ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΩΟΤΟΚΙΑ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΥΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ CERATITIS CAPITATA (DIPTERA: TEPHRITIDAE) ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Σ. IΩΑΝΝΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΚΑΤΟΧΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2

3 ΜΕΛΕΤΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΩΟΤΟΚΙΑ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΥΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ CERATITIS CAPITATA (DIPTERA: TEPHRITIDAE) ΙΩΑΝΝΟΥ Σ. ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Ν.Α. Κουλούσης Αναπληρωτής Καθηγητής Εισηγητής Β.Ι. Κατσόγιαννος Ομότιμος Καθηγητής Μέλος Ν.Θ. Παπαδόπουλος Καθηγητής Μέλος Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Ν.Α. Κουλούσης Αναπληρωτής Καθηγητής Εισηγητής Β.Ι. Κατσόγιαννος Ομότιμος Καθηγητής Μέλος Ν.Θ. Παπαδόπουλος Καθηγητής Μέλος Δ.Σ. Κωβαίος Καθηγητής Μέλος Δ.Α. Προφήτου-Αθανασιάδου Καθηγήτρια Μέλος Μ. Σαββοπούλου-Σουλτάνη Καθηγήτρια Μέλος Χ.Γ. Αθανασίου Αναπληρωτής Καθηγητής Μέλος Θεσσαλονίκη 2014

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η διατριβή αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν χώροι και εξοπλισμός του Εργαστηρίου καθώς επίσης και εξοπλισμός των Εργαστηρίων Δενδροκομίας και Μελισσοκομίας. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον ομότιμο καθηγητή κ. Β.Ι. Κατσόγιαννο, αρχικό επιβλέποντα της διδακτορικής διατριβής και το νυν επιβλέποντα, αναπληρωτή καθηγητή κ. Ν.Α. Κουλούση για την υπόδειξη του θέματος, τις πολύτιμες συμβουλές τους κατά το σχεδιασμό και εκτέλεση των πειραμάτων και τις διορθώσεις τους στο κείμενο της διατριβής. Επίσης τον καθηγητή κ. Ν.Θ. Παπαδόπουλο, μέλος της συμβουλευτικής επιτροπής για τις ιδιαίτερα χρήσιμες συμβουλές και υποδείξεις του κατά την πραγματοποίηση των πειραμάτων και τη συγγραφή της διατριβής. Ιδιαίτερες ευχαριστίες εκφράζονται επίσης προς στον καθηγητή κ. Δ.Σ. Κωβαίο για τις εποικοδομητικές συζητήσεις σε επιστημονικά θέματα κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής. Για τη συμμετοχή τους στην επταμελή εξεταστική επιτροπή, ευχαριστώ τους καθηγητές κ.κ. Δ.Σ. Κωβαίο, Δ.Α. Προφήτου-Αθανασιάδου και Μ. Σαββοπούλου-Σουλτάνη και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Χ.Γ. Αθανασίου. Ευχαριστίες απευθύνω επίσης προς το διδάκτορα κ. Ι. Μηνά για την ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε κατά τις χημικές αναλύσεις των χυμών των εσπεριδοειδών, καθώς επίσης και τη λέκτορα Χ. Τανανάκη για τη συνδρομή της στις αναλύσεις των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτορα Χ. Γεροφώτη και το συνάδελφο γεωπόνο Ι. Ηλιάδη για κάθε είδους βοήθεια που μου προσέφεραν. Ακόμη, τους γονείς μου για τη θερμή και διαρκή τους συμπαράσταση. iv

5 ΕΥΡΕΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μελετήθηκε η επίδραση χημικών κυρίως ερεθισμάτων προερχόμενων από καρπούς εσπεριδοειδών και άλλα φυτά στην ωοτοκία των θηλυκών και τη συμπεριφορά των ανήλικων σταδίων της μύγας της Μεσογείου Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Σε μια πρώτη ενότητα πειραμάτων μελετήθηκε η προτίμηση ωοτοκίας και η επιβίωση των ανήλικων σταδίων σε πέντε διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών. Παράλληλα σε πειράματα οπτικής παρατήρησης μελετήθηκε η συμπεριφορά ωοτοκίας των θηλυκών σε άθικτους και τραυματισμένους καρπούς τους. Σε πειράματα πολλαπλής επιλογής θηλυκά απέθεσαν περισσότερα αυγά σε πορτοκάλια και ακολούθησαν τα μανταρίνια και τα νεράντζια ενώ τα γκρέιπφρουτ και τα λεμόνια ήταν οι λιγότερο προτιμητέοι ξενιστές. Η επιβίωση των προνυμφών στους ανωτέρω καρπούς συσχετίστηκε αρνητικά με τη σκληρότητα του φλοιού τους και δε συνδέονταν στενά με την προτίμηση ωοτοκίας των θηλυκών. Από τα πειράματα της οπτικής παρατήρησης προέκυψε ότι η δυνατότητα των θηλυκών να αποθέτουν αυγά σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών επίσης επηρεάστηκε αρνητικά από τη σκληρότητα του φλοιού τους. Η παρουσία επιφανειακών τραυμάτων στο φλοιό, αν και δεν είχε θετική επίδραση στην προσέλκυση των θηλυκών, αύξησε τη δραστηριότητα (δοκιμές) ωοτοκίας σε σχέση με τους άθικτους καρπούς, που επικεντρώθηκε ως επί το πλείστο στα τραύματα. Τέλος, η παρουσία βαθύτερων τραυμάτων που έφταναν μέχρι τη σάρκα, απελευθερώνοντας μικρές ποσότητες χυμού στη επιφάνεια, αύξησε σημαντικά την προσέλκυση σε σχέση με τους άθικτους καρπούς και τους καρπούς με επιφανειακά τραύματα. Ωστόσο, μετά την άφιξη των θηλυκών στους συγκεκριμένους καρπούς, οι χημικές ιδιότητες του χυμού καθόρισαν σε μεγάλο βαθμό την αξιοποίηση των τραυμάτων κατά την απόθεση των αυγών. Ειδικότερα, η αποδοχή των τραυμάτων για ωοτοκία καθώς επίσης και ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκε σε αυτά συσχετίστηκε αρνητικά με την οξύτητα του χυμού των καρπών. Η επόμενη ενότητα επικεντρώθηκε στη μελέτη των επιδράσεων στην ωοτοκία των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών και ορισμένων συστατικών τους. Πειράματα διπλής επιλογής έδειξαν ότι θηλυκά απέθεσαν σημαντικά περισσότερα αυγά στις οπές κοίλων, πλαστικών ημισφαίριων κάτω από τα οποία υπήρχε 1 μl αιθέριων ελαίων από τα παραπάνω εσπεριδοειδή σε σχέση με ημισφαίρια κάτω από τα οποία υπήρχε μόνο νερό. Ωστόσο, πειράματα μη επιλογής αποκάλυψαν μια ασθενέστερη επίδραση των ελαίων του λεμονιού σε σχέση με τα άλλα v

6 εσπεριδοειδή και μια ισχυρότερη επίδραση των ελαίων του πορτοκαλιού. Η ωοπαραγωγή των θηλυκών στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού βρέθηκε να επηρεάζεται σημαντικά από την ένταση (δόση) των οσμών του. Από τις ουσίες που μελετήθηκαν προέκυψε ότι το λιμονένιο (κυρίαρχο συστατικό όλων των αιθέριων ελαιών) διέγειρε την ωοτοκία, ενώ η λιναλούλη (χαρακτηριστική ουσία των ανώριμων εσπεριδοειδών) είχε ισχυρή αποτρεπτική δράση. Τέλος, σε πειράματα μη επιλογής, θηλυκά αφέθηκαν να ωοτοκήσουν σε 1μl αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού και δύο τεχνητών μιγμάτων εκ των οποίων το ένα αποτελούνταν από 93% λιμονένιο (ποσοστό ίδιο με εκείνο που υπήρχε στο έλαιο του πορτοκαλιού) και το άλλο από 93% λιμονένιο και 3% λιναλούλη (περίπου δεκαπλάσιο ποσοστό από εκείνο που υπήρχε στο έλαιο του πορτοκαλιού). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το περιεχόμενο του λιμονένιου εξηγούσε σε μεγάλο βαθμό (όχι όμως πλήρως) τη διεγερτική δράση που παρατηρήθηκε στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού και πιθανότατα και στα υπόλοιπα έλαια, ενώ τα υψηλά ποσοστά λιναλούλης περιόρισαν σημαντικά τις διεγερτικές επιδράσεις του λιμονένιου. Σε μια άλλη ενότητα πειραμάτων, μελετήθηκε η ικανότητα των προνυμφών να αντιλαμβάνονται οσμηρά ερεθίσματα καθώς επίσης και η ικανότητά τους για μάθηση. Σε πειράματα διπλής επιλογής που έγιναν σε κατάλληλα διαμορφωμένες αρένες οι προνύμφες όλων των ηλικιών επέδειξαν ισχυρή οσφρητική ανταπόκριση προσελκυόμενες σε οσμές χυμού πορτοκαλιού πολύ περισσότερο από ότι στο μάρτυρα (νερό). Επιπλέον, προνύμφες 3 ης ηλικίας μπορούσαν να διακρίνουν μεταξύ οσμών ξενιστών (αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού) και μη-ξενιστών (μενθόλη, κύριο συστατικό της μέντας). Όταν προνύμφες αφέθηκαν να συνδέσουν οσμές αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού ή μενθόλης με την παρουσία τροφής (ανταποδοτικό ερέθισμα) επί 24 ώρες πριν τις βιοδοκιμές, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της ανταπόκρισής τους και στις δύο οσμές, γεγονός που υποδηλώνει ικανότητα για συνειρμική μάθηση (associative learning). Σε ένα τελευταίο πείραμα προνύμφες αφέθηκαν να συνδέσουν τις οσμές από λιμονένιο ή γερανιόλη με την παρουσία τροφής. Σε πειράματα ολφακτομέτρου που έγιναν στη συνέχεια, θηλυκά έντομα ηλικίας μιας ημέρας που προέκυψαν από τις προνύμφες αυτές επέδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη οσφρητική ανταπόκριση προς το λιμονένιο και τη γερανιόλη σε σύγκριση με θηλυκά του μάρτυρα που δεν είχαν την ίδια εμπειρία ως προνύμφες. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η εμπειρία που αποκτάται στο στάδιο της προνύμφης μεταφέρεται μέσω κάποιου μηχανισμού στο ενήλικο. Τέλος, μελετήθηκε η ωοτοκία θηλυκών τα οποία είχαν εκτεθεί σε ορισμένα οσμηρά ερεθίσματα κατά το στάδιο της προνύμφης. Σε ένα πρώτο πείραμα έντομα που εκτέθηκαν ως προνύμφες σε οσμηρά ερεθίσματα με διεγερτική δράση vi

7 επί της ωοτοκίας (λιμονένιο, αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού και λεμονιού) απέθεσαν ανταποκρινόμενα σε αυτά ως ενήλικα σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό αυγών σε σχέση με έντομα που δεν είχαν εκτεθεί (μάρτυρας). Στην περίπτωση έκθεσης σε ουσίες με ουδέτερη δράση επί της ωοτοκίας (μυρσίνη, α-πινένιο) επίσης παρατηρήθηκε αύξηση της ωοπαραγωγής, χωρίς ωστόσο οι διαφορές να είναι σημαντικές σε σχέση με το μάρτυρα. Αντιθέτως, στην περίπτωση έκθεσης σε ουσίες με αποτρεπτική δράση (λιναλούλη) η ωοπαραγωγή των θηλυκών της μεταχείρισης ήταν σημαντικά μικρότερη σε σχέση με το μάρτυρα. Στην περίπτωση του λιμονένιου, η ωοπαραγωγή των θηλυκών επηρεάστηκε σημαντικά από τη συγκέντρωση των οσμών της ουσίας στις οποίες είχαν εκτεθεί ως προνύμφες. Σε ένα άλλο πείραμα, προνύμφες εκτέθηκαν σε μια σειρά οσμηρών ερεθισμάτων (αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού, μανταρινιού, νεραντζιού και λεμονιού) με κλιμακούμενο βαθμό χημικής συγγένειας σε σχέση με τις οσμές στις οποίες αφέθηκαν να ωοτοκήσουν τα θηλυκά (αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όσο εγγύτερη ήταν η χημική συγγένεια μεταξύ ερεθίσματος έκθεσης των προνυμφών και ωοτοκίας των θηλυκών τόσο μεγαλύτερος ήταν και ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκε. Τέλος, προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων μη συγγενών μεταξύ τους, θηλυκά που ως προνύμφες εκτέθηκαν σε αιθέριο έλαιο μπανάνας αφέθηκαν να ωοτοκήσουν σε αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού και αντιστρόφως θηλυκά που είχαν εκτεθεί σε πορτοκάλι αφέθηκαν να ωοτοκήσουν σε μπανάνα. Η διαδικασία αυτή είχε ως συνέπεια και στις δύο περιπτώσεις τη μείωση της ωοπαραγωγής σε σχέση με το μάρτυρα. Η σημασία των αποτελεσμάτων στη βιολογία και οικολογία του εντόμου καθώς επίσης και οι προεκτάσεις τους στην αντιμετώπισή του σχολιάζονται στα επί μέρους Κεφάλαια. vii

8 ABSTRACT This dissertation deals with the effect of chemical stimuli derived from citrus fruits and some other plants on female oviposition and larvae behaviour of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). In a first series of experiments, oviposition preference and immature survival in five different citrus species were studied. In observational studies, ovipositional behavior exhibited by females in both intact and wounded citrus fruits was also explored. In multiple-choice experiments females laid more eggs into sweet oranges followed by mandarin oranges and bitter oranges while grapefruits and lemons were the least preferred hosts. Larvae survival in the above fruits was negatively correlated with peel toughness and was not closely associated with female oviposition preference. Observational studies revealed that the ability of females to lay eggs into intact citrus fruits was also negatively affected by peel toughness. Surface peel wounds did not affect female attraction, however they increased ovipositional activity relative to intact fruits which was mainly took place into the wounds. Finally, deep pulp wounds causing the release of juices on the fruits surface significantly increased female attraction relative to intact and surface wounded fruits. However, after landing on such fruits, the chemical properties of the juices greatly influenced the use of wounds during oviposition. More specifically, both wounds acceptance for oviposition and the number of eggs laid thereinto was negatively correlated with fruits juice acidity. Additional experiments were focused on the effects of citrus peel essential oils as well as some of their components on female ovipositional response. In dual-choice tests, females laid significantly more eggs into pre-punctured hollow oviposition hemispheres (domes) provided with 1 μl of peel oil from the five different citrus fruits compared with odorless domes. No-choice tests showed a weaker effect of lemon oils and a stronger one of sweet orange oils relative to others. The female ovipositional response to sweet orange oil was dosedependent. Among citrus peel oils components tested, it was found that limonene (the most abundant chemical in all citrus oils) stimulated oviposition, whereas linalool (a representative compound of immature citrus fruits) had a significant deterrent effect. Finally, in further no-choice tests, females were allowed to oviposit responding to equal amounts (1 μl) of sweet orange oil and two artificial mixtures consisting of 93% limonene (percentage found in orange oil) in the first case and 93% limonene and 3% linalool (approximately 10-fold the percentage found in orange oil) in the second case. The results showed that the limonene viii

9 content accounted largely (but not completely) for the stimulating properties of sweet orange oil (and probably of the other oils), whereas high linalool proportions were capable of significantly masking and/or disrupting its stimulatory effects in citrus oils. In another series of experiments, the olfactory capabilities of larvae as well as the existence of associative learning for olfactory stimuli were explored. In dualchoice tests performed in specially made experimental arenas, all larvae instars exhibited significantly stronger olfactory attraction to orange juice odours relative to control (water). Additionally, 3 rd instar larvae were capable of discriminating between host (sweet orange oil) and no host (peppermint) odours. When larvae were allowed to associate the presence of these odours with positive stimuli (food source) there was a significant increment in attraction to both odour types relative to non treated larvae, suggesting the existence of associative learning. Finally, females that had been exposed as larvae to distinct odours (limonene and geraniol) showed significantly greater response to respective cues one day following emergence compared with controls (non-exposed females as larvae). These results suggest that experience acquired during larvae stage is transferred through some mechanism to the adult. In a final experiment, the effects of larvae exposure to olfactory cues on female ovipositional behaviour were determined. In a first experiment, insects that had been exposed as larvae to cues stimulating oviposition (limonene, and sweet orange and lemon peel oils) and were allowed to respond to them as adults laid significantly more eggs relative to controls (non-exposed insects). In the case of compounds with neutral effects on oviposition (myrcene and a-pinene), there was also an increment on female eggs deposition relative to controls though not significant. On the other hand, in the case of compounds with deterrent effects (linalool) treated females laid significantly fewer eggs than controls. Ovipositional rates in response to limonene odours were highly depended on the amount (dose) that females had been exposed to this compound as larvae. In another experiment, larvae were exposed to a series of odours (essential oils of sweet orange, mandarin orange, bitter orange and lemon) with varying chemical affinity to the odours that females were allowed to oviposit (essential oil of sweet orange). Results showed that the closer the chemical affinity the greater the number of eggs laid. Finally, in order to determine the effects of unrelated odours, females that had been exposed as larvae to banana oils were allowed to oviposit in response to sweet orange oils and vice versa. This procedure resulted in both ix

10 cases to a significant reduction in the number of eggs laid relative to controls (non exposed females). The practical value of certain results for the control of the insect is discussed. x

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΡΕΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT iv v viii 1. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μορφολογία του εντόμου Ξενιστές και οικονομική σημασία του εντόμου Γεωγραφική εξάπλωση Βιολογία του εντόμου Καταπολέμηση Συμπεριφορά ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου Συμπεριφορά προνυμφών της μύγας της Μεσογείου Σκοπός της παρούσας διατριβής 15 Βιβλιογραφία ΓΕΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Συνθήκες εργαστηρίου Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν και μέθοδος εκτροφής τους 29 Βιβλιογραφία ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΩΟΤΟΚΙΑΣ ΤΩΝ ΘΗΛΥΚΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΩΝ ΑΝΗΛΙΚΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ ΣΕ ΚΑΡΠΟΥΣ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Έντομα και καρποί που χρησιμοποιήθηκαν Προσδιορισμός των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των καρπών Προτίμηση ωοτοκίας σε καρπούς των εσπεριδοειδών Ωοτοκία θηλυκών και επιβίωση των ανήλικων σταδίων σε διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών Συμπεριφορά ωοτοκίας σε άθικτους και τραυματισμένους καρπούς εσπεριδοειδών Στατιστική ανάλυση 45 xi

12 3.5 Αποτελέσματα Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των καρπών Προτίμηση ωοτοκίας στους καρπούς των εσπεριδοειδών Ωοτοκία θηλυκών και επιβίωση των ανήλικων σταδίων σε διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών Συμπεριφορά ωοτοκίας των θηλυκών σε άθικτους και τραυματισμένους καρπούς εσπεριδοειδών Συζήτηση 61 Βιβλιογραφία ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ ΣΤΗΝ ΩΟΤΟΚΙΑ Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν και χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων Επίδραση αιθέριων ελαίων από διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών στην ωοτοκία Επίδραση διαφορετικών δόσεων αιθέριων ελαίων πορτοκαλιού Επίδραση ορισμένων συστατικών των αιθέριων ελαίων Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων Επίδραση αιθέριων ελαίων από διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών στην ωοτοκία Επίδραση διαφορετικών δόσεων αιθέριων ελαίων πορτοκαλιού Επίδραση συστατικών των αιθέριων ελαίων Συζήτηση 90 Βιβλιογραφία ΟΣΦΡΗΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΡΟΝΥΜΦΩΝ ΚΑΙ ΣΥΝΕΙΡΜΙΚΗ ΜΑΘΗΣΗ ΣΕ ΟΣΜΗΡΑ ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΑ Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν και μέθοδος εκτροφής τους Οσφρητική ικανότητα των προνυμφών 101 xii

13 5.3.3 Ανταπόκριση των προνυμφών σε οσμηρά ερεθίσματα ξενιστών και μη-ξενιστών Συνειρμική μάθηση των προνυμφών σε οσμηρά ερεθίσματα Μεταφορά της συνειρμικής μάθησης σε οσμηρά ερεθίσματα που αποκτήθηκε κατά το προνυμφικό στάδιο ανάπτυξης στο ενήλικο Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Οσφρητική ικανότητα των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου Ανταπόκριση των προνυμφών σε οσμηρά ερεθίσματα ξενιστών και μη-ξενιστών και συνειρμική μάθηση Μεταφορά της συνειρμικής μάθησης σε οσμηρά ερεθίσματα που αποκτήθηκε κατά το προνυμφικό στάδιο ανάπτυξης στο ενήλικο Συζήτηση 118 Βιβλιογραφία ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΟΣΜΗΡΩΝ ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟ ΠΡΟΝΥΜΦΙΚΟ ΣΤΑΔΙΟ ΣΤΗΝ ΩΟΤΟΚΙΑ ΤΩΝ ΘΗΛΥΚΩΝ Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Έντομα και οσμηρά ερεθίσματα που χρησιμοποιήθηκαν Επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων με γνωστό τρόπο δράσης ως προς την ωοτοκία των θηλυκών Επίδραση διαφορετικών δόσεων λιμονενίου Επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων συγγενών προς τα ερεθίσματα ωοτοκίας των θηλυκών Επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων μη συγγενών προς τα ερεθίσματα ωοτοκίας των θηλυκών Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων με γνωστό τρόπο δράσης ως προς την ωοτοκία των θηλυκών Επίδραση διαφορετικών δόσεων λιμονένιου Επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων συγγενών προς τα ερεθίσματα ωοτοκίας των θηλυκών Επίδραση οσμηρών ερεθισμάτων μη συγγενών προς τα ερεθίσματα ωοτοκίας των θηλυκών 136 xiii

14 6.5 Συζήτηση 139 Βιβλιογραφία 143 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ 145 xiv

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μύγα της Μεσογείου, Ceratitis capitata (Wiedemann), ανήκει στην οικογένεια Tephritidae των Διπτέρων και στο άθροισμα Ceratidini. Τα περισσότερα είδη της οικογένειας αυτής είναι φυτοφάγα, λίγα είναι παρασιτοειδή (είδη της υποοικογένειας Tachiniscinae όπως το Bibundia sp.) και κάποια σαπροφάγα (είδη της υποοικογένειας Phytalmiinae όπως τα Clusiosoma, Clusiosomina, Rabaulia κ.α) (Díaz-Fleischer et al., 2000). Από τα φυτοφάγα είδη περίπου το 35% προσβάλλει καρπούς διαφόρων φυτών, το 40% ανθοκεφαλές φυτών της οικογένειας Asteraceae και τo 25% φύλλα, βλαστούς και ρίζες διαφόρων φυτών (White & Elson-Harris, 1992). Το γένος Ceratitis περιλαμβάνει περισσότερα από 90 είδη με τη μύγα της Μεσογείου να αποτελεί το πλέον γνωστό και το σημαντικότερο από άποψη οικονομικής σημασίας (De Meyer, 2000). 1.1 Μορφολογία του εντόμου Το ενήλικο έχει μήκος σώματος 4-6 mm, πλάτος mm και χαρακτηριστικό χρωματισμό με μαύρες, καστανές και κίτρινες κηλίδες στο θώρακα και τις πτέρυγες (Εικόνα 1). Η κεφαλή είναι κίτρινη, πιο σκούρα ανάμεσα στις βάσεις των κεραιών, οι οποίες έχουν καστανό χρώμα και φέρουν μικρό αριθμό μαύρων τριχών στο μέσο τους. Τα δύο βασικά άρθρα των κεραιών είναι ερυθροκάστανα, το τρίτο κιτρινωπό και η arista σχεδόν μαύρη. Οι σύνθετοι οφθαλμοί καταλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος της κεφαλής και έχουν ιριδίζον πορφυρό έως σκούρο καστανέρυθρο χρώμα. Τα αρσενικά διακρίνονται εύκολα από τα θηλυκά από ένα ζεύγος έμμισχων κερατοειδών αποφύσεων αργυρότεφρου χρώματος που υπάρχει στο μέτωπό τους. Οι πτέρυγες είναι διαφανείς, με κίτρινες, καστανέρυθρες και μαύρες ζώνες και κηλίδες και έχουν μήκος περίπου 4.5 mm η καθεμιά. Το νωτιαίο τμήμα του θώρακα είναι μαύρο γυαλιστερό, με χαρακτηριστικά γκρίζα στίγματα, ενώ το κοιλιακό κίτρινο. Το μεγαλύτερο τμήμα του scutellum είναι μαύρου γυαλιστερού χρώματος. Η κοιλιά είναι πορτοκαλοκίτρινη και έχει δύο καστανέρυθρες εγκάρσιες ζώνες. Ο ωοθέτης είναι κιτρινέρυθρος, εξέχει από το τελευταίο κοιλιακό τμήμα και έχει μήκος mm. Τα πόδια είναι κιρτινέρυθρα με μάλλον μακριές κίτρινες, σκληρές τρίχες στο οπίσθιο τμήμα της κνήμης (Papadopoulos, 2004). Τα αυγά είναι λεία, λευκά, ελλειπτικού σχήματος, και έχουν μήκος mm και διάμετρο mm. Οι 1

16 Εικόνα 1. Ενήλικο θηλυκό (επάνω) και αρσενικό (κάτω) της μύγας της Μεσογείου με τους χαρακτηριστικούς χρωματισμούς να διακρίνονται στα διάφορα μέρη του σώματος. 2

17 προνύμφες έχουν υπόλευκο χρώμα, είναι άποδες, κυλινδρικές με το πρόσθιο τμήμα του σώματός τους στενότερο από το οπίσθιο. Υπάρχουν τρεις προνυμφικές ηλικίες που διακρίνονται μεταξύ τους με βάση το σχήμα, το μέγεθος και το χρώμα των στοματικών αγκίστρων. Γενικά η προνύμφη της πρώτης ηλικίας έχει μήκος mm, της δεύτερης mm και της τρίτης 6-10 mm. Η νύμφη έχει σχήμα ελλειψοειδές βαρελόμορφο, μήκος mm και διάμετρο mm. Το χρώμα της νύμφης εξαρτάται κυρίως από τον ξενιστή στον οποίο αναπτύσσονται οι προνύμφες και μπορεί να ποικίλλει από υπόλευκο έως σκούρο καστανό (Papadopoulos, 2004). 1.2 Ξενιστές και οικονομική σημασία του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου αποτελεί ένα εξαιρετικά πολυφάγο είδος, δεδομένου ότι προσβάλλει διάφορους ξενιστές που ανήκουν σε περισσότερες από 67 οικογένειες φυτών. Οι ξενιστές του εντόμου ανέρχονται στους 353 περίπου (για ορισμένους δεν υπάρχουν στοιχεία για προσβολή τους στο ύπαιθρο), εκ των οποίων το 40% περίπου ανήκει στις οικογένειες Myrtaceae (6%), Rosaceae (10%), Rutaceae (9%), Spotaceae (9%) και Solanaceae (6%) (Liquido et al., 1991). Ο Παπαδόπουλος (1999) αναφέρει δύο επιπλέον ξενιστές του εντόμου στην περιοχή της Θεσσαλονίκης, το Malus floridunda (Rosaceae) και το Carya illinoensis (Juglandaceae), ενώ από την ίδια περιοχή ανακτήθηκαν ενήλικα και από προσβεβλημένα καρύδια βαμβακιού (Α. Χατζηγεωργίου προσωπική επικοινωνία). Σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές αποτελεί σημαντικό εχθρό καλλιεργειών καφέ, μάνγκο, παπάγιας, αβοκάντο, γκουάβας κ.α (Papadopoulos, 2004). Σε εύκρατες περιοχές προσβάλλει κυρίως πυρηνόκαρπα, γιγαρτόκαπρα και εσπεριδοειδή. Στις περιοχές της Μεσογείου θεωρείται από τους σημαντικότερους εχθρούς των καρποφόρων δέντρων (Fimiani, 1989). Στη χώρα μας προκαλεί σημαντικές ζημιές σε εσπεριδοειδή, αχλάδια, μήλα, ροδάκινα, βερίκοκα, σύκα και άλλα φρούτα (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 1998). Η μύγα της Μεσογείου θεωρείται από τους πλέον σοβαρούς εχθρούς παγκοσμίως με τα επίπεδα προσβολής να προσεγγίζουν ακόμη και το 100% σε ορισμένους ξενιστές. Η παρουσία και μόνιμη εγκατάσταση του εντόμου σε μια περιοχή συνεπάγεται σημαντικές οικονομικές συνέπειες για την προστασία της παραγωγής. Πέρα από τις άμεσες ζημιές που προκαλεί η προσβολή και απώλεια των καρπών, η μύγα της Μεσογείου θεωρείται έντομο καραντίνας σε χώρες που δεν έχει εγκατασταθεί ακόμη. Το γεγονός αυτό δυσχεράνει σημαντικά το εμπόριο προς τέτοιες χώρες, καθώς για τη μεταφορά φρούτων από περιοχές όπου το 3

18 έντομο ενδημεί απαιτούνται αυστηρά μέτρα απεντόμωσης που αυξάνουν σημαντικά το κόστος (Mitchell & Saul, 1990). Κατά το πρόσφατο παρελθόν, πραγματοποιήθηκαν εκτεταμένες προσπάθειες από διεθνείς και εθνικούς οργανισμούς με σκοπό αφενός τον περιορισμό της εξάπλωσης της μύγας της Μεσογείου και αφετέρου την εκρίζωσή της από περιοχές με μόνιμη εγκατάσταση (Hagen et al., 1981; Mitchell & Saul, 1990; Gonzalez & Troncoso, 2007; Guillen & Sanchez, 2007; Mau et al., 2007; Reyes et al., 2007). Ωστόσο, μια πρόσφατη έρευνα αναφορικά με τα προγράμματα εξάλειψης τόσο της μύγας της Μεσογείου όσο και άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae στην πολιτεία της Καλιφόρνιας θέτει υπό σοβαρή αμφισβήτηση την αποτελεσματικότητά τους προτείνοντας διαφορετικές προσεγγίσεις (Papadopoulos et al., 2013). 1.3 Γεωγραφική εξάπλωση Μια σειρά από γενετικές μελέτες σε πληθυσμούς από διαφορετικές ηπείρους συγκλίνουν στο γεγονός ότι η μύγα της Μεσογείου κατάγεται από την Αφρική και συγκεκριμένα από τις νότιες περιοχές της ερήμου Σαχάρα (Kourti et al., 1992; Malacrida et al., 1998; Kourti, 2002). Η εξάπλωση του εντόμου σε νέες περιοχές φαίνεται να ξεκίνησε από τη Μεσόγειο, με το είδος να καταγράφεται για πρώτη φορά το 1842 στην Ισπανία και αργότερα (1898) στην Πορτογαλία (Fimiani, 1989). Στη χώρα μας το C. capitata εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 1915 σε οπωρώνες εσπεριδοειδών της Αττικής και της Αίγινας και αργότερα (1937,1965) στην ηπειρωτική Ελλάδα και σε άλλα νησιά (Fimiani, 1989 και πηγές που αναφέρει). Πιθανολογείται ότι ο εποικισμός της λεκάνης της Μεσογείου πραγματοποιήθηκε είτε μέσω της κοιλάδας του Νείλου και στη συνέχεια κατά μήκος των ακτών της Μέσης Ανατολής, είτε μέσω της Ισπανίας από τη βορειοδυτική ακτή της Αφρικής και το Γιβραλτάρ (Papadopoulos, 2004). Η εξάπλωση του εντόμου σε περιοχές του Νέου Κόσμου (Λατινική Αμερική) εικάζεται ότι έγινε από την Ισπανία μέσω του εμπορίου φρούτων. Το έντομο ενδημεί σε όλες τις χώρες της νότιας και κεντρικής Αμερικής με μοναδική εξαίρεση το Μεξικό απ όπου εξαλείφθηκε ύστερα από συντονισμένες προσπάθειες (White & Elson- Harris, 1992). Στη βόρεια Αμερική έχουν αναφερθεί κατά καιρούς αρκετές εισβολές σε διάφορες περιοχές με την πρώτη να καταγράφεται το 1926 στην κεντρική Φλόριντα (Hagen et al., 1981). Η εφαρμογή προγραμμάτων εξάλειψης φαίνεται να απέτρεψε την εγκατάσταση στο πλείστο των περιπτώσεων, με μοναδική εξαίρεση την πολιτεία της Καλιφόρνιας όπου πλέον θεωρείται βέβαιο ότι έχουν εγκατασταθεί τόσο η μύγα της Μεσογείου όσο και άλλα είδη της οικογένειας 4

19 Tephritidae (Papadopoulos et al., 2013). Το έντομο επίσης ενδημεί στη δυτική Αυστραλία, τη Μέση Ανατολή, σε νησιά του Ατλαντικού, Ειρηνικού και Ινδικού ωκεανού (White & Elson-Harris, 1992). Η περιστασιακή παρουσία του είδους σε χώρες της κεντρικής Ευρώπης όπως το Βέλγιο, η Γερμανία, η Ουγγαρία και η Σουηδία θα πρέπει να αποδοθεί στη μεταφορά προσβεβλημένων φορτίων καρπών από άλλες χώρες καθώς το έντομο δεν ενδημεί σε τόσο μεγάλα γεωγραφικά πλάτη (Papadopoulos, 2004). Ως βορειότερη ζώνη εξάπλωσης της μύγας της Μεσογείου φαίνεται να αποτελούν περιοχές της βόρειας Ελλάδας καθώς επίσης και ορισμένες παραθαλάσσιες περιοχές της Κροατίας και του Μαυροβούνιου όπου καλλιεργούνται εκτενώς εσπεριδοειδή (Παπαδόπουλος, 1999; Randonjić et al., 2013). 1.4 Βιολογία του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου είναι πολυκυκλικό, ομοδυναμικό είδος και συμπληρώνει αρκετές γενεές το έτος ανάλογα με την περιοχή, τις επικρατούσες συνθήκες (θερμοκρασία) και τη διαθεσιμότητα των ξενιστών. Στη χώρα μας θεωρείται ότι συμπληρώνει 3-7 γενεές το έτος (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 1998). Σε τροπικές, υποτροπικές καθώς επίσης και σε νότιες περιοχές της Μεσογείου το είδος είναι δραστήριο και αναπαράγεται καθ όλη τη διάρκεια του έτους (Mavrikakis et al., 2000). Σε βορειότερες περιοχές όπου οι χειμερινές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν την επιβίωση των ενηλίκων, το έντομο διαχειμάζει ως προνύμφη μέσα σε προσβεβλημένους καρπούς που παραμένουν στα δένδρα ή έχουν πέσει στο έδαφος (Papadopoulos et al., 1996; Katsoyannos et al., 1998). Οι χειμερινές θερμοκρασίες μειώνουν σημαντικά τους ρυθμούς ανάπτυξης και έτσι οι προνύμφες κατορθώνουν να περάσουν το μεγαλύτερο μέρος της ψυχρής περιόδου προστατευμένες στο εσωτερικό των καρπών. Τα ενήλικα εμφανίζονται την άνοιξη και αμέσως μετά την έξοδό τους από το νυμφικό περίβλημα, διασπείρονται προς αναζήτηση τροφής. Τα θηλυκά έχουν την τάση να διασπείρονται σε μεγαλύτερες αποστάσεις σε σχέση με τα αρσενικά κατά την αναζήτηση τροφής και ορισμένες φορές μεταναστεύουν σε νέες θέσεις εποικίζοντας καινούρια ενδιαιτήματα (Hendrichs et al., 1991). Πριν την έναρξη της ωοτοκίας, τα θηλυκά της μύγας της Μεσογείου θα πρέπει να διανύσουν μια περίοδο αναπαραγωγικής ωρίμανσης στη διάρκεια της οποίας είναι απαραίτητη η διατροφή σε πρωτεϊνούχες τροφές και άλλα θρεπτικά συστατικά για την ολοκλήρωση της ωογένεσης. Χωρίς την παρουσία πρωτεϊνούχων τροφών τα άγρια θηλυκά της μύγας της Μεσογείου κατά κανόνα ωριμάζουν ελάχιστα ή και 5

20 καθόλου αυγά. Η αναυτογένεια που είναι τυπική για τα περισσότερα φρουτοφάγα είδη της οικογένειας Tephritidae σύμφωνα με τους Hendrichs & Prokopy (1994) είναι το αποτέλεσμα της ταχείας ανάπτυξης των προνυμφών σε καρπούς κατά κανόνα φτωχούς σε πρωτεΐνη. Παρά το γεγονός ότι τα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου διαθέτουν γόνιμο σπέρμα λίγες ώρες μετά την έξοδό τους από το νυμφικό περίβλημα, εντούτοις και αυτά θα πρέπει να διέλθουν μια περίοδο σεξουαλικής ωρίμασης τρεφόμενα με σακχαρούχες και πρωτεϊνούχες τροφές προκειμένου να είναι σε θέση να εκδηλώσουν σεξουαλικό κάλεσμα (Christenson & Foote, 1960). Αφού ωριμάσουν αναπαραγωγικά τα δύο φύλα ακολουθεί η σύζευξη. Τα αρσενικά συγκροτούν χαλαρές συναθροίσεις τύπου lek στην κάτω επιφάνεια των φύλλων ξενιστών που αποτελούνται από 3 έως 4 άτομα και επιδίδονται σε σεξουαλικό κάλεσμα με σκοπό την προσέλκυση παρθένων θηλυκών (Eberhard, 2000). Με την προσέγγιση των θηλυκών ακολουθεί μια αλληλουχία συμπεριφορών (ερωτοτροπία) και από τα δύο φύλα που συνήθως οδηγεί στη σύζευξη (Féron, 1962). Τα γονιμοποιημένα θηλυκά αρχίζουν να ωοτοκούν σε ώριμους ή σχεδόν ώριμους καρπούς. Το θηλυκό ανοίγει με τον ωοθέτη του οπή στο επικάρπιο ή βαθύτερα στο μεσοκάρπιο των καρπώνξενιστών και τοποθετεί στο βάθος της οπής συνήθως 1 έως 10 αυγά. Στη συνέχεια αποθέτει φερομόνη αποτροπής ωοτοκίας σύροντας τον ωοθέτη του αρχικά γύρω από την οπή ωοτοκίας και στη συνέχεια στην υπόλοιπη επιφάνεια του καρπού. Με τον τρόπο αυτό αποτρέπει άλλα θηλυκά να ωοτοκήσουν στον ίδιο καρπό (Prokopy et al., 1978). Μετά την εκκόλαψη των προνυμφών, συνήθως η μια κοντά στην άλλη, αναπτύσσονται εντός του καρπού. Τόσο το είδος όσο και η ποικιλία των καρπών στους οποίους αναπτύσσονται οι προνύμφες παίζει σημαντικό ρόλο σε παραμέτρους που σχετίζονται με τη γονιμότητα και μακροζωία των ενηλίκων που προκύπτουν (Carey, 1984; Krainacker et al., 1987; Papachristos & Papadopoulos, 2009). Εκτός από τη διάβρωση και νέκρωση της σάρκας των καρπών που οφείλεται στη διατροφή των προνυμφών, συχνά στους προσβεβλημένους καρπούς αναπτύσσονται μύκητες και άλλοι μικροοργανισμοί που επιτείνουν τη ζημιά. Όταν οι προνύμφες ολοκληρώσουν την ανάπτυξή τους, εγκαταλείπουν τον καρπό, πέφτουν στο έδαφος και νυμφώνονται σε σχετικά μικρό βάθος (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 1998). 1.5 Καταπολέμηση Η αντιμετώπιση της μύγας της Μεσογείου γίνεται συνήθως με δολωματικούς ψεκασμούς ή με ψεκασμούς πλήρους καλύψεως με 6

