ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΥΡΙΑΚΗ 17 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Transcript

1 ΘΕΜΑ 1 1:γ, 2:γ, 3:α, 4:β, 5:δ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΥΡΙΑΚΗ 17 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 2 1. H μελέτη των χρωμοσωμάτων είναι δυνατή μόνο σε κύτταρα τα οποία διαιρούνται. Τα κύτταρα αυτά μπορεί να προέρχονται είτε από ιστούς που διαιρούνται φυσιολογικά είτε από κυτταροκαλλιέργειες, όπου γίνεται in vitro επαγωγή της διαίρεσης με ουσίες που έχουν μιτογόνο δράση. Τα χρωμοσώματα μελετώνται στο στάδιο της μετάφασης, όπου εμφανίζουν το μεγαλύτερο βαθμό συσπείρωσης και είναι ευδιάκριτα. Επειδή σε ένα πληθυσμό διαιρούμενων κυττάρων το ποσοστό αυτών που βρίσκονται στη μετάφαση είναι μικρό, χρησιμοποιούνται ουσίες οι οποίες σταματούν την κυτταρική διαίρεση στη φάση αυτή. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάζονται σε υποτονικό διάλυμα, ώστε να σπάσει η κυτταρική τους μεμβράνη, και τα χρωμοσώματά τους απλώνονται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Τέλος, χρωματίζονται με ειδικές χρωστικές ουσίες και παρατηρούνται στο μικροσκόπιο. Κάθε φυσιολογικό μεταφασικά χρωμόσωμα αποτελείται από δύο αδελφές χρωματίδες, οι οποίες συγκρατούνται στο κεντρομερίδιο. Το κεντρομερίδιο «διαιρεί» κάθε χρωματίδα σε δύο βραχίονες, ένα μεγάλο και ένα μικρό. Τα μεταφασικά χρωμοσώματα ενός κυττάρου διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος και ως προς τη θέση του κεντρομεριδίου. Τα χρωμοσώματα ταξινομούνται σε ζεύγη κατά ελαττούμενο μέγεθος. Η απεικόνιση αυτή αποτελεί τον καρυότυπο. 2. Ένας οργανισμός που χρησιμοποιείται ως πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη της κληρονομικότητας θα πρέπει να αναπτύσσεται πολύ εύκολα. Επίσης, είναι απαραίτητο ο οργανισμός αυτός να εμφανίζει ποικιλότητα σε κάποιους χαρακτήρες. Δεν μπορούμε, για παράδειγμα, να μελετήσουμε την κληρονομικότητα του χρώματος των μαλλιών σε έναν πληθυσμό στον οποίο όλα τα άτομα έχουν ξανθά μαλλιά. Τέλος, θα πρεπει να δίνει μεγάλο αριθμό απογόνων και να παρέχει τη δυνατότητα στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσμάτων. Το μοσχομπίζελο, που χρησιμοποίησε ο Μέντελ στα πειράματα του, είναι ιδανικό για τη μελέτη του τρόπου μεταβίβασης των κληρονομικών χαρακτήρων, δηλαδή των τύπων κληρονομικότητας καθώς διαθέτει τα παραπάνω πλεονεκτήματα. Το μοσχομπίζελο επίσης παρέχει τη δυνατότητα τεχνητής γονιμοποίησης, πέρα από την αυτογονιμοποίηση, η οποία συμβαίνει φυσιολογικά. Για τους παραπάνω λόγους, ο άνθρωπος δεν μπορεί να χαρακτηριστεί καλό πειραματικό μοντέλο. Οι άνθρωποι έχουν μικρό αριθμό απογόνων, ενώ η κάθε γενιά έχει μεγάλη διάρκεια, περίπου χρόνια. Επιπλέον στον άνθρωπο δεν είναι δυνατόν να γίνουν διασταυρώσεις ανάλογες με εκείνες που έκανε ο Mendel, χρησιμοποιώντας το μοσχομπίζελο. 