ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ: ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΙΩΑΝΝΗ Β.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ: ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΙΩΑΝΝΗ Β. ΗΛΙΑ Η Πτυχιούχου Γεωπόνου ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΟΥ ΣΤΗΝ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΚΑΙ ΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ CERATITIS CAPITATA (DIPTERA: TEPHRITIDAE) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ΙΩΑΝΝΗ Β. ΗΛΙΑ Η ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΟΥ ΣΤΗΝ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΚΑΙ ΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ CERATITIS CAPITATA (DIPTERA: TEPHRITIDAE) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή, Μεταπτυχιακή Ειδίκευση Φυτοπροστασία Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 03/05/2010 Εξεταστική Επιτροπή Επίκουρος Καθηγητής Ν. Κουλούσης, Επιβλέπων Καθηγήτρια Μ. Σαββοπούλου - Σουλτάνη, Εξετάστρια Καθηγητής. Κωβαίος, Εξεταστής

3 ii Ιωάννης Β. Ηλιάδης Α.Π.Θ. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙΟΥ ΣΤΗΝ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΚΑΙ ΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ CERATITIS CAPITATA (DIPTERA: TEPHRITIDAE) ISBN «Η έγκριση της παρούσης Μεταπτυχιακής ιατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2) ii

4 iii Περιεχόμενα Ευχαριστίες... 1 Περίληψη... 3 Abstract Γενική Εισαγωγή Μορφολογικά χαρακτηριστικά του εντόμου Ξενιστές Βιολογία του εντόμου Καταπολέμηση Σεξουαλική συμπεριφορά της μύγας της Μεσογείου και ρόλος ουσιών που προέρχονται από φυτά-ξενιστές Σκοπός της διατριβής Γενικά υλικά και μέθοδοι Συνθήκες εργαστηρίου Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν Αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού και άλλες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν Επίδραση συστατικών του αιθέριου ελαίου του πορτοκαλιού στο σεξουαλικό κάλεσμα στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Πειραματική διαδικασία Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα iii

5 iv Επίδραση του χημικού ερεθίσματος, της ηλικίας και της τροφής των ενηλίκων στο σεξουαλικό κάλεσμα Επίδραση του χημικού ερεθίσματος, της τροφής των ενηλίκων και της ώρας της ημέρας στον ημερήσιο ρυθμό του σεξουαλικού καλέσματος Συζήτηση Επίδραση του αιθερίου ελαίου πορτοκαλιού στην επιβίωση των στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα Συζήτηση Επίδραση του αιθερίου ελαίου πορτοκαλιού στην ικανότητα σύζευξης των στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα Συζήτηση Γενικά συμπεράσματα και προοπτικές πρακτικής εφαρμογής των αποτελεσμάτων Βιβλιογραφία iv

6 1 Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε σε χώρο του Εργαστηρίου Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας του Τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. κατά τα έτη 2007 και 2008 στα πλαίσια ερευνητικού προγράμματος του οργανισμού FAO/ΙΑΕA. Η διατριβή πραγματοποιήθηκε υπό την άριστη επίβλεψη, καθοδήγηση, αμέριστη βοήθεια και συμπαράσταση του Επίκουρου Καθηγητή κ. Νικολάου Κουλούση, τον οποίο αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω με τα θερμότερα λόγια. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στην κ. Ματθίλδη Σαββοπούλου-Σουλτάνη, Καθηγήτρια της Γεωπονικής Σχολής (Α.Π.Θ.) και στον κ. ημήτριο Κωβαίο, Καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής (Α.Π.Θ.) για τη συμμετοχή τους στην Εξεταστική Επιτροπή, την κριτική ανάγνωση της διατριβής και τις ουσιαστικές υποδείξεις τους. Ευχαριστίες εκφράζονται στον καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης κ. Βύρωνα Κατσόγιαννο και στον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Γεωπονίας, Φυτικής και Ζωικής Παραγωγής Πανεπιστημίου Θεσσαλίας κ. Νικόλαο Παπαδόπουλο για την βοήθειά τους, την κριτική τους, και τις έμπειρες συμβουλές τους, στα τελικά προσχέδια της διατριβής αυτής. Ευχαριστίες εκφράζονται προς τον υποψήφιο διδάκτορα κ. Χαράλαμπο Ιωάννου για τις πολύτιμες συμβουλές του, την άψογη συνεργασία, την αμέριστη βοήθεια καθώς και για τις υποδείξεις του στο χειρισμό του στατιστικού πακέτου SPSS και Microsoft Οffice. Ευχαριστώ θερμά τον κ. Α. Jessup για την άψογη συνεργασία και αποστολή των στείρων εντόμων από τις εγκαταστάσεις του εργαστηρίου Γεωπονίας και Βιοτεχνολογίας του Siebersdorf (Αυστρίας). 1

7 2 Ευχαριστώ όλους τους ανθρώπους με τους οποίους μοιράστηκα το εργαστήριο όλα αυτά τα χρόνια, για την υποστήριξη τους, τις ιδέες τους και κυρίως για την ζεστή επικοινωνία μας. Αυτές μου οι ευχαριστίες απευθύνονται στον Μπάμπη Ιωάννου, το Στέφανο Ανδρεάδη, το Γιώργο Μυρωνίδη, τη Μαρία Παππα, το Χρήστο Γεροφώτη, τη Μαρία Μπετίλα, τη Ρεβέκκα Παπαδοπούλου, το Χρήστο Σπανούδη, αλλά και σε όλους τους φοιτητές που πέρασαν κάποιο κομμάτι της ζωής τους εδώ, παρέα με τις μύγες μας. Θερμές ευχαριστίες απευθύνονται στους φίλους μου Μαθιουδάκη Ματθαίο, Παπαδοπούλου Μαρίνα και Μηνά Ιωάννη για την αμέριστη συμπαράστασή τους καθ όλη την διάρκεια των σπουδών μου. Τέλος, οι πιο θερμές ευχαριστίες απευθύνονται προς την οικογένεια μου, στην οποία και αφιερώνω το έργο αυτό. Για τον Βλάσση, τη Μαρίνα και τη Μαρία 2

8 3 Επίδραση αιθερίου ελαίου πορτοκαλιού στην σεξουαλική συμπεριφορά και διάρκεια ζωής της μύγας της Μεσογείου Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) Περίληψη Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκθεση αρσενικών ορισμένων ειδών ε- ντόμων της οικογένειας Tephritidae σε ουσίες προερχόμενες από φυτά-ξενιστές επιδρά στη σεξουαλική τους συμπεριφορά. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε στο εργαστήριο (25±1ºC, 65±5% σχ. υγρασία, φωτοπεριόδος 14Φ:10Σ) η επίδραση του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού και ορισμένων συστατικών του στη σεξουαλική συμπεριφορά και τη διάρκεια ζωής αρσενικών της μύγας της Μεσογείου, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). Σε ένα πρώτο πείραμα μελετήθηκε η επίδραση αιθερίου ελαίου από πορτοκάλι, καθαρού λιμονένιου και ενός μίγματος αποτελούμενου από λιμονένιο, μυρσίνη, λιναλούλη, γερανιόλη και α-πινένιο, στο σεξουαλικό κάλεσμα των στείρων αρσενικών. Σε αυτό όπως και σε όλα τα επόμενα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν στείρα αρσενικά του στελέχους VIENNA-8 tsl που χρησιμοποιείται διεθνώς για την καταπολέμηση του εντόμου με τη μέθοδο των στείρων εντόμων. Βρέθηκε ότι στην περίπτωση που τα αρσενικά τρέφονταν με πρωτεΐνη και ζάχαρη η έκθεση των αρσενικών και στις τρεις μεταχειρίσεις αύξησε την συχνότητα του σεξουαλικού καλέσματος σε σχέση με αρσενικά που δεν είχαν εκτεθεί σε αυτές, ενώ δεν υπήρξαν διαφορές μεταξύ των τριών μεταχειρίσεων. Στην περίπτωση που τα αρσενικά είχαν στην διάθεσή τους ως τροφή σκέτη ζάχαρη, μόνο η έκθεση στο μίγμα αύξησε το σεξουαλικό κάλεσμα. Η ηλικία των εντόμων επηρέασε επίσης το σεξουαλικό κάλεσμα ιδιαίτερα στην περίπτωση των αρσενικών που είχαν στη διάθεσή τους μόνο ζάχαρη, όπου παρατηρήθηκε μείωση της συχνότητας του με την αύξηση της ηλικίας. Ο ημερήσιος ρυθμός σεξουαλικού καλέσματος δεν επηρεάστηκε από την έκθεση στις διάφορες μεταχειρίσεις. Σε ένα επόμενο πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της έκθεσης σε αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού στην επιβίωση των στείρων αρσενικών. Βρέθηκε ότι η προσθήκη 3

