ΜΕΡΟΣ ΙII: ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9

Transcript

1 Ευάγγελος Κωλέττας, B.Sc (HONS), Ph.D.(LON) Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Βιολογίας Ιατρική Σχολή, Παν/μιο Ιωαννίνων ΜΕΡΟΣ ΙII: ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Ο Πυρήνας ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η παρουσία πυρήνα είναι το βασικό γνώρισμα που διαφοροποιεί τα ευκαρυωτικά κύτταρα από τα προκαρυωτικά. Στεγάζοντας το γονιδίωμα του κυττάρου, ο πυρήνας χρησιμεύει ως χώρος αποθήκευσης της γενετικής πληροφορίας και ως κέντρο ελέγχου για το κύτταρο. Στον πυρήνα γίνεται η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή, καθώς και η ωρίμανση του RNA, ενώ στο κυτταρόπλασμα λαμβάνει χώρα μόνο το τελικό στάδιο της γονιδιακής έκφρασης (η μετάφραση). Ο διαχωρισμός του γονιδιώματος από το κυτταρόπλασμα, που γίνεται με τον πυρηνικό φάκελο, επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μηχανισμών που απαντώνται αποκλειστικά στους ευκαρυώτες. Ενώ στους προκαρυώτες το mrna μεταφράζεται όσο η μεταγραφή του βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη, το mrna των ευκαρυωτών υπόκειται σε αρκετές μορφές μεταμεταγραφικής επεξεργασίας προτού μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Επομένως, η παρουσία του πυρήνα επιτρέπει τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μετα-μεταγραφικών μηχανισμών, όπως είναι το εναλλακτικό μάτισμα. Περιορίζοντας την πρόσβαση επιλεγμένων πρωτεϊνών στο γενετικό υλικό, ο πυρηνικός φάκελος προσφέρει επίσης νέες ευκαιρίες για έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής. Για παράδειγμα, η έκφραση ορισμένων ευκαρυωτικών γονιδίων ελέγχεται από τη ρυθμιζόμενη μεταφορά μεταγραφικών παραγόντων από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, η οποία είναι μια μορφή μεταγραφικής ρύθμισης που δε διαθέτουν οι προκαρυώτες. Ο διαχωρισμός επομένως της θέσης του γονιδιώματος από τη θέση όπου πραγματοποιείται η μετάφραση του mrna έχει κεντρικό ρόλο στη γονιδιακή έκφραση των ευκαρυωτών Ο πυρηνικός φάκελος και η κυκλοφορία μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα Ο πυρηνικός φάκελος διαχωρίζει τα περιεχόμενα του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα και συγκροτεί το δομικό πλαίσιο του πυρήνα. Οι δύο μεμβράνες του πυρηνικού φακέλου δρουν ως φραγμοί που εμποδίζουν την ελεύθερη διέλευση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα ο πυρήνας να συνιστά ένα διακριτό βιοχημικό διαμέρισμα. Οι μόνοι δίαυλοι που διαπερνούν τον πυρηνικό φάκελο είναι τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, τα οποία επιτρέπουν τη ρυθμιζόμενη ανταλλαγή μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η επιλεκτική διακίνηση πρωτεϊνών και RNA μέσω των πυρηνικών πόρων αφενός καθορίζει την εσωτερική σύσταση του πυρήνα και αφετέρου έχει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των ευκαρυωτών. Η δομή του πυρηνικού φακέλου Ο πυρηνικός φάκελος (nuclear envelope) έχει πολύπλοκη δομή. Αποτελείται από δύο πυρηνικές μεμβράνες την πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), η οποία τον επενδύει εσωτερικά, και τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (Εικ. 9.1). Ο πυρήνας περιβάλλεται από ένα σύστημα δύο ομόκεντρων μεμβρανών, που ονομάζονται εσωτερική και εξωτερική πυρηνική μεμβράνη (internal and external nuclear membrane). Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη αποτελεί συνέχεια του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ), με συνέπεια ο χώρος ανάμεσα στην εσωτερική και την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη να συνδέεται άμεσα με τον αυλό του ενδοπλασματικού δικτύου. Η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη είναι λειτουργικά όμοια με τις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου και φέρει ριβοσώματα στην κυτταροπλασματική της επιφάνεια, διαφέρει όμως σε μικρό βαθμό ως προς την πρωτεϊνική της σύσταση, καθώς είναι πλούσια σε μεμβρανικές πρωτεΐνες που προσδένονται στον κυτταροσκελετό και δε διαθέτει τις πρωτεΐνες που προσδίδουν στο ΕΔ τη σωληνοειδή του οργάνωση. Αντίθετα, η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη φέρει πρωτεΐνες που εντοπίζονται αποκλειστικά στον πυρήνα, όπως είναι οι πρωτεΐνες που προσδένονται στην πυρηνικά λάμινα. 1

