ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008 ΤΕΥΧΟΣ 46 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ

Transcript

1 ΕΦΗΜΕΡΙΔΕΣ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ Χ + 7 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008 ΤΕΥΧΟΣ 46 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΚΩΔ ΠΛΗΡΩΜΕΝΟ ΤΕΛΟΣ Ταχ. Γραφείο Κ Ε Μ Π Α Θ Αριθμός Άδειας 5207/07 ΕΚΔΟΤΩΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Αλωπεκής Αθήνα - τηλ.:

2

3 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 Περιεχόμενα 4 Συγκρότηση σε Σώμα Δ.Σ. ΕΕΚΧ - ΚΒ 5 33 o Συνέδριο FEBS 6 Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών : 50 χρόνια προσφοράς και δημιουργίας 7 Διερεύνηση μεμονωμένων μορίων με την τεχνολογία του μέλλοντος lab-on-a-chip 13 Ανίχνευση σημειακών πολυμορφισμών DNA (SNPs) με μικροσυστοιχίες και τεχνική MALDI-TOF MS 18 Συσχέτιση του παράγοντα νέκρωσης όγκων με την παχυσαρκία 22 Εκπαιδευτικό Σεμινάριο για το Πρότυπο ΕΛΟΤ EN ISO 15189:2007 με πρακτικές εφαρμογές 23 Ημερίδα του τμήματος εργαστηριακής διάγνωσης και ελέγχου ποιότητας της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας 24 Καλοκαιρινό QUIZ: Είσαι κατάλληλος για Μέλος του Δ.Σ. της ΕΕΚΧ-ΚΒ; 26 Προσεχείς Επιστημονικές Εκδηλώσεις (Επηρεασμένες από το FEBS ) Διοικητικό Συμβούλιο Πρόεδρος: Κ. Ψαρρά Αντιπρόεδρος: Α. Σταθάκη-Φερδερίγου Γ. Γραμματέας: Φ. Καράμπαμπα Αν. Γεν. Γραμματέας: Α. Χαλιάσος Ταμίας: Ε. Μπότουλα Μέλη: Α. Διακουμή-Σπυροπούλου, Χ. Κρούπης Ιδιοκτήτης: ΕΕΚΧ-ΚΒ Αλωπεκής Αθήνα Τηλ.: Fax: Διευθύντρια Σύνταξης Κ. Ψαρρά Νοταρά 39, Αθήνα stcps@hol.gr Επιτροπή Σύνταξης Μ. Βικεντίου, Μ. Γαροφαλάκη, Α. Γρηγοράτου, Ε. Κώνστα, Κ. Κωνσταντινάκου, Β. Λόη, Ν. Παπαγεωργάκης Εκδότης Σταμάτης Σταματόπουλος Focus on Health ΕΠΕ Δημιουργικός Σχεδιασμός Multimedia Trend ΕΠΕ Επιμέλεια - Παραγωγή Focus on Health ΕΠΕ Ιωάννου Γενναδίου 16, Αθήνα, Τηλ.: , Fax: info@focusonhealth.gr Κωδικός Διεύθυνσης Εποπτείας ΜΜΕ: 4283 Editorial Αγαπητοί συνάδελφοι Το καλοκαίρι έφθασε κι εγώ τι να σας γράψω; Να σας γράψω για το νέο.σ.; Κάτι θα βρείτε κάτω από την επίσηµη ανακοίνωση σύστασής του. Να σας γράψω για τα σχέδιά µας; Θα τα µάθετε σύντοµα. Νοµίζω µε δύο λόγια, αν και αρχίζουν οι διακοπές, και όλοι θέλουν να πάρουν τα βουνά και τις θάλασσες άρα η σύσφιξη σχέσεων δεν είναι ό,τι καλύτερο, αυτό που θέλουµε είναι να είµαστε το.σ. σας, δηλαδή να σας εκπροσωπούµε και να εκπληρώνουµε τις επιθυµίες σας καµιά φορά και πριν τις εκφράσετε (αυτό είναι το πιο πονηρό και δύσκολο). Σκεφθείτε το.σ. να τραβάει το δρόµο του και τα µέλη της εταιρείας το δικό τους και να αλληλοκοιτάζονται µε απορία Σ αυτό το ελτίο θα βρείτε εικόνες από το παρελθόν, ευγενική προσφορά του καθ. Α. εσύπρη, και άρθρα από το µέλλον (φανταστείτε όσα περιγράφονται στα κείµενα να γινόντουσαν στα εργαστήρια των εικόνων ). Θα βρείτε άρθρα για συνέδρια που έγιναν και που θα γίνουν. Εν τω µεταξύ ετοιµαστείτε για το Βαλκανικό µας συνέδριο, οι εργασίες είναι πολλές, όλα τακτοποιούνται σιγά-σιγά, επιστολές πάνε και έρχονται, εδώ είναι Βαλκάνια Ένα χρόνο µετά περίπου ετοιµάστε τις βαλίτσες σας το συνέδριο πάει εκδροµή, ώρα να συναντηθούµε και να γνωρίσουµε όλοι µαζί την κλινική χηµεία στον κάθε τόπο της σ αυτή τη χώρα. Και πριν από όλα αυτά, επιστρέφοντας το φθινόπωρο η ποιότητα µάς την έχει στηµένη! Ένα σεµινάριο µε την Ένωση Ελλήνων Χηµικών, επίσηµο και επαγγελµατικό (µε περιορισµένο αριθµό συµµετεχόντων) και ένα σεµινάριο µε την Ελληνική Εταιρεία Αιµατολογίας, όπου οι συνάδελφοί µας αναπτύσσουν ποιοτικά θέµατα ποιότητας και όπου είµαστε όλοι καλεσµένοι. Στο µεταξύ καλά µπάνια! Με συναδελφικούς χαιρετισµούς Κατερίνα Ψαρρά 3

4 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Συγκρότηση σε Σώμα Δ.Σ. ΕΕΚΧ - ΚΒ ΕΕΚΧ - ΚΒ Αλληλογραφία: Αλωπεκής 47, Αθήνα Τηλ , Fax: info@eekx-kb.gr Ημερομηνία: Παρόντες: Τακτικά μέλη: Ψαρρά Αικατερίνη, Καράμπαμπα Φωτεινή, Φερδερίγου-Σταθάκη Αγγελική, Χαλιάσος Αλέξανδρος, Μπότουλα Έφη, Σπυροπούλου-Διακουμή Παναγιώτα, Κρούπης Χρήστος. Αναπληρωματικό μέλος: Λεϊμονή Ειρήνη. Θέματα: 1. Πρόταση για συγκρότηση Δ.Σ. 2. Η συνεδρίαση εκλήθη από την Κ. Ψαρρά που πλειοψήφησε στις αρχαιρεσίες της Θέμα 1 ο : Προτάθηκε ως Πρόεδρος του Δ.Σ. η Κατερίνα Ψαρρά. Ψηφοφορία για τη θέση του Προέδρου: 7 ψήφοι υπέρ, ψηφίζεται ομόφωνα. Η Κατερίνα Ψαρρά εκλέγεται Πρόεδρος του Δ.Σ. Προτάθηκε ως Γενικός Γραμματέας η Φωτεινή Καράμπαμπα. Ψηφοφορία για τη θέση του Γενικού Γραμματέα: 7 ψήφοι υπέρ, ψηφίζεται ομόφωνα. Η Φωτεινή Καράμπαμπα εκλέγεται Γραμματέας του Δ.Σ. Προτάθηκε ως Αντιπρόεδρος η Αγγελική Σταθάκη- Φερδερίγου. Ψηφοφορία για τη θέση του Αντιπροέδρου: 7 ψήφοι υπέρ, ψηφίζεται ομόφωνα. Η Α. Σταθάκη-Φερδερίγου εκλέγεται Αντιπρόεδρος του Συμβουλίου. Προτάθηκε ως Ταμίας η Έφη Μπότουλα. Ψηφοφορία για τη θέση του Ταμία: 7 ψήφοι υπέρ, ψηφίζεται ομόφωνα. Η Ε. Μπότουλα εκλέγεται Ταμίας. Προτάθηκε ως Αναπληρωτής Γενικός Γραμματέας ο Αλέξανδρος Χαλιάσος. Ψηφοφορία για τη θέση του Αναπληρωτή Γενικού Γραμματέα: 7 ψήφοι υπέρ, ψηφίζεται ομόφωνα. Ο Α. Χαλιάσος εκλέγεται Αναπληρωτής Γενικός Γραμματέας. Η Πρόεδρος Αικατερίνη Ψαρρά Η Γεν. Γραμματέας Φωτεινή Καράμπαμπα Το νέο Δ.Σ. είναι γεμάτο κέφι, δυναμισμό και ζωντάνια, γεμάτο προτάσεις και σχέδια. Συναντηθήκαμε ήδη με την Επιτροπή Εκπαίδευσης και με την Επιτροπή Μητρώου. Μακάρι να συναντηθούμε και μαζί σας. Θα γίνει! Στα συνέδρια, στα σεμινάρια, στην εκπαίδευσή σας, στα εργαστήριά σας. Το νέο Δ.Σ. είναι συνέχεια του παλιού (φαίνεται και από τη σύνθεσή του). Ωστόσο, ο Δημήτρης Ρίζος και ο Όθωνας Παναγιωτάκης, οι δύο αγαπημένοι, πολλαπλά επιτυχημένοι συνάδελφοι, που δεν θέλησαν να συνεχίσουν τη δράση τους μέσα από το Δ.Σ., σίγουρα δεν επιθυμούν να τους μιμηθούμε, να τους αντιγράψουμε, θέλουν να βάλουμε τη δική μας πινελιά. Αυτό θα γίνει, το θέλουμε, το υποσχόμαστε. Όπως σε κάθε καινούριο μηχάνημα ή καινούργιο λογισμικό πρέπει να κρατηθούν τα καλά, και να εξελιχθούν. Ακόμη και αν αυτό καμιά φορά δεν γίνεται (ρωτάω τους τεχνικούς: Γιατί δεν κρατήσατε αυτό το τόσο καλό και αποτελεσματικό κομμάτι του λογισμικού; Απάντηση: Δεν συμβάδιζε με το καινούργιο), οι δύο συνάδελφοι και ό,τι πρόσφεραν στην εταιρεία έχει εμπεδωθεί στον εγκέφαλό μας και μας καθοδηγεί, κάπως όπως και οι ευχές και συμβουλές των δασκάλων μας σε άλλα θέματα. Αυτό νομίζω τα λέει όλα Σημείωση: Μην το πάρετε από ηλικιακή πλευρά. Απλά προηγήθηκαν, έδρασαν, κοπίασαν, τα κατάφεραν Ευχαριστούμε! 4

5 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ ο Συνέδριο FEBS Ανδριανή Γηγοράτου Στις 28 Ιουνίου-3 Ιουλίου έγινε στην Αθήνα, στο Μέγαρο Μουσικής το 33 ο Συνέδριο της Ομοσπονδίας Ευρωπαϊκών Εταιρειών Βιοχημείας (Federation of European Biochemical Societies, FEBS) και το 11 ο Συνέδριο της Διεθνούς Ένωσης Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB). Πρόεδρος της οργανωτικής επιτροπής ήταν ο καθηγητής Εμμ. Φραγκούλης και της επιστημονικής επιτροπής ο καθηγητής Κων. Σέκερης. Οι εργασίες του συνεδρίου κάλυψαν ευρύ φάσμα της σύγχρονης Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας. Η εναρκτήρια διάλεξη με θέμα τη μίτωση και τους μοριακούς «διακόπτες», που καθορίζουν την έναρξη και τη λήξη της κυτταρικής διαίρεσης, έγινε από τον Tim Hunt (Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής 2001). Ο Tom Blundel αναφέρθηκε στην αποτελεσματικότερη, με τη βοήθεια της κρυσταλλογραφίας, της πρωτεομικής, της συνθετικής χημείας και των ηλεκτρονικών υπολογιστών, επιλογή νέων μορίων, κατάλληλων να χρησιμοποιηθούν για φάρμακα, που διακρίνονται από ικανοποιητικό θεραπευτικό αποτέλεσμα και χαμηλή τοξικότητα. Ο Peter Friedl ανέφερε τους διαφόρους τρόπους μετακίνησης των καρκινικών κυττάρων πάνω στην ενδοκυττάρια ουσία και τις στρατηγικές των μεταστάσεων σε άλλους ιστούς και όργανα. Στη χρήση αντισωμάτων έναντι πρωτεϊνών, που υπερεκφράζονται στα καρκινικά κύτταρα και τη στοχευόμενη θεραπεία των καρκινικών όγκων αναφέρθηκε ο Axel Ulrich. Οι άνθρωποι και τα πρωτεύοντα θηλαστικά έχουν διαφορετικά μόρια σακχάρων. Σε αυτό αποδίδεται και η διαφορά στην ευαισθησία σε ποικίλες ασθένειες, ανέλυσε ο Ajit Varki. Για τις Ν-γλυκάνες, την πολυπλοκότητα των μορίων τους, τις δυσκολίες της μελέτης τους και την πρόοδο της γλυκομικής μίλησε ο Naoyuki Tanigushi. Οι Marc Henrik Baumann και Elias Lolis ανέπτυξαν τη σημασία των ανωμαλιών της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών, τις ασθένειες που προκύπτουν από αυτές και τις επιπτώσεις στην επιλογή των χορηγούμενων φαρμάκων. Διεξήχθησαν επίσης τρία συμπόσια με θέμα την εκπαίδευση σε θέματα Βιοχημείας, το ρόλο των γυναικών στην επιστήμη και τη σχέση της επιστήμης με την ευρύτερη κοινωνία. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν δύο ανοιχτές στο κοινό εκδηλώσεις, με θέματα: «Βιοχημεία - Προεκτάσεις στην ποιότητα ζωής» και «Από το Πείραμα, στο Φάρμακο και την Εφαρμογή». Στο επιτυχημένο αυτό συνέδριο συμμετείχαν περισσότεροι από επιστήμονες από όλο τον κόσμο (65% Ευρωπαίοι, από τους οποίους 25% Έλληνες). Επίσης, από Ιουνίου στο Λουτράκι έγινε το Συνέδριο των Νέων Επιστημόνων, που υποστηρίζεται από το FEBS. 5

