών Αρχικά παρασκευάστηκε επαρκής ποσότητα των αντιγονικών πρωτεϊνών His 10 -gb και His 10 -gd από τα βακτηριακά έγκλειστα με τη χρήση διαλύματος 0.25 Μ KCl, όπως περιγράφεται στη μεθοδολογία. Οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν και χωρίστηκαν σε ποσότητες ( μg για την 1 η δόση, μg για τις επόμενες). Στη συνέχεια, ακολούθησε ομογενοποίηση και χορήγησή τους ανά 2 εβδομάδες στα κουνέλια όπως αναφέρεται στις μεθόδους. Μία εβδομάδα μετά την 4 η ένεση συλλέχθηκε για πρώτη φορά αντι-ορός (1 η αφαίμαξη), το οποίο επαναλήφθηκε άλλες δύο φορές ανά δύο εβδομάδες. Σημειώνεται ότι πριν την έναρξη της χορήγησης των αντιγονικών πρωτεϊνών, συλλέχθηκε μικρή ποσότητα προάνοσου ορού από τα κουνέλια, που χρησιμεύει ως αρνητικός μάρτυρας στη διαδικασία ελέγχου. 83

84 Ο έλεγχος των αντι-ορών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ανοσοαποτυπώματος (western blot), στην οποία χρησιμοποιήθηκε ως πρώτο αντίσωμα ο αντι-ορός που συλλέχθηκε από τα κουνέλια σε διάφορες αραιώσεις (1:200, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:10000). Ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιείται αντίσωμα που αναγνωρίζει τις ανοσοσφαιρίνες κουνελιού σε αραίωση 1:2000. Τα αποτελέσματα του ελέγχου των 3 αντι-ορών που συλλέχθηκαν για κάθε πρωτεΐνη, εμφανίζονται στα Σχήματα 14, 15, 16 και 17. Τα αντισώματα ελέγχθηκαν ενάντια στις φυσικές πρωτεΐνες του ιού. Το φυσικό μέγεθος της πρωτεΐνης gb, στον απλό έρπητα HSV-1, είναι Da ενώ της πρωτεΐνης gd Da. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους ενάντια σε 2x10 5 PFUs ιού. Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Προάνοσος gb gb gb gb 1:200 1:200 1:500 1:1000 1:2000 kda gb Σχήμα 14. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τον έλεγχο του αντι-ορού gb, 1 η αφαίμαξη. 84

85 Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός gb gb gb gb 1:2000 (3 η ) 1:4000 (3 η ) 1:4000 (2 η ) 1:10000 (3 η ) gb Σχήμα 15. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τον έλεγχο του αντι-ορού gb, 2 η και 3 η αφαίμαξη. Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Προάνοσος gd gd gd gd 1:200 1:200 1:500 1:1000 1:2000 kda gd Σχήμα 16. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τον έλεγχο του αντι-ορού gd, 1 η αφαίμαξη. 85

86 Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός Αντι-ορός gd gd gd gd 1:2000 (3 η ) 1:4000 (3 η ) 1:4000 (2 η ) 1:10000 (3 η ) gd Σχήμα 17. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τον έλεγχο του αντι-ορού gd, 2 η και 3 η αφαίμαξη. Στη συνέχεια, έγινε έλεγχος της ευαισθησίας των αντισωμάτων σε διάφορες συγκεντρώσεις του ιού HSV-1 που χρησιμοποιείται στην ηλεκτροφόρηση πηκτής ακρυλαμιδίου. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 18. Το anti-gb αντίσωμα σε αραίωση 1:2000 αναγνωρίζει 4x10 4 PFUs ιού όπως και το anti-gd αντίσωμα, στην ίδια αραίωση. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από τη 2 η αφαίμαξη. 86

