ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ «Στραγγίσματα και υδάτινο περιβάλλον: μελέτη των τοξικών επιπτώσεων με τη χρήση οργανισμών-βιοενδεικτών και Βιομαρτύρων» Βασιλική Τσαρπαλή Α.Μ. 470 Επιβλέπων Καθηγητής: Στέφανος Νταϊλιάνης ΠΑΤΡΑ 2013

2 Τριμελής Επιτροπή Επιβλέπων Καθηγητής Νταϊλιάνης Στέφανος (Λέκτορας),, Τομέας Βιολογίας Ζώων, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλη επιτροπής Κουτσικόπουλος Κωνσταντίνος (Καθηγητής),, Τομέας Βιολογίας Ζώων, Πανεπιστήμιο Πατρών Καραπαναγιώτη Χρυσή (Επίκουρος Καθηγήτρια), Τμήμα Χημείας, Τομέας Χημικών Εφαρμογών, Χημικής Ανάλυσης και Χημείας Περιβάλλοντος, Πανεπιστήμιο Πατρών

3 Ευχαριστίες Ολοκληρώνοντας την παρούσα μελέτη θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ανθρώπους με τους οποίους συνεργάστηκα όλο αυτόν τον καιρό, και οι οποίοι με βοήθησαν υλικά και πνευματικά να την πραγματοποιήσω. Συγκεκριμένα, θα ήθελα να ευχαριστήσω: Τον κ. Στέφανο Νταϊλιάνη, Λέκτορα του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών για την ανάθεση της παρούσας εργασίας και την καθοδήγησή του μέχρι να έρθει σε πέρας, αλλά κυρίως για την ευκαιρία που μου έδωσε να συμμετάσχω στο ερευνητικό πρόγραμμα Καραθεοδωρή (κωδικός έργου D179), με τίτλο «Μελέτη των τοξικών επιπτώσεων στραγγισμάτων από ΧΥΤΑ σε υδρόβιους οργανισμούς με τη χρήση βιοενδεικτών και βιομαρτύρων». Η συνεργασία μας μου προσέφερε πολλές γνώσεις και σημαντικές εμπειρίες, και χαίρομαι πολύ που είχα την ευκαιρία να συνεργαστώ μαζί του, καθώς πρόκειται για έναν δραστήριο και ικανό επιστήμονα. Κυρίως όμως θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για την εμπιστοσύνη του και την υποστήριξη του καθόλη τη διάρκεια της παρούσας μελέτης. Την κα. Χρυσή Καραπαναγιώτη, Λέκτορα του Τμήματος Χημείας, του Πανεπιστημίου Πατρών και τον κ. Κωνσταντίνο Κουτσικόπουλο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, όχι μόνο για την συμμετοχή τους στην Τριμελή Επιτροπή, αλλά και για την βοήθειά τους κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Την κα. Μαρία Κωστοπούλου-Καραντανέλλη, Επίκουρη Καθηγήτρια του τμήματος Επιστημών της Θάλασσας, του Πανεπιστημίου Αιγαίου, για την προσφορά του μονοκύτταρου φυτοπλαγκτονικού οργανισμού Dunaliella tertiolecta. Την κα. Μαρία Καμηλάρη, υποψήφια διδάκτωρ του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, η οποία βοήθησε σημαντικά στην στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης. Τα μέλη του εργαστηρίου, με τα οποία μοιραστήκαμε αρκετές στιγμές, δύσκολες και ευχάριστες, σε αυτά τα δύο χρόνια.

4 Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του προγράμματος Καραθεοδωρή (κωδικός έργου D179), με τίτλο «Μελέτη των τοξικών επιπτώσεων στραγγισμάτων από ΧΥΤΑ σε υδρόβιους οργανισμούς με τη χρήση βιοενδεικτών και βιομαρτύρων», που τελεί υπό τη χρηματοδότηση του Πανεπιστημίου Πατρών.

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη... 8 Abstract ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Αστικά Στερεά Απόβλητα (Municipal Solid Wastes) Διαχείριση των αποβλήτων Υγειονομική Ταφή (Sanitary landfilling) ΧΥΤΑ (landfills of waste) Αποικοδόμηση απορριμμάτων σε χώρους υγειονομικής ταφής Στραγγίσματα Σύσταση των στραγγισμάτων Διαχείριση των στραγγισμάτων Εκτίμηση του περιβαλλοντικού κινδύνου με τη χρήση υδρόβιων οργανισμών Το είδος Thamnocephalus platyurus ως οργανισμός Βιοενδείκτης Το είδος Artemia franciscana ως οργανισμός Βιοενδείκτης Το είδος Brachionus plicatilis ως οργανισμός Βιοενδείκτης Το είδος Dunaliella tertiolecta και η χρήση του σε δοκιμασίες τοξικότητας Δίθυρα μαλάκια-το είδος Mytilus galloprovincialis Το είδος Mytilus galloprovincialis και η χρήση του ως οργανισμό Βιοενδείκτη Βιολογικοί παράμετροι και χρήση τους ως δείκτες καταπόνησης (stress) Κυτταροτοξικές επιπτώσεις Νευροτοξικές επιπτώσεις Φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (oxidative stress) Γενοτοξικές επιπτώσεις Σκοπός της εργασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια και διαλύματα Περιοχή δειγματοληψίας Όγκος απορριμάτων και κλιματολογικά δεδομένα της περιοχής μελέτης Σχεδιασμός της πειραματικής διαδικασίας Συλλογή και χαρακτηρισμός στραγγισμάτων Δοκιμές τοξικότητας με τη χρήση μικροβιοτεστ και φυτοπλαγκτον... 46

6 2.3.3 Τοξικές επιπτώσεις του στραγγίσματος στο είδος Mytilus galloprovincialis Πειραματικός βιομαρτύρων σε ιστούς των μυδιών έπειτα από έκθεση τους σε υποθανατογόνες συγκεντρώσεις στραγγίσματος Προσδιορισμός επιλεγμένων βιομαρτύρων σε ιστούς των μυδιών Προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης στα δείγματα Στατιστική ανάλυση δεδομένων Ανάλυση δεδομένων φυσικοχημικών παραμέτρων και βαρέων μετάλλων σε δείγματα στραγγισμάτων Ανάλυση δεδομένων από δοκιμές τοξικότητας (LC 50, IC 50 ) Συσχετίσεις μεταξύ αβιοτικών και βιοτικών παραμέτρων Ανάλυση δεδομένων από τους επιλεγμένους βιομάρτυρες που προσδιορίστηκαν στους ιστούς των μυδιών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ποσοστά βροχόπτωσης (ύψος υετού) και ταχύτητα ροής/παροχής (flow rate) παραγόμενων στραγγισμάτων Φυσικοχημικές παράμετροι και συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων Αποτελέσματα τοξικότητας με την χρήση των μικροβιοτέστ και του μονοκύτταρου φυτοπλαγκτονικού οργανισμού Διερεύνηση στατιστικώς σημαντικών συσχετίσεων μεταξύ αβιοτικών και βιοτικών παραμέτρων Αποτελέσματα δοκιμών τοξικότητας με την χρήση του βιοενδείκτη Μ. galloprovincialis Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του στραγγίσματος Νοεμβρίου Διερεύνηση θανατογόνου δράσης και προσδιορισμός υποθανατογόνων συγκεντρώσεων Προσδιορισμός του χρόνου αποσταθεροποίησης των λυσοσωμικών μεμβρανών στα αιμοκύτταρα των μυδιών (NRRT Assay) Προσδιορισμός επιπέδων σουπεροξειδικών ανιόντων (. Ο 2 - ) και MDA Προσδιορισμός μικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωμαλιών στα αιμοκύτταρα και τα βράγχια των μυδιών Προσδιορισμός της δραστικότητας της ακετυλ-χολινστεράσης (AChE) στα βράγχια και τον πεπτικό αδένα των μυδιών Προσδιορισμός των επιπέδων των μεταλλοθειονινών (MT) στα βράγχια και τον πεπτικό αδένα των μυδιών Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα ΣΥΖΗΤΗΣΗ Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των στραγγισμάτων και οι εποχικές τους μεταβολές... 95

7 4.2 Εποχιακές διακυμάνσεις της τοξικότητας των στραγγισμάτων Επαγωγή τοξικών φαινομένων στο είδος Mytilus galloprovincialis Επαγωγή θνησιμότητας Επαγωγή φαινομένων κυτταροτοξικότητας στα αιμοκύτταρα των μυδιών Επαγωγή νευροτοξικών επιπτώσεων σε ιστούς των μυδιών Επαγωγή φαινομένων οξειδωτικής καταπόνησης και γενοτοξικών επιπτώσεων 101 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ξενόγλωσση βιβλιογραφία Ελληνική Βιβλιογραφία Ηλεκτρονικές πηγές ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙI ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙI

8 Περίληψη Η παρούσα μελέτη στοχεύει στη διερεύνηση των τοξικών επιπτώσεων των στραγγισμάτων που δημιουργούνται σε χώρους υγειονομικής ταφής απορριμμάτων (ΧΥΤΑ) σε υδρόβιους οργανισμούς, όπως τα ανόστρακα καρκινοειδή Thamnocephalus platyurus και Artemia franciscana, το τροχόζωο Brachionus plicatilis, το μικροφύκος Dunaliella tertiolecta και το δίθυρο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis, καθώς και τη διερεύνηση των παραμέτρων που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εν δυνάμει τοξικότητά τους. Η μελέτη στραγγισμάτων που συλλέχθηκαν από τον ΧΥΤΑ Αιγείρας (ν. Αχαΐας) κατά τη διάρκεια του έτους 2011, έδειξε σημαντικές ποιοτικές και ποσοτικές εποχιακές διαφορές στην εν δυνάμει τοξικότητα των στραγγισμάτων στους οργανισμούς που ελέγχθηκαν, με τις σημαντικότερες τοξικές επιπτώσεις να εμφανίζονται στα δείγματα που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια άνυδρων περιόδων, όπως η περίοδος μεταξύ Οκτωβρίου και Δεκεμβρίου. Παρόμοια, έκθεση μυδιών σε δείγμα στραγγίσματος που συλλέχθηκε κατά τη διάρκεια της παραπάνω περιόδου (Νοέμβριος 2011) έδειξε σημαντική αύξηση του ποσοστού θνησιμότητας των ατόμων, σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 0.5% v/v, ενώ σε μικρότερες συγκεντρώσεις (0.01 και 0.1% v/v) εμφανίστηκαν σημαντικές κυτταροτοξικές, νευροτοξικές και γενοτοξικές επιπτώσεις, καθώς και φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (oxidative stress). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας καταδεικνύουν την τοξικότητα των σταγγισμάτων σε υδρόβιους οργανισμούς, η οποία μπορεί επιπλέον να εκτιμηθεί μέσω της ανάλυσης επιλεγμένων παραμέτρων όπως η αγωγιμότητα (Cond), τα παράγωγα του αζώτου (NO 3, και NH 4 N), ο λόγος BOD 5 /NH 4 N και οι φαινόλες (T-PH).

9 Abstract The present study investigates seasonal variations of leachate composition and its toxic potency on different species, such as the brine shrimp Artemia franciscana (formerly Artemia salina), the fairy shrimp Thamnocephalus platyurus, the estuarine rotifer Brachionus plicatilis and the microalgal flagellate Dunaliella tertiolecta, as well as its ability to induce lethal and pre-pathological alterations in organisms bioindicators, such as the mussel Mytilus galloprovincialis. In specific, leachate regularly collected from the municipal landfill site of Aigeira (Peloponissos, Greece) during the year 2011, showed significant alterations of almost all its physicochemical parameters, as well as its toxic potency, with time. Samples collected during the dry season (October until December) proved to be more toxic than samples from other sample dates/periods. Further analysis showed significant increase of mortality among mussels exposed to leachate collected during that period (November 2011) (96h LC 50 = 0.526%, v/v), while mussels exposed to sub-lethal concentrations (0.01 και 0.1% v/v) showed increased cytotoxic, neurotoxic, genotoxic and oxidative effects. The current study revealed for the first time that the estimation of a battery of leachate physicochemical parameters, such as Cond, TDS, NH 4 N, T-PH and the respective BOD 5 /NH 4 N ratio, could be used as a low-cost effective tool in order to estimate leachate strength and toxicity, at least in the case of semi-arid areas, such as the most of the Mediterranean countries.

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 1.1 Αστικά Στερεά Απόβλητα (Municipal Solid Wastes) Σύμφωνα με την ΚΥΑ με αρ /2727/2003, ως στερεό απόβλητο ορίζεται «κάθε ουσία ή αντικείμενο, το οποίο ο κάτοχός του απορρίπτει ή προτίθεται να απορρίψει ή υποχρεούται να απορρίψει», και ως αστικά στερεά απόβλητα ή αλλιώς αστικά απορρίμματα (Municipal Solid Wastes, MSW), ορίζονται «τα οικιακά απόβλητα, καθώς και τα άλλα απόβλητα, που λόγω της φύσης ή της σύνθεσής τους προσομοιάζουν με τα οικιακά απόβλητα, όπως τα δημοτικά απόβλητα ή τα απόβλητα από εμπορικές δραστηριότητες». Tα στερεά αστικά απόβλητα αποτελούνται από οργανικά και ανόργανα υλικά και κυρίως από ζυμώσιμα, χαρτικά, πλαστικά, μέταλλα και γυαλί. Στα αστικά στερεά απόβλητα περιλαμβάνονται επίσης τα ογκώδη αντικείμενα, όπως τα έπιπλα, καθώς και τα απόβλητα κήπων (κλαδιά και φύλλα). Ενδεικτικά δίνεται η Eικόνα 1 όπου απεικονίζονται χρωματικά οι ποσότητες αστικών στερεών αποβλήτων ( σε kg/άτομο) που παράχθηκαν στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, κατά το έτος Εικόνα 1. Αστικά στερεά απόβλητα ανά χώρα, σε kg ανά άτομο, για το έτος 2010 (πηγή: Eurostat). Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Διαχείριση των αποβλήτων Τα τελευταία χρόνια, η αυξητική τάση στα ποσοστά των παραγόμενων αστικών απορριμμάτων που παρατηρείται σε σε παγκόσμιο επίπεδο (Suocheng et al., 2001; Magrinho et al., 2006; OECD, 2012) καταδεικνύει την ανάγκη της ορθής διαχείρισής τους, έτσι ώστε να μειωθεί ο περιβαλλοντικός κίνδυνος (MacArthy, 1994). Επειδή όμως η διαχείρισή τους θα πρέπει να ικανοποιεί σαφή κοινωνικά, υγειονομικά, οικονομικά και περιβαλλοντικά κριτήρια, η ορθή διαχείριση των απορριμμάτων αποτελεί σήμερα ένα μείζον πρόβλημα παγκοσμίως (Hadjibiros et al., 2011; Renou et al., 2008; Kalcíková et al., 2011). Η συλλογή, η μεταφορά, η μεταφόρτωση, η προσωρινή αποθήκευση, η αξιοποίηση και η διάθεση των αποβλήτων, συμπεριλαμβανομένης της εποπτείας των εργασιών αυτών, καθώς και της μετέπειτα φροντίδας των χώρων διάθεσης (ΚΥΑ με αρ /2727/2003), πρέπει να πραγματοποιούνται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να διασφαλίζεται η ανθρώπινη υγεία και η περιβαλλοντική συνέχεια και ισορροπία. Ειδικότερα, λαμβάνονται μέτρα ώστε: α) να μην δημιουργούνται κίνδυνοι για το νερό, τον αέρα, το έδαφος, τη χλωρίδα, την πανίδα καθώς και την εν γένει βιώσιμη ανάπτυξη. β) να μην προκαλούνται ενοχλήσεις από το θόρυβο ή τις οσμές. γ) να μην προκαλείται αλλοίωση του τοπίου και των περιοχών που παρουσιάζουν ιδιαίτερο οικολογικό, πολιτιστικό, αισθητικό ενδιαφέρον (όπως αρχαιολογικοί χώροι, τοπία ιδιαιτέρου φυσικού κάλους, ευαίσθητα οικοσυστήματα) Υγειονομική Ταφή (Sanitary landfilling) Ως πιο διαδεδομένη μορφή ελεγχόμενης απόθεσης των αστικών απορριμμάτων θεωρείται η υγειονομική ταφή τους (Ehrig, 1983; El-Fadel et al., 1997; Baderna et al., 2011; Kalčíková et al., 2011; Pablos et al., 2011). Κατά την διαδικασία αυτή λαμβάνονται τα κατάλληλα μέτρα ώστε να επιτυγχάνεται ελαχιστοποίηση τόσο της περιβαλλοντικής επιβάρυνσης, όσο και του κινδύνου για τη δημόσια υγεία. Η προστασία του περιβάλλοντος επιτυγχάνεται μέσω: της κατάλληλης χωροθέτησης του χώρου ταφής την κατασκευή ειδικών έργων υποδομής, τα οποία μεταξύ άλλων, περιλαμβάνουν την απομόνωση του χώρου ταφής από το περιβάλλον, καθώς και την συλλογή των παραπροϊόντων της διαδικασίας αυτής Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 11