3. Το βακτήριο Ε. coli παραγάγει τρία ένζυμα για να μεταβολίσει το δισακχαρίτη λακτόζη, όταν δεν υπάρχει γλυκόζη στην τροφή του. Tα γονίδια που κωδικοποιούν τα τρία αυτά ένζυμα βρίσκονται το ένα δίπλα στο άλλο πάνω στο γονιδίωμα του βακτηρίου και αποτελούν μια μονάδα, το οπερόνιο της λακτόζης. Σε αυτό περιλαμβάνονται εκτός από αυτά τα γονίδια, που ονομάζονται δομικά, και αλληλουχίες DNA που ρυθμίζουν τη μεταγραφή τους, ο υποκινητής και ο χειριστής. Το οπερόνιο της λακτόζης δε μεταγράφεται ούτε μεταφράζεται, όταν απουσιάζει από το θρεπτικό υλικό η λακτόζη. Τότε λέμε ότι τα γονίδια που το αποτελούν βρίσκονται υπό κατάστολή. Η καταστολή επιτυγχάνεται με δύο ρυθμιστικά μόρια: μια αλληλουχία DNA, που ονομάζεται χειριστής και βρίσκεται μεταξύ του υποκινητή και του πρώτου γονιδίου, και μια ρυθμιστική πρωτεΐνη-καταστολέας. Όταν απουσιάζει η λακτόζη ο καταστολέας προσδένεται ισχυρά

2 στο χειριστή και εμποδίζει την RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή των γονιδίων του οπερονίου. Ο καταστολέας κωδικοποιείται από ένα ρυθμιστικό γονίδιο, που βρίσκεται μπροστά από τον υποκινητή. Το ρυθμιστικό γονίδιο μεταγράφεται συνεχώς και παράγει λίγα μόρια του καταστολέα. Τα μόρια αυτά προσδένονται συνεχώς στο χειριστή. Όταν στο θρεπτικό υλικό υ- πάρχει μόνο λακτόζη, τότε ο ίδιος ο δισακχαρίτης προσδένεται στον καταστολέα και δεν του ε- πιτρέπει να προσδεθεί στο χειριστή. Τότε η RNA πολυμεράση είναι ελεύθερη να αρχίσει τη μεταγραφή. Δηλαδή η λακτόζη λειτουργεί ως επαγωγέας της μεταγραφής των γονιδίων του οπερονίου. Τότε τα γονίδια αρχίζουν να «εκφράζονται», δηλαδή να μεταγράφονται και να συνθέτουν τα ένζυμα. Τα τρία ένζυμα μεταφράζονται ταυτόχρονα από το ίδιο μόριο mrna το οποίο περιέχει κωδικόνιο έναρξης και λήξης για κάθε ένζυμο. Όταν η λακτόζη διασπαστεί πλήρως, τότε η πρωτεΐνη καταστολέας είναι ελεύθερη να προσδεθεί στο χειριστή και να καταστείλει τη λειτουργία των τριών γονιδίων. Επομένως, στον αρχικό πληθυσμό E.coli, το οπερόνιο της λακτόζης «εκφράζεται», με αποτέλεσμα να παράγονται τα τρία ένζυμα για να μεταβολίσει τη λακτόζη. Όταν η λακτόζη εξαντληθεί από το θρεπτικό υλικό και προστεθεί γλυκόζη, τα δομικά γονίδια που αποτελούν το οπερόνιο βρίσκονται υπό καταστολή, και επομένως παύουν να παράγονται τα τρία ένζυμα. 4. Γονιδιακή έκφραση στα ευκαρυωτικά κύτταρα ρυθμίζεται σε τέσσερα επίπεδα: α) στο επίπεδο της μεταγραφή β) στο επίπεδο μετά τη μεταγραφή γ) στο επίπεδο της μετάφρασης και δ) στο ε- πίπεδο μετά τη μετάφραση. Το mrna παίζει ρόλο στο δεύτερο και τρίτο επίπεδο. Στο επίπεδο μετά τη μεταγραφή περιλαμβάνονται οι μηχανισμοί με τους οποίους γίνεται η ωρίμανση του πρόδρομου mrna και καθορίζεται η ταχύτητα με την οποία το ώριμο mrna αφήνει τον πυρήνα και εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Στο επίπεδο της μετάφρασης, περιλαμβάνονται μηχανισμοί που σχετίζονται με το χρόνο που «ζουν» τα μόρια mrna στο κυτταρόπλασμα και την ι- κανότητα πρόσδεσης τους στα ριβοσώματα. Ο χρόνος που «ζουν» τα μόρια mrna στο κυτταρόπλασμα δεν είναι ο ίδιος για όλα τα είδη RNA, επειδή μετά από κάποιο χρονικό διάστημα α- ποικοδομούνται. 5. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν α- κόμη ολοκληρωθεί η μεταγραφή του. Αντίθετα, στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, το mrna που παράγεται κατά τη μεταγραφή ενός γονιδίου συνήθως δεν είναι έτοιμο να μεταφραστεί, αλλά υφίσταται μια πολύπλοκη διαδικασία ωρίμανσης. Έτσι, τα περισσότερα γονίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών (και των ιών που τους προσβάλλουν) χαρακτηρίζονται ως ασυνεχή ή διακεκομμένα. Δηλαδή, η αλληλουχία που μεταφράζεται σε αμινοξέα, τα εξώνια, διακόπτεται από ενδιάμεσες αλληλουχίες οι οποίες δε μεταφράζονται σε αμινοξέα, τα εσώνια. Το πρόδρομο mrna, που παράγεται αρχικά από τη μεταγραφή του γονιδίου, μετατρέπεται σε mrna με τη διαδικασία της ωρίμανσης, κατά την οποία τα εσώνια κόβονται από μικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά «σωματίδια» και απομακρύνονται. Έτσι σχηματίζεται το «ώριμο» mrna. Αυτό, παρ ότι αποτελείται αποκλειστικά από εξώνια, έχει δύο περιοχές που δε μεταφράζονται σε αμινοξέα. Η μία βρίσκεται στο 5 άκρο και η άλλη στο 3 άκρο. Οι αλληλουχίες αυτές ονομάζονται 5 και 3 αμετάφραστες περιοχές, αντίστοιχα. Η αλληλουχία των βάσεων του mrna καθορίζει την αλληλουχία των αμινοξέων στις πρωτεΐνες με βάση έναν κώδικα αντιστοίχισης νουκλεοτιδίων mrna με αμινοξέα πρωτεϊνών, ο οποίος ονομάζεται γενετικός κώδικας. Ο γενετικός κώδικας χαρακτηρίζεται ως εκφυλισμένος. Με εξαίρεση δύο αμινοξέα (μεθειονίνη και τρυπτοφάνη) τα υπόλοιπα 18 κωδικοποιούνται από δύο μέχρι και έξι διαφορετικά κωδικόνια. Τα κωδικόνια που κωδικοποιούν το ίδιο αμινοξύ ονομάζονται συνώνυμα. Ο γενετικός κώδικας επίσης, έχει κωδικόνιο έναρξης και κωδικόνια λήξης. Το κωδικόνιο έναρξης σε όλους τους οργανισμούς είναι το AUG και κωδικοποιεί το αμινοξύ μεθειονίνη. Υπάρχουν, όμως, τρία κωδικόνια λήξης (συνώνυμα), τα UAG, UGA και UAA που δεν κωδικοποιούν αμινοξέα. Όταν γίνει η πρωτεϊνοσύνθεση και παραχθεί η κατάλληλη πρωτεΐνη, μπορεί να πρέπει να υποστεί τροποποιήσεις, για να γίνει βιολογικά λειτουργική. Για παράδειγμα, δεν έχουν όλες οι πρωτεΐνες του οργανισμού ως πρώτο αμινοξύ μεθειονίνη. Αυτό συμβαίνει γιατί, σε πολλές πρωτεΐνες, μετά τη σύνθεσή τους απομακρύνονται ορι-

