Kεφ. 3 Εξερευνώντας τις πρωτεΐνες και τα πρωτεώματα

Transcript

1 Kεφ. 3 Εξερευνώντας τις πρωτεΐνες και τα πρωτεώματα Το γάλα αποτελείται εν μέρει από μια ποικιλία πρωτεϊνών. Η μελέτη των πρωτεϊνών του γάλακτος στο σχήμα έγινε με την τεχνική φασματομετρίας μάζας MALDI TOF, που διαχωρίζει τα μόρια βάσει του λόγου της μάζας προς το φορτίο τους. 2 περιεκτηκοτητα

2 Εξερευνώντας τις πρωτεΐνες και τα πρωτεώματα 2 περιγραμμας

3 ΠΕΡΙΓΡΑΜΜΑ 3.1 Ο καθαρισμός των πρωτεϊνών είναι ένα ουσιαστικό πρώτο βήμα για την κατανόηση της λειτουργίας τους 3.2 Η ανοσολογία προσφέρει σημαντικές τεχνικές για τη διερεύνηση των πρωτεϊνών 3.3 Η φασματομετρία μάζας είναι μια τεχνική μεγάλης εμβέλειας για την ταυτοποίηση πεπτιδίων και πρωτεϊνών 3.4 Μπορούμε να συνθέτουμε πεπτίδια με αυτοματοποιημένες μεθόδους στερεάς φάσης 3.5 Η τριδιάστατη δομή μιας πρωτεΐνης μπορεί να καθοριστεί με κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) 2 καθασισμος

4 3.1 Ο καθαρισμός των πρωτεϊνών είναι ένα ουσιαστικό πρώτο βήμα για την κατανόηση της λειτουργίας τους Πώς αναγνωρίζουμε την πρωτεΐνη που ψάχνουμε; Για τα ένζυμα (πρωτεϊνικοί καταλύτες) μετράται η ενζυμική δραστικότητα, δηλ. η ικανότητα του ενζύμου να καταλύει μια συγκεκριμένη χημική αντίδραση. Πχ Η δραστικότητα συνήθως μετριέται έμμεσα. Ας πάρουμε για παράδειγμα το ένζυμο γαλακτική αφυδρογονάση που το οποίο καταλύει την παραπάνω αντίδραση. 2 NADH

5 Το ανηγμένο νικοτιναμιδο αδενινο δινουκλεοτίδιο NADH, απορροφά φως στα 340 nm, σε αντίθεση με το οξειδωμένο (NAD+). Ο προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας κατά την απομόνωση της γαλακτικής αφυδρογονάσης γίνεται με τη μέτρηση της αύξησης της απορρόφησης στα 340 nm ανά μονάδα χρόνου μετά την προσθήκη του ενζύμου. Γνωρίζοντας την ενζυμική δραστικότητα και τη συγκέντρωση της συνολικής πρωτεΐνης, μπορούμε να υπολογίσουμε την ειδική δραστικότητα, που είναι ο λόγος της ενζυμικής δραστικότητας προς την ποσότητα της πρωτεΐνης στο μείγμα. 2 διαρρηξη

6 Υπέρηχοι Μπορούμε να διασπάσουμε κύτταρα εφαρμόζοντας σε εναιώρημα αυτών υπερήχους (20 50 ΚΗz) μέσω κατάλληλης συσκευής. Οι υπέρηχοι δημιουργούν σπηλαιώσεις μέσα στο εναιώρημα των κυττάρων επιβάλλοντας κύματα πίεσης στα κύτταρα που τελικά σπάζουν και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους. Μειονεκτήματα: Θερμότητα που παράγεται από τους υπέρηχους μπορεί να αποδιατάξει τις πρωτεΐνες Μεγάλα επίπεδα θορύβου Κυμαινόμενη απόδοση Μέθοδοι διάρρηξης κυττάρων Μηχανικές μέθοδοι 2 ομογενοποιηση

7 Μέθοδοι διάρρηξης κυττάρων Μηχανικός ομογενοποιητής Οι μηχανικοί ομογενοποιητές χρησιμοποιούν έμβολα από τεφλόν ή έμβολα με λεπίδες που περιστρέφονται με μεγάλη ταχύτητα μέσα σε κατάλληλου σχήματος σωλήνα στον οποίο έχει τοποθετηθεί ο ιστός. Η απόσταση μεταξύ του εμβόλου και του τοιχώματος του σωλήνα είναι τέτοια ώστε τα κύτταρα που εγκλωβίζονται μεταξύ τους να διασπούνται από τις διατμητικές δυνάμεις που ασκούνται σε αυτά. Συνήθως χρησιμοποιούνται σε μαλακούς ιστούς αλλά ο χειρισμός μεγάλων όγκων είναι δύσκολος. 2 ενζυμικα

