ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ Gene Cloning (T.A. Brown) Σελίδες (1-245)

Transcript

1 ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ Gene Cloning (T.A. Brown) Σελίδες (1-245) Ανασυνδυασμένο DNA Κεφάλαιο 4 Κεφάλαιο 6 [εκτός σελίδες: , ] Κεφάλαιο 10 [σελίδες ] Κεφάλαιο 13 [σελίδες: ]

2 Εισαγωγή (Silencer) polya + RTFs TFs RTFs Transcription polya + Cap-- 5 UTR 3 UTR --polya Processing RFs Cap-- 5 UTR 3 UTR --polya Ρύθμιση Λειτουργία Διαγνωστική Φαρμακευτικά, Γεωργικά, Βιομηχανικά, Προϊόντα Γονιδιακή θεραπεία Translation N-- Processing N-- RFs --C RFs --C

3 F-1.1, 1.2

4 Ένζυμα περιορισμού F-4.8

5 Ένζυμα περιορισμού Πίνακας 4.1 Λεία άκρα 5 μονόκλωνα άκρα 3 μονόκλωνα άκρα Τα περισσότερα ένζυμα είναι ομοδιμερή αναγνωρίζουν παλίνδρομες αλληλουχίες

6 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης F-4.16

7 Χαρτογράφηση DNA A Β Β A

8 Ένζυμα περιορισμού Ένζυμο Αλληλουχία Προϊόν Μονόκλωνα άκρα EcoRI / FunII GAATTC GAATTC CTTAAG 5 -AATT Ισοσχιζομερή Ένζυμο Αλληλουχία Προϊόν Μονόκλωνα άκρα BamHI GGATCC GGATCC CCTAGG BglII AGATCT AGATCT TCTAGA BclI TGATCA TGATCA ACTAGT Sau3AI NGATCN NGATCN NCTAGN 5 -GATC 5 -GATC 5 -GATC 5 -GATC Συμβατά άκρα

9 Σύνδεση τμημάτων DNA Εικόνα 4.2

10 Σύνδεση DNA F-4.19, 4.20

11 F & 3 5 έξω DNA Πολυμεράσες 5 T4 DNA πολυμεράση 3 5 έξω

12 Klenow DNA πολυμεράση Ι 3 έξω 5 έξω

13 Τροποποιητικά ένζυμα F-4.3,

14 Linkers (Συνδέτες) F-4.21, 4.22

15 Adaptors (Προσαρμοστές) F-4.23, 4.25

16 Πλασμίδια F-2.3

17 Τεχνητά πλασμίδια F-5.9, 6.4

18 Επιλογή ανασυνδυασμένων πλασμιδίων ΕΙΚΟΝΑ 4.9

19 Καθαρισμός DNA ή RNA Υδρόφιλα μόρια Νουκλεϊκά οξέα Πρωτεΐνες Υδατική φάση + 2Χ EtOH Φυγοκέντριση Υδρόφοβα μόρια Νουκλεϊκά οξέα

20 Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA ΕΙΚΟΝΑ 4.4

21 Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA ΕΙΚΟΝΑ 4.4

22 ΕΙΚΟΝΑ 4.5 Τα πέντε βασικά βήματα της κλωνοποίησης DNA

23 ΠΙΝΑΚΑΣ 4.5 Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης (λ)

24 Φάγος λ F-2.10, 5.12

25 Κύκλος του λ

26 F-3.19, 3.20 Απομόνωση λ

27 F-6.14, 6.16 (cdna βιβλιοθήκη) Τεχνητοί λ Ανασυνδυασμένοι λ kb DNA up to 10 Kb π

28 Τεχνητοί λ F-6.17 (γονιδιωματική βιβλιοθήκη) 21 kb 19 kb 9 kb 19 kb 9 kb

29 Συσκευασία λ in vitro F-5.11

30 Γονιδιωματική βιβλιοθήκη 19 kb 21 kb 9 kb

31 F-6.19 Κοσμίδια (40-45 Kb)

32 F-7.7, 7.8 Τεχνητά χρωμοσώματα ( kb) Κόκκινες αποικίες Μετασχηματισμός σε Κύτταρα ζύμης TRPI -, URA3 - (άσπρες αποικίες)

33 Μέγεθος Βιβλιοθηκών (235) (114) ( ) ( )