87 kda Σχήμα 18. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τον έλεγχο της ευαισθησίας των αντισωμάτων anti-gb και anti-gd σε διάφορες συγκεντρώσεις του ιού HSV-1 (KOS). Διαδρομή 1: 100 PFUs (αραίωση 1:2000) επωασμένα με anti-gb Διαδρομή 2: 4x10 2 PFUs (αραίωση 1:500) επωασμένα με anti-gb Διαδρομή 3: 2x10 3 PFUs (αραίωση 1:100) επωασμένα με anti-gb Διαδρομή 4: 8x10 3 PFUs (αραίωση 1:25) επωασμένα με anti-gb Διαδρομή 5: 4x10 4 PFUs (αραίωση 1:5) επωασμένα με anti-gb Διαδρομή 6: 2x10 5 PFUs επωασμένα με anti-gb Διαδρομή 7: 100 PFUs (αραίωση 1:2000) επωασμένα με anti-gd Διαδρομή 8: 4x10 2 PFUs (αραίωση 1:500) επωασμένα με anti-gd Διαδρομή 9: 2x10 3 PFUs (αραίωση 1:100) επωασμένα με anti-gd Διαδρομή 10: 8x10 3 PFUs (αραίωση 1:25) επωασμένα με anti-gd Διαδρομή 11: 4x10 4 PFUs (αραίωση 1:5) επωασμένα με antigd Διαδρομή 12: 2x10 5 PFUs επωασμένα με anti-gd Διαδρομή 13: μάρτυρες μοριακής μάζας. Γ.11. Έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-ORF60-His6 και GST- ORF68-His6 του VZV σε βακτήρια Tα πλασμίδια pxv60 και pxv68 παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον κ. X. Παναγιωτίδη, Aναπλ. Καθηγητή του τμήματος Φαρμακευτικής. Τα πλασμίδια αυτά περιέχουν τις περιοχές bp του γονιδίου ORF60 και του γονιδίου ORF68 κλωνοποιημένες στο πλασμίδιο palex, του οποίου ο χάρτης παρουσιάζεται στο κεφάλαιο των μεθόδων. Οι αμινοξικές περιοχές των αντίστοιχων πρωτεϊνών είναι aa και aa. Οι περιοχές αυτές είναι αντιγονικές και έχουν παραχθεί, στο παρελθόν, αντισώματα εναντίον τους από τον κ. Χ. Παναγιωτίδη. Οι πρωτεΐνες παράγονται συντηγμένες με το ένζυμο GST (glutathione S-transferase) στο αμινοτελικό άκρο και με μία ουρά 6 ιστιδινών στο καρβόξυ-τελικό άκρο. Επειδή η συγκέντρωση του πλασμιδίου pxv68 ήταν χαμηλή και δεν κατέστη δυνατή η μεταμόρφωση βακτηριακών στελεχών E. coli BL21[DE3], επιλέχθηκε, αρχικά, η μεταμόρφωση επιδεκτικών E. coli TOP10. Τα επιμολυσμένα βακτηριακά 87

88 κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία, επωάστηκαν στους 37 o C για ώρες και αναπτύχθηκαν αποικίες. Κατόπιν επελέγησαν 6 από αυτές για απομόνωση θετικού κλώνου και αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υγρό 2ΧΥΤ και αντιβιοτικό επιλογής (αμπικιλλίνη) στους 37 o C για ώρες. Στη συνέχεια απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA σε μικρή κλίμακα (mini prep) και έγινε έλεγχος ενσωμάτωσης των αλληλουχιών του γονιδίου ORF68 με τη χρήση των ενζύμων περιορισμού EcoRI και NotI. Το ένζυμο EcoRI κόβει στο 5 άκρο του ενθέματος και όχι σε άλλη περιοχή του πλασμιδιακού φορέα. Ενώ, το ένζυμο NotI κόβει επίσης μία φορά στo 3 του ενθέματος και όχι σε άλλη περιοχή του πλασμιδιακού φορέα. Έτσι στην πηκτή ηλεκτροφόρησης αγαρόζης θα εμφανιστούν: Στην περίπτωση αρνητικού κλώνου εμφανίζεται μία ζώνη στα 6150 bp (μέγεθος πλασμιδιακού φορέα) 26= 6124 bp και μία ζώνη στα 26 bp (δεν παρατηρείται), αφού η απόσταση των θέσεων κοπής για τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και NotI είναι 26 bp. Στην περίπτωση ενός θετικού κλώνου θα εμφανιστούν δύο ζώνες. Μία στα 6150 bp (μέγεθος πλασμιδιακού φορέα)και μία στα 414 bp (ένθεμα-insert). Μετά από επιτυχημένη κλωνοποίηση ταυτοποιήθηκαν 6 θετικοί κλώνοι για το γονίδιο ORF68 [ORF68(1), ORF68(2), ORF68(3), ORF68(4), ORF68(5), ORF68(6)], όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 19, με τη βοήθεια μαρτύρων DNA γνωστού μοριακού βάρους bp 6150 bp 564 bp 414 bp Σχήμα 19. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% για την επιβεβαίωση της παρουσίας θετικών κλώνων pxv68, μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και NotI. Διαδρομή 1: μάρτυρες, DNA λ φάγου κομμένο με HindIII Διαδρομές 2-7: θετικοί κλώνοι pxv68 [ORF68(1), ORF68(2), ORF68(3), ORF68(4), ORF68(5), ORF68(6)] μετά από πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα EcoRI και NotI. 88

