ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΟΤΗΤΑ Ι. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Ρόλος και προετοιμασία μικροβιακών καλλιεργειών

Transcript

1 ΕΝΟΤΗΤΑ Ι ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Ρόλος και προετοιμασία μικροβιακών καλλιεργειών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Μικροβιακή κινητική και λειτουργία Βιοαντιδραστήρων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: Βιοχημικό προφίλ Μικροοργανισμών (Σύστημα ΑPI) 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 1

2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ρόλος και προετοιμασία μικροβιακών καλλιεργειών 1.1 Εισαγωγή Είναι γνωστό ότι οι μικροοργανισμοί είναι ικανοί να πραγματοποιούν ένα μεγάλο αριθμό βιοχημικών αντιδράσεων. Το γεγονός αυτό εκφράζεται είτε με την παραγωγή βιομάζας, είτε με την παραγωγή ή βιομετατροπή οργανικών ουσιών. Η ιδιότητα αυτή των μικροοργανισμών χρησιμοποιείται σήμερα σε μεγάλο βαθμό και ένας σημαντικός αριθμός ενώσεων, όπως ένζυμα, οργανικά οξέα, αμινοξέα, αντιβιοτικά, αυξητικοί παράγοντες κ.λπ., παράγονται βιομηχανικά απ αυτούς. Είναι λοιπόν φανερό, πως το κλειδί της επιτυχίας ή της αποτυχίας για μια βιοτεχνολογική παραγωγή ενός προϊόντος, είναι ο μικροοργανισμός που χρησιμοποιείται. Αυτός υπήρξε ένα από τα σπουδαιότερα προβλήματα από την αρχή που ο άνθρωποs παρασκεύαζε διάφορα τρόφιμα και ποτά με ζύμωση. Συνήθως το εμβολίασμα που χρησιμοποιούσε για το ξεκίνημα μιας ζύμωσης ήταν η φυσική χλωρίδα του ίδιου του προϊόντος, όπως στην περίπτωση πα ρασκευής του άρτου. Τα τελευταία όμως χρόνια, και με την ανάπτυξη της βιομηχανικής μικροβιολογίας απαιτούνται διαδικασίες τέτοιες ώστε τα διάφορα μεταβολικά προϊόντα που μας ενδιαφέρουν να λαμβάνονται κατά τρόπο συνεχή και σε υψηλές αποδόσεις. Χρειάστηκε λοιπόν να μελετήσουμε τα μέσα και τις τεχνικές για την απομόνωση την διατήρηση, καθώς και την βελτίωση των ιδιοτήτων των μικροβιακών στελεχών, με τελικό σκοπό την αύξηση του δυναμικού τους για παραγωγή μεταβολιτών (πρωτογενών και δευτερογενών) ή βιομάζας. 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 3

3 4 Ενότητα Ι: Μικροβιακή Ανάπτυξη Τα επιθυμητά χαρακτηριστικά που θα μας οδηγήσουν στην χρησιμοποίηση των μικροοργανισμών στην βιομηχανία είναι: 1. Η ικανότητα τους να αναπτύσσονται γρήγορα και εύκολα πάνω σε ένα υπόστρωμα χαμηλού σχετικά κόστους. 2. Τα μικροβιακά στελέχη πρέπει να είναι γενετικώς σταθερά, να παρουσιάζουν δηλ. ένα μικρό μόνο αριθμό μεταλλακτικών στελεχών. 3. Να παράγουν το επιθυμητό προϊόν σε μικρό χρόνο. 4. Να μη παράγουν ταυτόχρονα με το προϊόν, τοξικές ουσίες. 5. Να μπορούν να υπόκεινται σε γενετική τροποποίηση των ιδιοτήτων τους. 6. Να παρουσιάζουν σταθερή παραγωγικότητα μέσα στο χρόνο. Οι μικροοργανισμοί με τα παραπάνω επιθυμητά χαρακτηριστικά μπορούν να παραληφθούν με δύο τρόπους: 1. Να απομονωθούν από την φύση (δηλ. από τον αέρα, το νερό, το χώμα κ.λπ.) 2. Να παραληφθούν από τις ονομαζόμενες Τράπεζες Μικροοργανισμών. 1.2 Τρόποι απομόνωσης και επιλογής στελεχών Από την φύση Όλες οι τεχνικές που εφαρμόζονται για την εύρεση νέων μικροοργανισμών με βιομηχανικό ενδιαφέρον αναπτύχθηκαν κυρίως κατά την διάρκεια της έρευνας παραγωγής νέων αντιβιοτικών. Όμως, ανεξάρτητα από την χρησιμοποιούμενη τεχνική, σκοπός είναι η απομόνωση και επιλογή ενός μικροοργανισμού που θα είναι προικισμένος με μια ή περισσότερες ιδιότητες. Η διαδικασία απομόνωσης μικροβιακών στελεχών συνιστά μια μακρόχρονη διαδικασία. Η μέθοδος του screening εφαρμόζεται σήμερα ευρέως για ένα μεγάλο σύνολο μικροβιακών αντιδράσεων. Σύμφωνα με την μέθοδο αυτή, η απομόνωση και επιλογή γίνεται σε 3 φάσεις: 1. Στην πρώτη φάση απομονώνονται από διάφορες φυσικές πηγές, όπως το χώμα, ο αέρας, τα τρόφιμα, τα απόβλητα κ.λπ., ένα σύνολο μικροβίων με ορισμένες γενικές ιδιότητες. 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 4