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ της εφαρμογής διαδικασιών ελέγχου και παρακολούθησης της διαδικασίας σε όλα τα στάδια. Συγκεκριμένα, τα απορρίμματα συλλέγονται και οδηγούνται σε κατάλληλα διαμορφωμένους χώρους, τους ΧΥΤΑ (Χώροι Υγειονομικής Ταφής Απορριμμάτων/landfills of waste), όπου εναποτίθενται σε διαδοχικές επάλληλες στρώσεις και καλύπτονται με αδρανή υλικά, συνήθως χώμα (Εικόνα 2 Α). Τα απόβλητα δεν τοποθετούνται άμεσα πάνω στο έδαφος, αλλά διαχωρίζονται από αυτό μέσω ειδικών γεωλογικών τοίχων απομόνωσης και κατάλληλων αδιαπέραστων μεμβρανών, τα οποία λειτουργούν ως μονωτές (Εικόνα 2 Β,Γ). Οι προϋποθέσεις που πρέπει να πληρούνται για την ορθή κατασκευή και λειτουργία ενός ΧΥΤΑ περιγράφονται αναλυτικά στην Οδηγία 1999/31/ΕΚ περί «υγειονομικής ταφής των αποβλήτων», καθώς και στην ΚΥΑ /97 (ΦΕΚ 1016Β/ ) περί «κατάρτισης πλαισίου προδιαγραφών και γενικών προγραμμάτων διαχείρισης στερεών αποβλήτων». A B Γ Εικόνα 2. Απεικόνιση λειτουργίας ΧΥΤΑ (Α), τυπική μορφή ΧΥΤΑ( Β), μονωτικό υλικό (Γ). Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 1.2 ΧΥΤΑ (landfills of waste) Σύμφωνα με την Οδηγία 1999/31/ΕΚ περί υγειονομικής ταφής των απορριμμάτων ως «χώρος υγειονομικής ταφής απορριμμάτων» (landfill of waste) ονομάζεται κάθε χώρος διάθεσης αποβλήτων για την υγειονομική απόθεση των αποβλήτων επί ή εντός του εδάφους ή υπογείως, συμπεριλαμβανομένων: των εσωτερικών χώρων διάθεσης (δηλαδή των χώρων υγειονομικής ταφής, στους οποίους ένας παραγωγός απορριμάτων πραγματοποιεί τη διάθεσή τους στον τόπο παραγωγής), κάθε μόνιμου (δηλαδή χρησιμοποιούμενου άνω του έτους) χώρου προσωρινής αποθήκευσης. Σύμφωνα με τη νομοθεσία, τα αστικά στερεά απορρίμματα οδηγούνται σε ΧΥΤΑ μη επικίνδυνων αποβλήτων. Στους χώρους αυτούς πραγματοποιείται διάθεση μόνο απορριμμάτων που έχουν υποστεί επεξεργασία, εξαιρουμένων των αδρανών υλικών, των οποίων η επεξεργασία είναι τεχνικώς αδύνατη, και οποιουδήποτε άλλου απορρίμματος, του οποίου η επεξεργασία δε μειώνει την ποσότητα των αποβλήτων ή τους κινδύνους για την υγεία του ανθρώπου και του περιβάλλοντος. Συγκεκριμένα, σε χώρους υγειονομικής ταφής μη επικίνδυνων αποβλήτων μπορούν να εισρέουν τα εξής: Αστικά απόβλητα/απορρίμματα Μη επικίνδυνα απόβλητα κάθε άλλης προέλευσης, τα οποία πληρούν τα κριτήρια υγειονομικής ταφής μη επικίνδυνων αποβλήτων που καθορίζονται από το παράρτημα ΙΙ της Οδηγίας 1999/31/ΕΚ. Σταθερά μη ενεργά απόβλητα (π.χ. στερεοποιημένα, υαλοποιημένα) με συμπεριφορά απόπλυσης αντίστοιχη προς τη συμπεριφορά των μη επικίνδυνων αποβλήτων, τα οποία πληρούν τα κριτήρια που καθορίζονται στο παράρτημα ΙΙ της Οδηγίας 1999/31/ΕΚ. Τα απόβλητα που θεωρούνται μη αποδεκτά προς εναπόθεση σε χώρους υγειονομικής ταφής είναι τα εξής: Υγρά απόβλητα Απόβλητα τα οποία, σε συνθήκες ταφής, είναι εκρηκτικά, διαβρωτικά, οξειδωτικά, πολύ εύφλεκτα ή εύφλεκτα, όπως ορίζονται στο παράρτημα ΙΙΙ της Οδηγίας 91/689/ΕΟΚ. Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Απόβλητα νοσοκομείων και συναφή, προερχόμενα από ιατρικές ή κτηνιατρικές εγκαταστάσεις, τα οποία είναι μολυσματικά κατά την έννοια της Οδηγίας 91/689/ΕΟΚ (παράρτημα ΙΙΙ, ιδιότητα Η9), καθώς και απόβλητα της κατηγορίας 14 (παράρτημα Ι μέρος Α) της ίδιας Οδηγίας. Ολόκληρα ή μεταχειρισμένα ελαστικά αυτοκινήτων, εκτός από τα υλικά που προορίζονται για χρήση σε έργα, και τεμαχισμένα μεταχειρισμένα ελαστικά αυτοκινήτων, μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, όπως ορίζεται από την Οδηγία 1999/31/ΕΚ, εξαιρουμένων των ελαστικών ποδηλάτων και ελαστικών με εξωτερική διάμετρο άνω των 1400mm. Οποιοσδήποτε άλλος τύπος αποβλήτων που δεν πληρεί τα κριτήρια αποδοχής που καθορίζονται σύμφωνα με το παράρτημα ΙΙ της Οδηγίας 1999/31/ΕΚ. Αναφέρεται ότι απαγορεύεται η αραίωση ή ανάμειξη των αποβλήτων, απλώς και μόνο για να τηρηθούν τα κριτήρια αποδοχής των αποβλήτων Αποικοδόμηση απορριμμάτων σε χώρους υγειονομικής ταφής Έπειτα από την εναπόθεση και την ταφή των απορριμμάτων δημιουργείται ένα ιδανικό μέρος ανάπτυξης μικροοργανισμών, καθώς προσφέρονται τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά και οι κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες για την ανάπτυξή τους (Καρλής, 2001). Η αποικοδόμηση των απορριμμάτων επιτυγχάνεται μέσω βιολογικών λειτουργιών που επιτελούν οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται στον χώρο, προκειμένου να εξασφαλίσουν τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά. Η διαδικασία της αποικοδόμησης αποτελείται από διαφορετικά στάδια, το καθένα από τα οποία έχει διαφορετικά χαρακτηριστικά. Η διαδικασία αρχικά είναι αερόβια, καθώς στον όγκο των αποβλήτων υπάρχει εγκλωβισμένος αέρας. Σε αυτό το στάδιο, το οποίο διαρκεί μόλις μερικές εβδομάδες, οι μικροοργανισμοί καταναλώνουν οξυγόνο, ενώ παράλληλα, λόγω της βιοποικοδόμησης, παράγεται CO 2 και νερό. Λόγω σταδιακής μείωσης του οξυγόνου, αρχίζουν να επικρατούν αναερόβιες συνθήκες που σηματοδοτούν το τέλος της φάσης αυτής. Στην συνέχεια, ακολουθεί το ανερόβιο στάδιο της οξυγένεσης, κατά το οποίο πραγματοποιείται η βιολογική αποικοδόμηση των σύνθετων οργανικών ενώσεων σε απλούστερες οργανικές ενώσεις, ενώ παράλληλα παράγονται οξικό οξύ, διοξείδιο του άνθρακα και υδρογόνο. Στο δεύτερο στάδιο της αναερόβιας αποικοδόμησης, το στάδιο της Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ μεθανογένεσης, παρατηρείται σημαντική παραγωγή μεθανίου, με ταυτόχρονη μείωση των προϊόντων που είχαν παραχθεί κατά το προηγούμενο στάδιο (οξικό οξύ, υδρογόνο). Σε αυτό το στάδιο, το απαραίτητο για την παραγωγή CO 2, προέρχεται από οργανικά συστατικά και τις ανόργανες ρίζες (Καρλής, 2001). Τέλος, επέρχεται το στάδιο της σταθεροποίησης Στραγγίσματα Η υγειονομική ταφή θεωρείται, όπως προαναφέρθηκε, ως μια τεχνική απόθεσης των απορριμμάτων η οποία μειώνει την περιβαλλοντική επιβάρυνση και βοηθά στην προστασία της δημόσιας υγείας. Όμως, κατά τη διαδικασία αυτή δημιουργούνται παραπροϊόντα, όπως τα στραγγίσματα, τα οποία αποτελούν σημαντικό πιθανό περιβαλλοντικό κίνδυνο. Στράγγισμα ή διασταλάζον ύδωρ (landfill leachate) ονομάζεται οποιοδήποτε υγρό ρέει δια μέσου των αποτεθέντων αποβλήτων και εκρέει από το χώρο ταφής ή περιέχεται μέσα του (Οδηγία 1999/31/ΕΚ). Η κυριότερη αιτία παραγωγής στραγγισμάτων είναι η εισροή κατακρημνισμάτων στον όγκο των αποβλήτων. Παρότι τα στραγγίσματα προέρχονται από την ανάμειξη ύδατος με μη επικίνδυνα απόβλητα, το αποτέλεσμα που προκύπτει είναι ένα εν δυνάμει τοξικό υδατικό διάλυμα, πλούσιο σε οργανικό και ανόργανο υλικό, καθώς και σε βαρέα μέταλλα, το οποίο σε περίπτωση διαφυγής του μπορεί να επιφέρει σημαντικές επιπτώσεις τόσο στο περιβάλλον όσο και στον άνθρωπο (Ding et al., 2001; Pivato and Gaspari, 2006; Olivero-Verbel et al., 2008; Matejcyk et al., 2011; Pablos et al., 2011). Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, ακόμα και μια μικρή ποσότητα στραγγίσματος αρκεί για να ρυπάνει τα γειτονικά υπόγεια ύδατα, καθιστώντας τα ακατάλληλα ακόμα και για άρδευση (Loizidou and Kapetanios, 1993; Hancock et al., 1995; Flyhammar, 1997; Bakare et al., 2000) Σύσταση των στραγγισμάτων Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, τα στραγγίσματα χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη υψηλών συγκεντρώσεων οργανικών και ανόργανων ενώσεων, βαρέων μετάλλων και ξενοβιοτικών ουσιών (Christensen et al., 1994; Clément et al., 1997; Słomczynska and Słomczynski, 2004; Bortolotto et al., 2009; Pablos et al., 2011), ενώ έχει αναφερθεί και η Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 15

