ΜΕΡΟΣ ΙI: Η ΡΟΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

Transcript

1 Ευάγγελος Κωλέττας, B.Sc (HONS), Ph.D.(LON) Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Βιολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων ΜΕΡΟΣ ΙI: Η ΡΟΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Η οργάνωση και οι αλληλουχίες των κυτταρικών γονιδιωμάτων ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το DNA, ως γενετικό υλικό, αποτελεί τον κώδικα που καθοδηγεί όλες τις κυτταρικές δραστηριότητες και καθορίζει το αναπτυξιακό πρόγραμμα των πολυκύτταρων οργανισμών. Συνεπώς, είναι αναγκαία η κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των γονιδίων. Τα τελευταία χρόνια έχουν ταυτοποιηθεί με προγράμματα μεγάλης κλίμακας, οι αλληλουχίες των γονιδιωμάτων εκατοντάδων ειδών βακτηρίων, ζυμομυκήτων και πολλών ειδών φυτών και ζώων, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου. Οι αλληλουχίες αυτών των γονιδιωμάτων προσφέρουν πλήθος πληροφοριών που επιτρέπουν την ταυτοποίηση αγνώστων μέχρι σήμερα γονιδίων και ρυθμιστικών αλληλουχιών. Τα αποτελέσματα αυτών των προγραμμάτων αλληλούχισης αναμένονται να αποτελέσουν την βάση για μακροχρόνιες έρευνες στον στη μοριακή και κυτταρική βιολογία και να έχουν ουσιαστικές επιπτώσεις στην κατανόηση και στον τρόπο αντιμετώπισης των ασθενειών του ανθρώπου Η πολυπλοκότητα των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων Τα γονιδιώματα των ευκαρυωτικών οργανισμών είναι μεγαλύτερα και πολυπλοκότερα από αυτά των προκαρυωτικών (Εικ. 5.1). Αυτό είναι αναμενόμενο καθώς οι πιο πολύπλοκοι οργανισμοί έχουν περισσότερα γονίδια. Ωστόσο, το μέγεθος των γονιδιωμάτων πολλών ευκαρυωτικών δεν σχετίζεται με την γενετική πολυπλοκότητα. Για παράδειγμα, γονιδιώματα της σαλαμάνδρας και του κρίνου περιέχουν 10πλάσια ποσότητα DNA από ότι το γονιδίωμα του ανθρώπου, ενώ δεν εμφανίζουν μεγαλύτερη πολυπλοκότητα από τον άνθρωπο. ΕΙΚΟΝΑ 5.1: Μεγέθη γονιδιώματος. Παρουσιάζεται, σε λογαριθμική κλίμακα, το εύρος των μεγεθών του γονιδιώματος διαφόρων αντιπροσωπευτικών ομάδων οργανισμών. 1

2 Αυτό το παράδοξο αποσαφηνίστηκε με την ανακάλυψη ότι τα γονιδιώματα των περισσοτέρων ευκαρυωτικών κυττάρων δεν περιέχουν μόνο λειτουργικά γονίδια, αλλά και μεγάλες ποσότητες αλληλουχιών DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επομένως, η μεγάλη διαφορά στο μέγεθος των γονιδιωμάτων της σαλαμάνδρας και του ανθρώπου δε συνδέεται με μεγάλες διαφορές στον αριθμό γονιδίων αλλά με την παρουσία μεγαλύτερης ποσότητας μη-κωδικού DNA στο γονιδίωμα της σαλαμάνδρας. Η παρουσία μεγάλων ποσοτήτων μη-κωδικών αλληλουχιών αποτελεί γενική ιδιότητα των γονιδιωμάτων των πολύπλοκων ευκαρυωτικών οργανισμών. Επομένως, το γεγονός ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα είναι 1000 φορές μεγαλύτερο από αυτό του βακτηρίου E. Coli δεν οφείλεται μόνον στο μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων που περιέχει. Το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει γονίδια 5 φορές περισσότερα από του E. Coli. Η πολυπλοκότητα των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων προκύπτει κυρίως από τους πολλούς διαφορετικούς τύπους μη-κωδικών αλληλουχιών DNA, που καλύπτουν το μεγαλύτερο μέρος του DNA των κυττάρων των ανώτερων ευκαρυωτών. ΜΗ-ΚΩΔΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ DNA ΣΤΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΓΩΝΙΔΙΩΜΑΤΑ Εντός των γονιδίων Ιντρόνια 5 Μη μεταφραζόμενη περιοχή (5 UTR; Untranslated Regions) 5 Μη μεταφραζόμενη περιοχή (3 UTR; Untranslated Regions) Συναφή με γονίδια Ύπαρξη πολλών γονιδίων σε πολλαπλά αντίγραφα μερικά από τα οποία δεν είναι λειτουργικά, δηλαδή είναι Ψευδογονίδια Εκτός των γονιδίων Μη κωδικές Αλληλουχίες μεσοδιαστήματος Μη κωδικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του γονιδιώματος του ανθρώπου Επαναλήψεις απλών αλληλουχιών Ρετροτρανσποζόνια Βραχέα διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων ή Στοιχεία SINE Μακρά διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων ή Στοιχεία LINE Στοιχεία ρετροϊκού τύπου DNA τρανσποζόνια 2

3 Ιντρόνια και Εξόνια Ένα γονίδιο (gene) μπορεί να οριστεί ως ένα τμήμα DNA που εκφράζεται για να παράγει ένα λειτουργικό προϊόν που μπορεί να είναι είτε RNA [π.χ. ριβοσωμικό RNA (rrna) ή μεταφορικό RNA (mrna)] ή πολυπεπτίδιο (πρωτεΐνη). Μέρος του μη κωδικού DNA των ευκαρυωτών αντιπροσωπεύεται από μεγάλο μήκος αλληλουχιών DNA που παρεμβάλλονται μεταξύ των γονιδίων και ονομάζονται αλληλουχίες μεσοδιαστήματος (spacer sequences). Μεγάλες ποσότητες μη κωδικού DNA έχουν εντοπιστεί στο εσωτερικό των περισσοτέρων ευκαρυωτικών γονιδίων. Αυτά τα γονίδια έχουν μωσαϊκή δομική οργάνωση στην οποία τμήματα κωδικών αλληλουχιών που ονομάζονται εξόνια (exons) διακόπτονται από μη κωδικές αλληλουχίες που ονομάζονται παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες ή ιντρόνια (introns) (Εικ. 5.2). Το πλήρες γονίδιο μεταγράφεται σε ένα ενιαίο μεγάλο μόριο RNA από το οποίο απομακρύνονται στη συνέχεια τα ιντρόνια με τη διαδικασία του ματίσματος, ώστε το τελικό mrna να περιλαμβάνει μόνο εξόνια. ΕΙΚΟΝΑ 5.2: Η δομή ενός ευκαρυωτικού γονιδίου. Τα περισσότερα ευκαρυωτικά γονίδια περιέχουν τμήματα κωδικών αλληλουχιών (εξόνια) τα οποία διακόπτονται από μη κωδικές αλληλουχίες (ιντρόνια). Τα εξόνια και τα ιντρόνια μεταγράφονται σε ένα πρόδρομο αρχικό μετάγραφο RNA. Στη συνέχεια, τα ιντρόνια απομακρύνονται με τον μηχανισμό του ματίσματος για να σχηματιστεί το ώριμο mrna. Επομένως, μέρος του μη-κωδικού DNA των ευκαρυωτών αντιπροσωπεύεται από: (α) Μεγάλες ποσότητες μη-κωδικού DNA - τα ιντρόνια - στο εσωτερικό των περισσοτέρων ευκαρυωτικών γονιδίων, που συμβάλλουν σημαντικά στο μεγάλο μέγεθος των ανώτερων ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων. Στον άνθρωπο, τα ιντρόνια αντιπροσωπεύουν το 20% του συνολικού DNA του γονιδιώματος. (β) Μεγάλο μήκος αλληλουχιών DNA που παρεμβάλλονται μεταξύ των γονιδίων και ονομάζονται αλληλουχίες μεσοδιαστήματος. Τα ιντρόνια ανακαλύφθηκαν ανεξάρτητα από τους Phil Sharp & Richard Roberts το 1977 μελετώντας την αντιγραφή του αδενοϊού σε καλλιέργειες ανθρωπίνων κυττάρων. Ο αδενοϊός αποτελεί ένα χρήσιμο μοντέλο για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης γιατί: (α) το ιικό γονιδίωμα έχει ελάχιστο μέγεθος (~3.5x104 bp), και (β) τα ιικά μόρια RNA παράγονται σε υψηλά επίπεδα στο εσωτερικό των μολυσμένων κυττάρων. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για το χαρακτηρισμό των μορίων mrna του αδενοϊού ήταν να εντοπιστούν οι αντίστοιχες θέσεις των αντίστοιχων ιικών γονιδίων με εξέταση υβριδίων RNA-DNA στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Το γεγονός ότι τα υβρίδια RNA-DNA μπορούν να διακριθούν από μονόκλωνο DNA καθιστά εφικτό τον εντοπισμό των θέσεων υβριδισμού των μεταγράφων RNA πάνω σε ένα μόριο DNA. Αποκαλύφθηκε ότι τα μόρια mrna του αδενοϊού δεν υβριδίζονται με μια μόνο περιοχή ιικού DNA, αλλά ισχύει ότι ένα μόριο mrna υβριδίζεται με αρκετές διαφορετικές περιοχές του ιικού γονιδιώματος (Εικ. 5.3). Άρα, το mrna του αδενοϊού δεν αντιστοιχεί σε ένα συνεχές μετάγραφο της μήτρας DNA, αλλά συναρμολογείται από διαφορετικά τμήματα αλληλουχιών που προκύπτουν από διαφορετικά μέρη του ιικού DNA. Επιπλέον πειράματα έδειξαν ότι αυτή η συρραφή διαφορετικών τμημάτων μέσω ενός μηχανισμού ματίσματος του RNA (RNA splicing). 3