6 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών : 50 χρόνια προσφοράς και δημιουργίας Ανδριανή Γρηγοράτου Φέτος συμπληρώνονται 50 χρόνια από την ίδρυση του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών, «προς ενίσχυσιν των εν τη χώρα επιστημονικών ερευνών και εξασφάλισιν περισσοτέρων ευκαιριών εις τους Έλληνας επιστήμονας». Η επέτειος γιορτάστηκε πανηγυρικά με εκδηλώσεις παρουσία του Προέδρου της Δημοκρατίας και του Πρωθυπουργού. Η ίδρυση του ΕΙΕ απετέλεσε την πραγματοποίηση του οράματος του ακαδημαϊκού και καθηγητή οργανικής χημείας Λεων. Ζέρβα, με συνεργάτες τους Κων. Δημαρά και Ιω. Πεσματζόγλου. Το 1968 ολοκληρώνεται η κατασκευή του κτιρίου, που στεγάζει το ΕΙΕ, έργο του Κων. Δοξιάδη. Το ΕΙΕ περιλαμβάνει 3 ινστιτούτα ανθρωπιστικών σπουδών - Ελληνικής και Ρωμαϊκής αρχαιότητας, Βυζαντινών ερευνών και Νεοελληνικών ερευνών- καθώς και 3 ινστιτούτα θετικών επιστημών. Στο ινστιτούτο Βιολογικών ερευνών και Βιοτεχνολογίας (1977) μελετώνται προγράμματα μοριακής βιολογίας DNA, γονιδιακής ρύθμισης, μοριακής ενδοκρινολογίας, μοριακής και κυτταρικής γήρανσης, χημικής καρκινογένεσης και γενετικής τοξικολογίας, ενζυμολογίας, βιομιμητικής, μεταβολικής μηχανικής και βιοπληροφορικής. Στο ινστιτούτο Οργανικής Χημείας και Φαρμακοχημείας (1977) μελετούν οργανομεταλλική χημεία, και ασχολούνται επίσης με την πρόληψη και τη θεραπεία διαφόρων νοσημάτων, όπως ο διαβήτης τύπου 2, ο καρκίνος, οι φλεγμονώδεις διαταραχές, τα νευροεκφυλιστικά σύνδρομα. Αυτό το ινστιτούτο κατέχει τον επίζηλο τίτλο του ερευνητικού φορέα επιστημονικής αριστείας για την πρόταση Νέες προσεγγίσεις κατά των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων, στόχος της οποίας είναι ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων ισχυρών και εκλεκτικών αντιοξειδωτικών, νευροστεροειδών και κανναβινοειδών για την πρόληψη ή/και θεραπεία νευροεκφυλιστικών παθήσεων. Στο ινστιτούτο Θεωρητικής Χημείας και Φυσικοχημείας (1979) το ενδιαφέρον εστιάζεται στη νανοτεχνολογία, την υπολογιστική φυσική και χημεία, τη σύνθεση νέων υλικών και τον φασματοσκοπικό χαρακτηρισμό τους, την επιστήμη των υλικών και τη φασματοσκοπία laser. Στο ΕΙΕ εντάσσεται και το Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης (1980) με σκοπό την τεκμηρίωση και την πληροφόρηση σε θέματα επιστήμης, έρευνας και τεχνολογίας. Η βιβλιοθήκη του ΕΙΕ (1958) εξυπηρετεί την επιστημονική κοινότητα της χώρας. Περιλαμβάνει περισσότερα από 3000 επιστημονικά βιβλία και τίτλους επιστημονικών περιοδικών. Λειτουργεί επίσης ηλεκτρονικό αναγνωστήριο που παρέχει πρόσβαση στο περιεχόμενο της Ψηφιακής Βιβλιοθήκης Επιστήμης & Τεχνολογίας του ΕΚΤ. Το έμψυχο υλικό του ΕΙΕ απασχολεί 600 ερευνητές και 200 εργαζόμενους. Σημαντική προσφορά αποτελούν και οι εκδηλώσεις που οργανώνονται στο ΕΙΕ και αναφέρονται στις εξελίξεις της σύγχρονης επιστήμης και τον πολιτισμό. 6

7 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 Διερεύνηση μεμονωμένων μορίων με την τεχνολογία του μέλλοντος lab-on-a-chip Advances in technology have allowed chemical sampling with high spatial resolution and the manipulation and measurement of individual molecules. Adaptation of these approaches to lab-on-a-chip formats is providing a new class of research tools for the investigation of biochemistry and life processes. Μετάφραση-Προσαρμογή: Βικεντίου Μυροφόρα Χημικός MSc Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής και Θεοδωρίδου Αλεξάνδρα Χημικός MSc Βιοχημείας Πρωτότυπος τίτλος: Harold Craighead. Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules Nature, 2006, Vol. 442, Ένα μεγάλο εύρος καινούργιων τεχνολογιών έχουν αναπτυχθεί για την παρατήρηση και την ταυτοποίηση μεμονωμένων μορίων. Οι καλά καθιερωμένες μορφές μικροσκόπησης, όπως το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, επέτρεψαν την απεικόνιση, και την ταυτοποίηση της χημικής φύσης (των χημικών ιδιοτήτων) (με τη χρήση κατάλληλων labels) των μεμονωμένων μορίων. Πρόσφατα, τα μικροσκόπια ανιχνευτή σάρωσης (scanning probe microscopes) αύξησαν τις πιθανότητες για την άμεση παρατήρηση και άμεση αλληλεπίδραση με τα μεμονωμένα μόρια. Ο ανιχνευτής ενός συστήματος σάρωσης μπορεί να εντοπίσει, ηλεκτρονικά, μετρήσεις για ένα επιλεγμένο μόριο ή να μετρήσει τις μηχανικές ιδιότητες ενός απομονωμένου βιοπολυμερούς. Οι μοντέρνες τεχνολογίες επεξεργασίας υλικών, ανάλογα με αυτές που πέτυχαν τη μετατροπή των ηλεκτρονικών στην τεχνολογία που βασίζεται σ ένα chip ( chip-based technology) διερευνώνται για πιθανές lab-on-a-chip εφαρμογές. Οι μικρής κλίμακας αναλυτικές διαδικασίες, συνδυασμένες με προηγμένα συστήματα μικροροής (microfluidics), συμβάλλουν στην ανάπτυξη διαφόρων chip-based μεθόδων στις οποίες οι αναλύσεις μπορεί να διεκπεραιώνονται ταχύτερα και με χαμηλότερο κόστος μέσω μικρής κλίμακας συστημάτων σε σύγκριση με τις ήδη υπάρχουσες μεθόδους κλίμακας εργαστηριακού πάγκου (laboratory bench-scale methods). Οι νέες ερευνητικές προσεγγίσεις που ακολουθούν, παρακινούνται από την πιθανότητα παρατήρησης καινούργιων φαινομένων ή εξασφάλισης λεπτομερούς πληροφορίας από ενεργά βιολογικά συστήματα. Για το λόγο αυτό, μια τάξη ερευνητικών συστημάτων αναπτύσσεται αφού προηγηθεί η εφαρμογή ενός εύρους νέων φυσικών και χημικών προσεγγίσεων στην ανάλυση βιομορίων. Τα chips ενοποιούν τις ηλεκτρονικές, οπτικές και φυσικές μετρήσεις με χειρισμό των υγρών, δημιουργώντας έτσι μια νέα τάξη λειτουργικών συστημάτων βασισμένων σε chip. Τα συστήματα αυτά επιτρέπουν παρατήρηση στην κατάλληλη θέση, όπως για παράδειγμα, της λειτουργίας ενός ενεργού ενζύμου, της δραστικότητας ενός υποδοχέα στην επιφάνεια κυττάρου, ή της απελευθέρωσης μορίων από κυστίδιο λόγω εξωκυτταρικού γεγονότος σε κύτταρο του ανοσιακού συστήματος. Το μακροχρόνιο αποτέλεσμα της έρευνας αυτής μπορεί να είναι η ανάπτυξη μιας νέας ομάδας συστημάτων χειρισμού υγρών τύπου chip, τα οποία πρόκειται να χρησιμοποιήσουν ή να αναλύσουν μεμονωμένα μόρια. Αυτό μπορεί να αποτελέσει τη βάση υπερευαίσθητων αισθητήρων και ιατρικών διαγνωστικών συστημάτων. Μοριακή απεικόνιση και ανιχνευτές Τα όργανα ανιχνευτών σάρωσης, όπως είναι το μικροσκόπιο ατομικής ισχύος (atomic force microscope) και το μικροσκόπιο σάρωσης καναλιών (scanning tunneling microscope) επέτρεψαν την υλοποίηση πειραμάτων στα οποία μεμονωμένα μόρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν και να διερευνηθούν. Με τον τρόπο αυτό παρέχεται επιπλέον γνώση βιομοριακών συστημάτων τα οποία, μέχρι σήμερα, έχουν διερευνηθεί μόνο με έμμεσο τρόπο. Η μικροσκοπία σάρωσης καναλιών μπορεί να απεικονίσει μόρια στις επιφάνειες και άμεσα μπορεί να παρατηρήσει- να «αποκαλύψει» τη διαμόρφωσή τους όπως και τη δομή τους. Η μικροσκοπία ατομικής σάρωσης (Atomic Force Microscopy, AFM) μπορεί να απεικονίσει μόρια στη φυσική τους ένυδρη μορφή, ενώ μπορεί να λάβει εικόνες κατά τη διάρκεια της λειτουργίας των μορίων. Επιπλέον, η AFM χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της περιέλιξης και της αναδίπλωσης (folding-unfolding) μορίων πρωτεΐνης. Η παρακολούθηση της λειτουργίας ενεργών μορίων σε συνθήκες που συγκλίνουν με αυτές των in vivo συνθηκών μπορεί να παρέχει νέα δεδομένα- γνώση για τον τρόπο με τον οποίο λειτουργούν τα ζώντα συστήματα σε μοριακό επίπεδο. 7