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ παρουσία τοξικών και καρκινογόνων ουσιών (Schrab et al., 199; Kalcíková et al., 2011; Matejcyk et al., 2011) (Παράρτημα ΙI). Η σύσταση των στραγγισμάτων, τόσο ποσοτικά όσο και ποιοτικά ποικίλλει όχι μόνο από ΧΥΤΑ σε ΧΥΤΑ, αλλά και από εποχή σε εποχή (Baderna et al., 2011). Οι κυριότερες παράμετροι που επηρεάζουν την σύσταση των στραγγισμάτων είναι οι εξής (Chen, 1996; Christensen et al., 2001; Frascari et al., 2004; Fan et al., 2006; Zgajnar et al., 2009; Ziyang et al., 2009; Baderna et al., 2011; Kalcíková et al., 2011): η ηλικία του ΧΥΤΑ, δηλαδή πόσα χρόνια λειτουργεί και σε πιο στάδιο αποικοδόμησης βρίσκεται η σύνθεση των απορριμμάτων από τα οποία προέρχονται οι κλιματικές συνθήκες της περιοχής η γεωλογία της περιοχής Διαχείριση των στραγγισμάτων Η διαχείριση των στραγγισμάτων αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα παγκοσμίως (Baccini et al., 1987; Tatsi and Zouboulis, 2002). Σύμφωνα με την ευρωπαϊκή νομοθεσία (Οδηγία 1999/31/ΕΚ), τα στραγγίσματα θα πρέπει: να συλλέγονται, ώστε να μην διαφεύγουν ανεπεξέργαστα στο περιβάλλον να υποβάλλονται σε επεξεργασία, ώστε να πληρούνται οι κατάλληλες προδιαγραφές που απαιτούνται για την αποχέτευσή τους. να ελέγχεται ο όγκος και η σύνθεσή τους. Για την κάλυψη των προαναφερθέντων απαιτήσεων, κάθε ΧΥΤΑ υποχρεούται, εκτός των άλλων, να έχει ειδικό σύστημα στεγανοποίησης του χώρου και συλλογής των στραγγισμάτων, τα οποία κατόπιν θα αποθηκεύονται σε ειδική δεξαμενή αποθήκευσης, ενώ στην συνέχεια θα πρέπει, ανάλογα με την ποσότητα και την σύστασή τους, να υφίστανται την κατάλληλη επεξεργασία προκειμένου να επιτευχθεί μείωση του φέροντος ρυπαντικού φορτίου, σε επίπεδα περιβαλλοντικώς αποδεκτά για διάθεση. Το πρόβλημα όμως που δημιουργείται είναι η δυσκολία εξαγωγής ενός πρωτοκόλλου επεξεργασίας τους, εξαιτίας της μεγάλης ανομοιομορφίας που παρουσιάζουν στην σύστασή τους, ακόμα και από ίδιους ΧΥΤΑ. Γι αυτό το λόγο, η μέθοδος επεξεργασίας τους διαφέρει ανά περίπτωση, και πρέπει να επιλέγεται ανάλογα με τις εκάστοτε ανάγκες. Οι συνήθεις τεχνικές επεξεργασίας είναι οι εξής (Lema et al, 1988): Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 16

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Ανακυκλοφορία μέσα στο κύριο όγκο των αποβλήτων Συνδυασμένη επεξεργασία με αστικά λύματα Βιολογική επεξεργασία Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τη διαχείριση των στραγγισμάτων είναι το κόστος συλλογής και επεξεργασίας τους. Στον Πίνακα 1 αναφέρεται ενδεικτικά το κόστος διαχείρισης και παρακολούθησης των στραγγισμάτων σε σχέση με τον αριθμό των κατοίκων που εξυπηρετεί, όταν στο ΧΥΤΑ λειτουργεί ή όχι μονάδα επεξεργασίας. Τα στοιχεία στηρίζονται σε μελέτη που εκπονήθηκε για λογαριασμό του Υπουργείου Περιβάλλοντος, Χωροταξίας και Δημοσίων Έργων της Ελλάδας με τίτλο «Σχεδιασμός Προγραμματισμός έργων διαχείρισης απορριμμάτων σε επίπεδο χώρας» (Παρασκευόπουλος Γεωργιάδης ΕΠΕ, 1999). Πίνακας 1. Κόστος διαχείρισης και παρακολούθησης των στραγγισμάτων σε σχέση με τον εξυπηρετούμενο πληθυσμό (σε ) κάτοικοι κάτοικοι κάτοικοι Χωρίς μονάδα επεξεργασίας Με μονάδα επεξεργασίας Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 17

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 1.3 Εκτίμηση του περιβαλλοντικού κινδύνου με τη χρήση υδρόβιων οργανισμών Η εκτίμηση του περιβαλλοντικού κινδύνου βασίζεται πολλές φορές μόνο σε χημικές αναλύσεις. Σε περίπλοκα μίγματα, όπως τα περισσότερα υγρά απόβλητα και τα στραγγίσματα, εμπεριέχονται ξενοβιοτικές ενώσεις, δηλαδή ουσίες που δεν υπάρχουν φυσιολογικά σε έναν οργανισμό, αλλά αν βρεθούν σε αυτό σε κάποιο ποσοστό επηρεάζουν τις φυσιολογικές του λειτουργίες, οι οποίες πολλές φορές είναι δύσκολο να προσδιοριστούν. Επιπλέον, τις περισσότερες φορές είναι δύσκολο να προσδιοριστούν οι πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφορετικών ξενοβιοτικών ουσιών και κατ επέκταση η βιοδιαθεσιμότητά τους και η ικανότητά τους να επάγουν τοξικές επιπτώσεις. Τέτοιου είδους μίγματα μπορεί να προκαλέσουν σοβαρές επιπτώσεις τόσο σε βιοχημικό όσο και σε κυτταρικό επίπεδο, να επιφέρουν θνησιμότητα στον οργανισμό, και να δημιουργήσουν διαταραχές ακόμα και σε επίπεδο πληθυσμού και οικοσυστήματος (Arslan et al., 2010). Λόγω της ανεπάρκειας εκτίμησης των βιολογικων επιπτώσεων, μέσω μόνο χημικών αναλύσεων, τα τελευταία χρόνια γίνονται πολλές προσπάθειες ταυτόχρονης μελέτης τόσο των χημικών παραμέτρων όσο και της τοξικότητας των μελετούμενων ουσιών, ιδιαίτερα στην περίπτωση μελέτης και σωστής διαχείρισης πολυσύνθετων μιγμάτων, όπως τα στραγγίσματα (Pandard et al., 2006; Wolska et al. 2007; Bortolotto et al., 2009). Συγκεκριμένα, οι οικοτοξικολογικές/τοξικολογικές μελέτες έχουν την ικανότητα να προσφέρουν άμεσα στοιχεία για την επίδραση των δειγμάτων στους διαφόρους οργανισμούς. Καθώς τα υδάτινα οικοσυστήματα σε πολλές περιπτώσεις καθίστανται αποδέκτες εν δυνάμει τοξικών ουσιών, καθώς και περίπλοκων μιγμάτων, όπως τα υγρά απόβλητα και τα στραγγίσματα, η μελέτη των επιπτώσεων των διαλυμάτων αυτών σε υδρόβιους οργανισμούς θεωρείται πλέον επιβεβλημένη (Council Directive 1999/31/EC; USEPA, 1998). Τα καρκινοειδή Thamnocephalus platyurus και Artemia franciscana, το τροχόζωο Brachionus plicatilis, ο μονοκύτταρος φυτοπλαγκτονικός οργανισμός Dunaliella tertiolecta, καθώς και το δίθυρο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis αποτελούν οργανισμούς που χρησιμοποιούνται ευρέως σε δοκιμές τοξικότητας (Bortolotto et al., 2009). Οι οργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση της οικολογικής επιβάρυνσης από ρυπογόνες ουσίες, όπως οι προαναφερθέντες, ονομάζονται οργανισμοί «Βιοενδείκτες» (Organisms-Bioindicators). Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 18

