ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΠΣ «ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΊΑ» «Μελέτη της διαδικασίας της αναπνευστικής έκρηξης (respiratory burst)

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΠΣ «ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΊΑ» «Μελέτη της διαδικασίας της αναπνευστικής έκρηξης (respiratory burst) σε αιμοκύτταρα μυδιού του είδους Mytilus galloprovincialis, μετά από έκθεση σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις του ιοντικού υγρού [omim][bf 4 ].» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μπελαβγένη Αλεξία (Α.Μ ) ΠΑΤΡΑ

2 Τριμελής Επιτροπή Επιβλέπων Καθηγητής Γεωργίου Χρήστος (Καθηγητής), Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Γενετικής Βιολογίας κυττάρου & Ανάπτυξης, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλη Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Νταϊλιάνης Στέφανος (Επίκουρος καθηγητής), Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βιολογίας Ζώων, Πανεπιστήμιο Πατρών Βλαστός Δημήτρης (Επίκουρος Καθηγητής), Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

3 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών (ΜΠΣ) του Τμήματος Βιολογίας (Κατεύθυνση Βιολογική Τεχνολογία) στο εργαστήριο Ζωολογίας (Μονάδα Οικοτοξικολογίας και Μελέτης της Ρύπανσης), του τομέα Βιολογίας Ζώων, του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντά μου, κ. Χρήστο Γεωργίου, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας (Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης) που με βοήθησε στο να αναπτύξω σωστή επιστημονική σκέψη. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή κ. Στέφανο Νταϊλιάνη, που μου δίδαξε πώς να προσεγγίζω επιστημονικά ζητήματα και μέσω των εποικοδομητικών συμβουλών του συνέβαλε στο να αποκτήσω ένα διαφορετικό τρόπο σκέψης. Εκτός των άλλων, η καθοδήγησή του και η βοήθεια που μου προσέφερε καθ όλη την πορεία μου στο εργαστήριο ήταν σημαντική. Η συμβολή του κ. Βλαστού Επίκουρου Καθηγητή (Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανεπιστήμιο Πατρών) ήταν πολύτιμη για την ολοκλήρωση της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κα. Γεωργία Στεφάνου, Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας (Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης), για την ευγενική παραχώρηση του εργαστηριακού εξοπλισμού προκειμένου να διεξαχθούν τα πειράματα της τεχνικής ανάλυσης Κομητών (Comet Assay). Κλείνοντας, θα ήθελα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου που ήταν συνέχεια στο πλευρό μου και με στήριξε σε όλες μου τις αποφάσεις. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πίνακας περιεχομένων ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT... 7 Συντομογραφίες Abbreviations Εισαγωγή Τα ιοντικά υγρά Ορισμός Διαχωρισμός των ILs Τα κυριότερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των ILs Οι εφαρμογές των ILs Ιοντικά υγρά: «Πράσινη Χημεία»; Κανονισμοί περί της αξιολόγησης της τοξικότητας των ILs Αξιολόγηση της τοξικότητας των ILs Το δίθυρο θαλάσσιο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis και η χρήση του ως οργανισμός «βιοενδείκτης» Γενικά χαρακτηριστικά του είδους Το είδος Mytilus galloprovincialis ως οργανισμός «βιοενδείκτης» Αιμόλεμφος/αιμοκύτταρα δίθυρων μαλακίων Η αναπνευστική έκρηξη και τα ένζυμα που εμπλέκονται σε αυτή Φαγοκυττάρωση Δείκτες καταπόνησης (δείκτες stress ή βιομάρτυρες) στα δίθυρα μαλάκια Διαταραχές φυσιολογικής ομοιόστασης και ξενοβιοτικές ουσίες Κυτταροτοξικές επιπτώσεις Αποσταθεροποίηση της λυσοσωμικής μεμβράνης των αιμοκυττάρων Φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (stress) Tο σουπεροξειδικό ανιόν (Ο2 - ) Παραγωγή οξειδίων του αζώτου (NOx) Λιπιδική υπεροξείδωση Γενοτοξικές επιπτώσεις στα αιμοκύτταρα των μυδιών Σκοπός της παρούσας μελέτης ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια και διαλύματα Σχεδιασμός πειραματικής διαδικασίας Εγκλιματισμός μυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis Λήψη και χειρισμός αιμολέμφου για in vitro πειράματα

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εκτίμηση της σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης σε αιμοκύτταρα των μυδιών, μετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις [omim][βf4] Πειραματική διαδικασία έκθεσης αιμοκυττάρων σε [omim][βf4], απουσία ή παρουσία αναστολέων Προσδιορισμός σουπεροξειδικών ανιόντων Ανίχνευση NO στα αιμοκύτταρα των μυδιών Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, μέσω προσδιορισμού των επιπέδων της MDA στα αιμοκύτταρα των μυδιών M. galloprovincialis Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών Προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης στα δείγματα κάθε ομάδας έκθεσης Στατιστική ανάλυση των δεδομένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσδιορισμός των υποθανατογόνων συγκεντρώσεων του [omim][bf4] Προσδιορισμός των επιπέδων των O2 - και NO στα αιμοκύτταρα των μυδιών Προσδιορισμός των επιπέδων MDA στα αιμοκύτταρα των μυδιών Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών ΣΥΖΗΤΗΣΗ Κυτταροτοξικές επιπτώσεις του [omim][bf4] Οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις της έκθεσης των αιμοκυττάρων σε [omim][bf4] Ο ρόλος της PI3-κινάσης και της αναπνευστικής έκρηξης στην επαγωγή των οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων του [omim][bf4] Συμπεράσματα Βιβλιογραφία

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της ικανότητας του ιοντικού υγρού [omim][bf4] να επάγει κυτταροτοξικά, οξειδωτικά και γενοτοξικά φαινόμενα σε αιμοκύτταρα των δίθυρων μαλακίων του είδους Mytilus galloprovincialis, καθώς επίσης και την πιθανή ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης, της NO συνθετάσης και της κινάσης της φωσφοϊνοσιτόλης 3 (PI3-κινάση), μέσω της χρήσης ειδικών αναστολέων (10 μμ DPI, 10 μμ L-NAME and 50 nm wortmannin, αντίστοιχα). Συγκεκριμένα, αιμοκύτταρα μυδιών που εκτέθηκαν για 1 h σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις του [omim][bf4] (1 mg L -1 ), εμφάνισαν σημαντική αποσταθεροποίηση των λυσοσωμικών τους μεμβρανών (μέθοδος ουδέτερου ερυθρού/nru), παραγωγή σουπεροξειδικών ανιόντων (O2 - ) και οξειδίων του αζώτου (NO), υπεροξείδωση λιπιδίων (εκφραζόμενη ως συγκέντρωση της μηλονικής διαλδεΰδης/mda), καθώς και διαταραχή της ακεραιότητας του γενετικού τους υλικού (DNA damage). Έκθεση των αιμοκυττάρων σε 1 mg L -1 [omim][bf4] παρουσία των αναστολέων έδειξε σημαντική μείωση των οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων του ιοντικού υγρού. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης και NO συνθετάσης μπορεί εν μέρει να σχετίζεται με τις τοξικές επιπτώσεις του ιοντικού υγρού, ενώ η παράλληλη ενεργοποίηση της PI3-κινάσης υποδεικνύει την επαγωγή σηματοδοτικών μορίων που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του μηχανισμού της αναπνευστικής έκρηξης και την επιβίωση των εκτιθέμενων κυττάρων. 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT The aim of the present study was to investigate the ionic liquid [omim][bf4]-mediated toxic potency, in terms of its ability to induce cytotoxic, oxidative and genotoxic effects, in hemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis, via the stimulation of the main enzymes of the respiratory burst mechanism (NADPH oxidase, NO synthase and phosphatidyloinositol-3-oh-kinase/pi3-kinase). Specifically, mussel hemocytes primarily exposed for 1 h to different concentrations of [omim][bf4] ( mg L -1 ) showed a dose-dependent increase of cell death (measured with the use of the neutral red uptake method), with mortality >50% to be enhanced after exposure to [omim][bf4] at concentrations higher than 1 mg L -1. Moreover, mussel hemocytes exposed to sub-lethal concentrations of [omim][bf4] (1 mg L -1 ) showed increased levels of both superoxide and nitric oxide (in terms of nitrites) anions, as well as significantly increased levels of lipid peroxidation and DNA damage. On the other hand, hemocytes pre-treated for a period of 15 min with (a) NADPH oxidase inhibitor (DPI 10 μμ), (b) NO synthase inhibitor (L-NAME 10 μμ) as well as (c) wortmannin (at concentration of 50 nm, a known covalent PI3-k inhibitor due to its highly reactive C20 carbon), showed a significant attenuation of [omim][bf4]-mediated effects in all cases, thus indicating the involvement of both PI3-k and respiratory burst enzymes (NADPH oxidase and NO synthase) in the [omim][bf4]-mediated mode of action. 7

8 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ Συντομογραφίες Abbreviations 1-methyl-3-octylimidazolium tetrafluoroborate [omim][bf4] 3-κινάση της φωσφοϊνοσιτόλης Phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase) Απρωτικά ιοντικά υγρά Aprotic Ionic Liquids (AILs) Δίαυλος ιόντων Na + /H + Na + /H + exchanger (NHE) Δραστικές Μορφές Αζώτου (ΔΜΑ) Reactive Nitrogen Species (RNS) Δραστικές Μορφές Οξυγόνου (ΔΜΟ) Reactive Oxygen Species (ROS) Ενδοθηλιακή συνθάση/συνθετάση νιτρικών οξέων Endothelial NOS (enos) Επαγώγιμη συνθάση/συνθετάση νιτρικών οξέων Inducible NOS (inos) Ιοντικά υγρά Ionic Liquids (ILs) Μηλονική διαλδεΰδη Malondialdehyde (MDA) Μέθοδος του ουδέτερου ερυθρού Neutral Red Uptake (NRU) Νευρική συνθάση/συνθετάση νιτρικών οξέων Neuronal NOS (nnos) Νιτρικά οξέα Nitric Oxides (NO) Ουδέτερο ερυθρό Neutral Red (NR) Πολυακόρεστα λιπαρά οξέα Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) Πρωτικά ιοντικά υγρά (ή ιοντικά υγρά κατά Bronsted ή Lewis) Protic Ionic Liquids (PILs) Σουπεροξειδική δισμουτάση Superoxide Dismutase (SOD) Συνθάση/συνθετάση νιτρικών οξέων Nitric Oxide Synthase (NOS) Τεχνητό θαλασσινό νερό Artificial Sea Water (ASW) Υποθανατογόνος συγκέντρωση Sub-lethal concentration 50% (LC50) 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Εισαγωγή 1.1. Τα ιοντικά υγρά Ορισμός Ο όρος «ιοντικά υγρά» (Ionic liquids/ils) αναφέρεται σε μια ευρεία χημική κατηγορία ημι-οργανικών αλάτων ή μειγμάτων αλάτων, τα οποία αποτελούνται εξ ολοκλήρου από ιόντα. Εναλλακτικά, ως ILs ορίζονται οι ενώσεις εκείνες που εμφανίζουν σημείο τήξης μέχρι 100 ο C (Baker et al., 2005; Bubalo et al., 2014; Ghandi, 2014). Τα ιοντικά υγρά διαχωρίζονται στα ILs (Tm < 373 K) και στα RTILs (roomtemperature ILs) (Tm < 298 K) (Hayes et al., 2015). Στην πραγματικότητα, χιλιάδες από τα ILs που έχουν καταγραφεί παραμένουν σε υγρή κατάσταση ακόμα και σε θερμοκρασίες κάτω των -96 ο C, σε αντίθεση με το χλωριούχο νάτριο που εμφανίζει σημείο τήξης γύρω στους 800 ο C (Baker et al., 2005). Τα παραπάνω δίνουν τη δυνατότητα στα ILs να συμπεριφέρονται πολύ διαφορετικά, συγκριτικά με συμβατικά μοριακά διαλύματα που χρησιμοποιούνται ως διαλύτες, ενώ παράλληλα οι πολλά υποσχόμενες ιδιότητές τους (μη πτητικά, μη εύφλεκτα, ανακυκλώσιμα) (Ghandi, 2014) και ο φιλικός προς το περιβάλλον τρόπος σύνθεσής τους, τα καθιστά «πράσινους διαλύτες» (Matzke et al., 2010). Γενικότερα, τα ILs μπορούν να αποτελούνται από οποιοδήποτε μονοσθενές κατιόν ή ανιόν, ενώ έχουν καταγραφεί και ILs βασισμένα σε δισθενή ιόντα (Olivier- Bourbigou and Magna, 2002; Plechkova and Seddon, 2008). Ειδικότερα για το κατιόν, είναι συνήθως οργανικό, ογκώδες και με μικρή συμμετρία (Clare et al., 2009; Olivier- Bourbigou and Magna, 2002), ενώ στο κέντρο του κατιόντος συνήθως εντοπίζεται ένα θετικά φορτισμένο μόριο αζώτου ή φωσφόρου. Αντίθετα, τα ανιόντα που χρησιμοποιούνται είναι συνήθως ανόργανα ή οργανικά, αρνητικά φορτισμένα μόρια (Clare et al., 2009). Το αυξανόμενο ενδιαφέρον ως προς τη χρήση των ILs φαίνεται και από τον αυξανόμενο αριθμό των σχετικών δημοσιεύσεων από το Συγκεκριμένα, πάνω από 6000 δημοσιεύσεις σχετιζόμενες με τα ILs δημοσιεύτηκαν από το 2000 και μετά, πάνω από 1000 το 2004, 1300 το 2005 και γύρω στις 1900 το 2006 (Hapiot and Lagrost, 2008), κυρίως από την Κίνα (Εικόνα 1) (Zhang et al., 2014). 9