89 Το απομονωμένο πλασμιδιακό DNA του θετικού κλώνου ORF68(4) χρησιμοποιήθηκε για τη μεταμόρφωση δεκτικών E. coli BL21[DE3] και Rosetta[DE3], προκειμένου να πραγματοποιηθεί παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης σε μικρή κλίμακα. Τα E. coli Rosetta[DE3] είναι βακτηριακά στελέχη που περιέχουν ένα επιπλέον πλασμίδιο, σε σχέση με τα E. coli BL21[DE3], που περιέχει κωδικόνια για την έκφραση συνώνυμων αμινοξέων που κωδικοποιούνται συχνά στον άνθρωπο. Επιπλέον, το πλασμίδιο αυτό περιέχει και μία περιοχή που κωδικοποιεί γονίδιο αντίστασης στην χλωραμφαινικόλη. Η επαγωγή σε όλες τις περιπτώσεις έγινε στους 37 o C με 1 mm IPTG. Ο έλεγχος της επαγωγής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο ελέγχου έκφρασης πρωτεϊνών που περιγράφηκε στη μεθοδολογία. Τα αποτελέσματα από τη βαφή με Coomassie της πηκτής πολυακρυλαμιδίου 12% SDS PAGE απεικονίζονται στο Σχήμα 20. Οι κλώνοι του ενδιαφέροντός μας ταυτοποιήθηκαν περαιτέρω και με τη βοήθεια της τεχνικής της ανοσοαποτύπωσης κατά western. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his που αναγνωρίζει εκλεκτικά το εξαπεπτίδιο His που εμπεριέχεται στον πλασμιδιακό φορέα palex και εκφράζεται συντηγμένο μαζί με τις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος (Σχήμα 20). Τo προσδοκώμενο μέγεθος του πρωτεϊνικού τμήματος, με υπολογιστικές μεθόδους, είναι Da. kda GST-ORF68-His 6 His 10- gd GST-His

90 kda GST-ORF68-His 6 His 10- gd GST-His 6 Σχήμα 20. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για την επιβεβαίωση της έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης GST-ORF68-His 6 και μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για την ανίχνευση της πρωτεϊνης GST-ORF68-His 6 με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 3: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη επαγώμενα κύτταρα E. coli BL21[DE3] στα οποία έχει εισαχθεί το πλασμίδιο palex Διαδρομή 4: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από επαγώμενα κύτταρα E. coli BL21[DE3] στα οποία έχει εισαχθεί το πλασμίδιο palex Διαδρομή 5: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 Διαδρομή 6: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gd (εσωτερικός μάρτυρας) Διαδρομή 7: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] Διαδρομή 8: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη επαγώμενα κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] στα οποία έχει εισαχθεί το πλασμίδιο palex Διαδρομή 9: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από επαγώμενα κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] στα οποία έχει εισαχθεί το πλασμίδιο palex Διαδρομή 10: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 Διαδρομή 11: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από επαγώμενα κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] στα οποία έχει εισαχθεί το πλασμίδιο palex. Το πλασμίδιο pxv60 χρησιμοποιήθηκε για τη μεταμόρφωση των βακτηριακών στελεχών E. coli BL21[DE3]. Η περαιτέρω διαδικασία επαγωγής σε μικρή κλίμακα και ελέγχου ήταν όμοια με αυτή που ακολουθήθηκε για τον κλώνο ORF68(4). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 21. Τo προσδοκώμενο μέγεθος του πρωτεϊνικού τμήματος, με υπολογιστικές μεθόδους, είναι Da. 90

91 kda GST-ORF60-His His 10 -gb kda GST-ORF60-His 6 His 10 -gb 25 Σχήμα 21. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για την επιβεβαίωση της έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης GST-ORF60-His 6 και μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για την ανίχνευση της πρωτεϊνης GST-ORF60-His 6 με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομές 2,3: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομές 4,5: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομές 6,7: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3]που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης His 10 -gb (εσωτερικός μάρτυρας). Γ.12. Επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνών GST-ORF60-His6 και GST-ORF68-His6 σε μεγάλη κλίμακα (500 ml) Ακολούθησε επαγωγή της έκφρασης των πρωτεϊνών GST-ORF60-His 6 και GST-ORF68-His 6 σε μεγάλη κλίμακα (500 ml) όπως περιγράφηκε στις μεθόδους. Η επαγωγή έγινε με χρήση IPTG σε τελική συγκέντρωση 0.5 mm για 4 ώρες στους 91

