To πρωτέωμα είναι η λειτουργική απεικόνιση του γονιδιώματος. Βιοχημεία Ι Γ-1

Transcript

1 To πρωτέωμα είναι η λειτουργική απεικόνιση του γονιδιώματος Βιοχημεία Ι Γ-1

2 καθαρισμός των πρωτεϊνών είναι το απαραίτητο πρώτο ήμα για να χαρακτηρίσουμε τη λειτουργικότητα μιας ρωτεΐνης σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις Never waste pure thoughts on an impure protein! απομόνωση σε καθαρή μορφή γίνεται με ήπιες συνθήκες ιαχωρισμού και σε χαμηλές θερμοκρασίες, γιατί οι πρωτεΐνες είναι υαίσθητα μόρια Βιοχημεία Ι Γ-2

3 Βιολογική δοκιμασία Πώς αναγνωρίζουμε την πρωτεΐνη που μελετάμε; Συχνά, όχι πάντα με μια βιολογική δοκιμασία: Μια πειραματική διαδικασία που ταυτοποιεί μια πρωτεΐνη Προϊόν με χαρακτηριστικό χρώμα Βιοχημεία Ι Γ-3

4 Για να καθαριστεί μια πρωτεΐνη πρέπει πρώτα να απομακρυνθεί από το κυτταρικό περιβάλλον 1. Λύση των κυττάρων-αδρό εκχύλισμα 2. Διαφορική φυγοκέντρηση- Υποκυτταρικά κλάσματα και οργανίδια 3. Κλασματοποίηση των πρωτεϊνών με βάση διαφορές στο μέγεθος, το φορτίο, τη διαλυτότητα κλπ Βιοχημεία Ι Γ-4

5 Ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από μικρά μόρια ή από άλατα γίνεται με διαπίδυση-βασίζεται στο μέγεθος των μορίων πρωτεΐνης που δεν μπορούν να περάσουν από τους πόρους ημιπερατής μεμβράνης Βιοχημεία Ι Γ-5

6 Κύρια παρασκευαστική μέθοδος καθαρισμού και απομόνωσης πρωτεϊνών είναι η Χρωματογραφία στήλης Ο διαχωρισμός ενός μείγματος πρωτεϊνών στα συστατικά του επιτυγχάνεται συχνά με χρωματογραφία ενός ή περισσοτέρων ειδών σε ένα ή περισσότερα βήματα. Η χρωματογραφία βασίζεται στις διαφορετικές φυσικές και χημικές ιδιότητες των υπό διαχωρισμό βιομορίων και στη διαφορική τους κατανομή μεταξύ δυο διαφορετικών φάσεων. Στατική φάση: Πορώδες στερεό υλικό συγκρατείται σε μια στήλη, διαμέσου της οποίας διακινείται η κινητή φάση, δηλ. ένα πρωτεϊνικό διάλυμα. Οι διάφορες πρωτεΐνες μετακινούνται με διαφορετική ταχύτητα στη στήλη, ανάλογα με τις ιδιότητές τους. Βιοχημεία Ι Γ-6

7 Κοινά είδη χρωματογραφίας Είδος Διήθησης σε πηκτή Βάση διαχωρισμού Μέγεθος Ανταλλαγής ιόντων Φορτίο σε ph διαχωρισμού Συγγένειας Δέσμευση πρωτείνης σε άλλο μόριο Βιοχημεία Ι Γ-7

8 Διαχωρισμός βάσει διαφορετικού μεγέθους: Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή Τα μεγάλα μόρια περνούν γρηγορότερα μέσα από τη στήλη, επειδή δεν κατακρατούνται από τους κόκκους και εμφανίζονται πρώτα, τα μικρότερα τελευταία Βιοχημεία Ι Γ-8

9 Διαχωρισμός βάσει διαφορετικού φορτίου: Χρωματογραφία ιοντανταλλαγής Οι πρωτεΐνες δεσμεύονται σε κόκκους της στήλης που φέρουν φορτίο αντίθετο με το δικό τους εκλούονται με αυξανόμενες συγκεντρώσεις άλατος ή αλλαγή ph Βιοχημεία Ι Γ-9

10 Υλικά στήλης Για πρωτεΐνες θετικά φορτισμένες στο ph διαχωρισμού Για πρωτεΐνες αρνητικά φορτισμένες στο ph διαχωρισμού Βιοχημεία Ι Γ-10

11 Διαχωρισμός βάσει επιλεκτικής συγγένειας για χημική ομάδα: Χρωματογραφία συγγένειας Τα κοκκία της στήλης είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένα με ομάδα που δεσμεύει με υψηλή συγγένεια η υπό απομόνωση πρωτεΐνη Η πρωτεΐνη αυτή δεσμεύεται στις ομάδες αυτές και ακινητοποιείται στη στήλη, ενώ οι υπόλοιπες πρωτεΐνες περνούν μέσα από τη στήλη τελικά εκλούεται με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της ελεύθερης χημικής ένωσης που δεσμεύει η πρωτεΐνη ή με μεταβολή των συνθηκών πρόσδεσης Βιοχημεία Ι Γ-11