9 4 πρωτεΐνης στη τροφή αύξησε τη διάρκεια ζωής των αρσενικών σε σχέση με αρσενικά που τρέφονταν μόνο με ζάχαρη. Η διάρκεια ζωής ήταν σημαντικά μικρότερη όταν τα έντομα που τρέφονταν με πρωτεΐνη και ζάχαρη είχαν εκτεθεί σε αιθέριο έλαιο σε σχέση με όταν δεν είχαν εκτεθεί. Αντίθετα, στην περίπτωση των αρσενικών που τρέφονταν με σκέτη ζάχαρη η έκθεση στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού αύξησε την επιβίωση τους. Σε ένα τελευταίο πείραμα μελετήθηκε η ικανότητα σύζευξης των στείρων αρσενικών. Βρέθηκε ότι όταν τα στείρα αρσενικά τρέφονταν με πρωτεΐνη και ζάχαρη η έκθεση τόσο στο αιθέριο έλαιο όσο και το μίγμα αύξησε σημαντικά την ικανότητά τους να συζευγνύονται με παρθένα θηλυκά σε σχέση με αρσενικά μάρτυρες που δεν είχαν εκτεθεί. Η αποτελεσματικότητα του μίγματος μάλιστα φάνηκε να είναι μεγαλύτερη από αυτή του αιθέριου ελαίου. Αντίθετα, στην περίπτωση που τα στείρα αρσενικά τρέφονταν με σκέτη ζάχαρη, το ποσοστό των συζεύξεων μεταξύ των αρσενικών που είχαν εκτεθεί σε ένα από τα δύο χημικά ερεθίσματα και αυτών που δεν είχαν εκτεθεί δεν διέφεραν σημαντικά. Τα ευρήματα της παρούσας εργασίας βοηθούν στην καλύτερη κατανόηση της σεξουαλικής συμπεριφοράς της μύγας της Μεσογείου ενώ παράλληλα έχουν πρακτικό ενδιαφέρον. Το γεγονός ότι το μίγμα των πέντε συστατικών αύξησε το σεξουαλικό κάλεσμα ακόμα και στην περίπτωση που τα έντομα τρέφονταν μόνο με ζάχαρη δείχνει την μεγάλη του αποτελεσματικότητα. Το μίγμα αυτό θα μπορούσε πιθανά να αξιοποιηθεί για την αύξηση της ανταγωνιστικότητας των στείρων αρσενικών που εξαπολύονται στα πλαίσια της μεθόδου των στείρων εντόμων. Λέξεις κλειδιά: Ceratitis capitata, ικανότητα σύζευξης, σεξουαλικό κάλεσμα, επιβίωση, Μέθοδος των στείρων εντόμων 4

10 5 Effect of orange oil on the sexual behavior and life span of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata (Diptera:Tephritidae). Abstract Previous studies have shown that exposure of certain male insects of the Tephritidae family in substances derived from host plants affects their sexual behaviour. In the current dissertation, we studied in the laboratory (25±1ºC, 65 ± 5% relative humidity, and a photophase of 14L:10D) the effect of orange oil and some of its compounds to the sexual behaviour and life span of the male Mediterranean fly, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae). In a first experiment, we studied the effect of orange oil, pure limonene and a mixture consisting of limonene, β-myrcene, linalool, geraniol and a-pinene, to the sexual calling of sterile male. In that, as in all other experiments we used sterile males from the genetic sexing strain VIENNA-8 tsl, which are used worldwide in the Sterile Insect Technique. It was found that in the case of insects fed with protein and sugar, the exposure of males in all three treatments increased the frequency of their sexual calling in comparison with males which were not exposed to them, while there were no differences among the three treatments. When males had in their disposal only sugar, only the exposure to the mixture increased the sexual calling. The age of insects also influenced the sexual calling, particularly in the case of males which had in their disposal sugar only, where a decrease in the frequency was observed, as age increased. The daily rythm of the sexual calling was not affected by the exposure to different treatments. In another experiment, we studied the effect of exposure to orange oil to the lifespan of males of the genetic sexing strain VIENNA-8 tsl. It was found that the addition of protein in food increased the life span of males, comparing to those which were fed with plain sugar in their diet. Their life span was significantly 5

11 6 decreased when insects which were fed with protein and sugar and were exposed to orange oil in comparison with those they had not. On the contrary, in the case of males which were fed with plain sugar, the exposure to orange oil increased their life span. In a final experiment, we studied the mating competitiveness of sterile male. It was found that when males were fed with protein and sugar, the exposure to the orange oil and to its compounds increased significantly their ability to mate with virgin female compared to unexposed control males. On the contrary, in the case of the sterile males fed with plain sugar, the rate of mating among males who were exposed to at least one of the two chemical stimuli and of those who weren t, wasn t significantly different. The findings of the current study can help to better comprehend the sexual behaviour of the Mediterranean fly, while having practical interest. The fact that the mixture of five ingredients increased the sexual calling, even when the insects were fed with plain sugar, indicates its great effectiveness. This mixture could probably be used to increase the mating competitiveness of the sterile males which are used in Sterile Insect Technique operations. Key-words: Ceratitis capitata, mating success, sexual calling, survival, Sterile Ιnsect Τechnique 6

12 7 1. Γενική Εισαγωγή Η μύγα της Μεσογείου, Ceratitis capitata (Wiedemann), ανήκει στην οικογένεια Tephritidae των ιπτέρων και στο άθροισμα Ceratidini. Το γένος Ceratitis περιλαμβάνει περισσότερα από 90 είδη τα οποία κατάγονται από την τροπική Αφρική (De Meyer 2000). Το C. capitata είναι το πιο πολυφάγο είδος του γένους με ευρεία γεωγραφική εξάπλωση. Αναπτύσσεται σε περισσότερους από 350 ξενιστές και θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους εντομολογικούς εχθρούς των καρποφόρων δέντρων παγκοσμίως (Liquido et al. 1991, Mitchell & Saul 1990). 1.1 Μορφολογικά χαρακτηριστικά του εντόμου Το ενήλικο έχει μήκος 4-6 mm, πλάτος mm και χαρακτηριστικό χρωματισμό με μαύρες, κίτρινες και καστανές κηλίδες στον θώρακα, την κοιλιά και τις πτέρυγες (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος 1998). Το χρώμα της κεφαλής είναι υπόλευκο-κιτρινωπό, ενώ οι κεραίες είναι καστανού χρώματος με μικρό αριθμό μαύρων τριχών στο μέσο τους. Τα δύο βασικά άρθρα των κεραιών είναι ερυθροκάστανα και η arista σχεδόν μαύρη. Το μεγαλύτερο τμήμα της κεφαλής καταλαμβάνεται από τους σύνθετους οφθαλμούς οι οποίοι έχουν χρώμα ιριδίζον πορφυρό, έως σκούρο καστανέρυθρο. Στο μέτωπο των αρσενικών υπάρχουν δυο έμμισχες κερατοειδείς αποφύσεις χρώματος αργυρότεφρου. Οι πτέρυγες έχουν μήκος περίπου 4.5 mm η κάθε μία, είναι διαφανείς, με κίτρινες, καστανέρυθρες και μαύρες ζώνες και κηλίδες. Το νωτιαίο τμήμα του θώρακα είναι μαύρο γυαλιστερό με χαρακτηριστικές ρίγες λευκού χρώματος, ενώ το κοιλιακό είναι κιτρινωπό. Το μεγαλύτερο τμήμα του scutellum είναι μαύρου γυαλιστερού χρώματος, ενώ η κοιλιά πορτοκαλί-κίτρινη με δυο καστανέρυθρες εγκάρσιες ζώνες. Ο ωοθέτης είναι κιτρινέρυθρος, χαρακτηριστικά προεξέχων από το τελευταίο κοιλιακό τμήμα των θηλυκών και το μήκος του κυμαίνεται μεταξύ mm. Τα πόδια είναι κιτρινέρυθρα με μάλλον μακριές κίτρινες, σκληρές τρίχες στο οπίσθιο τμήμα της κνήμης. Τα αυγά είναι λεία, λευκά, επιμήκη, ελλειπτικού σχήματος, με μήκος mm και διάμετρο mm. Οι προνύμφες έχουν υπόλευκο χρώμα, είναι άποδες, 7