21 οργανοφωσφορούχα κυρίως εντομοκτόνα. Ο προσδιορισμός της ανάγκης και του χρόνου επέμβασης βασίζεται κυρίως στην παρακολούθηση του πληθυσμού των εντόμων με τροφικές και φερομονικές παγίδες (παγίδες τύπου McPhail και τύπου Jackson αντίστοιχα). Στις περιπτώσεις εκείνες που δε γίνεται παρακολούθηση του πληθυσμού, οι καρποί θα πρέπει να προστατεύονται καθ όλη την περίοδο που είναι ευπρόσβλητοι από το έντομο (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 1998). Πέραν της χημικής καταπολέμησης, άλλα μέτρα που έχουν εφαρμοστεί κατά καιρούς για την αντιμετώπιση της μύγας της Μεσογείου είναι η εξαπόλυση στείρων εντόμων, η μαζική παγίδευση, η βιολογική καταπολέμηση και η υιοθέτηση καλλιεργητικών και νομοθετικών μέτρων (Mitchell & Saul, 1990). Η μέθοδος των στείρων εντόμων, άλλοτε από μόνη της και άλλοτε σε συνδυασμό με εντομοκτόνους ψεκασμούς, έχει εφαρμοστεί και συνεχίζει να εφαρμόζεται σε πολλές χώρες με αρκετά καλά αποτελέσματα. Η μέθοδος βασίζεται στην εξαπόλυση μεγάλου αριθμού στείρων αρσενικών σε ευρεία έκταση με στόχο τη σύζευξη με τα άγρια θηλυκά των πληθυσμών και την απόθεση άγονων αυγών (Dyck et al., 2005). Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητα των στείρων αρσενικών να ανταγωνίζονται με επιτυχία τα άγρια ως προς την προσέλκυση, ερωτοτροπία και σύζευξη με τα θηλυκά (Prokopy & Hendrichs, 1979). Οι μέθοδοι μαζικής εκτροφής των εντόμων και η στείρωσή τους με τη χρήση ακτινοβολίας κατά κανόνα αποδίδουν άτομα με μειωμένη σεξουαλική ανταγωνιστικότητα σε σχέση με τα άγρια (Shelly et al., 1994; Shelly & Whittier, 1996; Hendrichs et al., 1996). Τα τελευταία χρόνια ωστόσο έχουν γίνει σημαντικά βήματα για την αύξηση της ανταγωνιστικότητας με τη χρήση ουσιών φυτικής προέλευσης από ξενιστές και μη ξενιστές του εντόμου που βελτιώνουν τη σεξουαλική επιτυχία των αρσενικών (Kouloussis et al., 2013 και πηγές που αναφέρει). Επιπλέον, ως εναλλακτική της χρήσης ακτινοβολίας για την πρόκληση στειρότητας έχει αρχίσει να εφαρμόζεται η μέθοδος της κυτοπλασμικής ασυμβατότητας με τη μεταφορά ενδοκυτταρικών συμβιωτικών στελεχών του βακτηρίου της Wolbachia σε εργαστηριακές φυλές της μύγας της Μεσογείου (Zabalou et al., 2004). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η στειρότητα των θηλυκών μπορεί να επιτευχθεί αποτελεσματικά και στο ύπαιθρο με τη χρήση τροφικών ελκυστικών που φέρουν ρυθμιστές ανάπτυξης των εντόμων (IGRs). Από τους διάφορους ρυθμιστές ανάπτυξης που μελετήθηκαν, η ουσία lufenuron αποδείχτηκε η πλέον αποτελεσματική τόσο στο εργαστήριο (Casana-Giner et al., 1999) όσο και στο ύπαιθρο (Navarro-Llopis et al., 2007). Ένα σημαντικό πλεονέκτημα εφαρμογής της μεθόδου αυτής είναι ότι προκαλεί συσσωρευτική μείωση των πληθυσμών του 7

22 εντόμου σε βάθος χρόνου, κάτι που δε συμβαίνει με τη χρήση συμβατικών εντομοκτόνων. Με τη μέθοδο της μαζικής παγίδευσης μπορεί να επιτευχθεί ικανοποιητική αντιμετώπιση της μύγας της Μεσογείου, ιδιαίτερα σε περιοχές με χαμηλές πυκνότητες πληθυσμού του εντόμου. Η μέθοδος αυτή έχει εφαρμοστεί και στη χώρα μας στην περιοχή της Κορινθίας με ικανοποιητικά αποτελέσματα (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 1998 από Ζέρβας & συνεργάτες, 1997). Η ανάπτυξη κατά το πρόσφατο παρελθόν εξειδικευμένων τροφικών ελκυστικών για τα θηλυκά του εντόμου κατέστησε πιο αποδοτική την εφαρμογή της μεθόδου τόσο από πρακτική όσο και από οικονομική άποψη (Katsoyannos et al., 1999α,β). Παλαιότερες προσπάθειες για τη δημιουργία αποτελεσματικών προσελκυστικών με βάση πτητικές ουσίες προερχόμενες από τον αρχέγονο ξενιστή του εντόμου, τον καφέ, αν και έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα φαίνεται να έχουν πλέον εγκαταλειφτεί (Prokopy & Vargas, 1996; Vargas et al., 1997; Prokopy et al., 1998). Η βιολογική καταπολέμηση της μύγας της Μεσογείου αφορά κυρίως την εκτροφή και εξαπόλυση είτε ιθαγενών είτε εξωτικών παρασιτοειδών με σκοπό τη μείωση των πληθυσμών του εντόμου. Από τα παρασιτοειδή που έχουν μελετηθεί, το Fopius arisanus (Hymenoptera: Braconidae) έχει αποδειχτεί το πλέον αποτελεσματικό έναντι της μύγας της Μεσογείου και άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae (Zenil et al., 2004; Rousse et al., 2006) και εκτρέφεται μαζικά για το σκοπό αυτό εδώ και κάποια χρόνια (Bautista et al., 1999). Στη χώρα μας έχει γίνει μια μόνο προσπάθεια βιολογικής καταπολέμησης της μύγας της Μεσογείου με το παρασιτοειδές Dirhinus giffardii (Hymenoptera: Chalcididae) που εισήχθη από το Ισραήλ το 1962 και εξαπολύθηκε στη νότια ηπειρωτική Ελλάδα, χωρίς ωστόσο να διαπιστωθεί η παρουσία του έκτοτε (Papadopoulos & Katsoyannos, 2003 από Greathead, 1976). Πρόσφατα καταγράφηκε στη χώρα μας η παρουσία του Aganaspis daci (Hymenoptera: Eucoilidae) σε παρασιτισμένες νύμφες της μύγας της Μεσογείου που προέρχονταν από προσβεβλημένα σύκα που συλλέχθηκαν στο νησί της Χίου (Papadopoulos & Katsoyannos, 2003). Τα σχετικά υψηλά ποσοστά παρασιτισμού που παρατηρήθηκαν (περίπου 62 και 65% κατά τα έτη 1999 και 2000 αντίστοιχα) σε συνδυασμό με το γεγονός ότι πρόκειται για ήδη εγκατεστημένο είδος, αποτελούν ενθαρρυντικά στοιχεία για την αξιοποίησή του έναντι της μύγας της Μεσογείου στη χώρα μας. Πέρα από τα παρασιτοειδή, στη βιολογική αντιμετώπιση του εντόμου έχουν δοκιμαστεί με καλά αποτελέσματα στο εργαστήριο και οι εντομοπαθογόνοι μύκητες Beauveria bassiana και Metarhizium anisopliae (Quesada-Moraga et al., 2006, 2008). Τέλος, από τα βιολογικά σκευάσματα, το spinosad έχει δώσει επίσης πολύ καλά αποτελέσματα τόσο στο 8

23 εργαστήριο (Adan et al., 1996) όσο και στο ύπαιθρο (McQuate et al., 2005). Στα θετικά του συγκεκριμένου σκευάσματος θα πρέπει να συνυπολογιστεί και το γεγονός ότι δεν επιφέρει δυσμενείς επιδράσεις σε φυσικούς εχθρούς της μύγας της Μεσογείου και άλλων ειδών των Tephritidae (Stark et al., 2004). Επίσης, σημαντικά για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του εντόμου είναι τα καλλιεργητικά και τα νομοθετικά μέτρα που λαμβάνονται. Τα καλλιεργητικά μέτρα αφορούν την καταστροφή των προσβεβλημένων καρπών και των μη καλλιεργούμενων άγριων ξενιστών, την καλλιέργεια του εδάφους κάτω από δένδρα που φέρουν προσβεβλημένους καρπούς ώστε να εκτεθούν οι νύμφες του εντόμου στους διάφορους άρπαγες κ.α. Τα νομοθετικά μέτρα υπό τη μορφή των φυτοϋγειονομικών ελέγχων αφορούν την αποτροπή της εισαγωγής προσβεβλημένων καρπών σε χώρες στις οποίες το έντομο δεν έχει εγκατασταθεί. Για το λόγο αυτό, πριν την εισαγωγή είναι υποχρεωτική η απεντόμωση των καρπών που προέρχονται από περιοχές όπου το έντομο ενδημεί (Mitchell & Saul, 1990). Οι διαδικασίες απεντόμωσης περιλαμβάνουν τη χρήση χαμηλών ή υψηλών θερμοκρασιών και ακτινοβολίας γ και θα πρέπει να εξασφαλίζουν ουσιαστικά την πλήρη εξάλειψη του εντόμου. Επιπλέον, στα σημεία εισόδου των εμπορευμάτων γίνονται συχνοί δειγματοληπτικοί έλεγχοι των φορτίων που εισέρχονται προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι οι καρποί είναι πράγματι ελεύθεροι προσβολών. 1.6 Συμπεριφορά ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό γνώρισμα της μύγας της Μεσογείου είναι η μεγάλη πλαστικότητα που διέπει τη συμπεριφορά ωοτοκίας των θηλυκών (Prokopy et al.,1984; Katsoyannos, 1989) γεγονός που αντικατοπτρίζεται από την ικανότητά τους να εποικίζουν ποικίλα ενδιαιτήματα και να αποδέχονται ως ξενιστές ακόμη και καρπούς στους οποίους οι προνύμφες αδυνατούν να ολοκληρώσουν την ανάπτυξή τους (Carey, 1984; Krainacker et al., 1987). Σε αντίθεση με άλλα είδη οικονομικής σημασίας της οικογένειας Tephritidae, η πλαστικότητα αυτή της μύγας της Μεσογείου έχει ως αποτέλεσμα μια ιδιαίτερα μη προσαρμοστική συμπεριφορά που μπορεί κάτω από ορισμένες προϋποθέσεις όπως εξηγείται παρακάτω να καταλήγει σε απόθεση αυγών ακόμη και σε επίπεδες διάτρητες επιφάνειες (δίχτυα ωοτοκίας) που στερούνται οπτικών, απτικών και οσμηρών ερεθισμάτων που να παραπέμπουν σε κάποιο ξενιστή (Schawarz et al., 1981). Μετά την έξοδο από το νυμφικό περίβλημα υπάρχει μια περίοδος πρωοτοκίας κατά τη διάρκεια της οποίας τα θηλυκά προβαίνουν σε αναζήτηση τροφής προκειμένου να ωριμάσουν αναπαραγωγικά και να συζευχθούν. Τα 9

24 θηλυκά της μύγας της Μεσογείου διαθέτουν κατά μέσο όρο 28 πολυτροφικούς σωληνίσκους (ovarioles) σε κάθε ωοθήκη (Hanna, 1938) και μπορούν να παράγουν 300 με 1000 αυγά κατά τη διάρκεια τη ζωής τους ωοτοκώντας σε καθημερινή βάση (Christenson & Foote, 1960; Bateman, 1972). Προκειμένου να εκφραστεί πλήρως το μεγάλο αυτό αναπαραγωγικό δυναμικό, τα θηλυκά θα πρέπει να εφοδιάζονται σε καθημερινή σχεδόν βάση με πρωτεϊνούχες τροφές ώστε να διατηρείται η παραγωγή ωοκυττάρων σε όλα τα διαδοχικά στάδια ωρίμανσης. Πριν τη σύζευξη, τα θηλυκά σπάνια επισκέπτονται τους καρπούς, κυρίως για να τραφούν με χυμούς και η κύρια δραστηριότητά τους επικεντρώνεται στην αναζήτηση αρσενικών. Ωστόσο, μετά τη σύζευξη και την επιτυχή μεταφορά του σπέρματος και των εκκριμάτων των βοηθητικών αδένων παρατηρείται σημαντική αλλαγή στη συμπεριφορά των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου καθώς παύουν πλέον να ανταποκρίνονται στις οσμές της φερομόνης των αρσενικών και προσελκύονται έντονα σε οσμές καρπών ξενιστών (Jang, 1995). Τα αναπαραγωγικώς δραστήρια θηλυκά έχουν την τάση να παραμένουν επάνω ή πολύ κοντά σε φυτά ξενιστές εφόσον υπάρχουν διαθέσιμοι καρποί για ωοτοκία. Ωστόσο, όταν οι καρποί σε μια περιοχή αρχίσουν να σπανίζουν και ο ανταγωνισμός μεταξύ των θηλυκών γίνεται έντονος, διασπείρονται γρήγορα, ορισμένες φορές σε μεγάλες αποστάσεις για την ανεύρεση νέων ξενιστών (Prokopy & Roitberg, 1984; Hendrichs & Hendrichs, 1990). Το κύριο ερέθισμα που κατευθύνει τα θηλυκά από μεγάλες αποστάσεις στις νέες θέσεις φαίνεται να είναι ένας συνδυασμός από οσμές που αναδύονται από τους καρπούς που ωριμάζουν, τη φερομόνη αρσενικών που ενδεχομένως βρίσκονται ήδη στο ενδιαίτημα, περιττώματα πτηνών και καρπούς που βρίσκονται σε αποσύνθεση στο έδαφος (Yuval & Hendrichs, 2000 και πηγές που αναφέρουν). O εντοπισμός των φυτών ξενιστών που βρίσκονται στο ενδιαίτημα βασίζεται σε μια αλληλουχία τόσο οπτικών (Katsoyannos, 1989) όσο και οσμηρών ερεθισμάτων (Schoonhoven, 1983; Levinson et al., 1990). Ωστόσο, μετά την άφιξη την θηλυκών στα φυτά ξενιστές, ο εντοπισμός και η επιλογή των καρπών βασίζεται κυρίως σε οπτικά ερεθίσματα. Το σχήμα, το χρώμα και το μέγεθος και η αντίθεση σε σχέση με το φόντο του φυλλώματος και του ορίζοντα είναι οι κυρίαρχοι παράγοντες που καθορίζουν τις ανταποκρίσεις των θηλυκών. Το σχήμα μιας δυνητικής θέσης ωοτοκίας είναι πρωταρχικής σημασίας για την επιλογή της από τα φρουτοφάγα είδη της οικογένειας Tephritidae. Σφαιρικές και ημισφαιρικές επιφάνειες προτιμώνται πολύ περισσότερο σε σχέση με επίπεδες κατά την απόθεση των αυγών (Katsoyannos, 1989). Σε ότι αφορά την προτίμηση του χρώματος από τη μύγα της Μεσογείου μια σειρά από μελέτες αποδεικνύουν ότι αυτή μπορεί να 10

25 μεταβάλλεται ως συνέπεια της γενετικής παραλλακτικότητας των πληθυσμών του εντόμου καθώς επίσης και του υποστρώματος ανάπτυξης των προνυμφών (ξενιστής, τεχνίτη τροφή). Οι Katsoyannos και συνεργάτες (1986) μελετώντας την προτίμηση ωοτοκίας σε άγρια έντομα που προέρχονταν από προσβεβλημένα σύκα, διαπίστωσαν ότι συγκεκριμένες ιδιότητες των χρωμάτων που εξέτασαν όπως το μήκος κύματος που αντανακλούσαν και η φωτεινότητα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της επιλογής. Το γεγονός επίσης ότι στη συγκεκριμένη μελέτη τα θηλυκά επισκέπτονταν πιο συχνά τα προτιμητέα χρώματα φαίνεται να υποδεικνύει ότι η επιλογή λαμβάνει χώρα πριν την άφιξη στις θέσεις ωοτοκίας. Τέλος, σε ότι αφορά το μέγεθος των καρπών, οι Prokopy και συνεργάτες (1984) διαπίστωσαν διαφορές ως προς την προτίμηση μεταξύ πληθυσμών της μύγας της Μεσογείου που τις απέδωσαν εν μέρει σε γενετικά αίτια. Οι Freeman & Carey (1990) επιβεβαιώνοντας την άποψη αυτή, αναφέρουν ότι εργαστηριακοί πληθυσμοί που έχουν προσαρμοστεί να ωοτοκούν σε μεγάλα τεχνητά υποστρώματα εμφανίζουν έντονη προτίμηση προς ευμεγέθεις ξενιστές κάτι που δε συμβαίνει στο πλείστο των περιπτώσεων που αφορούν άγρια έντομα. Μετά την άφιξή στους καρπούς, τα θηλυκά αξιολογούν την καταλληλότητα τους για ωοτοκία με βάση απτικά (δομή επιφάνειας, κατάσταση και ποιότητα καρπού) και χημικά ερεθίσματα (οσμές που αναδύονται από τον ξενιστή και παρουσία ή μη φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας) (Schoonhoven, 1983; McDonald & McInnis, 1985; Averill & Prokopy, 1989; Prokopy & Roitberg, 1989). Τα θηλυκά κατά την αξιολόγηση χαμηλώνουν την κεφαλή και με την προβοσκίδα τους ερευνούν την επιφάνεια του καρπού μέχρι να εντοπίσουν ένα κατάλληλο σημείο για ωοτοκία. Όπως συμβαίνει και με άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae, η μύγα της Μεσογείου προτιμά να αποθέτει τα αυγά της σε σημεία του φλοιού των ξενιστών που φέρουν τραύματα, συμπεριλαμβανομένων και νυγμάτων ωοτοκίας από άτομα του είδους. Τα οφέλη που προκύπτουν από μια τέτοια συμπεριφορά φαίνεται να είναι τόσο η εξοικονόμηση χρόνου και ενέργειας όσο και η αποφυγή της φθοράς του ωοθέτη (Díaz-Fleischer et al., 2000 και πηγές που αναφέρουν). Αφού επιλέξουν μια κατάλληλη θέση, τα θηλυκά προβάλλουν τον ωοθέτη και με την κοιλιά τους σε σχεδόν ορθή γωνία σε σχέση με τον καρπό αρχίζουν να διατρυπούν το επικάρπιο και με ρυθμικές κινήσεις φτάνουν στο μεσοκάρπιο όπου διαμορφώνουν μια μικρή κοιλότητα 3-4 mm κάτω από την επιφάνεια στην οποία αποθέτουν συνήθως 1-10 αυγά (Levinson et al., 2003 από Sanders, 1962). Κατά το πρόσφατο παρελθόν και σε αντιστοιχία με άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae, πραγματοποιήθηκαν διάφορες μελέτες αναφορικά με τους παράγοντες που ενδεχομένως επηρεάζουν τις αποφάσεις ωοτοκίας τη μύγας της 11

26 Μεσογείου. Οι McDonald & McInnis (1985) χρησιμοποιώντας έντομα μαζικής εκτροφής υποστήριξαν ότι τα θηλυκά προσαρμόζουν τον αριθμό των αυγών που αποθέτουν σε κάθε ωοτοκία με βάση το μέγεθος (διάμετρος) του ξενιστή. Ισχυρίστηκαν μάλιστα ότι για κάθε 10 mm αύξησης της διαμέτρου, τα θηλυκά αποθέτουν κατά μέσο όρο ένα επιπλέον αυγό. Ωστόσο, ο Papaj (1990) χρησιμοποιώντας άγρια έντομα και πιο αξιόπιστη πειραματική διαδικασία κατέρριψε τον ισχυρισμό αυτό και θεώρησε ότι τα αποτελέσματα των παραπάνω ερευνητών ήταν συνέπεια του γεγονότος ότι στους μικρότερους καρπούς η φερομόνη αποτροπής ωοτοκίας συσσωρεύονταν ταχύτερα επηρεάζοντας με τον τρόπο αυτό τον αριθμό των αυγών που αποθέτονταν. Πράγματι, σύμφωνα με τους Papaj και συνεργάτες (1989α, 1990) η παρουσία φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας μειώνει σημαντικά τόσο την πρόθεση των θηλυκών να ωοτοκήσουν όσο και τον αριθμό των αυγών που αποθέτουν σε σχέση με μη σημασμένους καρπούς. Ωστόσο, ο βαθμός της αποτρεπτικής δράσης μπορεί να ποικίλει επηρεαζόμενος από μια σειρά παραγόντων όπως η ποιότητα, η ποσότητα και η κατανομή των διαθέσιμων για ωοτοκία καρπών, το μέγεθος του φορτίου των ώριμων αυγών που φέρουν τα θηλυκά (πίεση ωοτοκίας) και η προηγούμενη επαφή τους με ήδη προσβεβλημένους καρπούς (Fletcher & Prokopy, 1991). Οι ίδιοι παράγοντες και κυρίως η αυξημένη πίεση ωοτοκίας μπορεί να συντελέσουν και στην απόθεση αυγών σε καρπούς μη ξενιστές στο ύπαιθρο, καθώς επίσης και σε τεχνητά υποστρώματα στο εργαστήριο (δίχτυα ωοτοκίας ή ομοιώματα καρπών). Παρόλα ταύτα, θηλυκά με μικρή έως μέτρια πίεση ωοτοκίας τείνουν να προσαρμόζουν τον αριθμό των αυγών που αποθέτουν κάθε φορά, ανάλογα με το βαθμό προτίμησης (υψηλό ή χαμηλό) των ξενιστών τους (Prokopy et al., 1994). Τέλος, μια σημαντική παράμετρος της συμπεριφοράς ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου είναι η ικανότητα μάθησης. Θηλυκά που ωοτοκούν αρκετές φορές σε ένα ορισμένο είδος καρπού στην συνέχεια εμφανίζουν έντονη τάση για απόρριψη προς άλλα είδη εξίσου προτιμητέα (Cooley et al., 1986). Ο τύπος αυτός της μάθησης είναι αντιστρέψιμος και η μνήμη από την εμπειρία της ωοτοκίας σε ένα δεδομένο είδος καρπού μπορεί να διαρκεί από αρκετές ώρες έως ημέρες (Papaj et al., 1989β). Το κύριο χαρακτηριστικό που μαθαίνεται και χρησιμοποιείται για την ανεύρεση οικείων καρπών είναι το μέγεθος, ενώ το χρώμα και τα χημικά χαρακτηριστικά φαίνεται να έχουν ελάχιστη ή καθόλου σημασία (Prokopy et al., 1989). Μετά την είσοδο του ωοθέτη στους καρπούς, πληροφορίες που προέρχονται από αισθητήρια όργανα που εδράζονται σε αυτόν, καθορίζουν τις τελικές αποφάσεις ωοτοκίας. Η παρουσία σακχάρων, κυρίως γλυκόζης και 12

27 φρουκτόζης, η οξύτητα της σάρκας, η παρουσία τοξικών ουσιών όπως τα αιθέρια έλαια και η υγρασία στο εσωτερικό των καρπών είναι τα κυριότερα χαρακτηριστικά με βάση τα οποία τα θηλυκά της οικογένειας Tephritidae επιλέγουν εάν θα αποθέσουν τα αυγά στους (Schoonhoven, 1983). Σε ότι αφορά τη μύγα της Μεσογείου, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τόσο η πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων όσο και η ποσότητα των αιθέριων ελαίων στο φλοιό των εσπεριδοειδών επιδρούν αρνητικά κατά την απόθεση των αυγών (Papachristos & Papadopoulos, 2009). Από την άλλη μεριά, η υψηλή σχετική υγρασία στο εσωτερικό των καρπών φαίνεται να ευνοεί σημαντικά την ωοπαραγωγή του εντόμου (Levinson et al., 2003). Τα θηλυκά πιθανότατα επιλέγουν για ωοτοκία θέσεις με υψηλή υγρασία γιατί έτσι προστατεύονται τα αυγά τους από αφυδάτωση και διασφαλίζεται υψηλή εκκολαψιμότητα των προνυμφών. Η άποψη αυτή ισχυροποιείται από το γεγονός ότι τα αυγά της μύγας της Μεσογείου είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε συνθήκες χαμηλής σχετικής υγρασίας ακόμη και κατά την παραμονή τους για σχετικά μικρό χρονικό διάστημα (Shoukry & Hafez, 1979). Τέλος, χημικές ουσίες και κυρίως αλκοόλες που εκλύονται κατά τις ζυμώσεις των σακχάρων σε υπερώριμους καρπούς φαίνεται να δρουν αποτρεπτικά στην ωοτοκία των θηλυκών (Vita et al., 1986). 1.7 Συμπεριφορά προνυμφών της μύγας της Μεσογείου Αμέσως μετά την εκκόλαψη, οι νεαρές προνύμφες της μύγας της Μεσογείου αρχίζουν να κατευθύνονται από το φλοιό προς το χυμώδες ενδοκάρπιο. Η διαδρομή αυτή μπορεί να συνοδεύεται από ποικίλα επίπεδα θνησιμότητας ως αποτέλεσμα της συνδυασμένης δράσης αμυντικών μηχανισμών των ξενιστών και φυσικών εχθρών (κυρίως παρασιτοειδών) (Yuval & Hendrichs, 2000). Από τη στιγμή που θα καταφέρουν να απομακρυνθούν από τους κινδύνους που ελλοχεύουν στα επιφανειακά στρώματα των καρπών, οι προνύμφες θα πρέπει απλά να αξιοποιήσουν τα τροφικά αποθέματα του ξενιστή και να αποφύγουν άρπαγες και παρασιτοειδή προκειμένου να ολοκληρώσουν με επιτυχία την ανάπτυξή τους και να νυμφωθούν. Μια σειρά από μελέτες δείχνουν ότι οι προνύμφες της μύγας της Μεσογείου είναι ικανές να προσαρμόζουν τη συμπεριφορά τους ώστε να βελτιστοποιούν την πρόσληψη τροφής. Συγκεκριμένα, σε τεχνητές δίαιτες που εξετάστηκαν στο εργαστήριο διαπιστώθηκε ότι οι προνύμφες πάντοτε προτιμούσαν εκείνες με τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη (Zucoloto, 1987). Μάλιστα στα πειράματα αυτά, προέκυψε ότι οι προνύμφες ήταν ικανές να αντιλαμβάνονται διαφορές της 13

28 τάξης των gr πρωτεΐνης ανά 100 ml δίαιτας. Επιπλέον, όταν οι προνύμφες αναπτύσσονται σε χαμηλής ποιότητας δίαιτες, έχουν την τάση να μετακινούνται προς πιο θρεπτικά υποστρώματα εφόσον έχουν τη δυνατότητα (Zucoloto, 1991). Αντίστοιχα, οι Fernades Da Silva & Zucoloto (1993) κατάφεραν να επαληθεύσουν τα παραπάνω αποτελέσματα χρησιμοποιώντας τμήματα από καρπούς ξενιστές του εντόμου που επίσης διέφεραν ως προς τη θρεπτική τους αξία. Τέλος, μια σειρά πειραμάτων έδειξε ότι η προτίμηση του υποστρώματος ανάπτυξης των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου μπορεί να μεταβάλλεται ως αποτέλεσμα της προηγούμενης εμπειρίας τους (μάθηση) αλλά και παραγόντων που οφείλονται σε γενετικά αίτια (Canato & Zucoloto, 1993). Από τη στιγμή της εκκόλαψης και μετά οι προνύμφες αποτελούν εν δυνάμει ξενιστές για μια σειρά εξειδικευμένων παρασιτοειδών. Ο εντοπισμός των προνυμφών από τα παρασιτοειδή γίνεται με βάση τις δονήσεις που παράγονται από τις δραστηριότητές τους (Lawrence, 1981), ενώ ορισμένα είδη του γένους Aganaspis εισέρχονται από προϋπάρχουσες οπές στο εσωτερικό των καρπών (Ovruski, 1994). Οι συμπεριφορές των προνυμφών που ενδεχομένως συνδέονται με την αποφυγή των παρασιτοειδών παραμένουν ως επί το πλείστο άγνωστες εξαιτίας των δυσκολιών που προκύπτουν ως προς τη μελέτη τους στο εσωτερικό των καρπών. Ωστόσο, σύμφωνα με το Bateman (1972), η αρνητική φωτόταξη των προνυμφών των Tephritidae σε συνδυασμό με αντίστοιχες ανταποκρίσεις ως προς τις διαβαθμίσεις της θερμοκρασίας μεταξύ περιβάλλοντος και ξενιστών που έχουν ως συνέπεια την παραμονή τους στο εσωτερικό των καρπών ενδεχομένως να παρέχουν ένα πρώτο μέτρο προστασίας έναντι των παρασιτοειδών. Καθώς οι προνύμφες αναπτύσσονται και οι μεταβολικές τους ανάγκες σε οξυγόνο αυξάνονται, μετακινούνται προς το φλοιό των ξενιστών όπου ανοίγουν μικρές οπές προκειμένου να διευκολύνουν την είσοδο του αέρα. Μόλις ολοκληρώσουν την ανάπτυξη, διευρύνουν τις οπές και πηδούν στο έδαφος για να νυμφωθούν. Κατά το στάδιο αυτό οι προνύμφες είναι ιδιαίτερα ευάλωτες σε μια ποικιλία γενικών αρπάγων όπως μυρμήγκια και κολεόπτερα εδάφους καθώς επίσης και σε παρασιτοειδή (Yuval & Hendrichs, 2000). Κατά την διασπορά τους για νύμφωση οι προνύμφες έχουν την τάση να συστέλλουν το σώμα τους και να εκτινάσσονται. Η συμπεριφορά αυτή που πιθανότατα συνδέεται με την αποφυγή των φυσικών εχθρών έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ταχύτητας των προνυμφών σε σχέση με τη έρπυση κατά διακόσες φορές (Maitland, 1992). Πέρα από την προσαρμογή αυτή, η επιλογή κατάλληλου χρόνου εξόδου των προνυμφών από τους καρπούς μπορεί επίσης να συμβάλλει σημαντικά στην αποφυγή των αρπάγων. Η έξοδος των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου από 14

29 τους ξενιστές εκδηλώνεται στα πλαίσια συγκεκριμένου ημερήσιου ρυθμού καθώς επικεντρώνεται σε ένα στενό χρονικό πλαίσιο λίγο πριν την αυγή (Myburgh, 1963). Η προσαρμοστικότητα της συμπεριφοράς αυτής γίνεται πιο σαφής όταν εξετάζεται συγχρόνως και με τη δραστηριότητα αρπάγων. Για παράδειγμα, οι Eskafi & Kolbe (1990) παρατήρησαν ότι η αρπακτικότητα από μυρμήγκια του είδους Solenopsis geminata (Hymenoptera: Formicidae) σε προνύμφες του εντόμου στο ύπαιθρο κυμαίνονταν από 7 έως 25%. Παρά το γεγονός ότι η εποχικότητα δεν είχε καμία επίδραση στην αρπακτικότητα, η ώρα της ημέρας έπαιζε καθοριστικό ρόλο καθώς το μέγιστο των απωλειών συνέπιπτε με την έναρξη της δραστηριότητας του συγκεκριμένου άρπαγα. Συνεπώς, προνύμφες που δραστηριοποιούνταν νωρίτερα αύξαναν σημαντικά τις πιθανότητες επιβίωσής τους. Το βάθος νύμφωσης των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου κυμαίνεται από 0 έως 5 cm με το πλείστο των περιπτώσεων (54%) να λαμβάνει χώρα στο εύρος μεταξύ 0.55 και 1.1 cm (Jackson et al., 1998; Yuval & Hendrichs, 2000 από Cavalloro & Delrio, 1975). Η δομή και η περιεκτικότητα σε υγρασία του εδάφους παίζουν σημαντικό ρόλο ως προς την παράμετρο αυτή. Ειδικότερα, σε ξηρά εδάφη οι προνύμφες έχουν την τάση να εισέρχονται σε μεγαλύτερα βάθη σε σχέση με υγρά. Γενικώς, τα βάθη νύμφωσης δε φαίνεται να επαρκούν στο πλείστο των περιπτώσεων για την πλήρη προστασία των νυμφών του εντόμου από οριακές χαμηλές ή υψηλές θερμοκρασίας και παρασιτοειδή, με συνέπεια να παρατηρούνται ποικίλα επίπεδα θνησιμότητας αναλόγα με τις επικρατούσες συνθήκες (Jackson et al., 1998). Οι νύμφες της μύγας της Μεσογείου είναι καλύτερα προσαρμοσμένες σε ξηροθερμικές συνθήκες σε σχέση με άλλα είδη του γένους όπως τα C. catoirii και C. rosa αλλά ιδιαίτερα ευαίσθητες σε εδάφη κορεσμένα με νερό, γεγονός που μπορεί να οδηγεί στην προτίμηση ενδιαιτημάτων με τις καταλληλότερες κλιματολογικές συνθήκες για την επιβίωσή τους (Duyck et al., 2006). 1.8 Σκοπός της παρούσας διατριβής Από το σύνολο των ξενιστών που προσβάλλει η μύγα της Μεσογείου, τα εσπεριδοειδή φαίνεται να διαδραματίζουν εξαιρετικά σημαντικό ρόλο στη γενικότερη βιολογία του εντόμου. Συγκεκριμένα, παρατηρήσεις στο ύπαιθρο έδειξαν ότι σε μικτούς οπωρώνες το πλείστο των συζεύξεων στη μύγα της Μεσογείου λαμβάνει χώρα σε εσπεριδοειδή (κυρίως πορτοκαλιές) ακόμη και στις περιπτώσεις που η παρουσία τους σε σχέση με άλλους ξενιστές του εντόμου είναι περιορισμένη (Hendrichs & Hendrichs, 1990; Hendrichs et al., 1991). Σε 15

30 πειράματα με κλουβιά υπαίθρου οι Katsoyannos και συνεργάτες (1997) διαπίστωσαν ισχυρή προσέλκυση και των δύο φύλων σε οσμές προερχόμενες από τη σάρκα καρπών εσπεριδοειδών και αποκλειστικά αρσενικών σε οσμές από τα αιθέρια έλαια του φλοιού τους. Εργαστηριακά πειράματα έδειξαν ότι οσμηρά ερεθίσματα του χυμού πορτοκαλιών διεγείρουν σημαντικά την ωοπαραγωγή των θηλυκών του είδους (Ιωάννου, 2005), ενώ η έκθεση των αρσενικών σε αιθέρια έλαια του φλοιού από διάφορα είδη και ποικιλίες εσπεριδοειδών αυξάνει σημαντικά την επιτυχία της σύζευξης καθώς επίσης και τη συχνότητα του σεξουαλικού τους καλέσματος (Papadopoulos et al., 2001, 2006; Shelly, 2009; Kouloussis et al., 2013). Σημαντικός είναι επίσης ο ρόλος των εσπεριδοειδών και στη βιολογία του εντόμου κατά τη διάρκεια του χειμώνα, καθώς οι καρποί τους παραμένουν στα δέντρα καθ όλη τη διάρκεια της ψυχρής περιόδου. Σε περιοχές όπου οι χειμερινές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν την επιβίωση των ενηλίκων, η μύγα της Μεσογείου είθισται να διαχειμάζει ως προνύμφη εντός των καρπών των εσπεριδοειδών (Katsoyannos et al., 1998), ενώ σε νοτιότερες περιοχές της Μεσογείου όπως η Κρήτη όπου τα ενήλικα παραμένουν δραστήρια καθ όλη τη διάρκεια του έτους, κατά τους ψυχρούς μήνες η συγκεκριμένη κατηγορία ξενιστών αποτελεί τη μοναδική επιλογή για τη συνέχιση της αναπαραγωγής του είδους (Mavrikakis et al., 2000). Παρά τη σπουδαιότητά τους ως προς τη βιολογία της μύγας της Μεσογείου, τα εσπεριδοειδή γενικώς δε θεωρούνται ιδιαίτερα ευνοϊκοί ξενιστές, καθώς εκδηλώνουν διάφορα επίπεδα ανθεκτικότητας στις προσβολές του εντόμου που ανάλογα με το είδος και την ποικιλία των καρπών μπορεί να κυμαίνονται από μέτρια έως εξαιρετικά υψηλά (Back & Pemberton, 1915; Spitler et al., 1984; Aluja & Mangan, 2008). Φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά του φλοιού των καρπών φαίνεται να αποτελούν τα κύρια συστατικά στοιχεία του αμυντικού τους μηχανισμού έναντι της μύγας της Μεσογείου και άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae (Greany, 1989). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα αιθέρια έλαια του φλοιού συνιστούν ένα ιδιαίτερα κρίσιμο παράγοντα της ανθεκτικότητας, καθώς η έκθεση των νεαρών προνυμφών ως προς αυτά, επιφέρει καθολική θνησιμότητα στο πλείστο των περιπτώσεων (Papachristos et al., 2008). Επιπλέον, ποσοτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά της χημικής τους σύστασης, μπορούν να επηρεάζουν σημαντικά την αποτελεσματικότητά τους ως αμυντικού μηχανισμού έναντι των προσβολών της μύγας της Μεσογείου (Papachristos et al., 2009). Ωστόσο, φαίνεται ότι τα θηλυκά του εντόμου έχουν υιοθετήσει ορισμένες συμπεριφορές που τους επιτρέπουν να παρακάμπτουν τη συγκεκριμένη μορφή άμυνας των καρπών. Συγκεκριμένα, η διαπίστωση ότι τα θηλυκά προσελκύονται έντονα σε 16