92 37 C. Ο προσδιορισμός της διαλυτότητας των πρωτεϊνών που μας ενδιαφέρουν πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε στη μεθοδολογία. Τα αποτελέσματα από την βαφή με Coomassie της πηκτής πολυακρυλαμιδίου 12% SDS PAGE απεικονίζονται στο Σχήμα 22. Από αυτά γίνεται αντιληπτό πως η πρωτείνη GST-ORF68-His 6 είναι διαλυτή, ενώ ένα μικρό τμήμα της σχηματίζει βακτηριακά έγκλειστα. Ως μάρτυρες χρησιμοποιούνται βακτηριακά εκχυλίσματα από μη μεταμορφωμένα E. coli BL21[DE3] και E. coli Rosetta[DE3] που υπέστησαν την ίδια επεξεργασία με τα μεταμορφωμένα κύτταρα. Οι κλώνοι του ενδιαφέροντός μας ταυτοποιήθηκαν περαιτέρω και με τη βοήθεια της τεχνικής του ανοσοαποτυπώματος κατά western. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his που αναγνωρίζει εκλεκτικά το εξαπεπτίδιο His, το οποίο εμπεριέχεται στον πλασμιδιακό φορέα palex και εκφράζεται συντηγμένο μαζί με τις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος (Σχήμα 22). Από τα αποτελέσματα έγινε αντιληπτό ότι δεν υπήρξε επαγωγή της έκφρασης της GST-ORF60-His 6 και η διαδικασία επαναλήφθηκε. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με τον ίδιο τρόπο και από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η πρωτεΐνη GST-ORF60- His 6 σχηματίζει βακτηριακά έγκλειστα (Σχήμα 23). kda Έγκλειστα Κυτταροπλασματικό Ολικό GST-ORF68-His

93 Έγκλειστα Κυτταροπλασματικό Ολικό kda 48 GST-ORF68-His Σχήμα 22. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της διαλυτότητας των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών GST-ORF60-His 6, GST-ORF68-His 6 και μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 3: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 4: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 5: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 6: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 7: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 8: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] Διαδρομή 9: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 Διαδρομή 10: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68- His 6 Διαδρομή 11: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] Διαδρομή 12: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 Διαδρομή 13: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 Διαδρομή 14: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli Rosetta[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 Διαδρομή 15: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 93

94 Ολικό Έγκλειστα kda 175 Ολικό Κυτταροπλασματικό Κυτταροπλασματικό Έγκλειστα kda GST-ORF60-His Σχήμα 23. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της διαλυτότητας της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης GST-ORF60-His 6 και μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-his. Διαδρομή 1: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 2: ολικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 3: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 4: κυτταροπλασματικό βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνών από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 5: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από μη μεταμορφωμένα κύτταρα E. coli BL21[DE3] Διαδρομή 6: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από κύτταρα E. coli BL21[DE3] που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 7: μάρτυρες μοριακής μάζας. Γ.13. Απομόνωση και καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων που σχηματίζει η πρωτεΐνη GST-ORF60-His6 Ακολούθησε καθαρισμός των βακτηριακών εγκλείστων που περιέχουν την πρωτεΐνη GST-ORF60-His6, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφηκε στις μεθόδους. Ένα τμήμα των καθαρισμένων εγκλείστων διαλυτοποιήθηκε σε 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS και τα εκχυλίσματα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% για να διαπιστωθεί η καθαρότητά τους. Η πηκτή μετά από χρώση με Coomassie απεικονίζεται στο Σχήμα

95 kda GST-ORF60-His Σχήμα 24. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της καθαρότητας των βακτηριακών εγκλείστων της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών εγκλείστων από μη μεταμορφωμένα κύτταρα Διαδρομή 3: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών μη καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 Διαδρομή 4: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 (2.5 μl) Διαδρομή 5: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 (5 μl) Διαδρομή 6: βακτηριακό εκχύλισμα πρωτεϊνικών καθαρισμένων εγκλείστων από κύτταρα που έχουν επαχθεί για παραγωγή πρωτεΐνης GST-ORF60-His 6 (10 μl). Γ.14. Καθαρισμός των πρωτεϊνών His10-gB, His10-gD, GST-ORF60-His6 και ORF68 με χρωματογραφία συγγένειας Η έκφραση των πρωτεϊνών His 10 -gb, His 10 -gd και GST-ORF60-His 6 σε E. coli οδηγεί στη συσσώρευσή τους σε βακτηριακά έγκλειστα, τα οποία μπορούν να απομονωθούν και να καθαριστούν με τη μεθοδολογία που περιγράφηκε προηγουμένως. Ο καθαρισμός και των τριών πρωτεϊνών έγινε με χρωματογραφία αγχιστείας με τη χρήση στήλης Ni-NTA αγαρόζης και κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (6 M υδροχλωρική γουανιδίνη, 8 Μ ουρία) όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο των μεθόδων. Μετά τον καθαρισμό ακολούθησε διαπίδυση, που διήρκησε 12 ώρες, για την απομάκρυνση της ουρίας και του ιμιδαζολίου σε περίσσεια διαλύματος. Το διάλυμα διαπίδυσης για την πρωτεΐνη GST-ORF60-His 6 περιείχε 20 mm Tris HCl ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.1 % Nonidet P-40, 1 mm DTT, 0.5 mm PMSF και 10% γλυκερόλη. Στην περίπτωση των 2 άλλων πρωτεϊνών το διάλυμα διαπίδυσης περιείχε 2 Μ ουρία για την αποφυγή δημιουργίας ιζήματος. Ο 95