2 ΕΙΚΟΝΑ 9.1: Ο πυρηνικός φάκελος. Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει: (Α) έναν πυρήνα. Η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (βέλη), και (Β) τη συνέχεια της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης με το ενδοπλασματικό δίκτυο. (Γ) Σχηματική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου. Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη επενδύεται από την πυρηνική λάμινα, η οποία χρησιμεύει ως θέση προσάρτησης της χρωματίνης. Η λειτουργία των πυρηνικών μεμβρανών είναι ζωτικής σημασίας, καθώς δρουν ως ένα φραγμός που διαχωρίζει το περιεχόμενο του πυρήνα από το κυτταρόπλασμα. Όπως όλες οι κυτταρικές μεμβράνες, κάθε πυρηνική μεμβράνη είναι μια φωσφολιπιδική διπλοστιβάδα διαπερατή μόνο από μικρά μη πολικά μόρια. Άλλα μόρια δεν μπορούν να διαπεράσουν τη διπλοστιβάδα με διάχυση. Η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη ενώνονται στα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων, που είναι οι μοναδικοί δίαυλοι μέσω των οποίων μπορούν να διαπεράσουν τον πυρηνικό φάκελο μικρά πολικά μόρια και μακρομόρια (Εικ. 9.2). Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου είναι μια πολύπλοκη δομή που ευθύνεται για την επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών και RNA ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. 2

3 ΕΙΚΟΝΑ 9.2: Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει πυρηνικούς πόρους. Σε αυτό το παρασκεύασμα πυρηνικού φακέλου που έχει υποστεί τεμαχισμό υπό ψύξη διακρίνονται πολλοί πυρηνικοί πόροι (βέλη). Η πυρηνοπλασματική επιφάνεια της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης επενδύεται από την πυρηνική λάμινα (nuclear lamina), ένα ινώδες δίχτυ που παρέχει στον πυρήνα δομική στήριξη (Εικ. 9.3). Η πυρηνική λάμινα αποτελείται από ινώδεις πρωτεΐνες μοριακής μάζας 60 έως 80 kda που ονομάζονται λαμίνες (lamins) καθώς και από τις πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές. Οι λαμίνες είναι μια κατηγορία πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων. Οι άλλες κατηγορίες πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων συναντώνται στον κυτταροσκελετό. Τα κύτταρα των θηλαστικών διαθέτουν τρία γονίδια για τις λαμίνες, τα Α/C, Β1 και B2, που κωδικοποιούν τουλάχιστον επτά διακριτές πρωτεΐνες. ΕΙΚΟΝΑ 9.3: Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει την πυρηνική λάμινα. Η λάμινα είναι ένα δίκτυο ινιδίων που βρίσκεται κάτω από την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και εκτείνεται στο εσωτερικό του πυρήνα [Aebi Α, Cohn J. Buhle L & Gerace L (1986) Nature 323:560]. Σημείωση: Ο κυτταροσκελετός (cytoskeleton) αποτελείται από ένα σύστημα ινιδίων: τα λεπτά ινίδια ή ινίδια ακτίνης (actin filaments) πάχους 7-10 nm, τα παχύτερα ινίδια, τους μικροσωληνίσκους (microtubules) (25 nm) και τα ενδιάμεσα ινίδια (intermediate filaments), ινίδια με ενδιάμεσο πάχος nm. 3

4 Πυρηνικές λαμίνες, ινώδεις πρωτεΐνες ΜΒ kda, που σχηματίζουν ενδιάμεσα ινίδια τύπου V, πάχους nm. Δύο τύποι πυρηνικών λαμινών με όμοια δομή που κωδικοποιούνται από 3 γονίδια: Λαμίνες τύπου Α: A, C, C2 και ΑΔ10 που κωδικοποιούνται από το γονίδιο A/C (LMNA) και προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα. Οι λαμίνες A και C είναι οι κύριοι τύποι, ενώ η C2 εκφράζεται στους όρχεις και η ΑΔ10 στα σωματικά κύτταρα με άγνωστο ρόλο. Λαμίνες τύπου Β: B1, B2 και B3 που κωδικοποιούνται από τα γονίδια Β1 (LMNB1) και B2 (LMNB2). Η λαμίνη B3 εκφράζεται στους όρχεις και κωδικοποιείται από το γονίδιο LMNB2 εναλλακτικό μάτισμα. Οι λαμίνες φέρουν μια μικρή Ν-τελική περιοχή καταλοίπων, την κεφαλή, μια κεντρική αελικοειδή επικράτεια που περιέχει 4 περιοχές 1Α, 1Β, 2Α και 2Β σπειρωμένου σπειράματος που διαχωρίζονται από τις συνδετικές περιοχές L1, L12 και L2, και μια μεγάλη C-τελική περιοχή (ουρά) που φέρει μια Ig σφαιρική επικράτεια και ένα διατηρημένο πλαίσιο CAAX (όπου C, cys) που υπόκειται φαρνεσυλίωση. Οι λαμίνες, όπως και άλλες πρωτεΐνες των ενδιάμεσων ινιδίων, συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας δομές με υψηλότερο βαθμό οργάνωσης (Εικ. 9.4), αν και θεωρείται ότι η σύνδεση των λαμινών διαφέρει σε έκταση και πολικότητα από αυτήν που συναντάται σε άλλα ενδιάμεσα ινίδια. Το πρώτο στάδιο σύνδεσης των λαμινών είναι η αλληλεπίδραση δύο λαμινών που οδηγεί στον σχηματισμό ενός διμερούς. Στο διμερές αυτό, οι περιοχές α-έλικας των δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη σχηματίζοντας μια δομή που ονομάζεται σπειρωμένο σπείραμα (coiled coil). Στη συνέχεια, τα διμερή λαμίνης συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας την πυρηνική λάμινα. 4