31 καρπούς πορτοκαλιών που φέρουν βαθιά τραύματα έως τη σάρκα και της τάσης να αποθέτουν τα αυγά τους μέσα ή πολύ κοντά σε αυτά, χαρακτηρίστηκε από τους Papaj και συνεργάτες (1989γ) ως μια μορφή προσαρμογής που συντελεί την αποφυγή της τοξικής δράσης των αιθέριων ελαίων του φλοιού. Με βάση τα παραπάνω, γίνεται αντιληπτό ότι τα θηλυκά κατά την επαφή τους με τους καρπούς των εσπεριδοειδών έρχονται αντιμέτωπα με μια κατηγορία ξενιστών που μπορεί να διαφέρουν ως προς την καταλληλότητά τους για την επιβίωση των απογόνων ως συνέπεια των αμυντικών τους μηχανισμών. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο εάν και κατά πόσο οι αποφάσεις ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου είναι προσαρμοσμένες προς αυτή την κατεύθυνση. Επιπλέον, οι συμπεριφορές που συνδέονται με την προσέλκυση και αποδοχή των καρπών των εσπεριδοειδών καθώς επίσης και η επίδραση της παρουσίας τραυμάτων στις συγκεκριμένες παραμέτρους παραμένουν ως επί το πλείστο άγνωστες. Για το λόγο αυτό σε ένα πρώτο Κεφάλαιο μελετήθηκε η προτίμηση ωοτοκίας των θηλυκών σε διαφορετικά είδη καρπών εσπεριδοειδών (πορτοκάλι, μανταρίνι, λεμόνι, νεράντζι και γκρέιπφρουτ) καθώς επίσης και η αντίστοιχη επιβίωση των απογόνων τους. Επιπλέον, μελετήθηκαν πτυχές της συμπεριφοράς των θηλυκών που είχαν να κάνουν με την προσέλκυση και αποδοχή για ωοτοκία των συγκεκριμένων καρπών καθώς επίσης και της επίδρασης της παρουσίας τραυμάτων στις παραμέτρους αυτές. Παρά τη μεγάλη ποικιλία ξενιστών που προσβάλλει η μύγα της Μεσογείου, τα θηλυκά είναι ιδιαίτερα ικανά στο να αντιλαμβάνονται τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά χαρακτηριστικά της χημικής σύστασης των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών (Light et al., 1988; Levinson et al., 1990; Hernandez et al., 1996). Παρόλα ταύτα, τόσο ο βαθμός όσο και ο τρόπος με τον οποίο τα οσμηρά ερεθίσματα του φλοιού των εσπεριδοειδών καθορίζουν τις αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Με δεδομένη τη σημασία των αιθέριων ελαίων του φλοιού των εσπεριδοειδών ως αμυντικού μηχανισμού έναντι των προσβολών της μύγας της Μεσογείου και την αντίστοιχη ικανότητα των θηλυκών να αντιλαμβάνονται ποσοτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά της σύστασής τους, σε ένα δεύτερο Κεφάλαιο μελετήθηκε η επίδραση των αιθέριων ελαίων από διαφορετικούς καρπούς εσπεριδοειδών (πορτοκάλι, μανταρίνι, λεμόνι, νεράντζι και γκρέιπφρουτ) καθώς επίσης και ορισμένων συστατικών τους στην ωοτοκία του εντόμου. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, οι προνύμφες της μύγας της Μεσογείου επιδεικνύουν αξιοσημείωτη ικανότητα στο να διακρίνουν μεταξύ υποστρωμάτων ανάπτυξης που χαρακτηρίζονται από διαφορετική δομή και 17

32 χημική σύσταση. Ωστόσο οι μηχανισμοί (απτικοί, οσφρητικοί) που σχετίζονται με τη δυνατότητα αυτή, καθώς επίσης και οι απώτερες συνέπειές τους στη βιολογία του εντόμου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Για το λόγο, αυτό σε ένα τρίτο Κεφάλαιο εξετάστηκε η ικανότητα των προνυμφών να αντιλαμβάνονται οσφρητικά ερεθίσματα του περιβάλλοντός τους. Καθώς τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τη συγκεκριμένη υπόθεση, οι μελέτες στη συνέχεια επικεντρώθηκαν στη διερεύνηση ορισμένων συμπεριφορών που συνδέονται με την οσφρητική ικανότητα των προνυμφών όπως συμβαίνει σε αντίστοιχες περιπτώσεις άλλων εντόμων. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η δυνατότητα των προνυμφών να συνδέουν την παρουσία ανταποδοτικών ερεθισμάτων (τροφή) με την παρουσία συγκεκριμένων οσμών, ένα φαινόμενο που αναφέρεται από πολλούς ερευνητές ως συνειρμική μάθηση (associative learning) (Papaj & Prokopy, 1989; Dukas, 1999) καθώς επίσης και η δυνατότητα μεταφοράς της συγκεκριμένης μορφής μάθησης από το προνυμφικό στάδιο στο ενήλικο. Τέλος, με δεδομένο ότι το χημικό περιβάλλον στο οποίο αναπτύσσονται τα ανήλικα στάδια ολομετάβολων εντόμων μπορεί να επηρεάζει τις αποφάσεις ωοτοκίας των ενηλίκων που προκύπτουν (Anderson et al., 2013 και πηγές που αναφέρει), σε ένα τελευταίο Κεφάλαιο διερευνήθηκε το αντίστοιχο φαινόμενο στη μύγα της Μεσογείου. Για το σκοπό αυτό, προνύμφες εκτέθηκαν σε μια σειρά οσμηρών ερεθισμάτων και εν συνεχεία εξετάστηκε η συμπεριφορά ωοτοκίας των θηλυκών που προέκυψαν ως προς αυτά. 18

33 Βιβλιογραφία Adán, A., Estal, P.D., Budia, F. et al. (1996) Laboratory evaluation of the novel naturally derived compound spinosad against Ceratitis capitata. Pesticide Science, 48, Aluja, M. & Mangan, R.L. (2008) Fruit fly (Diptera: Tephritidae) host status determination: critical conceptual, methodological, and regulatory considerations. Annual Review of Entomology, 53, Anderson, P., Sadek, M.M., Larsson, M. et al. (2013) Larval host plant experience modulates both mate finding and oviposition choice in a moth. Animal Behaviour, 85, Averill, A.L. & Prokopy, R.J. (1989) Host marking pheromones. Fruit Flies: Their Biology, Natural Enemies and Control. World Crop Pests (ed. by A. S. Robinson and G. Hooper), Vol 3A, pp Elsevier, The Netherlands. Back, E.A., & Pemberton, C.E. (1918) The Mediterranean fruit fly in Hawaii (No. 536). US Department of Agriculture. Bateman, M.A. (1972) The ecology of fruit flies. Annual Review of Entomology, 17, Bautista, R.C., Mochizuki, N., Spencer, J.P. et al. (1999) Mass-Rearing of the Tephritid Fruit Fly Parasitoid Fopius arisanus (Hymenoptera: Braconidae). Biological Control, 15, Canato, C.M. & Zucoloto, F.S. (1993) Diet selection by Ceratitis capitata larvae (Diptera, Tephritidae): Influence of the rearing diet and genetic factors. Journal of Insect Physiology, 39, Carey. J.R. (1984) Host-specific demographic studies of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Ecological Entomology, 9, Casana-Giner, V., Gandia-Balaguer, A., Mengod-Puerta, C. et al. (1999) Insect growth regulators as chemosterilants for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology, 92, Christenson, L.D. & Foote, R.H. (1960) Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology, 5, Cooley, S.S., Prokopy, R.J., McDonald, P.T. (1986) Learning in oviposition site selection by Ceratitis capitata flies. Entomologia Experimentalis et Applicata, 40, De Meyer, M. (2000) Phylogeny of the genus Ceratitis (Dacine: Ceratitidini) Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior (ed. by M. Aluja and A.L. Norrbom), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. 19

34 Díaz-Fleischer, F., Papaj, D.R., Prokopy, R.J. et al. (2000) Evolution of fruit fly oviposition behavior. Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior (ed. by M. Aluja and A.L. Norrbom), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. Dukas, R. (1999) Ecological relevance of associative learning in fruit fly larvae. Behavioral Ecology and Sociobiology, 45, Duyck, P.F., David, P. & Quilici, S. (2006) Climatic niche partitioning following successive invasions by fruit flies in La Réunion. Journal of Animal Ecology, 75, Dyck, V.A., Hendrichs, J. & Rodinson, A.S. (2005) Sterile Insect Techiques: Principles and Practice in Area-Wide Integrated Pest Management. Springer, Dordrecht, The Netherlands. Eberhard, W.G. (2000) Sexual behavior and sexual selection in the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Ceratitidini). Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior (ed. by M. Aluja and A.L. Norrbom), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. Eskafi, F.M. & Kolbe, M.M. (1990) Predation on larval and pupal Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) by the ant Solenopsis geminata (Hymenoptera: Formicidae) and other predators in Guatemala. Environmental Entomology, 19, Fernandes Da Silva, P.G. & Zucoloto, F.S. (1993) The influence of host nutritive value on the performance and food selection of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Journal of Insect Physiology, 39, Féron, M. (1962) L instinct de réproduction chez la mouche méditerranéenne des fruits Ceratitis capitata. Comportement sexuel. Comportement de ponte. Revue de Pathologie Végétale et d Entomologie Agricole de France, 41, Fimiani, P. (1989) Mediterranean region. Fruit Flies: Their Biology, Natural Enemies and Control (ed. by A. S. Robinson and G. Hooper), Vol 3A, pp Elsevier, The Netherlands. Fletcher, B.S. & Prokopy, R.J. (1991) Host location and oviposition in tephritid fruit flies. Reproductive Behavior of Insects. Individuals and Populations (ed. by W. J. Baily and J. Ridsdill-Smith), pp Chapman & Hall, London. Freeman, R. & Carey, J.R. (1990) Interaction of host stimuli in the ovipositional response of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Environmental Entomology, 19,

35 Gonzalez, J. & Troncoso, P. (2007) The fruit fly exclusion programme in Chile. Area-Wide Control of Insect Pests. From Researchto Field Implimentation (ed. by M.J.B Vreysen, A.S. Rhobinson and J. Hendrichs), pp Springer, The Netherlands. Greany, P.D. (1989) Host plant resistance to tephritids: an under-exploited control strategy. Fruit flies: Their Biology, Natural Enemies and Control, Vol. 3A (ed. by A.S. Robinson and G. Hooper), pp Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. Guillen, D. & Sanchez, R. (2007) Expansion of the national fruit fly control programme in Argentina. Area-Wide Control of Insect Pests. From Research to Field Implementation (ed. by M.J.B Vreysen, A.S. Rhobinson and J. Hendrichs), pp Springer, The Netherlands. Hagen, K.S., Allen, W.W. & Tassan, R.L. (1981) Mediterranean fruit fly: the worst may be yet to come. California Agriculture, 35, 5-7. Hanna, A.D. (1938) Studies on the Mediterranean fruit-fly: Ceratitis capitata Wied. I. The structure and operation of the reproductive organs. Bulletin of the Entomological Society of Egypt, 22, Hendrichs, J. & Hendrichs, M.A. (1990) Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in nature: location and diel pattern of feeding and other activities on fruiting and nonfruiting hosts and nonhosts. Annals of the Entomological Society of America, 83, Hendrichs, J. & Prokopy, R.J. (1994) Food foraging behavior of frugivorous fruit flies. Fruit Flies and the Sterile Insect Technique (ed. by C.O Calkins, W. Klassen and P. Liedo), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. Hendrichs, J., Katsoyannos, B.I., Papaj, D.R. & Prokopy, R.J. (1991) Sex differences in movement between natural feeding and mating sites and tradeoffs between food consumption, mating success and predator evasion in Mediterranean fruit flies (Diptera: Tephritidae). Oecologia, 86, Hendrichs, J., Katsoyannos, B.I., Gaggl, K. & Wornoayporn, V. (1996) Competitive behavior of males of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, genetic sexing strain Vienna-42. Fruit Fly Pests: A World Assessment of Their Biology and Management (ed. by B. A McPheron and G. J. Steck), pp St. Lucie Press, Delray Beach, Florida, Hernandez, M.M., Sanz, I., Adelantado, M., et al. (1996) Electroantennogram activity from antennae of Ceratitis capitata (Wied.) to fresh orange airborne volatiles. Journal of Chemical Ecology, 22,

36 Ιωάννου, Χ.Σ. (2005) Επίδραση πτητικών ουσιών από καρπούς πορτοκαλιών στην ωοτοκία και άλλες βιολογικές παραμέτρους της μύγας της Μεσογείου Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Μεταπτυχιακή διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Θεσσαλονίκη. Jackson, C.G., Long, J.P. & Klungness, L.M. (1998) Depth of pupation in four species of fruit flies (Diptera: Tephritidae) in sand with and without moisture. Journal of Economic Entomology, 91, Jang, E.B. (1995) Effect of mating and accessory gland injections on olfactory mediated behaviour in the female Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Journal of Insect Physiology, 41, Katsoyannos, B.I. (1989) Response to shape, size and color. Fruit Flies: Their Biology, Natural Enemies and Control. World Crop Pests (ed. by A. S. Robinson and G. Hooper), Vol 3A, pp Elsevier, The Netherlands. Katsoyannos, B.I., Panagiotidou, K. & Kechagia, I. (1986) Effect of color properties on the selection of oviposition site by Ceratitis capitata. Entomologia Experimentalis et Applicata, 42, Katsoyannos, B.I., Kouloussis, N.A. & Papadopoulos, N.T. (1997) Response of Ceratitis capitata to citrus chemicals under semi-natural conditions. Entomologia Experimentalis et Applicata, 82, Katsoyannos, B.I., Kouloussis N.A. & Carey, J.R. (1998) Seasonal and annual occurrence of Mediterranean fruit flies (Diptera: Tephritidae) on Chios island, Greece: Differences between two neighboring citrus orchards. Annals of the Entomological Society of America, 91, Katsoyannos, B.I., Heath, R.R., Papadopoulos, N.T. et al. (1999α) Field evaluation of Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) female selective attractants for use in monitoring programs. Journal of Economic Entomology, 92, Katsoyannos, B.I., Papadopoulos, N.T., Heath, R.R. et al. (1999β) Evaluation of synthetic food-based attractants for female Mediterranean fruit flies (Diptera: Tephritidae) in McPhail type traps. Journal of Applied Entomology, 123, Kouloussis, N.A., Katsoyannos, B.I., Papadopoulos, N.T. et al. (2013) Enhanced mating competitiveness of Ceratitis capitata males following exposure to citrus compounds. Journal of Applied Entomology, 137, Kourti, A. (2002) Estimates of heterozygosity and patterns of geographic differentiation in natural populations of the medfly (Ceratitis capitata). Hereditas, 137,

37 Kourti, A., Loukas, M. & Sourdis, J. (1992) Dispersion pattern of the medfly from its geographic centre of origin and genetic relationships of the medfly with two close relatives. Entomologia Experimentalis et Applicata, 63, Krainacker, D.A, Carey, J.R. & Vargas, R.I. (1987) Effect of larval host on life history traits of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Oecologia, 73, Lawrence, P.O. (1981) Host vibration-a cue to host location by the parasite, Biosteres longicaudatus. Oecologia, 48, Levinson, H.Z., Levinson, A.R. & Muller, K. (1990) Influence of some olfactory and optical properties of fruits on host location by the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata Wied). Journal of Applied Entomology, 109, Levinson, H., Levinson, A. & Eosterried, E. (2003) Orange-derived stimuli regulating oviposition in the Mediterranean fruit fly. Journal of Applied Entomology, 127, Light, D.M., Jang, E.B. & Dickens, J.C. (1988) Electroantennogram responses of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, to a spectrum of plant volatiles. Journal of Chemical Ecology, 14, Liquido, N.J., Shinoda, L.A. & Cunningham, R.T. (1991) Host plants of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae): an annotated world review. Miscellaneous Publications, Entomological Society of. America, 77, Maitland, D.P. (1992) Locomotion by jumping in the Mediterranean fruit-fly larva Ceratitis capitata. Nature, 355, Malacrida, A.R., Marinoni, F., Torti, C., et al. (1998) Genetic aspects of the worldwide colonization process of Ceratitis capitata. Journal of Heredity, 89, Mau, R.F.L., Jang, E.B. & Vargas, R.I. (2007) The Hawaii area-wide fruit fly pest management programme. Area-Wide Control of Insect Pests. From Research to Field Implementation (ed. by M.J.B Vreysen, A.S. Rhobinson and J. Hendrichs), pp Springer, The Netherlands. Mavrikakis, P.G., Economopoulos, A.P. & Carey, J.R. (2000) Continuous winter reproduction and growth of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in Heraklion, Crete, Southern Greece. Environmental Entomology, 29, McDonald, P.T. & McInnis, D.O. (1985) Ceratitis capitata: effect of host fruit size on the number of eggs per clutch. Entomologia Experimentalis et Applicata, 37,

38 McQuate, G.T., Sylva, C.D., & Jang, E.B. (2005) Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) suppression in persimmon through bait sprays in adjacent coffee plantings. Journal of Applied Entomology, 129, Mitchell, A.C., & Saul, S.H. (1990) Current control methods for the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, and their application in the USA. Review of Agricultural Entomology, 78, Myburgh, A.C. (1963) Diurnal rhythms in emergence of mature larvae from fruit and eclosion of adult Pterandrus rosa (Ksh.) and Ceratitis capitata (Wied.). South African Journal of Agricultural Sciences, 6, Navarro-Llopis, V., Sanchis, J., Primo-Millo, J. & Primo-Yufera, E. (2007) Chemosterilants as control agents of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) in field trials. Bulletin of Entomological Research, 97, Ovruski, S.M. (1994) Comportamiento en la deteccion del huesped de Aganaspis pelleranoi (Hymenoptera: Eucoilidae), parasitoide de larvas de Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Revista de la Sociedad Entomológica Argentina, 53, Papachristos, D.P., Papadopoulos, N.T. & Nanos, G.D. (2008) Survival and development of immature stages of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in citrus fruit. Journal of Economic Entomology, 101, Papachristos, D.P., Kimbaris, A.C., Papadopoulos, N.T. & Polissiou, M.G. (2009) Toxicity of citrus essential oils against Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) larvae. Annals of Applied Biology, 155, Παπαδόπουλος, Ν.Θ. (1999) Μελέτη της Βιολογίας και Οικολογίας της Μύγας της Μεσογείου Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) στη Βόρεια Ελλάδα. Διδακτορική Διατριβή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Θεσσαλονίκη Papadopoulos, N.T. (2004) Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata (Wiedemann), (Diptera: Tephritidae). Encyclopedia of Entomology (ed. by J. L. Capinera), Vol 2, pp Kluwer Academic Press, The Netherlands. Papadopoulos, N.T. & Katsoyannos, B.I. (2003). Field parasitism of Ceratitis capitata larvae by Aganaspis daci in Chios, Greece. BioControl,48, Papadopoulos, N.T., Carey, J.R., Katsoyannos, B.I. & Kouloussis, N.A. (1996) Overwintering of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in northern Greece. Annals of the Entomological Society of America, 89, Papadopoulos, N.T., Katsoyannos, B.I., Kouloussis, N.A. & Hendrichs, J. (2001) Effect of orange peel substances on mating competitiveness of male Ceratitis capitata. Entomologia Experimentalis et Αpplicata, 99,

39 Papadopoulos, N.T., Shelly, T.E., Niyazi, N. & Jang, E. (2006) Olfactory and behavioral mechanisms underlying enhanced mating competitiveness following exposure to ginger root oil and orange oil in males of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Journal of Insect Behavior, 19, Papadopoulos, N.T., Plant, R.E., & Carey, J.R. (2013). From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 280, doi: /rspb Papaj, D.R. (1990) Fruit size and clutch size in wild Ceratitis capitata. Entomologia Experimentalis et Applicata, 54, Papaj, D.R. & Prokopy, R.J. (1989) Ecological and evolutionary aspects of learning in phytophagous insects. Annual Review of Entomology, 34, Papaj, D.R., Roitberg, B.D. & Opp, S. B. (1989α) Serial effects of host infestation on egg allocation by the Mediterranean fruit fly: a rule of thumb and its functional significance. Journal of Animal Ecology, 58, Papaj, D.R., Opp, S.B., Prokopy, R.J. & Wong, T.T. (1989β) Cross-induction of fruit acceptance by the medfly Ceratitis capitata: The role of fruit size and chemistry. Journal of Insect Behavior, 2, Papaj, D.R., Katsoyannos, B.I. & Hendrichs, J. (1989γ) Use of fruit wounds in oviposition by Mediterranean fruit flies. Entomologia Experimentalis et Applicata, 53, Papaj, D.R., Roitberg, B.D., Opp, S.B. et al. (1990) Effect of marking pheromone on clutch size in the Mediterranean fruit fly. Physiological Entomology, 15, Prokopy, R.J. & Hendrichs, J. (1979) Mating behavior of Ceratitis capitata on a field-caged host tree. Annals of the Entomological Society of America, 72, Prokopy, R.J. & Roitberg, B.D. (1984) Foraging behavior of true fruit flies. American Scientist, 72, Prokopy, R.J. & Roitberg, B.D. (1989) Fruit fly foraging behavior. Fruit Flies: Their Biology, Natural Enemies and Control. World Crop Pests (ed. by A. S. Robinson and G. Hooper), Vol 3A, pp Elsevier, The Netherlands. Prokopy, R.J. & Vargas, R.I. (1996) Attraction of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) flies to odor of coffee fruit. Journal of Chemical Ecology, 22,

40 Prokopy, R.J., Ziegler, J.R. & Wong, T.T. (1978) Deterrence of repeated oviposition by fruit-marking pheromone in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Journal of Chemical Ecology, 4, Prokopy, R.J., McDonald, P.T. & Wong, T.T. (1984) Inter-population variation among Ceratitis capitata flies in host acceptance pattern. Entomologia Experimentalis et Applicata, 35, Prokopy, R.J., Green, T.A. & Wong, T.T. (1989) Learning to find fruit in Ceratitis capitata flies. Entomologia Experimentalis et Applicata, 53, Prokopy, R.J., Roitberg, B.D., & Vargas, R.I. (1994) Effects of egg load on finding and acceptance of host fruit in Ceratitis capitata flies. Physiological Entomology, 19, Prokopy, R.J., Hu, X., Jang, E.B. et al. (1998) Attraction of mature Ceratitis capitata females to 2-heptanone, a component of coffee fruit odor. Journal of Chemical Ecology, 24, Quesada-Moraga, E., Ruiz-García, A. & Santiago-Alvarez, C. (2006) Laboratory evaluation of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae against puparia and adults of Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology, 99, Quesada-Moraga, E., Martin-Carballo, I., Garrido-Jurado, I. & Santiago-Alvarez, C. (2008) Horizontal transmission of Metarhizium anisopliae among laboratory populations of Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Biological Control, 47, Radonjić, S., Čizmović, M. & Pereira, R. (2013) Population Dynamics of the Mediterranean Fruit Fly in Montenegro. International Journal of Insect Science, 5, Reyes, J., Carro, X., Hernadez, J. et al. (2007) A multi-institutional approach to create fruit fly-low and fly-free areas in Central America. Area-Wide Control of Insect Pests. From Research to Field Implementation (ed. by M.J.B Vreysen, A.S. Rhobinson and J. Hendrichs), pp Springer, The Netherlands. Rousse, P., Gourdon, F. & Quilici, S. (2006) Host specificity of the egg pupal parasitoid Fopius arisanus (Hymenoptera: Braconidae) in La Reunion. Biological Control, 37, Schoonhoven, L.M. (1983) The role of chemoreception in hostplant finding and oviposition in phytophagous Diptera. Fruit Flies of Economic Importance (ed. by R. Cavalloro), pp A.A. Balkema, Rotterdam. Schwarz, A.J., Zambada, A., Orozco, D.H.S. et al. (1981) Mass production of the Mediterranean fruit fly at Metapa, Mexico. Florida Entomologist, 68,

41 Shelly, T.E. (2009) Exposure to grapefruits and grapefruit oil increases male mating success in the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Proceedings of the Hawaiian Entomological Society, 41, Shelly, T.E. & Whittier, T.S. (1996) Mating competitiveness of sterile male Mediterranean fruit flies (Diptera: Tephritidae) in male-only releases. Annals of the Entomological Society of America, 89, Shelly, T.E., Whittier, T.S. & Kaneshiro, K.Y. (1994) Sterile insect release and the natural mating system of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Annals of the Entomological Society of America, 87, Shoukry, A. & Hafez, M. (1979) Studies on the biology of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Entomologia Εxperimentalis et Αpplicata, 26, Spitler, G.H., Armstrong, J.W. & Couey, H.M. (1984) Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) host status of commercial lemon. Journal of Economic Entomology, 77, Stark, J.D., Vargas, R., & Miller, N. (2004) Toxicity of spinosad in protein bait to three economically important tephritid fruit fly species (Diptera: Tephritidae) and their parasitoids (Hymenoptera: Braconidae). Journal of Economic Entomology, 97, Τζανακάκης, Μ.Ε. & Κατσόγιαννος, Β.Ι. (1998) Έντομα καρποφόρων δέντρων και αμπέλου. Εκδόσεις Αγρότυπος, Αθήνα. Vargas, R.I., Prokopy, R.J., Duan, J.J. et al. (1997) Captures of wild Mediterranean and Oriental fruit flies (Diptera: Tephritidae) in Jackson and McPhail traps baited with coffee juice. Journal of Economic Entomology, 90, Vita, G., Correnti, A., Minnelli, F. & Pucci, C. (1986) Studies on the chemical basis of fruit acceptance by the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata Wied.: Laboratory trials. Fruit Flies of Economic Importance (ed. by R. Cavalloro), pp A. A. Balkema, Rotterdam, White, I.M. & Elson-Harris, M.M. (1992) Fruit Flies of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. CAB International, U.K. Yuval, B. & Hendrichs, J. (2000) Behavior of flies in the genus Ceratitis (Dacinae: Ceratitidini). Fruit flies (Tephritidae): Phylogeny and evolution of behavior (ed. by M. Aluja and A. L. Norrbom), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. Zabalou, S., Riegler, M., Theodorakopoulou, M. et al. (2004) Wolbachia-induced cytoplasmic incompatibility as a means for insect pest population control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101,

42 Zenil, M., Liedo, P., Williams, T. et al. (2004) Reproductive biology of Fopius arisanus (Hymenoptera: Braconidae) on Ceratitis capitata and Anastrepha spp.(diptera: Tephritidae). Biological Control, 29, Zucoloto, F.S. (1987) Feeding habits of Ceratitis capitata Diptera: Tephritidae): Can larvae recognize a nutritionally effective diet? Journal of Insect Physiology, 33, Zucoloto, F.S. (1991) Effects of flavour and nutritional value on diet selection by Ceratitis capitata larvae (Diptera, Tephritidae). Journal of Insect Physiology, 37,

43 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2 ΓΕΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Συνθήκες εργαστηρίου Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε χώρο του Εργαστηρίου Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος, του Α.Π.Θ. κατά τα έτη 2007 με Οι συνθήκες που επικρατούσαν κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ήταν θερμοκρασία 25±1 ºC, σχετική υγρασία 65±5% και φωτοπερίοδος 14:10 (Φ:Σ) με έναρξη της φωτόφασης στις 06:00 και λήξη στις 20:00. Το φως προερχόταν από λαμπτήρες φθορίου και συμπληρώνονταν από φυσικό φως που έμπαινε από δύο μεγάλα παράθυρα τα οποία βρίσκονταν στη βόρεια και την ανατολική πλευρά του εργαστηριακού χώρου. 2.2 Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν και μέθοδος εκτροφής τους Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν έντομα από αποικίες που είχαν εκτραφεί στο εργαστήριο για ορισμένο αριθμό γενεών (έως 7). Για την εγκατάσταση των αποικιών κάθε χρόνο, κατά τους μήνες Αύγουστο-Σεπτέμβριο συλλέγονταν από το Αγρόκτημα του Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης προσβεβλημένα σύκα (Ficus carica L.; Moraceae) και μήλα (Malus domestica L. Rosaceae) της ποικιλίας Golden delicious και μεταφέρονταν στο εργαστήριο σε πλαστικές λεκάνες με άμμο για τη συλλογή των νυμφών. Για την εγκατάσταση των αποικιών λαμβάνονταν 700 έως 1000 νύμφες κάθε φορά ανάλογα με τα επίπεδα προσβολής και την ποσότητα των καρπών που συλλέγονταν. Η εκτροφή των ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου γινόταν σε ξύλινα κλουβιά διαστάσεων 30 x 30 x 30 cm που είχαν τις τρεις πλευρές τους καλυμμένες με συρμάτινο πλέγμα και μια με γυαλί (Εικόνα 1). Σε κάθε κλουβί τοποθετούνταν άτομα και των δύο φύλων, νερό σε πλαστικά φιαλίδια με φιτίλι και τροφή ενηλίκων. Η τροφή των ενηλίκων αποτελούνταν από μίγμα υδρολυμένης πρωτεΐνης (INC Biomedicals Inc., Irvine, CA), ζάχαρης και νερού σε αναλογία 1:4:5 και προσφερόταν στα έντομα με τη μορφή στερεοποιημένων σταγόνων στην επιφάνεια πλαστικών τρυβλίων Petri διαμέτρου 9 cm. Τα θηλυκά ωοτοκούσαν σε κοίλα, διάτρητα, πλαστικά ημισφαίρια, χρώματος κόκκινου, πάχους 1.5 mm και δι- 29

44 Εικόνα 1. Κλουβί εκτροφής ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου (φωτ. Ν. Κουλούσης). 30

45 αμέτρου 5 cm (Εικόνα 2Α). Στη συνέχεια της διατριβής τα ημισφαίρια αυτά θα αναφέρονται ως υποστρώματα ωοτοκίας. Καθ ένα από τα τεχνητά αυτά υποστρώματα ωοτοκίας έφερε 100 ομοιόμορφα κατανεμημένες οπές διαμέτρου 1 mm, μέσα στις οποίες τα θηλυκά τοποθετούσαν τον ωοθέτη τους και απέθεταν τα αυγά τους στο εσωτερικό των ημισφαιρίων (Εικόνα 2Β). Το κάθε ημισφαίριο ήταν προσαρμοσμένο σε κυκλική οπή διαμέτρου 5 cm που είχε γίνει στο κάλυμμα ενός πλαστικού τρυβλίου Petri διαμέτρου 5.5 cm. Στην βάση του τρυβλίου υπήρχε νερό που διατηρούσε την σχετική υγρασία κάτω από το ημισφαίριο επαρκώς υψηλή ώστε τα θηλυκά να ωοτοκούν. Σε κάθε κλουβί εκτροφής υπήρχαν δύο τέτοια ημισφαίρια (Εικόνα 1). Τα αυγά μεταφέρονταν με τη βοήθεια μαλακού πινέλου από τα ημισφαίρια όπου είχαν αποτεθεί, σε θρεπτικό υπόστρωμα για την εκκόλαψη και ανάπτυξη των προνυμφών. Το υπόστρωμα αποτελούνταν από δίσκους βάμβακος διαμέτρου 5 cm εμποτισμένους με τεχνητή τροφή. Η τροφή αποτελούνταν από 100 gr ζάχαρης, 100 gr μαγιά μπύρας, 50 gr αλευριού σόγιας, 2 gr μίγματος αλάτων, 8 gr ασκορβικού οξέος, 8 gr κιτρικού οξέος, 1.5 gr προπιονικού νατρίου διαλυμένα σε 500 ml νερού. Λεπτομέρειες που αφορούν την προετοιμασία της τροφής δίνονται από τον Boller (1985). Οι δίσκοι με την τροφή των προνυμφών τοποθετούνταν μέσα σε πλαστικά τρυβλία Petri διαμέτρου 9 cm τα οποία είχαν αποστειρωθεί προηγουμένως με καθαρό οινόπνευμα. Σε κάθε Petri με τροφή προνυμφών, μεταφέρονταν αυγά. Στη συνέχεια τα τρυβλία κλείνονταν και τοποθετούνταν σε διαφανείς πλαστικές σακούλες τροφίμων προκειμένου να αποφευχθεί η απώλεια υγρασίας που θα είχε σαν αποτέλεσμα την αφυδάτωση και τον θάνατο αυγών και προνυμφών. Η ανάπτυξη των προνυμφών στο θρεπτικό υπόστρωμα, στις συνθήκες του εργαστηρίου (25 º C), ολοκληρωνόταν σε 8-10 ημέρες. Μετά την ολοκλήρωση της ανάπτυξης τα τρυβλία ανοίγονταν και τοποθετούνταν επάνω σε ένα στρώμα στεγνής άμμου πάχους 4-5 mm μέσα σε πλαστικές λεκάνες. Οι ανεπτυγμένες προνύμφες εξέρχονταν από το τρυβλίο και νυμφώνονταν στην άμμο. Δύο έως τρεις ημέρες μετά τη νύμφωση, η άμμος απομακρυνόταν με κοσκίνισμα και οι νύμφες τοποθετούνταν σε πλαστικά τρυβλία Petri. Η έξοδος των ενηλίκων λάμβανε χώρα 9-10 ημέρες μετά τη νύμφωση. 31

46 Α Β Εικόνα 2. Τεχνητό υπόστρωμα ωοτοκίας που χρησιμοποιήθηκε στις εκτροφές της μύγας της Μεσογείου (Α) και αυγά που έχουν αποτεθεί στην εσωτερική του επιφάνεια (Β) (φωτ. Ν. Κουλούσης). 32

47 Βιβλιογραφία Boller, E.F. (1985) Rhagoletis cerasi and Ceratitis capitata. Handbook of Insect Rearing, Vol. 2 (ed. by P. Sing and R.F. Moore), pp Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. 33

48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 3. ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΩΟΤΟΚΙΑΣ ΤΩΝ ΘΗΛΥΚΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΩΝ ΑΝΗΛΙΚΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ ΣΕ ΚΑΡΠΟΥΣ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ 3.1 Περίληψη Προσδιορίστηκε στο εργαστήριο η προτίμηση ωοτοκίας των θηλυκών και η επιβίωση των ανήλικων σταδίων της μύγας της Μεσογείου σε πέντε διαφορετικά είδη καρπών εσπεριδοειδών Παράλληλα σε πειράματα οπτικής παρατήρησης μελετήθηκε η συμπεριφορά ωοτοκίας των θηλυκών σε άθικτους και τραυματισμένους καρπούς τους. Σε πειράματα πολλαπλής επιλογής θηλυκά απέθεσαν περισσότερα αυγά κατά σειρά σε πορτοκάλια, μανταρίνια, νεράντζια, γκρέιπφρουτ και τέλος λεμόνια. Η επιβίωση των προνυμφών στους ανωτέρω καρπούς συσχετίστηκε αρνητικά με τη σκληρότητα του φλοιού τους και δε συνδέονταν στενά με την προτίμηση ωοτοκίας των θηλυκών. Από τα πειράματα της οπτικής παρατήρησης προέκυψε ότι η δυνατότητα των θηλυκών να αποθέτουν αυγά σε άθικτους καρπούς των εσπεριδοειδών επίσης επηρεάστηκε αρνητικά από τη σκληρότητα του φλοιού τους. Η παρουσία επιφανειακών τραυμάτων στο φλοιό, αν και δεν είχε θετική επίδραση στην προσέλκυση των θηλυκών, αύξησε τη δραστηριότητα (δοκιμές) ωοτοκίας σε σχέση με τους άθικτους καρπούς, που επικεντρώθηκε ως επί το πλείστο στα τραύματα. Τέλος, η παρουσία βαθύτερων τραυμάτων που έφταναν μέχρι τη σάρκα απελευθερώνοντας μικρές ποσότητες χυμού στην επιφάνεια, αύξησε σημαντικά την προσέλκυση σε σχέση με τις δύο άλλες κατηγορίες καρπών (άθικτοι, επιφανειακά τραυματισμένοι) σε όλες τις περιπτώσεις (είδη καρπών). Ωστόσο, μετά την άφιξη των θηλυκών στους καρπούς, οι χημικές ιδιότητες του χυμού καθόρισαν σε μεγάλο βαθμό την αξιοποίηση των τραυμάτων κατά την απόθεση των αυγών. Ειδικότερα, η αποδοχή των τραυμάτων για ωοτοκία καθώς επίσης και ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκε σε αυτά συσχετίστηκε αρνητικά με την οξύτητα του χυμού των καρπών. Αναλύονται οι ευρύτερες προεκτάσεις των αποτελεσμάτων στην κατανόηση της αξιοποίησης των εσπεριδοειδών ως ξενιστές από τη μύγα της Μεσογείου. 3.2 Εισαγωγή 34