3 σμένα αμινοξέα από το αρχικό αμινικό άκρο τους. Επομένως, αν είναι γνωστή η αμινοξική αλληλουχία μιας βιολογικά λειτουργικής πρωτεΐνης, δεν μπορούμε να προσδιορίσουμε με ακρίβεια την αλληλουχία των βάσεων του γονιδίου που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεσή της γιατί δε θα γνωρίζαμε: α) τις αλληλουχίες των εσωνίων (περίπτωση ευκαρυωτικού γονιδίου) β) ποιο από τα συνώνυμα κωδικόνια κωδικοποιεί καθένα από τα αμινοξέα της πρωτεΐνης γ) ποιο είναι το κωδικόνιο λήξης δ) ποιες είναι οι αλληλουχίες των 5-3 αμετάφραστων περιοχών ε) πόσα και ποια αμινοξέα αφαιρέθηκαν από την αρχική πολυπεπτιδική αλυσίδα προκειμένου ηπρωτεΐνηνακαταστεί βιολογικά λειτουργική. ΘΕΜΑ 3 1. Το ζυγωτό των ανώτερων οργανισμών (όπως ο άνθρωπος) περιέχει μόνο τα μιτοχόνδρια που προέρχονται από το ωάριο. Επομένως, η προέλευση των μιτοχονδριακών γονιδίων είναι μητρική. Ο τύπος μυοπάθειας της άσκησης, που οφείλεται σε γονίδιο που εδράζει στο μιτοχονδριακό DNA, θα κληρονομηθεί μόνο από τη ασθενή μητέρα σε όλα της τα παιδιά. Στη συγκεκριμένη οικογένεια, ο άνδρας θα κληρονομήσει την ασθένεια από τη μητέρα του, αλλά δεν είναι ικανός να τη μεταφέρει στους απογόνους του. Αντίθετα, η σύζυγός του δεν κληρονόμησε την μυοπάθεια από τον πατέρα της και είναι υγιής. Επομένως όλα της τα παιδιά θα είναι κι αυτά υγιή. Το γενεαλογικό δένδρο της οικογένειας θα έχει τη μορφή: 2. α) Έστω ότι η ασθένεια οφείλεται σε αυτοσωμικό υπολειπόμενο γονίδιο. Συμβολίζουμε: Α = το αλληλόμορφο που είναι υπεύθυνο για το φυσιολογικό φαινότυπο (επικρατές) α = το αλληλόμορφο που είναι υπεύθυνο για την ασθένεια (υπολειπόμενο) Πιθανοί γονότυποι ΑΑ Αα αα Πιθανοί φαινότυποι Oι αυτοσωμικές υπολειπόμενες ασθένειες εκδηλώνονται μόνο στα ομόζυγα άτομα, τα οποία έχουν κληρονομήσει ένα παθολογικό αλληλόμορφο από κάθε γονέα. Συνήθως και οι δύο γονείς ενός ασθενούς είναι ετερόζυγοι, έχουν φυσιολογικό φαινότυπο και ονομάζονται φορείς, επειδή μπορούν να μεταβιβάσουν το υπολειπόμενο αλληλόμορφο στους απογόνους. Τα άτομα Ι2, Ι3, ΙΙ2 και ΙΙΙ1 πάσχουν επομένως θα έχουν γονότυπο αα. Καθένα από τα άτομα αυτά κληρονόμησε ένα α από κάθε γονέα του και με τη σειρά του θα κληροδοτήσει το υπολειπόμενο γονίδιο στους απογόνους του. Tα άτομα Ι1, ΙΙ1, ΙΙ3, ΙΙ4, ΙΙ5 ΙΙ6, ΙΙ7 έχουν γονότυπο Αα και θα είναι φυσιολογικά. Η Ι4 που έχει φυσιολογικό φαινότυπο μπορεί να έχει γονότυπο είτε ΑΑ είτε Αα. Επομένως η αρχική υπόθεση είναι πιθανή. β) Έστω ότι η ασθένεια οφείλεται σε αυτοσωμικό επικρατές γονίδιο Α= το αλληλόμορφο που είναι υπεύθυνο για την ασθένεια (επικρατές) α = το αλληλόμορφο που είναι υπεύθυνο για το φυσιολογικό φαινότυπο (υπολειπόμενο) Πιθανοί γονότυποι ΑΑ Αα Πιθανοί φαινότυποι