8 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Ο Ashkin ήταν ο πρώτος που χρησιμοποίησε βαθμιδωτή ισχύ-δύναμη από οπτικές δέσμες φωτός για να παγιδεύσει σωματίδια και να ασκήσει ελεγχόμενη δύναμη σε μικρά σφαιρίδια, ιούς και βακτήρια. Η τεχνική, η οποία έγινε γνωστή ως «optical tweezers» (οπτικές πένσες) αποδείχτηκε δυναμικό εργαλείο στην εφαρμογή ελεγχόμενων δυνάμεων σε μεμονωμένα μόρια. Κλασικά πειράματα συμπεριλαμβάνουν τη δέσμευση του μορίου ενδιαφέροντος με χημικό τρόπο σε σφαιρίδιο και στη συνέχεια σύνδεση του μορίου με το άλλο τελικό άκρο στην επιφάνεια άλλου σφαιριδίου. Οι «οπτικές πένσες» μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα υγρά με αποτέλεσμα να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για βιομόρια τα οποία βρίσκονται στις φυσικές τους ένυδρες και λειτουργικές συνθήκες. Αυτό επιτρέπει τις μετρήσεις μακριά από την επίδραση της δύναμης όταν το βιοπολυμερές είναι ξεδιπλωμένο ή τη διερεύνηση του «σπασίματος» δεσμών σε συγκεκριμένες αντιδράσεις. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται πλέον ευρέως στις βιοφυσικές μελέτες μεμονωμένων μορίων, ενώ παρακίνησε τους ερευνητές να σκεφτούν τα μεμονωμένα μόρια ως προσβάσιμα αντικείμενα που μπορούν να επιλεχθούν και να μελετηθούν για τις ατομικές τους ιδιότητες. Επιπλέον, βοήθησε στο ξεκίνημα των δοκιμασιών που βασίζονται στα chip για την ανάλυση των μεμονωμένων μορίων. Η τεχνολογία Patch-clamp, αποτελεί άλλη μια μορφή εντοπισμένου ηλεκτρικού ανιχνευτή, ο οποίος προκάλεσε επανάσταση στις ικανότητες των ερευνητών να μελετήσουν δραστικά κανάλια ιόντων στις κυτταρικές μεμβράνες. Η τεχνολογία χρησιμοποιεί μια γυάλινη πιπέτα για να σχηματίσει μια οπή-διάφραγμα μικροκλίμακας που μπορεί να σχηματίσει σφικτό, μονωτικό, αεροστεγές σφράγισμα στην κυτταρική μεμβράνη. Με το ηλεκτρικό ρεύμα που άγεται και μετράται διαμέσου της πιπέτας, το ηλεκτρικό φορτίο περιορίζεται στη σύνδεση μονοπατιών μέσα στην απομονωμένη περιοχή της οπής της πιπέτας. Αυτή ήταν μια επαναστατική τεχνική που επέτρεψε την παρακολούθηση των μονοπατιών ιοντικών καναλιών σε ζωντανές κυτταρικές μεμβράνες. Παρόλο που χρησιμοποιούνται δυναμικά και αποτελεσματικά στην έρευνα, οι μέθοδοι των μεμονωμένων ανιχνευτών χρησιμοποιούν κουραστικούς χειρισμούς των μεμονωμένων ανιχνευτών και δε λαμβάνουν υπόψη την ενσωμάτωση, τον παραλληλισμό και την αυτοματοποίηση, που παρέχονται από συστήματα που βασίζονται σε chip. Ανάπτυξη νέων τεχνολογιών για ενσωμάτωση lab-on-a-chip Η ήδη υπάρχουσα τεχνολογία συνδέει λιθογραφικές προσεγγίσεις, για την επεξεργασία σκληρών υλικών, με την επεξεργασία μαλακών υλικών, ρευστών και βιοχημικήςβιομοριακής απεικόνισης (patterning). Οι τεχνολογίες αυτές παράγουν αξιόπιστα εμπορικά συστήματα χαρακτηριστικού μεγέθους μικρότερου από 100 nm, ενώ χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία πολύπλοκων και μαζικής παραγωγής παράλληλων ηλεκτρονικών συσκευών, παράγοντας δισεκατομμύρια πανομοιότυπων συσκευών σε μορφή chip. Οπτικές πηγές και ανιχνευτές έχουν, επίσης, σμικρυνθεί και παράλληλα έχουν κατασκευαστεί και είναι διαθέσιμα στα προϊόντα κατανάλωσης όπως είναι οι βιντεοκάμερες και οι οθόνες. Αυτό αποτελεί καλά αναπτυγμένη τεχνολογία που είναι, σήμερα, στην επιστήμη, και πιθανά, στο μέλλον, σε μια νέα τάξη λειτουργικών συσκευών για εκμεταλλεύσιμες βιοχημικές αναλύσεις βασισμένων στα chip. Ηλεκτρονικά chips με υψηλή ανάλυση στο χώρο Η ανάπτυξη του σφικτήρα (planar patch clamp) είναι ένα παράδειγμα μετατροπής της τεχνικής ανίχνευσης σε συσκευή τύπου chip. Σύμφωνα με την προσέγγιση αυτή, αντί χρησιμοποίησης γυάλινης πιπέτας στενού ανοίγματος, ένας ηλεκτρικός ανιχνευτής εισέρχεται μέσω χαραγμένου ανοίγματος μεγέθους μικρομέτρου το οποίο μπορεί εύκολα να κατασκευαστεί πάνω σε μια λεπτή μεμβράνη επίπεδης επιφάνειας. Τα μακροσκοπικά ηλεκτρόδια τότε τοποθετούνται σε αντίθετες πλευρές του ανοίγματος, με όλο το ρεύμα να διασχίζει το στενό άνοιγμα. Το αντικείμενο ενδιαφέροντος -τυπικά ένα κανάλι ιόντος σε λιπιδική μεμβράνη είναι ηλεκτρικά απομονωμένο. Οι Schmidt, Mayer και Vogel έδειξαν αυτού του είδους τη συσκευή σε μια μεμβράνη νιτριδίου σιλικόνης η οποία στηρίζεται από χαραγμένο δισκίο σιλικόνης, που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της δραστικότητας ενός καναλιού ιόντος του πεπτιδίου alamethicin ενσωματωμένων σε λιπιδική διπλοστοιβάδα. Η τεχνολογία ηλεκτρονικής συσκευής με chip μπορεί να εφαρμοστεί στη δημιουργία συστοιχιών ηλεκτροδίων με σκοπό την ανίχνευση ηλεκτρικών γεγονότων σε βιοσυστήματα. Για παράδειγμα, η ομάδα του Lindau παρουσίασε συστοιχίες ηλεκτροδίων για χωροχρονική ανάλυση εξωκυττάριων γεγονότων σε ζώντα κύτταρα. Χρησιμοποιώντας μοτίβο μεταλλικής συστοιχίας ηλεκτροδίων, στα οποία τοποθετούνται τα κύτταρα, καταγράφονται ηλεκτροχημικά σήματα από την οξείδωση των κατεχολαμινών που απελευθερώνονται από τα κύτταρα καθώς ένα κυστίδιο που περιέχεται στο κύτταρο συντήκεται με την κυτταρική μεμβράνη απελευθερώνοντας έτσι το περιεχόμενό του. Με τη μέτρηση σχετικών ισχύων των σημάτων ρεύματος από το κάθε ηλεκτρόδιο, οι ερευνητές μπορούν να υπολογίσουν τη θέση του κάθε εξωκυττάριου γεγονότος, τη συνολική ποσότητα των ιόντων που απελευθερώνονται 8

9 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 καθώς και τη διάρκεια του κάθε γεγονότος. Η λεπτομερής ποσοτικοποίηση, στο επίπεδο αυτό, είναι δύσκολο να επιτευχθεί με άλλες μεθόδους, ενώ η συγκεκριμένη κατασκευή επιτρέπει τη δημιουργία μεγάλης κλίμακας ομάδων πανομοιότυπων ηλεκτροδίων για μετρήσεις μεγάλων κυτταρικών συστοιχιών. Αυτό ενδιαφέρει ένα μεγάλο αριθμό βασικών κυτταροβιολογικών μελετών, ενώ προσφέρει δυναμική εφαρμογή στην παρακολούθηση της κυτταρικής λειτουργίας καθώς και επίδρασης φαρμάκων σε αυτή. Με τους ίδιους τύπους συστοιχιών ηλεκτροδίων, οι Lindau και συν. μπόρεσαν να καταγράψουν, ταυτόχρονα, εικόνες φθορισμού των γεγονότων σύντηξης πόρων των κυττάρων. Αυτό υποδεικνύει και την αξία των lab-on-achip στην κατασκευή επίπεδων συσκευών για την υλοποίηση πολλαπλών αναλυτικών διαδικασιών. Βέβαια, οι δυνατότητες των ολοκληρωμένων ηλεκτρονικών επεκτείνονται και πέραν αυτών των παθητικών ηλεκτροδίων (passive electrodes). Οι ερευνητές μπορούν να αναπτύξουν δραστικές, ηλεκτρονικές συσκευές που επιτρέπουν πολύπλοκες λειτουργίες, όπως είναι η ενίσχυση σημάτων. Πολλές ομάδες έχουν χρησιμοποιήσει μικροκατασκευές συστοιχιών ηλεκτροδίων για την εξωκυττάρια καταγραφή δυναμικών φάσεων των νευρώνων που καλλιεργήθηκαν σε συστοιχίες ηλεκτροδίων. Η ομάδα του Fromhertz εφάρμοσε συστοιχίες ηλεκτροδίων που συνδέονται με συστοιχίες σε chip κρυσταλλολυχνιών για να ενισχύσει τα σήματα δυναμικού κοντά στην πηγή τους με σκοπό τη βελτίωση του λόγου σήματος προς θόρυβο. Με την παροχή των ενεργών ηλεκτροδίων στο chip, η επεξεργασία επιπρόσθετων σημάτων και logic λειτουργιών μπορεί να ενσωματωθεί στη συσκευή. Επιπρόσθετα στην ολοκλήρωση της ηλεκτρικής λειτουργίας με οπτική ανάλυση, η προσέγγιση μέτρησης chip μπορεί να συνδυαστεί με βιοχημικό πρότυπο για να αλληλεπιδράσει με βιολογικά συστήματα. Για παράδειγμα, οι James και συν. εφάρμοσαν μεθόδους για την παροχή πρωτεϊνών σε συνεργασία με συστοιχίες ηλεκτροδίων. Οι προτυπωμένες πρωτεΐνες, κατεύθυναν την ανάπτυξη των νευρωνικών (neuronal) κυττάρων στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου η οποία κατέγραφε τα σήματα από επιλεγμένα σημεία σε μια οργανωμένη κυτταρική καλλιέργεια. Η ικανότητα χρησιμοποίησης παραγόντων ανάπτυξης των κυττάρων, χημειοτακτικών ή επιλεγμένων παραγόντων σύνδεσης, όπως είναι τα αντισώματα, παρέχει μέθοδο για την αλληλεπίδραση των δυναμικών αναλυτικών δυνατοτήτων που σχεδιάστηκαν στις ανόργανες συσκευές με οργανικά, κυτταρικά συστήματα. Η διάρθρωση ενεργών βιο-υλικών στις επιφάνειες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τις δοκιμασίες lab-on-achip στα κύτταρα. Ωστόσο, η διάρθρωση σε υποκυτταρικές διαστάσεις δίδει τη δυνατότητα κατεύθυνσης κυττάρων ως προς τα chip. Οι διαρθρώσεις από μόνες τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη μελέτη των κυτταρικών αποκρίσεων σε εντοπισμένο ερέθισμα καθώς και να παρατηρήσουν τις αποκρίσεις σε μοριακή κλίμακα. Για παράδειγμα, ο Orth και συν. εφάρμοσε μια μέθοδο υψηλής διακριτικής ικανότητας για να δημιουργήσει διαρθρωμένες λιπιδικές δι-επιφάνειες που περιείχαν αντιγόνα σε κύτταρα ανοσιακού συστήματος θηλαστικών. Οι υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας ομαδοποιούνται με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του κυττάρου. Ο Wu και συν. χρησιμοποίησαν την προσέγγιση αυτή για τη διερεύνηση γεγονότων σηματοδότησης σε διαμεμβρανικό επίπεδο. Χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού, με εξωγενείς ή γενετικώς κωδικοποιημένους ανιχνευτές φθορισμού, παρακολουθούνται τα συστατικά κυτταροπλάσματος, της αναδιάταξης της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και του κυτταροσκελετού μετά από διέγερση. Αυτό επέτρεψε τον έλεγχο της υπόθεσης που αφορά στο σχηματισμό των καλουμένων «λιπιδικών σχεδιών» (lipid rafts) όπου έδειξε την αποσύνθεση των έσω- και έξω στοιβάδων της κυτταρικής μεμβράνης. Ομοίως με τα προηγούμενα παραδείγματα, η ικανότητα δημιουργίας μεγάλου αριθμού ταυτόσημων χημικών διεγέρσεων επέτρεψε την πιστή αντιγραφή (επανάληψη) και παρουσία αυτών σε μεγάλο αριθμό κυττάρων. Η χρήση πατενταρισμένων βιοχημικών chip σε σύζευξη με το μικροσκόπιο φθορισμού παρέχει οπτικοποίηση -απεικόνιση της κυτταρικής απόκρισης σε καθορισμένα ερεθίσματα- διεγέρσεις καθώς και την ικανότητα ποσοτικοποίησής τους. Επίπεδες διατάξεις για την παρατήρηση μεμονωμένων μορίων Τα απλά chip με χαρακτηριστικά νανοκλίμακας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη της δραστικότητας μεμονωμένων μορίων, επεκτείνοντας τις ικανότητες για την παρατήρηση βιολογικών πορειών στη μοριακή κλίμακα. Η ομάδα Noji κατασκεύασε σε ένα chip μια συστοιχία χημικών θαλάμων, με όγκο της τάξης των φεμτολίτρων, για τη μελέτη της δραστικότητας μεμονωμένων μορίων του ενζύμου F1ATPase τα οποία είναι προσδεδεμένα σε μια επιφάνεια. Στη συγκεκριμένη εργασία, η ομάδα σχεδίασε μικρούς, και οπτικά διαφανείς, πολυμερείς θαλάμους προκειμένου να απομονώσει τη χημεία που σχετίζεται με ένα μεμονωμένο ένζυμο. Η ATPase λειτουργεί ως ένας περιστροφικός κινητήρας, και συνάπτοντας ένα μαγνητικό σφαιρίδιο στο περιστροφικό τμήμα του μορίου, η περιστροφή του μορίου μπορεί να παρατηρηθεί οπτικά. Η περιστροφική δύναμη του μαγνητικού σφαιριδίου δύναται να ελεγχθεί με την εφαρμογή ενός 9