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1. Αριθμός δημοσιεύσεων από τις τέσσερεις μεγαλύτερες περιοχές του κόσμου από το , όπου με πράσινο αντιπροσωπεύεται η Κίνα, με κόκκινο η Ευρώπη, με μαύρο οι Η.Π.Α., με μωβ η Ιαπωνία και με γαλάζιο ο υπόλοιπος κόσμος (τροποποιημένο από Zhang et al., 2014) Διαχωρισμός των ILs Με βάση τη χημική τους συμπεριφορά τα ILs διαχωρίζονται σε δύο κατηγορίες: τα «απρωτικά» (aprotic δέκτης πρωτονίων), γνωστά και ως «κλασσικά» ή «συμβατικά» ILs, και τα «πρωτικά» (protic δότης πρωτονίων ή ιοντικά υγρά κατά Brønsted ή Lewis) ILs. Στη μεν πρώτη κατηγορία εντοπίζονται ILs με κατιόντα όπως το ιμιδαζόλιο ή το πυριδίνιο και με ανιόντα όπως τα Cl -, Br -, BF4 -, PF6 - κ.λπ., στη δε δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα ILs που παρασκευάζονται μέσω αντίδρασης εξουδετέρωσης μεταξύ μιας οργανικής βάσης και ενός οξέος ή αντιστρόφως (μεταφορά ενός πρωτονίου από Brønsted οξύ σε Brønsted βάση) (Hayes et al., 2015; Mai et al., 2014). Βέβαια, ο διαχωρισμός αυτός δεν μπορεί να είναι απόλυτος καθώς έχουν αναφερθεί ILs με ικανότητα πρόσληψης και απελευθέρωσης πρωτονίου (Hayes et al., 2015). Εκτός από αυτό τον παραπάνω διαχωρισμό, αναφέρονται και άλλες κατηγορίες ILs με βάση το κατιόν (πχ., ILs με ετεροκυκλικά κατιόντα) ή το ανιόν του IL (πχ., ILs με μονοσθενή ανιόντα) (Clare et al., 2009; Olivier-Bourbigou and Magna, 2002), όπως τα PF6 - (Dzyuba and Bartsch, 2001), BF4 - (Forsyth et al., 2001) ή διακριτά δομικά χαρακτηριστικά του IL (π.χ., ύπαρξη παραμαγνητικού ή μαγνητικού ατόμου magnetic ILs) (Hayes et al., 2015). Τα κυριότερα κατιόντα και ανιόντα που χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό ILs φαίνονται στην Εικόνα 2. 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 2. Μερικά από τα κυριότερα κατιόντα και ανιόντα που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή διαφόρων κατηγοριών ILs. Από τα αριστερά προς τα δεξιά η σειρά των κατιόντων αποτελείται από: (1 η σειρά) αμμώνιο, πυρρολιδίνιο, 1-μεθυλ-3- αλκυλιμιδαζόλιο, 1,3-bis[3-methylimidazolium-1-yl]alkane, (2 η σειρά) φωσφόνιο, πυριδίνιο, πολύ(διαλυλδιμεθυλαμμώνιο), metal (M + ) tetraglyme. Η σειρά των ανιόντων αποτελείται από: (3 η σειρά) αλογονίδιο, μυρμηκικό, νιτρικό, όξινο θειικό, επταφθοροβουτυρικό, bis(perfluoromethylsulfonyl)imide, τετραφθοροβορικό, (4 η σειρά) θειοκυανικό, εξαφθοροφωσφορικό, tris (pentafluoroethyl) trifluorophospate, δικυαναμίδιο, πολυ(φωσφονικό οξύ), tetrachloroferrate (Hayes et al., 2015) Τα κυριότερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των ILs Η συστηματική μελέτη των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των ILs μπορεί να θεωρηθεί μια αρκετά δύσκολη και απαιτητική διαδικασία, καθώς περιλαμβάνει πολλές διαφορετικές κατηγορίες χημικών ενώσεων των οποίων οι ιδιότητες ποικίλουν σε πολύ μεγάλο βαθμό (Procedda et al., 2014). Επιπρόσθετα, λόγω του τεράστιου αριθμού των διαφορετικών ILs δεν είναι πάντα εφικτή η γενίκευση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων σε όλες τις κατηγορίες (Dong et al., 2014). Οι ιδιαίτερες φυσικοχημικές ιδιότητες των ILs σχετίζονται με την ιδιαίτερη μικρομοριακή δομή τους, ενώ η δυνατότητα τροποποίησης αυτών των ιδιοτήτων εξαρτάται από μικρές μετατροπές που υφίστανται σε μοριακό επίπεδο. Παράλληλα, αυξάνεται το ενδιαφέρον όσον αφορά στην πρόβλεψη των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών μέσω μοντέλων προσομοίωσης που βασίζονται στο γεγονός ότι τα ILs απαρτίζονται εξ ολοκλήρου από ιόντα. Λόγω αυτού θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν και ως καθαροί ηλεκτρολύτες, των οποίων η υγρή φύση οφείλεται κατά κύριο λόγο στη δομή και το μέγεθος του κατιόντος, καθώς και στο σχηματισμό ισχυρών ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ιόντων (Bodo and Migliorati, 2011). Κατά κύριο λόγο τα ILs παραμένουν υγρά σε ένα μεγάλο θερμοκρασιακό εύρος (από -96 έως 200 ο C), παρέχοντας ένα μεγάλο εύρος της κινητικής τους, με εξαίρεση 11

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ορισμένες ειδικές περιπτώσεις. Η χαμηλή έως και μηδενική τάση ατμών που τα χαρακτηρίζει, με εξαίρεση μερικά ILs όπως ο καρβαμικός εστέρας του διμεθυλικού αμμωνίου (dimethyl ammonium dimethyl carbamate), τα καθιστά ικανά να χρησιμοποιηθούν σε συστήματα εφαρμογής υψηλής πίεσης κενού. Συνεπώς, δύνανται να χαρακτηριστούν ως μη εύφλεκτα (με ελάχιστες εξαιρέσεις), ενώ παράλληλα παρουσιάζουν υψηλή θερμική σταθερότητα. Για παράδειγμα το τετραφθοριοβορικό αιθυλ-μεθυλιμιδαζόλιο και το [emim][(cf3so2)2n] παρουσιάζουν μεγάλη σταθερότητα σε θερμοκρασίες ο C, αντίστοιχα. Επίσης, δύνανται να διαλυτοποιήσουν μια ευρεία κατηγορία οργανικών ή ανόργανων ουσιών, πολικών ή μη, έχουν τη δυνατότητα να συμπεριφέρονται ως αποτελεσματικοί καταλύτες (πλην της αντίδρασης της ενυδάτωσης), και παρουσιάζουν υψηλή ιοντική αγωγιμότητα (Das and Roy, 2013). Φυσικά, οι ιδιότητες αυτές μπορεί να διαφέρουν για κάθε IL, με σκοπό την επίτευξη επιθυμητών φυσικοχημικών ιδιοτήτων, όπως για παράδειγμα την πολικότητα, την οξύτητα/αλκαλικότητα, την υδροφιλικότητα/λιποφιλία, το ιξώδες κ.λπ., καθώς εξαρτώνται άμεσα από το συνδυασμό του ανιόντος και του κατιόντος (Das and Roy, 2013; Hapiot and Lagrost, 2008). Συνεπώς, δεν θα αποτελούσε υπερβολή να θεωρηθεί ότι η μοναδική φυσικοχημική ιδιότητα που εμφανίζεται σε όλα τα ILs είναι η υψηλή τους ιοντική αγωγιμότητα (Hapiot and Lagrost, 2008), καθώς αλλάζοντας το κατιόν ενός IL παρατηρούνται αλλαγές στις φυσικοχημικές του ιδιότητες, ιδιαίτερα στο σημείο τήξης και στο θερμοκρασιακό εύρος στο οποίο παραμένει σε υγρή μορφή το IL (Plechkova and Seddon, 2008; Seddon, 1996), στο ιξώδες (Bonhôte et al., 1996), καθώς και στην ικανότητά τους να αναμιγνύονται με άλλους διαλύτες (Huddleston et al., 1998) Οι εφαρμογές των ILs Λόγω της εύκολης μετατροπής/εναλλαγής των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών τους, τα ILs έχουν προσεγγίσει το έντονο ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Λόγω των πλεονεκτημάτων τους έναντι των παραδοσιακών συμβατικών οργανικών διαλυτών (Das and Roy, 2013), τις τελευταίες δεκαετίες έχει αναπτυχθεί ένα μεγάλο δίκτυο εφαρμογών (Εικόνα 3). Τα ILs χρησιμοποιούνται σε πέντε βασικούς τομείς: Συνθετική Χημεία, Ηλεκτροχημεία, Αναλυτική Χημεία, Διαχωρισμός χημικών ουσιών Εκχύλιση και 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ άλλες μηχανικές ή/και βιολογικές εφαρμογές. Ιδιαίτερα στον τομέα της Συνθετικής Χημείας, τα ILs δρουν ως καταλύτες, καθώς και ως διαλύτες σε ένα ευρύ φάσμα οργανικών και ανόργανων αντιδράσεων, φαινόμενο που μπορεί να αποδοθεί στην πολύπλευρη φύση τους, με αποτέλεσμα να δρουν με διαφορετικό τρόπο, ανάλογα με τη μεταβολή των συνθηκών (Das and Roy, 2013; Sheldon, 2001). Άλλοι τομείς στους οποίους χρησιμοποιούνται τα ILs είναι ο διαχωρισμός αζεοτροπικών μιγμάτων (πχ. νερό-αιθανόλη), η αντικατάσταση του φωσφογενίου, η επιμετάλλωση του αλουμινίου, η διαλυτοποίηση της κυτταρίνης, οι αντιδράσεις υδροξυλίωσης του διπλού δεσμού μεταξύ ανθράκων, ως προσθετικές ενώσεις χρωμάτων, σε μπαταρίες λιθίου κ.ά. Εταιρείες, όπως η BP, έχουν αρχίσει να χρησιμοποιούν ILs σε διαδικασίες διύλισης, σε πετροχημικά, ενώ ενδέχεται να αντικαταστήσουν πολλά από τα βήματα των διαφόρων διεργασιών που επιτελούνται (Plechkova and Seddon, 2008). Εικόνα 3. Οι κυριότερες εφαρμογές των ILs (Das and Roy, 2013). 13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.5. Ιοντικά υγρά: «Πράσινη Χημεία»; Σκοπός της «Πράσινης Χημείας» είναι η χρήση μη τοξικών προς το περιβάλλον χημικών ουσιών, που θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν σημαντικό ζημιογόνο περιβαλλοντικό παράγοντα, συμπεριλαμβανομένης της ανθρώπινης ζωής. Ως εκ τούτου, η προστασία του περιβάλλοντος αποτελεί ένα θέμα παγκόσμιας ανησυχίας (Das and Roy, 2013). Καθώς τα ILs αποτελούν μια σχετικά νέα και σημαντική προσθήκη σε αυτήν την τεράστια στρατιά των χημικών ενώσεων, κυρίως ως υποψήφιοι αντικαταστάτες των συμβατικών διαλυτών, αντιδραστηρίων και καταλυτών («πράσινοι» διαλύτες, λόγω της θερμικής και χημικής τους σταθερότητας, των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους και της ελάχιστης έκλυσης πτητικών ουσιών στο περιβάλλον), ένας νέος επιστημονικός κλάδος, της «Οικολογικής Χημείας» αρχίζει να αναπτύσσεται. Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι τα ILs δεν αποτελούν εγγενώς μη τοξικούς παράγοντες και μπορούν σε κάποιο βαθμό να προκαλέσουν σοβαρά περιβαλλοντικά προβλήματα. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια σύνθεσής τους παράγονται απόβλητα, ενώ ο διαχωρισμός αυτών από διαλύτες, αντιδραστήρια ή καταλύτες κατά τη διάρκεια της χημικής επεξεργασίας δεν είναι εύκολη διαδικασία (Das and Roy, 2013; Mallakpour and Dinari, 2012). Συνεπώς, μια ενδεχόμενη απελευθέρωσή τους στο περιβάλλον, είτε λόγω ύπαρξης αυτών σε καταναλωτικά αγαθά (για παράδειγμα μπαταρίες, προϊόντα οικιακής χρήσης, καλλυντικά, προϊόντα κλωστοϋφαντουργίας) είτε λόγω κάποιας εκούσιας ή ακούσιας δραστηριότητας (πχ. κάποιο ατύχημα) (Studzińska and Buszewski, 2009), αναπόφευκτα αποτελεί θέμα μεγάλης ανησυχίας, καθώς θίγονται σοβαρά προβλήματα υγείας. Επιπρόσθετα, η ικανότητα των ILs να προκαλούν τοξικά φαινόμενα θα πρέπει να θεωρηθεί ως ένα ζήτημα υψηλής προτεραιότητας, προκειμένου να αποφευχθεί οποιαδήποτε επικίνδυνη επίδραση σε ολόκληρο το οικοσύστημα. Ως αποτέλεσμα των παραπάνω, φαίνεται ότι αμφισβητείται πλέον ο «πράσινος» χαρακτήρας τους (Das and Roy, 2013; Mallakpour and Dinari, 2012). Για το λόγο αυτό η ικανότητα των ILs να βιοαποικοδομούνται αποτελεί σημαντική παράμετρο όσον αφορά στην προστασία του περιβάλλοντος και των διαβιούντων σε αυτό οργανισμούς (Mallakpour and Dinari, 2012). Τα ILs δεν έχουν υποβληθεί ακόμα σε εκτεταμένες τοξικολογικές μελέτες, σε αντίθεση με πολλές άλλες επικίνδυνες χημικές ουσίες και ως εκ τούτου μια λεπτομερής μελέτη της χημείας τους θα μπορούσε να παρέχει ικανοποιητικές πληροφορίες σχετικά 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ με την βελτιωμένη ανάπτυξή τους, στοχεύοντας σε μια διαδικασία που θα παρουσιάζει ελάχιστες περιβαλλοντικές επιπτώσεις Κανονισμοί περί της αξιολόγησης της τοξικότητας των ILs Για την αξιολόγηση της τοξικότητας, καθώς και για τη βελτίωση της εφαρμογής και της χρήσης των ILs από τη σκοπιά της «Πράσινης Χημείας», διοργανώθηκε το 2000 από τη Βορειοατλαντική Συνθήκη (North Atlantic Treaty Organization/NATO) ένα Advanced Research Workshop στην Κρήτη με τίτλο «Πράσινες Βιομηχανικές εφαρμογές των ιοντικών υγρών», στο οποίο και τέθηκαν ορισμένα κριτήρια για τη σωστή ανάπτυξη και την πιο ορθολογική χρήση τους (Das and Roy, 2013; Plechkova and Seddon, 2008; Rogers et al., 2002). Εξ αυτών των κριτηρίων δόθηκε ιδιαίτερη σημασία στα εξής (Plechkova and Seddon, 2008): Διερεύνηση της τοξικότητας, της βιοαποικοδόμησης, της βιοσυσσώρευσης, της ασφάλειας και υγείας του περιβάλλοντος (Safety, Health and Environment/SHE). Μία δημόσια (δωρεάν), πιστοποιημένη, διαδικτυακή βάση δεδομένων των φυσικών, θερμοδυναμικών κ.λπ. παραμέτρων των ILs. Διεθνής συνεργασία, επικοινωνία και εκπαίδευση, αποσκοπώντας στα εκάστοτε επιθυμητά αποτελέσματα. Η αναγκαιότητα των παραπάνω κριτηρίων καθίσταται απόλυτα κατανοητή αν αναλογισθεί κανείς ότι για την ορθή εκτίμηση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων μιας χημικής ουσίας, μια οποιαδήποτε υποψία επικινδυνότητας και δεδομένα τοξικότητας από μόνα τους δεν μπορούν να θεωρηθούν επαρκή, και ως εκ τούτου η τύχη της συγκεκριμένης χημικής ουσίας διέπεται από την ικανότητά της να παραμένει στο περιβάλλον σε συνδυασμό με την παραγωγή οποιουδήποτε τοξικού προϊόντος κατά την αποικοδόμησή της αποικοδόμησης (Das and Roy, 2013) Αξιολόγηση της τοξικότητας των ILs Η πλειοψηφία των (οικο)τοξικολογικών μελετών των ILs σε διάφορες παραμέτρους συμπεριλαμβάνει τον προσδιορισμό της υποθανατογόνου συγκέντρωσης (Lethal concentration/lc50) ή της δραστικής συγκέντρωσης (Effective concentration/ec50) που προκαλεί θάνατο ή ακινησία του 50% των εκάστοτε εκτιθέμενων οργανισμών στη χημική ουσία. Μια μείωση της τιμής LC50 συνήθως υποδηλώνει υψηλότερη τοξικότητα του χημικού στοιχείου, ενώ λαμβάνοντας υπόψη 15