4 Απομονωμένο mrna υβριδίστηκε με DNA του αδενοϊού ΕΙΚΟΝΑ 5.3: Ταυτοποίηση ιντρονίων στο αδενοϊικό mrna. (Α) Το γονίδιο που κωδικοποιεί την εξόνη (μια βασική δομική πρωτεΐνη του ιικού σωματίου) αποτελείται από τέσσερα εξόνια, μεταξύ των οποίων παρεμβάλλονται τρία ιντρόνια. (Β) Σχεδιάγραμμα από μικροφωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει ένα υποθετικό υβρίδιο μεταξύ ενός μορίου mrna εξόνης και ενός τμήματος DNA του αδενοϊού. Τα εξόνια διακρίνονται ως περιοχές υβριδίων RNA-DNA, οι οποίες διαχωρίζονται από βρόχους μονόκλωνου DNA που αντιστοιχούν στα ιντρόνια. ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ: Η ανακάλυψη των ιντρονίων Το πλαίσιο: Πριν από την ανάπτυξη των τεχνικών της μοριακής κλωνοποίησης, ελάχιστα ήταν γνωστά για τη σύνθεση του mrνα στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ωστόσο, ήταν ήδη σαφές ότι επρόκειτο για μια διεργασία περισσότερο πολύπλοκη απ' ό,τι η σύνθεση του mrna στα βακτήρια. Η σύνθεση των ευκαρυωτικών μορίων mrna φαινόταν να απαιτεί όχι μόνο μεταγραφή αλλά και αντιδράσεις ωρίμανσης, που τροποποιούν τη δομή των πρωτογενών μεταγραφών. Το πιο αξιοσημείωτο είναι ότι το mrna φαινόταν αρχικά να συντίθεται ως ένα πρωτογενές μεγάλου μήκους μετάγραφο, που εντοπιζόταν στον πυρήνα, και στη συνέχεια να τεμαχίζεται για να σχηματιστεί ένα πολύ μικρότερο μόριο mrna που μεταφερόταν στο κυτταρόπλασμα. Αυτές οι διεργασίες εθεωρείτο γενικώς ότι απομακρύνουν αλληλουχίες από τα 5' και 3' άκρα των πρωτογενών μεταγραφών. Ένα τέτοιο υποθετικό μοντέλο προέβλεπε ότι τα μόρια mrna κωδικοποιούνται από συνεχείς αλληλουχίες DNA και βρίσκονται ενσωματωμένα σε μεγάλου μήκους πρωτογενή μετάγραφα. Αυτή η θεώρηση για το ευκαρυωτικό mrna άλλαξε ριζικά με την ανακάλυψη του ματίσματος (splicing), που προήλθε από δύο παράλληλες, ανεξάρτητες μελέτες - Berget SM, Moore C & Sharp P (1997). Spliced Segments at the 5 terminus of adenovirus 2 late mrna. Proc Natl Acad Sci USA 74: ] και Chow L, Gellinas R, Brocker T & Roberts R (1997). An amazing sequence arrangement at the 5 ends of adenovirus 2 messenger RNA. Cell 12:

5 Τα πειράματα: Και οι δυο ερευνητικές ομάδες που ανακάλυψαν το μάτισμα χρησιμοποίησαν τον αδενοϊό 2 ως εργαλείο μελέτης της σύνθεσης mrna σε κύτταρα ανθρώπου. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα που προσφέρει ο ιός είναι ότι συνιστά ένα μοντέλο πολύ απλούστερο από αυτό του κυττάρου-ξενιστή του. Ιικό DΝΑ μπορεί να απομονωθεί απευθείας από τα ιικά σωμάτια, ενώ τα mrna που κωδικοποιούν δομικές πρωτεΐνες του ιού παράγονται σε τόσο μεγάλη ποσότητα, ώστε μπορούν να απομονωθούν απευθείας από μολυσμένα κύτταρα. Τα πειράματα των Berget, Moore & Sharp επικεντρώθηκαν σε ένα από αυτά τα mrna, το mrna που κωδικοποιεί ένα δομικό πολυπεπτίδιο του ιού γνωστό με το όνομα εξόνη. Για να χαρτογραφηθεί το mrna της εξόνης πάνω στο γονιδίωμα του ιού, απομονωμένο mrna υβριδίστηκε με DNA του αδενοϊού και τα υβριδικά μόρια εξετάστηκαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Όπως αναμενόταν, το μεγαλύτερο μέρος του mrna της εξόνης σχημάτιζε υβρίδια με θραύσματα αδενοϊικού DNA, για τα οποία ήταν γνωστό από προηγούμενα πειράματα ότι περιείχαν το γονίδιο της εξόνης. Με έκπληξη ωστόσο παρατηρήθηκε ότι οι αλληλουχίες του 5' άκρου του mrna δεν υβριδίζονταν με αλληλουχίες DΝΑ συνεχόμενες με αυτές που κωδικοποιούν το υπόλοιπο του μηνύματος, οδηγώντας έτσι στην ερμηνεία ότι το 5' άκρο προέρχεται από αλληλουχίες άλλων περιοχών του ιικού γονιδιώματος. Αυτή η πιθανή ερμηνεία ελέγχθηκε με υβριδισμό του mrna της εξόνης με ένα θραύσμα DNA που εκτείνεται ανοδικά του γονιδίου της εξόνης. Τα υβρίδια mrna-dna που σχηματίστηκαν εμφάνιζαν μια πολύπλοκη δομή βρόχων. Το μεγαλύτερο μέρος του mrna σχημάτιζε μια εκτενή περιοχή υβριδισμού με τις αλληλουχίες DNA της εξόνης που είχαν ταυτοποιηθεί από τα προηγούμενα πειράματα. Αντίθετα το 5 άκρο του mrna της εξόνης υβριδιζόταν με 3 μικρές ανοδικές περιοχές DNA, που διαχωρίζονταν τόσο μεταξύ τους όσο και από το κύριο σώμα του μηνύματος με μεγάλους βρόχους μονόκλωνου DNA. Συνεπώς, οι αλληλουχίες του 5' άκρου του mrna της εξόνης φαινόταν ότι προέρχονται από μεταγραφή 3 διαφορετικών περιοχών του ιικού γονιδιώματος, που συρράπτονται στο κυρίως σώμα του mrna κατά την ωρίμανση ενός μεγάλου πρωτογενούς μεταγράφου. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και αντίστοιχο ιχνογράφημα του mrna του εξονίου που έχει υβριδιστεί με αδενοϊικό DNA. Οι μονόκλωνοι βρόχοι που συμβολίζονται με Α, Β και Γ αντιστοιχούν σε ιντρόνια. Ο αντίκτυπος: Μετά την ανακάλυψη του ματίσματος στο αδενοϊικό mrna ακολούθησαν παρόμοια πειράματα με μόρια mrna κυτταρικών οργανισμών, που έδειξαν ότι τα ευκαρυωτικά γονίδια είχαν μια νέα, μη αναμενόμενη δομή: οι κώδικες αλληλουχίες τους δεν ήταν συνεχόμενες, αλλά διακόπτονταν από ιντρόνια, που απομακρύνονταν από τα αρχικά, πρωτογενή μετάγραφα τους με μάτισμα. Σήμερα είναι γνωστό ότι τα ιντρόνια καταλαμβάνουν μεγάλο μέρος του DNA των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων και η διερεύνηση του ρόλου τους στην εξέλιξη και στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης αποτελεί πεδίο έντονης έρευνας. Η ανακάλυψη του ματίσματος προκάλεσε επίσης έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον για την κατανόηση του μηχανισμού αυτής της μη αναμενόμενης διεργασίας ωρίμανσης του RNA. Οι μελέτες αυτές όχι μόνο έφεραν στο φως νέους μηχανισμούς ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης αλλά αποκάλυψαν και νέες καταλυτικές δραστικότητες του RNA και έδωσαν πολύ σημαντική μαρτυρία υπέρ της υπόθεσης ότι η πρώιμη εξέλιξη της ζωής βασίστηκε σε αυτοαντιγραφόμενα μόρια RNA. Η αποκάλυψη επομένως αυτής της 5