10 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ περιστροφικού μαγνητικού πεδίου. Οι ερευνητές μπόρεσαν να μετρήσουν τις περιστροφές του κινητήρα και να υπολογίσουν την απόδοση καθώς ο ενζυμικός κινητήρας καταναλώνει ως καύσιμο ATP. Επειδή, ο όγκος του διαλύματος που περιείχε ATP ήταν πολύ μικρός, η δραστικότητα του ενζύμου, καθώς κατανάλωνε τη διαθέσιμη πηγή ενέργειας, ήταν δυνατόν να παρατηρηθεί σε λογικούς πειραματικούς χρόνους. Σε επίδειξη απίστευτου ελέγχου ο μεμονωμένος κινητήρας μπορούσε να οδηγηθεί σε αντίστροφη κατεύθυνση από το περιστρεφόμενο μαγνητικό πεδίο ώστε να συνθέσει μετρήσιμα μόρια ATP. Το συγκεκριμένο πείραμα μας προμηθεύει με γνώσεις σχετικά με τη δραστικότητα λειτουργικών βιομορίων, απαντώντας σε ερωτήματα κινητικής, ταχυτήτων και απόδοσης. Αυτό είναι ένα παράδειγμα από μια δυνητικά επαναστατική τάξη ψηφιδωτών διατάξεων στις οποίες η παρατήρηση και ο έλεγχος ενός μεγάλου αριθμού μεμονωμένων μορίων χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές μεμονωμένων χημικών γεγονότων ή ως συστατικά ενός συστήματος χημικής σύνθεσης. Δραστικά ένζυμα μπορούν να απομονωθούν με οπτικό τρόπο για μέτρηση, με τεχνικές οι οποίες επιτρέπουν την παρατήρηση μεμονωμένων γεγονότων της αντίδρασης σε υψηλές συγκεντρώσεις. Μια πρόσφατη μελέτη χρησιμοποίησε φυσικούς περιορισμούς (confinement) των αντιδρώντων προκειμένου να περιορίσει την αντίδραση σε μικρό όγκο. Ακόμη και με τον περιορισμό του δραστικού ενζύμου σε μικρό όγκο η παρατήρηση των διαφόρων διαδικασιών είναι δυνατόν να αναχθεί σε παρατήρηση της ειδικής χημικής δραστικότητας του απομονωμένου ενζύμου. Οι Levene et al., περιέγραψαν μια συστοιχία μεταλλικών οπών, με διάμετρο κατώτερη του μήκους κύματος, η οποία περιορίζει το φως σε διαστάσεις πολύ κατώτερες του ορίου διάθλασης του φωτός. Καθαρή δράση αποτελεί μια οπτική διέγερση όγκου της τάξης των ζεπτολίτρων (10-21 ), σημαντικά χαμηλότερη από αυτή που θα μπορούσε να επιτευχθεί, για παράδειγμα, με ολική εσωτερική ανάκλαση φωτισμού, η οποία μπορεί να περιορίσει το φως στο αποσβενόμενο πεδίο σε μια διεύθυνση μόνο. Αν το φως που χρησιμοποιείται για να διεγείρει τον φθορισμό στα μόρια διαλύματος συγκέντρωσης C και όγκου οπτικής διέγερσης V, τότε ο μέσος αριθμός των μορίων είναι Ν=CV. Με όγκο διέγερσης λίτρα, Ν=1 σε συγκέντρωση λίτρα -1, ή 1,7 mμ. Η συμπεριφορά μιας απλής, οπτικώς σημασμένης ουσίας, μπορεί ωστόσο να παρατηρηθεί σε υψηλές συγκεντρώσεις. Εάν το φθορίζον μόριο διαχέεται ελεύθερα στο υγρό, τότε ο χρόνος παραμονής στον όγκο οπτικής διέγερσης υπολογίζεται από το συντελεστή διάχυσης του μορίου. Παρατηρώντας το συγκεκριμένο χρόνο για μεμονωμένα μόρια, είναι δυνατός ο υπολογισμός της συγκέντρωσης ουσιών με διαφορετικούς συντελεστές διάχυσης. Η συγκεκριμένη εφαρμογή μπορεί να χρησιμοποιηθεί, για παράδειγμα, στη μέτρηση του βαθμού ολιγομερισμού ενός βιοπολυμερούς. Οι διαφορές στον πρόσκαιρο φθορισμό είναι περισσότερο σαφείς σε περιπτώσεις όπου το μόριο είναι σταθερά προσδεδεμένο, όπως έχει παρατηρηθεί κατά την ενζυματική σύνθεση δίκλωνου DNA από την DNA πολυμεράση. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, τα μη προσδεδεμένα φθορίζοντα μόρια φθορίζουν μόνον παροδικά κατά τη διαχεόμενη κίνηση τους διαμέσου της περιοχής διέγερσης. Τα προσδεδεμένα μόρια είναι φθορίζοντα για χρόνους οι οποίοι περιορίζονται με διαδικασίες τερματισμού του φθορισμού. Με μια συστοιχία, ένας μεγάλος αριθμός ανεξάρτητων όγκων παρατήρησης (independent observation volumes) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρατήρηση ενζυματικών ή άλλων, οπτικά ευδιάκριτων χημικών γεγονότων. Διατάξεις οι οποίες αποτελούνται από πόρους νανοκλίμακας σε μια ηλεκτρικά μονωτική στοιβάδα χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές μοριακής δομής. Στις συγκεκριμένες διατάξεις, το ρεύμα ιόντων ελαττώνεται καθώς περνάει μέσω του στενού πόρου, παρουσία ενός μεγάλου βιοπολυμερούς μορίου όπως το DNA. Μεμβρανικές πρωτεΐνες οι οποίες απαντούν φυσικά, όπως είναι η α-αιμολυσίνη (α-haemolysin) διαθέτουν πόρους με διαστάσεις της τάξης των νανομέτρων. Σχεδιασμένοι πόροι οι οποίοι κατασκευάζονται με διαβρωτική χάραξη επιφανείας, μπορούν να σχηματίσουν παρόμοιες οπές σε μια μονωτική μεμβράνη. Όταν το DNA σε διάλυμα καθοδηγείται ηλεκτρικά διαμέσου ενός τέτοιου πόρου, η παρουσία του DNA επηρεάζει τη δίοδο άλλων ιόντων του διαλύματος διαμέσου του στενού πόρου, και η διάβαση του DNA μπορεί να ανιχνευθεί από τις αλλαγές του μετρούμενου ρεύματος διαμέσου του πόρου. Στην απλούστερη περίπτωση, εάν η ηλεκτρικά υποκινούμενη ταχύτητα του μορίου είναι γνωστή, είναι δυνατόν από τον χρόνο διάβασης να εξαχθεί συμπέρασμα για το μήκος του μορίου DNA. Διακεκριμένες διαφορές στα επίπεδα του ρεύματος παρατηρούνται για ένα μονόκλωνο, δίκλωνο, τρίκλωνο κ.ο.κ. μόριο DNA που περνάει διαμέσου του πόρου. Εξαιτίας της ισχυρής ώθησης για γρήγορο γενετικό προσδιορισμό της αλληλουχίας ή για ανάλυση, καταβάλλονται προσπάθειες για ταυτοποίηση των βάσεων του DNA με τη βοήθεια διαφοροποίησης της διαλυτότητας κατά τη δίοδο τους από τον πόρο, αλλά οι απαιτήσεις διαλυτοποίησης, η αναλογία σήματος/ θόρυβο και οι πολύ μικρές διαφορές του ηλεκτρικού σήματος για τις διάφορες βάσεις καθιστά ιδιαίτερα δύσκολο το συγκεκριμένο έργο. Οι νανοπόροι, ωστόσο, είναι απλοί αλλά ισχυροί βιοφυσικοί ανιχνευτές μορίων και ένα μέσο για την παρατήρηση και τον έλεγχο των δυνάμεων επί των βιοπολυμερών σε υγρό. 10

11 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 Οπτική ανάλυση μεμονωμένων μορίων σε ρέοντα συστήματα a c. Οι οπτικές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί για την παρατήρηση, την ανίχνευση, την ανάλυση και την ποσοτικοποίηση μεμονωμένων μορίων. Σημαδεύοντας το μόριο που μας ενδιαφέρει με ένα φθορίζον μόριο ή με ένα σωματίδιο ημιαγωγό φωταύγειας επιτυγχάνεται ο εντοπισμός και η ανίχνευση αυτού με οπτικό μικροσκόπιο. Συνδυάζοντας επισήμανση με χημικά εξειδικευμένη δέσμευση, καθίσταται δυνατή η ταυτοποίηση συγκεκριμένης ομάδας μορίων. Η εξειδικευμένη επισήμανση με φθορισμό χρησιμοποιείται στις απεικονιστικές τεχνικές (imaging) και στις ανοσοδοκιμασίες. Επιπρόσθετα με τη χημική ταυτοποίηση, οι μέθοδοι των μεμονωμένων μορίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση άλλων χαρακτηριστικών ενός μορίου, όπως είναι η ταχύτητα διάχυσης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα, ή η ταχύτητα διέλευσης μέσω πορώδους υλικού. Σε κατάλληλα συστήματα, η προσέγγιση των μεμονωμένων μορίων μας εφοδιάζει με μοναδικές δυνατότητες ταυτοποίησης σε περιορισμένα δείγματα, όπως είναι αυτά ενός εξατομικευμένου μορίου. Επιπρόσθετα με τη χημική ταυτοποίηση, η ανάλυση μεμονωμένων μορίων δύναται να χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή γενετικών πληροφοριών από την αλληλουχία των νουκλεϊνικών οξέων. Μια ομάδα τεχνικών έχει αναπτυχθεί για την ανάλυση μεμονωμένων μορίων, με στόχο την ταχύτερη γενετική ανάλυση ή ανάλυση της έκφρασης του RNA. Οι οπτικές προσεγγίσεις επιτρέπουν στα μόρια ενδιαφέροντος να ανιχνευτούν με επισήμανση, αλλά πρέπει να συνδυαστούν με συστήματα μικροροής τα οποία θα μεταφέρουν τα μόρια στα οπτικά αναλυτικά συστήματα. Οι συνεστιακές, οπτικές προσεγγίσεις παρέχουν μια άμεση μέθοδο για τη διέγερση και την ανίχνευση του φθορισμού από ένα σύστημα μικροροής. Ένα βασικό σύστημα παρουσιάζεται στο Σχήμα 1. Πρόσφατες μελέτες τείνουν να χρησιμοποιούν μικροσκόπια μεγάλης κλίμακας, lasers και ανιχνευτές εξαιτίας της διαθεσιμότητας αυτών των συστημάτων. Ωστόσο, θα πρέπει να γίνει ξεκάθαρο ότι το μέγεθος των οπτικών συστημάτων θα μπορούσε να μειωθεί σε περισσότερο ολοκληρωμένα και λειτουργικά chip. Μια εφαρμογή είναι η μέτρηση μεμονωμένων μορίων καθώς αυτά περνούν από μια συγκεκριμένη περιοχή. Τα μόρια επισημαίνονται ώστε να είναι φασματικά αναγνωρίσιμα και η ακριβής συγκέντρωση υπολογίζεται με απευθείας μέτρηση του αριθμού κάθε ομάδας μορίων. Δεδομένου ότι ο λόγος σήμα/θόρυβο είναι ιδιαίτερα σημαντικός, είναι επιθυμητή η ελάττωση του όγκου της διέγερσης προκειμένου να μειωθεί το υπόβαθρο από τη σκέδαση ή τον φυσικό φθορισμό των μη επισημασμένων μορίων Σχήμα 1. Σύστημα καναλιού ροής για οπτική μέτρηση εξατομικευμένου μορίου. a. Σχήμα καναλιού ροής με οπτική διέγερση και όγκο ανίχνευσης. b. Σχήμα του οπτικού set-up/ c. Εικόνα 15 παράλληλων καναλιών ροής με περισταλτική (constricted) περιοχή ανάλυσης (κέντρο). στον όγκο της διέγερσης. Αυτό ωθεί στον περιορισμό της διέγερσης μειώνοντας είτε το μέγεθος του οπτικού φωτισμού είτε το φυσικό μέγεθος του καναλιού. Ελαττώνοντας την οπτική διέγερση κάτω από το πλάτος του καναλιού μειώνεται η αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης και είναι πιθανόν να μην ανιχνευτούν όλα τα μόρια του διαλύματος. Μειώνοντας το φυσικό μέγεθος του καναλιού βελτιώνεται η αναλογία οπτικό σήμα/θόρυβο, και αυξάνεται η αλληλεπίδραση με τις επιφάνειες του καναλιού. Το βέλτιστο, σε κάθε περίπτωση, υπαγορεύεται από τη φύση της ανάλυσης που πρόκειται να διεξαχθεί, συμπεριλαμβανομένων του εύρους συγκεντρώσεων των μορίων, του όγκου των δειγμάτων και της ισχύος των επιφανειακών αλληλεπιδράσεων. Οι προσεγγίσεις μεμονωμένων μορίων καθιστούν δυνατή την ανίχνευση γεγονότων απλής δέσμευσης, επιπρόσθετα με την απλή μέτρηση διαφοροποιημένα επισημασμένων ειδών. Για παράδειγμα, μεμονωμένα γεγονότα δέσμευσης μπορούν να ανιχνευτούν με ταυτόχρονη ανίχνευση του φθορισμού από δύο διαφορετικά επισημασμένα μόρια. Η επισήμανση μπορεί να πραγματοποιηθεί με ζευγάρια μορίων στα οποία η ενέργεια της διέγερσης μεταφέρεται από τον δότη προς τον δέκτη κατά τη διαδικασία FRET. Σε αυτήν την περίπτωση, η εκπομπή παρατηρείται μόνον όταν λαμβάνει χώρα και η δέσμευση, ώστε ο δότης και ο δέκτης να πλησιάσουν μεταξύ τους. Σε ένα σύστημα μικροροής στο οποίο το μόριο που μας ενδιαφέρει έχει φορτίο και χρησιμοποιείται ηλεκτρικό πεδίο για τη μετακίνηση του μορίου, είναι δυνατός ο προσδιορισμός της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας με μέτρηση του χρόνου διάβασης μέσω ενός καναλιού γνωστού μήκους. Αλλαγές στην κινητικότητα θα μπορούσαν να υποδείξουν τη διαφορά μεταξύ ενός b. 11