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την υδατοδιαλυτή φύση των ILs, η τιμή LC50 αποδεικνύεται ως ένας πολύ αξιόπιστος δείκτης για την εκτίμηση της οικοτοξικότητας (Das and Roy, 2013). Γενικότερα, οι οργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση/εκτίμηση των τοξικών/περιβαλλοντικών επιπτώσεων μιας χημικής ουσίας ονομάζονται οργανισμοί «βιοενδείκτες» (bioindicators). Κατά κύριο λόγο χρησιμοποιούνται οργανισμοί με μικρό κύκλο ζωής. Σε αυτή την περίπτωση, αρκετά είδη υδρόβιων ασπόνδυλων φαίνεται ότι αποτελούν μια καλή επιλογή για την αξιολόγηση της τοξικότητας των ILs (Das and Roy, 2013). Στην Εικόνα 4, αναφέρονται εν συντομία και ενδεικτικά μερικοί οργανισμοί-μοντέλα που έχουν χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση του IL [omim][bf4]. Εικόνα 4. Οι οργανισμοί «βιοενδείκτες» που έχουν χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της τοξικότητας του IL [omim][bf4] Το δίθυρο θαλάσσιο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis και η χρήση του ως οργανισμός «βιοενδείκτης» Γενικά χαρακτηριστικά του είδους Στην ομοταξία των δίθυρων μαλακίων ανήκει το γένος Mytilus, το οποίο θεωρείται ότι πρωτοεμφανίστηκε πριν από 1-2 εκατομμύρια χρόνια (Seed, 1976) και σε αυτό περιλαμβάνονται τα είδη M. galloprovincialis, M. edulis, M. trossulus και M. californianus (Gosling, 2015; Koehn, 1991). Συγκεκριμένα, είναι γνωστό ότι το είδος M. galloprovincialis (αλλιώς Μεσογειακό μύδι) (Πίνακας 1), αποτελεί γηγενές είδος 16

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ της Μεσογειακής και της Μαύρης θάλασσας (Chintiroglou et al., 1999; Gosling, 2015), το οποίο πλέον εμφανίζει μια σχεδόν παγκόσμια εξάπλωση, καθώς εντοπίζεται στα αγγλικά νησιά, στην Ευρώπη, στη Βόρεια Αφρική και σε ορισμένες περιοχές βόρεια του Ειρηνικού ωκεανού (Westfall et al., 2010). Η παρουσία του στην Ιαπωνία, στο Χόνγκ Κόνγκ, βόρεια της Καλιφόρνιας και στη Νότια Αφρική οφείλεται σε τυχαία εισαγωγή του. Το μέγεθος των μυδιών ποικίλει και συνήθως τα ενήλικα άτομα φτάνουν σε μήκος μέχρι τα cm (Gosling, 2015). Πίνακας 1. Η επιστημονική ταξινόμηση του δίθυρου μαλακίου του είδους Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819). Επικράτεια Eyrakyota Βασίλειο Animalia Φύλο Mollusca Κλάση Bivalvia Υπόκλαση Pteriomorphia Τάξη Mytiloida Οικογένεια Mytilidae Γένος Mytilus Είδος M. galloprovincialis Τα μύδια είναι διηθηματοφάγοι, αμφιπλευροσυμμετρικοί οργανισμοί (Εικόνα 5), με θυρίδες πλευρικά συμπιεσμένες που συνδέονται μεταξύ τους ραχιαία με τη βοήθεια ελαστικού συνδέσμου αποτελούμενου από κερατίνη. Η χαλάρωση ή η σύσπαση των προσαγωγών μυών, που είναι προσκολλημένοι στις θυρίδες, οδηγεί στο άνοιγμα ή κλείσιμο των θυρίδων, αντίστοιχα. Επάνω στο κέλυφός τους εντοπίζονται εγκάρσιες παράλληλες γραμμές, οι οποίες προσδιορίζουν την εποχιακή αύξηση του οργανισμού και κατ επέκταση την ηλικία του. Εσωτερικά του οστράκου βρίσκεται το μαλακό σώμα του μυδιού που περιλαμβάνει όλα τα όργανά του (πεπτικό σύστημα, ποδίσκος, καρδιά κ.λπ.) και καλύπτεται από τον δίλοβο μανδύα (Εικόνα 5). Μέσω ενός προσαγωγού σιφωνίου προσλαμβάνουν την τροφή τους, ενώ στη συνέχεια με τη συνδυασμένη κίνηση των βλεφαρίδων των βραγχίων και των χειλικών προσακτρίδων της μανδυακής κοιλότητας μεταφέρεται η τροφή στο στόμαχο δια μέσου του γαστρεντερικού σωλήνα. Επιπλέον, ο πεπτικός αδένας αποτελεί χώρο αποθήκευσης μεταβολικών αποθεμάτων που χρησιμοποιούνται ως πηγή ενέργειας κατά τη διαδικασία της γαμετογένεσης (Gosling, 2015). 17

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 5. Εξωτερική και εσωτερική μορφολογία του είδους M. galloprovincialis. Η κίνηση επιτυγχάνεται με τη βοήθεια του ποδίσκου απ τον οποίο ο βυσσογόνος αδένας οδηγεί κοιλιακά στο σχηματισμό της βύσσου (Α) προς την προσκόλληση του ατόμου στο βραχώδες υπόστρωμα του περιβάλλοντος που διαβιεί ή/και σε γειτονικά του άτομα (Β). Ο μανδύας (C) που αποτελείται από δύο λοβούς, περικλείει όλα τα μαλακά μέρη του σώματος του μυδιού και αποτελείται από συνδετικό ιστό στον οποίο εντοπίζονται η αιμόλεμφος, τα αγγεία, τα νεύρα, καθώς και το μυϊκό σύστημα, που είναι ιδιαίτερα ανεπτυγμένο στα περιθώρια του μανδύα. Η ύπαρξη βλεφαρίδων στην εσωτερική επιφάνεια του μανδύα διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην κατεύθυνση των διαφόρων σωματιδίων πάνω στα βράγχια, καθώς και στην εκτροπή βαρύτερων σωματιδίων προς το εσωτερικό του μανδύα ή στην απόρριψη αυτών (Gosling, 2015) Το είδος Mytilus galloprovincialis ως οργανισμός «βιοενδείκτης» Λόγω της συνεχούς διήθησης νερού, τα μύδια καθίστανται αποδέκτες πολλών ξενοβιοτικών ουσιών που βρίσκονται σε αυτό, οι οποίες εύκολα συσσωρεύονται στα βράγχια και στον πεπτικό τους αδένα (Moore and Allen, 2002). Τα είδη του γένους Mytilus χρησιμοποιούνται ευρέως τόσο για την αξιολόγηση των εν δυνάμει τοξικών επιπτώσεων των διαφόρων ρύπων (πχ. βαρέα μέταλλα, απόβλητα ελαιοτριβείου και βιολογικού καθαρισμού), όσο και σε εργαστηριακό επίπεδο (Angelo et al., 2007; Danellakis et al., 2011; Giannapas et al., 2012; Nasci et al., 2002; Regoli and Orlando, 1994; Tsarpali et al., 2015; Tsarpali and Dailianis, 2015). Επειδή τα μεταβολικά συστήματα εμφανίζουν χαμηλή ενζυμική δραστικότητα, η συγκέντρωση ουσιών στους ιστούς των μυδιών είναι αντιπροσωπευτική τόσο του βαθμού επιβάρυνσης των υδάτων, όσο και της βιοδιαθεσιμότητάς τους. Τέλος, τα μύδια του γένους Mytilus αποτελούν 18

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τμήμα της διατροφής του ανθρώπου, γεγονός που τα καθιστά πιθανή απειλή για την υγεία του ανθρώπου, όταν εκτίθενται σε ρυπογόνες ουσίες (Jović et al., 2011; Surenda et al., 2011) Αιμόλεμφος/αιμοκύτταρα δίθυρων μαλακίων Τα μύδια διαθέτουν «ανοιχτό» κυκλοφορικό σύστημα που αποτελείται από το πλάσμα της αιμολέμφου και τα έμμορφα συστατικά της (δηλαδή τα αιμοκύτταρα). Πιο συγκεκριμένα, η αιμόλεμφος συμβάλει στην ανταλλαγή των αερίων, την ωσμορύθμιση, τη μεταφορά των θρεπτικών συστατικών, την εξουδετέρωση και ελαχιστοποίηση των άχρηστων προϊόντων (Gosling, 2015). Παράλληλα, αποτελεί μια σημαντική άμυνα του ανοσοποιητικού συστήματος του οργανισμού, λόγω των βιομορίων που διαθέτει και αντιμετωπίζει τόσο τις ξενοβιοτικές ουσίες, όσο και τους παθογόνους μικροοργανισμούς, ενεργοποιώντας μηχανισμούς εξουδετέρωσής τους (Canesi et al., 2002; Gosling, 2015; Leclerc, 1996; Prieur et al., 1990). Επειδή, η αιμόλεμφος αποτελεί το 40-60% του νωπού βάρους των ιστών χρησιμεύει επίσης ως «υγρός» σκελετός, δίνοντας προσωρινή ακαμψία σε όργανα, όπως οι χειλικές προσακτρίδες, ο ποδίσκος, οι σίφωνες και η περιφέρεια του μανδύα (Gosling, 2015). Οι κύριες αποκρίσεις του ανοσοποιητικού συστήματος των δίθυρων μαλακίων είναι η φαγοκυττάρωση και η δράση των αιμοκυττάρων, ενώ μια πληθώρα παραγόντων, όπως οι συγκολλητίνες, πχ. οι λεκτίνες, διάφορα αντιμικροβιακά πεπτίδια (Antimicrobal peptides/amps) και λυσοσωμικά ένζυμα, αποτελούν τη χυμική άμυνα του οργανισμού. Τα αιμοκύτταρα αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας έναντι παρασίτων και παθογόνων μικροοργανισμών. Πιο συγκεκριμένα, οι μηχανισμοί δράσης των αιμοκυττάρων διαχωρίζονται σε δύο επιμέρους μηχανισμούς: ο πρώτος περιλαμβάνει την παραγωγή λυσοσωμικών ενζύμων, π.χ., αμινοπεπτιδάσες, β- γλυκουρονιδάσες, εστεράσες, υπεροξειδάσες, αλκαλική φωσφατάση κ.ά. (Gestal et al., 2008) και ο δεύτερος τη διαδικασία της αναπνευστικής έκρηξης, κατά την οποία παράγεται ένας σημαντικός αριθμός δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), όπως είναι για παράδειγμα τα σουπεροξειδικά ανιόντα (O2 - ) και το μονοξείδιο του αζώτου (NO) (Buggé et al., 2007; Pipe, 1992) Η αναπνευστική έκρηξη και τα ένζυμα που εμπλέκονται σε αυτή Η βιοχημική βάση της αναπνευστικής έκρηξης έγκειται στην ενεργοποίηση διαφόρων ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων της NADPH οξειδάσης και της 19

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνθάσης/συνθετάσης νιτρικών οξέων (NOS) (Dailianis, 2009). Η NADPH οξειδάση είναι υπεύθυνη για την παραγωγή σουπεροξειδικών ανιόντων (Ο2 - ), τα οποία μέσω της σουπεροξειδικής δυσμουτάσης (SOD) μετατρέπονται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2). Η NOS εντοπίζεται σε 3 διαφορετικές ισομορφές: νευρική NOS (neuronal NOS, nnos), την ενδοθηλιακή NOS (endothelial NOS, enos) και την επαγώγιμη NOS (inducible NOS, inos), και είναι υπεύθυνη για την παραγωγή οξειδίων του αζώτου (NOx) (Donaghy et al., 2015). Τα δύο αυτά ένζυμα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στους μηχανισμούς άμυνας των αιμοκυττάρων, όπως είναι η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης, έναντι ξενοβιοτικών ουσιών (Banakou and Dailianis, 2010; Dailianis, 2009) Φαγοκυττάρωση Κατά τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης στα κύτταρα των μυδιών φαίνεται να εμπλέκεται η κινάση της φωσφοϊνοσιτόλης 3 (phosphoinositide 3-kinase, PI3-kinase). Η ενεργοποίηση της PI3-κινάσης, μέσω αυξητικών παραγόντων, κυτοκινών και άλλων περιβαλλοντικών παραγόντων, οδηγεί, μεταξύ άλλων, στην ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης της Akt κινάσης. Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού με τη διαμεσολάβηση της Akt κινάσης/πρωτεϊνικής κινάσης Β οδηγεί στην αναστολή μεταγραφής γονιδίων, απόπτωσης και σύνθεσης γλυκογόνου, ενώ ενεργοποιείται η σύνθεση πρωτεϊνών, η αύξηση, ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, καθώς και η αλληλεπίδραση των κυττάρων με την εξωκυττάρια ύλη (Dailianis et al., 2009; Vouras and Dailianis, 2012). Επιπλέον, θεωρείται ότι η επαγωγή ROS μπορεί να σχετίζεται με την ενεργοποίηση σηματοδοτικού μονοπατιού στο οποίο συμμετέχει το συμπλόκου PI3-κινάσης/Akt κινάσης και ο επαγόμενος μηχανισμός της αναπνευστικής έκρηξης (Dailianis et al., 2009) Δείκτες καταπόνησης (δείκτες stress ή βιομάρτυρες) στα δίθυρα μαλάκια Η χρήση δεικτών καταπόνησης (δείκτες stress ή βιομάρτυρες) στην αξιολόγηση της εν δυνάμει τοξικότητας των ουσιών είναι πλέον αναγκαία, προκειμένου να εξασφαλισθεί μια ορθολογική διαχείριση περιβαλλοντικού κινδύνου (Lionetto et al., 2003; Vidal-Liñán et al., 2010). Ως βιομάρτυρες ορίζονται αλλαγές που συμβαίνουν σε κυτταρικό, βιοχημικό, μοριακό ή φυσιολογικό επίπεδο και δύνανται να μετρηθούν- 20