96 προσδιορισμός των συγκεντρώσεων των καθαρισμένων πρωτεϊνών έγινε με τη χρήση της μεθόδου Bradford και οι τελικές συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών ήταν για την GST-ORF60-His mg/ml, για την His 10 -gb 1 mg/ml και για την His 10 -gd 0.25 mg/ml. Η καθαρότητα προσδιορίσθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% (Σχήμα 25). Στην περίπτωση της His 10 -gb ένα τμήμα της πρωτεΐνης σχημάτισε ίζημα μετά τη διαπίδυση ακόμη και παρουσία 2Μ ουρίας. Η πρωτεΐνη GST-ORF68-His 6 που είναι διαλυτή επιλέχθηκε να καθαριστεί πρώτα σε στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης και εν συνεχεία καθαρισμός Ni-NTA αγαρόζης κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες. Μετά τον καθαρισμό ακολούθησε διαπίδυση, που διήρκησε 12 ώρες για την απομάκρυνση του ιμιδαζολίου σε περίσσεια διαλύματος. Το διάλυμα διαπίδυσης περιείχε 20 mm Tris HCl ph 8.0, 100 mm NaCl, 0.5 mm DTT, 0.5 mm PMSF και 10% γλυκερόλη. Ο προσδιορισμός της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης έγινε με τη χρήση της μεθόδου Bradford και η τελική συγκέντρωση της GST-ORF60-His 6 ήταν 0.25 mg/ml. Η καθαρότητά της προσδιορίσθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% (Σχήμα 25). kda Σχήμα 25. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για τoν προσδιορισμό της καθαρότητας των πρωτεϊνών GST- ORF68-His 6, GST-ORF60-His 6, His10-gB, His10-gD. Διαδρομή 1: αδιάλυτο τμήμα της πρωτεΐνης His 10 -gb (10 μl) Διαδρομή 2: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομές 3,4: πρωτεΐνη GST-ORF68-His 6 (0.5 και 1 μg) Διαδρομές 5,6: πρωτεΐνη GST-ORF60-His 6 (0.5 και 1 μg) Διαδρομές 7,8: πρωτεΐνη His 10 -gb (0.5 και 1 μg) Διαδρομές 9,10: πρωτεΐνη His 10 -gd (0.5 και 1 μg). Από τα παραπάνω γίνεται φανερό ότι οι πρωτεΐνες GST-ORF60-His 6 και GST-ORF68-His 6 δίνουν ζώνες σε πολύ κοντινά μεγέθη, γεγονός που θα δημιουργούσε πρόβλημα στη διάκρισή τους στον πρότυπο ορολογικό έλεγχο. Έτσι 96

