ΑΣΚΗΣΗ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ DNA

Transcript

1 ΑΣΚΗΣΗ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ DNA

2 ΑΣΚΗΣΗ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ DNA Σκοπός της άσκησης Η κατανόηση των βασικών μεθοδολογιών ποσοτικής ανάλυσης του DNA με τη μέθοδο της φωτομέτρησης και ποιοτικής ανάλυσης του DNA με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Η εκμάθηση των τεχνικών φωτομέτρησης και ηλεκτροφόρησης DNA σε πήκτωμα αγαρόζης. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ 1. Ποσοτικός προσδιορισμός DNA Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ενός δείγματος DNA γίνεται με τη χρήση φασματοφωτόμετρου και τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (optical density, OD) του δείγματος DNA σε υπεριώδη ακτινοβολία (U.V.) μήκους κύματος 260 nm, στο οποίο τα νουκλεϊκά οξέα έχουν μέγιστη απορρόφηση (Εικόνα 1Α). Καθώς το δείγμα εκτίθεται στην υπεριώδη ακτινοβολία, ένας αισθητήρας μετράει την αναλογία του φωτός που εισέρχεται (Ι 0 ) και εξέρχεται (Ι 1 ) από το δείγμα. Ένα μέρος της υπεριώδους ακτινοβολίας θα απορροφηθεί από το DNA / RNA που υπάρχει στο δείγμα ενώ το υπόλοιπο θα χαθεί. Όσο περισσότερο φως απορροφηθεί από το δείγμα τόσο μεγαλύτερη συγκέντρωση νουκλεϊκών οξέων αυτό περιέχει. Το αποτέλεσμα είναι ότι σε αυτήν την περίπτωση λιγότερο φως θα προσπέσει στον αισθητήρα και αυτό θα αντιστοιχεί σε υψηλότερη οπτική πυκνότητα. Η οπτική πυκνότητα ή απορρόφηση (Α) του δείγματος δίνεται από τη σχέση OD = - log I 1 / I 0 και σύμφωνα με το νόμο Lambert Beer OD = e x C x OL, όπου e μία σταθερά απορρόφησης ειδική για συγκεκριμένο μήκος κύματος, C η συγκέντρωση του δείγματος και OL το μήκος της διαδρομής του φωτός, που ουσιαστικά αντιστοιχεί στο μήκος της κυψελίδας του φασματοφωτόμετρου (Εικόνα 1Β).

3 Α Β Εικόνα 1. Η ανάλυση ενός δείγματος DNA από ένα φασματοφωτόμετρο παράγει ένα διάγραμμα φάσματος απορρόφησης του δείγματος μεταξύ των μηκών κύματος 220 nm και 320 nm. Ένα καθαρό δείγμα DNA, όπως αυτό που φαίνεται στην εικόνα, παράγει μια κωδωνοειδή καμπύλη με μέγιστο απορρόφησης στα 260 nm. Η πτώση της απορρόφησης στα nm υποδηλώνει ότι το DNA δεν έχει υπολείμματα αλάτων. Η συγκέντρωση DNA του δείγματος υπολογίζεται από την τιμή της απορρόφησης στα 260 nm. Από το νόμο αυτό, και με την παραδοχή ότι η διαδρομή του φωτός είναι 1cm, η συγκέντρωση C του DNA, μετρούμενη σε μg/ml, υπολογίζεται ως εξής: C = 1 x OD = F x OD, όπου F= 1 e OL e Ο παράγοντας F, για υπεριώδη ακτινοβολία μήκους κύματος 260 nm και τιμή οπτικής πυκνότητας ίση με 1, παίρνει τις κάτωθι τιμές 50 μg/ml, για δίκλωνο DNA 37μg/ml, για μονόκλωνο DNA 40 μg/ml, για μονόκλωνο RNA Η μέθοδος αυτή επιτρέπει επίσης τον έλεγχο της καθαρότητας του DNA που απομονώθηκε, δηλαδή τον προσδιορισμό της ύπαρξης στο δείγμα προσμίξεων RNA ή πρωτεϊνών. Η καθαρότητα του δείγματος προσδιορίζεται εάν μετρηθεί η απορρόφηση του ίδιου δείγματος τόσο στα 260 nm όσο και στα 280 nm και μετά υπολογισθεί ο λόγος OD 260 /OD 280. Αν ο λόγος των δύο απορροφήσεων είναι , τότε το δείγμα αποτελείται από καθαρό DNA. Αν ο λόγος είναι μεγαλύτερος από 2.0 τότε το δείγμα έχει πρόσμιξη από RNA, δεδομένου ότι και το RNA έχει μέγιστο απορρόφησης στα 260nm.