49 Όπως αναφέρθηκε στο πρώτο Κεφάλαιο η μύγα της Μεσογείου προσβάλλει μια πλειάδα ξενιστών συμπεριλαμβανόμενων και των εσπεριδοειδών. Παρά το γεγονός ότι οι πρώτες αναφορές περιέγραφαν το συγκεκριμένο έντομο ως εξαιρετικά ζημιογόνο για τα εσπεριδοειδή (Mac Leay, 1829), μεταγενέστερες μελέτες από τους Back & Pemberton (1915) αναθεώρησαν κατά πολύ την άποψη αυτή. Πράγματι, παρά το γεγονός ότι οι καρποί των εσπεριδοειδών μπορεί να προβάλλονται έντονα από τη μύγα της Μεσογείου, εμφανίζουν διάφορα επίπεδα ανθεκτικότητας που μπορεί να κυμαίνονται από μέτρια έως την πλήρη ανοσία αναλόγα με το είδος και την ποικιλία (Back & Pemberton, 1915; Spitler et al., 1984; Eskafi, 1988; Rössler & Greany, 1990; Katsoyannos et al., 1998; Mavrikakis et al., 2000; Papachristos et al., 2008; Staub et al., 2008). Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του φλοιού των εσπεριδοειδών φαίνεται να αποτελούν τα κύρια συστατικά στοιχεία του αμυντικού τους μηχανισμού στις προσβολές από τη μύγα της Μεσογείου και τα άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae (Papachristos & Papadopoulos, 2009 και πηγές που αναφέρουν). Ο φλοιός περιλαμβάνει το έντονα χρωματισμένο flavedo που περιέχει καροτίνες, ξανθοφύλλες και πολλούς ενδοκρινείς αδένες που παράγουν αιθέρια έλαια και το λευκού χρώματος albedo που έχει σπογγώδη υφή και αποτελείται από κυτταρίνες, ημικυτταρίνες και πηκτίνες (Βασιλακάκης & Θεριός, 1996). Για να επιβιώσουν και να αναπτυχτούν, οι νέοεκκολαπτόμενες προνύμφες θα πρέπει να κινηθούν διαμέσου του φλοιού προς την πιο θρεπτική σάρκα. Η διαδρομή αυτή συνήθως συνοδεύεται από υψηλή θνησιμότητα εξαιτίας της τοξικής δράσης των αιθέριων ελαίων του flavedo και της μηχανικής αντίστασης του albedo που εμποδίζει τη μετακίνησή τους προς το εσωτερικό (Back & Pemberton, 1915; Greany, 1989; Papachristos et al., 2008). Παρά το πλήθος των ερευνών σχετικά με τα επίπεδα ανθεκτικότητας των εσπεριδοειδών στις προσβολές από μύγα της Μεσογείου τόσο στο ύπαιθρο όσο και στο εργαστήριο, ελάχιστες μελέτες υπάρχουν που να συνδυάζουν την παράμετρο αυτή με την προτίμηση ωοτοκίας των θηλυκών. Επιπλέον, τα αποτελέσματα που προκύπτουν στις περιπτώσεις αυτές δε στοιχειοθετούν με σαφή τρόπο εάν η προτίμηση ωοτοκίας συνοδεύεται και από αντίστοιχα αυξημένη επιβίωση των απογόνων. Συγκεκριμένα, οι Staub και συνεργάτες (2008) αναφέρουν θετική σχέση μεταξύ προτίμησης και επιβίωσης των ανήλικων σταδίων για τα είδη των εσπεριδοειδών που εξέτασαν. Ωστόσο, από τα αποτελέσματα των Papachristos και συνεργατών (2008) και Papachristos & Papadopoulos (2009) δε φαίνεται να προκύπτει κάτι αντίστοιχο για το σύνολο των διαφορετικών καρπών που μελετηθήκαν. Η προτίμηση ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου στους καρπούς των εσ- 35

50 περιδοειδών αποδίδεται σε μια σειρά παραμέτρων όπως το χρώμα (Levinson et al., 1990), η σκληρότητα του φλοιού (Staub et al., 2008) και η συγκέντρωση των αιθέριων ελαιών (Bodenheimer, 1951; Levinson et al., 2003; Papachristos & Papadopoulos, 2009). Το γεγονός ότι η προτίμηση στο πλείστο των περιπτώσεων αξιολογήθηκε μεμονωμένα είτε στο επίπεδο της προσέλκυσης είτε στο επίπεδο του αριθμού των αυγών που αποτέθηκαν στους καρπούς δεν επιτρέπει τη διεξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων για τον ακριβή ρόλο της κάθε παραμέτρου. Επιπλέον, τα συμπεράσματα που προκύπτουν είναι μάλλον αντιφατικά περιπλέκοντας περαιτέρω την κατάσταση. Για παράδειγμα οι Staub και συνεργάτες (2008) υποστηρίζουν ότι η σκληρότητα του φλοιού είναι ο καθοριστικός παράγοντας της προτίμησης, ενώ αντιθέτως οι Papachristos & Papadopoulos (2009) προκρίνουν το ρόλο της συγκέντρωσης των αιθέριων ελαίων του φλοιού. Μια σημαντική παράμετρος που αφορά την ωοτοκία της μύγας της Μεσογείου στα εσπεριδοειδή είναι η παρουσία, αναλόγως βέβαια και του είδους των καρπών, υψηλών ποσοστών άγονων νυγμάτων (χωρίς αυγά) (Back & Pemberton, 1915). Το γεγονός αυτό φαίνεται να υποδηλώνει αρχική μεν αποδοχή των καρπών από τα θηλυκά που ωστόσο δεν καταλήγει σε απόθεση αυγών για λόγους που παραμένουν άγνωστοι καθώς δεν υπάρχουν λεπτομερείς μελέτες αναφορικά με τη συμπεριφορά ωοτοκίας του συγκεκριμένου εντόμου στα εσπεριδοειδή. Τα θηλυκά της μύγας της Μεσογείου όπως και άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae, προτιμούν να αποθέτουν τα αυγά τους σε τραυματισμένα σημεία των καρπών, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που προκύπτουν κατά την ωοτοκία ατόμων του είδους τους (Christenson & Foote, 1960; Bateman, 1972; Díaz-Fleischer et al., 2000). Τα οφέλη που προκύπτουν από μια τέτοια συμπεριφορά φαίνεται να είναι η εξοικονόμηση χρόνου κατά την απόθεση των αυγών που μειώνει τους κινδύνους από αρπακτικότητα (τα θηλυκά είναι ιδιαίτερα ευάλωτα όταν ωοτοκούν), η αύξηση του ποσοστού των δοκιμών ωοτοκίας που καταλήγουν σε απόθεση αυγών και η πιθανή μείωση της φθοράς του ωοθέτη (Papaj & Messing, 1996 και πηγές που αναφέρουν). Στην περίπτωση των εσπεριδοειδών, η αξιοποίηση των τραυμάτων φαίνεται να παρέχει επιπλέον οφέλη που συνδέονται με την αύξηση της επιβίωσης των απογόνων. Συγκεκριμένα, οι Papaj και συνεργάτες (1989a) διαπίστωσαν ότι τα θηλυκά της μύγας της Μεσογείου προσελκύονταν εντονότερα σε καρπούς πορτοκαλιών που έφεραν βαθιά τραύματα έως τη σάρκα που απελευθέρωναν μικρές ποσότητες χυμού σε σχέση με καρπούς που έφεραν επιφανειακά τραύματα στο φλοιό. Επιπλέον, μετά την άφιξή τους στους καρπούς, τα θηλυκά έδειξαν μεγαλύτερη αποδοχή για 36

51 ωοτοκία ως προς στα τραύματα της σάρκας σε σχέση με εκείνα του φλοιού. Η προφανής αυτή προτίμηση των θηλυκών για τα βαθιά τραύματα αποδόθηκε στο γεγονός ότι αφενός επιτρέπει στις προνύμφες να αποφεύγουν την τοξική δράση των αιθέριων ελαίων και αφετέρου να κινούνται πιο εύκολα προς τη σάρκα. Ωστόσο, ο αντίστοιχος ρόλος των τραυμάτων σε άλλα είδη εσπεριδοειδών παραμένει εντελώς άγνωστος. Επιπλέον, τα τραύματα στη σάρκα μπορεί να επιτρέπουν στα θηλυκά την αξιολόγηση δια της επαφής των χημικών χαρακτηριστικών των καρπών στους οποίους καλούνται να αναπτυχθούν οι απόγονοί τους. Αν και είναι γνωστό ότι οι χημικές ιδιότητες της σάρκας των εσπεριδοειδών επηρεάζουν σημαντικά μια σειρά από παραμέτρους της ανάπτυξης των ανήλικων σταδίων της μύγας της Μεσογείου (Papachristos et al., 2008), εντούτοις δεν υπάρχουν στοιχεία για το εάν και κατά πόσο τα θηλυκά προσαρμόζουν τις αποφάσεις ωοτοκίας τους ανταποκρινόμενα σε αυτού του είδους τις πληροφορίες. Με βάση τα παραπάνω και λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα των σχέσεων της μύγας της Μεσογείου με τη συγκεκριμένη κατηγορία των ξενιστών, στο παρόν Κεφάλαιο εξετάστηκαν: 1) η σχέση μεταξύ της προτίμησης ωοτοκίας των θηλυκών και της επιβίωσης των απογόνων τους σε διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών 2) οι συμπεριφορές που σχετίζεται με την αξιοποίησή τους ως ξενιστές και οι φυσικοχημικές ιδιότητες των καρπών που τις επηρεάζουν και 3) η ικανότητα των θηλυκών να αξιοποιούν την παρουσία τραυμάτων τόσο στο φλοιό όσο και τη σάρκα προς όφελος των ιδίων αλλά και των απογόνων τους. 3.3 Υλικά και μέθοδοι Έντομα και καρποί που χρησιμοποιήθηκαν Χρησιμοποιήθηκαν έντομα της F 2 F 4 γενεάς εργαστηρίου. Για τα πειράματα επιλέχθηκαν πέντε διαφορετικά είδη καρπών εσπεριδοειδών: πορτοκάλια [Citrus sinesnsis (L.) Osbeck] ποικιλίας Ναβελίνα (Navelina), λεμόνια [Citrus limon (L.) Burm. f.] ποικιλίας Λίσμπον (Lisbon), μανταρίνια (Citrus reticulata Blanco) ποικιλίας Κλημεντίνη (Clementine), γκρέιπφρουτ (Citrus paradisi Macfad.) ποικιλίας Μαρς (Marsh) και νεράντζια (Citrus aurantium L.). Με εξαίρεση τα νεράντζια που συλλέχθηκαν από δένδρα της πόλης, η προμήθεια των υπόλοιπων καρπών έγινε από το εμπόριο. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στο να μην έχουν υποστεί μετασυλλεκτικές μεταχειρίσεις όπως η επικάλυψη της επιφάνειάς τους με κηρώδη επιχρίσματα. Πριν τη χρήση τους, οι καρποί πλένονταν με νερό και 37

52 εξετάζονταν προσεκτικά προκειμένου να διαπιστωθεί ότι δε φέρουν συμπτώματα προσβολής από εχθρούς, ασθένειες ή αλλοιώσεις από άλλα αίτια Προσδιορισμός των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των καρπών Για καθένα από τα πέντε είδη καρπών προσδιορίστηκε το μέγεθος (μέση διάμετρος κατακόρυφης και οριζόντιας όψης), το πάχος και η σκληρότητα του φλοιού καθώς επίσης και ο αριθμός των ελαιογόνων αδένων ανά cm² που έφεραν. Σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν 25 καρποί (επαναλήψεις). Για τον προσδιορισμό του πάχους του φλοιού αφαιρούνταν από το μέσο των καρπών μια τετράγωνη επιφάνεια 1 cm² και το συνολικό πάχος του albedo και flavedo προσδιορίζονταν με τη βοήθεια παχύμετρου. Στη συνέχεια η επιφάνεια αυτή μεταφέρονταν κάτω από το στερεοσκόπιο προκειμένου να γίνει η καταμέτρηση του αριθμού των ελαιογόνων αδένων που υπήρχαν. Για τη μέτρηση της σκληρότητας του φλοιού χρησιμοποιήθηκε ένα χειροκίνητο δυναμόμετρο με μνήμη (FT 011 model, Facchini, Alfonsine, Italy), με ακίδα διαμέτρου 3 mm η οποία κατέληγε σε κώνο (μύτη) ύψους 5 mm. Από τον κάθε καρπό λαμβάνονταν τρεις μετρήσεις, μία στο μέσον και δύο σε απόσταση 1 cm τόσο από τον ποδίσκο όσο και από των ομφαλό των καρπών. Ο μέσος όρος των τριών μετρήσεων αντιπροσώπευε τη σκληρότητα του κάθε καρπού. Δέκα από τους παραπάνω καρπούς επιλέχθηκαν τυχαία και αφού αφαιρέθηκε ο φλοιός τους ομογενοποιήθηκαν, καθένας ξεχωριστά, σε ηλεκτρικό αποχυμωτή για την λήψη του χυμού, στον οποίο πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός των σακχάρων και της οξύτητας. Τα σάκχαρα, που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος (94%) των διαλυτών στερεών συστατικών (Δ.Σ.Σ.), προσδιορίστηκαν στο χυμό των καρπών με φορητό ηλεκτρονικό διαθλασίμετρο Atago PR-1 (Atago Co Ltd., Tokyo, Japan). Μια σταγόνα από το χυμό τοποθετήθηκε επάνω στην οπή του οργάνου και η ένδειξη ελήφθη ως επί τοις εκατό σύσταση. Η οξύτητα προσδιορίστηκε με τιτλοδότηση 5 ml χυμού με 0.1 Ν NaOH μέχρι το ph να φτάσει 8.2 και εκφράστηκε ως ποσοστό % κιτρικού οξέος, που αποτελεί το κύριο οργανικό οξύ των καρπών των εσπεριδοειδών. Τέλος, για καθένα από τα πέντε εσπεριδοειδή υπολογίστηκε η σχέση Δ.Σ.Σ./οξύτητα που αποτελεί το λεγόμενο δείκτη ωρίμανσης των καρπών και λαμβάνεται υπόψη πριν τη συγκομιδή τους (Βασιλακάκης & Θεριός, 1996). Όλες οι παραπάνω αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Δενδροκομίας του αγροκτήματος του Α.Π.Θ Προτίμηση ωοτοκίας σε καρπούς των εσπεριδοειδών 38

53 Για τον προσδιορισμό της προτίμησης ωοτοκίας, πενήντα θηλυκά ηλικίας 13 ημερών χωρίς προηγούμενη εμπειρία ωοτοκίας μεταφέρονταν από τις εκτροφές σε ξύλινα κλουβιά διαστάσεων 50 x 50 x 50 cm που περιείχαν νερό και τροφή. Μια μέρα μετά τη μεταφορά των θηλυκών, ακολουθούσε η ανάρτηση των καρπών (ένας από κάθε είδος) στα κλουβιά. Συγκεκριμένα, οι καρποί προσδένονταν από τον ποδίσκο τους σε σύρματα αλουμινίου μήκους 12 cm και διαμέτρου 1.2 mm που ήταν στερεωμένα σε ίσες μεταξύ τους αποστάσεις από ένα κυκλικό πλαίσιο διαμέτρου 35 cm από παχύ ατσάλινο σύρμα (3 mm διάμετρος) το οποίο στερεώνονταν εξωτερικά της οροφής των κλουβιών. Τα θηλυκά αφήνονταν να ωοτοκήσουν στους καρπούς των διαφορετικών εσπεριδοειδών για εικοσιτέσσερις ώρες. Μετά την πάροδο της περιόδου αυτής, οι καρποί απομακρύνονταν και εξετάζονταν κάτω από στερεοσκόπιο προκειμένου να προσδιοριστεί τόσο ο αριθμός των νυγμάτων ωοτοκίας που έφεραν όσο και ο αριθμός των αυγών που είχαν αποτεθεί. Στο συγκεκριμένο πείραμα πραγματοποιήθηκαν 15 επαναλήψεις Ωοτοκία θηλυκών και επιβίωση των ανήλικων σταδίων σε διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών Η πειραματική διαδικασία που εφαρμόστηκε βασίστηκε ως επί το πλείστο στο πρωτόκολλο των Rössler & Greany (1990) με ορισμένες τροποποιήσεις. Ειδικότερα, ομάδες των δέκα θηλυκών ηλικίας 13 ημερών χωρίς προηγούμενη εμπειρία ωοτοκίας μεταφέρονταν σε κλουβιά από Plexiglas διαστάσεων 20 x 20 x 20 cm που είχαν την οροφή τους και τη δεξιά πλευρά καλυμμένη με πλαστικό πλέγμα και έφεραν νερό και τροφή ενηλίκων. Την επόμενη ημέρα, από το μέσο της οροφής των κλουβιών αναρτιόνταν ένας καρπός από τον ποδίσκο του με τη βοήθεια αλουμινένιου σύρματος μήκους 6 cm και διαμέτρου 1.2 mm. Πριν την ανάρτηση, οι καρποί εμβαπτίζονταν για πέντε λεπτά σε υδατικό διάλυμα βορικού οξέος (6 gr βόρακας/3 lit νερό) ώστε να απολυμανθούν εξωτερικά από πιθανά φυτοπαθογόνα που θα μπορούσαν να εισέλθουν στη συνέχεια από τα νύγματα ωοτοκίας (Birke et al., 2006). Μετά την απολύμανση, οι καρποί πλένονταν με άφθονο νερό, σκουπίζονταν και αφήνονταν να στεγνώσουν. Τα θηλυκά όπως και στο προηγούμενο πείραμα είχαν πρόσβαση στους καρπούς για εικοσιτέσσερις ώρες. Για το κάθε εσπεριδοειδές πραγματοποιήθηκαν συνολικά 40 επαναλήψεις. Από τις επαναλήψεις αυτές, δέκα καρποί σε κάθε περίπτωση επιλέχθηκαν τυχαία και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό τόσο του αριθμού των αυγών που υπήρχαν ανά νύγμα ωοτοκίας όσο και του ποσοστού εκκόλαψής των προνυμφών. 39

54 Ειδικότερα, εικοσιτέσσερις ώρες μετά την ωοτοκία δέκα νύγματα από τον κάθε καρπό επιλέγονταν τυχαία και ο αριθμός των αυγών που περιείχαν καταμετρούνταν κάτω από το στερεοσκόπιο. Συνολικά για το κάθε είδος καρπού εξετάστηκαν εκατό νύγματα ωοτοκίας (10 καρποί x 10 νύγματα). Από τα αυγά που είχαν αποτεθεί στους καρπούς, σχηματίστηκαν σαράντα ομάδες των δέκα αυγών (400 αυγά συνολικά) και τοποθετήθηκαν σε διαβρεγμένο διηθητικό χαρτί εντός πλαστικών τρυβλίων Petri διαμέτρου 9 cm. Τα ποσοστά εκκόλαψης των προνυμφών προσδιορίστηκαν τρεις ημέρες μετά τη συλλογή τους. Οι υπόλοιποι τριάντα καρποί, αφού καταμετρήθηκε ο αριθμός των νυγμάτων ωοτοκίας που έφεραν με τη βοήθεια στερεοσκοπίου, τοποθετήθηκαν ατομικά σε πλαστικά δοχεία με άμμο και παρέμειναν για 25 ημέρες προκειμένου να ολοκληρωθεί η ανάπτυξη των προνυμφών. Ο χρόνος αυτός αποδείχτηκε επαρκής καθώς στο τέλος της περιόδου αυτής η εξέταση των καρπών έδειξε ότι δεν είχαν παραμείνει προνύμφες στο εσωτερικό τους. Με την έναρξη της εμφάνισης των νυμφών αυτές συλλέγονταν καθημερινά και τοποθετούνταν σε γυάλινα τρυβλία Petri διαμέτρου 8 cm προκειμένου να προσδιοριστούν τα ποσοστά εξόδου των ενηλίκων για το κάθε εσπεριδοειδές. Στις περιπτώσεις που ο αριθμός των προνυμφών που αναπτύσσονταν στο εσωτερικό των καρπών ήταν μεγάλος (φαινόμενο αρκετά συχνό στα μανταρίνια και σε ορισμένα νεράντζια), γεγονός που διαπιστώνονταν από την απότομη απώλεια του βάρους τους περίπου μια εβδομάδα μετά την απόθεση των αυγών, προκειμένου να αποφευχθούν φαινόμενα έλλειψης τροφής, με τη βοήθεια νυστεριού γίνονταν μια μικρή τομή γύρω από τον ποδίσκο και προσθέτονταν τεμαχίδια σάρκας από καρπούς του ίδιου είδους όπου και για όσο χρονικό διάστημα αυτό κρίνονταν απαραίτητο. Η επιβίωση των προνυμφών στα διαφορετικά είδη των εσπεριδοειδών υπολογίστηκε με βάση τον αριθμό των νυμφών που προέκυψε από τους καρπούς σε σχέση με εκείνον που αναμένονταν να προκύψει ως συνέπεια του αριθμού των νυγμάτων ωοτοκίας που έφεραν, του αριθμού των αυγών που εκτιμήθηκε ότι αυτά περιέχουν και του ποσοστού της εκκόλαψης των προνυμφών Συμπεριφορά ωοτοκίας σε άθικτους και τραυματισμένους καρπούς εσπεριδοειδών Χρησιμοποιήθηκαν τρεις κατηγορίες καρπών από τα προαναφερθέντα είδη. Η πρώτη αφορούσε άθικτους καρπούς, η δεύτερη καρπούς που έφεραν επιφανειακά τραύματα στο φλοιό και η τρίτη καρπούς με τραύματα που έφταναν έως τη σάρκα απελευθερώνοντας μικρές ποσότητες χυμού στην επιφάνεια, 40

55 παρέχοντας με τον τρόπο αυτό τη δυνατότητα στα θηλυκά να αξιολογούν δια της επαφής τις χημικές ιδιότητες του υποστρώματος στο οποίο καλούνταν να αναπτυχθούν οι προνύμφες τους. Η δημιουργία των τραυμάτων γινόταν με τη βοήθεια εντομολογικής βελόνας διαμέτρου 1 mm σε βάθος 2 και 15 mm αντίστοιχα για τις επιφανειακές πληγές και εκείνες που έφταναν μέχρι τη σάρκα. Σε κάθε καρπό διαμορφώνονταν 15 τραύματα, 5 σε απόσταση 1 cm από τον ποδίσκο και σε κυκλική μεταξύ τους διάταξη, 5 στο μέσον της περιφέρειας και τα υπόλοιπα σε απόσταση 1 cm από τον ομφαλό. Η διάταξή τους στις τρεις ζώνες του καρπού ήταν τέτοια ώστε σε κατακόρυφη όψη να σχηματίζουν ευθεία γραμμή. Η θέση των τραυμάτων επισημαίνονταν με ένα μαύρο κύκλο που σχηματίζονταν στην επιφάνεια των καρπών με τη βοήθεια μαρκαδόρου (Εικόνα 1). Για τη διευκόλυνση της καταγραφής των τραυμάτων στα οποία ωοτοκούσαν τα θηλυκά, εφαρμόστηκε ένα απλό σύστημα κωδικοποίησης. Συγκεκριμένα, τα τραύματα της περιοχής του ποδίσκου αριθμηθήκαν από το 1 έως το 5 (Εικόνα 1). Σε αυτά δόθηκαν οι κωδικοί 1-1, 2-1, 3-1 και ούτω καθεξής. Στα αντίστοιχα κατακόρυφα τραύματα της περιφέρειας και του ομφαλού δόθηκαν οι κωδικοί 1-2, 2-2, 3-2 και 1-3, 2-3, 3-3 κλπ. Η διαδικασία αυτή κρίθηκε απολύτως απαραίτητη καθώς επέτρεπε τη γρήγορη καταγραφή στο πρωτόκολλο του τραύματος που χρησιμοποιούσε το εκάστοτε θηλυκό για την απόθεση των αυγών του. Για να μην υπάρχουν οπτικές διαφορές μεταξύ τραυματισμένων και άθικτων καρπών, η σήμανση των καρπών με αυτόν τον τρόπο εφαρμόστηκε σε όλες τις περιπτώσεις. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, πέντε θηλυκά ηλικίας 13 ημερών χωρίς προηγούμενη εμπειρία ωοτοκίας μεταφέρονταν από τις εκτροφές και αφού επισημαίνονταν στο θώρακα με διαφορετικά χρώματα τέμπερας ώστε να ξεχωρίζουν μεταξύ τους, τοποθετούνταν σε κλουβιά από Plexiglas διαστάσεων 20 x 20 x 20 cm με νερό και τροφή που στις εισόδους τους έφεραν ελαστικό εντομολογικό δίχτυ που επέτρεπε χειρισμούς στο εσωτερικό τους χωρίς τον κίνδυνο διαφυγής των εντόμων. Την επόμενη ημέρα, ακολουθούσε η ανάρτηση των καρπών (βλέπε προηγούμενο πείραμα) και η συμπεριφορά των θηλυκών παρατηρούνταν συνεχώς για την επόμενη μια ώρα. Για κάθε μια από τις τρεις κατηγορίες των πέντε εσπεριδοειδών πραγματοποιήθηκαν 15 επαναλήψεις. Οι παρατηρήσεις λάμβαναν χώρα καθημερινά από τις 13:00 έως τις 18:00 (μια ώρα για το κάθε εσπεριδοειδές) και η σειρά με την οποία οι διαφορετικοί καρποί παρουσιάζονταν στα θηλυκά στο διάστημα αυτό εναλλάσσονταν κατά τη φορά των δεικτών του ρολογιού με κάθε νέα επανάληψη (ημέρα). Σε κάθε πειραματική ημέρα χρησιμοποιούνταν καρποί της ίδιας κατηγορίας σε ότι αφορούσε το είδος των τραυμάτων που έφεραν (ή όχι), έτσι ώστε σε διάστημα τριών διαδοχικών ημερών να ολοκληρώνεται μια επανάλη- 41

56 1 2 3 Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση της διάταξης των τραυμάτων στους καρπούς των εσπεριδοειδών. 42

57 ψη για όλες τις κατηγορίες, με τους καρπούς του κάθε είδους να προσφέρονται στα θηλυκά τις ίδιες ακριβώς ώρες. Με την ανάρτηση των καρπών, η τροφή και το νερό απομακρύνονταν ώστε το οπτικό επίπεδο να είναι τελείως ελεύθερο και τα έντομα (ένα κλουβί κάθε φορά) τοποθετούνταν σε απόσταση 30 cm από τον παρατηρητή. Στο πίσω μέρος του κλουβιού όπου δεν υπήρχε η δυνατότητα οπτικής επαφής, για να μη γίνονται έντονες κινήσεις που θα μπορούσαν να ενοχλήσουν τα έντομα, υπήρχε ένας καθρέφτης (25 x 20 cm) σε απόσταση 10 cm. Με τη βοήθεια κατάλληλα διαμορφωμένων πρωτόκολλων και ενός ψηφιακού χρονομέτρου, καταγράφονταν οι εξής παράμετροι: ο αριθμός των θηλυκών που επισκέπτονταν τους καρπούς, ο αριθμός και η επιτυχία (ή μη) των δοκιμών ωοτοκίας σε άθικτα και τραυματισμένα σημεία και τέλος ο χρόνος που μεσολαβούσε για κάθε δοκιμή που κατέληγε σε απόθεση αυγών, γεγονός που διαπιστώνονταν από το σύρσιμο του ωοθέτη των θηλυκών στην επιφάνεια των καρπών και την σήμανσή τους με φερομόνη αποτροπής ωοτοκίας (Prokopy et al., 1978). Ως δοκιμές ωοτοκίας θεωρήθηκαν οι προσπάθειες των θηλυκών να αποθέσουν αυγά που είχαν διάρκεια τουλάχιστον ενός λεπτού αποκλείοντας εκείνες που διαρκούσαν για κάποια δευτερόλεπτα. Στις περιπτώσεις που οι δοκιμές ωοτοκίας στα τραύματα (Εικόνα 2) κατέληγαν σε απόθεση αυγών, τα σημεία σφραγίζονταν με ένα κομμάτι 4 x 4 mm διαφανούς ταινίας (Scotch Magic, 3M, USA) που εφαρμόζονταν με τη βοήθεια μιας λαβίδας και στο πρωτόκολλο καταγράφονταν το θηλυκό που την πραγματοποίησε καθώς επίσης και η σειρά διαδοχής της (πρώτη, δεύτερη κλπ). Στην περίπτωση που η ωοτοκία λάμβανε χώρα σε άθικτη επιφάνεια των καρπών, μόλις κάποιο θηλυκό εισχωρούσε τον ωοθέτη του, με τη βοήθεια ενός λεπτού πινέλου σχηματίζονταν μια λευκή κουκίδα με χρώμα τέμπερας σε απόσταση 5 mm πίσω από το σημείο του καρπού στο οποίο είχε εισέλθει ο ωοθέτης. Εφόσον η προσπάθεια στέφονταν με επιτυχία, στη διαφανή ταινία σημειώνονταν το πρώτο γράμμα του χρώματος που έφερε το θηλυκό και ο αριθμός της σειράς διαδοχής της ωοτοκίας που είχε λάβει χώρα και το νύγμα σφραγίζονταν. Στην περίπτωση που δεν υπήρχε απόθεση αυγών το σημείο απλά καλύπτονταν με ταινία για να μην υπάρχει η δυνατότητα χρήσης του στη συνέχεια. Μετά την ολοκλήρωση όλων των παρατηρήσεων στο διάστημα της κάθε ημέρας, τα αυγά που είχε αποθέσει το κάθε θηλυκό καταμετρούνταν κάτω από το στερεοσκόπιο. Στην περίπτωση που κάποιο θηλυκό δεν είχε προλάβει να ολοκληρώσει την απόθεση των αυγών του με την ολοκλήρωση της μιας ώρας, του παρέρχονταν ο επιπλέον χρόνος που απαιτούνταν, χωρίς ωστόσο στο διάστημα αυτό να καταγράφονται άλλες δραστηριότητες που τυχόν προέκυπταν. Από τις αναλύσεις των στοιχείων που αφορούσαν την απόθεση των αυγών στους καρ- 43

58 Εικόνα 2. Δοκιμές ωοτοκίας από θηλυκά σε επιφανειακά τραύματα καρπού πορτοκαλιού. 44

59 πούς, προέκυψαν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των επιτυχημένων διαδοχικών ωοτοκιών του κάθε θηλυκού τόσο ως προς τον αριθμό των αυγών που είχε αποτεθεί όσο και ως προς τη διάρκειας της κάθε προσπάθειας. Συγκεκριμένα, ανεξάρτητα από το είδος του καρπού και των τραυμάτων που έφερε (ή όχι), τα θηλυκά συνήθως κατά την πρώτη επιτυχημένη προσπάθεια ωοτοκίας τους αφιέρωναν μεγαλύτερο χρόνο αποθέτοντας αντίστοιχα και μεγαλύτερο αριθμό αυγών σε σχέση με τις επόμενες προσπάθειες (βλέπε και Papaj et al., 1989b, 1990). Επιπλέον οι παράμετροι αυτοί (χρονική διάρκεια ωοτοκίας και αριθμός αυγών) στη μύγα της Μεσογείου μπορεί να επηρεάζονται σημαντικά από την ποσότητα της φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας που συσσωρεύεται στους καρπούς ξενιστές (Papaj et al., 1989b, 1990). Για τους παραπάνω λόγους, οι συγκρίσεις σχετικά με τη διάρκεια των επιτυχημένων δοκιμών ωοτοκίας και τον αριθμό των αυγών που αποτέθηκε σε αυτές μεταξύ των άθικτων και των τραυματισμένων καρπών (αφορούσαν μόνο τα τραύματα) επικεντρώθηκαν αποκλειστικά και μόνο στην πρώτη επιτυχημένη ωοτοκία της κάθε επανάληψης των αντίστοιχων μεταχειρίσεων. 3.4 Στατιστική ανάλυση Τα δεδομένα των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των καρπών, των παραμέτρων ωοτοκίας των θηλυκών και της αντίστοιχης επιβίωσης των ανήλικων σταδίων στα διαφορετικά είδη των καρπών των εσπεριδοειδών υποβλήθηκαν σε ανάλυση παραλλακτικότητας (one-way ANOVA) μετά από κατάλληλες μετατροπές όπου αυτό ήταν απαραίτητο και οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο Tukey s HSD. Στις περιπτώσεις όπου δεν κατέστη δυνατό να εξισωθούν οι παραλλακτικότητες, η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το μη παραμετρικό κριτήριο Kruskal-Wallis και οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο Mann-Whitney. Τα ποσοστά επιβίωσης των νυμφών που προήλθαν από τους διαφορετικούς καρπούς συγκρίθηκαν με το χ² κριτήριο. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση των χαρακτηριστικών του φλοιού των καρπών στην επιβίωση των προνυμφών, τα μέσα ποσοστά επιβίωσης του προέκυψαν για το κάθε εσπεριδοειδές συσχετίστηκαν (συσχέτιση Pearson) με το πάχος και η σκληρότητα του φλοιού, καθώς επίσης και με την πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων των καρπών. Τα δεδομένα της προτίμησης ωοτοκίας των θηλυκών στα πειράματα πολλαπλής επιλογής αναλυθήκαν με το κριτήριο Friedman και οι συγκρίσεις ανά δύο μεταξύ των μεταχειρίσεων (καρπών) πραγματοποιήθηκαν με το μη παραμετρικό Wilcoxon signed rank κριτήριο για επίπεδο σημαντικότητας P <

60 μετά από εφαρμογή της διόρθωσης κατά Bonferroni (Bonferroni correction, 0.05/n όπου n ο αριθμός των μεταχειρίσεων μεταξύ των οποίων γίνονται οι συγκρίσεις) (Sokal & Rohlf, 1995). Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση ορισμένων φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των καρπών στην προτίμηση ωοτοκίας, τα μέσα ποσοστά των αυγών που αποτέθηκαν στους διαφορετικούς καρπούς συσχετίστηκαν (συσχέτιση Pearson) με παραμέτρους όπως το μέγεθος (διάμετρος), η σκληρότητα του φλοιού και η πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων των καρπών. Στα πειράματα της οπτικής παρατήρησης, τα δεδομένα που αφορούσαν τις επισκέψεις στους καρπούς, τις δοκιμές ωοτοκίας, τους χρόνους που μεσολάβησαν κατά την πρώτη επιτυχημένη ωοτοκία σε κάθε επανάληψη και τον αντίστοιχο αριθμό των αυγών που αποτέθηκε υποβλήθηκαν (μετά από κατάλληλες μετατροπές όπου αυτό ήταν απαραίτητο) σε ανάλυση παραλλακτικότητας (twoway ANOVA) προκειμένου να προσδιοριστεί η επίδραση του είδους των εσπεριδοειδών και των τραυμάτων (ή μη) στις παραμέτρους αυτές. Για τις συγκρίσεις μεταξύ των διαφορετικών καρπών που υπάγονταν στην ίδια κατηγορία σε ότι αφορούσε την παρουσία (ή μη) των τραυμάτων και μεταξύ των καρπών του ίδιου είδους που υπάγονταν στις τρεις διαφορετικές κατηγορίες αναφορικά με τα τραύματα που έφεραν (ή όχι), τα δεδομένα των ανωτέρω παραμέτρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση παραλλακτικότητας και οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο Tukey s HSD. Στις περιπτώσεις που δεν κατέστη δυνατό να εξισωθούν οι παραλλακτικότητες, οι αναλύσεις έγιναν με το μη παραμετρικό κριτήριο Kruskal- Wallis και οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο Mann-Whitney. Για κάθε μια από τις δύο κατηγορίες των εσπεριδοειδών που έφεραν τραύματα, τα δεδομένα μεταξύ των διαφορετικών καρπών που αφορούσαν τα ποσοστά (%) επί των συνολικών δοκιμών ωοτοκίας που έλαβαν χώρα στα τραύματα, υποβλήθηκαν σε ανάλυση παραλλακτικότητας (one-way ANOVA) και οι μέσοι όροι τους συγκρίθηκαν με το κριτήριο Tukey s HSD. Για τις συγκρίσεις των ανωτέρω ποσοστών μεταξύ των καρπών του ιδίου είδους που έφεραν επιφανειακά και βαθιά τραύματα εφαρμόστηκε το t-κριτήριο. Στην περίπτωση των καρπών που έφεραν τραύματα μέχρι τη σάρκα, τα ποσοστά επί των συνολικών δοκιμών ωοτοκίας που έλαβαν χώρα σε αυτά συσχετίστηκαν με τις χημικές ιδιότητες (οξύτητα, Δ.Σ.Σ και Δ.Σ.Σ/οξύτητα) του χυμού των εσπεριδοειδών. Τα ποσοστά των δοκιμών ωοτοκίας που κατέληξαν σε απόθεση αυγών μεταξύ των άθικτων καρπών των εσπεριδοειδών αναλύθηκαν με το μη παραμετρικό κριτήριο Kruskal-Wallis και οι μέσοι όροι τους συγκρίθηκαν με το κριτήριο Mann-Whitney. Επιπλέον, τα παραπάνω ποσοστά συσχετίστηκαν 46

61 (συσχέτιση Pearson) με χαρακτηριστικά του φλοιού των καρπών που θα μπορούσαν ενδεχομένως να την επηρεάσουν την παράμετρο αυτή όπως η σκληρότητα και η πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων. Για τους καρπούς που έφεραν τραύματα, τα δεδομένα που αφορούσαν τα ποσοστά των επιτυχημένων δοκιμών ωοτοκίας τόσο στα τραύματα όσο και σε άθικτη επιφάνεια αναλύθηκαν επίσης με το μη παραμετρικό κριτήριο Kruskal-Wallis και οι μέσοι όροι τους συγκρίθηκαν με το κριτήριο Mann-Whitney. Τέλος, η σχέση μεταξύ των χημικών χαρακτηριστικών του χυμού (οξύτητα, Δ.Σ.Σ και Δ.Σ.Σ/οξύτητα) των εσπεριδοειδών και του αντίστοιχου αριθμού των αυγών που απέθεσαν τα θηλυκά κατά την πρώτη επιτυχημένη ωοτοκία σε κάθε επανάληψη στα τραύματα που έφταναν μέχρι τη σάρκα μελετήθηκε με συσχέτιση Pearson. 3.5 Αποτελέσματα Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των καρπών Το μέγεθος των καρπών διέφερε σημαντικά μεταξύ των ειδών των εσπεριδοειδών, με τα πορτοκάλια και τα γκρέιπφρουτ να είναι τα πιο ευμεγέθη και τα μανταρίνια τα μικτότερα σε διαστάσεις (Πίνακας 1). Οι καρποί των γκρέιπφρουτ έφεραν τον παχύτερο φλοιό σε σχέση με τους υπόλοιπους, ενώ τα μανταρίνια το λεπτότερο. Τα λεμόνια και τα πορτοκάλια είχαν το σκληρότερο φλοιό, ακολουθούμενα από τα νεράντζια τα γκρέιπφρουτ και τέλος τα μανταρίνια. Τα πορτοκάλια έφεραν το μεγαλύτερο αριθμό ελαιογόνων αδένων ανά cm² στο φλοιό τους ακολουθούμενα από τα λεμόνια που δε διέφεραν σημαντικά σε σχέση με τα μανταρίνια και τα νεράντζια, ενώ στα γκρέιπφρουτ παρατηρήθηκε η μικρότερη πυκνότητα. Ο χυμός των λεμονιών είχε την υψηλότερη οξύτητα ακολουθούμενος από τα νεράντζια και τα γκρέιπφρουτ. Η χαμηλότερη οξύτητα παρατηρήθηκε στα μανταρίνια. Το μεγαλύτερο ποσοστό διαλυτών στερεών συστατικών (Δ.Σ.Σ) βρέθηκε στο χυμό των γκρέιπφρουτ ενώ στα λεμόνια παρατηρήθηκε η μικρότερη τιμή. Τέλος, η αναλογία Δ.Σ.Σ/οξύτητα ήταν μέγιστη στο χυμό των μανταρινιών και ελάχιστη στα λεμόνια με τους υπόλοιπους καρπούς να έχουν ενδιάμεσες τιμές Προτίμηση ωοτοκίας στους καρπούς των εσπεριδοειδών Από τα πειράματα πολλαπλής επιλογής προέκυψαν σημαντικές διαφορές ως προς την προτίμηση ωοτοκίας μεταξύ των καρπών των εσπεριδοειδών (Πινάκας 2). Ειδικότερα, τα πορτοκάλια έφεραν τα περισσότερα νύγματα ωοτοκίας 47