12 Πώς αποφασίζουμε αν μια πρωτεΐνη έχει καθαριστεί:ελεγχος καθαρότητας και χαρακτηρισμός πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση πηκτής (αναλυτική μέθοδος) Προσοχή:Η ηλεκτροφόρηση δεν χρησιμοποιείται συνήθως για την απομόνωση πρωτεϊνών, αλλά για την επισήμανση και τον έλεγχο της καθαρότητάς τους. Φορτισμένα μόρια κινούνται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου μέσα σε πηκτή. Η πηκτή δρα σαν μοριακός ηθμός που ενισχύει το διαχωρισμό μόρια με μικρό λόγο μάζας/φορτίου μετακινούνται ταχύτερα, μεγάλα δυσκολότερα. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα, μ, εξαρτάται από τη μάζα, το φορτίο, το σχήμα του κινούμενου μορίου και από την πυκνότητα της πηκτής Βιοχημεία Ι Γ-12

13 Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή δρα σαν μοριακός ηθμός δεν είναι όμως χρωματογραφία! Βιοχημεία Ι Γ-13

14 Πηκτή πολυακρυλαμιδίου Monomer Cross-linker Βιοχημεία Ι Γ-14

15 Οι πρωτεΐνες εμφανίζονται στην πηκτή με χρώση μετά την ηλεκτροφόρηση Βιοχημεία Ι Γ-15

16 Ένταση χρώματος Ηλεκτροφόρηση υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες διαχωρίζει πρωτεΐνες που διαφέρουν σε συνολικό φορτίο και χρησιμοποιείται εκτεταμένα στο κλινικό εργαστήριο Στην ηλεκτροφόρηση βασίζεται ο διαχωρισμός πρωτεϊνών του πλάσματος (λευκωματίνεςα 1 -, α 2 -, β-,γ- σφαιρίνες) Φυσιολογικό Χρονια φλεγμονη Αμέσως μετά από οξεια φλεγμονή Κιρρωση του ηπατος Απώλεια πρωτεϊνών Βιοχημεία Ι Γ-16

17 Στην ηλεκτροφόρηση βασίζεται η ανίχνευση μη φυσιολογικών μορφών πρωτεϊνών Διάγνωση δρεπανοκυτταρικής αναιμίας (μετάλλαξης Glu σε Val) με ηλεκτροφόρηση υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες HbA HbS Ομόζυγος Ετερόζυγος Ομόζυγος HbA/HbA HbA/HbS HbS/HbS Βιοχημεία Ι Γ-17

18 Η SDS-PAGE σε συνθήκες αποδιάταξης διαχωρίζει πρωτεΐνες ανάλογα με τη μάζα τους και είναι η συνηθέστερη ηλεκτροφορητική μέθοδος 1. Το SDS αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες 2. Το SDS προσδένεται στις πρωτεΐνες σε αναλογία περίπου 1 μόριο SDS/2 αμινοξέα και τους προσδίδει υψηλό αρνητικό φορτίο περίπου ανάλογο με τη μάζα τους 3. DTT ή β-μερκαπτοαιθανόλη ανάγουν τους δισουλφιδικούς δεσμούς Αποτέλεσμα: H ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται σχεδόν αποκλειστικά από τη μάζα της αποδιαταγμένης πρωτεΐνηςελαχιστοποιείται η επίδραση του σχήματος και του εγγενούς φορτίου της πρωτεΐνης Βιοχημεία Ι Γ-18

19 SDS-PAGE Βιοχημεία Ι Γ-19

20 Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα της πλειοψηφίας των πρωτεΐνών (όχι όλων!) σε SDS-PAGE είναι ανάλογη της μάζας logm Βιοχημεία Ι Γ-20

21 Χρήση δεικτών μοριακών μαζών για την εκτίμηση του ΜΒ Βιοχημεία Ι Γ-21

22 Αλλά η Φασματομετρία Μαζών είναι η ΜΟΝΗ διαθέσιμη τεχνική με την οποία μπορεί να προσδιορισθεί με απόλυτη ακρίβεια (<1Da) τo MB πρωτεϊνών Η φασματοσκοπία μαζών βασίζεται στη μέτρηση του λόγου μάζας/φορτίο ενός ιονισμένου μορίου απομονωμένου ή σε μείγμα. Ο ιονισμός της πρωτεΐνης επιτυγχάνεται με διάφορες μεθόδους που δεν καταστρέφουν την πρωτεΐνη. Βιοχημεία Ι Γ-22

23

24 Πρωτόκολλα καθαρισμού και απομόνωσης πρωτεϊνών: Διαδοχή τεχνικών που αποσκοπούν στον καθαρισμό Βιοχημεία Ι Γ-24