4 Κεφάλαιο 1: Ρόλος και προετοιμασία μικροβιακών καλλιεργειών 5 2. Στην δεύτερη φάση, και από τους παραπάνω μικροοργανισμούς, απομονώνονται εκείνοι που έχουν την μεγαλύτερη δυνατότητα απόδοσης για το συγκεκριμένο βιομηχανικό προϊόν που μελετάται. 3. Στην τρίτη φάση τέλος, και σε εργαστηριακό επίπεδο, γίνεται η αριστοποίηση της παραγωγής για το στέλεχος της φάσης 2 που παρουσίασε την μεγαλύτερη απόδοση. Για παράδειγμα, αν θέλουμε να απομονώσουμε ένα στέλεχος του γένους Corynebacterium που έχει την ικανότητα να παράγει το αμινοξύ Λυσίνη από σόγια, ακολουθείται η εξής διαδικασία: Εμβολιάζεται αποστειρωμένο σογιάλευρο με χώμα, νερό αποβλήτων ή με κάποιο άλλο υλικό που περιέχει μεγάλο αριθμό μικροοργανισμών. Στην συνέχεια οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε αερόβιες συνθήκες και στην άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης των Corynebacterium, π.χ. 26 C. Η διαδικασία αυτή εφαρμόζεται σε μεγάλο αριθμό φιαλών που εμβολιάζονται με διαφορετικό αρχικό δείγμα η κάθε μία. Από τις φιάλες εκείνες που θα παρουσιάσουν ταχεία ανάπτυξη, εμβολιάζονται νέες και στη συνέχεια απομονώνονται οι μικροοργανισμοί σε τρυβλία, στα οποία έχει ενσωματωθεί σόγια. Κάθε καθαρή καλλιέργεια που απομονώνεται, ελέγχεται ως προς την ικανότητά της να παράγει λυσίνη σε μικρούς ζυμωτές, όπου η σόγια θα αποτελεί το βασικό συστατικό του θρεπτικού υποστρώματος. Θα ακολουθήσει η σύγκριση των διαφόρων στελεχών. Η αριστοποίηση της παραγωγής θα γίνει με το στέλεχος εκείνο που παρουσίασε την μεγαλύτερη απόδοση Τράπεζες μικροβιακών στελεχών Ταυτόχρονα με την ανάπτυξη της Βιομηχανικής Μικροβιολογίας άρχισε και η δημιουργία τραπεζών μικροοργανισμών σε πολλές χώρες. Οι τράπεζες αυτές διαφέρουν ως προς το μέγεθος των συλλογών και μερικές είναι αρκετά εξειδικευμένες ως προς το είδος των μικροοργανισμών που περιλαμβάνουν. Για παράδειγμα, τα βακτήρια και τα πρωτόζωα δεν υπάρχουν συνήθως στην ίδια συλλογή. Οι τράπεζες μικροοργανισμών αποτελούν έτσι, αυθεντικές πηγές καλλιεργειών για την έρευνα και παραγωγή προϊόντων με βιοτεχνολογική μεθοδολογία. Οι τράπεζες μικροοργανισμών στέλνουν στους ενδιαφερόμενους καθαρές καλλιέργειες έναντι κάποιας αμοιβής για την ενίσχυση και λειτουργία της συλ- 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 5