4 Αντίθετα, επειδή οι πρωτεΐνες απορροφούν στα 280 nm, όταν στο δείγμα υπάρχει πρόσμιξη από πρωτεΐνες ο λόγος των δύο απορροφήσεων είναι μικρότερος από Ποιοτικός προσδιορισμός DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι ο απλούστερος τρόπος διαχωρισμού και ανάλυσης DNA. Πρόκειται για μια τεχνική που διαχωρίζει φορτισμένα μόρια όπως DNA, RNA ή πρωτεΐνες, με βάση το μέγεθός τους. Το πήκτωμα αγαρόζης είναι ένα στερεό πορώδες υπόστρωμα μέσα από τους πόρους του οποίου μπορούν να κινηθούν τα μόρια DNA. Όταν εφαρμοστεί στο πήκτωμα αγαρόζης ηλεκτρική τάση τότε η μία άκρη του πηκτώματος αποκτάει θετικό και η άλλη αρνητικό φορτίο έτσι, τα φορτισμένα μόρια «μεταναστεύουν» πάντα προς τον αντίθετο πόλο από το φορτίο τους, π.χ. το αρνητικά φορτισμένο DNA κινείται πάντα προς τον θετικό πόλο. Τα μικρότερου μεγέθους μόρια κινούνται πιο γρήγορα μέσα στους πόρους του πηκτώματος από τα μεγαλύτερα μόρια και έτσι μεταναστεύουν σε μεγαλύτερη απόσταση μέσα στο πήκτωμα. Η αγαρόζη είναι ένας πολυσακχαρίτης που προέρχεται από θαλάσσια φύκη. Πολυμερίζεται στους 100 C δημιουργώντας ένα κολλώδες διάλυμα το οποίο πήζει σε θερμοκρασία μικρότερη από 45 C σχηματίζοντας πόρους στο εσωτερικό του. Ανάλογα με τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα σχηματίζονται πόροι που επιτρέπουν το διαχωρισμό μορίων μεγέθους από 50 ζεύγη βάσεων (bp) μέχρι 60κιλοβάσεις (kb) (Εικόνα 2). Α Β Εικόνα 2. Α) Ο χημικός τύπος της αγαρόζης. Β) Ενδεικτική αντιστοίχιση διαφορετικών συγκεντρώσεων πηκτωμάτων αγαρόζης με το εύρος μεγέθους μορίων DNA (σε κιλοβάσεις kb) που διαχωρίζουν. Το πήκτωμα αγαρόζης ετοιμάζεται σε ειδικά εκμαγεία και φέρει υποδοχές