6 μη αναμενόμενης δομής του αδενοϊικού mrna είχε μεγάλο αντίκτυπο σε πολλούς διαφορετικούς τομείς της κυτταρικής και μοριακής βιολογίας. Παρόμοιες μελέτες σε κλωνοποιημένα γονίδια ευκαρυωτικών κυττάρων αποκάλυψαν την ύπαρξη ιντρονίων. Η ανάλυση με ηλεκτρονική μικροσκοπία υβριδίων RNA-DNA και ο προσδιορισμός αλληλουχίας των αντίστοιχων μορίων γονιδιωματικού DNA και cdna έδειξε ότι η κωδική περιοχή του γονιδίου της β-σφαιρίνης του ποντικού, που κωδικοποιεί την β-υπομονάδα της αιμοσφαιρίνης, διακόπτεται από δύο ιντρόνια που απομακρύνονται από το mrna με μάτισμα (Εικ. 5.4). ΕΙΚΟΝΑ 5.4: Το γονίδιο της β-σφαιρίνης του ποντικιού. Το γονίδιο αυτό περιέχει δύο ιντρόνια, τα οποία διαιρούν την κωδική περιοχή σε τρία εξόνια. Το εξόνιο 1 κωδικοποιεί την αλληλουχία αμινοξέων 1-30, το εξόνιο 2 την αλληλουχία και το εξόνιο 3 την αλληλουχία Τα εξόνια 1 και 3 περιέχουν επίσης περιοχές των δύο άκρων 5 και 3 του mrna που δε μεταφράζονται σε πρωτεΐνη (5 και 3 UTR). Η δομή ιντρονίου-εξονίου πολλών γονιδίων ευκαρυωτικών κυττάρων είναι περίπλοκη και η ποσότητα του DNA στις αλληλουχίες των ιντρονίων είναι συνήθως μεγαλύτερη από αυτή των εξονίων. Για παράδειγμα, ένα ανθρώπινο γονίδιο περιέχει κατά μέσο όρο 9 εξόνια και 8 ενδιάμεσα ιντρόνια και έχει μήκος ~ ζεύγη βάσεων ή 30 κιλοβάσεις (kb; kilobases) (Πίνακας 5.1). ΠΙΝΑΚΑΣ 5.1: Χαρακτηριστικά ενός μέσου τυπικού γονιδίου του ανθρώπου Το συνολικό μέγεθος των εξονίων είναι ~2.5 kb συμπεριλαμβανομένων των περιοχών των 2 άκρων 5 και 3 του mrna που δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνη (5 και 3 UTR; Untranslated Regions). Συνεπώς τα ιντρόνια αποτελούν πάνω από το 90% του μέσου γονιδίου του ανθρώπου. Ιντρόνια υπάρχουν στα περισσότερα γονίδια των πολύπλοκων ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων. Υπάρχουν βέβαια και εξαιρέσεις, όπως τα γονίδια των ιστονών που δεν έχουν ιντρόνια, γεγονός που δείχνει ότι τα ιντρόνια δεν απαιτούνται για τη γονιδιακή λειτουργία στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Επίσης, στα περισσότερα γονίδια των απλών ευκαρυωτικών οργανισμών όπως των ζυμομυκήτων δεν υπάρχουν ιντρόνια. Όμως, ιντρόνια εντοπίζονται σε σπάνια γονίδια προκαρυωτικών οργανισμών. Επομένως, η παρουσία ή η απουσία ιντρονίων δεν συνιστά ένα απόλυτο κριτήριο διάκρισης μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών γονιδίων, αν και τα ιντρόνια είναι πολύ περισσότερο διαδεδομένα στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (φυτά & ζώα) όπου αποτελούν σημαντικό ποσοστό του συνολικού γονιδιωματικού DNA. Πολλά ιντρόνια έχουν 6

7 συντηρηθεί σε γονίδια των φυτών και των ζώων, που υποδηλώνει ότι εμφανίστηκαν νωρίς κατά την εξέλιξη πριν από τον διαχωρισμό των φυλογενετικών κλάδων φυτών και ζώων. Τα περισσότερα ιντρόνια δεν καθορίζουν τη σύνθεση πρωτεϊνικών προϊόντων, εμπλέκονται ωστόσο σε άλλες σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Πολλά ιντρόνια κωδικοποιούν λειτουργικά μόρια RNA, συμπεριλαμβανομένων των μικρών πυρηνισκικών RNA (small nucleolar RNA; snorna), που συμμετέχουν στην επεξεργασία του rrna, καθώς και των microrna (mirna; mir), που είναι βασικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Τα ιντρόνια περιέχουν επίσης ρυθμιστικές αλληλουχίες που ελέγχουν τη μεταγραφή και την επεξεργασία του mrna. Επιπλέον, τα ιντρόνια επιτρέπουν στα εξόνια ενός γονιδίου να συνενώνονται με διάφορους εναλλακτικούς συνδυασμούς με αποτέλεσμα τη σύνθεση διαφορετικών πρωτεϊνών από το ίδιο γονίδιο. Αυτή η διαδικασία που ονομάζεται εναλλακτικό μάτισμα (alternative splicing) (Εικ. 5.5), συμβαίνει συχνά στα γονίδια των πολύπλοκων ευκαρυωτικών οργανισμών. Θεωρείται ότι τα περισσότερα ανθρώπινα γονίδια έχουν τη δυνατότητα εναλλακτικού ματίσματος παράγοντας κατά μέσο όρο 5 διαφορετικά μόρια mrna ανά γονίδιο. Επομένως το εναλλακτικό μάτισμα επεκτείνει σε σημαντικό βαθμό το ρεπερτόριο των λειτουργιών των γονιδίων του γονιδιώματος του ανθρώπου. ΕΙΚΟΝΑ 5.5: Εναλλακτικό μάτισμα. Το γονίδιο που απεικονίζεται περιέχει έξι εξόνια, μεταξύ των οποίων παρεμβάλλονται πέντε ιντρόνια. Το εναλλακτικό μάτισμα επιτρέπει συρραφή των εξονίων αυτών σε διαφορετικούς συνδυασμούς, με αποτέλεσμα τη σύνθεση τριών διακριτών μορίων mrna και επομένως τριών διαφορετικών πρωτεϊνών από το αρχικό πρωτογενές μετάγραφο. Θεωρείται επίσης ότι τα ιντρόνια έχουν παίξει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη διευκολύνοντας τον ανασυνδυασμό μεταξύ κωδικών περιοχών (εξονίων) διαφορετικών γονιδίων. Πρόκειται για μια εξελικτική διεργασία που είναι γνωστή ως ανακατονομή εξονίων. Συχνά, διαφορετικά εξόνια κωδικοποιούν λειτουργικά διακριτές πρωτεϊνικές επικράτειες με αποτέλεσμα ο συνδυασμός μεταξύ ιντρονίων από διαφορετικά προϋπάρχοντα γονίδια να οδηγεί σε νέα γονίδια που περιέχουν νέους συνδυασμούς κωδικών περιοχών. Όπως προβλέπεται από αυτή τη θεωρία, οι μελέτες αλληλούχισης DNA απέδειξαν ότι μερικά γονίδια είναι χίμαιρες εξονίων προερχόμενων από άλλα γονίδια. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει ότι νέα γονίδια μπορούν να παραχθούν μέσω ανασυνδυασμού των αλληλουχιών των ιντρονίων. Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA Τα ιντρόνια συμβάλλουν σημαντικά στο μεγάλο μέγεθος των ανώτερων ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων. Στον άνθρωπο, τα ιντρόνια αντιπροσωπεύουν το 20% του συνολικού DNA του γονιδιώματος. Όμως, ακόμη μεγαλύτερο ποσοστό των πολύπλοκων ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων αποτελείται από μη-κωδικές πολυεπαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA. Αυτές οι αλληλουχίες μπορεί να υπάρχουν σε εκατοντάδες χιλιάδες αντίγραφα σε ένα γονιδίωμα ανακαλύφθηκαν από 7

8 τους Roy Britten & David Kohne οι οποίοι διερευνούσαν τον ρυθμό επανασύνδεσης αποδιαταγμένων θραυσμάτων κυτταρικού DNA (Εικ. 5.6). ΕΙΚΟΝΑ 5.6: Ταυτοποίηση των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών με δοκιμασία επανασύνδεσης DNA. Παρουσιάζεται η κινητική της επανασύνδεσης θραυσμάτων DNA E. coli και DNA βοός ως συνάρτηση του C0t, που είναι το γινόμενο της αρχικής συγκέντρωσης DNA C0 επί τον χρόνο επώασης t. Το DNA της E. coli επανασυνδέεται με ομοιογενή ρυθμό, υποδεικνύοντας ότι κάθε θραύσμα DNA αντιπροσωπεύεται μία μόνο φορά στο γονιδίωμα των 4.6x106 bp. Αντίθετα, τα θραύσματα DNA του βοός εμφανίζουν δύο διακριτά βήματα επανασύνδεσης. Το ~60% των θραυσμάτων αυτών (οι μη επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες) επανασυνδέεται πιο αργά απ ότι το DNA της E. coli, όπως θα αναμενόταν για αλληλουχίες που συναντώνται μία μόνο φορά στο μεγαλύτερου μεγέθους γονιδίωμα του βοός (3x109 bp). Ωστόσο, το υπόλοιπο 40% (οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες) επανασυνδέεται ταχύτερα απ ότι το DNA της E. coli, γεγονός που υποδεικνύει ότι περιέχει πολλαπλά αντίγραφα αυτών των αλληλουχιών. Εφόσον η επανασύνδεση του DNA είναι μια αντίδραση δύο μορίων (οι 2 διαχωρισμένοι κλώνοι του αποδιαταγμένου DNA πρέπει να έρθουν αντιμέτωποι ο ένας με τον άλλον για να υβριδιστούν), ο ρυθμός επανασύνδεσης εξαρτάται από τη σχετική συγκέντρωση των δύο κλώνων DNA. Όταν θραύσματα DNA της E. Coli αποδιατάχθηκαν και αφέθηκαν να υβριδιστούν μεταξύ τους, όλα τα μόρια DNA επανασυνδέθηκαν με τον ίδιο ρυθμό, όπως αναμένεται στην περίπτωση που κάθε αλληλουχία αντιπροσωπεύεται μια μόνο φορά στο γονιδίωμα. Όμως, η επανασύνδεση θραυσμάτων DNA κυττάρων θηλαστικών έδειξε ένα διαφορετικό πρότυπο. Το ~50% των θραυσμάτων DNA επανασυνδεόταν με το ρυθμό που αναμένεται με αλληλουχίες μοναδικές στο γονιδίωμα, ενώ τα υπόλοιπα επανασυνδέονταν πολύ γρηγορότερα. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων ήταν ότι ορισμένες αλληλουχίες υπήρχαν σε πολλά αντίγραφα και γι αυτό επανασυνδέονταν πιο γρήγορα από τις αλληλουχίες που υπήρχαν μόνο μια φορά στο γονιδίωμα. Άρα, το ~50% του DNA των θηλαστικών αποτελείται από πολυεπαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, ορισμένες από τις οποίες επαναλαμβάνονται 105 ως 106 φορές. Περαιτέρω αναλύσεις που κορυφώθηκαν με την αλληλούχιση ολόκληρων γονιδιωμάτων οδήγησαν στον προσδιορισμό διαφόρων τύπων αυτών των πολυεπαναλαμβανόμενων αλληλουχιών (Πίνακας 5.2). ΠΙΝΑΚΑΣ 5.2: Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του γονιδιώματος του ανθρώπου *Το ποσοστό των επαναλήψεων απλών αλληλουχιών υπολογίζεται από το κλάσμα ετεροχρωματίνης του γονιδιώματος του ανθρώπου. 8