13 8 ακέφαλες με κυλινδρικό σχήμα. Το πρόσθιο τμήμα του σώματός τους είναι στενότερο από το οπίσθιο. Υπάρχουν τρείς προνυμφικές ηλικίες που διακρίνονται μεταξύ τους με βάση το σχήμα, το μέγεθος και το χρώμα των στοματικών αγκίστρων (White & Elson-Harris 1992). Σε γενικές γραμμές η προνύμφη της 1 ης ηλικίας έχει μήκος mm, η 2 ης mm και η 3 ης 6-10 mm. Το σχήμα της νύμφης είναι ελλειψοειδές με μήκος mm και διάμετρο mm. Το χρώμα της νύμφης εξαρτάται κυρίως από τον ξενιστή στον οποίο αναπτύσσεται η προνύμφη και μπορεί να είναι από υπόλευκο έως σκούρο καστανό (Papadopoulos 2004). 1.2 Ξενιστές Είναι το πιο πολυφάγο είδος της οικογένειας Tephritidae προσβάλλοντας ξενιστές που ανήκουν σε 67 οικογένειες φυτών. Οι ξενιστές του ανέρχονται σε 353 είδη φυτών των οποίων το 40% ανήκει σε 5 οικογένειες: Μyrtaceae (6%), Rosaceae (10%), Rutaceae (9%), Sapotaceae (9%), και Solanaceae (6%) (Liquido et al. 1991). Σε εύκρατες περιοχές και ειδικότερα στην Λεκάνη της Μεσογείου, οι καλλιέργειες εσπεριδοειδών αποτελούν τους κύριους ξενιστές του εντόμου, ενώ σύκα, πυρηνόκαρπα και γιγαρτόκαρπα συγκαταλέγονται επίσης στην ομάδα των σημαντικότερων ξενιστών του (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος 1998). Στην χώρα μας προκαλεί σημαντικές ζημιές στις νοτιότερες περιοχές και σε νησιά, ιδιαίτερα σε εσπεριδοειδή, αχλάδια, μήλα, ροδάκινα, βερίκοκα, σύκα, κυδώνια και άλλα φρούτα (Papadopoulos et al. 2001). 8

14 9 1.3 Βιολογία του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου είναι πολυκυκλικό είδος και συμπληρώνει πολλές γενεές το έτος. Ο αριθμός των γενεών εξαρτάται από την περιοχή, την θερμοκρασία και ιδιαίτερα από τους διαθέσιμους ξενιστές. Στην χώρα μας συμπληρώνει από 3 έως και περισσότερες από 7 γενεές το έτος (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος 1998). Μειωμένοι ρυθμοί ανάπτυξης παρατηρούνται σε περιόδους όπου οι θερμοκρασίες είναι χαμηλές. Σε τέτοιες περιοχές διαχειμάζει κυρίως ως προνύμφη μέσα σε προσβεβλημένους καρπούς που παραμένουν στα δένδρα ή έχουν πέσει στο έδαφος (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος 1998). Στις βορειότερες περιοχές της Μεσογείου (Θεσσαλονίκη), η μύγα των φρούτων διαχειμάζει επιτυχώς μόνο ως προνύμφη εντός προσβεβλημένων καρπών (Papadopoulos et al. 1996). Τα ενήλικα εμφανίζονται την άνοιξη και αμέσως μετά την έξοδό τους από το νυμφικό περίβλημα τρέφονται με πρωτεϊνούχα και ζαχαρούχα θρεπτικά διαλύματα προκειμένου να ωριμάσουν αναπαραγωγικά και να καλύψουν τις ενεργειακές τους ανάγκες. Η έκλυση σεξουαλικής φερομόνης από τα αρσενικά έχει ως απώτερο στόχο την προσέκλυση επιδεκτικών προς την σύζευξη θηλυκών. Μετά την προσέγγιση των θηλυκών ακολουθεί ένα σύνολο πολύπλοκων συμπεριφορών τόσο από τα αρσενικά όσο και από τα θηλυκά, που χαρακτηρίζεται ως «ερωτοτροπία» courtship (Briceno & Eberhard 2000). Στην συνέχεια ακολουθεί η σύζευξη και τα θηλυκά αρχίζουν να ωοτοκούν σε ώριμους ή σχεδόν ώριμους καρπούς. Η αποτροπή της ωοτοκίας από άλλα θηλυκά στον ίδιο καρπό, επιτυγχάνεται μέσω της απόθεσης φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας (Prokopy et al. 1978). Τα θηλυκά ωοτοκούν σε ώριμους ή ημιώριμους καρπούς διατρυπώντας με τον ωοθέτη τους το περικάρπιο ή το μεσοκάρπιο των καρπών και τοποθετώντας στο βάθος της οπής συνήθως 1-6 αυγά. Η τροφική δραστηριότητα των προνυμφών παρατηρείται στο μεσοκάρπιο όπου ορύσσουν στοές καταστρέφοντάς τους σχεδόν ολοκληρωτικά. Αφού ολοκληρώσουν την διατροφή και την ανάπτυξή τους, εγκαταλείπουν τους καρπούς και πέφτουν στο έδαφος όπου και νυμφώνονται σε μικρό βάθος, έως 5 cm (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος 1998). Εκτός από την άμεση ζημιά που οφείλεται στην τροφική δραστηριότητα των προνυμφών, συχνά στους προσβεβλημένους καρπούς παρατηρείται και ανάπτυξη μυκήτων ή άλλων μικροοργανισμών που επιτείνουν τη ζημιά. 9

15 10 Εικόνα 1. Αρσενικό (επάνω) και θηλυκό (κάτω) ενήλικο της μύγας της Μεσογείου (φωτο. Β. Κατσόγιαννος) 10

16 Καταπολέμηση Η καταπολέμηση της μύγας της Μεσογείου βασίζεται στην παρακολούθηση του πληθυσμού των ενηλίκων με την χρήση τροφικών και φερομονικών παγίδων (τύπου McPhail και Jackson αντίστοιχα). Γίνεται συνήθως με δολωματικούς ψεκασμούς και ψεκασμούς καλύψεως με οργανοφωσφορικά κυρίως εντομοκτόνα. Τα τροφικά ελκυστικά που χρησιμοποιούνται συνήθως στις παγίδες τύπου McPhail είναι το οξικό αμμώνιο, η πουτρεσκίνη και η τριμεθυλαμίνη. Η παραφερομόνη trimedlure που προσελκύει τα αρσενικά χρησιμοποιείται στις παγίδες τύπου Jackson (Katsoyannos et al. 1999a, Katsoyannos et al. 1999b, Papadopoulos 2004). Εκτός από την χημική καταπολέμηση για την αντιμετώπιση της μύγας της Μεσογείου, εφαρμόζονται και άλλα μέτρα όπως η εξαπόλυση στείρων εντόμων, η μαζική παγίδευση, η βιολογική καταπολέμηση, καθώς επίσης και ένα πλήθος καλλιεργητικών μέτρων. Η μέθοδος της μαζικής εξαπόλυσης στείρων εντόμων (Sterile Insect Technique ή SIT) εφαρμόζεται με επιτυχία σε αρκετές περιοχές του πλανήτη. Συνιστάται στην παραγωγή, στείρωση και εξαπόλυση στο ύπαιθρο μεγάλου αριθμού αρσενικών με σκοπό τη σύζευξη με τα θηλυκά του άγριου πληθυσμού-στόχου και την απόθεση άγονων αυγών από αυτά (Ηendrichs et al. 2002). Σημαντικό είναι ότι τεράστια ποσά ξοδεύονται κάθε χρόνο με κύριο σκοπό την βελτιστοποίηση και ευρεία εφαρμογή της «φιλικής» αυτής μεθόδου. Η μέθοδος της μαζικής παγίδευσης μπορεί να έχει ικανοποιητικά αποτελέσματα ιδιαίτερα σε χαμηλές πυκνότητες του πληθυσμού (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος 1998). Με την ενδελεχή έρευνα που έγινε τα τελευταία χρόνια πάνω στην ανάπτυξη νέων ελκυστικών, καθώς επίσης και στην αποτελεσματικότητα των παγίδων όσον αφορά το χρώμα και το σχήμα, η μέθοδος της μαζικής παγίδευσης άρχισε να έχει ιδιαίτερα ικανοποιητικά αποτελέσματα (Epsky et al. 1999, Heath et al. 1997, Vargas et al. 1997). Η βιολογική καταπολέμηση της μύγας της Μεσογείου αφορά κυρίως την εκτροφή και εξαπόλυση είτε ιθαγενών είτε εξωτικών παρασιτοειδών για την μείωση του 11