12 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ μη δεσμευμένου επισημασμένου μορίου και ενός επισημασμένου μορίου δεσμευμένου σε πρωτεΐνη. Ο συνδυασμός συστημάτων μικροροής και υγρών συστημάτων καθοδηγούμενων ηλεκτρικά ή με πίεση δημιουργούν πιθανότητες ολοκληρωμένου σχεδιασμού. Ο παραλληλισμός πολλών υγρών και οπτικών καναλιών θα μπορούσε να σχεδιαστεί με μοντέρνα οπτικοηλεκτρονική τεχνολογία. Επιπρόσθετα με τη μέτρηση και τον προσδιορισμό της χημικής ταυτότητας των μορίων από την εξειδικευμένη χημική δέσμευση, είναι δυνατή η έρευνα των φυσικών ιδιοτήτων και της διαμόρφωσης των μεμονωμένων μορίων σε συστήματα νανοροής. Ένας αριθμός από μελέτες έχει πραγματοποιηθεί για τον διαχωρισμό των μορίων του DNA κατά μέγεθος σε νανοδομές. Μετά από τη δράση κατάλληλων περιοριστικών ενζύμων (association with restriction digests), το μέγεθος των θραυσμάτων DNA εμπεριέχει πληροφορίες για την αλληλουχία στο αρχικό μόριο DNA. Ταχεία μέτρηση του μεγέθους των θραυσμάτων DNA παρουσιάστηκε σε μια σειρά νανοδομών με διαστάσεις μικρότερες αυτής της ακτίνας περιστροφής του μορίου DNA σε διάλυμα. Στις λεγόμενες εντροπικές παγίδες, η ταχύτητα με την οποία ένα μόριο μπορούσε να εισχωρήσει στον πόρο (constriction) ήταν εξαρτώμενη από το μήκος και αυτή η παράμετρος χρησιμοποιήθηκε για να διαχωρίσει τις μπάντες του DNA σε ηλεκτροφορητικά καθοδηγούμενα κανάλια μικροροής με πόρους νανοκλίμακας. Ο διαχωρισμός ήταν περισσότερο ταχύς από αυτόν που μπορούσε να επιτευχθεί με τις συμβατικές-βασιζόμενες σε τζελ-τεχνικές. Εξαιτίας ενδιαφέροντος στις βασικές αλληλουχίες, τα μόρια DNA, RNA αντιπροσωπεύουν σημαντικούς στόχους για τις μελέτες μεμονωμένων μορίων, αλλά οι ίδιες ιδέες και οι φυσικές μέθοδοι των χαρακτηριζόμενων βιομορίων έχουν επεκταθεί στις πρωτεΐνες και σε άλλες ενώσεις. Σε περιπτώσεις όπου οι χημικές διαφορές συνοδεύουν τις φυσικές διαφορές, η κατάσταση είναι περισσότερο πολύπλοκη, περιπλέκοντας την εξήγηση των φαινομένων της ανάλυσης. Ωστόσο, η προσέγγιση της ανάλυσης, συνδυάζοντας συστήματα μικροροής, δομές νανοκλίμακας και οπτική ανίχνευση, δημιουργεί ένα εύρος ευκαιριών για μοριακή ανάλυση. Προοπτικές για τα λειτουργικά ολοκληρωμένα συστήματα Τα σημερινά ερευνητικά chip περιλαμβάνουν απλές δομές, σαν αυτές που είδαμε ανωτέρω, όπως είναι οι δύο-διαστάσεων συστοιχίες οπών ή οι θάλαμοι αντίδρασης για την απομόνωση μεμονωμένων μορίων για μελέτη. Σε αυτές τις απλές διατάξεις μπορούν να φανούν τα πλεονεκτήματα της ογκώδους και παράλληλης αντιγραφής ταυτόσημων μονάδων με 10 5, 10 6 ή περισσότερες μεμονωμένες αντιδράσεις ή περιοχές παρατήρησης. Οι πρόοδοι σε αυτόν τον τομέα είναι σημαντικές για τον προσδιορισμό της χρησιμότητας των lab-on-a-chip διατάξεων. Οι ευκαιρίες για την ανάλυση μεμονωμένων μορίων περιλαμβάνουν την ικανότητα χαρακτηρισμού μικρών όγκων σύνθετων μιγμάτων. Η ικανότητα χαρακτηρισμού των διαφορών σε πληθυσμούς κυττάρων θα μπορούσε να έχει μεγάλη πρόοδο με τη βοήθεια των lab-on-a-chip τα οποία θα μπορούσαν να μετρήσουν ταχέως τα επίπεδα μιας ομάδας πρωτεϊνών που μας ενδιαφέρουν σε ένα επιλεγμένο κύτταρο σε συγκεκριμένο χρόνο. Όπως τονίστηκε, η ικανότητα χειρισμού των κυττάρων αναπτύχθηκε με τεχνικές οι οποίες θα μπορούσαν να βοηθήσουν στην ανάλυση της λειτουργίας των συγκεκριμένων κυττάρων. Με παρόμοιο τρόπο, θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί ταχεία ανίχνευση της έκφρασης του RNA με αυτά τα συστήματα. Η ικανότητα για ευαίσθητη και ταχεία ανάλυση του σύνθετου χημικού περιεχομένου των βιολογικών υγρών δημιουργούν νέες ιατρικές, διαγνωστικές προσεγγίσεις οι οποίες θα μπορούσαν να ταυτοποιήσουν τους δείκτες μιας ασθένειας σε ένα στάδιο αυτής όπου η θεραπεία θα ήταν περισσότερο αποτελεσματική. Ο στόχος για ουσιώδη, περισσότερο ταχεία και φθηνή ανάλυση της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος είναι πλέον γεγονός. Ένα πλήθος προσεγγίσεων προς αυτόν το στόχο έχει μελετηθεί. Ο συνδυασμός της καλύτερης κατανόησης της φυσικής των βιοπολυμερών και η ικανότητα ολοκλήρωσης των ρευστών παρουσιάζει νέες ευκαιρίες και κατευθύνσεις έρευνας. Μια πολύτιμη διάταξη θα επέτρεπε ταχεία, λιγότερο παρεμβατική ανάλυση των βιολογικών υγρών και παρακολούθηση της θεραπείας. Ένα πλήθος τεχνολογιών κατευθύνεται προς αυτόν το στόχο. Οι lab-on-a-chip μέθοδοι, και ειδικότερα οι προσεγγίσεις των μεμονωμένων μορίων, θα μπορούσαν μακροπρόθεσμα να καταστήσουν ικανή την κατασκευή λειτουργικών διατάξεων για εξειδικευμένους διαγνωστικούς στόχους. Σημείωση της σύνταξης Δεν γνωρίζουμε αν ασχολείται κάποιος στην Ελλάδα με το lab-on a chip. Αν έχετε κάτι υπ όψη σας παρακαλούμε να μας ενημερώσετε για να έρθουμε σε επαφή με όσους ενδεχομένως ασχολούνται. Όσο για τη δυσκολία του θέματος αυτό είναι το μέλλον, δύσκολο, δυσνόητο, γοητευτικό. 12

13 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 Ανίχνευση σημειακών πολυμορφισμών DNA (SNPs) με μικροσυστοιχίες και τεχνική MALDI-TOF MS Ε. Ρηνώτα Χημικός, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια εξειδίκευσης στην Κλινική Χημεία Εισαγωγή Η έρευνα για το DNA έχει διανύσει έναν μακρύ δρόμο τα τελευταία 50 χρόνια. Η ανάλυση ενός μορίου DNA με ακτίνες Χ καθώς και η ανεύρεση του δομικού μοντέλου του DNA με τις δύο αλυσίδες και την ελικοειδή του φύση, δημιούργησε τις βάσεις για υψηλά εγχειρήματα όπως το ερευνητικό έργο για εύρεση της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος, το οποίο τώρα ολοκληρώθηκε. Η προσοχή τώρα επικεντρώνεται στη διασαφήνιση της λειτουργίας και ρύθμισης των γονιδίων. Η κατανόηση των γενετικών βάσεων των ανθρώπινων παραλλαγών είναι ένας ζωτικός στόχος στη βιοϊατρική έρευνα. Μεταβολές της αλληλουχίας των γονιδίων, των επιπέδων έκφρασης και των πρωτεϊνικών δομών και λειτουργιών έχουν συσχετισθεί με πολλούς τύπους ασθενειών. Στη σύγχρονη εποχή, η έρευνα επικεντρώθηκε στους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Εξαιτίας της διττής φύσης τους, οι SNPs είναι αρκετά εύκολο να γονοτυπηθούν και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων μπορεί να γίνει αυτόματα. Οι διάφορες προσεγγίσεις μεθόδων γονοτύπωσης των SNPs οφείλουν να εκπληρώνουν κριτήρια όπως η ακρίβεια της ανίχνευσης SNP, η ευαισθησία στην αναγνώριση SNPs χρησιμοποιώντας πολύ μικρό αριθμό αντιγράφων, η αναλυτική ικανότητα εξαγωγής αποτελεσμάτων, η ευελιξία της διαδικασίας και το κόστος λειτουργίας. Οι μέθοδοι γονοτύπωσης που βασίζονται στην τεχνική φασματομετρία μαζών MALDI-TOF είναι ανάμεσα στις πιο ισχυρές και αξιόπιστες. Στην παρούσα εργασία θα μελετηθεί η εφαρμογή της τεχνικής της φασματομετρίας μαζών MALDI σε μικροσυστοιχίες για την εύρεση του γονότυπου των SNPs. Γονοτύπωση των σημειακών πολυμορφισμών (SNPs) Ένας μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός ή SNP είναι μια μικρή γενετική αλλαγή ή παραλλαγή, που μπορεί να εμφανισθεί στην DNA αλληλουχία. Οι παραλλαγές SNP παρατηρούνται όταν ένα νουκλεοτίδιο αντικαθιστά ένα από τα άλλα τρία. Για παράδειγμα, όταν στο α) β) ACGTGTCAGTCTTAGCTACGGATTACGT TGCACAGTCAGAATCGATGCCTAATGCA ACGTGTCAGTCTTCGCTACGGATTACGT TGCACAGTCAGAAGCGATGCCTAATGCA Σχήμα 1. Τα δύο αλλήλια ενός σημειακού νουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (SNP). ένα άτομο παρατηρείται η αλληλουχία AAGCCTA και στο άλλο AAGCTTA. Σε αυτή την περίπτωση λέμε ότι υπάρχουν δύο αλλήλια: C και T (Σχήμα 1). Παρόλο που προσθήκη ή έλλειμμα μιας βάσης δεν θεωρείται SNP, συχνά περιλαμβάνονται σε αυτό τον ορισμό. Εξ ορισμού το λιγότερο συχνό αλλήλιο έχει συχνότητα εμφάνισης 1% ή μεγαλύτερη, διαφορετικά αναφέρεται ως μετάλλαξη. Κατά μέσο όρο, ένα SNP βρίσκεται σε κάθε βάσεις στους ανθρώπους. Μόνο ένα μικρό μέρος αυτών βρίσκεται στις κωδικοποιούσες περιοχές (csnps), και ένα ακόμα μικρότερο ποσοστό είναι υπεύθυνο για αλλαγές αμινοξέων σε εκφραζόμενες πρωτεΐνες. Ωστόσο, SNPs σε μη κωδικοποιούσες περιοχές μπορούν επίσης να επηρεάσουν την ρύθμιση του γονιδίου κυρίως στο μάτισμα του γονιδίου, στη δέσμευση του παράγοντα μεταγραφής, ή στην αλληλουχία του μη κωδικοποιούντος RNA. Καθώς το μεγαλύτερο μέρος του DNA δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνες, η μεγάλη πλειονότητα των SNPs δεν έχουν καμία επίδραση στη λειτουργία του οργανισμού και χαρακτηρίζονται ως «σιωπηρές μεταλλάξεις». Ωστόσο, έχει πλέον βρεθεί ότι συγκεκριμένα SNPs σε ένα αλλήλιο ενός γονιδίου προκαλούν σοβαρό πρόβλημα υγείας ή «μονογονιδιακή ασθένεια». Πολλές από αυτές τις ασθένειες έχουν χαρακτηριστεί στους ανθρώπους. Αυτές οι ασθένειες είναι συνήθως σπάνιες αλλά πολύ σοβαρές, για παράδειγμα η κυστική ίνωση που προκαλείται από μετάλλαξη στο CFTR γονίδιο στο χρωμόσωμα 7. Πολλές κοινές ασθένειες όπως τα καρδιαγγειακά νοσήματα και ο καρκίνος είναι γενετικά πολύπλοκες, όπου αλλήλια από πολλά γονίδια συνεισφέρουν στην ασθένεια αυτή. Τα αλλήλια δεν προκαλούν πάντα την ασθένεια, αλλά μπορούν να αλληλεπιδράσουν με το περιβάλλον του ατόμου και με άλλα αλλήλια και να την προκαλέσουν. Η παραλλαγή των περισσότερων SNPs είναι «σιωπηλή» - κανένα αλλήλιο δεν παρέχει έναν ορατό φαινότυπο. 13