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανιχνευθούν σε κύτταρα, σωματικά υγρά, ιστούς ή όργανα ενός οργανισμού και παράλληλα μπορούν να αποτελέσουν ένδειξη έκθεσης του οργανισμού σε κάποια ξενοβιοτική ουσία, καθώς και το αποτέλεσμα της έκθεσης (Benali et al., 2015; Lionetto et al., 2003; Vidal-Liñán et al., 2010). Ως εκ τούτου παρέχεται έγκαιρη προειδοποίηση όσον αφορά σημαντικές βιολογικές επιδράσεις σε επίπεδο οργανισμού και σε υποκυτταρικό επίπεδο που αντανακλούν την ύπαρξη επιβαρυντικών ουσιών στο περιβάλλον (Dailianis, 2011; Forbes et al., 2006; Lam, 2009) Διαταραχές φυσιολογικής ομοιόστασης και ξενοβιοτικές ουσίες Η είσοδος μιας ξενοβιοτικής ουσίας στον οργανισμό δύναται να επιφέρει μια σειρά από κυτταρικές, βιοχημικές και μοριακές διαταραχές, σχετιζόμενες με την πρόκληση κυτταροτοξικών (Lam, 2009; Viarengo et al., 2007), νευροτοξικών (Benali et al., 2015; Viarengo et al., 2007), οξειδωτικών φαινομένων (Lionetto et al., 2003; Pytharopoulou et al., 2008; Viarengo et al., 2007; Vidal-Liñán et al., 2010), καθώς και φαινομένων που σχετίζονται με την καταστροφή του γενετικού υλικού (Bolognesi and Cirillo, 2014; Viarengo et al., 2007). Ως αποτέλεσμα των παραπάνω, η ομοιόσταση του οργανισμού διαταράσσεται (Dailianis et al., 2003). Στη συνέχεια παρατίθενται πληροφορίες για το είδος των διαταραχών που μπορούν να προκληθούν ύστερα από έκθεση του οργανισμού σε κάποια ξενοβιοτική ουσία και συγκεκριμένα σε αυτές που εξετάσθηκαν στην παρούσα μελέτη Κυτταροτοξικές επιπτώσεις Αποσταθεροποίηση της λυσοσωμικής μεμβράνης των αιμοκυττάρων Τα λυσοσώματα είναι υποκυτταρικά οργανίδια, που περιβάλλονται από μια ημιπερατή μεμβράνη, και στο εσωτερικό τους εντοπίζονται πολυάριθμα υδρολυτικά ένζυμα. Τα οργανίδια αυτά εμπλέκονται σε μια πλειάδα κυτταρικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της πέψης, της άμυνας και της αναπαραγωγής, ενώ, παράλληλα, συμμετέχουν στην αποικοδόμηση ενδογενών και εξωγενών μακρομορίων. Ως εκ τούτου, συμβάλουν στην απόκριση του οργανισμού σε συνθήκες stress (Viarengo et al., 2007). Μια έντονη καταβολική δραστηριότητα, καθώς και βλάβες στη λυσοσωμική μεμβράνη είναι δυνατό να οδηγήσουν σε απελευθέρωση των όξινων υδρολασών στο κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα το κύτταρο να οδηγηθεί σε σοβαρές δυσλειτουργίες και τελικά στον κυτταρικό θάνατο (Koehler et al., 2002). 21

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όσον αφορά στους ιστούς του μυδιού M. galloprovincialis η εκτίμηση της σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης χρησιμοποιείται ευρέως ως βιομάρτυρας για την αξιολόγηση των εν δυνάμει τοξικών επιπτώσεων των διαφόρων ρύπων (Regoli, 1992). Πιο συγκεκριμένα, στα κύτταρα του πεπτικού αδένα καθώς και στα αιμοκύτταρα του μυδιού το λυσοσωμικό δίκτυο είναι ιδιαίτερα ανεπτυγμένο, ενώ παράλληλα αποτελεί στόχο για πολλούς εν δυνάμει τοξικούς ρύπους (Moore, 1985) Φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (stress) Tο σουπεροξειδικό ανιόν (Ο2 - ) Ως ελεύθερες ρίζες νοούνται τα άτομα ή τα μόρια εκείνα που φέρουν ένα τουλάχιστον ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στην εξωτερική ηλεκτρονική στοιβάδα, γεγονός που τα καθιστά ιδιαίτερα δραστικά στο να συζευχθούν με άλλα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) αποτελούν τμήμα της ευρύτερης κατηγορίας των ελεύθερων ριζών και αναφέρονται σε ενώσεις που παράγονται από το μοριακό οξυγόνο ύστερα από αναγωγή ενός, δύο ή τριών ηλεκτρονίων, καθώς και σε ρίζες οξυγόνου ή οργανικών ενώσεων και υπεροξειδίων που έχουν αντιδράσει με ρίζες οξυγόνου (Εικόνα 6). Πολλές ROS αποτελούν ελεύθερες ρίζες, όπως είναι το υπεροξείδιο, το υδροξύλιο, το μονοξείδιο του αζώτου και οι ρίζες των λιπιδίων υπεροξυλίου (Halliwell, 2006). Εικόνα 6. Αντιδράσεις σχηματισμού δραστικών μορφών οξυγόνου, ύστερα από σταδιακή αναγωγή του μοριακού οξυγόνου. Η ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS αποτελεί φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου με σκοπό την άμυνα έναντι μικροοργανισμών και ξενοβιοτικών ουσιών, ενώ τα φυσιολογικά τους επίπεδα ρυθμίζονται από τη δράση αντιοξειδωτικών μηχανισμών (Halliwell, 2006; Vidal-Liñán et al., 2010). Όταν τα επίπεδα παραγωγής ROS υπερβαίνουν την αντιοξειδωτική άμυνα, τα κύτταρα υφίστανται οξειδωτικό stress που προκαλεί, μεταξύ άλλων, την υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης, την οξείδωση των πρωτεϊνών και την καταστροφή του γενετικού υλικού (Pytharopoulou et 22

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ al., 2008). Το φαινόμενο του οξειδωτικού stress προκύπτει είτε από την άμεση ενεργοποίηση του μηχανισμού που οδηγεί στη σύνθεση των ROS, είτε με έμμεση δράση στα ένζυμα (συμπεριλαμβανομένης της σουπεροξειδικής δισμουτάσης/sod, της καταλάσης κ.ά.) και στα μόρια που δεσμεύουν τις ROS (υδροφιλικά μόρια, όπως το ασκορβικό οξύ, καθώς και λιπόφιλα, όπως η βιταμίνη Ε και τα καροτενοειδή) (Viarengo et al., 2007). Τα σουπεροξειδικά ανιόντα (Ο2 - ) αποτελούν μια δραστική μορφή οξυγόνου που παράγεται τόσο στο περιβάλλον της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων, κατά τη διαδικασία της αλυσιδωτής μεταφοράς ηλεκτρονίων, όσο και από τα φλαβοένζυμα (Dailianis et al., 2005) (Εικόνα 7). Εικόνα 7. Κατά τη διαδικασία της αναπνοής ενεργοποιούνται διαμεμβρανικά ένζυμα, όπως η NADPH οξειδάση, που καταλύει την οξείδωση του οξυγόνου σε Ο2 -, το οποίο και μετατρέπεται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) με τη βοήθεια του ενζύμου SOD. Το H2O2 αντιδρά με δισθενή σίδηρο (Fe 2+ ), με παραχθέν προϊόν ρίζες υδροξυλίου που είναι ιδιαίτερα δραστικές και εμφανίζουν την ικανότητα να αποσπούν ένα υδρογόνο από βιομόρια του οργανισμού, προκαλώντας σοβαρές βλάβες, όπως λιπιδική υπεροξείδωση. Η έκθεση του οργανισμού σε διάφορους περιβαλλοντικούς ρύπους μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό Ο2 -, καθώς και σε φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (Dailianis, 2009). Οι τοξικές επιπτώσεις των διαφόρων ρυπογόνων ουσιών εξαρτώνται και από την ικανότητά τους να αυξάνουν τα κυτταρικά επίπεδα των ROS (Valavanidis et al., 2006; Viarengo et al., 2007) Παραγωγή οξειδίων του αζώτου (NOx) Στις ελεύθερες ρίζες ανήκουν και οι δραστικές μορφές αζώτου (Reactive Nitrogen Species/RNS), οι οποίες διαδραματίζουν εξίσου σημαντικό ρόλο στη φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου και κατ επέκταση του οργανισμού. Συμβάλουν 23

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στο βασικό μεταβολισμό των κυττάρων, καθώς και στην απόκρισή του σε ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες. Η παραγωγή των RNS ξεκινά με την εμφάνιση των οξειδίων του αζώτου (NO), προϊόντα παραγωγής της ΝΟ συνθετάσης. Τα NO είναι εξαιρετικά ενεργές ρίζες και δύνανται να διαπεράσουν τις κυτταρικές μεμβράνες. Η αντίδρασή τους με τα Ο2 - οδηγεί στο σχηματισμό του περοξυνιτρίτη (ONOO - ), που αποτελεί ένα ιδιαίτερα δραστικό μόριο (Donaghy et al., 2015). Η έκθεση του οργανισμού σε περιβαλλοντικούς ρύπους, όπως για παράδειγμα σε βαρέα μέταλλα, μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό NO, γεγονός που χαρακτηρίζει τον προσδιορισμό των επιπέδων NO σημαντικό βιομάρτυρα οξειδωτικής καταπόνησης (Banakou and Dailianis, 2010; Dailianis, 2009; Dailianis et al., 2009; Vouras and Dailianis, 2012) Λιπιδική υπεροξείδωση Οι μεμβράνες των κυττάρων αποτελούνται από λιπίδια και πρωτεΐνες σε αναλογία που ποικίλει με βάση τη βιολογική διεργασία που επιτελεί το κάθε κύτταρο. Τα λιπίδια συνίστανται σε λιπαρά οξέα, ακυλογλυκερόλες, γλυκεροφωσφολιπίδια και στεροειδή. Συγκεκριμένα, τα γλυκεροφωσφολιπίδια συνίστανται σε εστέρες γλυκερόλης, οι οποίοι συνδέονται με ένα φωσφορικό οξύ και λιπαρά οξέα (πολυακόρεστα λιπαρά οξεά/pufas) και βρίσκονται σε αφθονία στις μεμβράνες των ζωικών κυττάρων. Σε περιπτώσεις οξειδωτικού stress, μια ενεργή ελεύθερη ρίζα (για παράδειγμα OH ή NO2 ) δύναται να αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από έναν δεσμό C-H. Καθώς το αποσπώμενο Η διαθέτει ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, το άτομο του άνθρακα παραμένει με το άλλο ασύζευκτο μόριο (του ομοιοπολικού δεσμού), και αντιδρά με ένα μόριο οξυγόνου, οδηγώντας στο σχηματισμό ριζών περοξυλίου. Οι ρίζες αυτές είναι ιδιαίτερα δραστικές και οξειδώνουν τις πρωτεΐνες των μεμβρανών, καθώς και τα γειτονικά PUFAs. Συνεπώς, παράγεται μια νέα ρίζα ατόμου άνθρακα με αποτέλεσμα να πραγματοποιείται εκ νέου η αλυσιδωτή αντίδραση που περιγράφεται παραπάνω, καταλήγοντας στη σχηματισμό μιας πληθώρας ελεύθερων ριζών (Εικόνα 8). Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται λιπιδική υπεροξείδωση. Ως εκ τούτου, παρατηρούνται φαινόμενα μείωσης της ρευστότητας της κυτταρικής μεμβράνης και αύξησης της διαπερατότητάς της από ενώσεις που διακινούνται μόνο μέσω ειδικών καναλιών (πχ. ιόντα K + και Ca 2+ ), καταστροφής των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και απενεργοποίησης υποδοχέων, ενζύμων και ιοντικών καναλιών (Halliwell, 2006). 24

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 8. Οι αλυσιδωτές αντιδράσεις που πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια της λιπιδικής υπεροξείδωσης (τροποποιημένο από Halliwell, 2006). Λόγω των αλυσιδωτών αντιδράσεων που επάγονται από τις ROS, η σωστή ποσοτικοποίηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης καθίσταται ιδιαίτερα απαιτητική. Παρόλα αυτά, έχουν καταγραφεί αξιόπιστοι βιομάρτυρες, όπως είναι η λιπιδική υπεροξειδάση και η μηλονική διαλδεΰδη, καθώς αποτελούν σταθερά αλδεϋδικά προϊόντα της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Grintzalis et al., 2013). Εν γένει, η εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης αποτελεί έναν αξιόπιστο βιομάρτυρα οξειδωτικού stress και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται ευρύτατα σε πολλές (οικο)τοξικολογικές μελέτες (Banakou and Dailianis, 2010; Giannapas et al., 2012; Toufexi et al., 2016) Γενοτοξικές επιπτώσεις στα αιμοκύτταρα των μυδιών Οι οργανισμοί των θαλάσσιων οικοσυστημάτων έρχονται συχνά σε επαφή με μια πλειάδα μειγμάτων χημικών ουσιών, που μπορούν να προκαλέσουν σοβαρές βλάβες σε επίπεδο γενετικού υλικού. Αυτές οι ξενοβιοτικές ουσίες που εμφανίζουν έντονο γενοτοξικό χαρακτήρα εμπλέκονται σε πολλές παθολογικές διεργασίες, όπως είναι η καρκινογένεση, καθώς και στην αναπαραγωγική διαδικασία, οδηγώντας σε ζημιογόνα αποτελέσματα, τόσο σε ατομικό επίπεδο όσο και στο επίπεδο των επόμενων γενεών. Συνεπώς, λόγω της βιολογικής σημασίας τους οι γενοτοξικές επιδράσεις θεωρούνται μείζονος σημασίας για την εκτίμηση της τοξικότητας που σχετίζεται με τη ρύπανση (Bolognesi and Cirillo, 2014) Σκοπός της παρούσας μελέτης Τα ILs, λόγω των ιδιαίτερων φυσικοχημικών χαρακτηριστικών τους, θεωρούνται ιδανικοί αντικαταστάτες των συμβατικών οργανικών διαλυτών. Μεταξύ αυτών το [omim][bf4], χρησιμοποιείται είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με οργανικούς 25