5 (πηγαδάκια) όπου τοποθετούνται τα δείγματα του DNA. Πριν την τοποθέτηση των δειγμάτων DNA το πήκτωμα μεταφέρεται σε μια συσκευή ηλεκτροφόρησης και εμβαπτίζεται σε ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα, το οποίο χρησιμεύει σαν αγωγός για το ηλεκτρικό ρεύμα. Στο μεταξύ στο δείγμα του DNA προστίθεται ένα διάλυμα «φόρτωσης» (loading dye), π.χ. μπλε της βρωμοφαινόλης, που περιέχει γλυκερόλη και μία χρωστική που κινείται στο πήκτωμα με ταχύτητα ίδια με αυτή που έχουν τα μικρού μεγέθους μόρια DNA (Εικόνα 3). Η χρωστική φόρτωσης εξυπηρετεί τρεις λειτουργίες: πρώτον, αυξάνει το ιξώδες του δείγματος ώστε αυτό να βυθιστεί στα πηγαδάκια και να μη διαχυθεί στο υδατικό διάλυμα, δεύτερον, οπτικοποιεί το ρυθμό μετανάστευσης του δείγματος και τρίτον, η συνεχής παρακολούθηση του επιπέδου κίνησης των μικρότερων μορίων DNA παρέχει το σήμα του έγκαιρου τερματισμού της ηλεκτροφόρησης, καθώς αν συνεχιστεί η παροχή ηλεκτρικής τάσης το DNA του δείγματος τελικά θα βγει από το πήκτωμα. Α Β Γ Εικόνα 3. Α) Το πήκτωμα της αγαρόζης με τα ειδικά «πηγαδάκια». Το πήκτωμα αυτό μεταφέρεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης (Β) και καλύπτεται με το ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα. Στη συνέχεια τοποθετείται στα πηγαδάκια το δείγμα του DNA στο οποίο έχει προστεθεί και η κατάλληλη χρωστική (Γ). Πρέπει να γίνει κατανοητό από τα παραπάνω ότι η χρωστική φόρτωσης δεν απεικονίζει το DNA που υπάρχει στο δείγμα που ηλεκτροφορείται. Για να απεικονιστεί το DNA του δείγματος είναι αναγκαία η προσθήκη μιας άλλης χρωστικής που να το καθιστά ορατό (Εικόνα 4). Μια χρωστική που έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα γι αυτόν τον σκοπό είναι το βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr), το οποίο παρεμβάλλεται στη μεγάλη αύλακα του DNA και όταν απορροφήσει υπεριώδη ακτινοβολία μήκους κύματος nm εκπέμπει πορτοκαλί φως μήκους κύματος 605 nm. Συνήθως το βρωμιούχο αιθίδιο προστίθεται κατά την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης ή εναλλακτικά μπορεί το πήκτωμα να

6 εμβαπτιστεί σε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης. Το βρωμιούχο αιθίδιο απαιτεί ιδιαίτερα προσεκτικό χειρισμό (χρήση γαντιών απαραίτητα) καθώς είναι μεταλλαξιγόνος ουσία. Για να γίνει η παρατήρηση των μορίων DNA του δείγματος το πήκτωμα τοποθετείται σε μια τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας όπου τα μόρια DNA, λόγω του βρωμιούχου αιθιδίου που παρεμβάλλεται σε αυτά, φθορίζουν (Εικόνα 4). Η παρατήρηση του πηκτώματος στην τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας επίσης απαιτεί πολύ μεγάλη προσοχή και πρέπει να γίνεται πάντα πάνω από ένα προστατευτικό ειδικό κάλυμμα καθώς η υπεριώδης ακτινοβολία είναι επικίνδυνη για τον δέρμα και τα μάτια. Α Β Εικόνα 4. Διαφορές στην όψη του ίδιου πηκτώματος αγαρόζης με το διάλυμα φόρτωσης (Α) και με το βρωμιούχο αιθίδιο (Β). Στην πρώτη περίπτωση απεικονίζεται μόνο η χρωστική του διαλύματος φόρτωσης ενώ στη δεύτερη απεικονίζονται τα μόρια DNA του δείγματος σαν ζώνες που φθορίζουν λόγω του βρωμιούχου αιθιδίου που έχει παρεμβληθεί στη δομή τους. Με την ηλεκτροφόρηση ενός δείγματος DNA σε πήκτωμα αγαρόζης έχουμε τη δυνατότητα να εκτιμήσουμε το μέγεθος, την ποιότητα αλλά και την ποσότητα του εξεταζόμενου DNA. Για να εκτιμήσουμε το μέγεθος του DNA πρέπει ταυτόχρονα με το εξεταζόμενο δείγμα να τοποθετηθεί σε άλλο πηγαδάκι του πηκτώματος ένα δείγμαμάρτυρας που περιέχει ζώνες DNA γνωστού μοριακού βάρους. Το μέγεθος του εξεταζόμενου DNA μπορεί να εκτιμηθεί αντιστοιχίζοντας την εμφανιζόμενη ζώνη με τη ζώνη του μάρτυρα που βρίσκεται στο ίδιο ύψος (Εικόνα 5Α). Η ποιότητα του DNA που περιέχεται στο δείγμα, αν δηλαδή είναι άθικτο ή αν έχει αποικοδομηθεί, μπορεί εύκολα να ελεγχθεί από την τελική εικόνα της ηλεκτροφόρησης καθώς το άθικτο DNA εμφανίζεται σαν συμπαγής ζώνη ενώ το αποικοδομημένο DNA εμφανίζει μια διάχυτη εικόνα (Εικόνα 5Β). Τέλος, η ποσότητα του DNA του δείγματος εκτιμάται πάλι με βάση το