9 Μια κατηγορία που ονομάζεται επαναλήψεις απλών αλληλουχιών (simple-sequence repeats) αποτελείται από συνεχείς συστοιχίες χιλιάδων αντιγράφων μικρών αλληλουχιών με μήκος από 1 έως 500 νουκλεοτίδια. Ένας τύπος επαναλήψεων απλών αλληλουχιών της Drosophila είναι οι συνεχείς επαναλήψεις του επτανουκλεοτιδίου ACAAACT. Λόγω της διαφορετικής σύνθεσης των βάσεων τους, πολλές απλές αλληλουχίες DNA μπορούν να διαχωριστούν από το υπόλοιπο γονιδιωματικό DNA με φυγοκέντριση ισορροπίας σε διαλύματα διαβαθμισμένης πυκνότητας CsCl. Η πυκνότητα του DNA καθορίζεται από τη σύνθεση των βάσεων του, εφόσον αλληλουχίες πλούσιες σε Α και T (AT-rich) έχουν μικρότερη πυκνότητα από αλληλουχίες πλούσιες σε G και C (GC-rich) [ρat < ρgc]. ΕΙΚΟΝΑ 5.7: Δορυφορικό DNA. Η φυγοκέντριση ισορροπίας του DNA της Drosophila σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας CsCl διαχωρίζει τα δορυφορικά DNA (που συμβολίζονται με Ι έως IV) με πυκνότητες επίπλευσης 1,672, 1,687 και 1,705 g/cm3 από την κύρια ζώνη του γονιδιωματικού DNA (πυκνότητα επίπλευσης 1,701). Επομένως, στις φυγοκεντρίσεις ισορροπίας διαβαθμισμένης πυκνότητας CsCl, οι επαναλήψεις απλών αλληλουχιών DNA που είναι εμπλουτισμένες με βάσεις Α και T εμφανίζονται σε ζώνες χαμηλότερης πυκνότητας από ότι το μεγαλύτερο μέρος του γονιδιωματικού DNA της Drosophila (Εικ. 5.7). Τέτοιες επαναλήψεις απλών αλληλουχιών DNA που συγκεντρώνονται σε δορυφορικές ζώνες των διαβαθμίσεων CsCl διακριτές από την κύρια ζώνη DNA, αναφέρονται ως δορυφορικό DNA (Satellite DNA). Αυτές οι αλληλουχίες επαναλαμβάνονται εκατομμύρια φορές σε κάθε γονιδίωμα αντιπροσωπεύοντας περίπου το 10% του DNA των περισσοτέρων ευκαρυωτικών οργανισμών. Οι επαναλήψεις απλών αλληλουχιών DNA δε μεταγράφονται και δε μεταβιβάζουν λειτουργική γενετική πληροφορία. Ορισμένες απ αυτές έχουν σημαντικούς ρόλους στη δομική οργάνωση των χρωμοσωμάτων. Ορισμένες άλλες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA δεν είναι συγκεντρωμένες σε συστοιχίες επαναλήψεων, αλλά είναι διάσπαρτες στο γονιδίωμα. Αυτά τα διάσπαρτα επαναλαμβονόμενα στοιχεία έχουν καθοριστική συμβολή στο μέγεθος των γονιδιωμάτων και αντιστοιχούν στο ~45% του γονιδιωματικού DNA του ανθρώπου. Οι 2 περισσότερο διαδεδομένες κατηγορίες αυτών των αλληλουχιών είναι τα: 2. Βραχέα διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων ή στοιχεία SINE (Short Interspersed Nucleotide Elements) 3. Μακρά διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων ή στοιχεία LINE (Long Interspersed Nucleotide Elements) Τα στοιχεία SINE έχουν μήκος bp, και ~1.5 εκατομμύρια αλληλουχίες SINE εντοπίζονται διάσπαρτες μέσα στο ανθρώπινο γονιδίωμα καταλαμβάνοντας το ~13% του συνολικού DNA. Τα στοιχεία SINE μεταγράφονται σε RNA αλλά δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες, και 9

10 η λειτουργία τους είναι άγνωστη. Σ αυτήν την κατηγορία ανήκουν και οι αλληλουχίες Alu (Alu sequences) μήκους ~300 bp. Τα στοιχεία Alu προέρχονται από το 7SL RNA, είναι τα πιο άφθονα μεταθετά στοιχεία και ενθέσεις ή μεταλλάξεις Alu στο γονιδίωμα έχουν συνδεθεί με διάφορες νόσους (υπερχοληστερολαιμία, αιμοροφιλία, Alzheimer s, Σακχαρώδης διαβήτης τύπου ΙΙ και καρκίνος μαστού, πνεύμονα και στομάχου). Τα κυριότερα στοιχεία LINE του ανθρώπινου γονιδιώματος έχουν μήκος 4-6 kb. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα εντοπίζονται επαναλήψεις αλληλουχιών LINE που καταλαμβάνουν το ~21% του συνολικού DNA. Τα στοιχεία LINE μεταγράφονται και ορισμένα απ αυτά κωδικοποιούν πρωτεΐνες χωρίς να είναι γνωστός ο ρόλος τους στη φυσιολογία του κυττάρου. Τα στοιχεία SINE και LINE είναι μεταθετά στοιχεία, δηλ. στοιχεία DNA που έχουν την ικανότητα να μετακινούνται σε διαφορετικές θέσεις του γονιδιώματος. Και τα δύο στοιχεία είναι ρετροτρανσποζόνια (retrotransposons), δηλ. η μετάθεση τους επιτυγχάνεται μέσω αντίστροφης μεταγραφής (Εικ. 5.8). Στον άνθρωπο, ένα χαρακτηριστικό ρετροτρανσπιοζόνιο είναι το μεταθετό στοιχείο L1 (L1 transposable element, LINE-1). Είναι μια αλληλουχία που επαναλαμβάνεται πολύ συχνά και αντιπροσωπεύει το ~15% του συνολικού ανθρώπινου γονιδιώματος. Τα περισσότερα αντίγραφα του στοιχείου L1 είναι πλέον ακίνητα και λίγα διατηρούν την ικανότητα να μετακινούνται. Η μετατόπιση του L1 μπορεί σποραδικά να προκαλέσει νοσήματα στον άνθρωπο: μια ιδιαίτερη μορφή αιμορροφιλίας προκαλείται από ενσωμάτωση ενός στοιχείου L1 στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον παράγοντα VIII, μια πρωτεΐνη απαραίτητη για τη σωστή πήξη του αίματος. Το RNA αντίγραφο ενός SINE ή LINE μετατρέπεται μέσα στο κύτταρο σε DNA από την αντίστροφη μεταγραφάση και το νέο αντίγραφο DNA ενσωματώνεται σε μια νέα θέση του γονιδιώματος. ΕΙΚΟΝΑ 5.8: Μετάθεση ρετροτρανσποζονίων. Ένα ρετροτρανσποζόνιο που εντοπίζεται σε μια θέση χρωμοσωμικού DNA μεταγράφεται σε RNA και στη συνέχεια μετατρέπεται σε DNA με αντίστροφη μεταγραφή. Το DNA ρετροτρανσποζόνιο μπορεί κατόπιν να ενσωματωθεί σε μια νέα χρωμοσωμική θέση. 4. Μια τέταρτη κατηγορία διάσπαρτων επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, που μοιάζουν πολύ με ρετροϊούς, ονομάζονται στοιχεία ρετροϊκού τύπου (retroviral-like elements), και τα οποία μετατίθενται επίσης σε διαφορετικές θέσεις του γονιδιώματος μέσω αντίστροφης μεταγραφής. Το μήκος των στοιχείων ρετροϊκού τύπου του ανθρώπου κυμαίνεται από 2-10 kb. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα υπάρχουν περίπου στοιχεία ρετροϊκού τύπου που καταλαμβάνουν το ~8% του συνολικού DNA. 5. Η πέμπτη κατηγορία διάσπαρτων επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, τα DNA τρανσποζόνια (DNA transposons), μετακινούνται στο γονιδίωμα μέσω απλής αντιγραφής και ένθεσης των αντιγράφων DNA σε νέες θέσεις και όχι μέσω αντίστροφης μεταγραφής. Το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει ~ αντίγραφα τρανσποζονίων DNA με μήκος bp, και καταλαμβάνουν το ~3% του συνολικού DNA. Επομένως, το μισό περίπου του ανθρώπινου γονιδιώματος αποτελείται από διάσπαρτα επαναλαμβανόμενα στοιχεία που έχουν αντιγραφεί και μετατεθεί σε διάφορες θέσεις στο γονιδίωμα με μεσολάβηση ενδιάμεσων μορίων RNA ή DNA. Η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των στοιχείων μετατίθεται με μεσολάβηση ενδιάμεσων RNA. Επομένως, η αντίστροφη μεταγραφή είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία πάνω από το 40% του ανθρώπινου γονιδιώματος. 10

