QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

Transcript

1 QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite β 2 GPI IgG αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων β 2 GPI IgG σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων έναντι της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη διάγνωση ορισμένων αυτοάνοσων νοσημάτων με θρομβωτικές διαταραχές όπως σε άτομα με δευτεροπαθή νοσήματα του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ) ή με νοσήματα παρεμφερή με ΣΕΛ και θρομβωτικές διαταραχές. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα έχουν συσχετιστεί άμεσα με τη φλεβική και αρτηριακή θρόμβωση. 1-5 Τα ευρήματα αυτά παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά σε μελέτες του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ), μια νόσος όπου πολλά συμπτώματα της συμπεριλαμβάνουν θρομβώσεις. 6,7 Πρόσφατες μελέτες 8-12 έχουν δείξει ότι ένας συμπαράγοντας (cofactor) 50kD απαιτείται για τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα, τα οποία παράγονται στους ασθενείς με ΣΕΛ, για να συνδεθούν στη καρδιολιπίνη. Αυτός ο συμπαράγοντας έχει οριστεί ως β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι αλλά είναι επίσης γνωστός και ως απολιποπρωτεΐνη Η. 8,12,13,14 Ενώ η β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι θεωρείται in vitro αναστολέας της ενδογενούς οδούς του μηχανισμού πήξης, 15 της ADPεξαρτώμενης συγκόλησης των αιμοπεταλίων, 16 και της δραστικότητας της προθρομβινάσης από ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, 17 ο φυσιολογικό της ρόλος δεν είναι ακόμα απόλυτα διευκρινισμένος. Είναι πλέον γνωστό ότι τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα από ασθενείς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο αναγνωρίζουν μια τροποποιημένη δομή της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι και όχι την καρδιολιπίνη, την φυσιολογική (native) β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι ή κάποιον επίτοπο που να είναι δομικά κοινός στην καρδιολιπίνη και στην β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι Ο Galli et al 9 και ο Viard et al 18 ανεξάρτητα μεταξύ τους ήταν οι πρώτοι που ανέφεραν ότι τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα που προέρχονται από ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα κατευθύνονται έναντι του μορίου της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι. O Koike 11 and Matsuura 12 έδειξαν πέρα από κάθε αμφιβολία ότι το μόριο της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι είναι το αντιγόνο έναντι του οποίου παράγονται και συνδέονται τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα και επιπλέον έδειξαν ότι τα φωσφολιπίδια χρησιμεύουν κυρίως ως σύνδεσμος της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι στη στερεά φάση. Είναι γνωστό ότι οι κλασικές δοκιμασίες αντισωμάτων έναντι των αντικαρδιολιπινών μπορεί να αποδώσουν ψευδή θετικά αποτελέσματα εξαιτίας της διασταυρωμένης αντιδραστικότητας των φωσφολιπιδίων με ορισμένα δείγματα μολυσματικών ασθενειών, κυρίως της σύφιλης, καθώς και ορισμένα άλλα αντισώματα, όπως με το δίκλωνο DNA. 2,3 Εξαλείφοντας το φωσφολιπίδιο από την στερεά κατάσταση και χρησιμοποιώντας μόνο β 2 GPI, η δοκιμασία καθίσταται πιο ειδική για τον εντοπισμό δυνητικών αιμοπηκτικών προβλημάτων. Αυτή η βελτιωμένη ειδικότητα έχει αποδειχτεί από διάφορες ομάδες. 