7 δείγμα-μάρτυρας αλλά αυτή τη φορά αντιστοιχίζοντας το πάχος της ζώνης του εξεταζόμενου DNA με μια ζώνη ίδιου πάχους του μάρτυρα, καθώς όλες οι ζώνες του μάρτυρα είναι ποσοτικοποιημένες, π.χ. στην Εικόνα 5Α η ζώνη που αντιστοιχεί στις 2500 bp περιέχει 100 ng/ 5 μl DNA. A B bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3000 bp 100 ng / 5μl 2500 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 400 bp 300 bp Εικόνα 5. Εκτίμηση μεγέθους, ποσότητας και ποιότητας του DNA. Για να βρεθεί το μέγεθος των μορίων DNA που διαχωρίστηκαν στο πήκτωμα Α αντιστοιχούμε την εμφανιζόμενη ζώνη με τη ζώνη του μάρτυρα που βρίσκεται στο ίδιο ύψος π.χ. το μόριο DNA που βρίσκεται στη θέση 1 έχει μέγεθος bp. Η ποσότητα του εξεταζόμενου DNA βρίσκεται αν αντιστοιχηθεί η εμφανιζόμενη ζώνη με μια ζώνη του μάρτυρα ίδιου πάχους, π.χ. το δείγμα DNA της θέσης 4 έχει συγκέντρωση περίπου 20 ng/μl. Στο πήκτωμα Β φαίνεται η ηλεκτροφορητική εικόνα αποικοδομημένων μορίων DNA Παράγοντες που επηρεάζουν την ηλεκτροφορητική κινητικότητα Η κινητικότητα των μορίων DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης εξαρτάται από: Το μέγεθος του DNA. Όσο μικρότερα είναι τα μόρια του DNA τόσο πιο εύκολα κινούνται μέσα στους πόρους του πηκτώματος και τόσο πιο μακριά μεταναστεύουν κατά μήκος του. Αντίθετα, τα μεγαλύτερα μόρια DNA συναντούν μεγαλύτερη αντίσταση στους πόρους του πηκτώματος και έτσι κινούνται βραδύτερα και παραμένουν προς το επάνω μέρος του πηκτώματος (Εικόνα 5Α). Πιο συγκεκριμένα, τα μόρια του γραμμικού δίκλωνου DNA κινούνται στο πήκτωμα με ταχύτητα που είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογάριθμου (log10) του μοριακού τους βάρους. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της αγαρόζης τόσο μικρότεροι είναι οι πόροι που σχηματίζονται στο πήκτωμα και τόσο μεγαλύτερη είναι η αντίσταση που συναντούν τα μόρια DNA κατά την κίνησή τους. Έτσι για παράδειγμα το ίδιο μόριο DNA σε πηκτώματα αυξανόμενης συγκέντρωσης αγαρόζης