11 Μερικές από τις διάσπαρτες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες συμβάλλουν στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, όμως οι περισσότερες δεν είναι χρήσιμες στα κύτταρα. Αντίθετα, φαίνεται ότι αντιπροσωπεύουν στοιχεία εγωϊστικού DNA (selfish DNA) που έχουν επιλεχθεί για την ικανότητα τους να αντιγράφονται μέσα στο γονιδίωμα και όχι για τη συνεισφορά κάποιου επιλεκτικού πλεονεκτήματος στον ξενιστή τους. Ωστόσο, τα μεταθετά στοιχεία έχουν παίξει καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ανακατανομής γονιδίων, η οποία έχει συμβάλλει στη δημιουργία της γενετικής ποικιλότητας. Διπλασιασμός γονιδίων και Ψευδογονίδια Ένας άλλος παράγοντας που συμβάλλει στο μεγάλο μέγεθος των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων είναι η ύπαρξη πολλών γονιδίων σε πολλαπλά αντίγραφα μερικά από τα οποία δεν είναι λειτουργικά. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα πολλαπλά αντίγραφα γονιδίων είναι αναγκαία για την παραγωγή μορίων RNA ή πρωτεϊνών που απαιτούνται σε μεγάλες ποσότητες, όπως rrna ή ιστονών. Σε άλλες περιπτώσεις, διακριτά μέλη μιας ομάδας συγγενικών γονιδίων που αναφέρεται ως οικογένεια γονιδίων (gene family), είναι δυνατόν να εκφράζεται σε διαφορετικούς ιστούς ή σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης. Για παράδειγμα, οι υπομονάδες α και β της αιμοσφαιρίνης κωδικοποιούνται στο ανθρώπινο γονιδίωμα από διακριτές οικογένειες γονιδίων, διαφορετικά μέλη των οποίων εκφράζονται στους πρώιμους εμβρυικούς ιστούς, στους ιστούς του κυοφορούμενου εμβρύου ή στους ιστούς του ενήλικα (Εικ. 5.9). Τα μέλη πολλών οικογενειών γονιδίων (π.χ. σφαιρινών) είναι συγκεντρωμένα σε μια συγκεκριμένη περιοχή του DNA, ενώ τα μέλη άλλων οικογενειών βρίσκονται διάσπαρτα σε διαφορετικά χρωμοσώματα. ΕΙΚΟΝΑ 5.9: Οι οικογένειες γονιδίων των σφαιρινών. Τα μέλη των οικογενειών γονιδίων της ασφαιρίνης και της β-σφαιρίνης του ανθρώπου εντοπίζονται σε ομάδες, στα χρωμοσώματα 16 και 11 αντίστοιχα. Εκτός από μη λειτουργικά αντίγραφα γονιδίων (ψευδογονίδια), καθεμία από τις δύο οικογένειες περιλαμβάνει γονίδια που εκφράζονται ειδικά σε πρώιμους εμβρυϊκούς ιστούς, εμβρυϊκούς ιστούς του κυήματος και ιστούς του ενήλικα. Οι οικογένειες γονιδίων θεωρείται ότι έχουν προέλθει από διπλασιασμό ενός αρχικού προγονικού γονιδίου, μετά τον οποίο διαφορετικά μέλη της οικογένειας απέκλιναν μεταξύ τους ως συνέπεια της συσσώρευσης μεταλλάξεων κατά την εξέλιξη. Αυτή η απόκλιση μπορεί να οδηγήσει στην εξέλιξη συγγενικών πρωτεϊνών που εμφανίζουν βέλτιστες εξειδικεύσεις λειτουργίας για διαφορετικούς ιστούς ή για διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Για παράδειγμα, οι σφαιρίνες του κυοφορούμενου εμβρύου έχουν μεγαλύτερη συγγένεια προς το O2 απ' ότι οι σφαιρίνες του ενήλικα. Αυτή η διαφορά επιτρέπει στο κύημα να προσλαμβάνει O2 από την κυκλοφορία του αίματος της μητέρας. Ωστόσο, δεν είναι όλες οι μεταλλάξεις ενισχυτικές της γονιδιακής λειτουργίας. Ορισμένα αντίγραφα γονιδίων έχουν διατηρήσει μεταλλάξεις που οδηγούν σε απώλεια της ικανότητας παραγωγής ενός λειτουργικού γονιδιακού προϊόντος. Π.χ. οι οικογένειες γονιδίων των α-σφαιρινών και β-σφαιρινών του ανθρώπου περιέχουν γονίδια που έχουν απενεργοποιηθεί λόγω της συσσώρευσης μεταλλαγών κατά την εξέλιξη. Τέτοια μη λειτουργικά αντίγραφα γονιδίων, τα ψευδογονίδια (pseudogenes), αντιπροσωπεύουν εξελικτικά κατάλοιπα, που αυξάνουν το μέγεθος των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων χωρίς να συμβάλλουν σε γενετική λειτουργικότητα. Μελέτες έχουν ταυτοποιήσει πάνω από ψευδογονίδια στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Αν ο αριθμός 11

12 αυτός θεωρείται υποεκτίμηση του πραγματικού αριθμού ψευδογονιδίων, το ανθρώπινο γονιδίωμα πιθανά να περιέχει πολύ περισσότερα ψευδογονίδια απ' ότι λειτουργικά γονίδια. Διπλασιασμοί γονιδίων (Gene duplications) μπορεί να προκύψουν με 2 διακριτούς μηχανισμούς: 1. Ο διπλασιασμός ενός τμήματος DNA μπορεί να οδηγήσει στη μετάθεση μιας ολόκληρης αλληλουχίας σε μια νέα θέση στο γονιδίωμα. Τέτοιοι διπλασιασμοί τμημάτων DNA μεγέθους από 1 kb - >50 kb υπολογίζεται ότι αντιπροσωπεύουν περίπου το 5% του ανθρώπινου γονιδιώματος. 2. Εναλλακτικά, τα γονίδια μπορεί να διπλασιαστούν μέσω αντίστροφης μεταγραφής ενός mrna και ενσωμάτωσης του αντιγράφου cdna σε μια νέα χρωμοσωμική θέση (Εικ. 5.10), όπως συμβαίνει και με τα επαναλαμβανόμενα στοιχεία που μετατίθενται με τη μεσολάβηση ενδιάμεσων μορίων RNA. Με αυτόν τον τρόπο διπλασιασμού σχηματίζονται γονιδιακά αντίγραφα που δεν έχουν ούτε ιντρόνια ούτε τις αλληλουχίες που καθοδηγούν τη μεταγραφή του γονιδίου σε mrna. Το προϊόν του διπλασιασμού ενός γονιδίου μέσω αντίστροφης μεταγραφής είναι συνήθως ένα αδρανοποιημένο αντίγραφο γονιδίου που ονομάζεται επεξεργασμένο ψευδογονίδιο (processed pseudogene). Τα ~⅔ των ψευδογονιδίων που έχουν ταυτοποιηθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα αντιστοιχούν σε επεξεργασμένα ψευδογονίδια. ΕΙΚΟΝΑ 5.10: Σχηματισμός ενός επεξεργασμένου ψευδογονιδίου. Η μεταγραφή και το μάτισμα ενός γονιδίου αποδίδει ένα μόριο mrna από το οποίο έχουν απομακρυνθεί τα ιντρόνια. Το μόριο mrna αντιγράφεται από την αντίστροφη μεταγραφάση, αποδίδοντας ένα αντίγραφο cdna χωρίς ιντρόνια. Η ενσωμάτωση αυτού του cdna στο χρωμοσωμικό DNA οδηγεί στον σχηματισμό ενός επεξεργασμένου ψευδογονιδίου. Η εξέλιξη της οικογένειας γονιδίων σφαιρίνης δείχνει πώς συνεισφέρουν οι διπλασιασμοί του DNA στην εξέλιξη των οργανισμών Η οικογένεια των γονιδίων σφαιρίνης είναι ένα παράδειγμα για τη δημιουργία νέων πρωτεϊνών με διπλασιασμό του DNA επειδή έχει μελετηθεί πολύ καλά η εξελικτική ιστορία της. Η ομολογία των μορίων σφαιρίνης ως προς την αλληλουχία των αμινοξέων και τη δομή υποδηλώνει ότι πρέπει όλα να προήλθαν από ένα κοινό, αρχέγονο γονίδιο, παρόλο που τα γονίδια που κωδικοποιούν μερικές από αυτές τις σφαιρίνες σήμερα βρίσκονται σε πολύ απομακρυσμένες θέσεις του γονιδιώματος των θηλαστικών. Ορισμένα γεγονότα που οδήγησαν στην εμφάνιση των ποικίλων τύπων αιμοσφαιρίνης συνάγονται από τη μελέτη των διαφορετικών μορφών της αιμοσφαιρίνης σε οργανισμούς που βρίσκονται σε διαφορετικές θέσεις του φυλογενετικού δέντρου της ζωής. Πρωτεΐνες πρόσδεσης O2 συγγενείς με την αιμοσφαιρίνη υπάρχουν ακόμα και στα βακτήρια. Ωστόσο, είναι ιδιαίτερα σημαντικές σε πολυκύτταρα ζώα μεγάλου μεγέθους που για να οξυγονώσουν επαρκώς τους ιστούς τους δεν μπορεί να βασιστούν στην απλή διάχυση O2 διαμέσου της επιφάνειας του σώματος. Στα ζώα, το πιο αρχέγονο μόριο μεταφοράς O2 είναι μια πολυπεπτιδική αλυσίδα σφαιρίνης ~150 αμινοξέων, που υπάρχει σε θαλάσσια σκουλήκια, έντομα και αρχέγονα ψάρια. Στα ανώτερα σπονδυλωτά, το μόριο της αιμοσφαιρίνης αποτελείται από δύο διαφορετικά είδη αλυσίδων σφαιρίνης. Φαίνεται ότι πριν από ~500 εκατομμύρια χρόνια, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των ανώτερων ψαριών, συνέβη μια σειρά μεταλλάξεων και διπλασιασμών γονιδίων, δημιουργώντας δύο ελαφρώς διαφορετικά γονίδια, ένα για την α- και ένα για τη β-αλυσίδα 12