14 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Μερικά SNPs, ωστόσο, δεν είναι σιωπηλά, μας κάνουν γενετικά μοναδικούς. Διαφορές στη φυσική εμφάνιση, στην προδιάθεση για μία ασθένεια, στην απόκριση στα φάρμακα, και πολλές άλλες ιδιότητες είναι συχνά τα αποτελέσματα των παραλλαγών SNP. Καθώς τα SNPs είναι εξελικτικά σταθερά (δεν αλλάζουν πολύ από γενεά σε γενεά) τα κάνει να μπορούν να μελετηθούν πιο εύκολα σε μελέτες πληθυσμών. Γι αυτό το λόγο, οι επιστήμονες πιστεύουν ότι χάρτες με SNPs θα τους βοηθήσουν να προσδιορίσουν τον πολλαπλό συσχετισμό των γονιδίων με πολύπλοκες ασθένειες όπως καρκίνος, διαβήτης, αγγειακές και μερικές μορφές νοητικών ασθενειών. Έτσι, με σκοπό να προσδιοριστεί ο γονότυπος 10 6 ή περισσότερων διαφορετικών αλληλουχιών (SNPs), οι συχνότητές τους και ο βαθμός συσχετισμού μεταξύ τους δημιουργήθηκε το Hap Map Project, μια διεθνής συνεργασία μεταξύ των επιστημόνων. Κύρια μέριμνα αυτού του προγράμματος είναι να αναπτύξει ένα εργαλείο έρευνας που θα βοηθήσει τους ερευνητές σε όλο τον κόσμο να ανακαλύψουν τους γενετικούς παράγοντες που συμβάλλουν στην ευαισθησία για μια ασθένεια, στην προστασία ενάντια στις νόσους και στην απόκριση σε θεραπεία. Καθώς τα SNPs συνδέθηκαν με την εμφάνιση πολλών ασθενειών η ανάγκη για καταγραφή τους έγινε επιτακτική. Έτσι, αναπτύχθηκαν πολλές τεχνικές γονοτύπωσης των SNPs και διαφοροποιήθηκαν ως προς δύο κύριες προσεγγίσεις: Η πρώτη προσέγγιση είναι να αναπτυχθούν τεχνικές που είναι απλές και εύκολες να εφαρμοστούν (Real time PCR, Δυναμικός Ειδικός Υβριδισμός Αλληλίου DASH, Pyrosequencing, TDI). Όλες οι παραπάνω δοκιμασίες έχουν ως κοινό στοιχείο, το γεγονός ότι όλες εξαρτώνται από την ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου με PCR. Η δεύτερη προσέγγιση αφορά την πολλαπλή καταγραφή SNPs για κάθε δείγμα (Minisequencing). Εφαρμογή της τεχνικής φασματομετρίας μαζών MALDI-TOF στην καταγραφή και ταυτοποίηση SNPS Η φασματομετρία μαζών MALDI αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο στις βιοχημικές αναλύσεις με ένα ευρύ φάσμα δυνατοτήτων εφαρμογής, συμπεριλαμβανομένης της γονοτύπωσης SNPs για μελέτες υποψήφιων γονιδίων και για διαγνωστική αποτύπωση των δεικτών DNA. Μια τελευταία προσέγγιση στην ανάλυση με MALDI επιτρέπει την ανάλυση ακατέργαστου δείγματος DNA που αποτυπώνεται σε διαφάνειες μικροσκοπίου επικαλυμμένες με πρωτοταγείς αμινομάδες, οι οποίες προσδένονται αποτελεσματικά με το αρνητικά φορτισμένο DNA. Μετά από απλό πλύσιμο των διαφανειών προστίθεται η μήτρα για MALDI και χρησιμοποιείται ένα συμβατικό φασματόμετρο μάζας MALDI για την ανίχνευση των προϊόντων DNA. Τα βασικά στάδια της μεθόδου αυτής είναι (Σχήμα 2): 1. PCR 2. Επέκταση ειδικών εκκινητών 3. Εφαρμογή μικροσυστοιχιών 4. MALDI-TOF φασματομετρία μαζών Σχήμα 2. Σχηματική παράσταση των βασικών σταδίων της μεθόδου. Πειραματική πορεία PCR Για να είναι δυνατόν να εντοπιστεί ένας σημειακός νουκλεοτιδικός πολυμορφισμός (SNP) είναι απαραίτητο να είναι διαθέσιμη μόνο η περιοχή του DNA που βρίσκεται γύρω από το SNP, αλλά παράλληλα να υπάρχει μεγάλος αριθμός αντιγράφων ώστε να είναι πιο εύκολη και αξιόπιστη η ανίχνευση του. Αυτό επιτυγχάνεται με την χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Για να επιτευχθεί καλύτερη ευαισθησία, εξειδίκευση και απόδοση σε μια αντίδραση PCR πρέπει να βελτιστοποιηθούν οι παράγοντες: 1. δείγμα DNA 2. DNA πολυμεράση 3. επιλογή εκκινητών 4. θερμοκρασία υβριδίωσης εκκινητών συγκέντρωση ιόντων Mg 6. συγκέντρωση τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών 7. παρουσία ενισχυτών και αναστολέων 8. αριθμός κύκλων. 14

15 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 Επέκταση ειδικών εκκινητών Αφού προστέθηκε SAP (Shrimp alkaline phosphatase, αλκαλική φωσφατάση γαρίδων) για την πέψη των ολιγονουκλεοτιδίων που δεν χρησιμοποιήθηκαν, τοποθετήθηκε στο διάλυμα της PCR ένας ειδικός για συγκεκριμένο σημειακό πολυμορφισμό εκκινητής (Πίνακας 1), TermiPol DNA πολυμεράση, διδεόξυ-ctp, διδεόξυ-gtp και δεόξυ- ΤΤP. Το αρχικό στάδιο αποδιάταξης ακολουθήθηκε από 35 κύκλους. Το προϊόν μεταφέρεται στη συνέχεια στις μικροσυστοιχίες DNA όπου θα γίνει καθαρισμός του δείγματος πριν την ανάλυση με MALDI. Μικροσυστοιχίες DNA Το DNA και η προετοιμασία της μήτρας είναι σημαντικά στην τεχνολογία MALDI, αλλά μπορούν να περιορίσουν αυστηρά την ένταση και τη διαχωριστική ικανότητά της, διότι τα πολλαπλά αρνητικά φορτισμένα πολυανιόντα του DNA σχηματίζουν παράγωγα αλάτων με τα κατιόντα που χρησιμοποιούνται στα κοινά ρυθμιστικά διαλύματα αντίδρασης. Ωστόσο, ούτε τα καθαριστικά είναι συμβατά με την κρυσταλλοποίηση της μήτρας στην MALDI ανάλυση. Επομένως, πρέπει να πραγματοποιηθεί αυστηρός καθαρισμός του DNA, που μπορεί να είναι χρονοβόρος και δαπανηρός, πριν το δείγμα μεταφερθεί στον στόχο MALDI. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν μικροσυστοιχίες DNA. Οι μικροσυστοιχίες είναι μικροσκοπικές αναλυτικές διατάξεις οι οποίες περιέχουν ομάδες βιομορίων (ολιγονουκλεοτιδίων, cdnas, αντισωμάτων) τα οποία έχουν τοποθετηθεί με τη βοήθεια ρομπότ ή έχουν συντεθεί in situ σε κάποιο στερεό υπόστρωμα (γυαλί, επικαλυμμένο γυαλί, πυρίτιο, πλαστικό κ.τ.λ.) με τέτοιο τρόπο, ώστε η ταυτότητα κάθε βιομορίου να καθορίζεται από τη θέση του. Στα βιομόρια, που είναι συνήθως ακινητοποιημένα στις μικροσυστοιχίες, περιλαμβάνονται τα ολιγονουκλεοτίδια, προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης, πρωτεΐνες, λιπίδια, πεπτίδια και υδατάνθρακες. Για καλύτερα αποτελέσματα, τα ακινητοποιημένα βιομόρια πρέπει να διατηρούν την ενεργότητά τους, να παραμένουν σταθερά και να μην απομακρύνονται και αποκολλώνται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και τα στάδια πλυσίματος. Η διαδικασία ακινητοποίησης πρέπει να εξασφαλίζει ότι τα βιομόρια έχουν ακινητοποιηθεί σε βέλτιστη πυκνότητα στις επιφάνειες των μικροσυστοιχιών για ικανοποιητική σύνδεση. Ελαττωμένος αυτοφθορισμός και μηδαμινή μη ειδική σύνδεση των βιομορίων στις επιφάνειες είναι επίσης σημαντικά κριτήρια για δημιουργία υψηλής ποιότητας συστοιχιών. Βασιζόμενοι στην τεχνική δημιουργίας της μικροσυστοιχίας, οι επίπεδες μικροσυστοιχίες μπορούν να ταξινομηθούν σε αυτές που η αλληλουχία στόχος εναποτίθεται απευθείας στη θέση ενδιαφέροντος και σε αυτές με άμεση απόθεση των βιομορίων σε γυαλί, μεμβράνη ή άλλες παράγωγες επιφάνειες από μικροαποτύπωση ή τεχνολογία ink-jetting. Η σημαντικότερη εξ αυτών και η πιο κοινή είναι του τύπου Affymetrix (in situ σύνθεση). Στην ανάλυση με την τεχνική MALDI-TOF μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο χρυσές επιφάνειες, διότι υποστρώματα όπως το PANAM δενδρομερές εύκολα «ζευγαρώνουν» με τις χρυσές επιφάνειες με τη χρήση θειολοχημείας και παρέχουν υψηλής πυκνότητας θετικά φορτισμένων λειτουργικών αμινομάδων που απαιτούνται για δέσμευση των ολιγονουκλεοτιδίων κατά τη διάρκεια του καθαρισμού. Η διαδικασία αποφεύγει ογκώδη καθαρισμό δειγμάτων νουκλεϊκών οξέων πριν την προετοιμασία των στόχων Πίνακας 1. Εκκινητές για PCR και για επέκταση εκκινητών συγκεκριμένων πολυμορφισμών. SNP Εκκινητές για PCR Εκκινητές για επέκταση OPRM1, IVS+691 OPRM1, rs OPRM1, rs OPRM1, rs OPRM1, rs OPRM1, rs OPRM1, rs GAGTGATGTTACCAGCCTGA AAGGAAAAATTAGCAGCAACA TGTGATGGGTGCTCTAGACAAA GAAACCTGCAATACTTGCTGAA AAGCTCTAAAACATGGAAAGGAAA TCATGCAATGAAGGGGTCTTAT TTTTCTGCATGAAGGACACATT CCAATTTCAGTGGCCTTGGATC TAGCTGAAATGTTCCACTACACTG TCTCCCATTTGGATTCCTTGCG ATTCCAAGTCAGAAGACAACTCC TGATGACTGTTTTCCATCCAAGA GTCCCCAAGCTCCAGAACACAA AGAGGTCACCAGTGGTTCAAGC GGTGTTAATACTGCCATTTTGCTLptAptTptT GATATATGGCATTTCACATTCACALptGptTptA GCCTAAAATTGAATGGCTCTALptGptAptC GCAGAGAATGACAACCTGGAATLptTptTptA CTGAGAGCTAATGTTTCAAAGAALptCptTptT TCCTTACAAATGCTATTGLptGptTptT AATGTGATATTTTAAAGGGLptCptCptT 15

16 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ MALDI, γεγονός που επιτρέπει ικανοποιητικό καθαρισμό του DNA και ανίχνευση με MALDI στην ίδια συσκευή. Τεχνική MALDI TOF MS Για την ανάλυση MALDI-TOF MS τα μόρια νουκλεϊκών οξέων μήκους 3-29 βάσεων ( Dalton) χρειάζεται να παραχθούν και να αποτεθούν σε μια μήτρα (π.χ. 3-υδρόξυ-πικολινικό οξύ). Το σύστημα αναλύτη και μήτρας τότε ακτινοβολείται με laser προκαλώντας εκρόφηση και ιονισμό. Μετά από αυτό, τα μόρια περνάνε μέσω ενός αγωγού πτήσης σε έναν ανιχνευτή στην άλλη πλευρά. Ο διαχωρισμός γίνεται βάσει του χρόνου πτήσης που είναι ανάλογος της μάζας του κάθε μορίου. Το κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι μετράει απευθείας μια εσωτερική φυσική ιδιότητα των μορίων, δηλαδή τη μάζα τους, και με πολύ γρήγορη ταχύτητα (περίπου 100 μs). Περιορισμοί υφίστανται στο μέγεθος των μορίων DNA που μπορούν να ανιχνευτούν άθικτα σε λιγότερο από 100 βάσεις (εξαιτίας της εξάρτησης του θρυμματισμού κατά την διάρκεια της διαδικασίας MALDI από το μέγεθος), και στο γεγονός ότι οι αναλύτες πρέπει να είναι ελεύθεροι από ιόντα που φέρουν μαζί τους τα οποία οδηγούν σε παραποίηση της μάζας. H MALDI MS βασίζεται στον βομβαρδισμό του μοριακού δείγματος με δέσμη laser ώστε να επέλθει ιονισμός του δείγματος. Το δείγμα έχει προ-αναμιχθεί με μία υψηλά απορροφούσα ένωση-μήτρα για πιο συνεπή και αξιόπιστα αποτελέσματα. Η μήτρα μετασχηματίζει την ενέργεια Σχήμα 3. Σχήμα 4. Σχηματική αναπαράσταση φασματόμετρου MALDI και καταγράφημα που προκύπτει από αυτό. του laser σε ενέργεια διέγερσης για το δείγμα, το οποίο οδηγεί σε sputtering του αναλύτη και των ιόντων της μήτρας από την επιφάνεια του μίγματος (Σχήμα 3). Με αυτό τον τρόπο, η μεταφορά ενέργειας είναι ικανοποιητική και επίσης τα μόρια του αναλύτη αποφεύγουν υπερβολική άμεση ενέργεια που μπορεί διαφορετικά να προκαλέσει αποσύνθεση. Δεν θα πρέπει να αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι δεν λειτουργούν καλά όλα τα δείγματα με κάθε μήτρα της MALDI ανάλυσης καθώς κάθε πεπτίδιο/πρωτεΐνη έχει μια μοναδική δομή που είναι ανάγκη να ενσωματώνεται σε μια ειδική κρυσταλλική δομή μήτρας. Η κύρια λειτουργία του αναλυτή μάζας είναι να διαχωρίσει ή να ξεκαθαρίσει τα ιόντα που σχηματίστηκαν στην πηγή ιονισμού του φασματόμετρου μάζας σύμφωνα με τον λόγο μάζας προς φορτίο. Οι TOF αναλυτές είναι οι πιο διαδεδομένοι λόγω του απλού σχεδιασμού του οργάνου. Τα φασματόμετρα μάζας TOF στηρίζονται στην αρχή ότι όταν μία προσωρινή και κατά διαστήματα καλά προσδιορισμένη ομάδα από ιόντα διαφορετικού λόγου μάζα προς φορτίο εκτίθενται στο ίδιο ηλεκτρικό πεδίο και τους επιτρέπεται να κινηθούν σε μία περιοχή συνεχούς ηλεκτρικού πεδίου, θα διασχίσουν αυτή την περιοχή σε χρόνο που εξαρτάται από τον λόγο μάζα προς φορτίο. Τα ιόντα που έχουν σχηματιστεί με την εφαρμογή ενός γρήγορου παλμού ιοντισμού στη συνέχεια εισέρχονται σε παλμικό ηλεκτρικό πεδίο 10 3 έως 10 4 ίδιας συχνότητας με τον παλμό που προκαλεί τον ιοντισμό. Τα επιταχυνόμενα σωματίδια διέρχονται μέσω ενός σωλήνα πορείας (drift tube), ο οποίος είναι απαλλαγμένος από πεδία και έχει μήκος περίπου ενός μέτρου, στον οποίο τα ελαφρύτερα ιόντα θα μετακινηθούν γρηγορότερα. Οι αναλύτες TOF-MS είναι οι πιο διαδεδομένοι διότι: Τα όργανα είναι πολύ απλά φασματόμετρα μάζας που χρησιμοποιούν σταθερές τάσεις και δεν απαιτούν μαγνητικό πεδίο Θεωρητικά έχουν άπειρο εύρος τιμών ανιχνευόμενων μαζών Είναι ιδανικά όπου έχουμε ιονισμό προκαλούμενο από παλμό ή όταν αυτός είναι χωροταξικά περιορισμένος Ολοκληρωμένο φάσμα μαζών για κάθε περίπτωση ιονισμού Υψηλή ακρίβεια λόγω υψηλής ταχύτητας μετάβασης ιόντων προς τον ανιχνευτή Δεν υπάρχει ανάγκη σάρωσης της ακτίνας ιόντων. Τελικά τα ιόντα ανιχνεύονται από έναν μεταλλάκτη ο οποίος συνδέεται με έναν παλμογράφο στην οθόνη του οποίου εμφανίζεται σχεδόν ακαριαία το φάσμα μαζών. Οι τυπικοί χρόνοι πτήσης είναι της τάξης των μs και για τον λόγο αυτό η επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων απαιτεί ταχύτατα ηλεκτρονικά κυκλώματα. 16