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Το είδος Thamnocephalus platyurus ως οργανισμός Βιοενδείκτης Το είδος Thamnocephalus platyurus (Πίνακας 2, Εικόνα 3) είναι καρκινοειδές του γλυκού νερού, με μεγάλη γεωγραφική εξάπλωση. Απαντάται συνήθως σε περιοδικά κατακλυζόμενα υδάτινα περιβάλλοντα με χαμηλό αριθμό θηρευτών και θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 15 έως 35 C. Είναι ανθεκτικό σε θερμοκρασίες μέχρι και 40 C (Hillyard and Vinegar, 1972), καθώς και σε ένα ευρύ φάσμα ph (Eng et al., 1990). Χρησιμοποιείται εδώ και πολλά χρόνια σε οικοτοξικολογικές μελέτες, λόγω της μεγάλης του ευαισθησίας έναντι των διαφόρων ρύπων (Nałecz-Jawecki and Persoone, 2006). Πίνακας 2. Επιστημονική ταξινόμηση του είδους Thamnocephalus platyurus. Επιστημονική Ταξινόμηση Επικράτεια Eykaryota Βασίλειο Animalia Φύλο Arthropoda Υπόφυλο Crustacea Κλάση Branchiopoda Τάξη Anostraca Οικογένεια Thamnocephalidae Γένος Thamnocephalus Είδος T. platyurus Διωνυμικό Όνομα Thamnocephalus platyurus Εικόνα 3. Τυπική μορφή ατόμου Thamnocephalus platyurus (Πηγή: Microbiotest Inc.). Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 19

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Το είδος Artemia franciscana ως οργανισμός Βιοενδείκτης Το γένος Artemia έχει παγκόσμια εξάπλωση. Τα είδη του γένους είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στις μεταβολές της αλατότητας, αλλά προτιμούν τις υψηλές αλατότητες, όπου δύσκολα επιβιώνουν οι θηρευτές τους (Triantaphyllidis et al., 1998). Το είδος Artemia franciscana (πρώην ονομασία: Artemia salina) (Πίνακας 3, Εικόνα 4) κατέχει σημαντική οικολογική θέση στην διατροφική αλυσίδα (χρησιμοποιείται ευρύτατα στις υδατοκαλλιέργειες), ενώ η χρησιμοποίηση του είδους σε οικοτοξικολογικε ς μελέτες αναφέρεται από το 1931 (Boone and Baas-Becking, 1931). Πίνακας 3. Επιστημονική ταξινόμηση του είδους Artemia franciscana. Επιστημονική Ταξινόμηση Επικράτεια Eykaryota Βασίλειο Animalia Φύλο Arthropoda Υπόφυλο Crustacea Κλάση Branchiopoda Τάξη Anostraca Οικογένεια Artemiidae Γένος Artemia Είδος A. franciscana Διωνυμικό Όνομα Artemia franciscana (Kellogg, 1906) Εικόνα 4. Τυπική μορφή ατόμου Artemia franciscana (Πηγή: MGEL).. Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 20

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Το είδος Brachionus plicatilis ως οργανισμός Βιοενδείκτης Το είδος Brachionus plicatilis (Πίνακας 4, Εικόνα 5) ανήκει στα τροχόζωα (rotifers) και λόγω της ανθεκτικότητάς του σε μεταβολές τις αλατότητας (Walker, 1981) απαντά συχνά σε υφάλμυρα οικοσυστήματα. Πρόκειται για είδη με παγκόσμια εξάπλωση, ενώ έχουν σημαντική εμπορική και οικολογική αξία, καθώς χρησιμοποιούντια εντατικά σε μονάδες υδατοκαλλιέργειας (Lubzens, 1987), καθώς και σε οικοτοξικολογικές μελέτες (Snell and Janssen, 1995; Ciros-Pérez et al., 2001). Πίνακας 4. Επιστημονική ταξινόμηση του είδους Brachionus plicatilis. Επιστημονική Ταξινόμηση Επικράτεια Eykaryota Βασίλειο Animalia Φύλο Rotifera Κλάση Monogononta Τάξη Ploimida Οικογένεια Brachionidae Γένος Brachionus Είδος Α. plicatilis Διωνυμικό Όνομα Brachionus plicatilis (Müller, 1786) Εικόνα 5. Τυπική μορφή ατόμου Brachionus plicatilis (Πηγή: J.B. Leonardsen) Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 21

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Το είδος Dunaliella tertiolecta και η χρήση του σε δοκιμασίες τοξικότητας Οι φυτοπλαγκτονικοί οργανισμοί χρησιμοποιούνται ευρέως σε μελέτες εκτίμησης του περιβαλλοντικού κινδύνου (Millington et al., 1988; Eguchi et al., 2004). Συγκεκριμένα, η συμμετοχή ενός πλαγκτονικού οργανισμού σε οικοτοξικολογικές μελέτες (δοκιμασίες τοξικότητας) διάρκειας 96 ωρών (δοκιμή οξείας τοξικότητας) αντιπροσωπεύει χρόνια έκθεση για τον πληθυσμό, καθώς στο χρόνο αυτό έχει ολοκληρωθεί ο βιολογικός κύκλος 5-6 γενεών. Παράλληλα, το κόστος της μελέτης είναι αρκετά μικρότερο, συγκρινόμενο με το κόστος συντήρησης και πραγματοποίησης άλλων υδρόβιων οργανισμών (π.χ. ψάρια), ενώ οι συνθήκες διατροφής και ανάπτυξής τους είναι αρκετά απλές στην πραγματοποίησή τους στο εργαστήριο. Τα είδη του γένους Dunaliella (φύλο Chlorophyta) (Teodoresco, 1905) είναι ίσως τα πιο ευρύαλα ευκαρυωτικά φωτοσυνθετικά κύτταρα (González et al, 2001), ενώ αποτελούν τους σημαντικότερους ίσως πρωτογενείς παραγωγούς σε περιβάλλοντα με υψηλή αλατότητα (Oren, 2005). Διαθέτουν δύο μηχανισμούς που τους επιτρέπουν να διαβιούν σε περιβάλλοντα με έντονες διακυμάνσεις αλατότητας (Fisher et al, 1994). Συγκεκριμένα, η απουσία κυτταρικού τοιχώματος επιτρέπει στο κύτταρο να ανταποκρίνεται στις μεταβολές της αλατότητας μέσω της συρρίκνωσης ή της διόγκωσής του, ενώ η ικανότητά τους να μεταβάλλουν τα επίπεδα της γλυκερόλης συντελεί στη ρύθμιση της ωσμωτικής ισορροπίας, παρέχοντας τη δυνατότητα στο κύτταρο να επανέρχεται στον αρχικό του όγκο (Sadka et al., 1989). Τα είδη του γένους Dunaliella είναι πολύ εύκολα καλλιεργήσιμα στο εργαστήριο, λόγω της ανθεκτικότητας και της γρήγορης ανάπτυξής τους. Συγκεκριμένα, το είδος Dunaliella tertiolecta (Πίνακας 5, Εικόνα 6) χρησιμοποιείται συχνά σε δοκιμές τοξικότητας (NIWA, 1998; Thomas et al., 2009) και έχει προταθεί ως οργανισμός βιοενδείκτης (APHA, 1998), καθώς πληρεί όλα τα κριτήρια (Reish and Lemay, 1988), όπως: 1. Αντιπροσωπεύει ένα ευρύ φάσμα ευαισθησίας 2. Είναι είδος με μεγάλη γεωγραφική εξάπλωση 3. Έχει σημαντική οικολογική σημασία 4. Βρίσκεται σε αφθονία 5. Είναι εύκολα καλλιεργήσιμο Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 22