11,12,16,17,19,20,21,22 Η δοκιμασία αντισωμάτων β 2 GPI είναι μια χρήσιμη και ειδικότερη ανάλυση για χρήση σε συνδυασμό με την κλασική δοκιμασία αντισωμάτων έναντι των καρδιολιπινών και τη δοκιμασία για κύτταρα λύκου, με σκοπό την υποβοήθηση της διάγνωσης θρόμβωσης σε πάσχοντες που ανήκουν σε ομάδες κινδύνου. Αντισώματα έναντι β 2 GPI τάξης IgG βρέθηκαν σε 17 από 47 πάσχοντες από ΣΕΛ (36%). 18 Εννέα από αυτούς τους 47 πάσχοντες από ΣΕΛ είχαν εκδηλώσει θρόμβωση και 8 (89%) είχαν το αντίσωμα έναντι β 2 GPI Οι Hisham, et al. 20 βρήκαν τα αντισώματα έναντι β 2 GPI τάξης IgG σε άλλους 5 πάσχοντες (100%) με τουλάχιστον 2 καταγεγραμμένες κλινικές εκδηλώσεις αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου (APS). Και οι 5 πάσχοντες έχουν ταξινομηθεί ως έχοντες υψηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων έναντι β 2 GPI. Οκτώ στους 14 πάσχοντες (57%) που ταξινομήθηκαν ως έχοντες χαμηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων έναντι β 2 GPI είχαν εκδηλώσει τουλάχιστον 1 θρομβωτικό επεισόδιο. Οι Tsutsumi, et al. 22 βρήκαν αντισώματα IgG και IgM έναντι β 2 GPI σε ποσοστό 10.1% και 5.8% αντιστοίχως για 308 τυχαία επιλεγμένους πάσχοντες από ΣΕΛ Ιαπωνικής καταγωγής. Η συχνότητα εμφάνισης των αντισωμάτων IgG έναντι β 2 GPI ήταν μεγαλύτερη σε πάσχοντες με ιστορικό θρόμβωσης. Αυτή η ερευνητική ομάδα ανέφερε επίσης ότι από 15 πάσχουσες με καθ έξη αποβολές ποσοστό 20% βρέθηκε θετικό για το αντίσωμα IgG έναντι β 2 GPI. Απέδειξαν επίσης ότι οι πάσχοντες με ιστορικό θρόμβωσης παρουσίαζαν μεγαλύτερη πιθανότητα να βρεθούν θετικοί για το IgM έναντι β 2 GPI και ότι οι συγκεντρώσεις του αντισώματος ήταν υψηλότερες στην ομάδα με θρόμβωση σε σύγκριση με τις ομάδες που δεν έπασχαν από θρόμβωση. Από τις 15 πάσχουσες χωρίς ιστορικό αποβολών, καμία δεν βρέθηκε θετική σε IgM έναντι β 2 GPI. Οι Cabiedes, et al. 23 μελέτησαν 94 πάσχοντες από ΣΕΛ. Από αυτούς, 39 παρουσίασαν κλινικές εκδηλώσεις APS. Ο συσχετισμός των κλινικών εκδηλώσεων APS ήταν πιο έκδηλος με τα αντισώματα έναντι β 2 GPI σε σχέση με τη θετικότητα στη συμβατική δοκιμασία ACA (αντι-κεντρομεριδιακών αντισωμάτων). Τα αντισώματα IgG έναντι β 2 GPI βρέθηκαν στους ορούς 16 από 18 πασχόντων (89%) από APS. Από τους 22 πάσχοντες που ήταν θετικοί για ACA, αλλά χωρίς κλινικές εκδηλώσεις αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου, κανένας τους δεν ήταν θετικός σε β 2 GPI. Οι Cerrato, et al. 24 βρήκαν αντισώματα IgG anti -β 2 GPI στο 87.5% μιας ομάδας 32 πασχόντων με ιστορικό θρόμβωσης (APS). Σε ποσοστό 71.9% αυτής της ομάδας των 32 πασχόντων βρέθηκαν αντισώματα IgM αντι-β 2 GPI. Οι Sebastiani, et al. 25 εντόπισαν αντισώματα IgG anti-β 2 GPI σε 110 πάσχοντες (20.3%) και IgM σε 109 πάσχοντες (20,1%) από σύνολο 542 πασχόντων από ΣΕΛ. Η παρουσία anti-β 2 GPI συσχετίστηκε στενά με το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (p < 10-5 ). Επίσης απέδειξαν ότι τα αντισώματα IgG και IgM έναντι β 2 GPI συσχετίζονταν με την αρτηριακή και την φλεβική θρόμβωση. 1

2 Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο αντιγόνο της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι είναι συνδεδεμένο στά πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στά πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντισώματα της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Το πρότυπο που χρησιμοποιείται για την κατασκευή αυτής της καμπύλης αναφέρεται στους πρότυπους ορούς αναφοράς για IgG β 2 -Γλυκοπρωτεΐνη I που διατίθενται από το Rheumatology Lab, Seton Hall University, St. Joseph's Hospital and Medical Center. 