97 αποφασίστηκε ο εκ νέου καθαρισμός της GST-ORF68-His 6 και η κοπή της με τον παράγοντα Xa πάνω στη στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης, ώστε να απομακρυνθεί η πρωτεΐνη GST (27000 Da). Το διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν όγκου 1.5 ml και σύστασης: 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm Nacl, 2M CaCl 2, 2 μg παράγοντα Xa. ενώ ο όγκος της πακεταρισμένης στήλης ήταν 1 ml. Η επώαση έγινε πάνω στη χρωματογραφική στήλη για 3 ώρες αρχικά. Μετά την επώαση η στήλη φυγοκεντρήθηκε. Το υπερκείμενο που περιείχε την κομμένη πρωτεΐνη ORF68-His 6, καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη Ni-NTA αγαρόζης, ώστε μετά την έκλουση να παραληφθεί η κομμένη πρωτεΐνη ORF68-His 6 μεγέθους Da. Το flow through που περιείχε τον παράγοντα Xa επανατοποθετήθηκε στη στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης ώστε να συνεχιστεί η κοπή για 18 ακόμη ώρες σε περίπτωση που είχε μείνει άκοπη πρωτεΐνη GST-ORF68-His 6 πάνω στη στήλη. Στη συνέχεια, ακολούθησε φυγοκέντρηση και καθαρισμός του υπερκειμένου με χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη Ni-NTA αγαρόζης. Τελικά, παραλήφθηκαν 3 κλάσματα που περιείχαν την κομμένη ORF68-His 6 καθώς και ποσότητα άκοπης πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 (Σχήματα 26,27). Οι συγκεντρώσεις των κλασμάτων ήταν 0.3 mg/ml, 0.2 mg/ml και 0.2 mg/ml, αντίστοιχα. Από τη στήλη γλουταθειόνηςαγαρόζης εκλούστηκαν στη συνέχεια οι GST και GST-ORF68-His 6 που είχαν παραμείνει προσκολλημένες (Σχήμα 26-διαδρομή 2). Επίσης δοκιμάστηκε να γίνει κοπή της πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 πάνω στη στήλη Ni-NTA αγαρόζης. Σ αυτή την περίπτωση μετά την κοπή και την φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο περιείχε GST (Σχήμα 26-διαδρομή 3), ενώ στη στήλη παρέμειναν ORF68-His 6 και GST-ORF68- His 6 που παραλήφθηκαν κατά την έκλουση με ιμιδαζόλιο (Σχήμα 26-διαδρομή 4). Το ποσοστό της άκοπης πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 ήταν πολύ μεγάλο και η διαδικασία διακόπηκε σε αυτό το στάδιο. 97

98 GST-ORF68-His 6 GST ORF68-His Σχήμα 26. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 15% για τoν προσδιορισμό των προϊόντων της κοπής της πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 με τον παράγοντα Xa. Διαδρομή 1: Ολική πρωτεΐνη πριν τον καθαρισμό με στήλη χρωματογραφίας Διαδρομή 2: κλάσμα έκλουσης από τη στήλη γλουταθειονης-αγαρόζης Διαδρομή 3: πρωτεΐνη (υπερκείμενο) μετά την κοπή σε στήλη Ni-NTA αγαρόζης Διαδρομή 4: προϊόντα κοπής από τη στήλη Ni-NTA αγαρόζης μετά την έκλουση με ιμιδαζόλιο Διαδρομή 5: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομές 6,7: προϊόντα κοπής διάρκειας 3 ωρών (κλάσματα 1,2) Διαδρομή 8: προϊόντα κοπής διάρκειας 18 ωρών (κλάσμα 3). kda A B GST-ORF68-His ORF68-His Σχήμα 27. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τoν προσδιορισμό των προϊόντων της κοπής της πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6 με τον παράγοντα Xa. A) Χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-his που αναγνωρίζει την ουρά των 6 ιστιδινών. B) Χρήση του πολυκλωνικού αντισώματος anti-orf68. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: ολική πρωτεΐνη πριν τον καθαρισμό με στήλη χρωματογραφίας Διαδρομή 3: προϊόντα κοπής από τη στήλη Ni-NTA αγαρόζης μετά την έκλουση με ιμιδαζόλιο Διαδρομές 4,5: προϊόντα κοπής διάρκειας 3 ωρών (κλάσματα 1,2) Διαδρομή 6: προϊόντα κοπής διάρκειας 18 ωρών (κλάσμα 3). 98

99 Τα τρία κλάσματα που περιείχαν την ORF68-His 6 και ένα μικρό ποσοστό GST-ORF68-His 6 ενώθηκαν και ακολούθησε διαπίδυση σε περίσσεια όγκου διαλύματος 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 0.5 mm DTT και 0.5 mm PMSF. Μετά τη διαπίδυση ακολούθησε καθαρισμός με στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης με την προοπτική η στήλη να κρατήσει την GST-ORF68-His 6 αλλά όχι την ORF68-His 6 που θα βρίσκεται στο flow-through. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στο flow-through προσδιορίστηκε στα 0.15 mg/ml και ακολούθησε διαπίδυση σε 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 100 mm NaCl, 0.5 mm DTT, 0.5 mm PMSF και 10% γλυκερόλη. Η αναλογία ORF68-His 6 /GST-ORF68-His 6 προσδιορίστηκε μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 15% (Σχήμα 28). kda GST-ORF68-His ORF68-His Σχήμα 28. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 15% για τoν προσδιορισμό της αναλογίας ORF68-His6/GST- ORF68-His6 μετά τον καθαρισμό με τη στήλη γλουταθειόνης-αγαρόζης. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: flow-through από τη στήλη γλουταθειόνηςαγαρόζης Διαδρομή 3: κλάσμα έκλουσης από τη στήλη γλουταθειονης-αγαρόζης. Όπως γίνεται φανερό από το κλάσμα έκλουσης, η στήλη δεν συγκράτησε παρά ελάχιστο ποσοστό άκοπης πρωτεΐνης GST-ORF68-His 6. Για να διαχωριστεί η ORF68-His 6 από την GST-ORF68-His 6 αποφασίστηκε να πραγματοποιηθεί χρωματογραφία μοριακής διήθησης ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες με βάση το μέγεθός τους. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Sephadex G-75, 37cm που 99