5 6 Ενότητα Ι: Μικροβιακή Ανάπτυξη λογής καθώς και για το κόστος μεταφοράς. Για την παραγγελία κάποιου συγκεκριμένου στελέχους ενός μικροοργανισμού είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε και τον κωδικό του αριθμό, που λαμβάνεται από τους καταλόγους των τραπεζών. Ο κωδικός αυτός, χαρακτηρίζει συνήθως διαφορετικές φυσιολογικές καταστάσεις μέσα στο ίδιο είδος. Για παράδειγμα, ο μικροοργανισμός Aspergillus niger ATCC χαρακτηρίζεται, μεταξύ άλλων από την ικανότητά του να παράγει αιμολυτικά ένζυμα, ενώ ο μικροοργανισμός Aspergillus niger ATCC από την ικανότητα του να παράγει κιτρικό οξύ. Στον πίνακα που ακολουθεί (Πίνακας 1.1), αναφέρονται οι κυριότερες συλλογές μικροοργανισμών σ όλο τον κόσμο. ΠΙΝΑΚΑΣ 1.1 ΟΝΟΜΑ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΧΩΡΑ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ American Type Culture Collection (ATCC) Central Bureau voor SchimmelcuLure (CBS) CommonweaLh Mycol. Institute (CMI) AgicuLure Res. Serv. CuL. Collection (NRRL) National Coll. of Ind. Bacteria (NCIB) Η.Π.Α Ολλανδία Αγγλία Η.Π.Α Σκωτία Βακτήρια, Μύκητες Άλγη, Φάγοι Μύκητες και Ακτινομύκητες Μύκητες Βακτήρια,Μύκητες Ακτινομύκητες Βακτήρια Institute Pasteur Γαλλία Βακτήρια, Μύκητες National Coll. of Type CuLure (NCTC) Αγγλία Βακτήρια, Μύκητες Ακτινομύκητες CuLure Collection Αγγλία Άλγη και Πρωτόζωα Chr. Hansens Labor. Δανία Βακτήρια, Μύκητες Τρόποι συντήρησης μικροβιακών στελεχών Η διατήρηση της σταθερής απόδοσης κατά την παραγωγή ενός προϊόντος αποτελεί μια απαραίτητη προϋπόθεση της βιοτεχνολογίας. Τα μικροβιακά στελέχη 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 6

6 Κεφάλαιο 1: Ρόλος και προετοιμασία μικροβιακών καλλιεργειών 7 πρέπει λοιπόν να διατηρούνται σε αυστηρά καθορισμένες συνθήκες. Πράγματι, κατά την διάρκεια της αποθήκευσής τους οι μικροοργανισμοί χάνουν μερικές από τις μεταβολικές τους λειτουργίες. Για παράδειγμα, αναφέρθηκε ότι κάποιο στέλεχος του μικροοργανισμού Streptomyces griseus που παράγει στρεπτομυκίνη, έχασε αυτή την ικανότητά του έπειτα από 58 συνεχείς ανακαλλιέργειες σε κάποιο συγκεκριμένο στερεό θρεπτικό υλικό. Οι τεχνικές που επιτρέπουν την διατήρηση των μεταβολικών ιδιοτήτων των μικροοργανισμών είναι πολλές. Η βασική αρχή αυτών των τεχνικών είναι η διατήρηση των μικροοργανισμών σε συνθήκες όπου η μεταβολική τους δραστηριότητα να είναι ελάχιστη. Σε ένα τέτοιο σύστημα, η πιθανότητα μεταλλάξεων λόγω έντονου πολλαπλασιασμού είναι σχετικά περιορισμένη. Οι σπουδαιότερες από τις τεχνικές αυτές είναι οι εξής: 1. Συνεχής ανακαλλιέργεια: Η μέθοδος αυτή συνίσταται στη διαδοχική μεταφορά μιας ήδη αναπτυγμένης καλλιέργειας από βλαστητικές μορφές, σπόρια ή μυκήλιο σε φρέσκο θρεπτικό υλικό, σε τακτά χρονικά διαστήματα. Ο χρόνος της κάθε μεταφοράς εξαρτάται από τη φύση του στελέχους και ποικίλλει από μερικές μέρες σε μερικούς μήνες ή ακόμη και χρόνια. Οι καλλιέργειες μπορεί να μεταφέρονται σε κεκλιμένο άγαρ, τρυβλία πετρί, ή θρεπτικό ζωμό. Η φύλαξη γίνεται συνήθως στους 4 C έως 8 C. Για την αποφυγή αφυδάτωσης είναι σκόπιμο να καλύπτονται οι καλλιέργειες με αποστειρωμένο παραφινέλαιο ή να κλείνονται καλά με ελαστικά πώματα, φελλούς ή με βαμβάκι. Με τη ψύξη ελαττώνεται ο ρυθμός ανάπτυξης των μικροοργανισμών, ελαχιστοποιούνται οι αλλαγές στο ph και στο οξειδοαναγωγικό δυναμικό (REDOX). Επίσης ελαττώνεται η πιθανότητα να υποστούν μεταλλάξεις τα κύτταρα. Παρ όλα αυτά η μέθοδος αυτή δεν εξασφαλίζει γενετική σταθερότητα και σε ορισμένο χρόνο μπορεί να χαθούν ή να αλλοιωθούν σημαντικά βιοχημικά χαρακτηριστικά. Για παράδειγμα, ένας μικροοργανισμός που έχει επιλεγεί να παράγει υψηλές ποσότητες ενός αμινοξέος μπορεί με τις συνεχείς μεταφορές να χάσει σταδιακά την ικανότητά του να παράγει το αμινοξύ παρ όλο που συνεχίζεται η πολλαπλασιαστική του ικανότητα. Μπορεί μάλιστα και η πολλαπλασιαστική του ικανότητα να αυξηθεί την ίδια στιγμή που χάνει την ικανότητα του για παραγωγή αυτού του αμινοξέος. 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 7