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ διαλύτες σε μια πλειάδα βιομηχανικών εφαρμογών (Keskin et al., 2007). Παρόλη, όμως, την έκρηξη της δημοτικότητάς τους στις διάφορες βιομηχανικές εφαρμογές, η τοξικότητα των ILs παραμένει ακόμα ένα άγνωστο κεφάλαιο. Το αυξημένο ενδιαφέρον στη διεύρυνση της χρήσης των ILs έχει αρχίσει να εγείρει σοβαρούς προβληματισμούς ως προς την πιθανότητά τους να εντοπιστούν στο περιβάλλον, μέσω ατυχημάτων, απόρριψης αποβλήτων ή άλλων μέσων, αποτελώντας έτσι έναν εν δυνάμει περιβαλλοντικό κίνδυνο, ενώ λίγες είναι οι γνώσεις όσον αφορά στο μηχανισμό δράσης τους σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Επιπλέον, παρά το μειωμένο κίνδυνο αέριας ρύπανσης που εμφανίζουν, η χαμηλή βιοαποικοδόμηση των ILs ενδέχεται να διαδραματίσει έναν περιβαλλοντικό κίνδυνο για τους υδρόβιους οργανισμούς (Bubalo et al., 2014; Das and Roy, 2013). Τα δίθυρα μαλάκια και συγκεκριμένα το είδος Mytilus galloprovincialis έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες οικοτοξικολογίας ως οργανισμός «βιοενδείκτης», ενώ έχει ήδη χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της τοξικότητας των ILs [bmim][bf4] και [omim][bf4] (Tsarpali et al., 2015; Tsarpali and Dailianis, 2015). Κατά τη διαδικασία της ανοσολογικής απόκρισης των αιμοκυττάρων των μυδιών σε ξενοβιοτικές ουσίες, παρατηρείται η ενεργοποίηση της φαγοκυττάρωσης και της αναπνευστικής έκρηξης (Garcia-Garcia et al., 2008). Μεταξύ των μορίων που συστρατεύονται στα επαγόμενα σηματοδοτικά μονοπάτια είναι η NADPH-οξειδάση, η NO-συνθετάση και η PI3- κινάση. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των κυτταροτοξικών, οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων του [omim][bf4] στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis, καθώς και η πιθανή συμμετοχή της διαδικασίας της αναπνευστικής έκρηξης (υπό τη μελέτη των NADPH-οξειδάσης και NO-συνθετάσης, καθώς και της PI3-κινάσης) στις [omim][bf4]-επαγόμενες επιπτώσεις. Συγκεκριμένα, η ενζυμική δραστικότητα σε κάθε περίπτωση προσδιορίστηκε έμμεσα με τη χρήση ειδικών αναστολέων σε κατάλληλες συγκεντρώσεις, όπως 10 μm DPI (αναστέλλει τη δράση της NADPH-οξειδάσης), 10 μm L-NAME (αναστέλλει τη δράση της NO-συνθετάσης) και 50 nμ wortmannin (αναστέλλει τη δράση της PI3-κινάσης). Οι κυτταροτοξικές επιπτώσεις του [omim][bf4] διερευνήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου ουδέτερου ερυθρού (Neutral Red Uptake/NRU), ενώ οι οξειδωτικές επιπτώσεις μελετήθηκαν μέσω προσδιορισμού των επιπέδων των σουπεροξειδικών ανιόντων, των οξειδίων του αζώτου και της μηλονικής διαλδεΰδης (δείκτης λιπιδικής υπεροξείδωσης). Τέλος, οι γενοτοξικές 26

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιπτώσεις που επάγονται από υπο-θανατογόνες συγκεντρώσεις του [omim][bf4] μελετήθηκαν με τη μέθοδο των κομητών (Comet Assay). 27

28 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Αντιδραστήρια και διαλύματα Για τις πειραματικές τεχνικές που εφαρμόστηκαν, χρησιμοποιήθηκε το IL [omim][bf4], της εταιρίας Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), συγκέντρωσης 1120 g L και καθαρότητας 97% (Πίνακας 2). Με λήψη της απαραίτητης ποσότητας επιτεύχθηκαν σε κάθε περίπτωση οι επιθυμητές συγκεντρώσεις. Πίνακας 2. Βασικά χαρακτηριστικά του IL [omim][bf4]. [omim][bf4] Χημική Δομή CAS-number Χημικός Τύπος C12H23BF4N2 Μοριακό Βάρος Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν, κατ αλφαβητική σειρά, για τη διεξαγωγή των πειραμάτων στις διάφορες τεχνικές που εφαρμόστηκαν είναι τα εξής: Acetic acid (οξικό οξύ) καθαρότητας 96% Agarose for routine use (normal melting point agarose /NMP) Agarose type VII (low melting point agarose/lmp) BHT (βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D(+) Sucrose EDTA (Ethylene-diamine-tetraacetic acid) καθαρότητας 99% Ethanol καθαρότητας 96% HCl 37% HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ] KCl Methanol καθαρότητας 99.8% Nitroblue tetrazolium (NBT) Sarcosinate-N-Lauroylsarcosine sodium salt Phosphoric acid (φωσφορικό οξύ) καθαρότητας 25% 28

29 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ TBA (θειοβαρβιτουρικό οξύ) TCA (τριχλωροξικό οξύ) καθαρότητας 99.5% TRIS [tris(hydroxymethyl)aminomethane] καθαρότητας 99.9 % Απορρυπαντικό TRITON X-100 Χρωστική Neutral Red Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας κατ αλφαβητική σειρά είναι τα εξής : 0.02% BHT (BHT διαλυμένο σε απόλυτη αιθανόλη) 1% LMP: Low Melting Point agarose διαλυμένο σε διάλυμα PBS (ph 7.4) 0.1% N-napthyl-ethylene-diamine (NEM) διαλυμένο σε διάλυμα 5% φωσφορικού οξέος 2% NMP: Normal Melting Point agarose διαλυμένο σε διάλυμα ΤΑΕ 1% sulfanilic acid διαλυμένο σε διάλυμα 5% φωσφορικού οξέος 0.375% w/v TBA σε HCl 0.25N 15% w/v TCA σε HCl 0.25N 0.1M TRIS/HCl και 0.1% TRITON X-100 (ph 7) CBB 2N: HCl 2N (60 mg CBB/100 ml HCl) Ethanol: acetic acid (3:1) HCl 0.25N (37% HCl σε 2dH2O) Kenny s salt ή PBS: 0.4 mm NaCl, 9 mm KCl, 0.7 mm K2HPO4, 2 mm NaHCO3, 2dH2O (ph 7.4) Methanol (70% διαλυμένη σε 2dH2O) NBT διαλυμένο σε διάλυμα TBS (1mg ml -1 ) Neutralizing solution (Διάλυμα TRIS): 0.4M TRIS, 2dH2O (ph 7.5) TRIS-HCl 50mM, 1mM EDTA, 0.15M KCl (ph 7.4) Διάλυμα ALSEVE (ALS): 20.8Μ glucose, 8Μ sodium citrate triphasic, 3.36Μ EDTA, 22.5M NaCl, 50 ml 2dH2O (ph 7) Διάλυμα Saline: g HEPES, g NaCl, g MgSO4, g KCl, g CaCl2, 100 ml 2dH2O (ph 7.3) Διάλυμα TAE: 40 mm TRIS-acetate, 1 mm Na4EDTA, 2dH2O (ph 7.4) Διάλυμα TBS: 0.05M Tris chloride buffer το οποίο περιέχει 2% NaCl (ph 7.6) Διάλυμα εξαγωγής: 2M KOH διαλυμένο σε DMSO 29

30 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Διάλυμα ηλεκτροφόρησης: 0.075M NaOH, 1 mm EDTA, 2dH2O (ph 12) Διάλυμα λύσης κυττάρων: 2.5M NaCl, 100 mm Na2EDTA, 10 mm TRIS, 1% Sarcosinate-N-Layroylsarccosine sodium salt, 1% TRITON X-100, 10% DMSO, 2dH2O (ph 10) 2.2. Σχεδιασμός πειραματικής διαδικασίας Εγκλιματισμός μυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis Από μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας/οστρακοκαλλιέργειας (βόρειο τμήμα του Κορινθιακού Κόλπου, στην περιοχή Γαλαξίδι, Κόλπος Κοντινόβα) λήφθηκαν τα μύδια που χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις πειραματικές τεχνικές τοξικότητας (Εικόνα 9). Η περιοχή αυτή δεν είναι επιβαρυμένη με τοξικές ουσίες, όπως αποδεικνύεται από πολλές μελέτες (Banakou and Dailianis, 2010; Danellakis et al., 2011; Kalpaxis et al., 2004). Τα μύδια που συλλέχθηκαν (μήκους 5-6 cm) μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο και τοποθετήθηκαν σε δεξαμενές τεχνητού θαλασσινού νερού (Artificial Seawater/ASW) αλατότητας 34-35, το οποίο διερχόταν μέσα από κατάλληλα φίλτρα καθαρισμού, καθώς και από λάμπα UV, προκειμένου να αποστειρώνεται πριν από την είσοδό του στη δεξαμενή. Η θερμοκρασία του χώρου, όπου φυλάσσονταν οι δεξαμενές, διατηρούταν σταθερή στους C. Οι συνθήκες αυτές επιλέχθηκαν, με βάση τις βέλτιστες παραμέτρους για την καλύτερη επιβίωση των οργανισμών. Κατά την περίοδο εγκλιματισμού δεν πραγματοποιήθηκε παροχή φαγητού, έτσι ώστε τα μύδια να αποβάλλουν τυχόν ουσίες που βρίσκονταν στον πεπτικό τους αδένα. Μετά την περίοδο εγκλιματισμού, ακολούθησε προσθήκη τροφής (Isochrysis galbana) καθημερινά, καθόλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Τυχόν νεκρά μύδια απομακρύνονταν από τα ενυδρεία και δεν χρησιμοποιούνταν για τις πειραματικές αναλύσεις. Ως νεκρά θεωρούνταν εκείνα τα άτομα που δεν αντιδρούσαν στο άγγιγμα και παρέμεναν ανοιχτά. 30

31 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 9. Περιοχή δειγματοληψίας μυδιών, στον Κόλπο Κοντινόβα που εντοπίζεται μεταξύ του Γαλαξιδίου και της Ιτέας (πηγή Λήψη και χειρισμός αιμολέμφου για in vitro πειράματα Για την πραγματοποίηση της in vitro έκθεσης των αιμοκυττάρων, η διαδικασία περιελάμβανε συλλογή της αιμολέμφου από τον οπίσθιο προσαγωγό μυ 10 μυδιών (μήκους 5-6 cm) με τη βοήθεια αποστειρωμένης σύριγγας (3 ml) και βελόνας (18G1/2 ) σε falcon των 15 ml, φυγοκέντρηση (1000 x g, 10 min) και διαχωρισμό της αιμολέμφου από τα αιμοκύτταρα. Ακολουθούσε αποστείρωση της αιμολέμφου με τη χρήση φίλτρου Whatman (διάμετρος πόρων 0.22 μm) και επαναιώρηση των αιμοκυττάρων. Στη συνέχεια, 1 ml κυτταρικού αιωρήματος εκτέθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις [omim][bf4] για 1h παρουσία ή απουσία αναστολέων, προκειμένου να ακολουθήσει η εκάστοτε πειραματική διαδικασία Εκτίμηση της σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης σε αιμοκύτταρα των μυδιών, μετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις [omim][βf4] Η μελέτη των οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων μιας ουσίας προϋποθέτει τη χρησιμοποίησή της σε υπο-θαναγόνες συγκεντρώσεις, προκειμένου να μειωθεί η πιθανότητα εσφαλμένων αποτελεσμάτων, λόγω κυτταρικού θανάτου (Danellakis et al., 2011). Συγκεκριμένα, αρχικά πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της σταθερότητας της λυσοσωμικής μεμβράνης των αιμοκυττάρων, με τη χρήση της μεθόδου ουδέτερου ερυθρού (Neutral red uptake) (Dailianis, 2009), μετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις [omim][bf4] (0,1-10 mg L -1 ) και ο προσδιορισμός των 31

32 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ συγκεντρώσεων που δεν προκαλούν στατιστικά σημαντική θνησιμότητα. Η εν λόγω χρωστική εισέρχεται στα λυσοσώματα των ζωντανών κυττάρων και η αποσταθεροποίηση της λυσοσωμικής μεμβράνης με το χρόνο οδηγεί σε διάχυσή της στο κυτταρόπλασμα, γεγονός που αποτελεί ένδειξη επιβάρυνσης των κυττάρων και γενικότερα της κατάστασης του οργανισμού. Σύμφωνα με τη μέθοδο, κύτταρα που εκτέθηκαν παρουσία ή απουσία του IL για 1 h, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Alseve (ALS) που περιείχε 0.004% (w/v) χρωστικής NR (1 ml/eppendorf). Ακολούθησε παραμονή των δειγμάτων στο σκοτάδι για 2h στους 4 ο C. Στη συνέχεια, και μετά από φυγοκέντρηση (1200 x g, 10 min) των δειγμάτων, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα αιμοκύτταρα επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα ALS προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια της χρωστικής που δεν εισήλθε στα κύτταρα (διαδικασία πλύσης με διάλυμα Alseve πραγματοποιήθηκε συνολικά 2 φορές). Στη συνέχεια, ακολούθησε προσθήκη διαλύματος οξικού οξέος:αιθανόλης (1% v/v:50% v/v), φυγοκέντρηση (1200 x g, 10 min) των δειγμάτων και μέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε μήκος κύματος 550 nm. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως οπτική απορρόφηση στα 550nm ανά mg πρωτεΐνης ± τυπική απόκλιση για κάθε δείγμα Πειραματική διαδικασία έκθεσης αιμοκυττάρων σε [omim][βf4], απουσία ή παρουσία αναστολέων. Με βάση τα αποτελέσματα της τεχνικής neutral red uptake η συγκέντρωση του [omim][bf4] που επιλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ήταν το 1 mg L -1. Συγκεκριμένα, εναιώρημα αιμοκυττάρων σε αποστειρωμένη αιμόλεμφο εκτέθηκαν σε [omim][bf4] 1 mg L -1 για 1 h, παρουσία των αναστολέων (α) της NADPH οξειδάσης (DPI 10 μμ), (β) της ΝΟ συνθετάσης (L-NAME 10 μμ) και (γ) PI3- κινάσης (wortmannin 50 nm). Μετά την έκθεση, το κυτταρικό εναιώρημα συλλέχθηκε προκειμένου να ακολουθήσει ο προσδιορισμός (α) των σουπεροξειδικών ανιόντων, (β) των οξειδίων του αζώτου (με την μορφή των NO2 - ), (γ) των επιπέδων της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και (δ) των επιπέδων βλάβης του DNA (με την τεχνική Comet assay) Προσδιορισμός σουπεροξειδικών ανιόντων Ο προσδιορισμός των σουπεροξειδικών ανιόντων (O2 ) στα αιμοκύτταρα των μυδιών πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο των Pipe et al. (Pipe et al., 1995), με ορισμένες τροποποιήσεις. Η μέθοδος στηρίζεται στη μετατροπή του αντιδραστηρίου NBT 32