4 αα Ένας αυτοσωμικός επικρατής χαρακτήρας εκδηλώνεται, εκτός από το ομόζυγο άτομο και σε άτομο ετερόζυγο για το χαρακτήρα αυτό. Ο φυσιολογικός γονέας μεταβιβάζει μόνο το φυσιολογικό αλληλόμορφο α σε κάθε παιδί του. Τα άτομα Ι1, Ι4, ΙΙ1, ΙΙ3, ΙΙ4, ΙΙ5 ΙΙ6, ΙΙ7 δεν πάσχουν επομένως θα έχουν γονότυπο αα. Καθένα από τα άτομα αυτά κληρονόμησε ένα α από κάθε γονέα του και με τη σειρά του θα κληροδοτήσει το υπολειπόμενο αλληλόμορφο στους απογόνους του. Από τη διασταύρωση των ατόμων ΙΙ4 και ΙΙ5, που είναι υγιείς, προκύπτει το άτομο ΙΙ1 που πάσχει. Κάτι τέτοιο δε θα ήταν δυνατόν αν η ασθένεια κληρονομούνταν με επικρατή τύπο κληρονομικότητας, όπως φαίνεται από την παρακάτω διασταύρωση: ΙΙ5 ΙΙ4 Γονείς: αα X αα (υγιής) (υγιής) Γαμέτες: α α Απόγονοι: αα Φαινοτυπική αναλογία 100% υγιείς απόγονοι Επομένως, δεν μπορεί να ισχύει η υπόθεση ότι η ασθένεια οφείλεται σε αυτοσωμικό επικρατές γονίδιο. γ) Έστω ότι η ασθένεια οφείλεται σε φυλοσύνδετο υπολειπόμενο γονίδιο. Συμβολίζουμε: Χ Α = το αλληλόμορφο που είναι υπεύθυνο για το φυσιολογικό φαινότυπο (επικρατές) Χ α = το αλληλόμορφο που είναι υπεύθυνο για την ασθένεια (υπολειπόμενο) Πιθανοί γονότυποι Πιθανοί φαινότυποι Θηλυκά Χ Α Χ Α Χ Α Χ α Χ α Χ α Αρσενικά Χ Α Υ Χ α Υ Τα γονίδια που βρίσκονται στο Χ χρωμόσωμα και δεν έχουν αλληλόμορφα στο Υ ονομάζονται φυλοσύνδετα και ο τρόπος με τον οποίο κληρονομούνται αναφέρεται ως φυλοσύνδετη κληρονομικότητα. Η κληρονομικότητα των φυλοσύνδετων υπολειπόμενων γονιδίων ακολουθεί ένα εύκολα αναγνωρίσιμο πρότυπο. Ένα υπολειπόμενο φυλοσύνδετο γονίδιο εκφράζεται φαινοτυπικά σε όλα τα αρσενικά άτομα που φέρουν το γονίδιο αλλά μόνο σε εκείνα τα θηλυκά που είναι ομόζυγα για το υπολειπόμενο γονίδιο. Όλοι οι αρσενικοί απόγονοί μιας γυναίκας που πάσχει από φυλοσύνδετη κληρονομικότητα (Χ α Χ α ) θα πάρουν το Χ α από τη μητέρα τους και το Υ χρωμόσωμα από τον πατέρα τους και επομένως θα πάσχουν. Η γυναίκα Ι3 πάσχει (Χ α Χ α ) και παντρεύεται τον Ι4 που είναι φυσιολογικός (Χ Α Υ). Όμως, οι γιοι της, ΙΙ6 και ΙΙ7, δεν πάσχουν. Επομένως, η αρχική μας υπόθεση δεν μπορεί να ισχύει όπως επιβεβαιώνεται από την παρακάτω διασταύρωση: ΙΙ5 ΙΙ4 Γονείς: Χ α Χ α X Χ Α Υ (πάσχει) (υγιής) Γαμέτες: Χ α Χ Α, Υ Απόγονοι: Χ Α Χ α, Χ α Υ Φαινοτυπική αναλογία 1 ( φυσιολογικό-φορέας) : 1 ( που πάσχει)

5 ΘΕΜΑ 4 1. Κατά την έναρξη της μεταγραφής ενός γονιδίου η RNA πολυμεράση προσδένεται στον υποκινητή και προκαλεί τοπικό ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA. Στη συνέχεια, τοποθετεί τα ριβονουκλεοτίδια απέναντι από τα δεοξυριβονουκλεοτίδια μίας αλυσίδας του DNA σύμφωνα με τον κανόνα της συμπληρωματικότητας των βάσεων, όπως και στην αντιγραφή, με τη διαφορά ότι εδώ απέναντι από την αδενίνη τοποθετείται το ριβονουκλεοτίδιο που περιέχει ουρακίλη. Το μόριο RNA που συντίθεται κατά τη μεταγραφή είναι συμπληρωματικό προς τη μία αλυσίδα της διπλής έλικας του DNA του γονιδίου. Η αλυσίδα αυτή είναι η μεταγραφόμενη και ονομάζεται μη κωδική. Η συμπληρωματική αλυσίδα του DNA του γονιδίου ονομάζεται κωδική. Η μεταγραφή έχει προσανατολισμό 5 3. Τα περισσότερα γονίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών (και των ιών που τους προσβάλλουν) είναι ασυνεχή ή διακεκομμένα. Δηλαδή, η αλληλουχία που μεταφράζεται σε αμινοξέα, τα εξώνια, διακόπτεται από ενδιάμεσες αλληλουχίες οι οποίες δε μεταφράζονται σε αμινοξέα, τα εσώνια. Η αλληλουχία των βάσεων του mrna καθορίζει την αλληλουχία των αμινοξέων στις πρωτεΐνες με βάση έναν κώδικα αντιστοίχισης νουκλεοτιδίων mrna με αμινοξέα πρωτεϊνών, ο οποίος ονομάζεται γενετικός κώδικας. Σύμφωνα με το γενετικό κώδικα, μια τριάδα νουκλεοτιδίων, το κωδικόνιο, κωδικοποιεί ένα αμινοξύ. Ο όρος κωδικόνιο δεν αφορά μόνο το mrna αλλά και το γονίδιο από το οποίο παράγεται. Το τμήμα ενός γονιδίου, και του mrna του που κωδικοποιεί μια πολυπεπτιδική αλυσίδα, αρχίζει με το κωδικόνιο έναρξης και τελειώνει με το κωδικόνιο λήξης. Το κωδικόνιο έναρξης σε όλους τους οργανισμούς είναι το AUG και κωδικοποιεί το αμινοξύ μεθειονίνη. Υπάρχουν τρία κωδικόνια λήξης, τα UAG, UGA και UAA. Το κωδικόνιο λήξης δεν κωδικοποιεί αμινοξύ. Ο γενετικός κώδικας χαρακτηρίζεται επίσης ως συνεχής, δηλαδή το mrna διαβάζεται συνεχώς ανά τρία νουκλεοτίδια χωρίς να παραλείπεται κάποιο νουκλεοτίδιο και μη επικαλυπτόμενος, δηλαδή κάθε νουκλεοτίδιο ανήκει σε ένα μόνο κωδικόνιο. Κατά την μετάφραση, το ριβόσωμα κινείται από το 5 (όπου προσδένεται στην 5 αμετάφραστη περιοχή) προς το 3 άκρο του mrna και η παραγόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα συντίθεται από το αμινοτελικό προς το καρβοξυλικό άκρο της. Σύμφωνα με το μοντέλο των Watson και Crick, τo DNA αποτελείται από δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες που είναι α- ντιπαράλληλες, δηλαδή το 3 άκρο της μίας είναι απέναντι από το 5 άκρο της άλλης. Σύμφωνα με τα δεδομένα της άσκησης, το πεπτίδιο που θα παραχθεί από το γονίδιο κωδικοποιείται από την εξής αλληλουχία: 5-AUG-GGA-GUU-UUA-AUA-CCC-3 (mrna) ή 5 -ATG-GGA-GTT- TTA-ATA-CCC-3 (στην κωδική αλυσίδα του DNA). Αναζητώντας την αλληλουχία αυτή στο γονίδιο που μας δίνει διαπιστώνουμε ότι βρίσκεται στην πάνω αλυσίδα και διακόπτεται από αλληλουχία που δε μεταφράζεται. Επομένως, το γονίδιο είναι ασυνεχές και η πάνω αλυσίδα η κωδική. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η κατεύθυνση των αλυσίδων θα είναι: 5 TATCGAATTCCTATGGGAGAATTCCCTACTTTTAATACCCTAATTAGCAAGCG-3 3 -ATAGCTTAAGGATACCCTCTTAAGGGATGAAAATTATGGGATTAATCGTTCGC-5 2. Όταν ένα γονίδιο που περιέχει εσώνια μεταγράφεται, δημιουργείται το πρόδρομο mrna που περιέχει και εξώνια και εσώνια. Το πρόδρομο mrna μετατρέπεται σε mrna με τη διαδικασία της ωρίμανσης, κατά την οποία τα εσώνια κόβονται από μικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά «σωματίδια» και απομακρύνονται. Έτσι σχηματίζεται το «ώριμο» mrna. Αυτό, παρ ότι αποτελείται αποκλειστικά από εξώνια, έχει δύο περιοχές που