7 8 Ενότητα Ι: Μικροβιακή Ανάπτυξη Άλλο μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι απαιτεί μεγάλο αριθμό θρεπτικών υλικών για τις ανακαλλιέργειες ιδίως για μικροοργανισμούς που αναπτύσσονται δύσκολα. 2. Λυοφιλίωση (Freeze - Drying): Η ανάπτυξη της λυοφιλίωσης τα τελευταία χρόνια υπήρξε ένα σημαντικό βήμα για τη διατήρηση των καλλιεργειών. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, μικροβιακά κύτταρα, σπόρια ή μερικές φορές τμήματα μυκηλίων αιωρούνται σ ένα προστατευτικό κολλοειδές όπως αποβουτυρωμένο γάλα ή ορό αίματος και ψύχονται γρήγορα με τη βοήθεια ξηρού πάγου και αλκοόλης. Στην συνέχεια, η καλλιέργεια αφυδατώνεται με εξάχνωση υπό κενό. Το παρασκεύασμα, σ αυτή τη μορφή του, σφραγίζεται αεροστεγώς και φυλάσσεται σε θερμοκρασία από 5 ως 10 C. Σ αυτές τις θερμοκρασίες η ικανότητα ανάπτυξης παρατείνεται για ακόμα μεγαλύτερα διαστήματα. Έχει αποδειχθεί ότι λυοφιλιωμένες καλλιέργειες που διατηρήθηκαν επί 11 μήνες στους 4 C έχασαν την ικανότητα ανάπτυξής τους κατά 50% περίπου, ενώ αυτές που διατηρήθηκαν στους 22 C έχασαν αυτή την ικανότητα κατά 99%. Στις συνθήκες λυοφιλίωσης οι μικροοργανισμοί αποκτούν μερικά από τα χαρακτηριστικά των βακτηριακών σπορίων, δηλαδή γίνονται περισσότερο ανθεκτικοί σε ακραία όρια θερμοκρασίας και ενεργότητας νερού (a w ) καθώς και στην επίδραση ακτινοβολιών. Ενώ με την μέθοδο της λυοφιλίωσης διατηρούνται πολλά από τα φυσιολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών, δεν ισχύει το ίδιο και για την βιωσιμότητα τους: Το μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων, μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, χάνει την ικανότητά τους για διπλασιασμό. Για τη βελτίωση της τεχνικής της λυοφιλίωσης έχει πραγματοποιηθεί ένας μεγάλος αριθμός ερευνητικών εργασιών με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. 3. Διατήρηση με ψύξη: Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, οι καλλιέργειες διατηρούνται σε ψυγεία που μπορούν να κατεβάσουν τη θερμοκρασία μέχρι και 75 C. Μια μέθοδος ψύξης που εφαρμόζεται και έχει ορισμένα πλεονεκτήματα σε σχέση με τη λυοφιλίωση είναι η διατήρηση με ψύξη και αποθήκευση σε υγρό άζωτο ( 165 μέχρι 196 C). Η μέθοδος είναι άριστη για τη διατήρηση των περισσοτέρων μικροοργανισμών καθώς και μικροφυκών, πρωτόζωων ή και ιστών θηλαστικών. 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 8

8 Κεφάλαιο 1: Ρόλος και προετοιμασία μικροβιακών καλλιεργειών 9 Έχει αναφερθεί πως ορισμένοι τύποι μικροοργανισμών που δεν επιζούν με τη μέθοδο της λυοφιλίωσης, διατηρούν τη βιωσιμότητά τους για μεγάλο χρονικό διάστημα με ψύξη σε υγρό άζωτο. Για παράδειγμα, καλλιέργειες μυκήτων διατηρούνται στη ζωή και χωρίς καμιά αλλαγή τουλάχιστον για 5 χρόνια, σε υγρό άζωτο. Οι καλλιέργειες στην περίπτωση του υγρού αζώτου όπως και στη λυοφιλίωση, κλείνονται ερμητικά σε γυάλινα μπουκαλάκια ή αμπούλες και έτσι προστατεύονται από επιμολύνσεις και άλλες αλλαγές από το περιβάλλον. Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι στη περίπτωση μεταφοράς των καλλιεργειών χρειάζονται ειδικά μεταφορικά μέσα που θα εξασφαλίζουν συνεχείς και χαμηλές θερμοκρασίες, έτσι ώστε να αποφευχθούν οι ζημιές και οι αλλοιώσεις. 1_BIOMHXANIKH MIKROBIOLOGIA.indd 9 19/9/2014 9:30:30 πμ