62 Πίνακας 1. Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των καρπών των εσπεριδοειδών Μέσος όρος ± Τ.Σ Είδος καρπού Διάμετρος καρπού (σε cm)¹ Πάχος φλοιού (σε mm)¹ Σκληρότητα φλοιού (σε Kg)¹ Αριθμός ελαιογόνων αδένων/cm² ¹ Οξύτητα χυμού (%)² Διαλυτά στερεά συστατικά (Δ.Σ.Σ) χυμού (%)² Δ.Σ.Σ/οξύτητα² Πορτοκάλι 7.70 ± 0.06α 6.18 ± 0.24β 0.75 ± 0.02β ± 3.41α 1.33 ± 0.03δ ± 0.18βγ 8.30 ± 0.20β Λεμόνι 6.75 ± 0.07β 5.36 ± 0.16γ 1.25 ± 0.02α ± 2.9β 6.47 ± 0.06α 8.90 ± 0.08δ 1.38 ± 0.02ε Μανταρίνι 5.35 ± 0.03δ 2.86 ± 0.08δ 0.31 ± 0.03ε ± 3.89βγ 0.56 ± 0.01ε ± 0.15γ ± 0.59α Νεράντζι 6.11 ± 0.07γ 5.18 ± 0.15γ 0.66 ± 0.02γ ± 2.89βγ 5.39 ± 0.10β ± 0.13β 2.10 ± 0.06δ Γκρέιπφρουτ 7.67 ± 0.08α 7.20 ± 0.21α 0.51 ± 0.01δ ± 1.68γ 2.13 ± 0.01γ ± 0.05α 5.49 ± 0.04γ F χ² B.E 4,120 4,120 4,120 4, P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, ¹Τukey s HSD κριτήριο, ²Mann-Whitney U-κριτήριο). 48

63 Πίνακας 2. Προτίμηση ωοτοκίας από ομάδες πενήντα θηλυκών της μύγας Μεσογείου σε πειράματα πολλαπλής επιλογής μεταξύ καρπών εσπεριδοειδών από πέντε διαφορετικά είδη. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 15 επαναλήψεις Μέσος όρος ± Τ.Σ Είδος καρπού Νύγματα ωοτοκίας Αυγά που αποτέθηκαν Ποσοστό % του συνόλου των αυγών που αποτέθηκε Πορτοκάλι ± 1.30α ± 44.91α ± 2.15α Λεμόνι 3.47 ± 0.50ε 7.93 ± 2.44ε 0.67 ± 0.20ε Μανταρίνι ± 1.24β ± 51.80β ± 1.93β Νεράντζι ± 0.82γ ± 24.26γ ± 1.75γ Γκρέιπφρουτ 8.27 ± 1.02δ δ 8.94 ± 1.17δ χ² B.E P <0.001 <0.001 <0.001 Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.01, Wilcoxon signed rank κριτήριο). 49

64 ακολουθούμενα από τα μανταρίνια και τα νεράντζια ενώ στα λεμόνια διαπιστώθηκε ο μικρότερος αριθμός. Ανάλογη ήταν και η τάση που παρατηρήθηκε ως προς την απόθεση των αυγών. Συγκεκριμένα, τα θηλυκά απέθεσαν κατά μέσο όρο περίπου το 46% των αυγών τους στα πορτοκάλια, το 29% στα μανταρίνια, το 15% στα νεράντζια, το 9% στα γκρέιπφρουτ και ελάχιστα (<1%) στα λεμόνια. Τα ποσοστά των αυγών που αποτέθηκαν στους καρπούς δε συσχετίστηκαν με φυσικοχημικές παραμέτρους τους όπως το μέγεθος (r p = 0.010, Β.Ε = 3, P = 0.988), ο αριθμός των ελαιογόνων αδένων που έφεραν (r p = 0.776, Β.Ε = 3, P = 0.123) και η σκληρότητά του φλοιού τους (r p = , Β.Ε = 3, P = 0.475) Ωοτοκία θηλυκών και επιβίωση των ανήλικων σταδίων σε διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών Η ωοτοκία των θηλυκών στους καρπούς με βάση τον αριθμό των νυγμάτων που καταμετρήθηκε ήταν παραπλήσια με τα αποτελέσματα του προηγούμενου πειράματος με τις διαφορές όμως να αμβλύνονται καθώς δεν υπήρχε η δυνατότητα επιλογής (Πίνακας 3). Ο αριθμός των αυγών που εκτιμήθηκε ότι περιέχονται ανά νύγμα ωοτοκίας κυμάνθηκε από 9.44 για τα λεμόνια έως για τα γκρέιπφρουτ και δε διέφερε σημαντικά μεταξύ των εσπεριδοειδών. Τα ποσοστά εκκόλαψης των προνυμφών στους διάφορους καρπούς ήταν αρκετά υψηλά και κυμάνθηκαν γύρω στο 80% χωρίς να διαφέρουν μεταξύ τους. Με βάση τις διαφορές μεταξύ του αναμενόμενου και του παρατηρούμενου αριθμού νυμφών σε κάθε μεταχείριση, στα μανταρίνια παρατηρήθηκε η μεγαλύτερη επιβίωση (34.85%) των προνυμφών και ακολούθησαν τα νεράντζια και τα γκρέιπφρουτ. Η επιβίωση στα πορτοκάλια (τον πιο προτιμητέο ξενιστή σύμφωνα με το προηγούμενο πείραμα) ήταν πολύ μικρή (6.77%) ενώ στα λεμόνια σχεδόν μηδενική. Τα ποσοστά επιβίωσης των προνυμφών στους καρπούς συσχετίστηκαν αρνητικά με τη σκληρότητα του φλοιού τους (r p = , Β.Ε = 3, P = 0.034), ενώ δεν υπήρξε συσχέτιση με το πάχος του φλοιού και την πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων (r p = , Β.Ε = 3, P = και r p = , Β.Ε = 3, P = αντίστοιχα). Τα ποσοστά επιβίωσης των νυμφών που προέκυψαν από τις διάφορες μεταχειρίσεις κυμάνθηκαν από έως 72.87% και δε διέφεραν μεταξύ των διαφορετικών καρπών των εσπεριδοειδών. 50

65 Πίνακας 3. Παράμετροι ωοτοκίας των θηλυκών και επιβίωσης των ανήλικων σταδίων της μύγας της Μεσογείου σε καρπούς εσπεριδοειδών πέντε διαφορετικών ειδών. Κάθε μεταχείριση περιλάμβανε ομάδες των 10 θηλυκών που είχαν πρόσβαση στους καρπούς για 24 ώρες σε πειράματα μη επιλογής. Σε κάθε περίπτωση πραγματοποιήθηκαν 30 επαναλήψεις Μέσος όρος ± Τ.Σ Είδος καρπού Νύγματα ωοτοκίας¹ Αριθμός αυγών/νύγμα ωοτοκίας² Ποσοστό εκκόλαψης προνυμφών² Αναμενόμενος αριθμός νυμφών/καρπό¹ Παρατηρούμενος αριθμός νυμφών/καρπό¹ Επιβίωση προνυμφών (%)¹ Ποσοστό επιβίωσης νυμφών (%)³ Πορτοκάλι ± 1.66α 9.79 ± ± ± 13.21α ± 3.35γ 6.77 ± 1.38γ Λεμόνι ± 1.56γ 9.44 ± ± ± 12.14γ 0.8 ± 0.5δ 0.43 ± 0.26δ Μανταρίνι ± 1.06αβ ± ± ± 9.25α ± 3.91α ± 0.96α Νεράντζι ± 1.97αβ ± ± ± 16.10αβ ± 4.96β ± 0.92β Γκρέιπφρουτ ± 1.64β ± ± ± 14.19β ± 5.54β ± 1.91β F χ² B.E 4 4,495 4, P < <0.001 <0.001 < Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, ¹Mann-Whitney U-κριτήριο, ²Τukey s HSD κριτήριο). ³ χ² κριτήριο. 51

66 3.5.4 Συμπεριφορά ωοτοκίας των θηλυκών σε άθικτους και τραυματισμένους καρπούς εσπεριδοειδών Η προσέλκυση (αριθμός επισκέψεων) των θηλυκών στους καρπούς επηρεάστηκε σημαντικά από το είδος των εσπεριδοειδών και από την παρουσία (ή μη) των τραυμάτων, χωρίς ωστόσο να παρατηρηθεί σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των παραγόντων (Πινάκας 4). Στην περίπτωση των άθικτων καρπών, οι περισσότερες επισκέψεις καταγράφηκαν στα μανταρίνια, ακολούθησαν τα πορτοκάλια και τα νεράντζια, ενώ στα γκρέιπφρουτ και τα λεμόνια παρατηρήθηκε ο μικρότερος ρυθμός αφίξεων (Πινάκας 5). Περίπου ανάλογα ήταν τα αποτελέσματα και στις περιπτώσεις των καρπών που έφεραν τραύματα. Οι συγκρίσεις μεταξύ καρπών του ιδίου είδους που διέφεραν ως προς την παρουσία (ή μη) των τραυμάτων αποκάλυψαν μια σημαντική θετική επίδραση των τραυμάτων που έφταναν μέχρι τη σάρκα στην προσέλκυση των θηλυκών σε όλες τις περιπτώσεις (Πινάκας 5). Το είδος των καρπών και η παρουσία (ή μη) των τραυμάτων επηρέασαν σημαντικά τις δοκιμές ωοτοκίας των θηλυκών, ενώ σημαντική ήταν και η αλληλεπίδρασή τους στην παράμετρο αυτή (Πίνακας 4). Στην περίπτωση των άθικτων καρπών οι δοκιμές ωοτοκίας που πραγματοποιήθηκαν στα πορτοκάλια τα μανταρίνια και τα νεράντζια διέφεραν σημαντικά σε σχέση με τα λεμόνια και τα γκρέιπφρουτ (Πίνακας 6). Η ίδια ακριβώς τάση παρατηρήθηκε και την περίπτωση των τραυμάτων στο φλοιό. Αντιθέτως, στους καρπούς που έφεραν τραύματα μέχρι τη σάρκα οι δοκιμές ωοτοκίας στα νεράντζια υπολείπονταν σημαντικά σε σχέση με τα πορτοκάλια και τα μανταρίνια. Σε κάθε περίπτωση η παρουσία τραυμάτων στο φλοιό αύξησε σημαντικά τις δοκιμές ωοτοκίας σε σχέση με τους άθικτους καρπούς. Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα και στην περίπτωση των τραυμάτων στη σάρκα με μοναδική εξαίρεση την περίπτωση των λεμονιών. Στους καρπούς που έφεραν τραύματα στο φλοιό, τα ποσοστά επί των συνολικών δοκιμών ωοτοκίας που έλαβαν χώρα σε αυτά κυμάνθηκαν από 67.56% έως 86.90% και δε διέφεραν σημαντικά μεταξύ των εσπεριδοειδών (Πίνακας 6). Αντίθετα στην περίπτωση των καρπών με τραύματα στη σάρκα το αντίστοιχο ποσοστό στα νεράντζια ήταν σημαντικά μικρότερο σε σχέση με τα πορτοκάλια, τα μανταρίνια και τα γκρέιπφρουτ ενώ στα λεμόνια παρατηρήθηκε η μικρότερη τιμή (Πινάκας 6). Τα ποσοστά επί των συνολικών των δοκιμών ωοτοκίας που πραγματοποιήθηκαν στα τραύματα του φλοιού σε σχέση με εκείνα της σάρκας διέφεραν σημαντικά στα πορτοκάλια (t = , Β.Ε = 17.80, Ρ = 0.014) τα λεμόνια (t = 5.000, Β.Ε = 22.69, Ρ < 0.001) και τα νεράντζια (t = 6.347, Β.Ε = 18.45, Ρ < 0.001) όχι όμως 52

67 Πίνακας 4. Ανάλυση παραλλακτικότητας της επίδρασης διαφορετικών καρπών εσπεριδοειδών και της παρουσίας (ή μη) τραυμάτων στο φλοιό και στη σάρκα τους στη συχνότητα αφίξεων των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου στους καρπούς, στις δοκιμές ωοτοκίας, στη διάρκεια της πρώτης επιτυχημένης ωοτοκίας σε κάθε επανάληψη και στον αντίστοιχο αριθμό των αυγών που αποτέθηκε Παράμετρος Πηγή παραλλακτικότητας Αφίξεις στους καρπούς Μέσα τετράγωνα F P Μέσα τετράγωνα Δοκιμές ωοτοκίας F P Διάρκεια πρώτης επιτυχημένης ωοτοκίας σε κάθε επανάληψη Μέσα τετράγωνα F P Αυγά που αποτέθηκαν κατά την πρώτη επιτυχημένη ωοτοκία σε κάθε επανάληψη Μέσα τετράγωνα F P Είδος καρπού (Β.Ε=4) < < < <0.001 Παρουσία (ή μη) και τύπος τραύματος (Β.Ε=2) < < < <0.001 Αλληλεπίδραση (Β.Ε=8) < < Σφάλμα (Β.Ε=210) (Β.Ε=210) (Β.Ε=173) (Β.Ε=173) 53

68 Πίνακας 5. Συχνότητα επισκέψεων θηλυκών της μύγας της Μεσογείου σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών και σε καρπούς που έφεραν τεχνητά τραύματα που είτε περιορίζονταν στο φλοιό είτε έφταναν μέχρι τη σάρκα σε πειράματα μη επιλογής. Κάθε επανάληψη περιελάμβανε 5 θηλυκά και είχε διάρκεια μιας ώρας. Για κάθε μεταχείριση πραγματοποιήθηκαν 15 επαναλήψεις Είδος καρπού Αριθμός επισκέψεων ± Τ.Σ. Άθικτοι καρποί Καρποί με τραύματα στο φλοιό Καρποί με τραύματα στη σάρκα Πορτοκάλι 5.00 ± 0.32βΒ 5.73 ± 0.46αΒ 9.27 ± 0.61αΑ F= Β.Ε=2,42 P<0.001 Λεμόνι 3.33 ± 0.40γΒ 3.27 ± 0.34βΒ 5.47 ± 0.57βΑ F=7.830 Β.Ε=2,42 P=0.001 Μανταρίνι 6.60 ± 0.51αΒ 5.27 ± 0.42αΒ ± 0.73αΑ F= Β.Ε=2,42 P<0.001 Νεράντζι 4.73 ± 0.43βγΒ 4.47 ± 0.40αβΒ ± 0.87αΑ F= Β.Ε=2,42 P<0.001 Γκρέιπφρουτ 3.27 ± 0.49γΒ 4.53 ± 0.64αβΒ 6.47 ± 0.52βΑ F=8.416 Β.Ε=2,42 P=0.001 F B.E 4,70 4,70 4,70 P < <0.001 Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο πεζό γράμμα και μέσοι οροί σε κάθε γραμμή ακολουθούνται από το ίδιο κεφαλαίο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, Τukey s HSD κριτήριο). 54

69 Πίνακας 6. Δοκιμές ωοτοκίας θηλυκών της μύγας Μεσογείου σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών και σε καρπούς που έφεραν τεχνητά τραύματα που είτε περιορίζονταν στο φλοιό είτε έφταναν μέχρι τη σάρκα σε πειράματα μη επιλογής. Κάθε επανάληψη περιελάμβανε 5 θηλυκά και είχε διάρκεια μιας ώρας. Για κάθε μεταχείριση πραγματοποιήθηκαν 15 επαναλήψεις Είδος καρπού Άθικτοι καρποί¹ Μέσος όρος ± Τ.Σ. Δοκιμές ωοτοκίας Καρποί με τραύματα στο φλοιό¹ Καρποί με τραύματα στη σάρκα¹ Πορτοκάλι 5.00 ± 0.32αΓ 7.60 ± 0.41αΒ ± 0.73 αα Λεμόνι 1.87 ± 0.29βΒ 4.07 ± 0.64βΑ 2.60 ± 0.52γΑΒ Μανταρίνι 4.87± 0.50αΓ 7.20 ± 0.55αΒ ± 0.66 αα Νεράντζι 4.60 ± 0.51αΒ 7.67 ± 0.49αΑ 7.20 ± 0.66βΑ Γκρέιπφρουτ 2.20 ± 0.24βΒ 4.67 ± 0.57βΑ 4.33 ± 0.48γΑ F= Β.Ε=2,42 P<0.001 F=4.872 Β.Ε=2,42 P=0.013 F= Β.Ε=2,42 P<0.001 F=8.629 Β.Ε=2,42 P=0.001 F= Β.Ε=2,42 P<0.001 Μέσο ποσοστό ± Τ.Σ. Ποσοστό (%) δοκιμών ωοτοκίας στα τραύματα επί του συνόλου Τραύματα στο φλοιό² Τραύματα στη σάρκα² ± ± 2.00α ± ± 5.47γ ± ± 3.76α ± ± 7.18β ± ± 6.16α F χ² Β.Ε 4,70 4,70 4, P <0.001 <0.001 < <0.001 Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο πεζό γράμμα και μέσοι οροί σε κάθε γραμμή ακολουθούνται από το ίδιο κεφαλαίο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, ¹Τukey s HSD κριτήριο, ²Mann-Whitney U-κριτήριο). 55

70 στα μανταρίνια και τα γκρέιπφρουτ (t = 0.490, Β.Ε = 28, Ρ = και t = 1.639, Β.Ε = 28, Ρ = αντίστοιχα). Τα ποσοστά επί των συνολικών δοκιμών ωοτοκίας που έλαβαν χώρα στα τραύματα της σάρκας των διαφορετικών εσπεριδοειδών συσχετίστηκαν αρνητικά με την οξύτητα του χυμού τους (r p = , Β.Ε = 3, P = 0.003). Δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ της προηγούμενης παραμέτρου και των διαλυτών στερεών συστατικών του χυμού (Δ.Σ.Σ) ή της αναλογίας Δ.Σ.Σ/οξύτητα (r p = 0.605, Β.Ε = 3, P = και r p = 0.737, Β.Ε = 3, P = αντίστοιχα). Οι δοκιμές ωοτοκίας στους άθικτους καρπούς που κατέληξαν σε απόθεση αυγών κυμάνθηκαν από 7.22 έως 70.55% και διέφεραν σημαντικά μεταξύ των εσπεριδοειδών (Πίνακας 7). Τα ποσοστά αυτά σχετίστηκαν αρνητικά με τη σκληρότητα του φλοιού των καρπών (r p = , Β.Ε = 3, P = 0.007) όχι όμως και με την πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων (r p = , Β.Ε = 3, P = 0.769). Τα ποσοστά των επιτυχημένων δοκιμών ωοτοκίας στους καρπούς που έφεραν τραύματα στο φλοιό κυμάνθηκαν από έως 98.15% σε αυτά και δε διέφεραν μεταξύ των εσπεριδοειδών (Πίνακας 7). Στην ίδια κατηγορία καρπών τα αντίστοιχα ποσοστά σε άθικτη επιφάνεια κυμάνθηκαν από έως 91.67%. Στους καρπούς που έφεραν τραύματα έως τη σάρκα, τα ποσοστά των επιτυχημένων δοκιμών ωοτοκίας που πραγματοποιήθηκαν σε αυτά ήταν ιδιαίτερα υψηλά (>90%) και δε διέφεραν μεταξύ των εσπεριδοειδών. Τα αντίστοιχα ποσοστά σε άθικτη επιφάνεια κυμάνθηκαν μεταξύ και 74.07% και δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών καρπών. Το είδος των καρπών και η παρουσία (ή μη) των τραυμάτων επηρέασαν σημαντικά, το χρόνο που μεσολάβησε κατά την πρώτη επιτυχημένη δοκιμή ωοτοκίας των θηλυκών σε κάθε επανάληψη, ενώ σημαντική ήταν και η αλληλεπίδρασής τους (Πίνακας 4). Στους άθικτους καρπούς ο χρόνος αυτός κυμάνθηκε από 3.86 έως λεπτά και παρουσίασε σημαντικές διαφορές μεταξύ των εσπεριδοειδών (Πίνακας 8), ενώ υπήρξε σημαντική θετική συσχέτισή του με τη σκληρότητα του φλοιού των εσπεριδοειδών (r p = 0.987, Β.Ε = 3, P = 0.002). Η ωοτοκία στα τραύματα τόσο του φλοιού όσο και της σάρκας μείωσε σημαντικά τη διάρκεια απόθεσης των αυγών σε σχέση με την προηγούμενη περίπτωση σε όλα τα είδη των εσπεριδοειδών (Πίνακας 8). Ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκε κατά την πρώτη επιτυχημένη δοκιμή ωοτοκίας των θηλυκών σε κάθε επανάληψη επηρεάστηκε σημαντικά τόσο από το είδος του καρπού όσο και από την παρουσία (ή μη) των τραυμάτων, χωρίς ωστόσο 56

71 Πίνακας 7. Δοκιμές ωοτοκίας θηλυκών της μύγας Μεσογείου που κατέληξαν σε απόθεση αυγών σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών και σε καρπούς που έφεραν τεχνητά τραύματα που είτε περιορίζονταν στο φλοιό είτε έφταναν μέχρι τη σάρκα σε πειράματα μη επιλογής. Κάθε επανάληψη περιελάμβανε 5 θηλυκά και είχε διάρκεια μιας ώρας. Για κάθε μεταχείριση πραγματοποιήθηκαν 15 επαναλήψεις Μέσο ποσοστό ± Τ.Σ. Είδος καρπού Άθικτοι καρποί Καρποί με τραύματα στο φλοιό Σε τραύματα Σε άθικτη επιφάνεια Καρποί με τραύματα στη σάρκα Σε τραύματα Σε άθικτη επιφάνεια Πορτοκάλι ± 3.52β ± ± 10.60βγ ± ± Λεμόνι 7.22 ± 4.06γ ± ± 13.96γ ± Μανταρίνι ± 2.58α ± ± 5.89 α ± ± Νεράντζι ± 4.13β ± ± 14.07βγ ± ± 7.83 Γκρέιπφρουτ ± 7.13α ± ± 10.54αβ ± ± χ² Β.Ε P < Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, Mann-Whitney U-κριτήριο). 57

72 Πίνακας 8. Διάρκεια ωοτοκίας θηλυκών της μύγας Μεσογείου που κατέληξαν σε απόθεση αυγών σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών και σε καρπούς που έφεραν τεχνητά τραύματα που είτε περιορίζονταν στο φλοιό είτε έφταναν μέχρι τη σάρκα Είδος καρπού Διάρκεια ωοτοκίας (σε min) ± Τ.Σ. Άθικτοι καρποί Καρποί με τραύματα στο φλοιό¹ Καρποί με τραύματα στη σάρκα¹ Πορτοκάλι 7.07 ± 0.34βΑ 3.93 ± 0.32αΒ 3.46 ± 0.34Β F= Β.Ε=2,42 P<0.001 Λεμόνι ± 0.88αΑ 5.44 ± 0.42βΒ 3.73 ± 0.67Β F= Β.Ε=2,17 P<0.001 Μανταρίνι 3.86 ± 0.31γΑ 3.72 ± 0.35αΑ 2.61 ± 0.17Β F=6.126 Β.Ε=2,40 P=0.005 Νεράντζι 7.10 ± 0.40βΑ 4.07 ± 0.33αΒ 2.58 ± 0.28Γ F= Β.Ε=2,36 P<0.001 Γκρέιπφρουτ 4.89 ± 0.43γΑ 2.80 ± 0.28αΒ 2.89 ± 0.16Β F= Β.Ε=2,38 P<0.001 F Β.Ε 4,57 4,64 4,52 P <0.001 < Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο πεζό γράμμα και μέσοι οροί σε κάθε γραμμή ακολουθούνται από το ίδιο κεφαλαίο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, Τukey s HSD κριτήριο). 58

73 να παρατηρηθεί σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο παραγόντων (Πίνακας 4). Στην περίπτωση των άθικτων καρπών, τα θηλυκά απέθεσαν λιγότερα αυγά στα λεμονιά και τα γκρέιπφρουτ σε σχέση με τους υπόλοιπους καρπούς (Πινάκας 9). Η ωοτοκία στα τραύματα του φλοιού αύξησε γενικά τον αριθμό των αυγών που αποτέθηκε σε όλες τις περιπτώσεις σε σχέση με την προηγούμενη μεταχείριση (άθικτοι καρποί), ωστόσο οι διαφορές ήταν σημαντικές μόνο στην περίπτωση των μανταρινιών, των νεραντζιών και των γκρέιπφρουτ. Τέλος, ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκε στα τραύματα που έφταναν μέχρι τη σάρκα συσχετίστηκε αρνητικά με την οξύτητα του χυμού των καρπών (r p = , Β.Ε = 3, P = 0.039) ενώ δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ της παραμέτρου αυτής και των διαλυτών στερεών συστατικών του χυμού (Δ.Σ.Σ) ή της αναλογίας Δ.Σ.Σ/οξύτητα (r p = 0.557, Β.Ε = 3, P = και r p = 0.704, Β.Ε = 3, P = αντίστοιχα). 59

74 Πίνακας 9. Αριθμός αυγών που αποτέθηκε από θηλυκά της μύγας Μεσογείου κατά την ωοτοκία τους σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών και σε καρπούς που έφεραν τεχνητά τραύματα που είτε περιορίζονταν στο φλοιό είτε έφταναν μέχρι τη σάρκα Είδος καρπού Μέσος αριθμός αυγών ± Τ.Σ. Άθικτοι καρποί¹ Καρποί με τραύματα στο φλοιό¹ Καρποί με τραύματα στη σάρκα² Πορτοκάλι 6.33 ± 0.81α 7.27 ± 0.58αβ 7.40 ± 0.80α F=0.615 Β.Ε=2,42 P=0.545 Λεμόνι 3.33 ± 0.33β 5.00 ± 0.70β 3.00 ± 0.41γ F=1.716 Β.Ε=2,17 P=0.209 Μανταρίνι 4.53 ± 0.36αβΒ 7.38 ± 0.56αβΑ 6.67 ± 0.30αΑ F= Β.Ε=2,40 P<0.001 Νεράντζι 5.33 ± 0.46αβΒ 8.20 ± 0.99αΑ 4.89 ± 0.45βΒ F=5.844 Β.Ε=2,36 P=0.006 Γκρέιπφρουτ 3.42 ± 0.20βΒ 4.92 ± 0.41βΑ 5.29 ± 0.45βΑ F=7.201 Β.Ε=2,38 P=0.002 F χ² Β.Ε 4,57 4,64 4 P Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο πεζό γράμμα και μέσοι οροί σε κάθε γραμμή ακολουθούνται από το ίδιο κεφαλαίο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, ¹Τukey s HSD κριτήριο,²mann-whitney U-κριτήριο). 60

75 3.6 Συζήτηση Από τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου προέκυψε μια σαφής ιεραρχία ως προς την προτίμηση ωοτοκίας των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου μεταξύ των ειδών των εσπεριδοειδών που μελετήθηκαν. Ωστόσο, η επιβίωση των προνυμφών στους αντίστοιχους καρπούς δε βρέθηκε να συμβαδίζει απόλυτα με τις αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών. Από τα πειράματα της οπτικής παρατήρησης προέκυψε ότι η σκληρότητα του φλοιού των καρπών φαίνεται να αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο κατά την απόθεση των αυγών στα εσπεριδοειδή, αυξάνοντας το χρόνο και πιθανότητα την ενέργεια που απαιτείται για την ολοκλήρωση της κάθε προσπάθειας. Ωστόσο, τα θηλυκά φαίνεται να έχουν αναπτύξει μια σειρά από συμπεριφορές που σχετίζονται με τη χρήση των τραυμάτων σε αυτή την κατηγορία των ξενιστών που αφενός διευκολύνουν την αξιοποίησή τους (απόθεση αυγών) και αφετέρου φαίνεται να συνδέονται με σημαντικές παραμέτρους της αρμοστικότητας (fitness) των απογόνων τους όπως εξηγείται παρακάτω. Στα πειράματα επιλογής, τα θηλυκά έδειξαν σαφή προτίμηση στα πορτοκάλια και ακολούθησαν τα μανταρίνια και τα νεράντζια, ενώ τα γκρέιπφρουτ και τα λεμόνια κατέλαβαν τις τελευταίες θέσεις της ιεραρχίας. Με βάση τις οπτικές παρατηρήσεις στους άθικτους καρπούς, η προτίμηση που προέκυψε, φαίνεται να ήταν το αποτέλεσμα μιας σειράς από συμπεριφορές που σχετίζονταν με την προσέλκυση, την αποδοχή για ωοτοκία μετά την άφιξή των θηλυκών στους καρπούς και την απόθεση διαφορετικού αριθμού αυγών μεταξύ των εσπεριδοειδών όταν οι δοκιμές κατέληγαν σε επιτυχία. Οι διαπιστώσεις αυτές έρχονται σε πλήρη συμφωνία με εκείνες των Muthuthantri & Clarke (2012) που αφορούσαν τη συμπεριφορά ωοτοκίας του Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae) σε διαφορετικά είδη και ποικιλίες εσπεριδοειδών. Σε αντιστοιχία με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, οι Staub και συνεργάτες (2008) διαπίστωσαν μεγαλύτερη προτίμηση ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου σε καρπούς πορτοκαλιών σε σχέση με μανταρίνια, ενώ στα λεμόνια η απόθεση των αυγών ήταν πολύ μικρή. Οι Papachristos & Papadopoulos (2009) χρησιμοποιώντας άγρια έντομα διαπίστωσαν ιδιαίτερη προτίμηση ως προς τα νεράντζια, χωρίς ωστόσο να παρατηρήσουν σημαντικές διαφορές σε σχέση με ορισμένες ποικιλίες πορτοκαλιών. Στη συγκεκριμένη μελέτη και πάλι τα λεμόνια ήταν ο ξενιστής με τη μικρότερη προτίμηση. Τέλος, οι Prokopy και συνεργάτες (1984) μελετώντας τη συμπεριφορά άγριων και εργαστηριακών πληθυσμών της μύγας της Μεσογείου σε διάφορους ξενιστές, διαπίστωσαν περιορισμένη αποδοχή για ωοτοκία ως προς τα γκρέιπφρουτ. Η προτίμηση που παρατηρήθηκε στην 61

76 παρούσα μελέτη δε σχετίστηκε με φυσικοχημικές παραμέτρους των καρπών όπως το μέγεθος, η σκληρότητα του φλοιού τους και η πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων που έφεραν. Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα της πιθανής εμπλοκής άλλων παραγόντων. Για παράδειγμα, το χρώμα, η υφή της επιφάνεια του φλοιού και η διαφορετική χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων των καρπών θα μπορούσαν να συγκαταλέγονται μεταξύ αυτών. Πράγματι, το χρώμα θα μπορούσε να έχει παίξει ρόλο καθώς διέφερε στα λεμόνια και τα γκρέιπφρουτ (κίτρινο) σε σχέση με τους υπόλοιπους καρπούς. Επίσης, όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα του 4 ου Κεφαλαίου, η χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών μπορεί να επηρεάζει σημαντικά τις αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών. Ανεξαρτήτως της προτίμησης ωοτοκίας που παρατηρήθηκε, η μεγαλύτερη επιβίωση των προνυμφών καταγράφηκε στα μανταρίνια και ακολούθησαν τα νεράντζια και τα γκρέιπφρουτ. Αντιθέτως, στα πορτοκάλια η επιβίωση ήταν ιδιαιτέρως μικρή ενώ στα λεμόνια σχεδόν μηδενική. Τα μανταρίνια και τα νεράντζια θεωρούνται γενικά ευπαθείς ξενιστές της μύγας της Μεσογείου (Back & Pemberton, 1915; Eskafi, 1988; Τζανακάκης & Κατσόγιανvος, 1998; Katsoyannos et al., 1998) ενώ το ίδιο ισχύει και για τα γκρέιπφρουτ (Back & Pemberton, 1918; Rössler & Greany, 1990). Σε ότι αφορά τα πορτοκάλια, αυτά φαίνεται να εμφανίζουν μέτρια έως μικρή ευπάθεια αναλόγως της ποικιλίας (Rössler & Greany, 1990; Katsoyannos et al., 1998), ενώ τα λεμόνια θεωρούνται ουσιαστικά απρόσβλητα από το έντομο και μόνο υπερώριμοι καρποί με αλλοιώσεις της επιφάνειάς τους που παραμένουν στα δέντρα μπορεί να εμφανίσουν μικρά ποσοστά προσβολής (Spitler et al., 1984). Οι Back & Pemberton (1915) απέδωσαν εν μέρει τη μεγάλη ανθεκτικότητα των καρπών των εσπεριδοειδών στις προσβολές από μύγα της Μεσογείου στα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας των αυγών εξαιτίας των αιθέριων ελαιών ελαίων του φλοιού. Ωστόσο, νεότερες μελέτες (Carey, 1984; Papachristos et al., 2008), καταρρίπτουν την άποψη αυτή, ενώ και από τα στοιχεία της συγκεκριμένης μελέτης δε φάνηκε να προκύπτει κάτι τέτοιο, καθώς η εκκόλαψη των προνυμφών κυμάνθηκε πάνω από 80% μετά από εικοσιτέσσερις ώρες παραμονής των αυγών στους καρπούς. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, η επιβίωση των προνυμφών στα διαφορετικά είδη των εσπεριδοειδών συσχετίστηκε αρνητικά με τη σκληρότητα του φλοιού τους. Σε αντίστοιχα συμπεράσματα κατέληξε και ο Eskafi (1988) μελετώντας τα επίπεδα προσβολής στη φύση ώριμων και ημιώριμων εσπεριδοειδών από είδη της οικογένειας Tephritidae συμπεριλαμβανομένης και της μύγας της Μεσογείου. Με βάση παλαιότερες αλλά και πιο πρόσφατες μελέτες 62

77 οι σημαντικότεροι παράγοντες που καθορίζουν την επιβίωση των νέοεκκολαπτόμενων προνυμφών της μύγας της Μεσογείου στους καρπούς των εσπεριδοειδών φαίνεται να είναι: α) τα αιθέρια έλαια των ελαιογόνων αδένων που εδράζονται στη περιοχή του flavedo και β) η σκληρότητα του σπογγώδους albedo που δυσχεραίνει τη μετακίνηση των προνυμφών προς τη σάρκα που αποτελεί και το υπόστρωμα ανάπτυξής τους (Back & Pemberton, 1915; Bodenheimer, 1951; Greany, 1989; Papachristos et al., 2008). Στο πλείστο των περιπτώσεων, η απόθεση των αυγών στην περιοχή του flavedo προκαλεί πλήρη θανάτωση του συνόλου των νέοεκκολαπτόμενων προνυμφών λόγω της έκθεσής τους στα αιθέρια ελαία και μόνο οι προνύμφες των αυγών που αποτίθενται κάτω από αυτό έχουν πιθανότητες να επιβιώσουν μετακινούμενες μέσω του albedo προς τη σάρκα (Papachristos et al., 2008). Γίνεται έτσι αντιληπτό, ότι η κατανομή των αυγών στις δύο αυτές περιοχές του φλοιού είναι καθοριστική για την επιτυχή προσβολή των εσπεριδοειδών. Ωστόσο, τα θηλυκά της μύγας της Μεσογείου στο πλείστο των περιπτώσεων, έχουν την ικανότητα να τοποθετούν ένα μεγάλο μέρος των αυγών τους στην περιοχή του albedo, αποφεύγοντας έτσι τις τοξικές επιδράσεις των αιθέριων ελαίων (Spitler et al., 1984; Papachristos & Papadopoulos, 2009). Χαρακτηριστικό αυτού, είναι το γεγονός ότι από το σύνολο των αυγών που απόθεσαν τα θηλυκά στα πειράματα παρατήρησης στους άθικτους καρπούς ένα ποσοστό της τάξης του 70 (λεμόνια) έως 95.8% (μανταρίνια) ανακτήθηκε από την περιοχή του albedo. Σε αυτό ίσως να συνέβαλλε και το γεγονός ότι στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν νεαρά έντομα (ηλικίας 14 ημερών) που ενδεχομένως η φυσιολογική τους κατάσταση να τους επέτρεπε την τοποθέτηση του πλείστου των αυγών τους κάτω από την περιοχή του flavedo. Η ικανότητα των θηλυκών να αποθέτουν αυγά σε άθικτους καρπούς εσπεριδοειδών φάνηκε να συνδέεται στενά με τη σκληρότητα του φλοιού τους. Ειδικότερα, τα ποσοστά επιτυχίας των δοκιμών ωοτοκίας ήταν υψηλά στους καρπούς με μαλακό φλοιό (μανταρίνια, γκρέιπφρουτ) και παρουσίασαν σταδιακή μείωση με την αύξηση της σκληρότητας (πορτοκάλια, νεράντζια και λεμόνια). Παρά την εξειδικευμένη μορφολογία του ωοθέτη τους και την ενδεχομένη προσαρμογή ως προς τους ξενιστές τους, πολλά είδη της οικογένειας Tephritidae αντιμετωπίζουν δυσκολίες ως προς τη διάτρηση των καρπών κατά τη διάρκεια της ωοτοκίας τους (Jones & Kim, 1994 και πηγές που αναφέρουν). Ως κυριότερες αιτίες αναφέρονται ο βαθμός ωριμότητας των καρπών που σχετίζεται άμεσα με τη σκληρότητά τους, η ηλικία των θηλυκών που έχει να κάνει με τη γενικότερη φυσιολογική τους κατάσταση και ευρωστία και οι πιθανές φθορές στη δομή του 63