17 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ Συμπεράσματα - Προοπτικές Η ανάλυση με την τεχνική MALDI των SNPs αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για τη γονοτύπωση των SNPs και μπορεί να αποτελέσει μελλοντικά μέθοδο ρουτίνας στη διαγνωστική ιατρική. Για την ανάλυση, ωστόσο, ευρείας περιοχής γονιδιώματος DNA η προσέγγιση αυτή είναι λιγότερο αποδοτική από την πολύ γρηγορότερη ανίχνευση σε μικροσυστοιχίες που βασίζονται σε φθορισμό. Στο κλινικό διαγνωστικό εργαστήριο, όμως, η μέθοδος μπορεί να διευκολύνει την επαναλαμβανόμενη, καθημερινή και εύκαμπτη ανάλυση ενός περιορισμένου αριθμού (προγνωστικών) σημειακών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών σε αρκετές χιλιάδες δείγματα DNA ανά ημέρα. Για να εφαρμοστεί αποτελεσματικά η μέθοδος, ο χρήστης πρέπει να επιλέξει προσεκτικά ένα γρήγορο και εύκαμπτο ρομποτικό σύστημα καθώς η ρυθμοαπόδοση που μπορεί να επιτευχθεί από τη διαδικασία εξαρτάται από τον χρόνο έκπλυσης των άκρων του συγκεκριμένου ρομπότ που χρησιμοποιείται. Τα άλλα χρονοβόρα βήματα της προσέγγισης αυτής αποτελούν η PCR και οι αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή. Ωστόσο, οι νέοι θερμικοί κυκλοποιητές είναι σε θέση να ολοκληρώσουν 30 κύκλους σε περίπου 20 min. Η χρήση γρήγορων συσκευών PCR καθιστά δυνατή την ολοκλήρωση της διαδικασία, συμπεριλαμβανομένης και της ανάλυσης με MALDI, σε περίπου 2 h. Εν περιλήψει, τα φασματόμετρα μαζών τύπου MALDI έχουν αποδειχθεί ως αποδοτικά και ακριβή όργανα στη διαγνωστική διαδικασία καθώς επίσης και για την ανίχνευση γενετικών παραλλαγών. Επομένως, η φασματομετρία μαζών είναι ιδιαίτερα σημαντική στα κλινικά εργαστήρια που εκτελούν συνήθως την ανάλυση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων. 5. Ε.Σ.Λιανίδου, Τεχνικές Μοριακής Διαγνωστικής, Ε.Κ.Π.Α : 2-7, 76, Sauer S., Lehrach H., Rreinhardt R., MALDI mass spectrometry analysis of single nucleotide polymorphisms by photocleavage and charge-tagging, Nucleic acid Research 2003; 31: No Kohane S.I., Kho T.A., Βufte J.A., Microarrays for an intergrative genomics, Cop.2003: Venkatasubbarao S., Microarrays-status and prospects, Trends in Biotechnology Rev. 2004; 22: Ragoussis J., Elvidge P.G., Kaur K., Colella S., Matrix-assisted Laser Desorption/ Ionisation, Time-of-flight Mass Spectrometry in Genomics Research, PLoS Genetics Rev.2006; 2: Skoog A.D., Holler F.J., Nieman A.T., Αρχές της ενόργανης ανάλυσης, Κωσταράκη Α.Ε., 2002: 310, Sauer S., Typing of single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry: Principles and diagnostic applications, Clinica Chimica acta Rev. 2006; 363: Βιβλιογραφία 1. Tost J., Gut I.G., Genotyping single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry in clinical applications, Clinical Biochemistry Rev. 2005; 38: Tost J., Gut I.G., Genotyping single nucleotide polymorphisms by mass spectrometry, Mass Spectr. Rev. 2002; 21: Brookes J.A., The essence of SNPs, Gene Rev.1999; 234: Kepper P., Reinhardt R., Dahl A., Lehrach H., Sauer S., Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization Mass Spectrometric Analysis of DNA on Microarrays, Clinical Chemistry 2006; 52:

18 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Συσχέτιση του παράγοντα νέκρωσης όγκων με την παχυσαρκία Μαρία Τράπαλη Χημικός, MSc. Κλινικής Χημείας, Ph. D. Βιοχημείας Ο λιπώδης ιστός είναι ο ιστός ο εξειδικευμένος στην αποθήκευση ενέργειας με τη μορφή τριγλυκεριδίων και στην κινητοποίηση ενέργειας με τη μορφή λιπαρών οξέων. Είναι ένας χαλαρός συνδετικός ιστός ο οποίος αποτελείται από λιποκύτταρα που περιβάλλονται από ένα δίκτυο ινών κολλαγόνου, αιμοφόρα αγγεία, ινοβλάστες και ανοσοκύτταρα και λιποβλάστες. Διακρίνονται δύο είδη λιπώδους ιστού: ο λευκός και ο φαιός που διαφέρουν τόσο στις λειτουργίες όσο και στη μορφολογία. Ο φαιός λιπώδης ιστός είναι λιγότερο εκτεταμένος από το λευκό, αλλά έχει πλουσιότερη αγγείωση. Και στους δύο τύπους λιπώδους ιστού απολήγουν νεύρα της συμπαθητικής μοίρας, όμως στον φαιό οι νευρικές απολήξεις είναι περισσότερες. Στον άνθρωπο, υπάρχει μόνο ο λευκός λιπώδης ιστός ο οποίος περιέχει λιποκύτταρα με έκκεντρο πυρήνα καταλαμβανόμενα σε μεγάλο ποσοστό από λιποσταγόνα αποτελούμενη από τριγλυκερίδια. Ο λιπώδης ιστός είναι ο μόνος ιστός στο σώμα που μπορεί να αλλάξει σημαντικά τη μάζα του ακόμη και μετά την πλήρη ανάπτυξη του ατόμου. Αποτελεί το 2-3% του σωματικού βάρους σε καλά γυμνασμένους αθλητές και φτάνει μέχρι το 60-70% του σωματικού βάρους σε παχύσαρκα άτομα, ενώ οι φυσιολογικές τιμές είναι 9-18% για τους άντρες και 14-28% για τις γυναίκες. Οι κυριότερες λειτουργίες του λιπώδους ιστού είναι η αποθήκευση ενέργειας με τη μορφή τριγλυκεριδίων και η κινητοποίησή της με τη μορφή λιπαρών οξέων. Στον λιπώδη ιστό μεταβολίζονται τόσο τα λιπίδια όσο και η γλυκόζη. Η λήψη της τροφής ρυθμίζεται από δύο κέντρα του υποθαλάμου, το κέντρο θρέψης και το κέντρο κόρου. Στον υποθάλαμο επίσης βρίσκεται και το κέντρο θερμογένεσης. Η διέγερση του κέντρου αυτού έχει σαν αποτέλεσμα τη μέσω συμπαθητικού νευρικού συστήματος διέγερση μεταβολικών πορειών που προκαλούν την ελευθέρωση της ενέργειας της τροφής με τη μορφή θερμότητας και όχι την αποθήκευσή της με τη μορφή λίπους. Υπεύθυνος για τη θερμογένεση είναι ο φαιός λιπώδης ιστός που υπάρχει σε πολλά ζώα. Στον άνθρωπο υπεύθυνος για τη θερμογένεση είναι κυρίως ο μυϊκός ιστός. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNFα) περιλαμβάνει δύο παρόμοιες δομικά και λειτουργικά πρωτεΐνες: ο TNFα ή καχεξίνη και ο TNFβ ή λεμφοτοξίνη. Οι δύο μορφές του TNF αποτελούν μέλη μιας υπεροικογένειας πρωτεϊνών όπου οι περισσότερες είναι μεμβρανικές τύπου ΙΙ που το C-τελικό τους άκρο εντοπίζεται εξωκυτταρικά. Στο άκρο αυτό εντοπίζεται μια περιοχή 150 περίπου αμινοξέων στην οποία δεσμεύονται κατάλληλα προσδέματα. Οι πρωτεΐνες αυτές δεν επιδεικνύουν στην αλληλουχία τους ποσοστό ομολογίας μεγαλύτερο από 20-25%, και αυτό είναι κυρίως στην περιοχή του C-τελικού τους άκρου. Οι περισσότερες από αυτές είναι τριμερείς ή πολυμερείς μεμβρανικές πρωτεΐνες, ενώ υπάρχουν και πρωτεΐνες που είναι ενεργές σε διαλυτή μορφή. Ο TNFα ανήκει σε αυτή την ομάδα των πρωτεϊνών. Ο TNFα παράγεται από τα κύτταρα, κυρίως από ενεργοποιημένα μακροφάγα και λεμφοκύτταρα, με τη μορφή μιας πρόδρομης ένωσης. Στον άνθρωπο τα γονίδια των TNFα και TNFβ εντοπίζονται στο χρωμόσωμα 6. Καθένα από αυτά έχει μήκος 3kb. Οι ομοιότητες μεταξύ των δύο γονιδίων ενισχύουν την υπόθεση ότι προήλθαν από ένα κοινό προγονικό γονίδιο με διπλασιασμό. Φαίνεται ότι τα διάφορα κύτταρα που παράγουν TNF φέρουν και τα δύο γονίδια, ενώ διαφορετικά σήματα επάγουν την έκφραση ενός μόνο από αυτά. Ο TNFβ διαθέτει μόλις 30% ομολογία στην αμινοτελική αλληλουχία με τον TNFα, και παράγεται κυρίως από μονοκύτταρα και μακροφάγα. Είναι, τέλος, πολύ σημαντικό να αναφερθεί ότι το μόριο του TNF δεν περιέχει καθόλου α-έλικες, ενώ όταν μειωθεί το ph σχηματίζονται τέτοιες δομές. Με τον τρόπο αυτό, ο TNFα μπορεί να εισέρχεται στην κυτταρική μεμβράνη και να λειτουργεί ως κανάλι ιόντων νατρίου ή να διασχίζει τη μεμβράνη και να εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου-στόχου όπου ανακτά την αρχική του διαμόρφωση. Έχουν απομονωθεί δύο διαφορετικοί τύποι υποδοχέων για τον TNFα, ο TNFRI και ο TNFRII. Ο τύπος 1 περιλαμβάνει ένα πεπτίδιο από 55 ή 60 Κd σε τρωκτικά και ανθρώπους αντίστοιχα, ενώ ο τύπος 2 περιλαμβάνει ένα πεπτίδιο από 75 ή 80 Κd σε τρωκτικά και ανθρώπους αντίστοιχα. Και οι δύο τύποι υποδοχέων είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες με μικρή ομολογία στην αλληλουχία τους που χαρακτηρίζονται από ομοιότητα στο Ν-τελικό τους άκρο (περιοχή πλούσια σε κατάλοιπα κυστεΐνης που φαίνεται ότι έχουν σημαντικό ρόλο στη σύνδεση των υποκαταστατών). Ενώ οι εξωκυτταρικές περιοχές των δύο υποδοχέων εμφανίζουν κάποια ομολογία στην αλληλουχία, οι ενδοκυτταρικές περιοχές φαίνεται ότι είναι τελείως ανόμοιες, δηλαδή φαίνεται ότι κάθε τύπος υποδοχέα εμπλέκεται σε διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες. Έχει αποδειχθεί ότι ο ίδιος ο TNFα ρυθμίζει την έκφραση του υποδοχέα του. Φαίνεται, όμως, ότι επάγει κυρίως 18