34 Φάγος Μ13 F-5.12

35 Κύκλος του Μ13 Plus strand T I I I T T I I

36 Απομόνωση Μ13 F-3.21

37 Τεχνητοί Μ13 F-6.6, 6.7 P Max 1.5 kb E E2 E E1 + +

38 Phagemids - pbluescript T I + helper Μονόκλωνο DNA έως 3 Kb Β-gal α-fragment Nt 60 αα GTA 5

39

40 Ανάλυση DNA κατά Southern ΕΙΚΟΝΑ 4.11

41 F-8.10 Σήμανση DNA - Ιχνηθέτης

42 Χαρτογράφηση γονιδίων (FISH)

43 Αλληλούχιση DNA ΕΙΚΟΝΑ 4.12

44 Αλληλούχιση DNA ΕΙΚΟΝΑ 4.12

45 ΕΙΚΟΝΑ 10.10: Δομές διδεοξυριβονουκλεοτιδίων (ddntp) σεσημασμένων με φθορίζουσες χημικές ομάδες.

46 ΕΙΚΟΝΑ 10.11, 13: Αυτοματοποιημένη αλληλούχιση.

47 EIKONA 10.7: Η εισαγωγή ρομποτικών συσκευών αύξησε σημαντικά την παραγωγικότητα των προγραμμάτων αλληλούχισης γονιδιωμάτων. Βιβλιοθήκη Bac DNA ανθρώπου (3Χ 10 9 ) 10 2 τρυβλία 10 3 αποικίες (10 5 bp) 10 2 καλλιέργειες δείγματα DNA 10 2 αντιδράσεις

48 ΕΙΚΟΝΑ 10.3: Αλληλούχιση του γονιδιώματος με βάση ένα χάρτη αλληλεπικαλυπτόμενων κλώνων.

49 ΕΙΚΟΝΑ 11.9: Η ανάλυση αποτυπωμάτων χρησιμοποιείται για τη χαρτογράφηση και τη συναρμολόγηση κλώνων τεχνητών χρωμοσωμάτων βακτηρίων (BAC).

50 ΕΙΚΟΝΑ 4.14 Τεχνική PCR.

51 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων DNA κατά την PCR. ΕΙΚΟΝΑ 4.15

52 Πιστότητητα ~5Χ10 7 Πιστότητητα ~10 6

53 PCR cloning F-9.12, 9.13, 9.14

54 Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) 3 RACE cdna V 5 V=A/G/C V 5 V TTTT 5

55 Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) cdna 5 5 Terminal deoxynucleotidyl transferase 5 RACE V=A/G/C V 5 3 5

56 Inverted PCR

57 ΕΙΚΟΝΑ 4-6: Απομόνωση πολυ(α) mrna.

58 +1 F-11.5 Xbp Προσδιορισμός του Xbp autoradiography M Δ _

59 F-11.7 Ανάλυση RNA κατά Northern

60 RT-PCR

61 PCR πραγματικού χρόνου ΕΙΚΟΝΑ 4.17

62 PCR πραγματικού χρόνου ΕΙΚΟΝΑ 4.17 (Χ10)

63 In vitro μεταγραφή RE1 RE2 Sense or ant-sense RNA In vitro translation Northern analysis In situ hybridization Knock Down

64 Ολικό mrna In vitro μετάφραση F11.19, 11.20

65 Ρύθμιση και λειτουργία των γονιδίων F-11.16, Μεταλλάξεις Μεταλλάξεις

66 F In vitro μεταλλαξιγένεση

67 Κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις F CAT (his).. GTA A- G A- G A- -T C- -G

68 Κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις ΕΙΚΟΝΑ 6.3

69 ---- Κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις ΕΙΚΟΝΑ 6.3

70 Αλληλεπιδράσεις Πρωτεϊνών-DNA

71 Αλληλεπιδράσεις Πρωτεϊνών-DNA Extract Antibody Competitor 100Χ Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

72 Αλληλεπιδράσεις Πρωτεϊνών-DNA Ιχνηλάτηση περιοχής πρόσδεσης

73 Αλληλεπιδράσεις Πρωτεϊνών-DNA Ιχνηλάτηση Θέσεων Πρόσδεσης

74 Απομόνωση ρυθμιστικών παραγόντων (Βιβλιοθήκη έκφρασης)

75 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών cdna library Bait BD Target AD

76 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών Επιλογή

77 Μετασχηματισμός ζωϊκών κυττάρων Μέθοδος Φωσφορικού ασβεστίου (Neo gene)