78 ωοθέτη ως αποτέλεσμα της εκτεταμένης χρήσης του κατά τη διάτρηση και σήμανση των καρπών με φερομόνη αποτροπής ωοτοκίας. Οι Back & Pemberton (1915) μελετώντας την προσβολή διαφορετικών ειδών εσπεριδοειδών από τη μύγα της Μεσογείου στο ύπαιθρο, διαπίστωσαν ότι ένα σημαντικό ποσοστό των νυγμάτων ωοτοκίας που έφεραν ήταν άγονα (χωρίς αυγά), γεγονός που αποδεικνύει ότι οι δοκιμές ωοτοκίας των θηλυκών στους συγκεκριμένους ξενιστές συχνά δε στέφονται με επιτυχία. Οι Papachristos & Papadopoulos (2009) απέδωσαν το φαινόμενο αυτό σε πιθανές τοξικές/αποτρεπτικές επιδράσεις των αιθέριων ελαίων του φλοιού στα θηλυκά όταν ο ωοθέτης έρχεται σε επαφή με υψηλές συγκεντρώσεις τους. Ωστόσο, κάτι τέτοιο δε φάνηκε να προκύπτει από την παρούσα μελέτη καθώς δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της πυκνότητας των ελαιογόνων αδένων των καρπών και του αντίστοιχου ποσοστού των δοκιμών ωοτοκίας που κατέληξαν σε επιτυχία. Αυτό πιθανότατα ίσως να οφείλεται στο ότι οι ποικιλίες των εσπεριδοειδών που χρησιμοποιήθηκαν στα εν λόγω πειράματα χαρακτηρίζονταν από μικρότερη πυκνότητα ελαιογόνων αδένων σε σχέση με εκείνες που χρησιμοποίησαν οι Papachristos & Papadopoulos (2009). Σε υποστήριξη των αποτελεσμάτων που προέκυψαν, οι Dukas και συνεργάτες (2001) αναφέρουν δυσκολίες της μύγας της Μεσογείου κατά τη διάτρηση του φλοιού καρπών κουμκουάτ. Αντίστοιχα, οι Rössler & Greany (1990) διαπίστωσαν ότι καρποί εσπεριδοειδών που δέχτηκαν μεταχείριση με γιβεριλικό οξύ, ένα ρυθμιστής ανάπτυξης του επιβραδύνει τη γήρανση και το μαλάκωμα του φλοιού, έφεραν περισσότερα άγονα νύγματα σε σχέση με το μάρτυρα κατά την ωοτοκία τους από τη μύγα της Μεσογείου, γεγονός που ισχυροποιεί την άποψη ότι η σκληρότητα του φλοιού παίζει σημαντικό ρόλο στη ικανότητα των θηλυκών να αποθέτουν με επιτυχία τα αυγά τους. Τέλος, το γεγονός ότι η σκληρότητα του φλοιού δε φάνηκε να επηρεάζει την απόθεση των αυγών στους καρπούς στα πειράματα πολλαπλής επιλογής θα πρέπει να αποδοθεί στην επανειλημμένη χρήση των νυγμάτων ωοτοκίας από τα θηλυκά. Τα επιφανειακά τραύματα στο φλοιό των καρπών, που απελευθέρωναν μικρές ποσότητες αιθέριων ελαίων, δε βρέθηκε να αυξάνουν την προσέλκυση των θηλυκών σε σχέση με τους άθικτους καρπούς. Η διαπίστωση αυτή συμφωνεί απόλυτα με αντίστοιχα πειράματα στο ύπαιθρο που αφορούσαν καρπούς πορτοκαλιών (Papaj et al., 1989a). Ομοίως, οι Katsoyannos και συνεργάτες (1997) δεν παρατήρησαν προσέλκυση των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου σε καρπούς εσπεριδοειδών που έφεραν επιφανειακά τραύματα στο φλοιό, αποδεικνύοντας ότι τα οσμηρά ερεθίσματα των αιθέριων ελαιών δεν επιφέρουν θετικές μεταβολές ως προς την ανταπόκριση. Ωστόσο, όπως προέκυψε από την 64

79 παρούσα μελέτη, τα θηλυκά μετά την άφιξή τους στους επιφανειακά πληγωμένους καρπούς, επέδειξαν εντονότερη δραστηριότητα ωοτοκίας σε σχέση με τους άθικτους καρπούς, που επικεντρώθηκε ως επί το πλείστο στη χρήση των τραυμάτων σε όλα ανεξαιρέτως τα είδη των εσπεριδοειδών. Γενικά, η ωοτοκία στα επιφανειακά τραύματα των καρπών σε σχέση με εκείνη τους άθικτους καρπούς, χαρακτηρίστηκε από μια σειρά σημαντικών πλεονεκτημάτων για τα θηλυκά που συνίσταντο στα υψηλότερα ποσοστά επιτυχών δοκιμών ωοτοκίας (Πινάκας 7), στη σημαντικά μικρότερη χρονική περίοδο που απαιτούνταν για την απόθεση των αυγών (Πινάκας 8) και στην αύξηση του αριθμού των αυγών που αποθέτονταν σε κάθε ωοτοκία (Πινάκας 9). Αντίστοιχα πλεονεκτήματα από τη χρήση τέτοιων τραυμάτων αναφέρουν και οι Papaj και συνεργάτες (1996) για διάφορα είδη της οικογένειας Tephritidae. Ωστόσο, στην περίπτωση των εσπεριδοειδών, η αξιοποίηση των επιφανειακών τραυμάτων, φαίνεται να είναι επωφελής μονό για τα θηλυκά, καθώς οι προνύμφες που θα προκύψουν θα πρέπει να διασχίσουν το φλοιό προκειμένου να φτάσουν στη σάρκα με σημαντικό κόστος για την επιβίωσή τους (Papaj et al., 1989a). Tα τραύματα στη σάρκα που απελευθέρωναν μικρές ποσότητες χυμού στην επιφάνεια αύξησαν σημαντικά την προσέλκυση των θηλυκών σε σχέση με τις άλλες δύο κατηγορίες καρπών (άθικτοι, επιφανειακά τραυματισμένοι). Το γεγονός αυτό έρχεται σε πλήρη αντιστοιχία με προηγούμενες μελέτες που αναφέρουν έντονη προσελκυστική δράση του χυμού των εσπεριδοειδών και στα δύο φύλα (Papaj et al., 1989a; Katsoyannos et al., 1997). Ωστόσο, μετά την άφιξη των θηλυκών στους καρπούς, οι χημικές ιδιότητες του χυμού και συγκεκριμένα η οξύτητα καθόρισαν την αξιοποίηση των τραυμάτων ως θέσεις ωοτοκίας επιδρώντας σε δύο επίπεδα. Το πρώτο αφορούσε τις αποφάσεις των θηλυκών να αποθέσουν ή όχι τα αυγά τους στα τραύματα και το δεύτερο τον αριθμό των αυγών που απέθεταν σε αυτά. Το γεγονός ότι η οξύτητα του χυμού των καρπών συσχετίστηκε αρνητικά τόσο με τα ποσοστά επί των συνολικών των δοκιμών ωοτοκίας που πραγματοποιήθηκαν στα τραύματα όσο και με τον αριθμό των αυγών που αποτέθηκε σε αυτά, φαίνεται να αποδίδεται σε αρνητικές επιδράσεις της παραμέτρου αυτής στην αρμοστικότητα (fitness) των απογόνων. Πράγματι, αν και η οξύτητα της σάρκας των εσπεριδοειδών δεν αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για την επιβίωση των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου, εντούτοις έχει σημαντικές αρνητικές επιπτώσεις τόσο στη διάρκεια της ανάπτυξής τους όσο και στο βάρος των νυμφών που προκύπτουν (Papachristos et al., 2008). Με βάση τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό ότι οι αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών στην περίπτωση των τραυμάτων στη σάρκα είχαν ως γνώμονα την ποιότητα του 65

80 υποστρώματος που καλούνταν να αναπτυχθούν οι προνύμφες τους. Αντίστοιχα, οι Papaj και συνεργάτες (1989b, 1990) χρησιμοποιώντας ως ποιοτικό χαρακτηριστικό του υποστρώματος (ξενιστή) ανάπτυξης των προνυμφών την παρουσία ή όχι φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας (η παρουσία σηματοδοτεί πιθανές συνθήκες αυξημένου ανταγωνισμού για τους απογόνους με αρνητικές επιπτώσεις για την αρμοστικότητά τους) διαπίστωσαν μειωμένη διάθεση των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου να ωοτοκήσουν στους σημασμένους με φερομόνη καρπούς ενώ στις περιπτώσεις που το έπραξαν, απέθεσαν σημαντικά λιγότερα αυγά κατά την ωοτοκία τους σε σχέση με τους καρπούς που δεν έφεραν φερομόνη. Ο μηχανισμός που καθόριζε τις αποφάσεις για την αποδοχή ή όχι των τραυμάτων φαίνεται να ήταν η επαφή του χυμού με τα στοματικά μόρια των εντόμων. Χαρακτηριστική ήταν η αποστροφή των θηλυκών όταν έρχονταν σε επαφή με τους όξινους χυμούς των νεραντζιών και κυρίως των λεμονιών. Ωστόσο, άγνωστος παραμένει ο μηχανισμός που καθόριζε τον αριθμό των αυγών που αποθέτονταν μετά την είσοδο του ωοθέτη στα τραύματα. Οι αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών στην περίπτωση αυτή θα μπορούσαν να ήταν είτε προειλημμένες μετά την επαφή των στοματικών μορίων με το χυμό είτε να βασίζονταν σε τελικές πληροφορίες που προέρχονταν από αισθητήρια όργανα του ωοθέτη. Η ικανότητα αντίληψης της οξύτητας των καρπών ξενιστών από αισθητήρια του ωοθέτη έχει επιβεβαιωθεί για τουλάχιστον ένα είδος της οικογένεια Tephritidae, το Rhagoletis pomonella (Walsh) (Crnjar et al., 1989) και δεν αποκλείεται κάτι αντίστοιχο να συνέβαινε και στη συγκεκριμένη περίπτωση. Η προσαρμογή των αποφάσεων ωοτοκίας των θηλυκών ανάλογα με την οξύτητα της σάρκας των εσπεριδοειδών πιθανότατα να αφορά και σε άλλους ξενιστές του εντόμου, καθώς η συγκεκριμένη παράμετρος αποτελεί γενικό χαρακτηριστικό των καρπών. Περαιτέρω μελέτες ως προς αυτή την κατεύθυνση αυτή ίσως αποκαλύψουν την ύπαρξη ενός ευρύτερου μηχανισμού που βασίζεται στη συγκεκριμένη παράμετρο βελτιστοποιώντας τις αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών προς όφελος των απογόνων τους. Ένα ενδιαφέρον φαινόμενο που παρατηρήθηκε στις περιπτώσεις των καρπών που ενώ έφεραν τραύματα έως τη σάρκα η δραστηριότητα ωοτοκίας δεν επικεντρώθηκε σε αυτά, όπως συνέβη στα λεμόνια και σε μικρότερο βαθμό στα νεράντζια, ήταν τα αυξημένα ποσοστά επιτυχημένων δοκιμών ωοτοκίας σε με μη τραυματισμένα σημεία σε σχέση με τα αντίστοιχα ποσοστά στους άθικτους καρπούς (Πινάκας 7). Το γεγονός αυτό θα πρέπει πιθανότατα να αποδοθεί σε διεγερτικές (της ωοτοκίας) επιδράσεις που προκαλούσαν τα οσμηρά ερεθίσματα του χυμού που υπήρχε στην επιφάνεια των καρπών, όπως άλλωστε αποδεικνύεται και από άλλες μελέτες (Κουλούσης και συνεργάτες, 2003). 66

81 Χαρακτηριστική ήταν η τάση των θηλυκών να προσπαθούν να αποθέσουν αυγά στα τοιχώματα των κλουβιών της παρατήρησης αμέσως μετά την είσοδο καρπών που έφεραν τραύματα έως τη σάρκα κάτι που δεν παρατηρήθηκε στις δύο άλλες περιπτώσεις (άθικτοι, επιφανειακά τραυματισμένοι). Συνοψίζοντας τα ευρήματα του παρόντος Κεφαλαίου προκύπτει ότι οι αποφάσεις ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου ως προς τα διαφορετικά είδη των εσπεριδοειδών δε συνοδεύονται πάντα από αυξημένη επιβίωση των απογόνων. Το ίδιο ισχύει και για άλλα πολυφάγα είδη της οικογένειας Tephritidae όπως το Bactrocera tryoni (Muthuthantri & Clarke, 2012). Ωστόσο, κάτι τέτοιο δεν είναι εντελώς παράδοξο για είδη που έχουν εξελιχτεί να προσβάλουν ένα μεγάλο εύρος ξενιστών που διαφέρουν ως προς τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους και τους αμυντικούς μηχανισμούς του διαθέτουν (Krainacker et al., 1987). Τα αποτελέσματα αναφορικά με την ικανότητα επιβίωσης στα διαφορετικά είδη των εσπεριδοειδών, θα μπορούσαν να συμβάλλουν σημαντικά στην καλύτερη κατανόηση των επιπέδων προσβολής στο ύπαιθρο και στη δυναμική των πληθυσμών του εντόμου συντελώντας στην ορθότερη λήψη μέτρων για τη αντιμετώπισή του. Επιπλέον, μηχανισμοί που προσδίδουν ανθεκτικότητα στις προσβολές όπως η σκληρότητα του φλοιού θα μπορούσαν να ενισχυθούν με τη χρήση ρυθμιστών ανάπτυξης όπως για παράδειγμα το γιβεριλικό οξύ. Τέλος, παρά το γεγονός ότι οι καρποί των εσπεριδοειδών δε φαίνεται να αποτελούν ιδιαίτερα ευνοϊκούς ξενιστές τόσο για την ωοτοκία όσο και για την επιβίωση της μύγας της Μεσογείου, εντούτοις προκύπτει ότι τα θηλυκά έχουν αναπτύξει μια σειρά από συμπεριφορές που διευκολύνουν την αξιοποίησή τους προς όφελος των ιδίων και των απογόνων τους. 67

82 Βιβλιογραφία Back, E.A. & Pemberton, C.E. (1915) Susceptibility of citrus fruits to the attack of the Mediterranean fruit fly. Journal of Agricultural Research, 3, Back, E. A., & Pemberton, C. E. (1918) The Mediterranean fruit fly in Hawaii (No. 536). US Department of Agriculture. Βασιλακάκης, Μ. & Θεριός, Ι. (1996). Μαθήματα ειδικής δενδροκομίας: Εσπεριδοειδή. Εκδόσεις Γαρταγάνης, Θεσσαλινίκη. Bateman, M.A. (1972) The ecology of fruit flies. Annual Review of Entomology, 17, Birke, A., Aluja, M., Greany, P. et al. (2006) Long aculeus and behavior of Anastrepha ludens render gibberellic acid ineffective as an agent to reduce Ruby Red grapefruit susceptibility to the attack of this pestiferous fruit fly in commercial groves. Journal of Economic Entomology, 99, Bodenheimer, F.S. (1951) Citrus Entomology in the Middle East: With Special References to Egypt, Iran, Irak, Palestine, Syria and Turkey. W. Junk, The Hague, The Netherlands. Carey. J.R. (1984) Host-specific demographic studies of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Ecological Entomology, 9, Christenson, L.D. & Foote, R.H. (1960) Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology, 5, Crnjar, R., Angiou, A., Pietra, P. et al. (1989) Electrophysiological studies of gustatory and olfactory responses of the sensilla on the ovipositor of the apple maggot fly, Rhagoletis pomonella Walsh. Bolletino di Zoologia, 56, Díaz-Fleischer, F., Papaj, D.R., Prokopy, R.J. et al. (2000) Evolution of fruit fly oviposition behavior. Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior (ed. by M. Aluja and A.L. Norrbom), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. Dukas, R., Prokopy, R.J. & Duan, J.J. (2001) Effects o larval competition on survival and growth in Mediterranean fruit flies. Ecological Entomology, 26, Eskafi, F.M. (1988) Infestation of citrus by Anastrepha spp. and Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) in high coastal plains of Guatemala. Environmental Entomology, 17, Greany, P.D. (1989) Host plant resistance to tephritids: an under-exploited control strategy. Fruit flies: Their Biology, Natural Enemies and Control, Vol. 3A (ed. 68

83 by A.S. Robinson and G. Hooper), pp Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. Jones, S. R. & Kim, K.C. (1994) Aculeus wear and oviposition in four species of Tephritidae (Diptera). Annals of the Entomological Society of America, 87, Katsoyannos, B.I., Kouloussis, N.A. & Papadopoulos, N.T. (1997) Response of Ceratitis capitata to citrus chemicals under semi-natural conditions. Entomologia Experimentalis et Applicata, 82, Katsoyannos, B.I., Kouloussis N.A. & Carey, J.R. (1998) Seasonal and annual occurrence of Mediterranean fruit flies (Diptera: Tephritidae) on Chios island, Greece: Differences between two neighboring citrus orchards. Annals of the Entomological Society of America, 91, Κουλούσης, Ν.Α., Κατσόγιαννος, Β.Ι., Παπαδόπουλος, Ν.Θ. και συν. (2003) Επίδραση οσμών από χυμούς διαφόρων εσπεριδοειδών στην ωοτοκία της μύγας της Μεσογείου. Περιλήψεις ανακοινώσεων 10 ου Πανελλήνιου Εντομολογικού Συνεδρίου. σ. 29. Krainacker, D.A, Carey, J.R. & Vargas, R.I. (1987) Effect of larval host on life history traits of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Oecologia, 73, Levinson, H.Z., Levinson, A.R. & Muller, K. (1990) Influence of some olfactory and optical properties of fruits on host location by the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata Wied). Journal of Applied Entomology, 109, Levinson, H., Levinson, A. & Eosterried, E. (2003) Orange-derived stimuli regulating oviposition in the Mediterranean fruit fly. Journal of Applied Entomology, 127, Mac Leay, W.S. (1829) Notice of Ceratitis citriperda, an insect very destructive to oranges. Zoological Journal, 4, Mavrikakis, P. G., Economopoulos, A.P. & Carey, J.R. (2000) Continuous winter reproduction and growth of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in Heraklion, Crete, Southern Greece. Environmental Entomology, 29, Muthuthantri, S. & Clarke, A. R. (2012) Five commercial citrus rate poorly as hosts of the polyphagous fruit fly Bactocera tryoni (Froggat) (Diptera: Tephritidae) in laboratory studies. Australian Journal of Entomology, 51, Papachristos, D.P. & Papadopoulos, N.T. (2009) Are citrus species favorable hosts for the Mediterranean fruit fly? A demographic perspective. Entomologia Experimentalis et Applicata, 132,

84 Papachristos, D.P., Papadopoulos, N.T. & Nanos, G.D. (2008) Survival and development of immature stages of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in citrus fruit. Journal of Economic Entomology, 101, Papaj, D.R. & Messing, R.H. (1996) Functional shifts in the use of parasitized hosts by a tephritid fly: the role of host quality. Behavioral Ecology, 7, Papaj, D.R., Katsoyannos, B.I. & Hendrichs, J. (1989a) Use of fruit wounds in oviposition by Mediterranean fruit flies. Entomologia Experimentalis et Applicata, 53, Papaj, D.R., Roitberg, B.D., Opp, S.B. (1989b) Serial effects of host infestation on egg allocation by the Mediterranean fruit fly: a rule of thumb and its functional significance. Journal of Animal Ecology, 58, Papaj, D.R., Roitberg, B.D., Opp, S.B. et al. (1990) Effect of marking pheromone on clutch size in the Mediterranean fruit fly. Physiological Entomology, 15, Prokopy, R.J., McDonald, P.T. & Wong, T.T.Y. (1984) Inter-population variation among Ceratitis capitata flies in host acceptance pattern. Entomologia Experimentalis et Applicata, 35, Rössler, Y. & Greany, P.D. (1990) Enhancement of citrus resistance to the Mediterranean fruit fly. Entomologia Experimentalis et Applicata, 54, Sokal, R. & Rohlf, F. (1995) Biometry, 3rd edn. WH Freeman & Company, New York, New York. Spitler, G.H., Armstrong, J.W. & Couey, H.M. (1984) Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) host status of commercial lemon. Journal of Economic Entomology, 77, Staub, C.G., De Lima, F. & Majer, J.D. (2008) Determination of host status of citrus fruits against the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Australian Journal of Entomology, 47, Τζανακάκης, Μ.Ε. & Κατσόγιαννος, Β.Ι. (1998) Έντομα καρποφόρων δέντρων και αμπέλου. Εκδόσεις Αγρότυπος, Αθήνα. 70

85 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 4. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ ΣΤΗΝ ΩΟΤΟΚΙΑ 4.1 Περίληψη Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι τα αιθέρια έλαια του φλοιού των εσπεριδοειδών αποτελούν το σημαντικότερο παράγοντα ανθεκτικότητας έναντι των προσβολών από τη μύγα της Μεσογείου. Παρά το γεγονός ότι τα θηλυκά διαθέτουν μια ιδιαίτερη ικανότητα στο να αντιλαμβάνονται τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά χαρακτηριστικά της χημικής τους σύστασης, παραμένει άγνωστος ο ρόλος τους στην ωοτοκία του εντόμου. Σκοπός του παρόντος Κεφαλαίου ήταν η μελέτη της επίδρασης των αιθέριων ελαίων από διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών καθώς επίσης και ορισμένων συστατικών τους στην ωοτοκία της μύγας της Μεσογείου. Σε πειράματα διπλής επιλογής θηλυκά απέθεσαν σημαντικά περισσότερα αυγά σε κοίλα, διάτρητα ημισφαίρια ωοτοκίας που περιείχαν 1μl αιθέριων ελαίων από καρπούς πορτοκαλιού, μανταρινιού, νεραντζιού, γκρέιπφρουτ και λεμονιού σε σχέση με άοσμα ημισφαίρια. Ωστόσο, πειράματα μη επιλογής αποκάλυψαν μια ασθενέστερη επίδραση των ελαίων του λεμονιού σε σχέση με τα άλλα εσπεριδοειδή και μια ισχυρότερη επίδραση των ελαίων του πορτοκαλιού. Η ωοπαραγωγή των θηλυκών στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού βρέθηκε να επηρεάζεται σημαντικά από την ένταση (δόση) των οσμών του. Από τα συστατικά των αιθέριων ελαίων που εξετάστηκαν, προέκυψε ότι το λιμονένιο (το κυρίαρχο από άποψη περιεκτικότητας συστατικό τους), διέγειρε την ωοπαραγωγή, ενώ η λιναλούλη (μια χαρακτηριστική ουσία των ανώριμων καρπών των εσπεριδοειδών που συνδέεται με υψηλή τοξικότητα έναντι των ανήλικων σταδίων ειδών της οικογένειας Tephritidae) είχε έντονη αποτρεπτική δράση. Τέλος, προκειμένου να μελετηθούν περαιτέρω οι διεγερτικές και αποτρεπτικές ιδιότητες των παραπάνω συστατικών, σε πειράματα μη επιλογής, θηλυκά αφέθηκαν να ωοτοκήσουν ως προς ίσιες ποσότητες (1μl) αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού και δύο τεχνητών μιγμάτων εκ των οποίων το ένα αποτελούνταν από 93% λιμονένιο (ποσοστό παραπλήσιο με εκείνο που υπήρχε στο έλαιο του πορτοκαλιού) και το άλλο από 93% λιμονένιο και 3% λιναλούλη (περίπου δεκαπλάσιο ποσοστό από εκείνο που υπήρχε στο έλαιο του πορτοκαλιού). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το περιεχόμενο του λιμονένιου εξηγούσε σε μεγάλο βαθμό (όχι όμως πλήρως) τη διεγερτική δράση που παρατηρήθηκε στο αιθέριο 71

86 έλαιο του πορτοκαλιού (και πιθανότατα και στα υπόλοιπα έλαια), ενώ τα υψηλά ποσοστά λιναλούλης περιόρισαν σημαντικά τις διεγερτικές επιδράσεις του συγκεκριμένου συστατικού (λιμονένιο). Αναλύονται η σημασία και η πρακτική εφαρμογή των ευρημάτων αναφορικά με την κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα χημικά χαρακτηριστικά του φλοιού των καρπών των εσπεριδοειδών επηρεάζουν την ωοτοκία της μύγα της Μεσογείου. 4.2 Εισαγωγή Η ανθεκτικότητα των εσπεριδοειδών στις προσβολές από τις μύγες των φρούτων αποδίδεται σε μια σειρά παραγόντων που έχουν να κάνουν με την τοξικότητα των αιθέριων ελαίων της περιοχής του flavedo, την έκκριση κόμμεος στα σημεία ωοτοκίας, τη φελοποίηση της κοιλότητας των αυγών με συνέπεια την πρόκληση ασφυξίας, το πάχος, την ελαστικότητα και τη μηχανική αντίσταση του φλοιού που εμποδίζει τη διείσδυση των προνυμφών προς την πιο θρεπτική σάρκα (Back & Pemberton, 1915; Bodenheimer, 1951; Spitler et al., 1984; Greany, 1989). Μια πρόσφατη μελέτη καταδεικνύει ότι τα αιθέρια έλαια αποτελούν το σημαντικότερο παράγοντα που επιφέρει ανθεκτικότητα στις προσβολές από τη μύγα της Μεσογείου, καθώς η απόθεση των αυγών στην περιοχή του flavedo προκαλεί πλήρη θανάτωση του συνόλου των νέοεκκολαπτόμενων προνυμφών (Papachristos et al., 2008). Σε αυτό συντελεί και το γεγονός ότι η μύγα της Μεσογείου, σε αντίθεση με άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae που θεωρούνται εξαιρετικά σοβαροί εχθροί των εσπεριδοειδών όπως το Anastrepha ludens (Loew), δεν διαθέτει αρκετά μακρύ ωοθέτη που να επιτρέπει σε όλες τις περιπτώσεις την απόθεση των αυγών βαθιά στο φλοιό ώστε να αποφεύγονται οι τοξικές επιδράσεις των αιθέριων ελαίων (Jones, 1989; Birke et al., 2006; Papachristos & Papadopoulos, 2009). Σύμφωνα με τους Papachristos και συνεργάτες (2009), πέρα από τη θετική σχέση μεταξύ της δόσης έκθεσης και των επιδράσεων των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών στη θνησιμότητα των νεαρών προνυμφών της μύγας της Μεσογείου, ποιοτικά χαρακτηριστικά της σύστασης τους μπορούν επίσης να επηρεάζουν την αποτελεσματικότητά τους ως αμυντικού μηχανισμού. Συγκεκριμένα, η χαμηλότερη τοξικότητα των αιθέριων ελαιών των λεμονιών σε σχέση με άλλα εσπεριδοειδή αποδίδεται στην παρουσία αξιόλογων ποσοτήτων των ουσιών α και β-πινένιου που εμφανίζουν πολύ μικρή τοξική δράση έναντι των προνυμφών. Πέρα από τις διαφορές της σύνθεσης των αιθέριων ελαίων του φλοιού μεταξύ των εσπεριδοειδών που απορρέουν από τα εγγενή βοτανικά χαρακτηριστικά τους, μια σειρά από μελέτες υποδεικνύουν ότι 72

87 κατά τη διάρκεια ωρίμανσης των καρπών σημειώνονται ουσιαστικές αλλαγές της σύστασής τους που επηρεάζουν σημαντικά τις τοξικές τους ιδιότητες (Attawaty et al., 1967, 1968; Greany et al., 1983; Greany, 1989; Rasgado at al., 2009; Flamini & Cioni, 2010). Πιο συγκεκριμένα, καθώς οι καρποί των εσπεριδοειδών μεταβάλλονται από ένα ανώριμο πράσινο σε ένα πορτοκαλί/κίτρινο στάδιο ωρίμανσης, το περιεχόμενο στης λιναλούλης των ελαιών του φλοιού, που επιφέρει εξαιρετικά υψηλή τοξικότητα εναντίον των προνυμφών των Tephritidae, μειώνεται προοδευτικά και αντικαθίσταται από το λιγότερο τοξικό λιμονένιο που γίνεται και το κυρίαρχο συστατικό. Με βάση τα παραπάνω, τα θηλυκά της μύγας της Μεσογείου κατά την επαφή τους με τους καρπούς των εσπεριδοειδών έρχονται αντιμέτωπα με ένα αλληλοχημικό αμυντικό μηχανισμό η αποτελεσματικότητα του οποίου μπορεί να ποικίλει εξαιτίας των ποιοτικών και ποσοτικών χαρακτηριστικών των αιθέριων ελαίων που περιέχονται. Παρά τη μεγάλη ποικιλία μη συγγενικών ξενιστών που προσβάλλει η μύγα της Μεσογείου, παραδόξως τα οσφρητικά αισθητήρια όργανα των κεραιών των θηλυκών είναι εξαιρετικά ικανά στο να αντιλαμβάνονται τόσο βαθμιαίες μεταβολές της ποσότητας των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών όσο και μεμονωμένα συστατικά της σύστασής τους (Light et al., 1988; Levinson et al., 1990; Hernández et al., 1996). Παρόλα ταύτα, τόσο ο βαθμός όσο και ο τρόπος με τον οποίο τα οσμηρά ερεθίσματα του φλοιού των εσπεριδοειδών καθορίζουν τις αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος, καθώς προηγούμενες μελέτες δεν κατάφεραν να δώσουν σαφείς απαντήσεις και τα αποτελέσματά τους είναι μάλλον αντιφατικά. Συγκεκριμένα, οι Levinson και συνεργάτες (2003) αναφέρουν ουδέτερες ή αποτρεπτικές επιδράσεις των αιθέριων ελαίων του πορτοκαλιού, αναλόγως με το χρώμα του υποστρώματος ωοτοκίας. Αντιθέτως, οι Kaspi και συνεργάτες (2001) προτείνουν τη χρήση μικρών ποσοτήτων αιθέριων ελαίων πορτοκαλιού σε ομοιώματα καρπών ως μέσο για τη διέγερση της ωοτοκίας άγριων συλληφθέντων θηλυκών. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία των αιθέριων ελαίων του φλοιού των εσπεριδοειδών ως αμυντικού μηχανισμού έναντι των προσβολών της μύγας της Μεσογείου και τη δεδομένη ικανότητα των θηλυκών να αντιλαμβάνονται ποσοτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά της χημικής τους σύστασης, στο παρόν Κεφάλαιο διερευνήθηκε ο ρόλος τους ως προς την ωοτοκία του εντόμου. Ειδικότερα μελετήθηκε: 1) η επίδραση αιθέριων ελαίων από διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών 2) η επίδραση διαφορετικών δόσεων αιθέριων ελαίων πορτοκαλιού (το πιο αποτελεσματικό ως προς τη διέγερση της ωοπαραγωγής με βάση τα αποτελέσματα που προέκυψαν) και 3) ο ρόλος ορισμένων συστατικών τους. 73

88 4.3 Υλικά και μέθοδοι Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν και χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων Χρησιμοποιήθηκαν έντομα της F 2 F 6 γενεάς εργαστηρίου. Τα αιθέρια έλαια και από τα πέντε είδη των εσπεριδοειδών που χρησιμοποιήθηκαν (παρατίθενται παρακάτω) αναλύθηκαν με αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας. Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε αέριος χρωματογράφος της εταιρίας Agilent μοντέλο 6890, (USA) συνδυασμένος με φασματογράφο μάζας MSD (Agilent μοντέλο, 5973). Ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε σε τριχοειδή στήλη Hewlett-Packard-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm). Αρχικά το αιθέριο έλαιο υφίστανο αραίωση με διαλύτη εξάνιο, κατάλληλης καθαρότητας για χρωματογραφία σε αναλογία 1/100. Μικροποσότητα 2 μl του παραπάνω διαλύματος εισαγόταν στη στήλη μέσου εισαγωγέα τύπου split-splitless, με λόγο διαχωρισμού (split ratio) 1:10 και σε θερμοκρασία 220 ºC, ενώ η ροή του φέροντος αερίου (He) ήταν 1 ml/min. Ο διαχωρισμός των πτητικών συστατικών στην τριχοειδή στήλη πραγματοποιήθηκε με βάση το εξής θερμοκρασιακό πρόγραμμα: 40 ºC (διατήρηση για 5 min), με ρυθμό 6 ºC min -1 αύξηση στους 90 ºC, με ρυθμό 2 ºC min -1 αύξηση στους 130 º C, με ρυθμό 6 º C min -1 αύξηση στους 200 º C, με ρυθμό 10 ºC min -1 αύξηση στους 280 º C (διατήρηση για 5 min). Η ανίχνευση των διαχωρισμένων συστατικών πραγματοποιήθηκε σε φασματογράφο μάζας, ο οποίος λειτουργούσε κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: θερμοκρασία διασύνδεσης (interface temperature) 280 ºC, θερμοκρασία πηγής ιονισμού 230 ºC, θερμοκρασία τετράπολου º 150 C, δυναμικό ιονισμού +70eV. Τα χρωματογραφήματα, επεξεργάστηκαν και ολοκληρώθηκαν με το λογισμικό GC/MSD ChemStation. Η ταυτοποίηση των κορυφών επιτεύχθηκε με τη σύγκριση του αγνώστου φάσματος μάζας, μ αυτά που ήταν αποθηκευμένα στις ηλεκτρονικές βιβλιοθήκες NIST 98 και Wiley 275L. Για το κάθε αιθέριο έλαιο ο προσδιορισμός της σύστασής του επικεντρώθηκε στα 10 επικρατέστερα από άποψη περιεκτικότητας συστατικά του Επίδραση αιθέριων ελαίων από διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών στην ωοτοκία Χρησιμοποιηθήκαν αιθέρια έλαια του εμπορίου από πορτοκάλι, μανταρίνι, νεράντζι, λεμόνι και γκρέιπφρουτ που είχαν ληφθεί με τη μέθοδο της ψυχρής συμπίεσης (cold-pressing) του φλοιού των αντίστοιχων καρπών. Το αιθέριο έλαιο 74

89 του νεραντζιού προέρχονταν από την New Directions Aromatics Inc. (San Ramon, California) και τα υπόλοιπα από τη Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Germany). Σε μια πρώτη σειρά πειραμάτων, προκειμένου να διερευνηθούν πιθανές διεγερτικές ή αποτρεπτικές επιδράσεις των ελαίων των εσπεριδοειδών, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλής επιλογής. Συγκεκριμένα, ομάδες των πέντε θηλυκών ηλικίας 13 ημερών χωρίς προηγούμενη εμπειρία ωοτοκίας μεταφέρονταν από τις εκτροφές σε κλουβιά με νερό και τροφή ενηλίκων από Plexiglas διαστάσεων 20 x 20 x 20 cm που είχαν την οροφή τους και τη δεξιά πλευρά καλυμμένη με λεπτή μουσελίνα. Την επόμενη ημέρα τοποθετούνταν δύο υποστρώματα ωοτοκίας, όμοια με εκείνα που χρησιμοποιούνταν στις εκτροφές του εντόμου (βλέπε Κεφάλαιο 2), σε αντιδιαμετρικά αντίθετες γωνίες του κάθε κλουβιού και σε απόσταση 18 cm μεταξύ τους (Εικόνα 1). Το κάθε υπόστρωμα εφοδιάζονταν εσωτερικά με 5 ml αποσταγμένου νερού καθώς επίσης και με ένα πλαστικό κυλινδρικό δοχείο που περιείχε είτε 1 μl αιθέριου ελαίου (μεταχείριση) είτε 1 μl αποσταγμένου νερού (μάρτυρας) που εφαρμόζονταν σε μια διπλή στρώση διηθητικού χαρτιού τοποθετημένου στον πυθμένα του κάθε δοχείου. Τα θηλυκά αφήνονταν να ωοτοκήσουν στα δύο υποστρώματα για 24 ώρες και στη συνέχεια τα αυγά που είχαν αποτεθεί τόσο στη μεταχείριση όσο και στο μάρτυρα καταμετρούνταν. Πριν επαναχρησιμοποιηθούν, τα υποστρώματα ωοτοκίας πλένονταν με αποσταγμένο νερό για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων της φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας. Η θέση των υποστρωμάτων της μεταχείρισης και του μάρτυρα εναλλάσσονταν με κάθε νέα επανάληψη για να εξαλείφουν τυχόν διαφορές ως προς την προτίμηση εξαιτίας της έντασης του φωτός ή άλλων παραγόντων. Για κάθε ένα από τα πέντε αιθέρια έλαια πραγματοποιήθηκαν 25 επαναλήψεις. Καθώς όλα τα αιθέρια έλαια που μελετήθηκαν διέγειραν την ωοπαραγωγή (βλέπε αποτελέσματα), πραγματοποιήθηκε μια δεύτερη σειρά πειραμάτων μη επιλογής, που αποσκοπούσε στην αξιολόγηση της διεγερτικής τους δράσης. Η πειραματική διαδικασία περιελάμβανε την τοποθέτηση νεαρών ζευγαριών (αρσενικό και θηλυκό) ηλικίας μιας ημέρας σε πλαστικά, διαφανή κλουβιά χωρητικότητας 0.4 L (ύψος 12.5 cm, διάμετρος οροφής 6.5 cm, διάμετρος βάσης 9.2 cm) που περιείχαν τροφή ενηλίκων. Για τον καλύτερο αερισμό σε κάθε κλουβί υπήρχε πλευρικά ένα άνοιγμα (5 x 8 cm) το οποίο καλύπτονταν με λεπτή μουσελίνα. Η βάση του κάθε κλουβιού έφερε το κάλυμμα ενός τρυβλίου Petri διαμέτρου 9 cm το οποίο σε ειδική υποδοχή διαμέτρου 5 cm στο κέντρο του έφερε ένα τεχνητό υπόστρωμα (πλαστικό ημισφαίριο) ωοτοκίας. Τα κλουβιά ήταν τοποθετημένα σε βάσεις τρυβλίων Petri διαμέτρου 9 cm που περιείχαν νερό για τη 75