33 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (nitroblue tetrazolium) σε NBT-diformazan υπό την επίδραση ανιόντων O2 (Εικόνα 10), ενώ ο υπολογισμός της παραγωγής τους διεξάγεται μέσω προσδιορισμού της οπτικής απορρόφησης του μορίου NBT-diformazan σε μήκος κύματος 620 nm. Πιο συγκεκριμένα, ύστερα από τη 1 h έκθεσης του κυτταρικού αιωρήματος ακολούθησε φυγοκέντρηση και επαναιώρηση των αιμοκυττάρων σε διάλυμα TBS/ΝBT (συγκέντρωση ΝΒΤ 1 mg ml -1 ). Μετά από επώαση των δειγμάτων για 2 h στο σκοτάδι, πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση (1200 x g, 10 min), απομάκρυνση του υπερκειμένου και μετέπειτα πλύση των δειγμάτων με την προσθήκη διαλύματος TBS (η διαδικασία πραγματοποιήθηκε συνολικά 2 φορές). Στη συνέχεια, ακολούθησε προσθήκη 70% μεθανόλης και παραμονή των δειγμάτων για 15 min σε σκοτεινό μέρος. Τέλος, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (1200 x g, 10 min) και μετά από την απομάκρυνση της μεθανόλης και την ξήρανση των δειγμάτων (περίπου για min), ακολούθησε προσθήκη διαλύματος εξαγωγής (2Μ KOH σε DMSO), παραμονή στο σκοτάδι για 30 min, φυγοκέντρηση (1000 x g, 10 min) και μέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε μήκος κύματος 620 nm (ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε το διάλυμα εξαγωγής, 2M KOH σε DMSO). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως οπτική απορρόφηση στα 620 nm mg πρωτεΐνης -1 του κάθε δείγματος. Εικόνα 10. Σχηματική απεικόνιση της δράσης των ανιόντων (O2 ) στη μετατροπής του NBT σε NBT-diformazan, που απορροφά στα 620 nm. Αυξημένη συγκέντρωση ανιόντων υποδηλώνεται με αυξημένη τιμή απορρόφησης του NBT-diformazan Ανίχνευση NO στα αιμοκύτταρα των μυδιών Τα νιτρώδη (NO2 - ) και νιτρικά (NO3 - ) προέρχονται από τις αντιδράσεις του ασταθούς μορίου NO εντός των κυττάρων. Η μέτρηση των NO2 - μέσω της αντίδρασης Griess (Green et al., 1982) έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές περιπτώσεις για την 33

34 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ εκτίμηση των επιπέδων των NO σε ζωντανά κύτταρα (Bouki et al., 2013; Dailianis, 2009; Dailianis et al., 2009; Toufexi et al., 2016; Vouras and Dailianis, 2012). Πιο συγκεκριμένα, ύστερα από την έκθεση των αιμοκυττάρων σε [omim][bf4] παρουσία ή απουσία των αναστολέων, ακολούθησε φυγοκέντρηση (1200 x g, 10 min) των δειγμάτων, απομάκρυνση του υπερκειμένου σε κάθε περίπτωση και επακόλουθη προσθήκη 500 μl 1% σουλφανιλικού οξέος (διαλυμένου σε 5% v/v φωσφορικού οξέος). Ύστερα από 10 min επώασης σε θερμοκρασία δωματίου ακολούθησε προσθήκη 500 μl 0.1% (v/v) N-(1-Naphthyl)ethylene-diamine (διαλυμένου σε 5% v/v φωσφορικού οξέος), επώαση των δειγμάτων για 15 min και μέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε μήκος κύματος 540 nm. Η συγκέντρωση των NO2 - σε κάθε δείγμα υπολογίστηκε με τη βοήθεια πρότυπων καμπυλών νιτρώδους νατρίου γνωστής συγκέντρωσης (1-100 μm NaNO2). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol NO2 - mg πρωτεΐνης -1 για κάθε δείγμα Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, μέσω προσδιορισμού των επιπέδων της MDA στα αιμοκύτταρα των μυδιών M. galloprovincialis Η εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης (lipid peroxidation, LPO) πραγματοποιήθηκε μέσω του σχηματισμού θειοβαρβιτουρικών ενώσεων (thiobarbituric acid-reactive substances, TBARs), ποσοτικά εκφραζόμενη ως ισοδύναμο της μηλονικής διαλδεΰδης (malondialdehyde, MDA). Το μόριο MDA αποτελεί παράγωγο της υπεροξείδωσης των λιπιδίων και η μέτρησή του χρησιμοποιείται ευρέως ως ένας αξιόπιστος δείκτης της οξειδωτικής καταστροφής των κυτταρικών μεμβρανών και, συνεπώς, του οξειδωτικού stress (Janero, 1990). Η εν λόγω αντίδραση βασίζεται στη στοιχειομετρική αντίδραση ενός μορίου MDA και 2 μορίων θειοβαρβιτουρικού οξέος προς σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος (Εικόνα 11), σε όξινες συνθήκες (ph 2-3, καθώς σε ph <2 δεν σχηματίζεται το έγχρωμο προϊόν). Η συγκέντρωση του προϊόντος προσδιορίζεται φωτομετρικά και παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση σε μήκος κύματος nm. Για τη μέτρηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (1200 x g, 10 min) και μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου ακολούθησε προσθήκη διαλύματος τριχλωροξικού οξέος (TCA)- θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBA)- HCL (15 % w/v TCA, 0.375% w/v TBA σε HCl 0.25 N), ανάδευση και εν συνεχεία προσθήκη 10 μl βουτυλιωμένου υδροξυ-τολουολίου (0.02% w/v BHT), προκειμένου να αποτραπεί η περαιτέρω υπεροξείδωση των λιπιδίων. Ακολούθησε μεταφορά των 34

35 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ δειγμάτων σε κλίβανο στους 90 ο C για 15 min, απομάκρυνση και παραμονή τους σε θερμοκρασία δωματίου, φυγοκέντρση (1500 x g, 10 min) και μέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε μήκος κύματος 535 nm (ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 15 % w/v TCA, 0.375% w/v TBA σε HCl 0.25 N). Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης MDA χρησιμοποιήθηκε ο μοριακός συντελεστής 1.5 x 10 5 M -1 cm -1 (Wills, 1969) και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol MDA mg πρωτεΐνης -1. Εικόνα 11. Η αντίδραση της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και του 2- θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBA) προς σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος (TBARS) (Grintzalis et al., 2013) Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών Προκειμένου να εκτιμηθεί ο βαθμός βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική ανάλυσης Κομητών (Comet Assay/Alkaline Single Cell Electrophoresis), σύμφωνα με τη μέθοδο των Danellakis και συν. (Danellakis et al., 2011). Η εν λόγο μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι οι πυρήνες των κυττάρων λαμβάνουν ένα χαρακτηριστικό σχήμα κομητών, η κεφαλή των οποίων αποτελείται από άθικτο γενετικό υλικό και η ουρά τους από θραύσματα γενετικού υλικού. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, ανιχνεύονται μονόκλωνα τμήματα γενετικού υλικού (singlestrand DNA breaks/alkali labile sites), μέσω του προσδιορισμού της μετανάστευσης του DNA από το πυρηνικό DNA (Singh et al., 1988). Πιο συγκεκριμένα, ύστερα από την έκθεση των αιμοκυττάρων σε [omim][bf4] παρουσία ή απουσία αναστολέα, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και μετά από την απομάκρυνση του υπερκειμένου, επαναιωρήθηκαν σε 180 μl 1% (w/v) low meltingpoint agarose (LMA, σε διάλυμα Kenny s σύστασης 0.4M NaCl, 9 mm KCl, 0.7 mm K2HPO4, 2 mm NaHCO3). Ακολούθησε επίστρωση 100 μl σε αντικειμενοφόρους πλάκες, οι οποίες είχαν προηγουμένως επιστρωθεί με 200 μl 0.2% (w/v) normal melting point agarose agarose (NMP, σε διάλυμα TAE σύστασης 40 mm TRIS-acetate, 1mM EDTA), τοποθέτηση καλυπτρίδας και παραμονή των δειγμάτων σε σκοτάδι 35

36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ προκειμένου να πραγματοποιηθεί πολυμερισμός της αγαρόζης (περίπου για min). Ακολούθησε εμβάπτιση των δειγμάτων, μετά από απομάκρυνση της καλυπτρίδας, σε διάλυμα λύσης (2.5M NaCl, 100 mm Na2EDTA, 10 mm TRIS base, 1% Sarcosinate-N-Lauroylsarcosinnatrium salt, 1% TRITON X-100, 10% DMSO, ph 10) για 1h στους 4 ο C, πλύση των δειγμάτων με απιονισμένο νερό και τοποθέτησή τους οριζόντια σε συσκευή ηλεκτροφόρησης, στην οποία είχε προστεθεί διάλυμα ηλεκτροφόρησης (Electrophoresis Buffer, 300 mm NaOH, 1 mm EDTA, ph>12). Μετά από την αποδιάταξη του DNA (παραμονή 30 min) ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων (25V/cm, 300 ma, 25 min) και εξουδετέρωση με τη χρήση διαλύματος TRIS (0.4M, ph 7.5) για 5 min (3 φορές). Ο προσδιορισμός (παρατήρηση, καταμέτρηση και αξιολόγηση ποιότητας κομητών) των κομητών πραγματοποιούνταν με την προσθήκη διαλύματος βρωμιούχου αιθιδίου (20 mg ml -1 ), με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού (μεγέθυνση 40 x, Axio Carl Zeiss, Micro-imaging, Germany/Isis fluorescence imaging system analysis, Metasystems, Germany). Ο προσδιορισμός του βαθμού της βλάβης του γενετικού υλικού επιτεύχθηκε με την επιλογή μόνο των κομητών (Εικόνα 12) που πληρούσαν τα κριτήρια που ανέπτυξαν οι Ritter και Knebel (Ritter and Knebel, 2009), οι οποίοι και αναλύθηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος Tritek Cometscore TM. Για κάθε περίπτωση ελέγχθηκαν τουλάχιστον 100 πυρήνες ανά αντικειμενοφόρο πλάκα (4 αντικειμενορόφοι πλάκες για κάθε περίπτωση) και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος του επί τοις % ποσοστό του γενετικού υλικού που αντιστοιχεί στην ουρά του κομήτη (% DNA in tail), olive moment (OM) και tail moment (TM) ± τυπική απόκλιση. Οι παράμετροι αυτοί θεωρούνται ως οι πιο αξιόπιστοι για την εκτίμηση της βλάβης του DNA. 36

37 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 12. Τυπική εικόνα κομητών (μεγέθυνση 100x) με διαφορετικά επίπεδα βλάβης Προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης στα δείγματα κάθε ομάδας έκθεσης Η μέτρηση της πρωτεΐνης στα δείγματα της κάθε ομάδας έκθεσης προσδιορίστηκε με βάση την υπερευαίσθητα υδρόφοβη μέθοδο των Grintzalis και συν. (Grintzalis et al., 2015), η οποία βασίζεται στη δοκιμασία Coomassie Brilliant Blue-G, και τη χρήση αλβουμίνης (Bovine Serum Albumin/BSA) για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης. Η εν λόγω μέθοδος βασίζεται στην ηλεκτροστατικής φύσης αντίδραση των πρωτεϊνών με το αντιδραστήριο Coomassie Brilliant Blue-G250 που ενισχύεται από την υδροφοβικότητα, η οποία αυξάνει τον αριθμό των μορίων της χρωστικής που προσδένονται ανά μόριο πρωτεΐνης. Παρόλο που η μέθοδος αναφέρεται στη μέτρηση πρωτεΐνης με τη χρήση microplate, όπως αναφέρουν οι συγγραφείς μπορεί να εφαρμοστεί και σε μεγαλύτερης κλίμακας μετρήσεις με αντίστοιχη αύξηση του όγκου των αντιδραστηρίων και του δείγματος ή του 2dH2O στην περίπτωση του τυφλού αντιδραστηρίου. Πιο συγκεκριμένα, για την παρασκευή του διαλύματος CBB 2N, σε 100 ml 2N HCl διαλύθηκαν 60 mg χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 υπό συνεχή ανάδευση για 40 min. Στη συνέχεια, απομακρύνθηκαν τυχόν αδιάλυτα σωματίδια χρωστικής με φυγοκέντρηση (4000 x g, 10 min) σε θερμοκρασία δωματίου. Το διηθημένο διάλυμα μεταγγίστηκε σε σκουρόχρωμο γυάλινο δοχείο προκειμένου να 37