78 Μετασχηματισμός ζωϊκών κυττάρων ΕΙΚΟΝΑ 6.8 Μέθοδος ηλεκτροδιάτρησης

79 Μετασχηματισμός ζωϊκών κυττάρων ΕΙΚΟΝΑ 6.9 Μέθοδος λιποσωμάτων

80 Μετασχηματισμός με ρετροϊούς ΕΙΚΟΝΑ 6.12 Ενσωμάτωση στο γονιδίωμα ψ Γονίδια επιλογής ΓG0 ψ

81 Μετασχηματισμός με ρετροϊούς ΕΙΚΟΝΑ Αντίστροφη Μεταγραφάση

82 Μετασχηματισμός σε θηλαστικά (ποντικούς) ΕΙΚΟΝΑ 6.14 Ορμονική θεραπεία- Υπερωορρηξία Κατάλληλοι υποκινητές Ετερόλογος ανασυνδιασμός

83 Μετασχηματισμός σε θηλαστικά (ποντικούς) ΕΙΚΟΝΑ 6.14 (Ορμονική θεραπεία - Διασταυρωμένη με στείρα αρσενικά) Ιδρυτής (+/-) 5-10% Διασταύρωση ενός ιδρυτή με θηλυκά (-/-) και επιλογή(+/-) απογόνων με PCR Ετερόζυγη σειρά (+/-)

84 Μετασχηματισμός σε θηλαστικά (ποντικούς) ΕΙΚΟΝΑ 6.14 Αρσενικά (+/-) Χ Θηλυκά (+/-) (PCR) (+/-) (+/-) (+/+) (-/-) (+/-) X (-/-) (+/-):(-/-)=1:1 (PCR) (+/+) X (-/-) (+/-) (PCR) (+/+) X (+/+) Ομόζυγη σειρά

85 Ομόλογος ανασυνδυασμός Μέθοδος βλαστοκυττάρων ΕΙΚΟΝΑ 6.16 Μαύρα ποντίκια Μετασχηματισμός επιλογή

86 Ομόλογος ανασυνδυασμός Μέθοδος βλαστοκυττάρων ΕΙΚΟΝΑ 6.16 (Ινοβλάστες) Από λευκό θηλυκό Εμφύτευση σε θετή μητέρα? Χ Λευκό Μετασχηματισμός Γαμέτες Επιλογή μαύρων απογόνων (ετερόζυγα) Επιλογή Επιλογή μαύρων απογόνων (ομόζυγα)

87 Στοχευμένη αδρανοποίηση γονιδίων (Knockout) Στοχευμένη αντικατάσταση γονιδίου ΕΙΚΟΝΑ Θετική/αρνητική επιλογή

88 Μετασχηματισμός στα έντομα

89 Μετασχηματισμός στα έντομα Ετερόζυγη σειρά

90 Συστήματα έκφρασης διαγονιδίων Συστατικά συστήματα Συστατικός Υποκινητής Γονίδιο (Υπ. Ακτίνης) Επαγώγιμα συστήματα Επαγώγιμος Υποκινητής Γονίδιο (Υπ. Hsp70) Ιστο-ειδικά συστήματα Ιστοειδικός Υποκινητής Γονίδιο (GAL4) Επαγώγιμα συστήματα με ελεγχόμενη έκφραση (Συστήματα Tet-off/on)

91 Συστήματα ιστοειδικής έκφρασης (GAL4/UAS) GFP β-gal

92 Συστήματα χρονοειδικής έκφρασης (Tet-off/on) TN10 Επαγωγέας T TetO R T R T Gene Gene

93 Μέτρηση των επιπέδων mrna με στύπωμα κουκκίδας και υβριδοποίηση. ΕΙΚΟΝΑ 13.1

94 Mικροσυστοιχίες DNA ΕΙΚΟΝΑ /cm 2 ~ 1m 2

95 Ανάλυση μεταγραφημάτων Mικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων Σ-84

96 /cm 2 Σ-85

97 cdn A Σ-86

98 Ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA

99 Πρωτεομική

100

101 Unknown protein Protease digestion P1 P2 P3 P4 MALDI-TOF Search Database Candidate protein Digestion Simulation m/z Calculate Mol wt MW4 MW2 MW3 MW1 MW4 MW2 MW3 MW1 peptide mass fingerprinting (PMF)