26 Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ημιποσοτικά σε τυπικές μονάδες IgG αντι-β 2 GPI (SGU). Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο β 2 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα IgG β 2 GPI) 3. β 2 GPI IgG Control, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml β 2 GPI IgG θετικό πρότυπο ελέγχου (control) 4. β 2 GPI IgG Calibrator A, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml β 2 GPI IgG πρότυπο διάλυμα Α 5. β 2 GPI IgG Calibrator B, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml β 2 GPI IgG πρότυπο διάλυμα Β 6. β 2 GPI IgG Calibrator C, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml β 2 GPI IgG πρότυπο διάλυμα C 7. β 2 GPI IgG Calibrator D, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml β 2 GPI IgG πρότυπο διάλυμα D 8. β 2 GPI IgG Calibrator E, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml β 2 GPI IgG πρότυπο διάλυμα E 9. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 10. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 11. β 2 HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 12. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 13. HRP Stop Solution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. 2

3 Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (Προηγουμένως NCCLS) Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 β 2 GPI ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος β 2 GPI IgG θετικό πρότυπο ελέγχου (control) (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος β 2 GPI IgG Calibrator A Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος β 2 GPI IgG Calibrator B Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος β 2 GPI IgG Calibrator C Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος β 2 GPI IgG Calibrator D Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος β 2 GPI IgG Calibrator E Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml β 2 HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm 3

4 Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων.. 5. Προετοιμασία της πρότυπης καμπύλης: Για τα σημεία A έως E της πρότυπης καμπύλης 5 σημείων, χρησιμοποιήστε ΠΡΟΑΡΑΙΩΜΕΝΟ β 2 GPI IgG ELISA ορό βαθμονόμησης A έως E απευθείας από το φιαλίδιο. Η πρότυπη καμπύλη πέντε σημείων έχει τις ακόλουθες τιμές: Διαλυματα Αναφορας Μοναδες Φωςφολιπιδιων (SGU) A β 2 GPI IgG πρότυπος ορός αναφοράς A B β 2 GPI IgG πρότυπος ορός αναφοράς B 75.0 C β 2 GPI IgG πρότυπος ορός αναφοράς C 37.5 D β 2 GPI IgG πρότυπος ορός αναφοράς D 18.8 ή E β 2 GPI IgG πρότυπος ορός αναφοράς E 9.4 ή Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl από τα δείγματα αναφοράς, τους πρότυπους ορούς και τα αραιωμένα δείγματα υπό έλεγχο στις προκαθορισμένες θέσεις όπως παρουσιάζονται στο παρακάτω διάγραμμα. ΠΡΟΣΟΧΗ : Τα διαλύματα αναφοράς, οι πρότυποι οροί είναι ήδη αραιωμένα. Οι τιμές και το αποδεκτό εύρος τους αναγράφεται πάνω στο φιαλίδιο. Σε περίπτωση που τα αποτελέσματα ξεφύγουν από το εύρος θα πρέπει να επαναλάβετε τη διαδικασία. 3. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 4. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 5. Προσθέστε 100 μl β 2 HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 8. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 9. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Τα διαλύματα αναφοράς, οι πρότυποι οροί θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Τα διαλύματα αναφοράς, οι πρότυποι οροί είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των αντιδραστηρίων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4