8 Μέθοδοι διάρρηξης κυττάρων Ενζυμικές μέθοδοι Οι ενζυμικές μέθοδοι βασίζονται στην χρήση ενζύμων που ενεργούν κυρίως στο κυτταρικό τοίχωμα των κυττάρων με στόχο να το αποδομήσουν για να δημιουργήσουν πρωτοπλάστες Τέτοια ένζυμα είναι: lysozyme, lysostaphin, zymolase, cellulase, mutanolysin, glycanases, proteases, mannase Τα ένζυμα αυτά είναι εμπορικά διαθέσιμα και λειτουργούν προσθέτοντάς τα σε εναιώρημα των κυττάρων σε συγκεκριμένη συγκέντρωση. 2 διαφ. φυγοκεντρηση

9 Για να καθαρίσουμε μια πρωτεΐνη πρέπει να την απομονώσουμε από το κύτταρο!!! Διαφορική φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα διαλύονται σε ομογενοποιητή και το μείγμα που προκύπτει (ομογενοποίημα) υπόκειται σταδιακά σε συνεχώς αυξανόμενη φυγόκεντρο δύναμη. Όσο πυκνότερο είναι το υλικό τόσο μικρότερη φυγόκεντρος δύναμη απαιτείται για την καταβύθισή του ως ίζημα. Διαχωρίζοντας τα κλάσματα της φυγοκέντρησης μπορούμε να συνεχίσουμε τον καθαρισμό των μορίων με άλλες μεθόδους. 2 εξαλατωση

10 Οι πρωτεΐνες είναι δυνατόν να καθαριστούν βάσει της διαλυτότητας, του μεγέθους, του φορτίου και της δεσμευτικής συγγένειας τους για άλλα μόρια Οι περισσότερες πρωτεΐνες παρουσιάζουν μικρότερη διαλυτότητα σε υψηλή συγκέντρωση άλατος. Η μέθοδος ονομάζεται ΕΞΑΛΑΤΩΣΗ Η συγκέντρωση του άλατος πχ θειικού αμμωνίου που απαιτείται για να εξαλατωθεί μια πρωτεΐνη διαφέρει από τη μια στην άλλη. Επομένως, η εξαλάτωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος κλασμάτωσης των πρωτεϊνών. Η εξαλάτωση είναι επίσης χρήσιμη ως μέθοδος αύξησης της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε αραιά διαλύματα, πχ εκείνων που προέρχονται από άλλα στάδια καθαρισμού. 2 διαπηδηση

11 Διαπίδυση. Οι πρωτεΐνες είναι δυνατόν να διαχωριστούν από μικρότερα μόρια ή ιόντα Τα μόρια που έχουν διαστάσεις σημαντικά μεγαλύτερες από τη διάμετρο των πόρων μιας ημιπερατής μεμβράνης (ΠΧ μια μεμβράνη κυτταρίνης διατηρούνται μέσα στη σακούλα διαπίδυσης. Τα μικρότερα μόρια και τα ιόντα περνούν από τους πόρους της μεμβράνης σύμφωνα με τη βαθμίδωση συγκέντρωσης και εμφανίζονται στο διάλυμα. Η μέθοδος της διαπίδυσης απομακρύνει το άλας από ένα διάλυμα. 2 χρωματογραφια

12 Χρωματογραφία: Βασικές αρχές Ο όρος χρωματογραφία καθιερώθηκε από τον Mikhail Semyonovich Tsvet ο οποίος χρησιμοποίησε σωλήνες γεμάτους με ανθρακικό ασβέστιο για να διαχωρίσει μείγμα χλωροφυλλών στα συστατικά τους 2 αρχες

13 Βασικές αρχές Η βασική αρχή της χρωματογραφίας βασίζεται στο γεγονός ότι τα μόρια που βρίσκονται διαλυμένα μέσα σε ένα διαλύτη (κινητή φάση) όταν βρεθούν μέσα σε ένα ακίνητο υλικό (στατική φάση ή προσροφητής) και εφαρμοστεί μια συνεχής ροή του διαλύτη τότε τα μόρια μεταναστεύουν (κινούνται) με διαφορετικές ταχύτητες ανάλογα με τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες Η κινητή φάση μπορεί να είναι οποιοδήποτε υδατικό διάλυμα ή άλλος διαλύτης Η στατική φάση μπορεί να αποτελείται από διάφορα υλικά όπως ανόργανα άλατα, οξείδια, χαρτί ή πιο εξειδικευμένα υλικά που χρησιμοποιούνται στη βιοχημική ανάλυση 2 στηλη