25 Η ειδική ενεργότητα είναι μέτρο της καθαρότητας ενός ενζύμου Βιοχημεία Ι Γ-25

26 Μοριακό ιόν

27 Η αμινοξική αλληλουχία των πρωτεϊνών είναι πηγή πολύτιμων πληροφοριών Μπορεί να υποδείξει: Σήματα στόχευσης ή ρύθμισης Σχεδιασμό αντισωμάτων Σχεδιασμό ολιγονουκλεοτιδίων Πρωτεϊνική οικογένεια-εξελικτική πορεία Κατασκευή «προτύπων» ασθενειών σε πειραματόζωα Βιοχημεία Ι Γ-27

28 Προσδιορισμός αμινοξικής αλληλουχίας πρωτεϊνών και πεπτιδίων 1. Διαχωρισμός πολυπεπτιδικών αλυσίδων (για πρωτεΐνες με τεταρτοταγή δομή) 2. Διάσπαση δισουλφιδικών δεσμών (αν υπάρχουν) 3. Ειδική σχάση πολυπεπτιδικών αλυσίδων σε μικρότερα πεπτίδια 4. Καθαρισμός των πεπτιδικών θραυσμάτων με χρωματογραφία 5. Προσδιορισμός αμινοξικής αλληλουχίας του κάθε πεπτιδίου-θραυσματος 6. Επανάληψη βημάτων #3, #4 and #5, με σχάση σε διαφορετική θέση ώστε να παραχθούν επικαλυπτόμενα θραύσματα 7. Προσδιορισμός αλληλουχίας με συνδυασμό των αποτελεσμάτων από τα επικαλυπτόμενα θραύσματα Βιοχημεία Ι Γ-28

29 Διάσπαση του πολυπεπτιδικού κορμού γίνεται με διάφορα ένζυμα Eνζυματική σχάση, κυρίως με: Θρυψίνη, χυμοθρυψίνη, κλωστριπαΐνη, σταφυλοκοκκική πρωτεάση Χημική διάσπαση, κυρίως με: Βρωμιούχο κυάνιο Βιοχημεία Ι Γ-29

30 Θέσεις αποκοπής Θρυψίνη διάσπαση στην καρβοξυτελική πλευρά Lys, Arg Χυμοθρυψίνη - διάσπαση στην καρβοξυτελική πλευρά κυρίως Phe, Tyr, Trp, Leu, Met Κλωστριπαΐνη διάσπαση στην καρβοξυτελική πλευρά Arg Σταφυλοκοκκική πρωτεάση - διάσπαση στην καρβοξυτελική πλευρά Glu, Asp σε διάλυμα φωσφορικών Καρβοξυπεπτιδάση A διάσπαση στην αμινοτελική πλευρά όλων των αμινοξέων εκτός από Pro, Arg, Lys CNBr διάσπαση στην καρβοξυτελική πλευρά Met Βιοχημεία Ι Γ-30

31 Θρυψινόλυση Βιοχημεία Ι Γ-31

32 Ο προσδιορισμός αμινοξικής σύστασης και αλληλουχίας του κάθε πεπτιδίου-θραυσματος γίνεται 1. Με αποικοδόμηση κατά Edman ή... Βιοχημεία Ι Γ-32

33 2....με φασματομετρία μαζών (Μass Spectrometry, MS) Βιοχημεία Ι Γ-33

34 Οι αλληλουχίες των αλληλεπικαλυπτόμενων πεπτιδίωνθραυσμάτων σε συνδυασμό δίνουν την αλληλουχία της πρωτεΐνης Βιοχημεία Ι Γ-34

35 Η γονιδιωματική και η πρωτεωμική ανάλυση συνιστούν συμπληρωματικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας πρωτεϊνών Η αλληλούχιση μεγάλων πρωτεϊνών (>1000aa) γίνεται σε νουκλεοτιδικό επίπεδο και επιτυγχάνεται με την τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA. Μειονέκτημα: ΔΕΝ εντοπίζονται οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών Βιοχημεία Ι Γ-35

36 Γνωση της αλληλουχιας επιτρεπει το σχεδιασμο εξειδικευμενων αντισωματων που είναι πολύτιμα διαγνωστικά-ερευνητικά εργαλεία α αντισώματα προσδένονται σφιχτά και εξειδικευμένα στα αντιγόνα Βιοχημεία Ι Γ-36

37 Τα αντισώματα με μεγάλη εξειδίκευση μπορούν να χρησιμοποιηθούν: σε πολλές διαγνωστικές εφαρμογές για τη μελέτη της σχέσης δομής/λειτουργίας σαν ακριβή αναλυτικά και παρασκευαστικά εργαλεία Βιοχημεία Ι Γ-37

38 Η ανοσοαποτύπωση κατά Western επιτρέπει την ανίχνευση πρωτεϊνών που έχουν διαχωρισθεί με ηλεκτροφόρηση πηκτής μεσω ειδικών αντισωματων Κυρια μέθοδος για τη διάγνωση ηπατίτιδας C μεσω της ανιχνευσης πρωτεϊνης του ιού Βιοχημεία Ι Γ-38

39 Βιοχημεία Ι Γ-39

40 Η μέθοδος Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση αντιγόνων (π.χ. HIV test) Διάγνωση έρπητα (HCV) με ELISA Βιοχημεία Ι Γ-40