5 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του πρότυπου ορού αναφοράς Α θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του θετικού πρότυπου ορού η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού. β. Η απορρόφηση του πρότυπου ορού αναφοράς Α θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του ορού ελέγχου β 2 GPI IgG ELISA Control πρέπει να είναι δύο φορές εκείνη του αρνητικού ορού ελέγχου ELISA Negative Control ή πάνω από δ. Η συγκέντρωση του θετικού πρότυπου ορού θα πρέπει να βρίσκεται εντός του αποδεκτού εύρους που αναγράφεται στην ετικέτα. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να παραπέμπεται στις οδηγίες που δίνονται από το CLSI (Προηγουμένως NCCLS) C24-A2 κείμενο για επιπλέον πληροφορίες στα θέματα ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων 1. Υπολογίστε τη μέση τιμή σε όλες τις εις διπλούν μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων. 2. Κάντε γραφική αναπαράσταση της μέσης απορρόφησης της καμπύλης του ορού βαθμονόμησης για την ανάλυση IgG σε σύγκριση με το λογάριθμο των συγκεντρώσεών τους. Χρησιμοποιήστε μια γραμμή γραφικής αναπαράστασης καμπύλης με τη βέλτιστη προσαρμογή. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά γραφική αναπαράσταση καμπύλης/καμπύλης. Οι μονάδες SGU που έχουν εκχωρηθεί στους ορούς βαθμονόμησης αναγράφονται στο φιαλίδιο του ορού βαθμονόμησης. 3. Με βάση την καμπύλη αναφοράς υπολογίστε τη συγκέντρωση IgG β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι (άξονας Χ)στα υπο έλεγχο δείγματα, αντιστοιχώντας την απορρόφηση τους σε συγκέντρωση ουσίας (άξονας Ψ). 4. Αρνητικά αποτελέσματα κυμαίνονται από 0 20 SGU μονάδες. Τα θετικά αποτελέσματα είναι >20 SGU. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η ανοσοενζυμική μέθοδος είναι μια ευαίσθητη τεχνική που είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφοροποιήσεις στα εξεταστέα δείγματα. Κάθε εργαστήριο είναι υποχρεωμένο να υπολογίσει το δικό του αποδεκτό εύρος φυσιολογικών τιμών με βάση τις δικές του τεχνικές μάρτυρες εξοπλισμό και πληθυσμό. 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ύπαρξη IgG τάξης αντισώματα της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι και υποδηλώνει την πιθανότητα ύπαρξης ορισμένων αυτοάνοσων θρομβωτικών διαταραχών σε ασθενείς με δευτεροπαθή νοσήματα του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ) ή με νοσήματα παρεμφερή με ΣΕΛ και θρομβωτικές διαταραχές. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα υποδηλώνει απουσία αντισωμάτων IgG τάξης της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι ή τα επίπεδα των αντισωμάτων είναι χαμηλότερα από τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου. 3. Προτείνεται η αναφορά των αποτελεσμάτων να συνοδεύεται από τη φράση «Το ακόλουθο δείγμα επεξεργάστηκε με αντιδραστήρια της INOVA QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA. Η ανίχνευση αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι IgG τάξης με διαφορετική μέθοδο και αντιδραστήρια μπορεί να δώσει διαφορετικά και μη συγκρίσιμα αποτελέσματα. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η κλινική σημασία της ανίχνευσης των αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι σε άλλα νοσήματα πέραν του ΣΕΛ είναι ακόμα υπό διερεύνηση. 