14 Εφαρμογές της χρωματογραφίας στο διαχωρισμό των βιομορίων Υγρή χρωματογραφία στήλης. Ο προσροφητής, που πακετάρεται μέσα σε ειδική υάλινη στήλη, αποτελείται από μικροσκοπικά σφαιρίδια πολυμερών υλικών (κυτταρίνη, αγαρόζη, σεφαρόζη) που φέρουν ειδικές χημικές ομάδες. Ανάλογα με αυτες τις ομάδες διαχωρίζονται πρωτείνες με βάση το φορτίο, το μέγεθος, την υδροφοβικότητα ή ακόμα και την χημική συγγένεια δέσμευσης τους. Από το παραπάνω προκύπτουν οι διάφοροι τύποι χρωματογραφικής ανάλυσης. 2 διαταξη

15 Εφαρμογές της χρωματογραφίας στο διαχωρισμό των βιομορίων 2 χρ. διηθησης

16 Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή. Διαχωρισμός βάσει του μεγέθους Πορώδεις κόκκοι από αδιάλυτο πολυμερές π.χ. δεξτράνη, αγαρόζη με τυπική διάμετρο 100 μm (0,1 mm). Tα μεγάλα μόρια περνούν πιο εύκολα μέσα από τη στήλη. Τα μόρια μέσου μεγέθους περνούν περιστασιακά μέσα από τους κόκκους, ενώ τα μικρά θα εκλουστούν τελευταία διότι ακολουθούν μια δαιδαλώδη διαδρομή μέσα από τους κόκκους. 2 ιοντοανταλλαγη

17 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Διαχωρισμός βάσει του φορτίου Aν το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης σε ph 7 είναι θετικό, αυτή συνήθως θα δεσμευθεί σε στήλη από κόκκους που περιέχουν καρβοξυλικά ιόντα, ενώ μια αρνητικά φορτισμένη πρωτεΐνη δεν θα δεσμευθεί. Για να απομονωθεί μια πρωτεΐνη σε υψηλή καθαρότητα απαιτούνται περισσότερα διαδοχικά βήματα χρωματογραφίας πχ αρχικά Χρωματογραφία διήθησης και στη συνέχεια Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής 2 συγγενεια

18 Χρωματογραφία συγγένειας. Διαχωρισμός βάσει χημικής συγγένειας (1) ομοιοπολική δέσμευση του G σε στήλη (2) προσθήκη του μείγματος πρωτεϊνών στη στήλη Απομόνωση πρωτεϊνης που αναγνωρίζει την ομάδα G (3) έκλουση της επιθυμητής πρωτεΐνης με προσθήκη υψηλής συγκέντρωσης διαλυτής μορφής του G Η χρωματογραφία συγγένειας είναι αποτελεσματική όταν οι αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης και του μορίου δόλωμα είναι εξειδικευμένες και ισχυρές. 2 HPLC

19 Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης. (high pressure liquid chromatography, HPLC) Βελτιωμένη εκδοχή των μεθόδων χρωματογραφίας στήλης Πολύ λεπτό υλικό, περισσότερες θέσεις αλληλεπίδρασης, μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα. Εφαρμόζεται πίεση για να επιτευχθεί ικανοποιητική ροή. Υψηλή διαχωριστική ικανότητα αλλά και γρήγορος διαχωρισμός. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύονται από την απορρόφηση τους στα 220 nm 2 ηλεκτροφορηση

20 Οι πρωτεΐνες είναι δυνατόν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS πολυακρυλαμιδίου. Το ρεύμα, περνώντας μέσα από την πηκτή, αναγκάζει το Σύμπλοκο πρωτεΐνης SDS (sodium dodecyl sulfate) που έχει αρνητικό φορτίο να μετακινηθεί προς την άνοδο που (στο κάτω μέρος της συσκευής). Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται μέσω της πορώδους πηκτής πολυακρυλαμιδίου σύμφωνα με το μέγεθός τους, με τις μικρότερες να μετακινούνται ταχύτερα προς την άνοδο. 2 SDS

21 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS πολυακρυλαμιδίου SDS: Ανιοντικό απορρυπαντικό που καταστρέφει σχεδόν όλες τις μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις μιας φυσικής πρωτεΐνης Τα ανιόντα του SDS δεσμεύονται στις πρωτεΐνες σε αναλογία 1 μόριο SDS / 2 αμινοξέα (συνολικό φορτίο αρνητικό το αρχικό φορτίο είναι αμελητέο πλέον) Η Μερκαπτοαιθανόλη ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσμούς. 2 ΜΒ