17 12 πληθυσμού του εντόμου. Στην Ελλάδα η παρουσία του παρασιτοειδούς Aganaspis daci (Weld) σε παρασιτισμένες νύμφες της μύγας της Μεσογείου που προέρχονταν από προσβεβλημένα σύκα στο νησί της Χίου, δείχνουν ότι το παρασιτοειδές αυτό μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην βιολογική καταπολέμηση του εντόμου (Papadopoulos & Katsoyannos 2003). Στα καλλιεργητικά μέτρα του εντόμου συμπεριλαμβάνονται η καταστροφή των προσβεβλημένων καρπών πριν την συγκομιδή, καθώς επίσης και των μη καλλιεργούμενων άγριων ξενιστών. Επιπλέον γίνεται απεντόμωση των φρούτων με χρήση χαμηλών και υψηλών θερμοκρασιών και ακτινοβολίας γ (Mitchell & Saul 1990). 1.5 Σεξουαλική συμπεριφορά της μύγας της Μεσογείου και ρόλος ουσιών που προέρχονται από φυτά-ξενιστές Ουσίες οι οποίες προέρχονται από φυτά ξενιστές φαίνεται πως διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην σεξουαλική συμπεριφορά των διπτέρων εντόμων της οικογένειας Tephritidae, και ιδιαίτερα σε αρκετά είδη του γένους Bactrocera και Ceratitis, όπως για παράδειγμα στην μύγα της Μεσογείου (Landlot & Philips 1997, Light & Jang 1996). Έτσι, σε ορισμένα είδη η έκθεση των αρσενικών σε αιθέρια έλαια φυτών αυξάνει την ικανότητα τους να συζευγνύονται με θηλυκά, δίνοντάς τους έτσι ένα πλεονέκτημα απέναντι στα άλλα αρσενικά ανταγωνιστές τους. Οι Landolt and Philips (1997) ανέφεραν μια συνεργιστική δράση μεταξύ χημικών ερεθισμάτων που απελευθερώνονται από τα φυτά και φερομονών φύλου που παράγονται από τα φυτοφάγα είδη εντόμων. Το αναπαραγωγικό σύστημα της μύγας της Μεσογείου μελετήθηκε διεξοδικά και έγινε αντικείμενο έρευνας σε πολλές μελέτες (Eberhard 1999, Yuval & Hendrichs 2000). Βασίζεται κυρίως στην ανταπόκριση των θηλυκών, που επιτυγχάνεται με το σεξουαλικό κάλεσμα (sexual calling) και την παραγωγή φερομόνης φύλου από τα αρσενικά. Στην μύγα της Μεσογείου η έκλυση φερομόνης από τα αρσενικά αποτελεί τμήμα της πολύπλοκης αναπαραγωγικής συμπεριφοράς του είδους, βασικό στοιχείο της οποίας αποτελούν οι συναθροίσεις τύπου «lek» (Arita & 12

18 13 Kaneshiro 1985, Whittier et al. 1992). Αρσενικά που συμμετέχουν σε συναθροίσεις αυτού του τύπου είναι περισσότερο αποτελεσματικά στην προσέλκυση θηλυκών δεκτικών για σύζευξη σε σχέση με αρσενικά που επιδίδονται στο σεξουαλικό κάλεσμα μόνα τους. Αν και πολλές πτυχές της συμπεριφοράς σύζευξης της μύγας της Μεσογείου μελετήθηκαν διεξοδικά τις τελευταίες δεκαετίες, υπάρχουν ακόμη πολλά αναπάντητα ερωτήματα. Για παράδειγμα δεν υπάρχουν αρκετές πληροφορίες για τον ρόλο που παίζουν τα χημικά ερεθίσματα, τα οποία προέρχονται από φυτά ξενιστές, στην σεξουαλική συμπεριφορά της μύγας της Μεσογείου. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε κλουβιά υπαίθρου οι Katsoyannos et al. (1997) βρήκαν ότι αρσενικά της μύγας της Μεσογείου προσελκύονταν σε μεγάλο βαθμό από οσμηρά ερεθίσματα που προέρχονταν από καρπούς εσπεριδοειδών, και κυρίως πορτοκάλια, τα οποία ήταν τραυματισμένα στην περιοχή του εξωκαρπίου (flavedo). Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και σε πλαστικές σφαίρες που είχαν τοποθετηθεί σε κλουβιά υπαίθρου, οι οποίες είχαν επαλειφθεί με μικρή ποσότητα αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε ότι τα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου αποκτούσανε ένα συγκριτικό πλεονέκτημα αυξημένης διάθεσης για σύζευξη όταν έρχονταν σε άμεση επαφή με πληγωμένους καρπούς εσπεριδοειδών (Papadopoulos et al. 2001). Το συγκριτικό αυτό πλεονέκτημα των εκτεθειμένων αρσενικών έναντι αρσενικών που δεν είχαν εκτεθεί διαρκούσε για τουλάχιστον 10 ημέρες, εφόσον είχε προηγηθεί έκθεση 24 ωρών. Αυτή είναι μια ισχυρή ένδειξη ότι η έκθεση σε οσμηρά ερεθίσματα από αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού αυξάνει την ανταγωνιστικότητα για τη σύζευξη των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Είναι πιθανό ότι τα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου χρησιμοποιούν τα χημικά ερεθίσματα του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού στην βιοσύνθεση της φερομόνης φύλου. Πρόσφατα ευρήματά μας αποδεικνύουν ότι η έκθεση σε αιθέρια έλαια από πληγωμένους καρπούς εσπεριδοειδών στην περιοχή του εξωκαρπίου (flavedo) (νεράντζι, μανταρίνι και γκρέιπφρουτ) δίνει στα αρσενικά ένα συγκριτικό πλεονέκτημα αυξημένης διάθεσης για σύζευξη. Παρόμοια συμπεριφορά καταγράφηκε και σε πληγωμένους καρπούς λεμονιού και πορτοκαλιού. Συγκεκριμένα, η έκθεση σε 13

19 14 πληγωμένους καρπούς πορτοκαλιού των ποικιλιών Μerlin, Newhole και Navel αύξησε σημαντικά την ικανότητα σύζευξης των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Σχετικές έρευνες σε πληγωμένους καρπούς γκρέιπφρουτ, νεραντζιού και σε πορτοκάλια της ποικιλίας Ξυνό Άρτας έδειξαν ότι η έκθεση των αρσενικών στις παραπάνω μεταχειρίσεις αύξησε την διάθεση για σύζευξη, ωστόσο οι διαφορές που παρατηρήθηκαν δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές. Τα αποτελέσματα μας επιβεβαιώνουν ότι χημικές ουσίες υπεύθυνες για την ενίσχυση της σεξουαλικής συμπεριφοράς των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου υπάρχουν στις περισσότερες ποικιλίες και είδη των εσπεριδοειδών. Σε ένα επόμενο πείραμα που αφορούσε την έκθεση των αρσενικών σε διαφορετικές δόσεις αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού, έντομα που εκτέθηκαν σε συγκέντρωση 12,5 μl και 25 μl αποκτήσανε ένα συγκριτικό πλεονέκτημα αυξημένης διάθεσης για σύζευξη με παρθένα θηλυκά ηλικίας μεταξύ 9 και 12 ημερών. εν παρατηρήθηκε όμως η ίδια συμπεριφορά σε δόσεις χαμηλότερες από 12,5 μl, ενώ υψηλότερες δόσεις του αιθερίου ελαίου αποδειχτήκαν εξαιρετικά τοξικές (Kouloussis et al. 2010). Σχετικές έρευνες έχουν δείξει ότι η έκθεση στην παραφερομόνη trimedlure προκαλεί ένα ισχυρό πλεονέκτημα σύζευξης στα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου, το οποίο όμως διαρκεί μόνο μια ημέρα (Shelly et al.1996, Shelly 1999). Η αυξημένη ικανότητα σύζευξης έπειτα από έκθεση σε οσμηρά ερεθίσματα που προέρχονταν από φυτά ξενιστές, αναφέρθηκε επίσης και για είδη του γένους Bactrocera (Landolt & Phillips 1997, Shelly 1995, Nishida et al.1997, Tan and Nishida 1995). Για παράδειγμα, στο B. dorsalis η κατανάλωση της ουσίας μέθυλο-ευγενόλης που προέρχεται από το φυτό-ξενιστή Archangellica Officinalis Hoffin αυξάνει την ανταγωνιστικότητα σύζευξης για περισσότερες από 21 ημέρες. Σύμφωνα με τους Nishida et al. (1988), τα αρσενικά του γένους Bactrocera αποθηκεύουν και μεταβολίζουν τα χημικά ερεθίσματα που δέχονται από τα φυτά ξενιστές για την παραγωγή φερομονών. Μια δραστική ουσία που επάγει την αύξηση της διάθεσης για σύζευξη στα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου είναι επίσης και η α-copaene. Η ουσία αυτή βρέθηκε να εμφανίζεται στα αιθέρια έλαια πολλών φυτών και αποδείχθηκε ότι προσελκύει ιδιαίτερα τα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου (Teranishi et al., 1987). Ωστόσο, στο πορτοκάλι βρέθηκε σε ιδιαίτερα μικρές ποσότητες που ανέρχονται 14