2. Όταν δίνεται αρνητικό αποτέλεσμα σε συνδυασμό με θετικά κλινικά στοιχεία προτείνεται η περαιτέρω διερεύνηση με επιπλέον ορολογικές εξετάσεις όπως τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα και το αντιπηκτικό του λύκου. 3. Η ανεύρεση αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι δεν μπορεί να θεωρηθεί διαγνωστικός δείκτης. Τα θετικά αποτελέσματα θα πρέπει να αξιολογούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά στοιχεία. 4. Η θεραπευτική αγωγή δεν μπορεί να βασίζεται μόνο στην ανεύρεση αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Πρέπει επίσης να είναι παρούσες υποστηρικτικές κλινικές ενδείξεις. 5. Θα πρέπει να αναμένεται ότι ορισμένα δείγματα μπορέι να είναι θετικά ως προς τα αντισώματα καρδιολιπίνης αλλά αρνητικά για τα αντισώματα έναντι της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Η συγκεκριμένη δοκιμασία είναι πιο ειδική για θρομβωτικές καταστάσεις. Η δοκιμασία ανεύρεσης αντισωμάτων έναντι της καρδιολιπίνης μπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω διασταυρούμενων αντιδράσεων με αντισώματα dsdna ή με αντισώματα ορισμένων μολυσματικών ασθενειών. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Δείγματα Εργαστηρίου - 7th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies (7 ο Διεθνές Συμπόσιο για τα αντισώματα αντιφωσφολιπιδίων) - Νέα Ορλεάνη Ως μέρος του 7ου συνεδρίου για τα αντιφωσφολιπίδια, το οποίο πραγματοποιήθηκε στις 9-13 Οκτωβρίου 1996, διενεργήθηκε εργαστήριο για την αξιολόγηση της απόδοσης διαφόρων δοκιμασιών βασισμένων σε έρευνες και εμπορικών δοκιμασιών αντικαρδιολιπίνης. Η QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA ανοσοενζυμική μέθοδος ανίχνευσης των αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι στα πλαίσια του συμποσίου και σε ταυτόχρονη μέτρηση με άλλες εταιρείες έκανε έλεγχο 10 δειγμάτων από ασθενείς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (APS), 7 δειγμάτων από ασθενείς με μολυσματικές ασθένειες όπως η σύφιλη και ο πυρετός Q, 2 δειγμάτων από ασθενείς με αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα και 11 δείγματα φυσιολογικών ατόμων. Τα αποτελέσματα παρατείθονται στον παρακάτω πίνακα. 5

6 Ομαδα ΑσθενΩων Αριθμος Αριθμος Θετικός β 2 GPI Αριθμος Θετικός Cardiolipin APS Μολυσματικο Ρευματολογικοί Φυσιολογικοί Και οι 10 ασθενείς APS ήταν θετικοί στις δοκιμασίες β 2 GPI και αντισωμάτων καρδιολιπινών. Από τις άλλες τρεις ομάδες ασθενών, όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά στη δοκιμασία β 2 GPI εκτός από 1 δείγμα ρευματικής νόσου. Τέσσερα από τα δείγματα μολυσματικής νόσου, και τα δύο ρευματικά καθώς και 1 από τα έντεκα φυσιολογικά δείγματα ήταν θετικά στην παραδοσιακή δοκιμασία αντισωμάτων καρδιολιπινών. Ειδικά Xαρακτηριστικά Aπόδοσης Σύνοψη Kλινικών Mελετών Η απόδοση της ανοσοενζυματικής δοκιμασίας της QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA αξιολογήθηκε σε 1 εσωτερική και 4 εξωτερικές κλινικές μελέτες. Τα αποτελέσματα παρατείθονται στον παρακάτω πίνακα. Ομαδα ΑσθενΩων Αριθμος Δειγμάτων Αριθμος Θετικός Ποσοστό (%) APS* Δευτεροβάθμιος ΣΕΛ Πρωτοπαθες APS ΣΕΛ Ρευματολογικοί Πολυυπεργαμμαςφαιςιναιμια Μολυσματικοί** Φυσιολογικοί *APS: αντιφοσφολιπιδικό σύνδρομο ** Οι περισσότερες από αυτές ήταν θετικές οροδιαγνωστικές δοκιμασίες σύφιλης Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα η κλινική ευαισθησία της μεθόδου ορίζεται στο 96.2% και η κλινική ειδικότητα στο 99.6% Σχέση Eυαισθησίας και Ειδικότητας Συμφωνία Mε Tην Aνάλυση Aντικαρδιολιπίνης 40 οροί τυχαία επιλεγμένοι από τα δείγματα που υποβλήθηκαν σε ένα μεγάλο εργαστήριο αναφοράς για