δε μεταφράζονται σε αμινοξέα, τις 5 και 3 αμετάφραστες περιοχές. Το ώριμο mrna θα μεταφραστεί στα ριβοσώματα για την παραγωγή του πεπτιδίου: 5 -UAUCGAAUUCCUAUGGGAGUUUUAAUACCCUAAUUAGCAAGCG-3 (5 αμετάφραστη περιοχή) (κωδικοποιούσα περιοχή) (3 αμετάφραστη περιοχή) Κάθε μόριο trna έχει μια ειδική τριπλέτα νουκλεοτιδίων, το αντικωδικόνιο, με την οποία προσδένεται, λόγω συμπληρωματικότητας, με το αντίστοιχο κωδικόνιο του mrna. Επιπλέον, κάθε μόριο trna διαθέτει μια ειδική θέση σύνδεσης με ένα συγκεκριμένο αμινοξύ. Το πρώτο κωδικόνιο του mrna είναι πάντοτε AUG και σ αυτό προσδένεται το trna που φέρει το αμινο-

6 ξύ μεθειονίνη. Κατά την επιμήκυνση ένα δεύτερο μόριο trna με αντικωδικόνιο συμπληρωματικό του δεύτερου κωδικονίου του mrna τοποθετείται στην κατάλληλη εισδοχή του ριβοσώματος, μεταφέροντας το δεύτερο αμινοξύ. Μεταξύ της μεθειονίνης και του δεύτερου αμινοξέος σχηματίζεται πεπτιδικός δεσμός Έτσι αρχίζει η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στη συνέχεια το ριβόσωμα κινείται κατά μήκος του mrna κατά ένα κωδικόνιο. Η πολυπεπτιδική αλυσίδα συνεχίζει να αναπτύσσεται καθώς νέα trna μεταφέρουν αμινοξέα τα οποία συνδέονται μεταξύ τους. Η επιμήκυνση σταματά σε ένα κωδικόνιο λήξης (UGA, UAG ή UAA), ε- πειδή δεν υπάρχουν trna που να αντιστοιχούν σε αυτά. Επομένως, η αλληλουχία των αντικωδικονίων του trnas, με τη σειρά που θα συμμετάσχουν, θα είναι: 3 -UAC-5, 3 -CCU-5, 3 - CAA-5, 3 -AAU-5, 3 -UAU-5, 3 -GGG-5 3. Οι cdna βιβλιοθήκες περιέχουν αντίγραφα των mrna όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά και έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης μόνο των αλληλουχιών των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δηλαδή των εξωνίων. Για να κατασκευαστεί μία cdna βιβλιοθήκη, απομονώνεται το ολικό «ώριμο» mrna από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο. Η τεχνική που χρησιμοποιείται συνήθως για τον εντοπισμό του κλώνου που φέρει την αλληλουχία που θέλουμε να μελετήσουμε περιλαμβάνει τη χρήση ιχνηθετημένων ανιχνευτών μορίων DNA ή RNA που περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες προς το κλωνοποιημένο DNA. Οι ανιχνευτές αναμειγνύονται με το DNA της βιβλιοθήκης (το οποίο έχει αποδιαταχθεί) και υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό και αντιπαράλληλο τους DNA. Από τους παρακάτω ανιχνευτές, ο πρώτος δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικός, ο δεύτερος συνδέεται μεταξύ δεύτερου εξωνίου και 3 αμετάφραστης περιοχής και ο τρίτος μεταξύ πρώτου εξωνίου και πρώτου εσωνίου. Επειδή στις cdna βιβλιοθήκες δεν υπάρχουν οι αλληλουχίες των εσωνίων θα χρησιμοποιήσουμε το δεύτερο ανιχνευτή. 