20 15 μόλις στο 0,1% του αιθέριου ελαίου. Παρά το γεγονός της μικρής της συγκέντρωσης, οι Teranishi et al. (1987) αναφέρουν ότι τα πορτοκάλια αποτελούν μια ιδιαίτερα αποτελεσματική πηγή α-copaene λόγω της μεγάλης περιεκτικότητάς τους σε αιθέριο έλαιο. Από την άλλη μεριά, θα πρέπει να αναφερθεί ότι οι Stashenko et al. (1996) δεν συμπεριέλαβαν την ουσια α-copaene στο χημικό προφίλ του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού, προφανώς λόγω της ιδιαίτερα μικρής συγκέντρωσής της. Σύμφωνα με τον Shelly (1999) αρσενικά της μύγας της Μεσογείου, που είχαν εκτεθεί σε έλαιο από τους σπόρους του φυτού Archangelica officinalis (Hoffin), συζευγνύονταν συχνότερα από έντομα ίδιας ηλικίας που δεν είχαν εκτεθεί σε αυτό, ακόμη και 7 ημέρες μετά την έκθεσή τους. Η α-copaene βρίσκεται σε μεγάλες συγκεντρώσεις στους σπόρους του συγκεκριμένου φυτού, και όπως η παραφερομόνη trimedlure, προκαλεί ιδιαίτερη προσέλκυση στα αρσενικά, χωρίς να απαιτείται η κατάποσή της. Ισχυρή προσέλκυση αρσενικών της μύγας της Μεσογείου από το αιθέριο έλαιο του φυτού A. officinalis αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Steiner et al. (1957). Όπως οι ίδιοι αναφέρουν, τα αρσενικά σχημάτιζαν «δακτυλίους» γύρω από την περιοχή όπου βρισκόταν το αιθέριο έλαιο από αυτό το φυτό και ακινητοποιούνταν για ένα χρονικό διάστημα, το οποίο και εξαρτάται από την συγκέντρωση της ουσίας. Πιο συγκεκριμένα, τα προσελκυσμένα αρσενικά δημιουργούσαν συναθροίσεις σε μικρές αποστάσεις γύρω από την περιοχή όπου βρισκόταν το αιθέριο έλαιο του φυτού A. officinalis, ενώ σε μικρότερες συγκεντρώσεις προσελκύονταν κατευθείαν στην περιοχή όπου αυτό είχε τοποθετηθεί (Hendrichs et al. 1989, Nakagawa et al. 1971). Παρόμοια προσέλκυση παρατηρήθηκε στο εργαστήριο, τόσο σε πληγωμένους καρπούς πορτοκαλιού, όσο και σε διάφορες συγκεντρώσεις αιθέριου ελαίου, που είχε εμποτιστεί σε διηθητικό χαρτί, σε κλουβιά όπου υπήρχαν σεξουαλικά ώριμα αρσενικά της μύγας της Μεσογείου (Papadopoulos et al. 2001, Kouloussis et al 2010). Υπάρχει δηλαδή μια ισχυρή ένδειξη ότι η ανταπόκριση των αρσενικών ε- ξαρτάται τόσο από το αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού όσο και από την συγκέντρωση στην οποία βρίσκεται. Η υπόθεση αυτή, έρχεται σε συνάρτηση με το γεγονός ότι η έκθεση σε έλαιο προερχόμενο από τις ρίζες του φυτού Zingiber officinale Roscoe (τζίντζερ) και σε αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού αυξάνει την διάρκεια 15

21 16 του σεξουαλικού καλέσματος των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου, αποσκοπώντας πιθανότατα στην προσέλκυση περισσότερων θηλυκών δεκτικών για σύζευξη (Papadopoulos 2006). Η αυξημένη ικανότητα σύζευξης έπειτα από έκθεση σε οσμηρά ερεθίσματα που προέρχονταν από φυτά ξενιστές, αναφέρθηκε και σε αρσενικά του είδους Anastrepha fraterculus (Wiedemann) (Diptera:Tephritidae). Οι Vera et al (2010) διαπίστωσαν ότι αρσενικά του είδους Anastrepha fraterculus που είχαν πρόσβαση σε έλαιο προερχόμενο από καρπούς του φυτού Psidium guajava L. αποκτούσαν ένα συγκριτικό πλεονέκτημα αυξημένης διάθεσης για σύζευξη σε σχέση με αρσενικά που δεν είχαν πρόσβαση στο συγκεκριμένο ερέθισμα. Επιπροσθέτως, η ά- μεση επαφή με τους καρπούς του φυτού Psidium guajava L. ή η κατανάλωση ουσιών που προέρχονταν από αυτό δεν φάνηκε να ενισχύει την ικανότητα σύζευξης των αρσενικών. Οι ίδιοι ερευνητές διαπίστωσαν ότι η έκθεση σε ουσίες προερχόμενες από καρπούς του φυτού Mangifera indica L. δεν φάνηκε να επηρεάζει την σεξουαλική συμπεριφορά των αρσενικών. εν παρατηρήθηκε όμως η ίδια συμπεριφορά σε αιθέριο έλαιο προερχόμενο από καρπούς λεμονιού (Citrus Limon L.) όπου η έκθεση των αρσενικών για 24 ώρες μείωσε σημαντικά την σεξουαλική ικανότητα τους σε σχέση με αρσενικά που δεν είχαν πρόσβαση στο α- ντίστοιχο ερέθισμα, ενώ έκθεση για μεγάλα χρονικά διαστήματα στο αιθέριο έ- λαιο δεν φάνηκε να επιδρά στην σεξουαλική συμπεριφορά. Περαιτέρω μελέτες όμως θα πρέπει να γίνουν ώστε να εξεταστεί αν υπάρχουν πιθανές αρνητικές επιπτώσεις σε οσμηρά ερεθίσματα από φυτά ξενιστές σε συνδυασμό με την διατροφή τους στην μακροζωία των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Για παράδειγμα μελετώντας τα αποτελέσματα της διατροφής των ε- νηλίκων αρσενικών, με στόχο την βελτιστοποίηση της μεθόδου του στείρου ε- ντόμου της μύγας της Μεσογείου, οι Kaspi & Yuval (2000) επισημαίνουν ότι η προσθήκη πρωτεΐνης στη δίαιτα αύξησε την ικανότητα σύζευξης, αλλά μείωσε αισθητά την επιβίωση. Εκτός από τη αυξημένη διάθεση για σύζευξη που παρατηρήθηκε στα στείρα αρσενικά, ιδιαίτερα υψηλά ήταν και τα επίπεδα του σεξουαλικού καλέσματος στα έντομα που τρέφονταν καθημερινά με πρωτεϊνούχο τροφή (Blay & Yuval 1997, Papadopoulos et al. 1998, Yuval et al. 1998). 16

22 Σκοπός της διατριβής Παρά τις πρόσφατες μελέτες που γίνανε πάνω στην σεξουαλική συμπεριφορά της μύγας της Μεσογείου, λίγα είναι γνωστά για το τι καθορίζει την επιτυχία ή την αποτυχία μιας ερωτοτροπίας. Το γεγονός αυτό παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον αν αναλογιστεί κανείς τα τεράστια ποσά τα οποία δαπανώνται ετησίως για την παραγωγή και εξαπόλυση τεράστιου αριθμού στειρωμένων αρσενικών στα πλαίσια της καταπολέμησης της μύγας της Μεσογείου με τη μέθοδο του στείρου ε- ντόμου. Όπως είναι γνωστό η φιλική αυτή προς το περιβάλλον μέθοδος εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την επιτυχία ή την αποτυχία των στείρων αρσενικών να συζευχθούν με τα δεκτικά προς σύζευξη θηλυκά. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκθεση αρσενικών ορισμένων ειδών της οικογένειας Tephritidae σε ουσίες προερχόμενες από φυτά-ξενιστές επιδρά σημαντικά στη σεξουαλική συμπεριφορά των διπτέρων εντόμων και ιδιαίτερα της μύγας της Μεσογείου αυξάνοντας αποτελεσματικά την διάθεση για σύζευξη και ενισχύοντας τη διάρκεια και την ένταση του σεξουαλικού καλέσματος (Κatsoyannos et al. 1997, Papadopoulos et al. 1998, Papadopoulos et al. 2001, Shelly et al. 1996, Shelly 1999, Shelly et al. 2001). Ύστερα από πρόσφατα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο επιβεβαιώθηκε ότι αρσενικά που είχαν πρόσβαση είτε σε πληγωμένους καρπούς πορτοκαλιού και άλλων εσπεριδοειδών στην περιοχή του εξωκαρπίου είτε σε αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού αποκτούσαν ένα σημαντικά μεγαλύτερο πλεονέκτημα συζεύξεων με παρθένα θηλυκά ό- ταν συναγωνίζονταν με αρσενικά που δεν είχαν πρόσβαση σε κάποια από τις παραπάνω μεταχειρίσεις (αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού, πληγωμένοι καρποί) (Kouloussis et al. 2010). Φαίνεται λοιπόν ότι ουσίες οι οποίες προέρχονται από φυτά ξενιστές και ιδιαίτερα εσπεριδοειδή διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην σεξουαλική συμπεριφορά των διπτέρων εντόμων της οικογένειας Tephritidae. Τα κύρια συστατικά που απαρτίζουν το αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού είναι το μονοτερπένιο λιμονένιο (94%), άλλα μονοτερπένια που βρίσκονται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (α-πινένιο 0.54%, σαμπινένιο 0,74% και η μυρσίνη 1,18%), αλκοόλες (λιναλούλη 0,89%, α-terpineol 0,06%) και αλδεϋδες (citral-z 0,09%, citral- 17