38 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ προστατεύεται από το φως. Για την παρασκευή του διαλύματος 2N HCl, σε 10 ml 2dH2O προστέθηκαν 2 ml 12N HCl (το διάλυμα αυτό παρασκευάζεται φρέσκο κάθε φορά). Για την παρασκευή του διαλύματος CBB 2N:2N HCl:2dH2O (1:1:3), αναμείχθηκαν 12 ml 2dH2O με 4 ml 2N HCl και 4 ml CBB 2N. Η τεχνική αυτή πραγματοποιείται με την προσθήκη 500 μl δείγματος ή 2dH2O (τυφλό αντιδραστήριο) και 500 μl διαλύματος CBB 2N:2N HCl: 2dH2O (1:1:3). Τα δείγματα αφού επωάστηκαν για 10 min, φωτομετρήθηκαν στα 610 nm και τα τελικά αποτελέσματα υπολογίσθηκαν με βάση την πρότυπη καμπύλη της αλβουμίνης και εκφράστηκαν ως mg ολικής πρωτεΐνης (ισοδύναμα BSA) ανά ml ομογενοποιήματος. 2.6 Στατιστική ανάλυση των δεδομένων Η στατιστική ανάλυση όλων των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου IBM SPSS 19 Inc. Πιο συγκεκριμένα, η εκτίμηση της βιωσιμότητας των κυττάρων (προσδιορισμός της τιμής NRRT50 για το υπό μελέτη IL, [omim][bf4]) υπολογίστηκε με τη χρήση του μη-παραμετρικού ελέγχου Mann Whitney U test (p<0.05). Με τη χρήση αυτού του μοντέλου ελέγχθηκαν και οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των επί μέρους περιπτώσεων που ελέγχθηκαν για την εκτίμηση των επιπέδων των O2 -, των NO και των MDA. Όσον αφορά στον έλεγχο των στατιστικώς σημαντικών διαφορών μεταξύ των επί μέρους περιπτώσεων που ελέγχθηκαν για την εκτίμηση των επιπέδων βλάβης του γενετικού υλικού χρησιμοποιήθηκε ο μη-παραμετρικός έλεγχος Kruskall Wallis (p<0.05, N=4). 38

39 OD 550 nm /mg protein ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Προσδιορισμός των υποθανατογόνων συγκεντρώσεων του [omim][bf4] Η διερεύνηση των θαναγοτόνων και υποθανατογόνων συγκεντρώσεων του [omim][bf4], που πραγματοποιήθηκε μέσω της τεχνικής του ουδέτερου ερυθρού (Neutral Red Uptake), έδειξε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες των 0.5 mg L -1 (Mann Whitney U test, p<0.05), ενώ για συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 1 mg L -1 παρατηρήθηκε πάνω από 50% βιωσιμότητα των κυττάρων (Διάγραμμα 1) p<0.05 >50% cell death [omim][bf 4 ] (mg L -1 ) Διάγραμμα 1. Προσδιορισμός της βιωσιμότητας των αιμοκυττάρων των μυδιών (εκφραζόμενης ως τιμές Neutral red uptake) ύστερα από έκθεση 1h σε διαφορετικές συγκεντρώσεις έκθεσης σε [omim][bf4]. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν (εκφραζόμενα ως οπτική απορρόφηση OD550nm mg πρωτεΐνης -1 ) αποτελούν τη μέση τιμή των τιμών της οπτικής απορρόφησης του ουδέτερου ερυθρού ± τυπική απόκλιση (SD) από έξι (6) διαφορετικές πειραματικές μετρήσεις για κάθε περίπτωση. Σε κάθε πειραματική πορεία, εναιώρημα αιμοκυττάρων συλλέχθηκε από δέκα (10) μύδια. Τα αιμοκύτταρα που εκτέθηκαν στο [omim][bf4] σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες των 0.2 mg L -1 ( mg L -1 ) εμφάνισαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05) από το control (Mann Whitney U test, p<0.05), ενώ τα αιμοκύτταρα που εκτέθηκαν στο [omim][bf4] σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 1 mg L -1 (2-10 mg L -1 ) εμφάνισαν ποσοστό κυτταρικού θανάτου μεγαλύτερο από 50%. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά επιλέχθηκε ως υπο-θανατογόνος συγκέντρωση το 1 mg L -1 και στη συνέχεια εξετάστηκαν οι οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις του, παρουσία ή απουσία των αναστολέων (50 nμ wortmannin, 10 μm L-NAME, 10 μm DPI). 39

40 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.2. Προσδιορισμός των επιπέδων των O2 - και NO στα αιμοκύτταρα των μυδιών Όσον αφορά στα αποτελέσματα των σουπεροξειδικών ανιόντων (O2 - ), στις περιπτώσεις έκθεσης των αιμοκυττάρων παρουσία των αναστολέων (wortmannin, L- NAME και DPI) δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου και τα DMSO-κύτταρα. Αντίθετα, τα εκτιθέμενα σε 1 mg L -1 [omim][bf4] αιμοκύτταρα παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αύξηση τόσο σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, όσο σε σχέση με τα εκτιθέμενα σε 1 mg L -1 [omim][bf4] παρουσία των αναστολέων (50 nμ wortmannin, 10 μm L-NAME, 10 μm DPI) αιμοκύτταρα (Διάγραμμα 2Α). Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν για τα επίπεδα των ΝΟ, σύμφωνα με τα οποία τα αιμοκύτταρα που εκτέθηκαν σε 1 mg L -1 [omim][bf4] παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου και τα DMSOκύτταρα. Για τις περιπτώσεις έκθεσης των κυττάρων σε 1 mg L -1 [omim][bf4] παρουσία των αναστολέων wortmannin ή DPI παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, ενώ για την περίπτωση έκθεσης των κυττάρων σε 1 mg L -1 [omim][bf4] παρουσία του αναστολέα L-NAME παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων των NO σε σχέση με τα εκτιθέμενα μόνο σε [omim][bf4] αιμοκύτταρα (Διάγραμμα 2Β). Πίνακας 3. Προσδιορισμός των επιπέδων των O2 -, των NO και της MDA, μετά από έκθεση των αιμοκυττάρων απουσία ή παρουσία DMSO (οργανικός διαλύτης/μεταφορέας), στο οποίο ήταν διαλυμένος ο εκάστοτε αναστολέας. Τα αποτελέσματα αποτελούν το μέσο όρο ± τυπική απόκλιση από έξι (6) ανεξάρτητες πειραματικές μετρήσεις για κάθε περίπτωση. Σε κάθε πειραματική πορεία, εναιώρημα αιμοκυττάρων λήφθηκε από δέκα (10) μύδια. Τιμές με το ίδιο γράμμα εμφανίζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ τους (Mann Whitney U test, p<0.05) O 2 2 NO 3 MDA Control 2.52 ± ± ± 1.53 DMSO 3.52 ± ± ± nm Wortmannin 3.03 ± ± ± μμ L-NAME 5.16 ± ± ± μμ DPI 3.44 ± ± ± , OD 620 nm mg πρωτεΐνης -1 2, nmol NO mg πρωτεΐνης -1 3, nmol MDA mg πρωτεΐνης -1 Σε κάθε περίπτωση, όσον αφορά στα επίπεδα των O2 - και στα επίπεδα των NO, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των περιπτώσεων έκθεσης 40

41 nmol NO/mg protein OD 620 nm /mg protein ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ των αιμοκυττάρων σε [omim][bf4] παρουσία των αναστολέων με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου (απουσία IL και παρουσία αναστολέων) (Mann Whitney U test, p<0.05) (Πίνακας 3). A *abc a b c B *a * * a Διάγραμμα 2. Προσδιορισμός των O2 - (A) και των NO (B) σε αιμοκύτταρα των μυδιών, μετά από έκθεση σε 1 mg L -1 [omim][bf4] απουσία ή παρουσία των αναστολέων (50 nμ wortmannin, 10 μm L-NAME, 10 μm DPI). Τα αποτελέσματα (εκφραζόμενα ως οπτική απορρόφηση OD620nm mg πρωτεΐνης -1 και ως nmol NO2 - mg πρωτεΐνης -1, με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης NaNO2) αποτελούν το Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση από έξι (6) διαφορετικές πειραματικές μετρήσεις για κάθε περίπτωση. Σε κάθε πειραματική πορεία, εναιώρημα αιμοκυττάρων συλλέχθηκε από δέκα (10) μύδια. *: στατιστικά σημαντική διαφορά από control. Τιμές με το ίδιο γράμμα εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (Mann Whitney U test, p<0.05). 41

42 nmol MDA/mg protein ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.3. Προσδιορισμός των επιπέδων MDA στα αιμοκύτταρα των μυδιών Αναφορικά με τα επίπεδα της MDA, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση μεταξύ των κυττάρων που εκτέθηκαν σε 1 mg L -1 [omim][bf4] σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, ενώ στις περιπτώσεις έκθεσης των κυττάρων σε 1 mg L -1 [omim][bf4] παρουσία των αναστολέων L-NAME (10 μm) ή DPI (10 μm), αντίστοιχα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων MDA σε σχέση με τα εκτιθέμενα σε [omim][bf4] αιμοκύτταρα (Mann Whitney U test, p<0.05) (Διάγραμμα 3). Σε κάθε περίπτωση δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα MDA τόσο μεταξύ των περιπτώσεων έκθεσης των αιμοκυττάρων σε [omim][bf4] παρουσία των αναστολέων με τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου τους (απουσία IL και παρουσία αναστολέων) (Mann Whitney U test, p<0.05) (Πίνακας 3). 12 *ab a b Διάγραμμα 3. Προσδιορισμός των επιπέδων της MDA σε αιμοκύτταρα των μυδιών, μετά από έκθεση σε 1 mg L -1 of [omim][bf4] απουσία ή παρουσία των αναστολέων (50 nμ wortmannin, 10 μm L-NAME, 10 μm DPI). Τα αποτελέσματα (εκφρασμένα ως nmol MDA mg πρωτεΐνης -1 ) αποτελούν το Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση από έξι (6) ανεξάρτητες πειραματικές μετρήσεις για κάθε περίπτωση. Σε κάθε πειραματική πορεία, εναιώρημα αιμοκυττάρων συλλέχθηκε από δέκα (10) μύδια. *: στατιστικά σημαντική διαφορά από control. Τιμές με το ίδιο γράμμα εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (Mann Whitney U test, p<0.05) Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών Τα αποτελέσματα της εκτίμησης του βαθμού βλάβης του DNA εκφράστηκαν ως το επί τοις % ποσοστό του γενετικού υλικού που αντιστοιχεί στην ουρά του κομήτη (% 42

43 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DNA in tail), καθώς και σε καθιερωμένες παραμέτρους εκτίμησης/προσδιορισμού της βλάβης του DNA (olive moment, tail moment) (Διάγραμμα 4A-C). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η έκθεση των αιμοκυττάρων σε κάθε αναστολέα δεν έδειξε στατιστική διαφορά (Kruskall Wallis, p<0.05) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου και τα DMSOκύτταρα σε κάθε περίπτωση, ενώ σημαντική βλάβη παρατηρήθηκε σε αιμοκύτταρα που εκτέθηκαν σε 1 mg L -1 [omim][bf4] (% DNA in tail = ± 3.21), συγκριτικά με τα μειωμένα επίπεδα βλάβης που παρατηρήθηκαν στα κύτταρα ελέγχου (control και DMSO-κύτταρα) (Πίνακας 4). Αντίθετα, κύτταρα που προ-επωάστηκαν με κάθε αναστολέα, προτού εκτεθούν στο ιοντικό υγρό, έδειξαν σημαντική μείωση των γενοτοξικών επιπτώσεών του σε κάθε περίπτωση (Διάγραμμα 4A-C), παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα βλάβης παρέμειναν μεγαλύτερα συγκριτικά με τα αντίστοιχα των κυττάρων ελέγχου. Πίνακας 4. Προσδιορισμός των επιπέδων βλάβης του DNA (εκφρασμένων ως επί τοις % ποσοστό του γενετικού υλικού που αντιστοιχεί στην ουρά του κομήτη, tail moment και olive moment) σε αιμοκύτταρα μυδιών απουσία ή παρουσία DMSO (οργανικός διαλύτης/μεταφορέας), στο οποίο ήταν διαλυμένος ο εκάστοτε αναστολέας. Τα αποτελέσματα αποτελούν το Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση από τέσσερεις (4) ανεξάρτητες πειραματικές μετρήσεις για κάθε περίπτωση (N = 4, κάθε μέτρηση υποδηλώνει το μέσο όρο που λήφθηκε από την ανάλυση τεσσάρων (4) αντικειμενοφόρων πλακών με παρόμοιο αριθμό κυττάρων, για κάθε περίπτωση). Τιμές με το ίδιο γράμμα εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους, ενώ τιμές με αστερίσκο (*) εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορά από το control (Kruskall-Wallis, p < 0.05, N = 4). % DNA in tail Tail moment Olive moment Control 3.75 ± ± ± 0.44 DMSO 3.80 ± ± ± nm Wortmannin 5.64 ± ± ± μμ L-NAME 8.42 ± ± ± μμ DPI 7.13 ± ± ±

44 Olive Moment (OM) Tail Moment (TM) % DNA in tail ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α *abc *a *b *c Β *abc *b *c 10 5 *a 0 C *abc *b *c 5 *a 0 Διάγραμμα 4. Προσδιορισμός των επιπέδων βλάβης του DNA (A: % DNA in tail; B: Tail moment; C: Olive moment) σε αιμοκύτταρα των μυδιών, μετά από έκθεση σε 1 mg L -1 of [omim][bf4] απουσία ή παρουσία των αναστολέων (50 nμ wortmannin, 10 μm L-NAME, 10 μm DPI). Τα αποτελέσματα αποτελούν το Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση τεσσάρων (4) ανεξάρτητων πειραματικών μετρήσεων (N = 4, κάθε μέτρηση υποδηλώνει το μέσο όρο που λήφθηκε από την ανάλυση τεσσάρων (4) αντικειμενοφόρων πλακών με παρόμοιο αριθμό κυττάρων, για κάθε περίπτωση). *: στατιστικά σημαντική διαφορά από control. Τιμές με το ίδιο γράμμα εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (Kruskall-Wallis, p < 0.05, N = 4). 44