100 εξισορροπήθηκε με διάλυμα διαπίδυσης. Τα λεπτομερή στάδια της διαδικασίας περιγράφονται στο κεφάλαιο με τις μεθόδους. Από τη στήλη συλλέχθηκαν 30 κλάσματα των 2 ml. Τα πρώτα 10 αντιπροσωπεύουν τον νεκρό όγκο που δεν περιέχει πρωτεΐνες. Από τα κλάσματα 9 ως 30 επιλέχθηκαν τα 12 και ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 15%, ακολούθησε μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοαποτύπωμα western blot, ώστε να προσδιοριστεί το προφίλ του διαχωρισμού. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 29. kda GST-ORF68-His ORF68-His Σχήμα 29. Μέθοδος ανοσοαπoτύπωσης (western blot) για τoν προσδιορισμό του προφίλ του διαχωρισμού της ORF68-His 6 από την GST-ORF68-His 6 μετά από χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Χρήση του πολυκλωνικού αντισώματος anti-orf68. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: κλάσμα 9 Διαδρομή 3: κλάσμα 11 Διαδρομή 4: κλάσμα 13 Διαδρομή 5: κλάσμα 15 Διαδρομή 6: κλάσμα 17 Διαδρομή 7: κλάσμα 19 Διαδρομή 8: κλάσμα 21Διαδρομή 9: κλάσμα 23 Διαδρομή 10: κλάσμα 25 Διαδρομή 11: κλάσμα 27 Διαδρομή 12: κλάσμα 29 Διαδρομή 13:. κλάσμα 30 Τα κλάσματα 23 ως 30 φαίνεται να περιέχουν επαρκή ποσότητα ORF68-His 6 και αμελητέα ποσότητα GST-ORF68-His 6. Αυτά ενώθηκαν και ακολούθησε χρωματογραφία συγγένειας με τη χρήση στήλης Ni-NTA αγαρόζης για να συμπυκνωθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης. Από τη στήλη συλλέχθηκαν 10 κλάσματα των 300 μl και μικρή ποσότητα από αυτά ηλεκτροφορήθηκε, και ακολούθησε μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοαποτύπωμα western blot για να προσδιοριστούν αυτά που περιέχουν την καθαρή ORF68-His 6. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα

101 kda ORF68-His Σχήμα 30. Μέθοδος ανοσοαπoτύπωσης (western blot) για τoν προσδιορισμό των κλασμάτων που περιέχουν την πρωτεΐνη ORF68-His 6 μετά τη χρωματογραφία συγγένειας με τη χρήση στήλης Ni-NTA αγαρόζης. Χρήση του πολυκλωνικού αντισώματος anti-orf68. Διαδρομή 1: μάρτυρες μοριακής μάζας Διαδρομή 2: κλάσμα 1 Διαδρομή 3: κλάσμα 2 Διαδρομή 4: κλάσμα 3 Διαδρομή 5: κλάσμα 4 Διαδρομή 6: κλάσμα 5 Τα κλάσμα 2,3,4 περιέχουν επαρκή πρωτεΐνη ORF68-His 6. Τα κλάσματα αυτά ενώθηκαν και προστέθηκε στο τελικό διάλυμα αντίστοιχη ποσότητα διαλύματος επιστοίβαξης SDS 5x ώστε να προκύψει τελική συγκέντρωση 1x. Γ.15. Δημιουργία μίγματος που περιέχει και τις 4 πρωτεΐνες (GST-ORF60-His6, ORF68-His6, His10-gB, His10-gD) και δημιουργία των διαγνωστικών ταινιών (strips) Αφού παραλήφθηκαν οι 4 πρωτεΐνες και προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις τους, καθώς και η εικόνα που δίνουν κατά την τεχνική ανοσοαποτυπώματος western blotting, δημιουργήθηκε ένα μίγμα όγκου 591 μl που περιείχε 200 μl ORF68-His 6 σε 1x διαλύματος επιστοίβαξης SDS, 77 μl GST-ORF60-His 6 (0.1 mg/ml) σε 1x διαλύματος επιστοίβαξης SDS, 14.5 μl His 10 -gd (0.2 mg/ml) σε 1x διαλύματος επιστοίβαξης SDS, 4 μl His 10 -gb (0.5 mg/ml) σε 1x διαλύματος επιστοίβαξης SDS και μl διαλύματος επιστοίβαξης SDS 1.5x. Από το μίγμα αυτό ηλεκτροφορήθηκαν ποσότητες των 5 και 10 μl σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12%, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ακολούθησε η τεχνική ανοσοαποτυπώματος western blotting χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα πολυκλωνικά αντισώματα. Τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν κάθε ένα χωριστά για να προσδιοριστεί τυχόν μη ειδική αναγνώριση, αλλά και σε κοινό 101