23 18 E 0,14%, citronellal 0,07%), ενώ το 1,73% αντιπροσωπεύεται από οκτανόλες, δεκανόλες, και δωδεκανόλες (Stashenko et al.1996). Οι Hernandez et al. (1996) αναγνωρίσανε 26 ουσίες του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού με το λιμονένιο να βρίσκεται στο μεγαλύτερο ποσοστό. Σε μελέτες που οι ερευνητές πραγματοποίησαν με τη μέθοδο των ηλεκτροαντενογραφημάτων, το λιμονένιο ήταν «ενεργό» και στα δύο φύλα της μύγας της Μεσογείου, ενώ το οξείδιο του λιμονενίου ήταν δραστικό για τα αρσενικά σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι στα θηλυκά. Το λιμονένιο είναι μία από τις ουσίες που απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια του σεξουαλικού καλέσματος των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου (Jang et al. 1989). Πέραν του λιμονένιου πολλές ουσίες του χημικού προφίλ των εσπεριδοειδών και του αιθερίου ελαίου του πορτοκαλιού περιέχονται ταυτόχρονα και στη φερομόνη φύλου της μύγας της Μεσογείου (Attaway et al. 1968, Howse & Knapp 1996). Όπως έδειξαν προηγούμενα πειράματα ορισμένες από τις ουσίες αυτές πιθανότατα ευθύνονται και για το φαινόμενο της αύξησης της ανταγωνιστικότητας σύζευξης των αρσενικών (Kouloussis et. al 2010). Εκτός από την ουσία α-copaene (βλ. κεφάλαιο 1.5) όπως αποδείχθηκε και άλλες ουσίες μπορεί να είναι υπεύθυνες για την ενίσχυση της διάθεσης αυτής, όπως για παράδειγμα ουσίες που περιέχονται στο αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού. Συγκεκριμένα, σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο οι Kouloussis et al. (2010) επιβεβαίωσαν ότι τόσο στείρα αρσενικά του στελέχους VIENNA 8 tsl όσο και άγρια αρσενικά έντομα που είχαν εκτραφεί στο εργαστήριο για περιορισμένο αριθμό γενεών (έως και 5), πέτυχαν ένα ιδιαίτερα αυξημένο ποσοστό συζεύξεων (πάνω από 70%) με παρθένα άγρια θηλυκά της ίδιας γενεάς όταν ανταγωνίζονταν με αρσενικά που δεν είχαν εκτεθεί στο μίγμα των ουσιών του αιθερίου ελαίου πορτοκαλιού αποτελούμενο από λιμονένιο, β-μυρσίνη, λιναλούλη, γερανιόλη και α-πινένιο. Η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται στην μελέτη της επίδρασης του αιθέριου ε- λαίου πορτοκαλιού και ορισμένων συστατικών του στην σεξουαλική συμπεριφορά και διάρκεια ζωής των στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Ειδικότερα όσον αφορά τη σεξουαλική συμπεριφορά μελετήθηκε πως επιδρούν το αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού, το λιμονένιο και ένα μίγμα αποτελούμενο από λι- 18

24 19 μονένιο, β-μυρσίνη, λιναλούλη, γερανιόλη και α-πινένιο τόσο στο σεξουαλικό κάλεσμα όσο και στην ανταγωνιστικότητα κατά την σύζευξη. Προκειμένου να μελετηθεί και η επίδραση δυο διαφορετικών ειδών τροφής οι παραπάνω παράμετροι μελετήθηκαν όταν τα έντομα τρέφονταν είτε σε πρωτεΐνη και ζάχαρη είτε μόνο σε ζάχαρη. Στα πειράματα μας χρησιμοποιήθηκαν στείρα αρσενικά έντομα στελέχους VIENNA 8 tsl διότι στείρα αρσενικά εξαπολύουμε ευρέως με την μέθοδο του στείρου εντόμου με απώτερο σκοπό να είμαστε όσο πιο αποτελεσματικοί σε ότι σχετίζεται με τα αποτελέσματά μας. Αντίστοιχες δοκιμές πάνω σε άγριους πληθυσμούς πραγματοποιήθηκαν σε άλλα πρόσφατα πειράματα μας (Kouloussis et al. 2010). Τα αποτελέσματα της εργασίας μας έχουν ως απώτερο στόχο να βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση της σεξουαλικής συμπεριφοράς της μύγας της Μεσογείου ενώ έχουν και πρακτικό ενδιαφέρον. Τα έντομα που εξαπολύουμε και που θα έχουν εκτεθεί μπορεί να είναι περισσότερο ή λιγότερο ανταγωνιστικά ανάλογα και με το είδος της τροφής. Για τον λόγο αυτό μελετήσαμε όλες τις παραπάνω παραμέτρους σε δύο διαφορετικά είδη τροφής. Απώτερος στόχος μας είναι να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της μεθόδου των στείρων εντόμων. Για παράδειγμα αν αυξηθεί η ανταγωνιστικότητα κατά 10% θα χρειάζεται να εξαπολύουμε 10% λιγότερα έντομα πράγμα που συνεπάγεται τεράστια εξοικονόμηση πόρων (παραγωγή, μεταφορά, εξαπόλυση στείρων εντόμων). Με αυτό τον τρόπο η έκθεση των εντόμων σε ουσίες που προέρχονται από φυτά ξενιστές (π.χ. αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού και συστατικών του) σε μαζική κλίμακα, θα μπορούσε να συντελέσει στην αύξηση της αποτελεσματικότητας της μεθόδου εξαπόλυσης στειρωμένων εντόμων και στην ελάττωση του κόστους της. 19

25 20 2. Γενικά υλικά και μέθοδοι 2.1 Συνθήκες εργαστηρίου Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε χώρο του Εργαστηρίου Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας του Τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. κατά τα έτη 2007 και Οι συνθήκες που επικρατούσαν κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων ήταν θερμοκρασία 25 ± 1 C, σχετική υγρασία 65 ± 5% και φωτο-περίοδος 14:10 (Φ:Σ) με έναρξη της φωτόφασης στις 07:00 και λήξη στις 21:00. Το φως προερχόταν από λαμπτήρες φθορίου και από φυσικό φως που έμπαινε από δύο μεγάλα παράθυρα τα οποία βρίσκονταν στην βόρεια και ανατολική πλευρά του χώρου. 2.2 Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν Α. Στείρα αρσενικά έντομα του στελέχους VIENNA-8 tsl Κατά την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν στείρα αρσενικά έντομα του στελέχους VIENNA-8 tsl. Τα έντομα στέλνονταν αεροπορικώς σε ειδικές ασφαλείς συσκευασίες από την πόλη Siebersdorf της Αυστρίας όπου βρίσκoνται οι εγκαταστάσεις του ιεθνούς Οργανισμού Ατομικής Ενέργειας (ΙΑΕΑ) και συγκεκριμένα το εργαστήριο Βιοτεχνολογίας και Εντομολογίας. Τα έντομα προέρχονταν από την μητρική αποικία του στελέχους VIENNA-8 tsl και είχαν εκτραφεί στο εργαστήριο για μεγάλο αριθμό γενεών. Το στέλεχος VIENNA-8 tsl το οποίο επιλέχθηκε για τα πειράματα του 3 ου και 4 ου κεφαλαίου δημιουργήθηκε από μια χρωμοσωμική μετάλλαξη ενός γονιδίου στην οποία τα ομοζύγωτα θηλυκά εξουδετερώνονται με έκθεση των αυγών στους 34 ο C για 12 έως 24 ώρες κατά την διάρκεια του τελευταίου σταδίου της εμβρυικής ανάπτυξης. Η διαδικασία της παραγωγής γενετικά επιλεγμένων αρσενικών εντόμων της μύγας της Μεσογείου έχει ως στόχο την βελτιστοποίηση της μεθόδου 20

