Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος Πρωτεϊνικές Τεχνικές Διδάσκουσα: Καθ. Μαρία - Ελένη Ε. Λέκκα

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3

4 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΟΥΣ ΡΟΛΟ Ένζυμα Δομικές πρωτεΐνες (κολλαγόνο, ελαστίνη) Πρωτεΐνες μεταφοράς (αλβουμίνη, αιμοσφαιρίνη, τρανσφερίνη) Κινητήριες πρωτεΐνες (κινησίνη, δυνεΐνη) Αποθηκευτικές πρωτεΐνες (φερριτίνη, οβαλβουμίνη, καζεΐνη) Σηματοδοτικές πρωτεΐνες (ινσουλίνη, αυξητικοί παράγοντες) Υποδοχείς (ροδοψίνη, β-αδρενεργικοί υποδοχείς κλπ) Πρωτεΐνες ρύθμισης γονιδίων (καταστολέας λακτόζης, γενετικοί διακόπτες) Πολύ εξειδικευμένες πρωτεΐνες (αντιψυκτικές πρωτεΐνες, φθορίζουσα πρωτεΐνη των μεδουσών, συγκολλητικές πρωτεΐνες κλπ) ΠΡΩΤΕΩΜΑ λειτουργική απεικόνιση του γονιδιώματος

5 ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ Αναφέρεται στη μεγάλης κλίμακας μελέτη της δομής και δράσης των πρωτεϊνών ενός συστήματος. Ο όρος πρωτεομική καθιερώθηκε το 1997, κατ αναλογία της γενομικής ή γονιδιοματικής, που είναι η συστηματική και σε ευρεία κλίμακα μελέτη των γονιδίων. Ο όρος πρωτέομα "proteome" είναι ανάμιξη του "protein" και "genome και αποτελεί τη λειτουργική απεικόνιση του γονιδιώματος. Ο όρος καθιερώθηκε το 1994 από τον Μ. Wilkins. Το πρωτέομα είναι ένα σύνολο πρωτεϊνών που εμπεριέχεται σε ένα ολόκληρο οργανισμό ή βιολογικό σύστημα, συμπεριλαμβανομένων και των μεταμεταφραστικών τροποποιήσεών τους.

6 Μ. Λέκκα 2012 ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΨΗΛΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟΤΗΤΑΣ High Throughput Analysis Αναφέρεται στη χρήση υψηλής κλίμακας αυτοματοποιημένων συστημάτων ανάλυσης, που επιτρέπουν την ταχεία συλλογή και επεξεργασία πολλαπλών δεδομένων, με υψηλή πιστότητα και ποιότητα. Συνδυάζει κλασικές τεχνικές κυτταρικής βιολογίας, βιοχημείας, οπτικής, χημείας καθώς και απεικονιστικών μεθόδων για να απαντηθούν βιολογικά ερωτήματα σχετικά με τη λειτουργία των κυττάρων, ερωτήματα που δε μπορούν να απαντηθούν με συμβατικές μεθόδους. Αυτού του είδους η έρευνα ονομάζεται και "Omics research"

7 Μέθοδοι 1. Απομόνωσης 2. Ποσοτικού προσδιορισμού 3. Kαθαρισμού -Διαχωρισμού 4. Χαρακτηρισμού / Ταυτοποίησης 5. Ελέγχου λειτουργικότητας Τεχνικές 1. Διαφορικές φυγοκεντρήσεις 2. Απορρόφηση στα 280 nm, Lowry, Bradford, BCA κλπ 3. Εξαρτώμενες από διαλυτότητα, μέγεθος, φορτίο, δεσμευτικής συγγένειας με άλλα μόρια 4. Αποδόμηση Εdman, ανοσοαποτύπωση, ΝΜR, Κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ, MS,

8 Εντοπισμός πρωτεΐνης Από την αύξηση απορρόφησης στα 340nm λόγω απορρόφησης NADH Ομογενοποίηση κυττάρων & ιστών

9 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

10 ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

11 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΟΡΓΑΝΙΔΙΩΝ: ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ΣΕ ΖΩΝΕΣ ΜΕ ΒΑΘΜΙΔΩΣΗ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ

12 ΥΠΕΡΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ

13 S (Svedberg): συντελεστής καταβύθισης

14 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ- ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΟΥ Kαταβύθιση, πχ με Να 2 SO 4 Εξαλάτωση (desalting) Υπερδιήθηση (ultrafiltration): Συνδυασμός διήθησης, φυγοκέντρησης Διαπίδυση (dialysis)

15 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕ ΤΟ ΜΕΓΕΘΟΣ Χρωματογραφία μοριακής διήθησης, μοριακού αποκλεισμού

16 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΙΟΝΤΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ (EXCHANGE CHROMATOGRAPHY) Διαχωρισμός των πρωτεϊνών ανάλογα με το καθαρό τους φορτίο Η έκλουση γίνεται με αύξηση της συγκέντρωσης NaCl στο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης ΠΛΗΡΩΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΙΟΝΤΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ

17 ΧΡΩΜAΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ (ΑFFINITY CHROMATOGRAPHY)

18 Απορρόφηση, 220 nm ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ / ΑΠΟΔΟΣΗΣ

19 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ

20 Δωδεκυλο-θειικό νάτριο (SDS)

21

22 ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ (pi) Το ph στο οποίο το συνολικό φορτίο της πρωτεΐνης είναι μηδέν Στο ph αυτό η πρωτεΐνη δε μετακινείται με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟΣ ΕΣΤΙΑΣΜΟΣ Ο διαχωρισμός πρωτεϊνης ανάλογα με το ισοηλεκτρικό της σημείο O διαχωρισμός γίνεται σε πήκτωμα βαθμίδωσης ph, χωρίς SDS Η βαθμίδωση ph πετυχαίνεται με ηλεκτροφόρηση των πολυαμφολυτών που έχουν διαφορετικές τιμές pi Διαχωρίζονται ακόμα και πρωτεΐνες με διαφορά pι κατά 0.1

23 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΔΙΠΛΗΣ ΔΙΑΣΤΑΣΗΣ Συνδυασμός ισοηλεκτρικού εστιασμού με ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμιδίου-sds

24 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

25

26 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

27 Matrix-Assisted Laser desorption-ionization (MALDI-TOF) Electrospray spectrometry

28

29 ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΚΑΤA EDMAN

30 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

31 ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

32 ΔΟΜΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ IgG

33 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

34 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

35 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

36 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

37

38 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

39 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

40 ΑΝΟΣΟΚΥΤΤΑΡΟΧΗΜIKH ΒΑΦΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ CONTROL STRETCH

41 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

42 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

43 ΕΥΡΕΣΗ ΤΡΙΔΙΑΣΤΑΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ ΝΜR

44 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

45 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

46 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ Θραύσμα πρωτεΐνης 55 αμινοξέων

47 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

48 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

49 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

50 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

51 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΩΣΗ ΜΥΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ

52 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

53 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

54 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

55 Τέλος Ενότητας

56 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

57 Σημειώματα

58 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

59 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκουσα: Καθ. Μαρία - Ελένη Ε. Λέκκα. «Βιολογικές Μεμβράνες και Μεταγωγή Σήματος. Πρωτεϊνικές Τεχνικές». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

60 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]