19 ΑΠΡΙΛΙΟΣ - ΜΑΪΟΣ - ΙΟΥΝΙΟΣ 2008, ΤΕΥΧΟΣ 46 την έκφραση του TNFRI ενώ κάτω από κατάλληλο ερέθισμα επιφέρει την έκφραση του TNFRII. Ο TNFα έχει σημαντικό ρόλο στη θερμογένεση, ιδιαίτερα στον φαιό λιπώδη ιστό. Τα λιποκύτταρα από τον φαιό λιπώδη ιστό χαρακτηρίζονται από πολυάριθμα μιτοχόνδρια που περιέχουν την ειδική UCP πρωτεΐνη που συμμετέχει στην αποσύζευξη της οξείδωσης από τη φωσφορυλίωση στα μιτοχόνδρια. Το αποτέλεσμα του παραπάνω φαινομένου είναι η παραγόμενη ενέργεια να μην χρησιμοποιείται για τη σύνθεση ATP, αλλά για την παραγωγή θερμότητας. Η υπερβολική και πέρα του φυσιολογικού ορίου αύξηση του σωματικού βάρους που οφείλεται στην εναπόθεση λίπους στον λιπώδη ιστό (λιποκύτταρα), χαρακτηρίζεται ως παχυσαρκία. Στα παχύσαρκα άτομα το σωματικό βάρος υπερβαίνει κατά 20-30% το επιθυμητό. Η παχυσαρκία είναι νόσος στην οποία διαταράσσεται το ενεργειακό ισοζύγιο. Εάν ένα άτομο προσλαμβάνει περισσότερη ενέργεια από αυτή που καταναλώνει, οδηγείται σε θετικό ενεργειακό ισοζύγιο και η περίσσεια ενέργειας αποθηκεύεται στα λιποκύτταρα με τη μορφή τριγλυκεριδίων. Αυτό οδηγεί σε αύξηση του αριθμού ή/και του μεγέθους των λιποκυττάρων. Για να καθοριστεί αν ένα άτομο είναι ή όχι παχύσαρκο, χρησιμοποιείται ο δείκτης μάζας σώματος, που προκύπτει από τη διαίρεση του βάρους του σώματος (σε κιλά) προς το τετράγωνο του ύψους (σε μέτρα) (Πίνακας 1). Ο TNFα επεμβαίνει στον έλεγχο του σωματικού βάρους με τρεις τρόπους: μέσω της πρόσληψης της τροφής, μέσω της κατανάλωσης της ενέργειας και μέσω της αποθήκευσης της ενέργειας. Ήδη είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία, ότι δίαιτα με λίγες θερμίδες (400 Kcal/day) σε παχύσαρκες γυναίκες προκάλεσε μείωση στο σωματικό βάρος κατά 7,5%, μείωση στην παραγωγή λεπτίνης κατά 40%, ελάττωση των επιπέδων TNFα, IL-6 και IL-8 κατά 25-30%, ενώ δεν επηρεάστηκαν τα επίπεδα της αντιπονεκτίνης και του PAI-1. Χορήγηση TNFα ή IL-1 μειώνει την πρόσληψη τροφής και συνδέεται με αυξημένη θερμογένεση στον φαιό λιπώδη ιστό. Φαίνεται ότι η δράση του TNFα επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση της IL-1 που δρα απευθείας στον υποθάλαμο, ελαττώνοντας την πρόσληψη τροφής. Επίσης, ο TNFα ρυθμίζει τη δράση των ορμονών γλυκαγόνη, ινσουλίνη και γλυκοκορτικοειδή που επηρεάζουν την πρόσληψη τροφής. Έχει αναφερθεί ότι στη δράση του TNFα στην πρόσληψη τροφής, μεσολαβεί ο παράγοντας CRF (corticotrophin-releasing factor), ένας νευροδιαβιβαστής από το ΚΝΣ που δρα αυξάνοντας τη θερμογένεση και ελαττώνοντας την πρόσληψη τροφής. Εισαγωγή του γονιδίου του TNFα σε αρουραίους που δεν το διαθέτουν, απέδειξε ότι η έκκριση της συγκεκριμένης κυτοκίνης οδηγεί σε σημαντική απώλεια βάρους λόγω ανορεξίας. Παχύσαρκοι αρουραίοι ανταποκρίνονται λιγότερο στον TNFα και IL-1 ως προς τη θερμογένεση, δηλαδή αναπτύσσουν αντίσταση στις κυτοκίνες αυτές. Ο TNFα προάγει την απόπτωση τόσο στις λιποβλάστες όσο και στα ώριμα λιποκύτταρα (μέσω ενός μηχανισμού που εμπλέκει την κασπάση-3 στον αρουραίο και την κασπάση-1 στον άνθρωπο), αναστέλλει τη λιπογένεση και ενισχύει τη λιπόλυση. Επίσης, συμβάλλει στη διατήρηση της μάζας του λιπώδους ιστού σταθερής, περιορίζοντας τόσο την υπερβολική παραγωγή ώριμων λιποκυττάρων όσο και τη συσσώρευση λιπιδίων. Στον Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ, η αντίσταση στην ινσουλίνη περιφερικά συνδέεται με αυξημένη παραγωγή του TNFα. Χρόνια χορήγηση TNFα σε αρουραίους προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη, ενώ στον άνθρωπο προκαλεί υπεργλυκαιμία χωρίς όμως να μεταβάλλονται τα επίπεδα ινσουλίνης. Ενδοφλέβια ένεση ανασυνδυασμένου TNFα σε έξι υγιείς εθελοντές προκαλεί ορμονικές και μεταβολικές διαταραχές παρόμοιες με τις παρατηρούμενες κατά την οξεία φλεγμονή (αύξηση των επιπέδων Πίνακας 1. Ταξινόμηση των ενηλίκων σε κατηγορίες, σύμφωνα με τον Δείκτη Μάζας Σώματος σύμφωνα με την ΠΟΥ. Κατηγορία ατόμων Βαθμός ΔΜΣ (Κg/m 2 ) Κίνδυνος για συνοδές νόσους Λιποβαρή <18,5 Χαμηλός (αλλά αυξημένος κίνδυνος για άλλα κλινικά προβλήματα) Φυσιολογικά 18,5-24,9 Σύμφωνος με τον μέσο όρο Υπέρβαρα >25,0 Προ-παχύσαρκα 25,0-29,9 Ελαφρά αυξημένος Παχύσαρκα >30,0 Κατηγορία Ι 30,0-34,9 Μέτριος Κατηγορία ΙΙ 35,0-39,9 Σοβαρός Κατηγορία ΙΙΙ >40,0 Πολύ σοβαρός 19

20 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ γλυκόζης, γλυκερόλης και ελεύθερων λιπαρών οξέων και αύξηση στην κατανάλωση ενέργειας). Μέτρηση της έκφρασης του TNFα σε διαβητικούς ασθενείς τύπου ΙΙ συσχετίζει ισχυρά την έκφρασή του στο λιπώδη ιστό με την πρόκληση υπερινσουλιναιμίας. Επίσης, η μείωση του σωματικού βάρους στους παχύσαρκους ασθενείς οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα TNFα, ενώ στην παχυσαρκία τα επίπεδα του TNFα είναι αυξημένα, γεγονός που σχετίζεται με την αντίσταση στην ινσουλίνη. Πιο συγκεκριμένα, είναι αποδεδειγμένο ότι η έκφραση του mrna TNFα στον λιπώδη ιστό παχύσαρκων γυναικών είναι 2,5 φορές αυξημένη συγκρινόμενη με αυτή στον λιπώδη ιστό αδύνατων γυναικών, είναι θετική η συσχέτιση του παραπάνω με την αντίσταση στην ινσουλίνη ενώ η μείωση του σωματικού βάρους βελτιώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη και μειώνει την έκφραση του TNFα κατά 45%. Μελέτες σε τέσσερα διαφορετικά μοντέλα παχυσαρκίας (fa/fa, ob/ob, tub/tub, db/db) επιβεβαιώνουν τα παραπάνω αποτελέσματα. Οι in vivo μελέτες σε ολικά διαφοροποιημένα 3T3-L1 λιποκύτταρα αποδεικνύουν ότι η έκθεση των κυττάρων αυτών στον TNFα προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη, μέσω της ελάττωσης των GLUΤ4 μεταφορέων της γλυκόζης και της παραγωγής κεραμιδίων. Η in vivo χορήγηση διαλυτού ανθρώπινου υποδοχέα TNFRI σε 3T3-F442A λιποκύτταρα, αναστέλλει την προκαλούμενη αντίσταση στην ινσουλίνη. O TNFα ασκεί την παραπάνω δράση μέσω του υποδοχέα της ινσουλίνης. Πιο συγκεκριμένα, ο TNFα προκαλεί μείωση της ενζυμικής δραστικότητας της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα της ινσουλίνης μέσω της φωσφορυλίωσης της σερίνης του υποστρώματος του υποδοχέα της ινσουλίνης-1 (IRS-1), δηλαδή ο TNFα προκαλεί μείωση του αριθμού των υποδοχέων ινσουλίνης και αύξηση των επιπέδων του IRS-1 (Σχήμα 1). Το αποτέλεσμα του παραπάνω φαινομένου είναι η μετατροπή του IRS-1 σε αναστολέα του υποδοχέα της ινσουλίνης. Η PKCε φαίνεται ότι διευκολύνει το φαινόμενο αυτό, παρόμοια δράση αναπτύσσουν και τα ισοένζυμα α, δ, β, θ της PKC σε μικρότερο βαθμό. Εκτός από το IRS-1, ως υποστρώματα του υποδοχέα της ινσουλίνης δρουν και τα IRS-2, IRS-3, IRS-4. Από τα υποστρώματα αυτά, τα IRS-1 και IRS-2 εκφράζονται ευρέως, το IRS-3 περιορίζεται στον λιπώδη ιστό και το IRS-4 εκφράζεται στον θύμο αδένα, στον εγκέφαλο και στους νεφρούς. Εναλλακτικά, ο TNFα μπορεί να δρα αναστέλλοντας τις φωσφατάσες της σερίνης/θρεονίνης και/ή επιστρατεύοντας τη δραστικότητα των πρωτεϊνικών φωσφατασών τυροσίνης (PTP). Επίσης, ο μεταβολισμός των σφιγγολιπιδίων φαίνεται ότι παίζει ρόλο στην προκαλούμενη από τον TNFα αντίσταση στην ινσουλίνη. Ο TNFα αυξάνει ενδοκυτταρικά τα επίπεδα των κεραμιδίων που δρουν άμεσα στον υποδοχέα της ινσουλίνης ή έμμεσα στον GLUT4 μεταφορέα της γλυκόζης στα κύτταρα. Γενικά, τα κεραμίδια ρυθμίζουν τη δραστικότητα πολλών διαφορετικών πρωτεϊνικών κινασών της σερίνης/θρεονίνης και φωσφατασών. Κατά τη μελέτη του γονότυπου 121 παχύσαρκων ατόμων με αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης PCR-RFLP Σχήμα 1. Μηχανισμοί μέσω των οποίων προκαλείται αντίσταση στην ινσουλίνη στα λιποκύτταρα από τον TNFα. φάνηκε ότι ο πολυμορφισμός στη θέση 308 της περιοχής εκκίνησης του γονιδίου του TNFα εμπλέκεται στην αντίσταση στην ινσουλίνη και στην ανάπτυξη της παχυσαρκίας κατά συνέπεια. Παρόμοια μελέτη έγινε σε παχύσαρκες γυναίκες προεμμηνοπαυσιακές. Συγκεκριμένα, προσδιορίστηκαν η συγκέντρωση του TNFα στο πλάσμα και στο μέσο από τον απομονωμένο λιπώδη ιστό. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του γονιδίου του TNFα στον λιπώδη ιστό των παχύσαρκων γυναικών είναι 2,5 φορές αυξημένη σε σχέση με τα control. Η απώλεια βάρους στις γυναίκες αυτές συνοδεύεται με μείωση της έκφρασης του γονιδίου του TNFα, δηλαδή φαίνεται ότι υπάρχει συσχέτιση του ΒΜΙ και της έκφρασης mrna του TNFα. Συγκεκριμένα, απώλεια βάρους μεταξύ 14 και 66 κιλά, οδηγεί σε μείωση της έκφρασης του mrna TNFα σε ποσοστό 58% και σε αυξημένη δραστικότητα της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης σε ποσοστό 411%. Συμπερασματικά, είναι φανερή η συσχέτιση του TNFα με την παχυσαρκία και κατά συνέπεια με την πρόκληση αντίστασης στην ινσουλίνη. Βιβλιογραφία 1. Junqueira L., Rokelley J. (2000) Βασική Ιστολογία, Πανεπιστημιακές εκδόσεις Κρήτης, 6 η έκδοση. 2. Pond C. (1996) Functional interpretation of the organization of mammalian adipose tissue: its relationship to the immune system, Biochem. Soc. Trans., 24, Vilcek J., Lee T. (1991) Tumor necrosis factor, J. Biol. Chem., 266,