26 21 του στείρου εντόμου με απώτερο σκοπό την ευρεία εφαρμογή της για την επιτυχή καταπολέμηση του εντόμου. B. Θηλυκά και μέθοδος εκτροφής τους Κατά την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν άγρια θηλυκά έντομα που είχαν εκτραφεί στο εργαστήριο για περιορισμένο αριθμό γενεών (έως και 5). Η εργαστηριακή αποικία του εντόμου κατά το πρώτο έτος των πειραμάτων ξεκίνησε από 1000 περίπου νύμφες προερχόμενες από προσβεβλημένα σύκα που συλλέχθηκαν στην Χίο τον Σεπτέμβριο του Τον Σεπτέμβριο του επομένου έτους η αποικία αντικαταστάθηκε από 1000 περίπου νύμφες που συλλέχθηκαν από προσβεβλημένα σύκα από την ίδια περιοχή. Η εκτροφή των ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου γινόταν σε ξύλινα κλουβιά διαστάσεων 30x30x30 cm που είχαν τρεις πλευρές τους καλυμμένες με συρμάτινο πλέγμα και μια πλευρά καλυμμένη με γυαλί. Σε κάθε κλουβί τοποθετούνταν άτομα και των δύο φύλων, νερό σε πλαστικά φιαλίδια με φυτίλι και τροφή ενηλίκων. Η τροφή των ενηλίκων αποτελούνταν από μίγμα υδρολυμένης πρωτεΐνης, ζάχαρης και νερού σε αναλογία 1:4:5 και προσφερόταν στα έντομα με την μορφή στερεοποιημένων σταγόνων στην επιφάνεια πλαστικών τρυβλίων Petri διαμέτρου 9 cm. Στη συνέχεια της διατριβής τα κλουβιά αυτά θα αναφέρονται ως «κλουβιά εκτροφής» (Εικόνα 2). Τα θηλυκά ωοτοκούσαν σε κοίλα πλαστικά ημισφαίρια, χρώματος κόκκινου, πάχους 1,5 cm και διαμέτρου 5 cm. Στη συνέχεια τα ημισφαίρια αυτά θα αναφέρονται ως «υποστρώματα ωοτοκίας». Καθένα από τα τεχνητά αυτά υποστρώματα ωοτοκίας έφερε 40 περίπου ομοιόμορφα κατανεμημένες οπές διαμέτρου 1 mm, μέσα στις οποίες τα θηλυκά τοποθετούσαν τον ωοθέτη τους και απέθεταν τα αυγά τους στο εσωτερικό των ημισφαιρίων. 21

27 22 Εικόνα 2. Κλουβί εκτροφής ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου (Φώτο. Χ. Ιωάννου) 22

28 23 Το κάθε ημισφαίριο ήταν προσαρμοσμένο σε κυκλική οπή διαμέτρου 5 cm που είχε γίνει στο κάλυμμα ενός πλαστικού τρυβλίου Petri, διαμέτρου 5,5 cm. Στη βάση του τρυβλίου υπήρχε νερό που διατηρούσε την σχετική υγρασία κάτω από το ημισφαίριο επαρκώς υψηλή ώστε τα θηλυκά να ωοτοκούν (Boller 1985). Σε κάθε κλουβί εκτροφής υπήρχαν δύο τέτοια ημισφαίρια (Εικόνα 2). Τα αυγά μεταφέρονταν με την βοήθεια μαλακού πινέλου από τα ημισφαίρια (Εικόνα 3Α). όπου είχαν αποτεθεί, σε θρεπτικό υπόστρωμα για την εκκόλαψή τους και την ανάπτυξη των προνυμφών (Εικόνα 3Β). Το υπόστρωμα αυτό αποτελούνταν από δίσκους βάμβακος διαμέτρου 5 cm εκ. εμποτισμένους με τεχνητή τροφή. Η τροφή είχε παχύρευστη μορφή κι αποτελούνταν από 100 gr ζάχαρης, 100 gr μαγιάς μπύρας, 50 gr αλευριού σόγιας, 2 gr μίγματος αλάτων, 8 gr ασκορβικού οξέος, 8 gr κιτρικού οξέος, 1,5 gr προπιονικού νατρίου διαλυμένα σε 500 ml νερό. Λεπτομέρειες που αφορούν την προετοιμασία της τροφής δίνονται από τον Boller (1985). Οι δίσκοι με την τροφή των προνυμφών τοποθετούνταν μέσα σε πλαστικά τρυβλία Petri διαμέτρου 9 cm τα οποία είχαν αποστειρωθεί προηγουμένως με καθαρό οινόπνευμα. Σε κάθε Petri με τροφή προνυμφών μεταφέρονταν αυγά. Στη συνέχεια τα τρυβλία κλείνονταν και τοποθετούνταν σε διάφανες πλαστικές σακούλες προκειμένου να αποφευχθεί η απώλεια υγρασίας που θα είχε ως αποτέλεσμα την αφυδάτωση και τον θάνατο αυγών και προνυμφών. Η ανάπτυξη των προνυμφών στο θρεπτικό υπόστρωμα στους 25 ο C ολοκληρωνόταν σε 8-10 ημέρες. Μετά την ολοκλήρωση της ανάπτυξης τα τρυβλία ανοίγονταν και τοποθετούνταν επάνω σε ένα στρώμα στεγνής άμμου πάχους 4-5 mm μέσα σε πλαστικές λεκάνες. Οι ανεπτυγμένες προνύμφες εξέρχονταν από το τρυβλίο και νυμφώνονταν στην άμμο. ύο έως τρεις ημέρες μετά την νύμφωση η άμμος απομακρύνονταν με κοσκίνισμα και οι νύμφες τοποθετούνταν σε πλαστικά τρυβλία Petri. Η έξοδος των ενηλίκων λάμβανε χώρα 9-10 ημέρες μετά την νύμφωση. 23

29 24 Α Β Εικόνα 3. (Α) Τεχνητό υπόστρωμα ωοτοκίας που χρησιμοποιήθηκε στις εκτροφές της μύγας της Μεσογείου (Φώτο. Ι Ηλιάδης) και (Β) αυγά που έχουν αποτεθεί από θηλυκά στην εσωτερική επιφάνειά του (Φώτο. Χ. Ιωάννου) 24

30 Αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού και άλλες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού το οποίο προερχόταν από την εταιρεία Sigma Αldrich (Karlsrhue Germany) (Πίνακας 1). Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν και πέντε καθαρές ουσίες που περιέχονται στο χημικό προφίλ του αιθέριου ελαίου πορτοκαλιού (Attaway et al. 1968) και οι οποίες φαίνονται στον Πίνακα 1. Ορισμένες από τις ουσίες αυτές περιέχονται επίσης στην φερομόνη φύλου των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου (Howse & Knapp 1996). Πίνακας 1. Ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα της διατριβής, ποσοστό καθαρότητας και προέλευση. Ουσία Καθαρότητα (%) Εταιρεία Προέλευση Χώρα λιμονένιο 97 Alfa Aesar Karlsrhue Γερμανία α-πινένιο 98 Alfa Aesar Karlsrhue Γερμανία λιναλούλη 97 Sigma Aldrich Steiheim Γερμανία γερανιόλη 97 Alfa Aesar Karlsrhue Γερμανία β-μυρσίνη 90 Fluka Lyon Γαλλία αιθέριο έλαιο πορτοκαλιού _ Sigma Aldrich Karlsrhue Γερμανία 25

31 26 3. Επίδραση συστατικών του αιθερίου ελαίου του πορτοκαλιού στο σεξουαλικό κάλεσμα στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου 3.1 Περίληψη Στο κεφάλαιο αυτό μελετήθηκε στο εργαστήριο η επίδραση καθαρού λιμονένιου, αιθέριου ελαίου από πορτοκάλι και ενός μίγματος αποτελούμενου από λιμονένιο, β-μυρσίνη, λιναλούλη, γερανιόλη και α-πινένιο, στο σεξουαλικό κάλεσμα στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Χρησιμοποιήθηκαν στείρα έντομα του στελέχους VIENNA-8 tsl τα οποία χρησιμοποιούν ευρέως για εξαπολύσεις σε διάφορες περιοχές του κόσμου όπου εφαρμόζεται η μέθοδος των στείρων εντόμων. Τα έντομα αυτά τρέφονταν είτε μόνο με ζάχαρη είτε με ζάχαρη και πρωτεΐνη. Ό- ταν τα αρσενικά τρέφονταν μόνο με ζάχαρη η έκθεση στις τρεις μεταχειρίσεις είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της συχνότητας του σεξουαλικού καλέσματος. Ω- στόσο οι διαφορές που παρατηρήθηκαν σε σχέση με τον μάρτυρα ήταν στατιστικά σημαντικές μόνο στην περίπτωση της έκθεσης στο μίγμα των πέντε συστατικών. Αντίθετα, όταν τα αρσενικά είχαν στη διάθεσή τους τόσο ζάχαρη όσο και πρωτεΐνη όλες οι μεταχειρίσεις αύξησαν σημαντικά την συχνότητα του σεξουαλικού καλέσματος σε σχέση με το μάρτυρα. Η ηλικία των εντόμων επίσης επηρέασε το σεξουαλικό κάλεσμα, ιδιαίτερα στην περίπτωση των αρσενικών που είχαν στη διάθεσή τους μόνο ζάχαρη όπου παρατηρήθηκε μείωση της συχνότητάς του με την αύξηση της ηλικίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα σχολιάζονται και ερμηνεύονται προκειμένου να κατανοήσουμε εκτενέστερα τη σεξουαλική συμπεριφορά της μύγας της Μεσογείου και να βελτιώσουμε τις προοπτικές επιτυχούς αντιμετώπισής της με τη φιλική προς το περιβάλλον μέθοδο του στείρου εντόμου. 26