4. Όλα τα κύτταρα ενός πολυκύτταρου οργανισμού (όπως ο άνθρωπος) έχουν το ίδιο DNA. Σε κάθε ομάδα κυττάρων όμως εκφράζονται διαφορετικά γονίδια. Στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα, για παράδειγμα, εκφράζονται κυρίως τα γονίδια των αιμοσφαιρινών, ενώ στα Β-λεμφοκύτταρα τα γονίδια των αντισωμάτων. Τα γονίδια διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: Α) Στα γονίδια που μεταγράφονται σε mrna και μεταφράζονται στη συνέχεια σε πρωτεΐνες και Β) Στα γονίδια που μεταγράφονται και παράγουν trna, rrna, και snrna. Από το συνολικό γονιδίωμα, ένα μικρό ποσοστό μεταγράφεται, δηλαδή αποτελεί τα γονίδια. Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που κατασκευάστηκε με τις τεχνικές του ανασυνδυασμένου DNA και περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού δότη αποτελεί μία γονιδιωματική βιβλιοθήκη. Αντίθετα, οι cdna βιβλιοθήκες περιέχουν αντίγραφα των mrna όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά και έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης μόνο των αλληλουχιών των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δηλαδή των εξωνίων. Επομένως, οι αλληλουχίες του DNA ενός ευκαρυωτικού οργανισμού που υπάρχουν σε μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη και δεν υπάρχουν στη cdna βιβλιοθήκη που κατασκευάστηκε από κύτταρο του ίδιου οργανισμού είναι: α) Οι αλληλουχίες του DNA που δεν αποτελούν γονίδια β) τα γονίδια που κωδικοποιούν trna, rrna, snrna, γ) τα γονίδια που δεν εκφράζονται στα συγκεκριμένα κύτταρα (κυτταρική διαφοροποίηση) ή τη δεδομένη στιγμή (αναπτυξιακό στάδιο) γ) οι υποκινητές δ) οι αλληλουχίες λήξης της μεταγραφής, ε) τα εσώνια 5. Μία από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιείται ευρέως είναι η EcoRI που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli. Το ένζυμο αυτό όποτε συναντά την αλληλουχία: 5 -G Α Α Τ Τ C-3 3 -C Τ Τ A A G-5 στο γονιδίωμα, κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του Α (με κατεύθυνση 5 3 ) αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα. Τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με το ίδιο ένζυμο. Για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί η EcoRI προκειμένου να κλωνοποιήσουμε το παραπάνω γονίδιο θα πρέπει να υπάρχουν θέσεις αναγνώρισης του ενζύμου εκατέρωθεν του γονιδίου προκειμένου να δημιουργηθούν μονόκλωνα άκρα που θα ενωθούν

7 με τα μονόκλωνα άκρα ενός φορέα κλωνοποίησης που κόπηκε με το ίδιο ένζυμο. Επιπλέον, το ένζυμο δε θα πρέπει «κόβει» μέσα στο γονίδιο γιατί αυτό θα κατέστρεφε την αλληλουχία. Παρατηρώντας την αλληλουχία του γονιδίου διαπιστώνουμε ότι υπάρχουν δύο θέσεις αναγνώρισης του ενζύμου: μία στην αρχή του γονιδίου και μία μέσα στο εσώνιο. Επομένως, η EcoRI δε θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την κλωνοποίηση του συγκεκριμένου γονιδίου. ΡΑΣΟΥΛΗ ΟΛΓΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ SCIENCE PRESS