δοκιμασία αντισωμάτων καρδιολιπινών εξετάστηκαν για αντισώματα IgG σε καρδιολιπίνη και β 2 GPI. Τα αποτελέσματα παρατείθονται στον παρακάτω πίνακα. β 2 GPI Σχετική Ευαισθησία 20.8% Kαρδιολιπινών Σχετική Ειδικότητα 100.0% Σχετική Δράση 52.5% Πέντε δείγματα ήταν θετικά και στις δύο αναλύσεις και 16 δείγματα ήταν αρνητικά και στις δύο. Δεν βρέθηκαν θετικά δείγματα για β 2 GPI και αρνητικά για αντισώματα καρδιολιπινών. Δεκαεννέα δείγματα βρέθηκαν θετικά για αντικαρδιολιπίνη και αρνητικά για αντισώματα IgG σε β 2 GPI. Σε αυτή τη μικρή συγκριτική μελέτη που συμπεριέλαβε τυχαία επιλεγμένα δείγματα χωρίς κλινικά ιστορικά, η σχετική ευαισθησία των αποτελεσμάτων IgG β 2 GPI φαίνεται να είναι χαμηλή σε σχέση με εκείνα της ανάλυσης IgG αντικαρδιολιπίνης. Αυτό είναι αναμενόμενο. Οι παραδοσιακές αναλύσεις αντικαρδιολιπίνης ανιχνεύουν αντισώματα σε β 2 GPI καθώς και αντισώματα που αντιδρούν με το ίδιο το φωσφολιπίδιο. Όπως καταδεικνύεται από τα δεδομένα του προαναφερθέντος εργαστηρίου της Νέας Ορλεάνης και επίσης από τη Σύνοψη κλινικών μελετών, η ανάλυση β 2 GPI εμφανίζει συγκριτική ευαισθησία και υψηλότερη ειδικότητα σε σχέση με τα αποτελέσματα αντικαρδιολιπίνης ασθενών με τεκμηριωμένο APS. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα ακριβείας και αναπαραγωγικότητας μετρήθηκαν με την εξέταση αρνητικού, ισχυρά θετικού και ασθενούς θετικού δείγματος με έξι ξεχωριστές αναλύσεις σε μία εκτέλεση πρωί και απόγευμα σε τρεις συνεχείς ημέρες. Η μέση τιμή του αρνητικού δείγματος ήταν 18.9, του ασθενούς θετικού δείγματος ήταν 44.3 και του ισχυρά θετικού δείγματος ήταν Τα αποτελέσματα ανάμεσα στις εξετάσεις και κατά τη διάρκεια της εξέτασης παρουσιάζονται στον πίνακα παρακάτω. Αρνητικό Aσθενώς θετικό Iσχυρώς θετικό SD CV SD CV SD CV Ολικό % % % Εντός μετρήσεων % % % Μεταξύ μετρήσεων % % % QUANTA Lite είναι ένα θεωρημένο σήμα κατατεθέν της INOVA Diagnostics, Inc. 6

7 Βιβλιογραφία 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: , Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: , Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: , Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: , McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: , Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: , Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: , McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: , Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: , Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: , Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: , Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: , Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: , Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: , Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: , Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: , Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: , Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: , Tsutsumi A, et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: , Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, Sebastiani, G.D., et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, Erickson, E., S. Najmey, L. Keil, H. EL-Kadi, and V. DeBari. Reference calibrators for IgG antibodies to β 2 - glycoprotein I: preparation, properties and availability to investigators. Clinical Chemistry, 42: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 7

8 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service GRC September 2010 Revision 14 8