8 θα μεταναστεύει σε όλο και μικρότερη απόσταση (Εικόνα 6). Επομένως τα πυκνά πηκτώματα ευνοούν το διαχωρισμό μορίων DNA μικρού μεγέθους ενώ για μεγαλύτερα μόρια DNA πρέπει να χρησιμοποιείται πήκτωμα μικρής πυκνότητας. Εικόνα 6. Επίδραση της συγκέντρωσης της αγαρόζης στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA. Αυξανόμενης της συγκέντρωσης αγαρόζης ένα ίδιου μεγέθους μόριο DNA θα καλύπτει μικρότερη απόσταση στο πήκτωμα. Παρατηρείστε ότι στο χαμηλής συγκέντρωσης πήκτωμα τα μεγάλου μεγέθους μόρια DNA διαχωρίζονται καλύτερα ενώ στο υψηλής συγκέντρωσης πήκτωμα είναι καλύτερος ο διαχωρισμός των μικρότερων μορίων DNA. Τη στερεοδιαμόρφωση του DNA. Η στερεοδιαμόρφωση του DNA (υπερελικωμένο, κυκλικό ή γραμμικό) επηρεάζει την αντίσταση που δέχεται ένα μόριο DNA κατά την κίνησή του μέσα σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Στην περίπτωση για παράδειγμα των διαφόρων μορφών του πλασμιδιακού DNA, η υπερελικωμένη μορφή, που είναι πιο συμπυκνωμένη, κινείται γρηγορότερα ακολουθούμενη από την χαλαρή κυκλική και την ανοιχτή κυκλική μορφή, αν και έχουν το ίδιο μέγεθος (Εικόνα 7). Η γραμμική μορφή του πλασμιδίου, που προκύπτει αν επωαστεί το πλασμίδιο με ενδονουκλεάσες περιορισμού (βλέπε Άσκηση Ένζυμα Περιορισμού Μοριακή Χαρτογράφηση), παρουσιάζει ενδιάμεση ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Τέλος, κατά τη διαδικασία της απομόνωσης του πλασμιδιακού DNA μπορεί να προκύψει και κυκλικό μονόκλωνο DNA σαν απόρροια έντονων αποδιατακτικών συνθηκών, το οποίο παρουσιάζει τη γρηγορότερη ηλεκτροφορητική κινητικότητα από όλα.

9 Ανοιχτό κυκλικό Χαλαρό κυκλικό Γραμμικό Υπερελικωμένο Μονόκλωνο κυκλικό Εικόνα 7. Διαφορές στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα μορίων DNA που έχουν το ίδιο μέγεθος αλλά διαφορετική στερεοδιαμόρφωση. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου. Γενικά όσο αυξάνει η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου που εφαρμόζεται στο πήκτωμα τόσο πιο γρήγορα κινούνται τα μόρια του DNA. Σε υψηλές τιμές όμως τάσης τα μεγάλου μεγέθους μόρια μεταναστεύουν συγκριτικά γρηγορότερα από τα μικρότερα κι έτσι μειώνεται η αναλυτική ικανότητα της μεθόδου. Συνήθως η εφαρμοζόμενη τάση είναι περίπου 5 V/cm, όπου η απόσταση αναφέρεται στην απόσταση μεταξύ των ηλεκτροδίων της ηλεκτροφορητικής συσκευής. Το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Τα πιο κοινά ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι το ΤΑΕ (Tris/Acetate/EDTA) και το ΤΒΕ (Tris/Borate/EDTA). Τα ρυθμιστικά διαλύματα διατηρούν σταθερό το ph και επιπλέον παρέχουν τα απαραίτητα ιόντα που συντηρούν την αγωγιμότητα η οποία είναι αναγκαία για την κίνηση των μορίων του DNA. Το βρωμιούχο αιθίδιο. Η παρεμβολή του βρωμιούχου αιθιδίου στη διπλή έλικα μειώνει το αρνητικό φορτίο του DNA, αλλάζει τη μάζα του και αυξάνει την ακαμψία του. Κατά συνέπεια μειώνεται η κινητικότητα του DNA μέχρι και 15%. 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΗΣ - ΠΟΙΟΤΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ DNA 3.1. Υλικά και όργανα Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του πλασμιδιακού DNA Φασματοφωτόμετρο και κυβέτες χαλαζία δις απιονισμένο (di-distilled - dd) H 2 O