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Πίνακας 5. Επιστημονική ταξινόμηση του μικροφύκους Dunaliella tertiolecta Επιστημονική Ταξινόμηση Επικράτεια Eykaryota Βασίλειο Plantae Υποβασίλειο Viridiplantae Φύλο Chlorophyta Κλάση Chlorophyceae Τάξη Volvocales/Chlamydomonadales Οικογένεια Dunaliellaceae Γένος Dunaliella Είδος D. tertiolecta Διωνυμικό Όνομα Dunaliella tertiolecta (Butcher, 1959) Α B Εικόνα 6. Καλλιέργεια Dunaliella tertiolecta (Α) και κύτταρο Dunaliella tertiolecta, όπου διακρίνονται τα μαστίγια, το ωοειδές σχήμα και τα χαρακτηριστικά σφαιρίδια γλυκερόλης (Β) (Πηγή: SCCAP, Scandinavian Culture Collection of Algae & Protozoa; Provasoli- Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton). Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 23

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 1.4 Δίθυρα μαλάκια-το είδος Mytilus galloprovincialis Το γένος Mytilus, το οποίο ανήκει στην ομοταξία των δίθυρων μαλακίων, θεωρείται πως εμφανίστηκε για πρώτη φορά πριν από 1-2 εκατομμύρια χρόνια (Seed, 1976) και περιλαμβάνει τα είδη M. galloprovincialis, M. edulis, M. trossulus και M. californianus (Gosling, 1992) (Πίνακας 6). To Mytilus galloprovincialis, ή αλλιώς μεσογειακό μύδι (Mediterranean Mussel), αποτελεί γηγενές είδος μυδιού της Μεσογείου και της Μαύρης Θάλασσας (Gosling, 1992; Chintiroglοu et al., 1999), το οποίο όμως πλέον έχει σχεδόν παγκόσμια εξάπλωση (Εικόνα 7). Πίνακας 6. Επιστημονική ταξινόμηση του είδους Mytilus galloprovincialis. Επιστημονική Ταξινόμηση Επικράτεια Eykaryota Βασίλειο Animalia Φύλο Mollusca Κλάση Bivalvia Τάξη Mytiloida Οικογένεια Mytilidae Γένος Mytilus Είδος M. galloprovinciallis Διωνυμικό Όνομα Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819) Εικόνα 7. Γεωγραφική εξάπλωσή του είδους M. galloprovincialis (πηγή: eol.org). Τα μύδια έχουν περιορισμένη ικανότητα μετακίνησης και ζουν προσκολλημένα στο υπόστρωμα βραχωδών ακτών (μέση και κατώτερη παλιρροιακή ζώνη), σχηματίζοντας Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 24

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ μεγάλους πληθυσμούς, που. Πρόκειται για ευρύαλους οργανισμούς, ανθεκτικούς στην επίδραση της παλίρροιας και του υψηλής ενέργειας κυματισμού. Είναι αμφιπλευροσυμμετρικοί οργανισμοί, των οποίων οι θυρίδες είναι πλευρικά συμπιεσμένες. Το όστρακο που τους περιβάλλει είναι μαύρο με λεπτομέρειες ανοιχτού υποκυανού, ενώ πάνω τους υπάρχουν παράλληλες εγκάρσιες γραμμές, οι οποίες υποδηλώνουν τη διαδοχική εποχική αύξηση του οστράκου (Εικόνα 8). Το μέγεθός του μυδιού ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία και την περιοχή διαβίωσης, και παρότι μπορεί να φτάσει μέχρι και τα 15 εκατοστά (cm), συνήθως στα ενήλικα άτομα δεν ξεπερνά τα 8 cm. Οι θυρίδες ενώνονται στο άνω μέρος μέσω ενός ελαστικού συνδέσμου που αποτελείται από κερατίνη και ανοιγοκλείνουν με τη βοήθεια δύο προσαγωγών μυών. Εικόνα 8. Τυπική μορφή του είδους M. galloprovincialis. Εσωτερικά του οστράκου βρίσκεται το μαλακό σώμα του μυδιού, το οποίο στερείται κεφαλής και αποτελείται από τη σπλαχνική μάζα και το πόδι. Η σπλαχνική μάζα αποτελείται από μια τρίχωρη καρδιά, δύο ζεύγη βραγχίων, τους γεννητικούς αδένες και το πεπτικό σύστημα (πεπτικός αδένας ή ηπατοπάγκρεας). Το πόδι συμβάλλει στην κίνηση του οργανισμού, ενώ παράλληλα περιλαμβάνει τον βυσσογόνο αδένα, ο οποίος εκκρίνει τα βυσσογόνα νημάτια με τη βοήθεια των οποίων το μύδι παραμένει προσκολλημένο στα βράχια (Γενική Ζωολογία, Όντριας). Είναι διηθηματοφάγοι οργανισμοί και προσλαμβάνουν την τροφή μέσω ενός προσαγωγού σιφωνίου (Bayne et al., 1986), ενώ στη συνέχεια μεταφέρουν την τροφή στον γαστρεντερικό σωλήνα με συνδυασμένες κινήσεις των βλεφαρίδων των βραγχίων και των χειλικών προσακτρίδων της μανδυακής κοιλότητας. Παράλληλα, εκτός από την πρόσληψη της τροφής, χρησιμοποιούν τα βράγχια τους για την ανταλλαγή των αερίων. Επιπλέον, Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 25

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ φέρουν πεπτικό αδένα, ο οποίος είναι υπεύθυνος για την απορρόφηση θρεπτικών μορίων που εισέρχονται με ενδοκύττωση στα πεπτικά κύτταρα, την απέκκριση των άχρηστων προϊόντων της ενδοκυτταρικής πέψης, την σύνθεση ενζύμων για την εξωκυτταρική πέψη και τη διαδικασία αποτοξικοποίησης διαφόρων ρύπων. Το γεγονός ότι διηθούν το νερό, τα καθιστά εκτεθειμένα σε ξενοβιοτικές ουσίες που βρίσκονται στο νερό, και οι οποίες εύκολα συσσωρεύονται στα βράγχια και τον πεπτικό αδένα τους. Τα μύδια διαθέτουν «ανοιχτό» κυκλοφορικό σύστημα, το οποίο αποτελείται από το πλάσμα της αιμολέμφου και τα έμμορφα συστατικά της, τα αιμοκύτταρα. Το πλάσμα αποτελεί σημαντική άμυνα του ανοσοποιητικού συστήματος των μαλακίων, καθώς φέρει βιομόρια, τα οποία έχουν την ικανότητα να εντοπίζουν τις ξενοβιοτικές ουσίες και τους παθογόνους μικροοργανισμούς και να ενεργοποιούν τους μηχανισμούς εξουδετέρωσής τους (Prieur et al., 1990; Renwrantz, 1990; Schneeweib and Renwrantz, 1993; Leclerc, 1996; Canesi et al., 2002). Έχουν περιγραφεί δύο μηχανισμοί άμυνας στα αιμοκύτταρα των δίθυρων μαλακίων κατά την εισαγωγή ξένων σωμάτων στον οργανισμό (Renwrantz, 1990; Carballal et al., 1997). Ο πρώτος μηχανισμός περιλαμβάνει την παραγωγή λυσοσωμικών ενζύμων και λυσινών (Cheng, 1981), και ο δεύτερος τη διαδικασία της αναπνευστικής έκρηξης, κατά την οποία λαμβάνει χώρα σημαντική παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου, όπως σουπεροξειδικά ανιόντα (. Ο - 2 ) και οξείδια του αζώτου (ΝΟ) (Nakamura et al., 1985; Pipe, 1992). Παράλληλα, τα αιμοκύτταρα έχουν την ικανότητα να συμβάλλουν στην επούλωση των πληγών, τον σχηματισμό και επισκευή του οστράκου, την πέψη και μεταφορά των θρεπτικών συστατικών, καθώς και την απέκκριση (Cheng, 1981; Chagot et al.,1987; Chu,1988; Sparks and Morado, 1988; Matozzo et al., 2001; Canesi et al., 2002; Beninger et al., 2003; Fisher, 2004; Mount et al., 2004) Το είδος Mytilus galloprovincialis και η χρήση του ως οργανισμός Βιοενδείκτης Τα είδη του γένους Mytilus χρησιμοποιείούνται ευρέως τόσο σε εργαστηριακό επίπεδο, όσο και στο πεδίο για την μελέτη των εν δυνάμει τοξικών επιπτώσεων διαφόρων ρύπων (Krishnakumar et al., 1994; Regoli and Orlando, 1994; Viarengo et al., 1997; De Lafontaine et al., 2000; Catsiki and Florou, 2006; Angelo et al., 2007; Cevik et al., 2008; Danellakis et al., 2011; Giannapas et al., 2012), λόγω μιας πλειάδας πλεονεκτημάτων και Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 26