13 σφαιρίνης. Στα σύγχρονα ανώτερα σπονδυλωτά, κάθε μόριο αιμοσφαιρίνης είναι ένα σύμπλοκο δύο α- και δύο β-αλυσίδων. Οι τέσσερεις θέσεις πρόσδεσης του O2 στο μόριο α2β2 αλληλεπιδρούν. Το μόριο υφίσταται αλλοστερική αλλαγή καθώς προσδένει και απελευθερώνει O2 και αυτό κάνει την αιμοσφαιρίνη πιο αποτελεσματικό φορέα O2 από το αντίστοιχο, απλούστερο, μονομερές μόριο. Ακόμα αργότερα, κατά την εξέλιξη των θηλαστικών, το γονίδιο της β-σφαιρίνης φαίνεται ότι διπλασιάστηκε και μεταλλάχθηκε, αποδίδοντας έτσι μια δεύτερη αλυσίδα β-τύπου που συντίθεται ειδικά στο έμβρυο. Η προκύπτουσα αιμοσφαιρίνη έχει υψηλότερη συγγένεια για το O2 από την αιμοσφαιρίνη του ενηλίκου και έτσι βοηθά στη μεταφορά του O2 από τη μητέρα προς το βρέφος. Το γονίδιο για τη νέα αλυσίδα β-τύπου (γ-γονίδιο) στη συνέχεια μεταλλάχθηκε και ξαναδιπλασιάστηκε. Έτσι παράχθηκε ένα ακόμα νέο γονίδιο, το ε, που εκφράζεται σε πρωϊμότερο στάδιο ανάπτυξης από το γ-γονίδιο, παράγοντας την αιμοσφαιρίνη α2ε2. Σε ακόμη μεταγενέστερο στάδιο κατά την εξέλιξη των πρωτευόντων, το β-γονίδιο διπλασιάστηκε ξανά και έτσι σχηματίστηκε το δ-γονίδιο που συνεισφέρει στη δημιουργία μιας ελάσσονος μορφής αιμοσφαιρίνης (α2δ2) που υπάρχει μόνο στα ενήλικα πρωτεύοντα. Καθένα από αυτά τα διπλασιασμένα γονίδια τροποποιήθηκε από σημειακές μεταλλάξεις που επηρεάζουν τις ιδιότητες μιας αιμοσφαιρίνης όπως επίσης και από αλλαγές σε ρυθμιστικές περιοχές που καθορίζουν το χρόνο και ίο επίπεδο έκφρασης του γονιδίου. Έτσι, κάθε σφαιρίνη παράγεται σε διαφορετικές ποσότητες σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια του ανθρώπου. Η εξέλιξη της οικογένειας γονιδίων σφαιρίνης στον άνθρωπο με επανειλημμένους γύρους διπλασιασμού-μετάλλαξης. Ένα αρχέγονο γονίδιο σφαιρίνης διπλασιάστηκε και οδήγησε στη δημιουργία της οικογένειας γονιδίων β-σφαιρίνης και της συγγενούς οικογένειας γονιδίων ασφαιρίνης. Στα σπονδυλωτά, το μόριο της αιμοσφαιρίνης αποτελείται από δύο α και δύο β αλυσίδες. Το διάγραμμα σχεδιάστηκε με βάση τα δεδομένα που προέκυψαν από τη σύγκριση των γονιδίων σφαιρίνης πολλών διαφορετικών οργανισμών. Για παράδειγμα, οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων των γονιδίων γg και γα, που παράγουν αλυσίδες της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, μοιάζουν πολύ περισσότερο μεταξύ τους απ' ότι με την αλληλουχία του «ενήλικου» β-γονιδίου. Η εντόπιση των γονιδίων σφαιρίνης στο ανθρώπινο γονιδίωμα παρουσιάζεται στο πάνω μέρος της εικόνας (δεξιά). 13

14 Το τελικό αποτέλεσμα των διεργασιών διπλασιασμού γονιδίων που ευθύνονται για την ποικιλότητα των γονιδίων σφαιρίνης είναι εμφανές στα ανθρώπινα γονίδια που προήλθαν από το αυθεντικό β-γονίδιο. Αυτά τα γονίδια είναι παραταγμένα σε μια συστοιχία ομόλογων αλληλουχιών DNA κοντά η μια στην άλλη. Ένα παρόμοιο άθροισμα α-γονιδίων σφαιρίνης εντοπίζεται πάνω σ' ένα ξεχωριστό ανθρώπινο χρωμόσωμα. Τα δύο αθροίσματα γονιδίων σφαιρίνης (α και β) βρίσκονται σε ξεχωριστά χρωμοσώματα στα πτηνά και στα σπονδυλωτά, ενώ εντοπίζονται στο ίδιο χρωμόσωμα του βατράχου Xenopus. Για το λόγο αυτό, πιστεύεται ότι διαχωρίστηκαν από μια χρωμοσωματική θραύση που συνέβη περίπου πριν από 300 εκατομμύρια χρόνια. Τα δύο αθροίσματα γονιδίων περιέχουν αρκετές διπλασιασμένες αλληλουχίες DNA σφαιρίνης που όμως δεν είναι λειτουργικά γονίδια, αλλά ψευδογονίδια. Τα ψευδογονίδια είναι πολύ ομόλογα με τα λειτουργικά γονίδια, αλλά έχουν αδρανοποιηθεί από μεταλλάξεις που παρεμποδίζουν την έκφραση τους. Η ύπαρξη των ψευδογονιδίων πιστοποιεί ότι κάθε διπλασιασμός δεν οδηγεί πάντοτε σ' ένα νέο λειτουργικό γονίδιο. Η σύνθεση των γονιδιωμάτων των ανώτερων ευκαρυωτών Αφού συζητήθηκαν οι διάφοροι τύποι μη κωδικού DNA που συνεισφέρουν στην πολυπλοκότητα των γονιδιωμάτων των ανώτερων ευκαρυωτών, είναι ενδιαφέρον να γίνει μια γενική θεώρηση της σύνθεσης των κυτταρικών γονιδιωμάτων. Στα βακτηριακά γονιδιώματα, το μεγαλύτερο μέρος του DNA κωδικοποιεί πρωτεΐνες. Για παράδειγμα, το γονιδίωμα της E. coli έχει μήκος ~4.6x106 bp και περιέχει περίπου γονίδια, χρησιμοποιώντας το 90% σχεδόν του DNA για κωδικοποίηση πρωτεϊνών. Το γονιδίωμα του σακχαρομύκητα, που αποτελείται από 12x106 bp, είναι πολύ συμπαγές, παρότι έχει μήκος περίπου 2,5 φορές μεγαλύτερο από αυτό του γονιδιώματος της E. coli. Μόνο το 4% των γονιδίων του Saccharomyces cereviciae περιέχει ιντρόνια, συνήθως τα γονίδια αυτά έχουν ένα μόνο μικρό ιντρόνιο κοντά στο κωδικόνιο έναρξης. Το ~70% του γονιδιώματος του σακχαρομύκητα χρησιμοποιείται για την κωδικοποίηση πρωτεϊνών, ο συνολικός αριθμός των οποίων υπολογίζεται στις Τα σχετικά απλά ζωικά γονιδιώματα του C. elegans και της Drosophila είναι ~10 φορές μεγαλύτερα από το γονιδίωμα του σακχαρομύκητα, αλλά περιέχουν μόνο 2 έως 3 φορές περισσότερα γονίδια. Όμως, αυτά τα απλά ζωικά γονιδιώματα περιέχουν περισσότερα ιντρόνια και περισσότερες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, με συνέπεια οι κωδικές τους αλληλουχίες να περιορίζονται κατά προσέγγιση στο 25% του γονιδιώματος του C. elegans και στο 13% του γονιδιώματος της Drosophila. Ο πρότυπος φυτικός οργανισμός Arabidopsis έχει παρεμφερή αριθμό γονιδίων, ενώ το 26% περίπου του γονιδιώματός του αντιστοιχεί σε κώδικες αλληλουχίες. Τα γονιδιώματα των ανώτερων ζώων (π.χ. ανθρώπου) είναι περίπου φορές μεγαλύτερα από τα γονιδιώματα του C. elegans και της Drosophila. Ωστόσο, μια σημαντική έκπληξη που επιφύλαξε η αποκρυπτογράφηση των αλληλουχιών του DNA του ανθρώπου ήταν η αποκάλυψη ότι το γονιδίωμα του ανθρώπου περιέχει μόνο γονίδια. Φαίνεται ότι μόνο το 1,2% του γονιδιώματος του ανθρώπου απαρτίζεται από κώδικες αλληλουχίες. Περίπου το 20% του γονιδιώματος αποτελείται από ιντρόνια, πάνω από 60% συνίσταται από επαναλαμβανόμενες και διπλασιασμένες αλληλουχίες DNA διαφόρων τύπων και το υπόλοιπο ποσοστό αντιστοιχεί σε ψευδογονίδια, μη επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μεσοδιαστήματος μεταξύ των γονιδίων και αλληλουχίες εξονίων στα 5' και 3' άκρα μορίων mrna που δε μεταφράζονται (5' και 3' UTR). Κατά συνέπεια, το αυξημένο μέγεθος των γονιδιωμάτων των ανώτερων ευκαρυωτών οφείλεται κατά κύριο λόγο στην παρουσία μεγάλων ποσοτήτων επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και ιντρονίων και όχι σε αυξημένο αριθμό γονιδίων Χρωματίνη και Χρωμοσώματα Τα γονιδιώματα των περισσοτέρων ευκαρυωτικών οργανισμών είναι πολυπλοκότερα και οργανωμένα με διαφορετικό τρόπο από τα γονιδιώματα των προκαρυωτικών. Το προκαρυωτικό γονιδίωμα περιέχεται σε ένα μόνο χρωμόσωμα, που συνήθως είναι ένα κυκλικό μόριο DNA. Αντίθετα, το ευκαρυωτικό γονιδίωμα αποτελείται από πολλαπλά χρωμοσώματα, καθένα από τα οποία περιέχει ένα γραμμικό μόριο DNA. Αν και ο αριθμός και το μέγεθος των χρωμοσωμάτων 14