45 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Λαμβάνοντας υπόψη προηγούμενες μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις των ιοντικών υγρών σε υδρόβιους οργανισμούς (Tsarpali et al., 2016, 2015; Tsarpali and Dailianis, 2015), ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της ικανότητας του IL [omim][bf4] να προκαλεί δυσμενείς επιπτώσεις στον υδρόβιο οργανισμό Mytilus galloprovincialis, μέσω ενεργοποίησης συγκεκριμένων μηχανισμών, όπως ο μηχανισμός της αναπνευστικής έκρηξης, στα αιμοκύτταρά τους. Τα αποτελέσματα της μελέτης καταδεικνύουν την ικανότητα του συγκεκριμένου υγρού να επάγει κυτταροτοξικά, οξειδωτικά και γενοτοξικά φαινόμενα, εν μέρει μέσω ενεργοποίησης σηματοδοτικών μορίων, όπως η PI3-κινάση, που σχετίζονται με την επαγωγή της δραστικότητας των κύριων ενζύμων της αναπνευστικής έκρηξης NADPH οξειδάσης και ΝΟ συνθετάσης Κυτταροτοξικές επιπτώσεις του [omim][bf4] Η χρήση in vitro μοντέλων, όπως είναι τα αιμοκύτταρα των μυδιών, επιτρέπουν με μεγάλη ακρίβεια τη μελέτη της δράσης εν δυνάμει τοξικών ουσιών (Borenfreund and Puerner, 1985). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν αιμοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα μύδια του είδους M. galloprovincialis προκειμένου να προσδιοριστούν οι κυτταροτοξικές (υποθανατογόνες και θανατογόνες συγκεντρώσεις) επιπτώσεις του [omim][bf4]. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, μύδια του είδους M. galloprovincialis που εκτέθηκαν για 96 h σε [omim][bf4] παρουσίασαν σημαντικές κυτταροτοξικές, οξειδωτικές και γενοτοξικές βλάβες (Tsarpali et al., 2015), γεγονός που συμφωνεί με τον τοξικό χαρακτήρα των ιοντικών υγρών και σε άλλους οργανισμούς που μελετήθηκαν, όπως τα φύκη Scenedesmus rubescens και Dunaliella tertiolecta, τα ανόστρακα καρκινοειδή Thamnocephalus platyurus και Artemia franciscana, καθώς και τα τροχόζωα Brachionus calyciflorus και Brachionus plicatilis (Tsarpali et al., 2016, 2015; Tsarpali and Dailianis, 2015). Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της κυτταροτοξικότητας του [omim][bf4], με τη χρήση της μεθόδου NRU έδειξαν σημαντική μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας των εκτιθέμενων αιμοκυττάρων, μετά από έκθεση σε συγκεντρώσεις του ιοντικού υγρού μεγαλύτερες από 1 mg L -1. Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης συμφωνούν με τις τιμές των Tsarpali και συν. (Tsarpali et al., 2015), σύμφωνα με τις 45

46 ΣΥΖΗΤΗΣΗ οποίες, τιμές μικρότερες από 1 mg L -1 θεωρούνται υποθανατογόνες για το συγκεκριμένο οργανισμό. Λαμβάνοντας υπόψη τα δεδομένα της κυτταροτοξικότητας, και προκειμένου να περιοριστεί ο ρόλος της κυτταρικής θνησιμότητας στην εξαγωγή των απαραίτητων συμπερασμάτων σχετικά με το ρόλο των ενζύμων της αναπνευστικής αλυσίδας, καθώς και τις επαγόμενες οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις του IL, η περεταίρω ανάλυση του οξειδωτικού και γενοτοξικού χαρακτήρα του IL πραγματοποιήθηκε με τη χρήση υπο-θανατογόνου συγκέντρωσης (1 mg L -1 ) Οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις της έκθεσης των αιμοκυττάρων σε [omim][bf4] Τα φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (οξειδωτικό stress), καθώς και οι βλάβες του γενετικού υλικού που προκαλούνται μετά από in vitro έκθεση των αιμοκυττάρων του μυδιού Mytilus galloprovincialis σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις [omim][bf4] συμφωνούν με πρόσφατες in vivo μελέτες (Tsarpali et al., 2015; Tsarpali and Dailianis, 2015). Παρόλο που υπάρχουν πολλές μελέτες που προσπαθούν να εξηγήσουν τον τοξικό χαρακτήρα των ILs, λίγα είναι γνωστά για το μηχανισμό που μπορεί να ευθύνεται για την επαγωγή των τοξικών επιπτώσεών τους. Συγκεκριμένα, έχει προταθεί ότι ο οξειδωτικός και γενοτοξικός χαρακτήρας του [omim][bf4] πιθανό να οφείλεται στο μεγάλο μήκος της αλκυλικής αλυσίδας του (Stepnowski and Storoniak, 2005; Tsarpali et al., 2016, 2015; Tsarpali and Dailianis, 2015). Συγκεκριμένα, η είσοδος της αλκυλικής αλυσίδας του IL στη διπλοστιβάδα της μεμβράνης του κυττάρου μπορεί να διαταράξει τη συνοχή της, οδηγώντας σε φαινόμενα λιπιδικής υπεροξείδωσης και κυτταρικό θάνατο, ενώ μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργικότητα των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών σε μοριακό επίπεδο (Gal et al., 2012; Jeong et al., 2012; Stepnowski and Storoniak, 2005). Η έκταση της αλληλεπίδρασης της αλκυλικής αλυσίδας του [omim][bf4] με τη διπλοστιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του IL (Jeong et al., 2012) (όσο μεγαλύτερη η συγκέντρωση του [omim][bf4], τόσο πιο εκτεταμένες είναι οι βλάβες που εντοπίζονται). Παρόλα αυτά, δυσκολίες στη μέτρηση της αρχικής συγκέντρωσης του IL και της πραγματικής συγκέντρωσης στο μέσο έκθεσης, καθώς και πιθανών μεταβολιτών, λόγω της παρεμβολής του μέσου έκθεσης στη δράση του IL, ενδέχεται να οδηγούν σε μια ασαφή εικόνα της πραγματικής δράσης του IL στα κύτταρα (Tsarpali et al., 2016), γεγονός που απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. 46

47 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επιπρόσθετα, αρκετές μελέτες αναφέρουν ότι η παρουσία του ανιόντος [BF4 - ] μπορεί να σχετίζεται με την τοξικότητα του [omim][bf4], καθώς η υδρόλυσή του οδηγεί στο σχηματισμό υδροφθορικού οξέος (HF) ή/και ανιόντων φθορίου (Cho et al., 2008; Du et al., 2012; Freire et al., 2010). Δεδομένου του ότι όσο μεγαλύτερη η αλκυλική αλυσίδα του IL τόσο μεγαλύτερη και η αλληλεπίδρασή της με την κυτταρική μεμβράνη (Jeong et al., 2012), η αλληλεπίδραση των κατιόντων και των ανιόντων του IL μειώνεται (Freire et al., 2010). Συνεπώς, η συμβολή του ανιόντος, [BF4 - ], στην τοξικότητα του [omim][bf4] δεν θα πρέπει να αποκλειστεί και είναι αναγκαία η περαιτέρω μελέτη της συμβολής του ανιόντος στην τοξικότητα του IL Ο ρόλος της PI3-κινάσης και της αναπνευστικής έκρηξης στην επαγωγή των οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων του [omim][bf4] Κατά τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης στα αιμοκύτταρα των μυδιών M. galloprovincialis η PI3-κινάση παίζει σημαντικό ρόλο (Garcia-Garcia et al., 2008), ενώ έχει προταθεί η δράση της ως μόριο που επάγει την κυτταρική επιβίωση (Shimamura et al., 2003). Επιπρόσθετα, πρόσφατες μελέτες έχουν αναφερθεί στο σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει στην απόκριση των κυττάρων έναντι ξενοβιοτικών ουσιών, όπως το κάδμιο, καθώς και τη συμμετοχή του στο σηματοδοτικό μηχανισμό που οδηγεί στην ενεργοποίηση του μηχανισμού της αναπνευστικής έκρηξης (Dailianis, 2009; Dailianis et al., 2009). Ο μηχανισμός της αναπνευστικής έκρηξης δεν αφορά στο σύνολο και τους τέσσερεις τύπους κυττάρων που εντοπίζονται στην αιμόλεμφο των μυδιών M. galloprovincialis, καθώς τα υαλινοκύτταρα στερούνται του μηχανισμού αυτού, ενώ δεν εμφανίζουν ιδιότητες φαγοκυττάρων. Παρόλα αυτά, φαίνεται πως όλα τα κύτταρα που εντοπίζονται στην αιμόλεμφο των μυδιών είναι ικανά να παράγουν NO, καθώς και χυμικούς παράγοντες που εμπλέκονται στο ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού (Koutsogiannaki and Kaloyianni, 2010). Σύμφωνα με τους Donaghy και συν. (Donaghy et al., 2012), η κύρια οδός παραγωγής ROS στο στρείδι του ειρηνικού, Crassostrea gigas, είναι μέσω της αναπνευστικής οδού στα μιτοχόνδρια με το σύμπλοκο ΙΙΙ να διαδραματίζει τον βασικότερο ρόλο, καθώς η αναστολή του οδηγεί σε δοσοεξαρτώμενη μείωση της παραγωγής ROS. Αντίθετα στα χερσαία σπονδυλωτά κύριο ρόλο στην παραγωγή ROS στα μιτοχόνδρια διαδραματίζει το σύμπλοκο Ι (Murphy, 47

48 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 2009), για το οποίο όμως δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με τη δράση του στα δίθυρα μαλάκια. Πιθανώς ο ρόλος του συμπλόκου Ι να αυξάνεται με τη μείωση της διαθεσιμότητας του οξυγόνου στο υδάτινο περιβάλλον των δίθυρων μαλακίων, με αποτέλεσμα τη μεταστροφή από τα αερόβια στα αναερόβια μεταβολικά μονοπάτια (Donaghy et al., 2015). Παράλληλα, φαίνεται πως το ενδοπλασματικό δίκτυο στα αιμοκύτταρα των μυδιών M. galloprovincialis είναι υπεύθυνο για ένα ποσοστό παραγωγής ROS, ενώ δεν υπάρχουν ακόμα αποδείξεις σχετικά με την παραγωγή ROS στα υπεροξειδιοσώματα (Donaghy et al., 2015). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η αναστολή της PI3-κινάσης, καθώς και των ενζύμων που παίζουν καθοριστικό ρόλο στο μηχανισμό της αναπνευστικής έκρηξης φαίνεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ελαχιστοποίηση των οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων του [omim][bf4]. Συγκεκριμένα, η παραγωγή των O2 - και NO φαίνεται να οφείλεται στην ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης και της NO συνθετάσης αντίστοιχα, καθώς η αναστολή τους παρουσίασε στατιστικώς σημαντική μείωση των επιπέδων τους. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση αυτών των ενζύμων στα αιμοκύτταρα των μυδιών έχει αναφερθεί σε αρκετές μελέτες (Dailianis, 2009; Dailianis et al., 2009; Donaghy et al., 2015), η επαγωγή τόσο οξειδωτικών, όσο και γενοτοξικών φαινομένων μέσω της αναπνευστικής έκρηξης λόγω έκθεσης των κυττάρων σε [omim][bf4] θα μπορούσε να αποτελέσει πιθανό μηχανισμό δράσης του IL. Πιο συγκεκριμένα, ο σχηματισμός O2 - και NO, μέσω της NADPH οξειδάσης και της NO συνθετάσης δύναται να οδηγήσει σε σοβαρές κυτταροτοξικές βλάβες μέσω της παραγωγής ριζών υδροξυλίου (OH ) και άλλων ενδιάμεσων προϊόντων, όπως είναι οι ρίζες περοξυνιτρίτη (ONOO - ), των οποίων η ικανότητα να επηρεάζουν τη δομή πρωτεϊνών, δεοξυριβονουκλεοτιδίων, μεμβρανικών φωσφολιπιδίων και της συνοχής του DNA είναι γνωστή (Bolognesi and Cirillo, 2014). Επιπλέον, ως προς την παραγωγή NO και ROS θα πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη σημασία στο γεγονός ότι παρόλο που ο αναστολέας DPI χρησιμοποιείται κυρίως για την αναστολή της NADPH οξειδάσης, εντούτοις δύναται να αναστείλει το ένζυμο NO συνθετάση, καθώς και τα μιτοχονδριακά σύμπλοκα Ι και ΙΙΙ (Cross and Jones, 1986; Stuehr et al., 1991). Στην παρούσα μελέτη, η μείωση των επαγόμενων ριζών οδήγησε σε σημαντική μείωση των οξειδωτικών επιπτώσεων, γεγονός που ισχυροποιεί την υπόθεση της ενεργοποίησης της αναπνευστικής έκρηξης. Το γεγονός ότι το [omim][bf4] έχει την ικανότητα να επάγει οξειδωτικά και γενοτοξικά φαινόμενα, θα μπορούσε να οδηγήσει στην υπόθεση ότι η PI3-κινάση 48

49 ΣΥΖΗΤΗΣΗ συμβάλει στην αναπνευστική έκρηξη χωρίς όμως να διαδραματίζει πρωταρχικό ρόλο στο μηχανισμό άμυνας των αιμοκυττάρων έναντι του [omim][bf4]. Επιπλέον, λόγω του ότι η παραγωγή ROS οδηγεί στην ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3-κινάσης/Akt (Dailianis et al., 2009), η ενεργοποίηση της NADPH-οξειδάσης και NO-συνθετάσης θα μπορούσε να ευθύνεται για την ενεργοποίηση της PI3-κινάσης στα αιμοκύτταρα των μυδιών, υπόθεση που χρήζει περεταίρω διερεύνησης. 49

50 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συμπεράσματα Δεδομένου ότι το ενδιαφέρον ως προς τη χρήση των IL διαρκώς αυξάνεται, η πιθανή παρουσία τους στο περιβάλλον, καθώς και οι επιπτώσεις τους στους οργανισμούς αποτελεί στις μέρες μας ένα σημαντικό αντικείμενο μελέτης. Στην παρούσα μελέτη αποδεικνύεται ότι μικρομοριακές συγκεντρώσεις του [omim][bf4] έχουν την ικανότητα να επάγουν κυτταροτοξικά, οξειδωτικά και γενοτοξικά φαινόμενα, γεγονός που συντελείται εν μέρει από την ενεργοποίηση του μηχανισμού της αναπνευστικής έκρηξης (Εικόνα 13). Επιπλέον, η ενεργοποίηση της PI3-κινάσης φαίνεται να αποτελεί (α) ένα σημαντικό βήμα στην επαγωγή των τοξικών επιπτώσεων του [omim][bf4], εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης του μηχανισμού της αναπνευστικής έκρηξης και (β) ένα σημαντικό μόριο με το οποίο τα κύτταρα αποκρίνονται στο επαγόμενο stress, προς όφελος της επιβίωσής τους. Παρόλα αυτά, είναι αναγκαία η περαιτέρω μελέτη της τοξικότητας του [omim][bf4] και της συμβολής της αναπνευστικής έκρηξης και άλλων πιθανών μορίων που ενεργοποιούνται, με σκοπό την καλύτερη κατανόηση της δράσης του IL στους υδρόβιους οργανισμούς. Kυτταρική επιβίωση? Προστατευτικός μηχανισμός? (τροποποιημένη από Jeong et al., 2012) PI3-kinase Αναπνευστική έκρηξη a b c d e NADPH οξειδάση NO συνθετάση MDA O 2 - Ελεύθερες ρίζες NO ROS LPO DNA damage ONOO - Εικόνα 13. Πιθανός μηχανισμός δράσης του [omim][bf4] στα αιμοκύτταρα του μυδιού Mytilus galloprovincialis, με τη συμμετοχή της PI3-κινάσης και των ενζύμων της αναπνευστικής έκρηξης (NADPH οξειδάση και ΝΟ συνθετάση). 50