102 διάλυμα. Μόνο στην περίπτωση του anti-orf68 αντισώματος αναγνωρίζεται και η GST-ORF60-His 6. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα πολυκλωνικά αυτά αντισώματα αναγνωρίζουν τον GST επίτοπο που συμπεριλαμβάνεται στην GST-ORF60-His 6. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 31. Anti-gD Anti-gB Anti-ORF60 Anti-ORF68 Μίγμα αντισωμάτων 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000 Σχήμα 31. Μέθοδος ανοσοαπoτυπώματος (western blot) για τον προσδιορισμό του προφίλ του μίγματος των τεσσάρων πρωτεϊνών. Χρήση των πολυκλωνικών αντισωμάτων anti-gd, anti-gb, anti- ORF60, anti-orf68. Γ.16. Διαγνωστικός ορολογικός έλεγχος για την παρουσία μολύνσεων από τους ιούς HSV-1 και VZV Κάθε μία από τις πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος αραιώθηκε ξεχωριστά ως εξής: ORF68-His 6 : 150 μl σε 150 μl 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS His 10 -gb: 50 μl (0.5 mg/ml) σε 250 μl 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS His 10 -gd: 30 μl (0.2 mg/ml) σε 270 μl 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS GST-ORF60- His 6 : 60 μl (0.1 mg/ml) σε 240 μl 1.5x διαλύματος επιστοίβαξης SDS Από κάθε πρωτεΐνη ηλεκτροφορήθηκε ποσότητα 10 μl σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12%. Η σειρά με την οποία τοποθετήθηκαν τα δείγματα στην πηκτή ήταν ORF68-His 6, His 10 -gb, His 10 -gd, GST-ORF60-His 6, μάρτυρες μοριακού βάρους με σκοπό να δημιουργηθούν μοριακές ταινίες που να περιέχουν τις 5 αντίστοιχες διαδρομές. Ακολούθησε η τεχνική ανοσοαποτυπώματος western blotting χρησιμοποιώντας ως πρώτα αντισώματα ανθρώπινους ορούς (σε αραίωση 1:50) που 102

103 παραλήφθηκαν από εθελοντές με την βοήθεια της κυρίας Εύης Μπούρα. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τα αντίστοιχα πολυκλωνικά αντισώματα. Ως δεύτερο αντίσωμα στην περίπτωση των ορών χρησιμοποιήθηκε αντι-ορός που αναγνωρίζει ανοσοσφαιρίνες IgG του ανθρώπου (σε αραίωση 1:2000), ενώ στην περίπτωση των μαρτύρων χρησιμοποιήθηκε αντι-ορός που αναγνωρίζει ανοσοσφαιρίνες του κουνελιού (σε αραίωση 1:2000). Ακολούθως παρουσιάζονται κάποια ενδεικτικά αποτελέσματα από την εμφάνιση των μοριακών ταινιών (Σχήμα 32). -GST-ORF60-His 6 -His 10 -gd -His 10 -gb -GST-ORF60-His 6 -His 10 -gd -His 10 -gb -GST-ORF60-His 6 -His 10 -gd -His 10 -gb -ORF68- His 6 -ORF68- His 6 -ORF68- His 6 μάρτυρας GST-ORF60- His 6 -His 10 -gd -His 10 -gb -GST-ORF60- His 6 -His 10 -gd -His 10 -gb - GST-ORF60- His 6 - His 10 -gd - His 10 -gb -ORF68- His 6 -ORF68-His 6 - ORF68- His Σχήμα 32. Ενδεικτικά αποτελέσματα μοριακών ταινιών. 103