15 διαφέρει κατά πολύ μεταξύ διαφορετικών ειδών (Πίνακας 5.3), η βασική δομή του χρωμοσώματος είναι ίδια σ όλους τους ευκαρυώτες. Το DNA των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι ισχυρά συνδεδεμένο σε μικρές βασικές πρωτεΐνες, τις ιστόνες, που πακετάρουν το DNA μέσα στον πυρήνα του κυττάρου. Αυτή η οργάνωση είναι σημαντική καθώς το συνολικό γραμμικό μήκος DNA ενός ανθρώπινου κυττάρου είναι ~1-2 m το οποίο θα πρέπει να πακεταριστεί μέσα σε έναν πυρήνα διαμέτρου μόλις 5-10 μm. ΠΙΝΑΚΑΣ 5.3: Μεγέθη γονιδιώματος και αριθμοί χρωμοσωμάτων *Ανά απλοειδές κύτταρο; Mb = εκατομμύρια ζεύγη βάσεων Χρωματίνη Τα σύμπλοκα ευκαρυωτικού DNA και πρωτεϊνών ονομάζονται χρωματίνη. Η χρωματίνη περιέχει περίπου διπλάσια ποσότητα πρωτεΐνης από ότι DNA. Οι κύριες πρωτεΐνες που περιέχει η χρωματίνη είναι οι ιστόνες (histones) ). Οι ιστόνες είναι μικρές πρωτεΐνες με υψηλό ποσοστό βασικών αμινοξέων (αργινίνης και λυσίνης) που διευκολύνουν την πρόσδεση στο αρνητικό φορτισμένο μόριο DNA. Υπάρχουν 5 κύριοι τύποι ιστονών - H1, H2A, H2B, H3 και H4 - που εμφανίζουν μεγάλη εξελικτική συντήρηση μεταξύ των διαφορετικών ειδών ευκαρυωτών (Πίνακας 5.4). ΠΙΝΑΚΑΣ 5.4: Οι σημαντικότεροι τύποι ιστονών Οι ιστόνες αφθονούν στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η συνολική μάζα των ιστονών ενός κυττάρου είναι περίπου ίση με τη συνολική μάζα DNA του κυττάρου. Επομένως, η χρωματίνη περιέχει ίση περίπου μάζα διαφόρων μη-ιστονικών χρωμοσωμικών πρωτεϊνών. Υπάρχουν πάνω από διαφορετικοί τύποι μη-ιστονικών πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε διάφορες διεργασίες, όπως στην αντιγραφή DNA και στη γονιδιακή έκφραση. Βασική δομική μονάδα της χρωματίνης είναι το νουκλεόσωμα (nucleosome). Δύο τύποι πειραμάτων οδήγησαν στο μοντέλο του νουκλεοσώματος του Roger D. Kornberg, 1974 (Εικ. 5.11): 15

16 1. Μερική πέψη της χρωματίνης με μικροκοκκική νουκλεάση (ένζυμο που διασπά το DNA) ότι παράγει θραύσματα DNA μήκους 200 bp. Αντίθετα, μια αντίστοιχη πέψη γυμνού DNA (μη συνδυασμένου με πρωτεΐνες) παράγει μια συνεχή ζώνη θραυσμάτων τυχαίων μεγεθών. Αυτό υποδηλώνει ότι η πρόσδεση των πρωτεϊνών της χρωματίνης στο DNA προστατεύει τις αντίστοιχες περιοχές DNA από τη δράση της μικροκοκκικής νουκλεάσης, ώστε το ένζυμο να μην δρα παρά μόνο σε θέσεις του DNA που απέχουν μεταξύ τους κατά ~200 bp. Αυτό το εύρημα συμβαδίζει με εκείνο της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, ότι οι ίνες της χρωματίνης εμφανίζουν μια εικόνα κομπολογιού του οποίου οι χάντρες απέχουν μεταξύ τους ~200 bp. Επομένως η πέψη και η ηλεκτρονική μικροσκοπία υπέδειξαν ότι η χρωματίνη αποτελείται από επαναλαμβανόμενες μονάδες των 200 bp που ονομάστηκαν νουκλεοσώματα. ΕΙΚΟΝΑ 5.11: Η οργάνωση της χρωματίνης σε νουκλεοσώματα (RD Kornberg, 1974; Nobel Χημείας, 2006). (Α) Το DNA τυλίγεται γύρω από ιστόνες σε πυρηνικά σωμάτια νουκλεοσώματος και σφραγίζεται από την ιστόνη H1. Μη ιστονικές πρωτεΐνες προσδένονται στο συνδετικό DNA μεταξύ των πυρηνικών σωματίων νουκλεοσώματος. (Β) Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα που αναλύει θραύσματα DNA τα οποία προήλθαν από μερική πέψη της χρωματίνης με μικροκοκκική νουκλεάση. Το συνδετικό DNA μεταξύ των πυρηνικών σωματίων νουκλεοσώματος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στη νουκλεάση, με αποτέλεσμα η μερική πέψη της χρωματίνης να αποδίδει τμήματα DNA πολλαπλάσια των 200 bp. (Γ) Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει μια ξεδιπλωμένη ίνα χρωματίνης, η οποία εμφανίζει τη χαρακτηριστική εικόνα κομπολογιού. 2. Εκτενέστερη πέψη της χρωματίνης με μικροκοκκική νουκλεάση παράγει σωμάτια που ονομάζονται πυρηνικά σωμάτια του νουκλεοσώματος (nucleosome core particles), που αντιστοιχούν στις χάντρες που είναι ορατές με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Καθένα απ αυτά τα σωμάτια περιέχει ένα τμήμα DNA των 147 bp που τυλίγεται κατά 1,67 στροφές γύρω από το οκταμερές των πυρηνικών ιστονών, δηλαδή έναν πυρήνα ιστονών αποτελούμενο από ομοδιμερή των ιστονών H2A, H2B, H3 και H4 (Εικ. 5.12). Ένα μόριο της πέμπτης ιστόνης, της ιστόνης H1, προσδένεται στο σημείο εισόδου του DNA στο πυρηνικό σωμάτιο του νουκλεοσώματος. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται μια υπομονάδα χρωματίνης γνωστή ως χρωματόσωμα (chromatosome). 16

17 Το χρωματόσωμα αποτελείται από ένα τμήμα DNA των 166 bp, που είναι τυλιγμένο γύρω απ αυτόν τον πυρήνα των ιστονών και συγκρατείται στη θέση του με τη συνδετική ιστόνη H1. ΕΙΚΟΝΑ 5.12: Η δομή ενός χρωματοσώματος. (Α) Το πυρηνικό σωμάτιο του νουκλεοσώματος αντιστοιχεί σε ένα τμήμα 147 bp DNA τυλιγμένο κατά 1,67 στροφές γύρω από το οκταμερές των ιστονών, δηλαδή γύρω από έναν πυρήνα που αποτελείται από ομοδιμερή των ιστονών H2A, H2B, H3 και H4. Ένα χρωματόσωμα περιέχει δύο πλήρεις στροφές DNA (166 bp) που σφραγίζονται από ένα μόριο H1. (Β) Μοντέλο του πυρηνικού σωματίου του νουκλεοσώματος. Οι δύο αλυσίδες DNA εμφανίζονται με καφέ και γαλαζοπράσινο χρώμα. Οι ιστόνες φαίνονται με μπλε (H3), πράσινο, (H4) κίτρινο (H2A) και κόκκινο (H2B). [Luger K et al. (1997) Nature 389: 251]. Η κρυσταλλική δομή ενός πυρηνικού σωματίου νουκλεοσώματος. Οι ιστόνες H2A, H2B, H3 και H4 είναι χρωματισμένες, και το DNA είναι γκρι. Το πυρηνικό σωμάτιο του νουκλεοσώματος αποτελείται από 8 υπομονάδες - 2 x H2A, 2x H2B, 2x H3, and 2x H4 - γύρω από το οποίο περιτυλίσσεται το DNA. Ένα μόριο της της ιστόνης H1, προσδένεται στο σημείο εισόδου του DNA στο πυρηνικό σωμάτιο του νουκλεοσώματος σχηματίζοντας το χρωματόσωμα, το οποίο αποτελείται από ένα τμήμα DNA των 166 bp, περιτυλιγμένο γύρω απ αυτόν τον πυρήνα των ιστονών και συγκρατείται στη θέση του με τη συνδετική ιστόνη H1. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ιστονών και του DNA είναι ηλεκτροστατικές και οφείλονται στο ότι οι ιστόνες είναι πλούσιες σε θετικά φορτισμένα (βασικά) αμινοξέα, ιδιαίτερα σε λυσίνη (lys) και αργινίνη (Arg), ενώ γενικά το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο. Επίσης, τα Ν-τελικά άκρα των ιστονών προεξέχουν από το νουκλεόσωμα, και είναι αυτές οι προεξοχές που αλληλεπιδρούν με το DNA, και οι οποίες υφίστανται τροποποιήσεις (π.χ. μεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση) 17