10 Γάντια Για την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Αγαρόζη Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 1x Βρωμιούχο αιθίδιο ή άλλη παρόμοια χρωστική πρόσδεσης στο DNA, όπως είναι η Midori Green Διάλυμα φόρτωσης Μάρτυρας γνωστών μοριακών μεγεθών Εκμαγείο, «χτενάκια», συσκευή ηλεκτροφόρησης, τροφοδοτικό ρεύματος Γάντια 3.2. Πειραματική πορεία Ποσοτικός προσδιορισμόςdna 1. Ετοιμάζετε το δείγμα του DNA ως εξής: Σε ένα σωληνάκι eppendorf αναμιγνύετε 5 μl DNA και 495 μl dh 2 O ώστε η τελική αραίωση του DNA να είναι 1:100. Φροντίζετε να αναμίξετε καλά ώστε το διάλυμα να είναι ομοιογενές. Κατόπιν τοποθετείτε το αραιωμένο DNA στην κυψελίδα του φασματοφωτόμετρου. 2. Θέτετε σε λειτουργία το φασματοφωτόμετρο. Το ρυθμίζετε στα 260 nm και μηδενίζετε με dh 2 O. 3. Καταγράφετε την οπτική πυκνότητα του αραιωμένου δείγματος στα 260 nm και υπολογίζετε τη συγκέντρωση του DNA στο αρχικό σας δείγμα με βάση τον τύπο C (μg / ml) = O.D. 260 x 100 x 50 όπου 100 είναι ο συντελεστής αραίωσης του αρχικού δείγματος. 4. Πραγματοποιείτε και δεύτερη φωτομέτρηση του δείγματος στα 280 nm για να εκτιμήσετε την καθαρότητα του DNA που απομονώσατε.

11 Ηλεκτροφόρηση πλασμιδιακού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 1. Κάθε ομάδα φοιτητών έχει παρασκευάσει, στην σχετική άσκηση παρασκευής διαλυμάτων, διάλυμα ηλεκτροφόρησης ΤΒΕ (Tris/Borate/EDTA) 10x. Από το stock αυτό διάλυμα παρασκευάζετε 1 L ΤΒΕ 1x. 2. Προετοιμάζετε το εκμαγείο στο οποίο θα παρασκευάσετε το πήκτωμα και τοποθετείτε τα κατάλληλα «χτενάκια» που θα δημιουργήσουν τα πηγαδάκια στα οποία θα «φορτώσετε» το δείγμα σας. 3. Παρασκευάζετε ένα πήκτωμα αγαρόζης συγκέντρωσης 1.5%, επομένως προσθέτετε 1.5 gr αγαρόζης σε 100 ml ΤΒΕ 1x. 4. Διαλύετε την αγαρόζη με βρασμό στο φούρνο μικροκυμάτων. Αφήνετε λίγο να κρυώσει μέσα σε απαγωγό και προσθέτετε 5 μl Midori Green (χρωστική παραπλήσια με το βρωμιούχο αιθίδιο αλλά λιγότερο βλαβερή). 5. Μόλις το πήκτωμα έχει θερμοκρασία ανεκτή στο εσωτερικό μέρος του χεριού σας ρίχνετε το διάλυμα αγαρόζης στο εκμαγείο προσεκτικά ώστε να μη δημιουργηθούν φυσαλίδες. 6. Μόλις στερεοποιηθεί το πήκτωμα τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και προστίθεται διάλυμα ηλεκτροφόρησης ΤΒΕ 1x σε όγκο ικανό να καλύψει το πήκτωμα. 7. Αναμιγνύετε το DNA με κατάλληλη ποσότητα χρωστικής φόρτωσης μπλε της βρωμοφαινόλης. Η χρωστική φόρτωσης βρίσκεται σε stock 6x και πρέπει στο μείγμα με το DNA να έχει συγκέντρωση 1x. Επομένως σε σωληνάκι τύπου eppendorf αναμιγνύετε 10 μl από το πλασμιδιακό DNA που απομονώσατε με 2 μl χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης. 8. Στην πρώτη θέση του πηκτώματος φορτώνετε 4 μl του μάρτυρα γνωστών μοριακών μεγεθών. 9. Φορτώνετε τα 12 μl του δείγματος του DNA που ετοιμάσατε και σημειώνετε τη θέση. 10. Τοποθετείτε το καπάκι στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και τη συνδέετε με το τροφοδοτικό (κόκκινο: άνοδος, μαύρο: κάθοδος). 11. Ρυθμίζετε το τροφοδοτικό στα 70 V και αφήνετε για περίπου 1 ώρα. 12. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης παρατηρείτε το πήκτωμα σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας.

12 4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ S.Β. Primrose, R.Μ. Twyman and R.W. Old. Principles of Gene Manipulation, Sixth edition. Blackwell Science Ltd, Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. Edited by Alan S. Gerstein. Wiley-Liss Inc., S. Harisha. Biotechnology Procedures and Experiments Handbook. Infinity Science Press LLC, 2007.