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ιδιαίτερων χαρακτηριστικών, όπως περιληπτικά αναφέρονται παρακάτω (NRC, 1980; Philips, 1980; Widdows, 1985; Surenda et al., 2011): Τα μύδια διηθούν καθημερινά μεγάλες ποσότητες νερού για να καλύψουν τις διατροφικές τους ανάγκες. Μέσω της διήθησης λαμβάνει χώρα η πρόσληψη των ρυπογόνων ουσιών που βρίσκονται διαλυμένες στο νερό, και η αποθήκευση των ουσιών αυτών στους ιστούς τους. Τα μύδια, συγκριτικά με άλλους οργανισμούς, εμφανίζουν χαμηλό επίπεδο ενζυμικής δραστικότητας των συστημάτων που μπορούν να μεταβολίζουν ρύπους. Οι συγκεντρώσεις των ρύπων στους ιστούς απεικονίζουν τον βαθμό επιβάρυνσης των υδάτων, ενώ παράλληλα προσφέρουν χρήσιμες πληροφορίες για την βιολογική διαθεσιμότητα των ρυπογόνων ουσιών. Χαρακτηρίζονται από μεγάλη εξάπλωση. Ο σχηματισμός μεγάλων και σταθερών πληθυσμών παρέχει τη δυνατότητα επαναλαμβανόμενων δειγματοληψιών και μακροχρόνιας παρακολούθησης του υδάτινου περιβάλλοντος. Η περιορισμένη ικανότητα μετακίνησής τους καθόλη τη διάρκεια της ζωής τους τους καθιστά αντιπροσωπευτικούς οργανισμούς των φυσικοχημικών και των περιβαλλοντικών παραμέτρων της κάθε περιοχής. Χαρακτηρίζονται από μεγάλη ανοχή σε πολλά είδη ρύπων. Συλλέγονται εύκολα. Η συντήρησής τους σε εργαστηριακές συνθήκες είναι ευκολότερη και με χαμηλότερο κόστος, σε σχέση με την συντήρηση άλλων οργανισμών βιοενδεικτών, όπως τα ψάρια. Προσφέρουν ικανοποιητικές ποσότητες ιστών για ανάλυση. Υπάρχει η δυνατότητα μεταφοράς και διατήρησης πληθυσμών σε άλλες περιοχές, προκειμένου να πραγματοποιηθεί έλεγχος της θαλάσσιας ρύπανσης. Αποτελούν μέρος της ανθρώπινης διατροφής, και συνεπώς έκθεση των οργανισμών αυτών σε ρυπογόνες ουσίες θέτει σε κίνδυνο την ανθρώπινη υγεία. Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 27

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 1.5 Βιολογικοί παράμετροι και χρήση τους ως δείκτες καταπόνησης (stress) Είναι πλέον γνωστή η ανάγκη της χρήσης βιολογικών παραμέτρων σε μελέτες εκτίμησης των επιπτώσεων διαφόρων ρυπογόνων ουσιών, έτσι ώστε να διασφαλίζεται η ορθή διαχείρισή τους στα πλαίσια εκτίμησης του περιβαλλοντικού κινδύνου (Rank et al., 2007; Vidal-Liñán et al., 2010). Οι βιολογικές παράμετροι που χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση της κατάστασης των υδάτων και την εκτίμηση του περιβαλλοντικού κινδύνου ονομάζονται «δείκτες καταπόνησης/stress» (stress indices) ή «βιομάρτυρες» (biomarkers). Κάθε παρατήρηση και μέτρηση οποιασδήποτε μεταβολής/απόκρισης σε μοριακό, βιοχημικό και κυτταρικό επίπεδο, καθώς και οι μεταβολές σε επίπεδο φυσιολογίας και συμπεριφοράς ενός οργανισμού, ο οποίος έχει εκτεθεί ή εκτίθεται σε τουλάχιστον ένα ρυπογόνο παράγοντα, μπορεί να χαρακτηριστεί ως βιομάρτυρας (McCarthy and Shugart, 1990; Depledge, 1993). Οι βιομάρτυρες αποτελούν σημαντικό εργαλείο εκτίμησης του περιβαλλοντικού κινδύνου, καθώς μπορούν να προσφέρουν χρήσιμες πληροφορίες για το βαθμό επιβάρυνσης των υδάτινων οικοσυστημάτων, πριν την εμφάνιση μη αναστρέψιμων φαινομένων όπως η θνησιμότητα, και γι αυτό πλέον χρησιμοποιούνται εντατικά τόσο σε οικοτοξικολογικές μελέτες όσο και σε μελέτες βιοπαρακολούθησης της θαλάσσιας ρύπανσης (Dailianis et al. 2003; Bolognesi et al., 2006; Dailianis, 2011). Για να χρησιμοποιηθεί ένας βιολογικός παράγοντας ως βιομάρτυρας θα πρέπει να χαρακτηρίζεται από επαναληψιμότητα, ευαισθησία και εξειδίκευση, αναστρεψιμότητα, μεγάλο εύρος ειδών που εμφανίζεται, ευκολία και χαμηλό κόστος εφαρμογής (UNEP, 1999).Τα πλεονεκτήματα της χρήσης των βιομαρτύρων είναι τα εξής: μικρό κόστος και ευκολία στον προσδιορισμό τους έγκαιρη προειδοποίηση για τις υπο-θανατογόνες επιπτώσεις διάφορων ρυπογόνων ουσιών, καθώς και της ικανότητάς τους να προκαλούν προ-παθολογικές καταστάσεις, προτού εμφανιστούν φαινόμενα θνησιμότητας. απόκριση ακόμα και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις των περισσοτέρων ρύπων, των οποίων ο προσδιορισμός τους χημικά ενδεχομένως να μην ήταν δυνατόν να πραγματοποιηθεί. συνεισφορά στην καλύτερη κατανόηση της τοξικής δράσης μιγμάτων ουσιών. Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 28

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι βιομάρτυρες διακρίνονται σε βιοχημικούς, μοριακούς και κυτταρικούς, ενώ ανάλογα με την εξειδίκευσής τους διακρίνονται σε: Βιομάρτυρες γενικού stress, οι οποίοι συνιστούν αποκρίσεις σε μια ομάδα ρυπογόνων ουσιών, χωρίς να προσδιορίζεται ακριβώς η φύση των ουσιών αυτών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν βιομάρτυρες όπως η σταθερότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης και η συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων (Micronuclei frequency). Βιομάρτυρες ειδικού stress, των οποίων ο προσδιορισμός σχετίζεται με έκθεση των οργανισμών σε συγκεκριμένες ομάδες ρυπογόνων ουσιών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν βιομάρτυρες, όπως η συγκέντρωση των μεταλλοθειονινών (MTs) μετά από έκθεση του οργανισμού σε βαρέα μέταλλα, και η εκτίμηση της δραστικότητας της ακετυλχολινεστεράσης (AChE) μετά από έκθεση του οργανισμού σε οργανικούς ρύπους*. Η είσοδος μιας ξενοβιοτικής ουσίας στο εσωτερικό των κυττάρων μπορεί να επιφέρει μια σειρά δομικών, βιοχημικών και μοριακών διαταραχών, με επακόλουθη αποσταθεροποίηση της φυσιολογικής ομοιόστασης των οργανισμών (Dailianis et al., 2003). Οι διαταραχές μπορεί να σχετίζονται με την πρόκληση κυτταροτοξικών, οξειδωτικών, νευροτοξικών φαινομένων, καθώς και βλάβες που σχετίζονται με τη δομή και την αρτιότητα του γενετικού υλικού. Παρακάτω δίνονται συνοπτικά πληροφορίες για το είδος των διαταραχών που μπορεί να προκληθεί μετά από έκθεση των οργανισμών σε ρυπογόνες ουσίες. * Η κατηγοριοποίηση των βιαμαρτύρων σε ειδικού και γενικού stress βασίζεται στην ιεραρχική και κατά προτεραιότητα επαγωγή τους, μετά την επίδραση συγκεκριμένων ουσιών. Για παράδειγμα, παρά το γεγονός ότι οι ΜΤς επάγωνται παρουσία κυρίως βαρέων μετάλλων, ο ρόλος τους είναι σημαντικός και σε καταστάσεις οξειδωτικού stress, κατά τη διάρκεια των οποίων δρουν ως αντιοξειδωτικοί παράγοντες. Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 29