22 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΒΑΡΟΥΣ 2 ανοσολογια

23 3.2 Η ανοσολογία προσφέρει σημαντικές τεχνικές δυνατότητες Αντίσωμα = ανοσοσφαιρίνη = immunoglobulin = Ig Αντιγόνο (πρωτεΐνη/πολυσακχαρίτης/νουκλεϊκό οξύ) Αντιγονικός προσδιοριστής = επίτοπος 2 κανοσολογια

24 3.2 Η ανοσολογία προσφέρει σημαντικές τεχνικές δυνατότητες Ένα αντίσωμα (ανοσοσφαιρίνη) είναι μια πρωτεΐνη που συντίθεται από τα σπονδυλωτά ως απόκριση στην παρουσία μιας ξένης ουσίας που λέγεται αντιγόνο. Tα αντισώματα έχουν μεγάλη και ειδική συγγένεια για τα αντιγόνα που προκάλεσαν τη σύνθεσή τους. Η θαυμαστή εξειδίκευση των αντισωμάτων για τις πρωτεΐνεςστόχους τους μας παρέχουν τα μέσα για να σημάνουμε μια πρωτεΐνη ώστε να απομονωθεί, να ποσοτικοποιηθεί ή να εμφανιστεί στην κυτταρική της θέση. 2 γουεστερν

25 Η ανοσοαποτύπωση επιτρέπει την ανίχνευση πρωτεϊνών που έχουν διαχωριστεί με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή 2 τοπολογια

26 Φθορίζοντες δείκτες επιτρέπουν την παρατήρηση συγκεκριμένων πρωτεϊνών μέσα στα κύτταρα Τα κύτταρα είναι δυνατόν να χρωματιστούν με αντισώματα που φθορίζουν και να αναλυθούν με μικροσκοπία φθορισμού για να αποκαλύψουν τη θέση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει. Στη φωτομικρογραφία φθορισμού του κυττάρου, εμφανίζονται τα νημάτια της ακτίνης πράσινα λόγω χρώσης με ένα αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη. 2 φασμ. μαζας

27 3.3 Η φασματομετρία μάζας είναι μια τεχνική μεγάλης εμβέλειας για την ταυτοποίηση πεπτιδίων και πρωτεϊνών Επιτρέπει με μεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία την μέτρηση της ατομικής σύστασης ενός συγκεκριμένου μορίου, ή μιας αναλυόμενης πρωτείνης. 2 φασμ. μαζας

28 Το πρωτεϊνικό δείγμα ιοντίζεται με δέσμη ακτίνων λέιζερ. Ένα ηλεκτρικό πεδίο επιταχύνει τα ιόντα προς τον ανιχνευτή. Τα ελαφρύτερα ιόντα φθάνουν πρώτα. Ο παλμός ιοντισμού ενεργοποιεί συγχρόνως την μέτρηση του χρόνου πτήσης των ιόντων. 2 μαζα/φορτιο

29 Στη διαδικασία του ιοντισμού, μια οικογένεια ιόντων, το κάθε ένα με την ίδια μάζα αλλά διαφορετικό φορτίο, προκύπτει από την ίδια προς ανάλυση ουσία. Επειδή ο φασματογράφος μάζας ανιχνεύει ιόντα βάσει του λόγου μάζας προς φορτίο, τα ιόντα αυτά θα εμφανιστούν ως διαφορετικές κορυφές στο φάσμα μάζας. 2 αλληλουχιση

30 Η αλληλουχία αμινοξέων σε πεπτίδια μπορεί να προσδιοριστεί με φασματομετρία μάζας Μέσα στον φασματομετρητή μάζας, τα εισαγόμενα πεπτίδια μπορούν να θραυσματοποιηθούν με βομβαρδισμό με αδρανή αέρια ώστε να προκύψει μια οικογένεια προϊόντων ιόντων από τα οποία έχουν απομακρυνθεί μεμονωμένα αμινοξέα από το ένα άκρο. Σε αυτό το παράδειγμα, ιοντίζεται το καρβοξυλικό άκρο του διασπασμένου πεπτιδικού δεσμού. 2 αλληλουχιση

31 Τα προϊόντα ιόντα αναλύονται από έναν δεύτερο αναλυτή μάζας. Οι διαφορές μάζας μεταξύ των κορυφών καταδεικνύουν την αλληλουχία των αμινοξέων στο πρόδρομο ιόν. 2 γονιδιωμα/πρωτεασωμα