90 Εικόνα 1. Κλουβί από Plexiglas που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων διπλής επιλογής. Στις δύο γωνίες διακρίνονται τα υποστρώματα ωοτοκίας της μεταχείρισης και του μάρτυρα. 76

91 διατήρηση επαρκούς υγρασίας στο εσωτερικό των υποστρωμάτων ωοτοκίας, ενώ μέσω ενός φιτιλιού εξασφαλίζονταν η πρόσβαση των ενηλίκων για την κάλυψη των αναγκών τους (Εικόνα 2). Ανάλογα με τη μεταχείριση, πλαστικά κυλινδρικά δοχεία που περιείχαν 1 μl αιθέριου ελαίου ενός εκ των πέντε εσπεριδοειδών ή αποσταγμένο νερό (μάρτυρας) τοποθετήθηκαν κάτω από τα υποστρώματα ωοτοκίας από την πρώτη ημέρα του πειράματος (Εικόνα 2). Τα θηλυκά αφέθηκαν να ωοτοκήσουν κατά τη διάρκεια των 25 πρώτων ημερών της ζωής τους. Η ωοπαραγωγή καταγράφονταν σε καθημερινή βάση και ταυτόχρονα γινόταν ανανέωση των οσμηρών ερεθισμάτων κάτω από τα υποστρώματα. Τα θηλυκά που απεβίωσαν πριν την ηλικία των 25 ημερών αποκλείστηκαν από την ανάλυση, ενώ τα αρσενικά αντικαθιστούνταν από αλλά της ίδιας ηλικίας από την εργαστηριακή αποικία. Για καθένα από τα πέντε αιθέρια έλαια και το μάρτυρα πραγματοποιήθηκαν 40 επαναλήψεις Επίδραση διαφορετικών δόσεων αιθέριων ελαίων πορτοκαλιού Προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος της έντασης των οσμηρών ερεθισμάτων των αιθέριων ελαιών των εσπεριδοειδών στην ωοτοκία, θηλυκά εκτέθηκαν σε διαφορετικές δόσεις ελαίου πορτοκαλιού (το πιο αποτελεσματικό ως προς τη διέγερση της ωοπαραγωγής με βάση τα αποτελέσματα του παραπάνω πειράματος) σε πειράματα μη επιλογής. Η μεθοδολογία που υιοθετήθηκε ήταν παραπλήσια με το προηγούμενο πείραμα. Ζεύγη εντόμων (αρσενικό και θηλυκό) τοποθετήθηκαν σε κλουβιά (0.4 L) και τα θηλυκά αφέθηκαν να ωοτοκήσουν κατά τις πρώτες 25 ημέρες της ζωής τους σε πέντε δόσεις αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού: 0 μl (μάρτυρας), 0.01, 0.1, 1 και 10 μl. Το αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού εφαρμόστηκε αδιάλυτο (δόσεις 1 και 10 μl) και ως διάλυμα 1:10 και 1:100 σε ακετόνη εφαρμόζοντας 1 μl για τη δόση των 0.1 και 0.01 μl αντίστοιχα. Στα κλουβιά του μάρτυρα εφαρμόζονταν 1 μl ακετόνης που εξατμίζονταν ταχύτατα στις συνθήκες του εργαστήριου. Όπως και στο προηγούμενο πείραμα τα θηλυκά που απεβίωσαν πριν την ηλικία των 25 ημερών αποκλείστηκαν από την ανάλυση, ενώ τα αρσενικά αντικαθιστούνταν από αλλά της ίδιας ηλικίας από την εργαστηριακή αποικία. Για κάθε μια από τις πέντε δόσεις πραγματοποιήθηκαν 40 επαναλήψεις Επίδραση ορισμένων συστατικών των αιθέριων ελαίων Με βάση τις χημικές αναλύσεις, επιλέχθηκαν τέσσερις ουσίες προκειμένου 77

92 Εικόνα 2. Κλουβί με υπόστρωμα ωοτοκίας που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα μη επιλογής. Στη βάση του τρυβλίου Petri διακρίνεται το κυλινδρικό δοχείο με το διηθητικό χαρτί επάνω στο οποίο εφαρμόζονταν τα αιθέρια έλαια. 78

93 να προσδιοριστούν οι επιδράσεις τους στην ωοτοκία των θηλυκών. Ειδικότερα, εξετάστηκε η επίδραση του R-(+)-limonene (λιμονένιου), του επικρατέστερου συστατικού και των πέντε αιθέριων ελαίων, της μυρσίνης, του α-πινένιου [παρασκευάστηκε αναμιγνύοντας ίσες ποσότητες των (+) και (-) εναντιομερών] και της λιναλούλης με τη μορφή εμπορικού ρακεμικού μίγματος. Η επιλογή των εναντιομερών βασίστηκε στη σχετική τους αφθονία στα αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη (Mondello et al., 2002). Παρόλο που η λιναλούλη ανιχνεύτηκε στα τέσσερα από τα πέντε έλαια των εσπεριδοειδών, εντούτοις επιλέχθηκε να συμπεριληφθεί στην εν λόγο μελέτη διότι: 1) αποτελεί συστατικό που απαντάται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στα έλαια του φλοιού των ανώριμων καρπών των εσπεριδοειδών (Attawaty et al., 1967, 1968; Kefford & Chandler, 1970; Rasgado at al., 2009; Flamini & Cioni, 2010) και 2) παρουσιάζει υψηλή τοξική δράση έναντι των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου (Salvatore et al., 2004; Papachristos et al., 2009) και άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae που προσβάλλουν εσπεριδοειδή όπως το Anastrepha suspensa (Greany et al., 1983). Τα εναντιομερή του λιμονένιου και του α-πινένιου προέρχονταν από την Alfa Aesar (Kalsruhe, Germany), η μυρσίνη από τη Fluka (Lyon, France) και η λιναλούλη από τη Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Germany). Η καθαρότητα της μυρσίνης ήταν 90% και των υπόλοιπων συστατικών 97-98%. Για τον προσδιορισμό της επίδρασης των ουσιών πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλής επιλογής υιοθετώντας το ίδιο πρωτόκολλο που περιγράφηκε παραπάνω. Ειδικότερα, ομάδες των πέντε θηλυκών αφέθηκαν να ωοτοκήσουν σε υποστρώματα ωοτοκίας που περιείχαν είτε 1 μl ουσίας είτε 1 μl αποσταγμένου νερού. Για κάθε μια από τις ουσίες πραγματοποιήθηκαν 25 επαναλήψεις. Καθώς τα αποτελέσματα του προηγούμενου πειράματος (βλέπε παρακάτω) αποκάλυψαν σημαντικές διεγερτικές και αποτρεπτικές επιδράσεις του λιμονένιου και της λιναλούλης αντίστοιχα, πραγματοποιήθηκε ένα ακόμη πείραμα που σκοπό είχε να διερευνήσει εάν και κατά πόσο: 1) οι διεγερτικές της ωοτοκίας ιδιότητες των αιθέριων ελαίων οφείλονται αποκλειστικά και μόνο στην υψηλή τους περιεκτικότητα σε λιμονένιο και 2) υψηλές συγκεντρώσεις λιναλούλης, ενδεικτικές των ανώριμων καρπών των εσπεριδοειδών, είναι ικανές να επισκιάσουν τις διεγερτικές επιδράσεις του περιεχομένου του λιμονένιου. Προκειμένου να μελετηθούν οι δύο αυτές παράμετροι, νεαρά ζευγάρια ηλικίας μιας ημέρας τοποθετήθηκαν σε κλουβιά (0.4 L) και επιμερίστηκαν σε τρεις μεταχειρίσεις. Η πρώτη μεταχείριση περιελάμβανε την εφαρμογή 1 μl αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού, η δεύτερη 1 μl ενός μείγματος που αποτελούνταν από 93% λιμονένιο (περίπου το ίδιο ποσοστό που βρέθηκε να περιέχεται στο αιθέριο έλαιο 79

94 του πορτοκαλιού) και 7% ακετόνη και η τρίτη την εφαρμογή 1 μl ενός μείγματος που αποτελούνταν από 93% λιμονένιο, 3% λιναλούλη (περίπου το δεκαπλάσιο ποσοστό που βρέθηκε να περιέχεται στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού) και 4% ακετόνη. Για την κάθε μεταχείριση πραγματοποιήθηκαν 40 επαναλήψεις. 4.4 Στατιστική ανάλυση Στα πειράματα διπλής επιλογής που αφορούσαν τις επιδράσεις των αιθέριων ελαίων και των συστατικών τους, οι αριθμοί των αυγών που απέθεσαν τα θηλυκά σε κάθε υπόστρωμα ωοτοκίας συγκρίθηκαν με το μη παραμετρικό κριτήριο Wilcoxon για δείγματα κατά ζεύγη (paired samples). Τα ποσοστά για κάθε μια από τις παραπάνω περιπτώσεις, όπου τα θηλυκά απέθεταν αποκλειστικά το αυγά τους στο ένα από τα δύο υποστρώματα (αποκλειστικότητα της ανταπόκρισης) (Brévault & Quilici, 2009) αναλύθηκαν με το G-κριτήριο. Στα πειράματα μη επιλογής υπολογίστηκαν τρεις παράμετροι αναφορικά με την ωοτοκία των θηλυκών: τα ποσοστά των θηλυκών που ωοτόκησαν, οι περίοδοι προωοτοκίας και οι αριθμοί των αυγών που αποτέθηκαν. Τα ποσοστά των θηλυκών που ωοτόκησαν σε κάθε πείραμα αναλύθηκαν με το χ² κριτήριο ακολουθούμενα από επιμέρους αναλύσεις για τις συγκρίσεις ανά δύο. Τα δεδομένα που αφορούσαν τις περιόδους προωοτοκίας και τον αριθμό των αυγών που αποτέθηκε σε κάθε πείραμα υποβλήθηκαν σε ανάλυση παραλλακτικότητας (one-way ANOVA) μετά από κατάλληλες μετατροπές όπου αυτό ήταν απαραίτητο. Η σύγκριση των μέσων όρων πραγματοποιήθηκε με το κριτήριο Tukey s HSD (Sokal & Rohlf, 1995). Στο πείραμα που περιελάμβανε την αξιολόγηση της διεγερτικής δράσης μεταξύ των αιθέριων ελαίων των πέντε εσπεριδοειδών, τα δεδομένα που αφορούσαν τον αριθμό των αυγών που αποτέθηκε στις διάφορες μεταχειρίσεις δεν κατανέμονταν κανονικά παρά τις όποιες μετατροπές και ως εκ τούτου η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το μη παραμετρικό κριτήριο Kruskal- Wallis ενώ οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο Mann-Whitney. Τέλος, η σχέση μεταξύ των δόσεων του αιθέριου ελαίου του πορτοκαλιού στις οποίες αφέθηκαν να ωοτοκήσουν τα θηλυκά και του μέσου αριθμού των αυγών που απόθεσαν εξετάστηκε με συμμεταβολή δευτέρου βαθμού. 4.5 Αποτελέσματα Χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων 80

95 Η χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών δίνεται στον Πίνακα 1. Τα δέκα κυριότερα από άποψη περιεκτικότητας συστατικά σε κάθε περίπτωση αποτελούσαν το % της συνολικής σύστασης των αιθέριων ελαίων. Σε αντιστοιχία και με προηγούμενες μελέτες (Shaw, 1979; Mitiku et al., 2000; Steuer et al., 2001; Lota et al., 2002; Papachristos et al., 2009), η σύσταση του ελαίου του λεμονιού βρέθηκε να διαφέρει αρκετά από εκείνη των υπολοίπων. Συγκεκριμένα, η περιεκτικότητά του σε λιμονένιο ήταν κατά πολύ μικρότερη (65.58%) σε σχέση με τα άλλα αιθέρια έλαια ( %) και αντισταθμίζονταν από τη παρουσία υψηλών ποσοτήτων β-πινένιου και γ-τερπινένιου (14.25% και 9.07% αντίστοιχα). Κάτι ανάλογο, αλλά σε μικρότερο βαθμό, παρατηρήθηκε και στο αιθέριο έλαιο του μανταρινιού, όπου και πάλι η χαμηλότερη περιεκτικότητα του λιμονένιου (85.53%) φάνηκε να εξισορροπείται από αξιόλογες ποσότητες (6.40%) γ-τερπινένιου. Άλλες ουσίες πέραν του λιμονένιου που υπήρχαν και στα πέντε αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών ήταν η μυρσίνη και το α-πινένιο με τα ποσοστά τους να κυμαίνονται από % και % αντίστοιχα. Όλα τα έλαια των εσπεριδοειδών εκτός του λεμονιού περιείχαν επίσης β-φαιλανδρένιο (phellandrene) και λιναλούλη σε ποσότητες μικρότερες του 0.60%. Το περιεχόμενο της λιναλούλης κυμάνθηκε από 0.14 έως 0.38% και ήταν τυπικό για αιθέρια έλαια εσπεριδοειδών που προέρχονταν από ώριμους καρπούς (Shaw, 1979) Επίδραση αιθέριων ελαίων από διαφορετικά είδη εσπεριδοειδών στην ωοτοκία Στα πειράματα διπλής επιλογής, τα θηλυκά απέθεσαν σημαντικά περισσότερα αυγά στα υποστρώματα ωοτοκίας που ανέδυαν οσμές από τα αιθέρια έλαια σε σχέση με τα άοσμα υποστρώματα (Wilcoxon signed-rank κριτήριο, μεταχείριση έναντι μάρτυρας: n = 25 ζεύγη, Ζ = 3.57 και 4.37 για το λεμόνι και τα υπόλοιπα έλαια των εσπεριδοειδών αντίστοιχα, P < 0.001) (Διάγραμμα 1Α). Επιπλέον, τα ποσοστά των περιπτώσεων (επαναλήψεων) όπου τα θηλυκά απέθεσαν αυγά αποκλειστικά στα υποστρώματα που περιείχαν αιθέρια έλαια εσπεριδοειδών ήταν σημαντικά υψηλοτέρα σε σχέση με τους μάρτυρες (Gκριτήριο: G 1 = 22.2 για την περίπτωση του λεμονιού, 29.9 για το πορτοκάλι, το μανταρίνι και το νεράντζι και 39.6 για το γκρέιπφρουτ αντίστοιχα, P < 0.01) και κυμάνθηκαν από 60% στην περίπτωση του λεμονιού έως 84% στο αιθέριο έλαιο του γκρέιπφρουτ (Διάγραμμα 1Β). Στα πειράματα μη επιλογής, και τα πέντε αι- 81

96 Πίνακας 1. Χημική σύσταση των πέντε αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών όπου δίνονται τα δέκα σημαντικότερα από άποψη περιεκτικότητας συστατικά τους όπως προσδιορίστηκαν από την αέριο χρωματογραφία-φασματογραφία μάζας Ποσοστό (%) επί της συνολικής σύστασης Χρόνος¹ (min) Συστατικό Πορτοκάλι Μανταρίνι Λεμόνι Γκρέιπφρουτ Νεράντζι α-pinene β-phellandrene β-pinene Myrcene Octanal Carene ρ-cymeme Limonene γ-terpinene Terpinolene Linalool Limonene oxide Decanal Carveol Citral Carvone α-copaene Nerol Caryophyllene α-bergamotene β-bisabolene γ-cadinene Σύνολο ¹Χρόνος κατακράτησης των συστατικών στη στήλη. 82

97 (A) Μέσος αριθμός αυγών ± ΤΣ ** ** Treatment Μεταχείριση ** Control Μάρτυρας ** ** (A) 0 (B) Αποκλειστική ανταπόκριση (%) * * * * * Πορτοκάλι Orange Μανταρίνι Mandarin Lemon Λεμόνι Γκρέιπφρουτ Grapefruit Bitter Νεράντζι orange (B) Διάγραμμα 1. Αριθμός αυγών που αποτέθηκε (Α) και ποσοστά αποκλειστικής ανταπόκρισης (Β) από θηλυκά της μύγας Μεσογείου σε πειράματα διπλής επιλογής μεταξύ υποστρωμάτων ωοτοκίας που περιείχαν 1μl αιθέριου ελαίου εσπεριδοειδών και 5 ml νερό (μεταχείριση) και υποστρωμάτων που περιείχαν μόνο 5 ml νερό (μάρτυρας). Σε κάθε περίπτωση πραγματοποιήθηκαν 25 επαναλήψεις που περιελάμβαναν 5 θηλυκά (**P < 0.001, *P < 0.01). 83

98 θέρια έλαια αύξησαν σημαντικά την απόθεση των αυγών σε σχέση με το μάρτυρα (Mann-Whitney U-κριτήριο: U 38,39 = 255 για το πορτοκάλι, U 39,39 = για το μανταρίνι; U 39,39 = για το λεμόνι, U 38,39 = 415 για το γκρέιπφρουτ και U 38,39 = για το νεράντζι αντίστοιχα P < 0.01) (Πίνακας 2). Ωστόσο, τα θηλυκά απέθεσαν σημαντικά λιγότερα αυγά ανταποκρινόμενα στα αιθέρια έλαια του λεμονιού σε σχέση με εκείνα του πορτοκαλιού, μανταρινιού και νεραντζιού (U 39,38 = 463.0, U 39,39 = και U 39,38 = αντίστοιχα, P < 0.01) αλλά όχι του γκρέιπφρουτ (U 39,38 = 642.5, P = 0.315). Η μέση περίοδος προωοτοκίας ήταν σημαντικά μικρότερη στα θηλυκά που ωοτόκησαν στα υποστρώματα που περιείχαν αιθέρια έλαια σε σχέση με εκείνη του μάρτυρα σε όλες τις περιπτώσεις εκτός του λεμονιού (Tukey s HSD κριτήριο, P < 0.05) (Πίνακας 2). Τα ποσοστά των θηλυκών που ωοτόκησαν στα αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών κυμάνθηκαν από 84.6 έως 100% και ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνο του μάρτυρα (66.7%) σε όλες τις περιπτώσεις (χ² = 9.67 για το αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού και του νεραντζιού, 15.6 για το μανταρίνι και 5.82 για το γκρέιπφρουτ αντίστοιχα, Β.Ε =1, P < 0.05) εκτός από την περίπτωση του λεμονιού (χ² = 3.41, Β.Ε = 1, P = 0.065) Επίδραση διαφορετικών δόσεων αιθέριων ελαίων πορτοκαλιού Οι διαφορετικές ποσότητες των αιθέριων ελαίων του πορτοκαλιού επηρέασαν σημαντικά την ωοπαραγωγή των θηλυκών. Συγκεκριμένα, εντός του εύρους από 0 έως 1 μl, καθώς η ποσότητα του ελαίου κάτω από τα υποστρώματα αυξάνονταν, η διάρκεια της περιόδου προωοτοκίας μειώθηκε και ο αριθμός των αυγών που απέθεσαν τα θηλυκά αυξήθηκε (Πίνακας 3). Ωστόσο, περαιτέρω αύξηση της δόσης από το 1 στα 10 μl, οδήγησε σε μείωση της απόθεσης των αυγών κατά περίπου 25% (αν και δεν ήταν σημαντική, Tukey s HSD, P > 0.05) που ταυτόχρονα συνοδεύτηκε από σημαντική αύξηση της περιόδου προωοτοκίας. Υπήρξε μια σημαντική σχέση δευτέρου βαθμού μεταξύ της δόσης και του αριθμού των αυγών που αποτέθηκαν (F 2, 2 = 39.13, P < 0.05, y = x² x+72.72, R² = 0.975) όχι όμως και με τη διάρκεια της περιόδου προωοτοκίας (F 2, 2 = 8.63, P = 0.104) Επίδραση συστατικών των αιθέριων ελαίων Τα θηλυκά απέθεσαν σημαντικά περισσότερα αυγά στα υποστρώματα ωοτοκίας που περιείχαν λιμονένιο σε σχέση με τα υποστρώματα που δεν ανέδυαν 84

99 Πίνακας 2. Παράμετροι ωοτοκίας θηλυκών της μύγας Μεσογείου που αφέθηκαν να ωοτοκήσουν κατά τη διάρκεια των πρώτων 25 ημερών της ζωής τους σε υποστρώματα ωοτοκίας που περιείχαν 1 μl αιθέριων ελαίων εσπεριδοειδών και νερό ή μόνο νερό (μάρτυρας) σε πειράματα μη επιλογής Αιθέριο έλαιο n Αυγά ανά 1 θηλυκό ± Τ.Σ Περίοδος 2 προωοτοκίας (ημέρες) ± Τ.Σ Ποσοστό θηλυκών που ωοτόκησε Πορτοκάλι ± 30.7α 13.3 ± 0.8α 94.7αβ Μανταρίνι ± 24.0α 13.7 ± 0.9αβ 100α Λεμόνι ± 15.7β 17.1 ± 0.9βγ 84.6βγ Γκρέιπφρουτ ± 32.0αβ 14.4 ± 1.1αβ 89.5αβ Νεράντζι ± 20.6α 14.9 ± 0.9αβ 94.7αβ Μάρτυρας ± 8.8γ 18.8 ± 0.8γ 66.7γ F χ² Β.Ε 5 5,198 5 P < < < Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, ¹Mann-Whitney U-κριτήριο, ²Τukey s HSD κριτήριο). Ποσοστά στη στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, χ² κριτήριο). 85

100 Πίνακας 3. Παράμετροι ωοτοκίας θηλυκών της μύγας Μεσογείου που αφέθηκαν να ωοτοκήσουν κατά τη διάρκεια των πρώτων 25 ημερών της ζωής τους σε υποστρώματα ωοτοκίας που περιείχαν διαφορετικές ποσότητες αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού σε πειράματα μη επιλογής Δόση αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού (μl) 0 (Μάρτυρας) n Αυγά ανά θηλυκό ± Τ.Σ Περίοδος προωοτοκίας (ημέρες) ± Τ.Σ Ποσοστό θηλυκών που ωοτόκησε ± 17.7δ 17.6 ± 1.0β 71.1β ± 13.8γδ 16.8 ± 0.8β 73.7β ± 14.1βγ 14.8 ± 0.9β 97.3α ± 20.7α 11.4 ± 0.8α 94.6α ± 21.5αβ 15.0 ± 0.8β 94.7α F χ² Β.Ε 4,183 4,157 4 P < < < Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, Τukey s HSD κριτήριο). Ποσοστά στη στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, χ² κριτήριο). 86

101 σχετικές οσμές (Wilcoxon signed-rank κριτήριο, μεταχείριση έναντι μάρτυρας: n = 25 ζεύγη, Ζ = 4.4, P < 0.001), ενώ το ποσοστό των περιπτώσεων όπου τα θηλυκά απέθεσαν αυγά αποκλειστικά στα υποστρώματα που υπήρχε η ουσία ήταν σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με το μάρτυρα (G-κριτήριο: G 1 = 24.6, P < 0.01) (Διάγραμμα 2). Η μυρσίνη και το α-πινένιο είχαν ουδέτερη επίδραση ως προς την ωοπαραγωγή των θηλυκών, καθώς ούτε ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκαν στα υποστρώματα που ανέδυαν τις οσμές των ουσιών αυτών (Wilcoxon signedrank κριτήριο, μεταχείριση έναντι μάρτυρα: n = 25 ζεύγη, Z = 0.4 και 1.7, P = και για τη μυρσίνη και για το α-πινένιο αντίστοιχα) ούτε τα ποσοστά των αποκλειστικών ανταποκρίσεων διέφεραν σε σχέση με τους μάρτυρες (G 1 = 0.8 και 0.1, P = και για τη μυρσίνη και για το α-πινένιο αντίστοιχα). Αντίθετα, η λιναλούλη είχε ισχυρή αποτρεπτική δράση καθώς στα υποστρώματα του μάρτυρα εναποτέθηκε σημαντικά μεγαλύτερος αριθμός αυγών (Wilcoxon signedrank κριτήριο, μεταχείριση έναντι μάρτυρα: n = 25 ζεύγη, Z = -3.4, P < 0.001) ενώ το ποσοστό των θηλυκών που απέθεσαν αυγά αποκλειστικά στα υποστρώματα του μάρτυρα έφτασε το 84% και ήταν υψηλότερο σε σχέση με εκείνο της λιναλούλης (G 1 = 28.8, P < 0.01). Στα πειράματα μη επιλογής, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς τις παραμέτρους ωοτοκίας μεταξύ των θηλυκών που ωοτόκησαν ανταποκρινόμενα στις οσμές των αιθέριων ελαίων του πορτοκαλιού και εκείνων που ωοτόκησαν ανταποκρινόμενα στο μίγμα που αποτελούνταν από το ισοδύναμο ποσοστό του σε λιμονένιο (Tukey s HSD κριτήριο, P > 0.05) (Πίνακας 4). Ωστόσο, το γεγονός ότι τα θηλυκά εμφάνισαν μικρότερη περίοδο προωοτοκίας και ταυτοχρόνως απέθεσαν περίπου 23% περισσότερα αυγά στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού δείχνει την ύπαρξη συνεργιστικής δράσης μεταξύ του λιμονένιου και άλλων συστατικών του αιθέριου ελαίου του πορτοκαλιού. Τέλος, η προσθήκη 3% λιναλούλης στο μίγμα του λιμονένιου είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της απόθεσης των αυγών που συνοδεύτηκε από αξιόλογη αύξηση της περιόδου προωοτοκίας σε σχέση τόσο με το αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού όσο και με το μίγμα του λιμονένιου (Πινάκας 4). 87

102 (A) 60 Treatment Μεταχείριση Control Μάρτυρας (A) Μέσος αριθμός αυγών ± Τ.Σ ** ns ** ns 0 (B) Αποκλειστική ανταπόκριση (%) * * Λιμονένιο α-πινένιο Λιναλούλη Μυρσίνη Διάγραμμα 2. Αριθμός αυγών που αποτέθηκε (Α) και ποσοστά αποκλειστικής ανταπόκρισης (Β) από θηλυκά της μύγας Μεσογείου σε πειράματα διπλής επιλογής μεταξύ υποστρωμάτων ωοτοκίας που περιείχαν 1μl καθαρής ουσίας και 5 ml νερό (μεταχείριση) και υποστρωμάτων που περιείχαν μόνο 5 ml νερό (μάρτυρας). Σε κάθε περίπτωση πραγματοποιήθηκαν 25 επαναλήψεις που περιελάμβαναν 5 θηλυκά (**P < 0.001, *P < 0.01). 88

103 Πίνακας 4. Παράμετροι ωοτοκίας θηλυκών της μύγας Μεσογείου που αφέθηκαν να ωοτοκήσουν κατά τη διάρκεια των πρώτων 25 ημερών της ζωής τους σε υποστρώματα ωοτοκίας που περιείχαν είτε 1 μl αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού είτε 1 μl δύο μιγμάτων που αποτελούνταν το μεν πρώτο από 93% λιμονένιο ¹ και το δεύτερο από 93% λιμονένιο και 3% λιναλούλη¹ αντίστοιχα σε πειράματα μη επιλογής Μεραχείριση n Αυγά ανά θηλυκό ± Τ.Σ Περίοδος προωοτοκίας (ημέρες) ± Τ.Σ Ποσοστό θηλυκών που ωοτόκησε Αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού ± 26.4α 12.3 ± 0.8α 92.3αβ Μίγμα 1 (Λιμονένιο 93%) ± 25.3α 14.6 ± 1.0αβ 100α Μίγμα 2 (Λιμονένιο 93% + Λιναλούλη 3%) ± 22.3β 17.2 ± 0.9β 79.5β F χ² 9.65 Β.Ε 2,113 2,102 2 P ¹Το υπόλοιπο των μιγμάτων αποτελούνταν από ακετόνη Μέσοι όροι σε κάθε στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, Τukey s HSD κριτήριο). Ποσοστά στη στήλη που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δε διαφέρουν σημαντικά (Ρ = 0.05, χ² κριτήριο). 89

104 4.6 Συζήτηση Όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα του παρόντος Κεφαλαίου τα αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών διεγείρουν την ωοπαραγωγή της μύγας της Μεσογείου κατά τρόπο που φαίνεται να είναι στενά συνυφασμένος τόσο με ποσοτικά όσο και με ποιοτικά χαρακτηριστικά της χημικής τους σύστασης. Τα αποτελέσματα αυτά δεν συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες που αναφέρουν ουδέτερες ή αποτρεπτικές επιδράσεις των ελαίων των εσπεριδοειδών αναλόγως με το χρώμα του υποστρώματος ωοτοκίας (Levinson et al., 2003). Οι διαφορές αυτές θα πρέπει να αποδοθούν κατά κύριο λόγο στις διαφορετικές μεθοδολογίες που υιοθετήθηκαν. Το πειραματικό πρωτόκολλο της παρούσας μελέτης έδωσε έμφαση στα οσμηρά ερεθίσματα των αιθέριων ελαίων αποκλείοντας την όποια αλληλεπίδραση οπτικών (χρήση υποστρωμάτων με ίδιο χρώμα) και απτικών (τα θηλυκά δεν μπορούσαν να έρθουν σε επαφή με τα αιθέρια έλαια) ερεθισμάτων. Αντιθέτως, το πρωτόκολλο των Levinson και συνεργατών (2003) βασίστηκε στην προσρόφηση των αιθέριων ελαίων στην επιφάνεια των υποστρωμάτων ωοτοκίας, παρέχοντας εκτός από οσμηρά και απτικά ερεθίσματα. Σύμφωνα με τους Katsoyannos και συνεργάτες (1997) η επαφή των ταρσών των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου με αιθέρια εσπεριδοειδών προκαλεί έντονες αποτρεπτικές επιδράσεις. Έτσι, ενώ η χρήση χρωμάτων υψηλής προτίμησης από τους Levinson και συνεργάτες (2003) φάνηκε να εξισορροπεί τις αρνητικές επιδράσεις από την επαφή των θηλυκών με τα αιθέρια έλαια, αυτό δε συνέβαινε με χρώματα χαμηλής προτίμησης οδηγώντας στο συμπέρασμα για ουδέτερες και αποτρεπτικές επιδράσεις αντίστοιχα. Από την άλλη μεριά, σε υποστήριξη των ευρημάτων της παρούσας μελέτης, οι Papachristos & Papadopoulos (2009) αναφέρουν μικρότερες περιόδους προωοτοκίας σε θηλυκά της μύγας της Μεσογείου που αφέθηκαν να ωοτοκήσουν σε καρπούς εσπεριδοειδών σε σχέση με άοσμα τεχνητά υποστρώματα, υποδεικνύοντας διεγερτικές επιδράσεις των ελαίων του φλοιού των εσπεριδοειδών. Ωστόσο, τα θηλυκά στην προηγούμενη μελέτη απέθεσαν σημαντικά λιγότερα αυγά στους καρπούς των εσπεριδοειδών σε σχέση με τα τεχνητά υποστρώματα, ενώ η ωοπαραγωγή τους συσχετίστηκε αρνητικά τόσο με την πυκνότητα των ελαιογόνων αδένων όσο και την ποσότητα των αιθέριων ελαίων στην περιοχή του flavedo των καρπών. Τα ευρήματα αυτά σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, αποδεικνύουν την ύπαρξη ενός διπλού ανταγωνιστικού μηχανισμού δράσεως των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών που φαίνεται να λειτουργεί διαδοχικά κατά τη διάρκεια της ωοτοκίας. Tα θηλυκά, αμέσως μετά την άφιξή τους στους καρπούς 90

105 αντιλαμβάνονται τα αιθέρια έλαια τα οποία προκαλούν διεγερτική επίδραση ως προς την ωοτοκία. Ωστόσο, πιθανή επαφή του ωοθέτη με μεγάλες ποσότητες αιθέριων ελαίων κατά τα αρχικά στάδια της εισαγωγής του στο φλοιό μπορεί να προκαλεί αποτρεπτικές επιδράσεις και επακόλουθη εγκατάλειψη της προσπάθειας ωοτοκίας. Το τελευταίο φαίνεται να υποστηρίζεται από τις παρατηρήσεις των Back & Pemberton (1915) που αναφέρουν σημαντικά ποσοστά άγονων νυγμάτων (χωρίς αυγά) σε καρπούς εσπεριδοειδών από τη μύγα της Μεσογείου σε σχέση με ξενιστές που δεν περιέχουν αντίστοιχα συστατικά στο φλοιό τους όπως τα ροδάκινα. Ωστόσο, όπως προέκυψε από το προηγούμενο Κεφάλαιο, ένα μέρος των άγονων αυτών νυγμάτων πιθανότατα να οφείλεται και στην αδυναμία των θηλυκών να διατρήσουν το φλοιό. Η αξιολόγηση της επίδρασης των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών, αποκάλυψε μια σημαντικά υποδεέστερη ικανότητα στην περίπτωση των ελαίων του λεμονιού ως προς τη διέγερση της ωοπαραγωγής. Το γεγονός αυτό θα πρέπει να αποδοθεί στις διαφορές της σύστασής του σε σχέση με τα υπόλοιπα αιθέρια έλαια. Από τα αποτελέσματα του προηγούμενου Κεφαλαίου όπως και από άλλες μελέτες (Staub et al., 2008; Papachristos & Papadopoulos, 2009) προκύπτει ότι τα λεμόνια συγκαταλέγονται στους λιγότερο προτιμητέους ξενιστές σε σχέση με άλλα είδη εσπεριδοειδών. Οι Papachristos & Papadopoulos (2009) πρότειναν ως τους σημαντικότερους παράγοντες που καθορίζουν τη μικρή προτίμηση των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου για τα λεμόνια το χρώμα, την υφή της επιφάνειας και τη σύσταση των αιθέριων ελαίων του φλοιού τους. Καθώς το πειραματικό πρωτόκολλο της παρούσας μελέτης, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, απέκλειε την όποια ταυτόχρονη επίδραση οπτικών και απτικών ερεθισμάτων ο τελευταίος παράγοντας φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά την ωοτοκία των θηλυκών. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τη διεγερτική δράση των αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών όπως προέκυψε από την παρούσα μελέτη και την αντίστοιχη τοξικότητά τους έναντι των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου (Papachristos et al., 2009) προκύπτει ότι υπάρχει διένεξη μεταξύ των αποφάσεων ωοτοκίας των θηλυκών και της αντίστοιχης επιβίωσης των προνυμφών (απογόνων). Συγκεκριμένα, αν και τα αιθέρια ελαία του λεμονιού χαρακτηρίζονται από περιορισμένη διεγερτική δράση ως προς την ωοπαραγωγή, εντούτοις παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερη τοξικότητα έναντι των ανήλικων σταδίων της μύγας της Μεσογείου σε σχέση με άλλα έλαια όπως εκείνα του νεραντζιού και του πορτοκαλιού. Συνεπώς φαίνεται ότι οι αποφάσεις ωοτοκίας των θηλυκών ως προς τα χημικά χαρακτηριστικά του φλοιού των εσπεριδοειδών δε συνοδεύονται πάντοτε από αντίστοιχη επιβίωση των απογόνων τους οδηγώντας 91

106 στο συμπέρασμα ότι η μύγα της Μεσογείου δεν είναι επαρκώς προσαρμοσμένη στα εσπεριδοειδή. Από την αξιολόγηση των προοδευτικά αυξανόμενων δόσεων αιθέριων ελαιών πορτοκαλιού, προέκυψε ότι δόσεις υψηλότερες της βέλτιστης (1 μl) προκαλούν μείωση της ωοπαραγωγής. Συνεπώς φαίνεται ότι τα θηλυκά βασιζόμενα στην εξαιρετική τους ικανότητα να αντιλαμβάνονται τα οσμηρά ερεθίσματα των αιθέρων ελαίων των εσπεριδοειδών (Levinson et al., 1990; Hernández et al., 1996) είναι σε θέση να προσαρμόζουν τις αποφάσεις ωοτοκίας τους σύμφωνα με την ένταση των ερεθισμάτων αυτών. Με δεδομένο ότι τα αιθέρια έλαια του φλοιού των εσπεριδοειδών θεωρούνται ως ο σημαντικότερος παράγοντας της θνησιμότητας των νεαρών προνυμφών της μύγας της Μεσογείου (Papachristos et al., 2008, 2009) η ικανότητα των θηλυκών να αξιολογούν ποσοτικά χαρακτηριστικά του αμυντικού αυτού μηχανισμού κατά την ωοτοκία τους πιθανότατα να συνδέεται με σημαντικά στοιχεία της αρμοστικότητάς τους. Στη φύση, κάτι τέτοιο θα μπορούσε να μεταφράζεται ως επιλεκτική προτίμηση των θηλυκών για ωοτοκία σε καρπούς εσπεριδοειδών ή σημεία τους που περιέχουν χαμηλές συγκεντρώσεις αιθέριων ελαίων αυξάνοντας με τον τρόπο αυτό τις πιθανότητες επιβίωσης των απογόνων τους. Την τάση αυτή φαίνεται να επιβεβαιώνουν και αντίστοιχες παρατηρήσεις του Bodenheimer (1951). Από τα συστατικά των αιθέριων ελαίων που εξετάστηκαν, προέκυψε ότι το λιμονένιο διέγειρε σημαντικά την ωοπαραγωγή των θηλυκών. Από όσα είναι γνωστά μέχρι στιγμής, αυτή είναι η πρώτη φορά όπου μια μεμονωμένη ουσία αναφέρεται να επιφέρει τέτοιου είδους επιδράσεις στη μύγα της Μεσογείου. Μέχρι σήμερα, η μοναδική εξειδικευμένη μελέτη προς την κατεύθυνση αυτή είναι εκείνη των Light & Jang (1996) που αναφέρουν ότι ένα μίγμα τριών εστέρων (ethyl haxanoate και methyl και ethyl octanoate) κοινό σε πολλά ώριμα φρούτα, δρώντας συνεργιστικά με τις φυσικές οσμές που εκλύονταν από ώριμα νεκταρίνια αύξανε σημαντικά την προσέλκυση και απόθεση αυγών σε τεχνητά υποστρώματα. Ωστόσο, το γεγονός ότι το συγκεκριμένο μίγμα εστέρων αδυνατούσε από μόνο του να προκαλέσει τις παραπάνω συμπεριφορές, πιθανότατα υποδηλώνει ένα διαφορετικό τρόπο δράσης μεταξύ των χημικών αυτών συστατικών και του λιμονένιου ως προς τη διέγερση της ωοτοκίας των θηλυκών. Το αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού βρέθηκε να διεγείρει περισσότερο την ωοπαραγωγή σε σχέση με το ισοδύναμό του σε περιεκτικότητα μίγμα λιμονένιου στα πειράματα μη επιλογής. Αντίστοιχα ήταν τα αποτελέσματα και από τα πειράματα διπλής επιλογής ( βλέπε Διάγραμμα 1 και 2). Συνεπώς φαίνεται να προκύπτει ότι οι διεγερτικές ιδιότητες του ελαίου του πορτοκαλιού (και πιθανότατα 92