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Κυτταροτοξικές επιπτώσεις Διαταραχή μεμβρανικών δομών και κυτταρικών οργανιδίων (αποσταθεροποίηση λυσοσωμικής μεμβράνης) Τα λυσοσώματα είναι υποκυτταρικά οργανίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών που συμβάλλουν στην διεξαγωγή σημαντικών λειτουργιών για τον οργανισμό, όπως η πέψη, η άμυνα και η αναπαραγωγή των κυττάρων (Pipe, 1993). Συμμετέχουν στην αποικοδόμηση ενδογενών και εξωγενών μακρομορίων με τη βοήθεια υδρολυτικών ενζύμων (νουκλεάσες, φωσφατάσες και υπεροξειδάσες) (Klionsky and Emr, 2000), ενώ παράλληλα έχουν την ικανότητα να συμβάλλουν στην άμυνα του οργανισμού, μέσω της συμμετοχής τους στην κυτταρική πέψη υλικών που έχουν προσληφθεί από ενδοκύττωση και φαγοκύττωση, βοηθώντας έτσι τον οργανισμό να ανταπεξέλθει σε συνθήκες stress (Cuervo, 2004; Moore et al., 2006). Η επίδραση διαφόρων ρυπογόνων ουσιών στον οργανισμό μπορεί να προκαλέσει αποσταθεροποίηση της μεμβράνης των λυσοσωμάτων και την ενεργοποίηση λυσοσωμικών υδρολασών, οι οποίες λόγω της αποσταθεροποιημένης λυσοσωμικής μεμβράνης απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα προκαλώντας κυτταρική νέκρωση. Η σταθερότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης, ειδικά στους ιστούς του Mytilus galloprovincialis, χρησιμοποιείται ευρέως ως βιομάρτυρας για την εκτίμηση των εν δυνάμει τοξικών επιπτώσεων των ξενοβιοτικών ουσιών (Regoli, 1992; Krishnakumar et al., 1994; Domouhtsidou et al., 2004), καθώς το λυσοσωμικό δίκτυο είναι πολύ καλά ανεπτυγμένο τόσο στα κύτταρα του πεπτικού αδένα (digestive cells) όσο και στα αιμοκύτταρα του είδους αυτού, ενώ παράλληλα αποτελεί στόχο για πολλές εν δυνάμει ρυπογόνες ουσίες (Moore, 1985) Νευροτοξικές επιπτώσεις Ενζυμική δραστικότητα της ακετυλ-χολινεστεράσης (AChE) Η παρουσία ξενοβιοτικών ουσιών στα υδάτινα οικοσυστήματα έχει συσχετισθεί με την πρόκληση νευροτοξικών διαταραχών στους υδρόβιους οργανισμούς (Dailianis et al., 2003; Dailianis, 2011). Συγκεκριμένα, η μελέτη της δραστικότητας ενζύμων που σχετίζονται με τη νευροφυσιολογία των οργανισμών μπορεί να δώσει μια ικανοποιητική εικόνα των επιπτώσεων που μπορεί να επιφέρουν ρυπογόνες ουσίες. Για παράδειγμα, η Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 30

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ακετυλ-χολινεστεράση (AChE) αποτελεί μια ομάδα εστερασών που καταλύει την υδρόλυση του νευροδιαβιβαστή ακετυλχολίνη στις χολινεργικές συνάψεις, αναστέλλοντας την μεταβίβαση των νευρικών ώσεων μεταξύ προ-συναπτικής και μετα-συναπτικής μεμβράνης (Luo et al., 1999). Έχει αναφερθεί σε όλους τους οργανισμούς, ενώ συγκεκριμένα στο μύδι Mytilus galloprovincialis, η AChE αφθονεί στην αιμόλεμφο, στα βράγχια και στον πεπτικό αδένα (Dailianis et al., 2003). Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες φαίνεται πως η δραστικότητα της AChE αναστέλλεται σε άτομα που έχουν εκτεθεί σε οργανοφωσφορικά και οργανικά άλατα, σε παράγωγα πετρελαίου, σε εντομοκτόνα, καθώς και σε βαρέα μέταλλα (Jebali et al., 2006; Vioque-Fernandez et al., 2007; Bonacci et al., 2008). Η αναστολή της AChE προκαλεί σημαντικές νευροτοξικές επιπτώσεις, όπως αδυναμία κίνησης, τροφοληψίας και ανάπτυξης των οργανισμών, με αποτέλεσμα ακόμα και τον θάνατο των εκτιθέμενων ατόμων (περισσότερες πληροφορίες Fulton and Key, 2001). Κατά καιρούς έχουν πραγματοποιηθεί αρκετές μελέτες στους ιστούς των μυδιών έπειτα από έκθεση τους σε νευροτοξικές ουσίες, οι οποίες έδειξαν πως ο προσδιορισμός της δραστικότητας της AChE αποτελεί έναν αξιόλογο βιομάρτυρα για την εκτίμηση της περιβαλλοντικής ρύπανσης από τέτοιου είδους ουσίες (Galgani and Bocquene, 1990; Mora et al., 1999; Dailianis et al., 2003; Danellakis et al., 2011) Φαινόμενα οξειδωτικής καταπόνησης (oxidative stress) Κάθε άτομο ή μόριο που φέρει τουλάχιστον ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στην εξωτερική ηλεκτρονική στιβάδα ονομάζεται ελεύθερη ρίζα (Halliwell and Gutteridge, 1990). Οι ελεύθερες ρίζες είναι ιδιαίτερα δραστικές μορφές, καθώς τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια της εξωτερικής στιβάδας έχουν την τάση να συζευχθούν με άλλα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Μία κατηγορία των ελεύθερων ριζών, η οποία παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον είναι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (Free oxygen radicals) και συγκεκριμένα οι δραστικές μορφές του (Δραστικές μορφές οξυγόνου/reactive oxygen species, ROS). Πρόκειται για ενώσεις που παράγονται από το μοριακό οξυγόνο με αναγωγή ενός, δύο, ή τριών ηλεκτρονίων, καθώς και για ρίζες οξυγόνου ή οργανικών ενώσεων και υπεροξειδίων, οι οποίες παράγονται από ενώσεις που έχουν αντιδράσει με ρίζες οξυγόνου (Εικόνα 9) (Halliwell and Gutteridge, 1999; Gutteridge, 1995). Οι ROS περιλαμβάνουν ελεύθερες ρίζες, όπως η Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 31

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ρίζα υδροξυλίου ( ΟΗ), ιόντα, όπως τα OCl -, ONO 2 -, OH -, συνδυασμό ελεύθερων ριζών και ιόντων, όπως το σουπεροξειδικό ανιόν/ O 2 - και μόρια, όπως το Η 2 Ο 2. Εικόνα 9. Σχηματισμός ριζών οξυγόνου, μετά από αναγωγή με 1,2 3 και 4 ηλεκτρόνια. Η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS είναι φυσιολογική, καθώς σε μικρές συγκεντρώσεις συμβάλλουν στην ορθή λειτουργία του κυττάρου. Τα επίπεδα τους ρυθμίζονται μέσω κατάλληλων αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Όμως σε κάποιες περιπτώσεις, λόγω αδυναμίας των αντιοξειδωτικών μηχανισμών να τις εξουδετερώσουν, παρατηρείται ανεξέλεγκτη αύξησή των ROS στον οργανισμό. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται οξειδωτικό stress (Davies, 1995) και έχει συσχετιστεί με την επαγωγή σοβαρών βλαβών στον οργανισμό, όπως η λιπιδική υπεροξείδωση, η βλάβη στο γενετικό υλικό και η διαταραχή στη φυσιολογική λειτουργία των πρωτεϊνών. Έχει βρεθεί ότι πολλές κατηγορίες περιβαλλοντικών ρύπων μπορούν να προκαλέσουν ενδοκυτταρική παραγωγή ROS και να προκαλέσουν την επαγωγή φαινομένων οξειδωτικής καταπόνησης (Winston and Di Giulio, 1991) Προσδιορισμός επιπέδων σουπεροξειδικών ανιόντων ( O 2 ) Το σουπεροξειδικό ανιόν ( O 2 ) είναι μια δραστική μορφή οξυγόνου, η οποία παράγεται τόσο στο περιβάλλον της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων, κατά τη διαδικασία της αλυσιδωτής μεταφοράς ηλεκτρονίων, όσο και από τα φλαβοένζυμα (Lander, 1997; Dailianis et al., 2005). Μια σημαντική πηγή παραγωγής σουπεροξειδικού ανιόντος είναι τα φαγοκύτταρα, καθώς κατά την είσοδο στον οργανισμό παθογόνων μικροοργανισμών ή ξένων σωματιδίων, τα φαγοκύτταρα παράγουν ROS, μέσω την αναπνευστικής έκρηξης, Πανεπιστήμιο Πάτρας, Σχολή Θετικών Επιστημών 32