32 Οι μεθοδολογίες μελέτης του γονιδιώματος και του πρωτεώματος είναι συμπληρωματικές Πολλές πρωτεΐνες υπόκεινται σε μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις. Μπορεί να έχουν αφαιρεθεί μερικά αμινοξέα απο τα άκρα τους ή άλλες προκύπτουν από τη διάσπαση μεγαλύτερων αρχικών πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Κυστεΐνες μπορεί να οξειδώνονται και να δημιουργούν δισουλφιδικούς δεσμούς, που συνδέουν διαφορετικές πολυποπτιδικές περιοχές. Συγκεκριμένες πλευρικές αλυσίδες μερικών πρωτεϊνών επιδέχονται τροποποίηση (φωσφορυλίωση, ακετυλίωση κλπ). Οι αλληλουχίες αμινοξέων που προβλέπονται από αλληλουχίες DNA περιέχουν πληροφορίες αλλά δεν περιλαμβάνουν τέτοιες μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις. 2 πρωτεν. αλληλουχία

33 Η αλληλουχία αμινοξέων είναι πολύτιμη πηγή πληροφοριών 1. Η αλληλουχία μιας πρωτεΐνης συγκρινόμενη με τις αλληλουχίες όλων των γνωστών πρωτεϊνών ελέγχει αν υπάρχουν σημαντικές ομοιότητες. 2. Η σύγκριση της αλληλουχίας της ίδιας πρωτεΐνης από διάφορα είδη οργανισμών παρέχει πλήθος πληροφοριών σχετικά με τις εξελικτικές πορείες. 3. Η αλληλουχία των αμινοξέων μπορεί να ελεγχθεί για την παρουσία εσωτερικών επαναλήψεων. 4. Πολλές πρωτεΐνες περιέχουν αλληλουχίες αμινοξέων που λειτουργούν ως σήματα τα οποία δηλώνουν την τύχη ή ρυθμίζουν την επεξεργασία των πρωτεϊνών. 5. Η γνώση της αλληλουχίας παρέχει τη βάση για την παρασκευή αντισωμάτων ειδικών για την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει 6. Οι αλληλουχίες αμινοξέων είναι χρήσιμες για τη δημιουργία ανιχνευτών DNA εξειδικευμένων για τα γονίδια που κωδικεύουν τις αντίστοιχες πρωτεΐνες. 2 συνθεση

34 3.4 Μπορούμε να συνθέτουμε πεπτίδια με αυτοματοποιημένες μεθόδους στερεάς φάσης. Αυτά τα πεπτίδια είναι πολύτιμα εργαλεία για πολλούς σκοπούς. 1. Τα συνθετικά πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιγόνα 2. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να απομονωθούν υποδοχείς πολλών ορμονών και άλλων σηματοδοτικών μορίων (στήλες χρωματογραφίας συγγένειας) 3. Μπορούν να λειτουργήσουν ως φάρμακα. 4. Η μελέτη των συνθετικών πεπτιδίων μπορεί να βοηθήσει στον καθορισμό των κανόνων που διέπουν την τριδιάστατη δομή των πρωτεϊνών. 2 3Δ

35 3.5 Η τριδιάστατη δομή μιας πρωτεΐνης μπορεί να καθοριστεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) Μια πηγή ακτίνων Χ παράγει την αντίστοιχη δέσμη, που περιθλάται από έναν κρύσταλλο. Το προκύπτον σχήμα περίθλασης συλλέγεται από ανιχνευτή. Περιθλασίγραμμα ακτίνων Χ. Πρωτεϊνικός κρύσταλλος σκεδάζει ακτίνες Χ δημιουργώντας ένα σχήμα από σημεία στην επιφάνεια του ανιχνευτή. Η λευκή περιοχή στο κέντρο οφείλεται σε ένα εμπόδιο που προστατεύει τον ανιχνευτή από τις ισχυρές μη σκεδασμένες ακτίνες Χ. 2 NMR

36 Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) μπορεί να αποκαλύψει τις δομές των πρωτεϊνών σε διάλυμα Χάρτες ηλεκτρονιακής πυκνότητας καταλοίπου τυροσίνης σε τέσσερα διαφορετικά επίπεδα διακριτικής ικανότητας (1,0 A, 2,0 A, 2,7 A και 3,0 A). Στα χαμηλότερα επίπεδα διακριτικής ικανότητας (2,7 A και 3,0 A) διακρίνεται μόνο μια ομάδα ατόμων που αντιστοιχεί στην πλευρική αλυσίδα, ενώ στην ύψιστη διακριτική ικανότητα (1,0 A) διακρίνονται μεμονωμένα άτομα μέσα στην πλευρική αλυσίδα. 2