18 Σχηματισμός ενός πυρηνικού σωματίου νουκλεοσώματος Το πυρηνικό σωμάτιο του νουκλεοσώματος σχηματίζεται από δύο διμερή των ιστονών Η2Α-Η2Β και ένα τετραμερές των ιστονών Η3-Η4, τα οποία σχηματίζουν μια σχεδόν δύο συμμετρικά ήμισυ μιας τεταρτοταγούς δομής. Το πακετάρισμα του DNA παράγει μια ίνα χρωματίνης διαμέτρου ~10 nm, που αποτελείται από χρωματοσώματα μεταξύ των οποίων παρεμβάλλονται τμήματα συνδετικού DNA με μέσο μήκος ~50 bp (Εικ. 5.13). Στο ΗΜ, αυτή η ίνα των 10 nm εμφανίζει τη χαρακτηριστική εικόνα κομπολογιού που συμφωνεί με το μοντέλο του νουκλεοσώματος. Το πακετάρισμα του DNA σε μια τέτοια ίνα χρωματίνης μικραίνει το μήκος του ~6 φορές. Η χρωματίνη μπορεί να περιελιχθεί και να συμπυκνωθεί περισσότερο σε ίνες διαμέτρου 30 nm, με αποτέλεσμα η συνολική συμπύκνωση να φτάνει τις 50 φορές. Σ αυτό το στάδιο συμπύκνωσης της χρωματίνης, που είναι καθοριστικό για τον έλεγχο της πρόσβασης του DNA σε διεργασίες, όπως η αντιγραφή του DNA ή η μεταγραφή, φαίνεται ότι σημαντικό ρόλο παίζουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων της ιστόνης H1. Μια εσωτερική αναδίπλωση των ινών διαμέτρου 30 nm (η ακριβής δομή της δεν έχει διευκρινιστεί επαρκώς), η χρωματίνη συμπυκνώνεται περαιτέρω μέσα στο κύτταρο. ΕΙΚΟΝΑ 5.13: Ίνες χρωματίνης. Από το πακετάρισμα του DNA σε νουκλεοσώματα προκύπτει μια ίνα χρωματίνης με διάμετρο ~10 nm. Με περαιτέρω αναδίπλωση η χρωματίνη συμπυκνώνεται σε μια ίνα διαμέτρου 30 nm, η οποία περιέχει περίπου έξι νουκλεοσώματα σε κάθε στροφή. 18

19 Με εσωτερική αναδίπλωση των ινών διαμέτρου 30 nm, η χρωματίνη συμπυκνώνεται περαιτέρω μέσα στο κύτταρο. Ίνα χρωματίνης: Έξι νουκλεοσώματα συγκροτούνται σε ένα σωληνοειδές (solenoid) λόγω των αλληλεπιδράσεων της ιστόνης Η1. Τα σωληνοειδή στη συνέχεια περιτυλίσσονται σχηματίζοντας ένα ικρίωμα (Scaffold), το οποίο περιτυλίσσεται περαιτέρω σχηματίζοντας τη χρωμοσωμική μήτρα (chromosomal matrix). Επίπεδο οργάνωσης της χρωματίνης Ορισμένα από τα επίπεδα οργάνωσης της χρωματίνης που οδηγούν στη δημιουργία πολύ συμπυκνωμένου μιτωτικού χρωμοσώματος. Το δίπλωμα ενός μορίου DNA σε νουκλεοσωμάτια είναι το πιο κατανοητό επίπεδο συσκευασίας. Οι δομές που αντιστοιχούν στα περαιτέρω επίπεδα συσκευασίας της χρωματίνης είναι πιο υποθετικές. Οι ίνες της χρωματίνης πιθανόν συφκροτούνται σύμφωνα με το μοντέλο ζιγκζαγκ. cular_visualisations_of_dna central_dogma_part_1_-_transcription/ central_dogma_part_2_-_translation/ 19

20 Στάδια οργάνωσης της χρωματίνης Η έκταση της συμπύκνωσης της χρωματίνης ποικίλλει κατά τη διάρκεια της ζωής του κυττάρου και παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Κατά τη μεσόφαση (όταν τα κύτταρα δε διαιρούνται), το μεγαλύτερο μέρος της χρωματίνης, που ονομάζεται ευχρωματίνη (euchromatin), είναι σχετικά αποσυμπυκνωμένο και διάσπαρτο μέσα στον πυρήνα (Εικ. 5.14). Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης του κυτταρικού κύκλου συμβαίνει μεταγραφή γονιδίων και προετοιμασία της κυτταρικής διαίρεσης με αντιγραφή του DNA.Το μεγαλύτερο ποσοστό της ευχρωματίνης του μεσοφασικού πυρήνα έχει τη μορφή ινών χρωματίνης διαμέτρου 30 nm ή ελαφρά πιο συμπυκνωμένων ινών διαμέτρου nm. Τα γονίδια που μεταγράφονται βρίσκονται στη λιγότερο συμπυκνωμένη μορφή χρωματίνης, ώστε το DNA τους να είναι προσβάσιμο στον μηχανισμό της μεταγραφής. Αντίθετα με την ευχρωματίνη, ένα ποσοστό ~10% της μεσοφασικής χρωματίνης, που ονομάζεται ετεροχρωματίνη (heterochromatin), βρίσκεται σε μορφή πολύ υψηλής συμπύκνωσης και μοιάζει με τη χρωματίνη κυττάρων που βρίσκονται σε μίτωση. Η ετεροχρωματίνη δε μεταγράφεται και περιέχει πολυεπαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA, όπως αυτές των κεντρομερών και των τελομερών. ΕΙΚΟΝΑ 5.14: Μεσοφασική χρωματίνη. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει έναν πυρήνα σε μεσόφαση. Η ευχρωματίνη είναι κατανεμημένη σε όλο τον πυρήνα. Η ετεροχρωματίνη υποδεικνύεται με τριγωνικές σφήνες και ο πυρηνίσκος με βέλος. 20

21 Μόλις αρχίζει η μίτωση των κυττάρων, τα χρωμοσώματα τους συμπυκνώνονται έντονα, έτσι ώστε να μπορούν να διανεμηθούν τα θυγατρικά κύτταρα. Τα συμπαγή μεταφασικά χρωμοσώματα των μιτωτικών κυττάρων θεωρείται ότι σχηματίζονται με εσωτερική αναδίπλωση των βρόχων των ινών χρωματίνης διαμέτρου 30 nm. Η συμπύκνωση του DNA στα χρωμοσώματα αυτά φτάνει σχεδόν τις φορές (Εικ. 5.15). Η τόσο έντονα συμπυκνωμένη χρωματίνη δεν έχει πλέον τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως μήτρα για τη σύνθεση RNA, με αποτέλεσμα η μεταγραφή να σταματά. ΕΙΚΟΝΑ 5.15: Συμπύκνωση της χρωματίνης κατά τη μίτωση. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης που δείχνει μεταφασικά χρωμοσώματα. Έχει προστεθεί τεχνητό χρώμα. Φωτογραφίες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου δείχνουν ότι το DNA των μεταφασικών χρωμοσωμάτων είναι οργανωμένο σε μεγάλους βρόχους που είναι προσδεδεμένοι σε μια πρωτεϊνική σκαλωσιά (Εικ. 5.16). Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει κατανοηθεί ούτε η λεπτομερής δομή αυτής της έντονα συμπυκνωμένης χρωματίνης ούτε ο μηχανισμός συμπύκνωσης της. ΕΙΚΟΝΑ 5.16: Δομή των μεταφασικών χρωμοσωμάτων. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει βρόχους DNA προσδεδεμένους στην πρωτεϊνική σκαλωσιά μεταφασικών χρωμοσωμάτων από τα οποία έχουν αφαιρεθεί οι ιστόνες. (Paulson JR & Laemnil UK (1977) Cell 12: 817) Τα μεταφασικά χρωμοσώματα είναι συμπυκνωμένα σε τέτοιο βαθμό, ώστε η μορφολογία τους να μπορεί να εξεταστεί με φωτονικό μικροσκόπιο (Εικ. 5.17). Διάφορες τεχνικές χρώσης δίνουν χαρακτηριστικές εικόνες εναλλαγής φωτεινών και σκοτεινών ζωνών για κάθε χρωμόσωμα, που προκύπτουν από τη διαφορετική ισχύ πρόσδεσης των χρωστικών ή των φθοριζόντων ανιχνευτών σε αλληλουχίες πλούσιες σε Α και Τ (ΑΤ-rich) και σε αλληλουχίες πλούσιες σε G και C (GC-rich). 21