32 Εισαγωγή Ουσίες οι οποίες προέρχονται από φυτά-ξενιστές φαίνεται πως διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην σεξουαλική συμπεριφορά διπτέρων εντόμων της οικογένειας Tephritidae (Landlot and Philips 1997, Light and Jang 1996). Σε ορισμένα είδη η έκθεση των αρσενικών σε αιθέρια έλαια φυτών αυξάνει την ικανότητα τους να συζευγνύονται με θηλυκά, δίνοντάς τους έτσι ένα πλεονέκτημα απέναντι στα άλλα αρσενικά ανταγωνιστές τους. Στη μύγα της Μεσογείου τα αρσενικά προσελκύονται και τρέφονται σε ουσίες που προέρχονται από τον φλοιό των πορτοκαλιών, όπως επίσης και ορισμένων άλλων φυτών (Katsoyannos et al. 1997, Shelly and Villalobos 2004). Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια έδειξαν ότι οσμηρά ερεθίσματα που προέρχονται από ορισμένα φυτά ξενιστές αυξάνουν αποτελεσματικά τη διάθεση για σύζευξη και ενισχύουν τη διάρκεια και την ένταση του σεξουαλικού καλέσματος (Katsoyannos et al. 1997, Papadopoulos et al.1998, Papadopoulos et al. 2001, Shelly et al. 1996, Shelly 1999, Shelly et al. 2001). Αρσενικά που είχαν εκτεθεί σε αιθέριο έλαιο από πορτοκάλι ή άλλα εσπεριδοειδή αποδείχτηκε ότι συζευγνύονταν σε μεγαλύτερο ποσοστό με παρθένα θηλυκά σε σχέση με αρσενικά που δεν είχαν πρόσβαση στο αντίστοιχο χημικό ερέθισμα. Η επίδραση του αιθερίου ελαίου του πορτοκαλιού στα αρσενικά εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη συγκέντρωση στην οποία αυτό βρίσκεται (Kouloussis et al. 2010). Εκτός από την ουσία α-copaene, η οποία μελετήθηκε εκτεταμένα τα τελευταία χρόνια, πιθανότατα και άλλες ουσίες οι οποίες βρίσκονται στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού μπορεί να είναι υπεύθυνες για την ενίσχυση της διάθεσης αυτής. Στα έντομα η ανταπόκριση στην έκλυση φερομονών παίζει σημαντικό ρόλο στην σεξουαλική συμπεριφορά και ιδιαίτερα στην διάθεση για σύζευξη. Η προσέλκυση των θηλυκών από τα αρσενικά συνδέεται τόσο με τη χρήση φερομονικών όσο και με την χρήση οπτικών και ακουστικών ερεθισμάτων (Alcock 1977). Όπως παρουσιάζεται αναλυτικά στο κεφάλαιο 3 της διατριβής, το σεξουαλικό κάλεσμα των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου επηρεάζεται τόσο από χημικά ερεθίσματα προερχόμενα από φυτά-ξενιστές (Papadopoulos et al. 2004, Papadopoulos et al. 27

33 ) όσο και από το είδος της τροφής (Yuval et al. 2000, Warburg & Yuval 1997b). Οι House & Knapp (1996) αναφέρουν αρκετές ουσίες που είναι κοινές στο χημικό προφίλ αιθέριων ελαίων εσπεριδοειδών και της φερομόνης φύλου των αρσενικών. Ορισμένες από τις ουσίες αυτές, όπως το λιμονένιο, η β- μυρσίνη, η γερανιόλη, η λιναλούλη και το α-πινένιο ενδέχεται να είναι υπεύθυνες για το φαινόμενο της αύξησης της ανταγωνιστικότητας κατά τη σύζευξη (Kouloussis et al. 2010). Ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ότι η παραγωγή και η έκλυση φερομόνης από τα αρσενικά είναι μια διεργασία που απαιτεί μεγάλη επένδυση ενέργειας και ότι μόνο αρσενικά με ικανοποιητικά θρεπτικά αποθέματα μπορούν να επιτύχουν τελικά συζεύξεις με θηλυκά (Yuval et al. 2000, Warburg & Yuval 1997b). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η διαθεσιμότητα σε πρωτεΐνη αυξάνει το σεξουαλικό κάλεσμα σε άγρια αρσενικά, όμως δεν είναι γνωστό εάν έχει παρόμοιες ποσοτικές επιδράσεις σε στείρα αρσενικά. Επίσης δεν είναι γνωστό αν το σεξουαλικό κάλεσμα των στείρων αρσενικών επηρεάζεται από την έκθεσή τους σε χημικά ερεθίσματα προερχόμενα από φυτά ξενιστές και αν η επίδραση αυτή εξαρτάται και από το είδος της τροφής. Στο κεφάλαιο που ακολουθεί μελετήθηκε στο εργαστήριο η επίδραση του αιθερίου ελαίου του πορτοκαλιού, του λιμονενίου και ενός μίγματος πέντε ακόμα ουσιών που περιέχονται στο αιθέριο έλαιο του πορτοκαλιού στο σεξουαλικό κάλεσμα στείρων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Παράλληλα με τις παραπάνω ουσίες μελετήθηκε και η επίδραση δύο διαφορετικών ειδών τροφής (πρωτεΐνης και ζάχαρης, σκέτης ζάχαρης). 28

34 Υλικά και μέθοδοι Πειραματική διαδικασία Αμέσως μετά την έξοδό τους, τα στείρα αρσενικά του στελέχους VIENNA-8 tsl τοποθετούνταν σε καλά αεριζόμενα ξύλινα κλουβιά 30 x 30 x 30 εκ. που είχαν τρεις πλευρές καλυμμένες με συρμάτινο πλέγμα και μία με γυαλί (Εικόνα 4Α). Σε κάθε κλουβί τοποθετούνταν 200 αρσενικά και νερό σε πλαστικά φιαλίδια. Ως τροφή το κάθε κλουβί περιείχε είτε μίγμα υδρολυμένης πρωτεΐνης, ζάχαρης και νερού σε αναλογία 1:4:5 αντίστοιχα (ΠΖ) (βλ. κεφάλαιο 2), είτε σκέτη ζάχαρη (Ζ). Οι μεταχειρίσεις μας αφορούσαν την έκθεση σε αιθέριο έλαιο από πορτοκάλι, καθαρό λιμονένιο, καθώς και ένα μίγμα συστατικών του πορτοκαλιού αποτελούμενου από λιμονένιο, β-μυρσίνη, λιναλούλη, γερανιόλη και α-πινένιο. Όπως προαναφέρθηκε οι ουσίες αυτές επηρεάζουν δραστικά τη ανταγωνιστικότητα κατά τη σύζευξη των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου και ενδεχομένως είναι πρόδρομες ουσίες για την παραγωγή φερομόνης φύλου. Το λιμονένιο, β- μυρσίνη, λιναλούλη και α-πινένιο βρίσκονται στα αιθέρια έλαια των εσπεριδοειδών και ιδιάιτερα στο χημικό προφίλ του αιθερίου ελαίου του πορτοκαλιού σε υψηλές συγκεντρώσεις (Attaway et al. 1968). Αντίθετα η γερανιόλη εντοπίζεται σε μικρές ποσότητες στο χημικό προφίλ του αιθερίου ελαίου πορτοκαλιού και χρησιμοποιείται ως προσελκυστικό σε παγίδες για την μύγα της Μεσογείου (Attaway et al. 1968). Το λιμονένιο, η λιναλούλη και η β-μυρσίνη είναι συστατικά της φερομόνης φύλου των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου (Howse & Knapp 1996). Tο λιμονένιο είναι μία από τις ουσίες που απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια του σεξουαλικού καλέσματος των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου (Jang et al. 1989). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό ταυτόσημες εργαστηριακές συνθήκες και για τις τρεις μεταχειρίσεις που είχαν υποστεί έκθεση σε κάποιο από τα χημικά ερεθίσματα. Τα έντομα στα οποία δεν επετράπη πρόσβαση σε κάποια από τις τρεις ουσίες (μάρτυρας) παρέμειναν σε διαφορετικό χώρο με ελεγχόμενες συνθήκες όπως και στις προηγούμενες μεταχειρίσεις. Την τέταρτη και πέμπτη ημέρα 29