107 εκείνες και των υπόλοιπων αιθέριων ελαίων των εσπεριδοειδών) είναι αποτέλεσμα συνεργιστικής δράσης μεταξύ του κύριου συστατικού (λιμονένιο) του και άλλων χημικών ουσιών που υπάρχουν σε μικρότερες συγκεντρώσεις. Κατά συνέπεια, το περιεχόμενο του λιμονένιου στα αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών δεν αποτελεί ένα απόλυτο δείκτη της ικανότητάς τους να διεγείρουν την ωοπαραγωγή. Πράγματι, το έλαιο του μανταρινιού το οποίο περιείχε μικρότερο ποσοστό λιμονένιου σε σχέση με εκείνο του γκρέιπφρουτ, βρέθηκε να είναι αποτελεσματικότερο ως προς τη διέγερση της απόθεση αυγών. Η περιορισμένη ικανότητα μεμονωμένων ουσιών ή ακόμη και μιγμάτων τους να επιφέρουν ανταποκρίσεις που σχετίζονται με τη συμπεριφορά πολυφάγων ειδών της οικογένειας Tephritidae ανάλογες με εκείνες που προκαλούν τα φυτικά εκχυλίσματα των ξενιστών στα οποία περιέχονται φαίνεται να αποτελεί κοινό φαινόμενο (Prokopy et al., 1998; Massa et al., 2008). Το γεγονός αυτό πιθανότητα οφείλεται στο ότι τα πολυφάγα είδη των Tephritidae έχουν εξελιχτεί να ανταποκρίνονται σε ένα ευρύ φάσμα ουσιών παρά σε μεμονωμένα συστατικά που εκλύονται από τους ξενιστές τους (Díaz-Fleischer et al., 2000). Με βάση τα αποτελέσματα του παρόντος Κεφαλαίου, τα θηλυκά της μύγας της Μεσογείου απέφευγαν να αποθέσουν αυγά σε υποστρώματα που περιείχαν λιναλούλη προφανώς ως αποτέλεσμα των έντονων αποτρεπτικών της ιδιοτήτων. Επιπλέον, όταν η συγκέντρωση του συγκεκριμένου συστατικού αυξήθηκε με τεχνητό τρόπο ώστε να προσομοιάζεται το χημικό προφίλ ανώριμων καρπών εσπεριδοειδών, παρατηρήθηκαν ισχυρές ανταγωνιστικές επιδράσεις στη διεγερτική δράση του λιμονένιου. Η προφανής αυτή τάση των θηλυκών να αποφεύγουν θέσεις ωοτοκίας που φέρουν υψηλές συγκεντρώσεις λιναλούλης θα μπορούσε να ερμηνευτεί ως μια μορφή μητρικής μεριμνάς. Σύμφωνα με μια πρόσφατη έρευνα, η λιναλούλη βρέθηκε να συγκαταλέγεται μεταξύ των πιο τοξικών συστατικών έναντι των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου που περιέχονται στα αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών (Papachristos et al., 2009). Επιπλέον, το γεγονός ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις της συγκεκριμένης ουσίας είναι χαρακτηριστικές των ανώριμων καρπών των εσπεριδοειδών, μπορεί να παρέχει πρόσθετες πληροφορίες στα θηλυκά για ένα φτωχό διατροφικό περιβάλλον για τους απογόνους. Συνεπώς, για τα θηλυκά που αξιολογούν την καταλληλότητα των καρπών των εσπεριδοειδών φαίνεται να είναι επωφελής η προσαρμογή τους να εκλαμβάνουν τις υψηλές συγκεντρώσεις λιναλούλης ως ένδειξη αλληλοχημικά προστατευμένων και θρεπτικά ανεπαρκών θέσεων ωοτοκίας και να αποτρέπονται από την παρουσία της. Η καλύτερη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της χημικής άμυνας 93

108 των ξενιστών και της συμπεριφοράς ωοτοκίας της μύγας της Μεσογείου, μπορεί να προσφέρει σημαντικά στοιχεία για την υιοθέτηση κατάλληλών πρακτικών διαχείρισης που αποσκοπούν στην παρεμπόδιση ή τη μείωση των απωλειών στις καλλιέργειες. Για παράδειγμα, η επιλογή και χρήση ποικιλιών εσπεριδοειδών που περιέχουν υψηλές ποσότητες αιθέριων ελαίων στο φλοιό τους θα μπορούσε να περιορίσει την επικείμενη προτίμησή τους από τα θηλυκά και ταυτοχρόνως να μειώσει την επιβίωση των ανήλικων σταδίων. Επιπλέον, με τη χρήση της γενετικής μηχανικής θα μπορούσε να τροποποιηθεί τόσο το περιεχόμενο όσο και η αναλογία ορισμένων συστατικών (λιμονένιο, λιναλούλη) των ελαίων του φλοιού των εσπεριδοειδών προκειμένου να διαταραχθούν οι σχέσεις που διέπουν την αποδοχή των καρπών από το έντομο. Προσφάτως, οι Rodríguez και συνεργάτες (2011) κατάφεραν να καταστείλουν την έκφραση ενός γονιδίου που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση του λιμονένιου σε φυτά πορτοκαλιάς. Παρά το γεγονός ότι οι διαγονιδιακοί καρποί που προέκυψαν εμφάνισαν τουλάχιστον 85 φορές μικρότερη συγκέντρωση λιμονένιου στο φλοιό τους σε σχέση με τους φυσιολογικούς καρπούς, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς την ωοτοκία των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου μεταξύ των δύο βιοτύπων των καρπών. Ωστόσο, τα πειράματα που αφορούσαν την ωοτοκία στη συγκεκριμένη έρευνα πραγματοποιήθηκαν με εργαστηριακούς πληθυσμούς και σε συνθήκες έντονου συνωστισμού. Μελέτες με άγρια έντομα σε ηπιότερες από άποψη συνωστισμού συνθήκες, θα μπορούσαν να δώσουν πιο πειστικές απαντήσεις εάν και κατά πόσο οι συγκεκριμένοι γενετικά τροποποιημένοι καρποί είναι λιγότερο επιρρεπείς στις προσβολές από το έντομο. Μια εναλλακτική προσέγγιση με βάση και τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θα μπορούσε να είναι η υπερέκφραση του γονιδίου που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση της λιναλούλης σε φυτά εσπεριδοειδών με σκοπό την αύξηση της συγκέντρωσης της συγκεκριμένης ουσίας στο φλοιό των καρπών επιφέροντας με τον τρόπο αυτό αποτελεσματικές αποτρεπτικές της ωοτοκίας και της επιβίωσης των προνυμφών ιδιότητες. 94

109 Βιβλιογραφία Attaway, J.A., Pieringer, A.P. & Barabas, L.J. (1967) The origin of citrus flavor components-iii. A study of the percentage variations in peel and leaf oil terpenes during one season. Phytochemistry, 6, Attaway, J.A., Pieringer, A.P. & Buslig, B.S. (1968) The origin of citrus flavor components-iv. The terpenes of Valencia orange leaf, peel, and blossom oils. Phytochemistry, 7, Back, E.A. & Pemberton, C.E. (1915) Susceptibility of citrus fruits to the attack of the Mediterranean fruit fly. Journal of Agricultural Research, 3, Birke, A., Aluja, M., Greany, P. et al. (2006) Long aculeus and behavior of Anastrepha ludens render gibberellic acid ineffective as an agent to reduce Ruby Red grapefruit susceptibility to the attack of this pestiferous fruit fly in commercial groves. Journal of Economic Entomology, 99, Bodenheimer, F.S. (1951) Citrus Entomology in the Middle East: With Special References to Egypt, Iran, Irak, Palestine, Syria and Turkey. W. Junk, The Hague, The Netherlands. Brévault, T. & Quilici, S. (2009) Oviposition preference in the oligophagous tomato fruit fly, Neoceratitis cyanescens. Entomologia Experimentalis et Applicata, 133, Díaz-Fleischer, F., Papaj, D.R., Prokopy, R.J. et al. (2000) Evolution of fruit fly oviposition behavior. Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior (ed. by M. Aluja and A.L. Norrbom), pp CRC Press, Boca Raton, Florida. Eskafi, F.M. (1988) Infestation of citrus by Anastrepha spp. and Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) in high coastal plains of Guatemala. Environmental Entomology, 17, Flamini, G. & Cioni, P.L. (2010) Odour gradients and patterns in volatile emission of different plant parts and developing fruits of grapefruit (Citrus paradisi L.). Food Chemistry, 120, Greany, P.D. (1989) Host plant resistance to tephritids: an under-exploited control strategy. Fruit flies: Their Biology, Natural Enemies and Control, Vol. 3A (ed. by A.S. Robinson and G. Hooper), pp Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. Greany, P.D., Styer, S.C., Davis, P.L. et al. (1983) Biochemical resistance of citrus to fruit flies. Demonstration and elucidation of resistance to the Caribbean fruit fly, Anastrepha suspensa. Entomologia Experimentalis et Applicata, 34,

110 Hernández, M.M., Sanz, I., Adelantado, M. et al. (1996) Electroantennogram activity from antennae of Ceratitis capitata (Wied.) to fresh orange airborne volatiles. Journal of Chemical Ecology, 22, Jones, S.R. (1989) Morphology and evolution of the aculei of true Fruit flies (Diptera: Tephritidae) and their relationship to host anatomy. PhD Dissertation, Pennsylvania State University, University Park: Pa. State Univ. Press. Kaspi, R., Feitelson, I., Drezner, T. & Yuval, B. (2001) A novel method for rearing progeny of wild Mediterranean fruit flies using artificial fruit. Phytoparasitica, 29, Katsoyannos, B.I., Kouloussis, N.A. & Papadopoulos, N.T. (1997) Response of Ceratitis capitata to citrus chemicals under semi-natural conditions. Entomologia Experimentalis et Applicata, 82, Kefford, J.F.& Chandler, B.V. (1970) The Chemical Constituents of Citrus Fruits. Academic Press, New York, New York. Levinson, H.Z., Levinson, A.R. & Muller, K. (1990) Influence of some olfactory and optical properties of fruits on host location by the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata Wied). Journal of Applied Entomology, 109, Levinson, H., Levinson, A. & Eosterried, E. (2003) Orange-derived stimuli regulating oviposition in the Mediterranean fruit fly. Journal of Applied Entomology, 127, Light, D.M. & Jang, E.B. (1996). Plant volatiles evoke and modulate tephritid behavior. Fruit Fly Pests: a World Assessment of their Biology and Management (ed. by B.A. McPheron & G.J. Steck), pp St. Lucie Press, Delray Beach, Florida. Light, D.M., Jang, E.B. & Dickens, J.C. (1988) Electroantennogram responses of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, to a spectrum of plant volatiles. Journal of Chemical Ecology, 14, Lota, M-L., de Rocca Serra, D., Tomi, F. et al. (2002) Volatile components of peel and leaf oils of lemon and lime species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, Mac Leay, W.S. (1829) Notice of Ceratitis citriperda, an insect very destructive to oranges. Zoological Journal, 4, Massa, M.J., Robacker, D.C. & Patt, J. (2008) Identification of grape juice aroma volatiles and attractiveness to the Mexican fruit fly (Diptera: Tephritidae). Florida Entomologist, 91,

111 Mitiku, S.B., Sawamura, M., Itoh, T. & Ukeda, H. (2000) Volatile components of peel cold-pressed oils of two cultivars of sweet orange (Citrus sinensis (L.) osbeck) from Ethiopoia. Flavour and Fragance Journal, 15, Mondello, L., Dugo, P., & Dugo, G. (2002) The chiral compounds of citrus essential oils. Citrus: The Genus Citrus, Medical and Aromatic Plants-Industrial Profiles (ed. by G. Dugo, and A. Di Giacomo), pp Taylor and Francis, London and New York. Papachristos, D.P. & Papadopoulos, N.T. (2009) Are citrus species favorable hosts for the Mediterranean fruit fly? A demographic perspective. Entomologia Experimentalis et Applicata, 132, Papachristos, D.P., Papadopoulos, N.T. & Nanos, G.D. (2008) Survival and development of immature stages of the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) in citrus fruit. Journal of Economic Entomology, 101, Papachristos, D.P., Kimbaris, A.C., Papadopoulos, N.T. & Polissiou, M.G. (2009) Toxicity of citrus essential oils against Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) larvae. Annals of Applied Biology, 155, Prokopy, R.J., Hu, X., Jang, E.B. et al. (1998) Attraction of mature Ceratitis capitata females to 2-heptanone, a component of coffee fruit odor. Journal of Chemical Ecology, 24, Rasgado, M.A., Malo, E.A., Cruz-LópeZ, L. et al. (2009) Olfactory response of the Mexican Fruit fly (Diptera: Tephritidae) to Citrus aurantium volatiles. Journal of Economic Entomology, 102, Rodríguez, A., San Andrés, V., Cervera, M. et al. (2011) Terpene downregulation in orange reveals the role of fruit aromas in mediating interactions with insect herbivores and pathogens. Plant Physiology, 156, Rössler, Y. & Greany, P.D. (1990) Enhancement of citrus resistance to the Mediterranean fruit fly. Entomologia Experimentalis et Applicata, 54, Salvatore, A., Borkosky, S., Willink, E. & Barton, A. (2004) Toxic effects of lemon peel constituents on Ceratitis capitata. Journal of Chemical Ecology, 30, Shaw, P.E. (1979) Review of quantitative analyses of citrus essential oils. Journal of Agricultural Food and Chemistry, 27, Sokal, R. & Rohlf, F. (1995) Biometry, 3rd edn. WH Freeman & Company, New York, New York. Spitler, G.H., Armstrong, J.W. & Couey, H.M. (1984) Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) host status of commercial lemon. Journal of Economic Entomology, 77,

112 Staub, C.G., De Lima, F. & Majer, J.D. (2008) Determination of host status of citrus fruits against the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Australian Journal of Entomology, 47, Steuer, B., Schulz, H. & Läger, E. (2001) Classification and analysis of citrus oils by NIR spectroscopy. Food Chemistry, 72, Styer, S.C. & Greany, P.D. (1983) Increased susceptibility of laboratory-reared vs. wild Caribbean fruit fly, Anastrepha suspense (Loew) (Diptera: Tephritidae), larvae to toxic citrus allelochemics. Environmental Entomology, 12,

113 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 5. ΟΣΦΡΗΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΠΡΟΝΥΜΦΩΝ ΚΑΙ ΣΥΝΕΙΡΜΙΚΗ ΜΑΘΗΣΗ ΣΕ ΟΣΜΗΡΑ ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΑ 5.1 Περίληψη Σε ένα πρώτο πείραμα διερευνήθηκε η δυνατότητα των προνυμφών διαφορετικών ηλικιών να αντιλαμβάνονται οσμηρά ερεθίσματα του περιβάλλοντος τους και συγκεκριμένα οσμές από χυμό πορτοκαλιού. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ύπαρξη οσφρητικής ικανότητας σε όλες τις προνυμφικές ηλικίες. Σε πειράματα διπλής επιλογής (οσμηρό ερέθισμα έναντι κενού μάρτυρα) προνύμφες 3 ης ηλικίας έδειξαν σημαντική προτίμηση ως προς τις οσμές του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού (ξενιστής) ενώ το αντίθετο συνέβη στην περίπτωση της μενθόλης [κυρίαρχο συστατικό των αιθέριων ελαίων της μέντας (μη ξενιστής)] καταδεικνύοντας την ικανότητά τους να ξεχωρίζουν οσμηρά ερεθίσματα διαφορετικής φυτικής προέλευσης. Όταν προνύμφες αφέθηκαν να συνδέσουν την παρουσία των ανωτέρω οσμών με ανταποδοτικά ερεθίσματα (παρουσία τροφής) για 24 ώρες πριν τις βιοδοκιμές, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της ανταπόκρισής τους και στις δύο περιπτώσεις (αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού, μενθόλη) γεγονός που υποδεικνύει την ύπαρξη συνειρμικής μάθησης. Τέλος, θηλυκά που προέκυψαν από προνύμφες που αφέθηκαν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξή τους να συνδέσουν την παρουσία συγκεκριμένων οσμηρών ερεθισμάτων (λιμονένιο και γερανιόλη) με την τροφή τους, εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερη προσέλκυση ως προς αυτά 24 ώρες μετά την έξοδό τους από το νυμφικό περίβλημα σε σχέση με το μάρτυρα (θηλυκά που δεν υποβλήθηκαν στην αντίστοιχη διαδικασία). Από τα αποτελέσματα αυτά προκύπτει ότι το φαινόμενο της συνειρμικής μάθησης ως προς οσμηρά ερεθίσματα που διαμορφώνεται κατά το προνυμφικό στάδιο δύναται να διατηρηθεί δια μέσου της μεταμόρφωσης επηρεάζοντας τη συμπεριφορά των ενηλίκων που προκύπτουν. Αναλύεται η πιθανή σημασία και ο ρόλος των παραπάνω ευρημάτων στη βιοοικολογία του εντόμου. 5.2 Εισαγωγή Όπως αναφέρθηκε και σε προηγούμενα Κεφάλαια, τα θηλυκά της οικογένειας Tephritidae χρησιμοποιούν μια σειρά χημικών, οπτικών και απτικών 99

114 ερεθισμάτων κατά τον εντοπισμό και την αποδοχή των θέσεων ωοτοκίας. Τα αυγά αποτίθενται εντός των καρπών και οι προνύμφες δεν έχουν τη δυνατότητα να μετακινηθούν από ένα καρπό σε άλλο. Ωστόσο ορισμένες εργαστηριακές μελέτες έχουν δείξει ότι οι προνύμφες της μύγας της Μεσογείου είναι ικανές να διακρίνουν μεταξύ υποστρωμάτων ανάπτυξης που χαρακτηρίζονται από διαφορετική θρεπτική αξία. Συγκεκριμένα ο Zucoloto (1987) σε πειράματα επιλογής που πραγματοποίησε σε κατάλληλα τροποποιημένες αρένες διαπίστωσε ότι προνύμφες ηλικίας 1-2 ημερών επέλεγαν πάντα την τεχνητή τροφή που ήταν πιο πλούσια σε πρωτεΐνη. Σε αντίστοιχες μελέτες, οι Fernandes Da Silva & Zucoloto (1993) βρήκαν ότι και πάλι οι προνύμφες επέλεγαν την περιοχή καρπών ξενιστών που ήταν πιο πλούσια σε θρεπτικά συστατικά. Η προτίμηση που περιγράφεται στις παραπάνω μελέτες, πιθανόν οφείλεται στην ανταπόκριση των προνυμφών είτε σε οσμηρά ερεθίσματα που εκλύονταν από τις επιμέρους μεταχειρίσεις είτε σε απτικά ερεθίσματα μετά από προηγούμενη επαφή τους. Ωστόσο, το γεγονός ότι η ανταπόκριση των προνυμφών προσδιορίζονταν 24 με 48 ώρες από την έναρξη των βιοδοκιμών, δεν αφήνει περιθώρια για την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Η οσφρητική ικανότητα ανήλικων σταδίων της τάξης των δίπτερων είναι ιδιαιτέρα διαδεδομένη στις δροσόφιλες. Παρά το γεγονός ότι πολλές φορές αναφέρονται ως μύγες των φρούτων, η βιολογία των Drosophilidae διαφέρει αρκετά από εκείνη των Tephritidae. Συνήθως ωοτοκούν και αναπτύσσονται σε σηπόμενες φυτικές επιφάνειες τρεφόμενες με ζύμες και βακτηρία (Dukas, 1998 και πηγές που αναφέρει). Η μεγάλη παραλλακτικότητα ως προς τους διαθέσιμους τροφικούς πόρους φαίνεται να δικαιολογεί απόλυτα την ικανότητα των προνυμφών αυτών να αντιλαμβάνονται οσμηρά ερεθίσματα προκειμένου να εντοπίσουν την τροφή τους. Πέρα από την ικανότητά τους αυτή, μια σειρά από μελέτες έχουν δείξει ότι οι προνύμφες του είδους Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) μαθαίνουν να συνδέουν τόσο θετικά όσο και αρνητικά ερεθίσματα του περιβάλλοντός τους με την παρουσία οσμών, ένα φαινόμενο γνωστό ως συνειρμική μάθηση (Aceves-Pina & Quinn, 1979; Dukas, 1998; Scherer et al., 2003; Hendel et al., 2005; Neuser et al., 2005). Επιπλέον, οι Tully και συνεργάτες (1994) κατάφεραν να αποδείξουν ότι η συνειρμική μάθηση που αποκτάται κατά το προνυμφικό στάδιο μπορεί να μεταφερθεί σε εκείνο του ενήλικου προκαλώντας αντίστοιχες συμπεριφορές. Καθώς δεν υπάρχουν πειραματικά δεδομένα για την οσφρητική ικανότητα των προνυμφών της μύγας της Μεσογείου, στο παρόν Κεφάλαιο μελετήθηκαν: 1) η ικανότητα διαφορετικών προνυμφικών ηλικιών να αντιλαμβάνονται οσμηρά 100

115 ερεθίσματα, 2) η δυνατότητά τους να διακρίνουν μεταξύ οσμηρών ερεθισμάτων που προέρχονται από ξενιστές και μη ξενιστές του εντόμου, 3) η ικανότητα των προνυμφών να συνδέουν την παρουσία οσμών με ανταποδοτικά ερεθίσματα (παρουσία τροφής) ένα φαινόμενο που από πολλούς ερευνητές περιγράφεται ως συνειρμική μάθηση και 4) η δυνατότητα μεταφοράς της συνειρμικής μάθησης από το προνυμφικό στο ενήλικο στάδιο. 5.3 Υλικά και μέθοδοι Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν και μέθοδος εκτροφής τους Χρησιμοποιήθηκαν έντομα της F 1 F 4 γενεάς εργαστηρίου. Σε αντίθεση με τα προηγούμενα Κεφάλαια, η ανάπτυξή των προνυμφών έγινε σε παχύρευστη τεχνητή τροφή, παραλλαγή της δίαιτας που χρησιμοποιείται για τη μαζική εκτροφή της μύγας της Μεσογείου (Hooper, 1987). Ειδικότερα η τροφή των προνυμφών, αποτελούνταν από 72.6 gr πίτουρο, 48.6 gr ζάχαρης, 24.3 gr μαγιά μπύρας, 10 gr φύτρο σιταριού, 10 gr αλευριού σόγιας, 5 ml ελαίου από φύτρο σιταριού, 2 gr μίγματος αλάτων, 1.8 gr κιτρικού οξέος, 1.5 gr βενζοϊκού νατρίου και 1 gr προπιονικού νατρίου διαλυμένα σε ml νερού. Η επιλογή της συγκεκριμένης δίαιτας βασίστηκε στην ευκολία που παρείχε ως προς τη μεταχείριση των προνυμφών που αναπτύσσονταν στο εσωτερικό της καθώς επέτρεπε την ανάκτησή τους χωρίς να απαιτείται η διάνοιξη των δίσκων βάμβακος όπως θα συνέβαινε στην περίπτωση που υιοθετούνταν η τυπική μέθοδος εκτροφής με την υγρή δίαιτα (βλέπε Κεφάλαιο 2) Οσφρητική ικανότητα των προνυμφών Σε ένα πρώτο πείραμα μελετήθηκε η δυνατότητα των διαφορετικών προνυμφικών ηλικιών να αντιλαμβάνονται οσμές από χυμό πορτοκαλιού. Αρχικά, η μελέτη επικεντρώθηκε στην ικανότητα των προνυμφών 3 ης ηλικίας και στη συνέχεια επεκτάθηκε και στις υπόλοιπες (2 ης και 1 ης ). Ο διαχωρισμός των ηλικιών βασίστηκε στο μέγεθος (μήκος) των προνυμφών (Papadopoulos, 2004). Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων, κάθε φορά περίπου αυγά από τα κλουβιά των εκτροφών μεταφέρονταν με τη βοήθεια λεπτού πινέλου και τοποθετούταν στο κέντρο ελαφρώς εμποτισμένων με νερό διηθητικών χαρτιών τα οποία εφάπτονταν στη βάση γυάλινων τρυβλίων Petri διαμέτρου 9.7 cm. Η εκτίμηση του αριθμού των αυγών γινόταν εμπειρικά με βάση την κάλυψη μιας 101

116 επιφάνειας 25 x 4 mm που ήταν σχεδιασμένη επάνω στο διηθητικό χαρτί. Περιμετρικά των αυγών τοποθετούνταν 10 gr παχύρευστης τεχνητής τροφής. Στη συνέχεια τα τρυβλία κλείνονταν και τοποθετούνταν σε διαφανείς σακούλες για τη διατήρηση υψηλής σχετικής υγρασίας στο εσωτερικό τους. Με την έναρξη της εκκόλαψης των προνυμφών, τα τρυβλία επιθεωρούνταν καθημερινά για την εξακρίβωση της ηλικίας τους. Για τις προνύμφες 2 ης και 3 ης ηλικίας, ο χρόνος που μεσολαβούσε βρέθηκε να είναι 3 και 5 ημέρες αντίστοιχα. Για τις προνύμφες 1 ης ηλικίας υπήρξαν δύο μεταχειρίσεις. Η μια αφορούσε προνύμφες ηλικίας 24 ωρών που είχαν πρόσβαση σε τροφή για το διάστημα αυτό και η άλλη προνύμφες ηλικίας περίπου 3 ωρών που λαμβάνονται από τρυβλία στα οποία δε γινόταν προσθήκη τροφής όπως στις άλλες περιπτώσεις. Προκειμένου να εκτιμηθεί η ικανότητα αντίληψης των οσμηρών ερεθισμάτων, κάθε φορά δέκα προνύμφες κατάλληλης ηλικίας μεταφέρονταν με τη βοήθεια μαλακού πινέλου στο κέντρο πλαστικών τρυβλίων Petri η επιφάνεια των οποίων ήταν καλυμμένη με διηθητικό χαρτί που εμποτίζονταν ελαφρώς με αποσταγμένο νερό. Στην περιφέρεια των τρυβλίων και σε αντίθετες θέσεις, ήταν προσαρμοσμένα δύο πλαστικά κυλινδρικά δοχεία στα οποία γινόταν προσθήκη 1 ml φρεσκοστυμμένου χυμού πορτοκαλιού στη μια περίπτωση και 1 ml νερού στην άλλη. Τα στόμια των κυλινδρικών δοχείων ήταν ελευθέρα (δεν καλύπτονταν από διηθητικό χαρτί) και οι προνύμφες μπορούσαν να εισέλθουν εφόσον το επιθυμούσαν αλλά όχι να εξέλθουν καθώς η παρουσία του χυμού ή του νερού προκαλούσε τη βύθισή τους. Για τις προνύμφες 2 ης και 3 ης ηλικίας, χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία Petri διαμέτρου 13 cm ενώ για τις προνύμφες 1 ης ηλικίας χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία διαμέτρου 9 cm. Λεπτομέρειες που αφορούν την κατασκευή των πειραματικών αρένων της συγκεκριμένης μελέτης δίνονται στην Εικόνα 1. Με την τοποθέτηση των προνυμφών στο σημείο εξαπόλυσης (Εικόνα 2), τα τρυβλία κλείνονταν και μεταφέρονταν σε σκοτεινό θάλαμο για 5 λεπτά. Μετά την πάροδο των 5 λεπτών, προσδιορίζονταν οι θέσεις των προνυμφών εντός των τρυβλίων. Για τις προνύμφες 2 ης και 3 ης ηλικίας αυτό γινόταν μακροσκοπικά, ενώ για τις προνύμφες 1 ης ηλικίας τα τρυβλία εξετάζονταν κάτω από το στερεοσκόπιο. Στην περίπτωση αυτή, αφού εξετάζονταν όλη η επιφάνεια του διηθητικού χαρτιού και το κυλινδρικό δοχείο με το νερό, οι προνύμφες που δεν εντοπίζονταν στα σημεία αυτά θεωρούνταν ότι είχαν παγιδευτεί στο δοχείο με το χυμό. Σε κάθε περίπτωση, προνύμφες που εντοπίζονταν είτε εντός των κυλινδρικών δοχείων είτε είχαν εγκαταλείψει τη ζώνη που διαμορφώνονταν από τη διάμετρο του κυκλικού σημείου εξαπόλυσης (Εικόνα 1 και 2) θεωρούνταν ότι είχαν ανταποκριθεί στα σχετικά ερεθίσματα. Προκειμένου να αποφευχθεί ο κίνδυνος προσρόφησης των οσμών του χυμού από το διηθητικό 102

117 3 cm 2.5 cm 2 cm (2.2) (1.5) (0.5) 1.5 cm Κυλινδρικά δοχεία στα οποία γινόταν η προσθήκη των οσμηρών ερεθισμάτων Σημείο εξαπόλυσης των προνυμφών Ζώνη ανταπόκρισης Ουδέτερη ζώνη Ζώνη ανταπόκρισης Διαβρεγμένο διηθητικό χαρτί Εικόνα 1. Σχεδιάγραμμα (κατακόρυφη και πλάγια όψη) των πειραματικών αρένων που χρησιμοποιηθήκαν για τη διαπίστωση της οσφρητικής ικανότητας των προνυμφών 2 ης και 3 ης ηλικίας της μύγας της Μεσογείου. Στις παρενθέσεις δίνονται οι διαστάσεις των αντίστοιχων κατασκευών που χρησιμοποιήθηκαν στις βιοδοκιμές που αφορούσαν τις προνύμφες 1 ης ηλικίας. 103

118 Εικόνα 2. Τοποθέτηση προνυμφών 3 ης ηλικίας στο σημείο εξαπόλυσης πειραματικής αρένας με τη βοήθεια πλαστικού πώματος. Δεξιά και αριστερά διακρίνονται τα κυλινδρικά δοχεία να φέρουν από 1 ml χυμού πορτοκαλιού και νερού αντίστοιχα. 104

119 χαρτί που κάλυπτε τις πειραματικές αρένες και αντί για οσμηρά υπάρξουν και απτικά ερεθίσματα, μετά από κάθε δεύτερη επανάληψη αντικαθιστούταν με νέο. Εξαιτίας του χαμηλού ποσοστού ανταπόκρισης που παρατηρήθηκε στις νεαρές προνύμφες ηλικίας τριών περίπου ωρών και για να μην εξαχθούν εσφαλμένα συμπεράσματα αναφορικά με την ικανότητά τους να αντιλαμβάνονται οσμηρά ερεθίσματα, μετά την καταμέτρηση του πρώτου πεντάλεπτου τα τρυβλία τοποθετούνταν για πέντε επιπλέον λεπτά στο σκοτεινό θάλαμο και η θέση των προνυμφών προσδιορίζονταν εκ νέου. Για την κάθε προνυμφική ηλικία πραγματοποιήθηκαν 30 επαναλήψεις Ανταπόκριση των προνυμφών σε οσμηρά ερεθίσματα ξενιστών και μηξενιστών Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν οι προνύμφες ανταποκρίνονται θετικά σε οποιασδήποτε μορφής οσμηρό ερέθισμα ή εάν η συμπεριφορά αυτή είναι εξειδικευμένη, μελετήθηκε η προσέλκυσή τους σε οσμές ξενιστών και μη ξενιστών του εντόμου. Για το σκοπό αυτό, προνύμφες τρίτης ηλικίας αφέθηκαν να ανταποκριθούν σε οσμές αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού (ξενιστής) και μενθόλης [κύριο συστατικό της μέντας (μη-ξενιστής)]. Το αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού που χρησιμοποιήθηκε ήταν ακριβώς το ίδιο με εκείνο που περιγράφεται στο Κεφάλαιο 4 ενώ η μενθόλη (Alfa Aesar, Kalsruhe, Germany) καθαρότητας 98% ήταν σε κρυσταλλική μορφή και πριν εφαρμοστεί διαλύονταν σε αιθανόλη σε αναλογία 1 gr/1 ml. Η πειραματική διαδικασία που εφαρμόστηκε ήταν ανάλογη με εκείνη που περιγράφηκε προηγουμένως. Στα κυλινδρικά δοχεία τοποθετούνταν μια διπλή στρώση διηθητικού χαρτιού επάνω στην οποία εφαρμόζονταν 1 μl αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού και 1 μl νερού στη μια περίπτωση και 1 μl διαλύματος μενθόλης και 1 μl αιθυλικής αλκοόλης στην άλλη. Τα τρυβλία τοποθετούνταν για πέντε λεπτά σε σκοτεινό θάλαμο και στη συνέχεια προσδιορίζονταν οι θέσεις των προνυμφών σε κάθε μεταχείριση. Επειδή στην προκειμένη περίπτωση τα κυλινδρικά δοχεία δεν περιείχαν επαρκείς ποσότητες διαλυμάτων όπως προηγουμένως ώστε να εμποδίζεται η διαφυγή των προνυμφών, τα κάθετα τοιχώματά τους επαλείφονταν με άοσμο πόσιμο ορυκτέλαιο (Nujol ). Προπειράματα έδειξαν ότι με αυτή τη διαδικασία μόνο ένα 10% των προνυμφών 3 ης ηλικίας μπορούσε να διαφύγει στο διάστημα των πέντε λεπτών που διαρκούσαν οι βιοδοκιμές. Για καθένα από τους δύο τύπους οσμηρών ερεθισμάτων πραγματοποιήθηκαν 25 επαναλήψεις Συνειρμική μάθηση των προνυμφών σε οσμηρά ερεθίσματα 105

120 Προνύμφες τρίτης ηλικίας αφέθηκαν να συνδέσουν την παρουσία συγκεκριμένων οσμηρών ερεθισμάτων με το υπόστρωμα διατροφής τους. Συγκεκριμένα 24 ώρες πριν από τις βιοδοκιμές στο χείλος των γυάλινων τρυβλίων όπου αναπτύσσονταν οι προνύμφες και χωρίς να έρχεται σε επαφή με την τροφή, στερεώνονταν ένα κυλινδρικό κομμάτι οδοντιατρικού βάμβακος (3.5 cm μήκος x 1 cm διάμετρος) επάνω στο οποίο εφαρμόζονταν 0.1 ml είτε αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού είτε μενθόλης. Για τον καλύτερο αερισμό του εσωτερικού των τρυβλίων και την αποφυγή φαινόμενων τοξικότητας από τις ουσίες, με την έναρξη της έκθεσης, τοποθετούνταν αντιδιαμετρικά από το οδοντιατρικό βαμβάκι ένα κομμάτι κυλινδρικού χαρτιού μήκους 4 cm και διαμέτρου 3.5 mm μεταξύ βάσης και πώματος (Εικόνα 3). Μετά την παρέλευση του εικοσιτετραώρου προσδιορίζονταν η ανταπόκριση των προνυμφών στις παραπάνω οσμές με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που αναφέρθηκε προηγουμένως. Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού συγκρίθηκαν με εκείνα που προέκυψαν από το προηγούμενο πείραμα (βλέπε επάνω) όπου δεν υπήρξε έκθεση των προνυμφών σε οσμές. Πραγματοποιήθηκαν 25 επαναλήψεις για το κάθε οσμηρό ερέθισμα που διεξήχθησαν παράλληλα (τις ίδιες πειραματικές ημέρες) με τις αντίστοιχες επαναλήψεις του προηγούμενου πειράματος Μεταφορά της συνειρμικής μάθησης σε οσμηρά ερεθίσματα που αποκτήθηκε κατά το προνυμφικό στάδιο ανάπτυξης στο ενήλικο Σκοπός των συγκεκριμένων πειραμάτων ήταν να διευκρινιστεί κατά πόσο η σύνδεση συγκεκριμένων πληροφοριών με την παρουσία οσμηρών ερεθισμάτων κατά το προνυμφικό στάδιο ανάπτυξης μπορεί να μεταφερθεί στο ενήλικο. Για το λόγο αυτό, προνύμφες 3 ης ηλικίας αφέθηκαν να συνδέσουν την παρουσία της τροφής τους με συγκεκριμένα οσμηρά ερεθίσματα και εν συνεχεία στα ενήλικα που προέκυψαν μελετήθηκε η ανταπόκρισή τους προς αυτά. Για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης μελέτης επιλέχθηκαν δύο κοινές φυτικές ουσίες σε καθαρή μορφή (98%) η γερανιόλη (Alfa Aesar, Kalsruhe, Germany) και το λιμονένιο (βλέπε Κεφάλαιο 4). Τα κριτήρια στα οποία βασίστηκε η επιλογή τους ήταν το γεγονός ότι σε αντίθεση με τη γερανιόλη, το λιμονένιο απαντάται πιο συχνά σε καρπούς-ξενιστές του εντόμου όπως εσπεριδοειδή (Hernandez et al., 1996; Rasgado et al., 2009) μάνγκος (Hernandez-Sanchez et al., 2001) παπάγιες (Pino et al., 2003) σταφύλια (Massa et al., 2008) νεκταρίνια, αχλάδια και βερίκοκα (Light et al., 1992) και ως εκ τούτου οι δύο ουσίες μπορεί να διέφεραν ως προς τη πρόκληση του φαινομένου. Η μεθοδολογία που ακολουθή- 106

121 Εικόνα 3. Διαδικασία που εφαρμόστηκε προκειμένου οι προνύμφες να συνδέσουν την παρουσία της τροφής τους με τα οσμηρά ερεθίσματα. Στο κέντρο του τρυβλίου διακρίνεται η παχύρευστη τροφή στην οποία αναπτύσσονταν οι προνύμφες. Στο κάτω μέρος της εικόνας διακρίνεται το κυλινδρικό κομμάτι βάμβακος στο οποίο εφαρμόζονταν τα οσμηρά ερεθίσματα και στο επάνω μέρος το κυλινδρικό χαρτί που υπήρχε για τον καλύτερο αερισμό του εσωτερικού των τρυβλίων. 107