5 ΕΙΚΟΝΑ 9.4: Μοντέλο συναρμολόγησης των λαμινών. Τα πολυπεπτίδια λαμίνης σχηματίζουν διμερή στα οποία οι κεντρικές περιοχές α-έλικας δύο πολυπεπτιδικών αλυσίδων τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη. Στην περαιτέρω συναρμολόγηση μπορεί να συνεισφέρουν η κατά σειρά σύνδεση των διμερών, με την οποία σχηματίζονται γραμμικά πολυμερή, και η πλευρική σύνδεση των πολυμερών, με την οποία σχηματίζονται δομές υψηλότερης οργάνωσης. Η σύνδεση των λαμινών με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη διευκολύνεται από τη μεταμεταφραστική προσθήκη λιπιδίων - πρενυλίωση των καρβοξυτελικών καταλοίπων κυστεΐνης Επιπλέον, οι λαμίνες προσδένονται σε ειδικές πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, όπως είναι η εμερίνη και ο υποδοχέας της λαμίνης Β, μεσολαβώντας στην πρόσδεση τους στον πυρηνικό φάκελο και συμβάλλοντας στην τοποθέτηση και στην οργάνωση τους μέσα στον πυρήνα (Εικ. 9.5). Η πυρηνική λάμινα προσδένεται επίσης στη χρωματίνη μέσω των ιστονών Η2Α και Η2Β, καθώς και μέσω άλλων πρωτεϊνών της χρωματίνης. Αν και η πυρηνική λάμινα προσδένεται άμεσα στο DNA, δεν έχει διευκρινιστεί κατά πόσο αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για το κύτταρο. Επιπρόσθετα, οι λαμίνες σχηματίζουν ένα χαλαρό δίχτυ που εκτείνεται σε ολόκληρο το εσωτερικό του πυρήνα. Στις λαμίνες προσδένονται πολλές πυρηνικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη σύνθεση του DNA, στη μεταγραφή ή στην τροποποίηση της χρωματίνης, παρόλο που η σημασία αυτών των αλληλεπιδράσεων μόλις έχει αρχίσει να κατανοείται. ΕΙΚΟΝΑ 9.5: Η πυρηνική λάμινα. Η εσωτερική πυρηνική μεμβράνη περιέχει αρκετές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, όπως είναι η εμερίνη και ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR, Lamin B Receptor), που αλληλεπιδρούν με τις λαμίνες του πυρήνα. Οι λαμίνες και οι πρωτεΐνες που συνδέονται με αυτές αλληλεπιδρούν επίσης με τη χρωματίνη. 5

6 Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου Τα σύμπλοκα των πυρηνικών πόρων (nuclear pore complexes) είναι οι μόνοι δίαυλοι που επιτρέπουν τη μεταφορά μικρών πολικών μορίων, ιόντων και μακρομορίων (πρωτεϊνών και RNA) ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Πρόκειται για εξαιρετικά ευμεγέθεις δομές με διάμετρο περίπου 120 nm και εκτιμώμενη μοριακή μάζα ~125x103 kda, δηλαδή μέγεθος 30 φορές μεγαλύτερο από το μέγεθος ενός ριβοσώματος. Στα σπονδυλωτά, το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από περίπου 30 διαφορετικές πρωτεΐνες που ονομάζονται νουκλεοπορίνες, οι περισσότερες από τις οποίες είναι παρούσες σε πολυάριθμα αντίγραφα. Το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου έχει θεμελιώδη ρόλο στη φυσιολογία όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων, καθώς ελέγχει τη διακίνηση μορίων ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Τα μόρια RNA που συντίθενται στον πυρήνα εξάγονται στο κυτταρόπλασμα, προκειμένου να λάβουν μέρος στην πρωτεϊνοσύνθεση. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που απαιτούνται για τη λειτουργία του πυρήνα (π.χ. μεταγραφικοί παράγοντες) θα πρέπει να μεταφερθούν από το κυτταρόπλασμα, όπου γίνεται η σύνθεση τους, στον πυρήνα. Επιπρόσθετα, πολλές πρωτεΐνες παλινδρομούν συνεχώς (shuttle) ανάμεσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Η μεταφορά μορίων μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου μπορεί να γίνει με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς, ανάλογα με το μέγεθος των μορίων (Εικ. 9.6): Τα μικρά μόρια και μερικές πρωτεΐνες μοριακής μάζας μικρότερης των kda διέρχονται ελεύθερα από τον πόρο προς οποιαδήποτε από τις δύο κατευθύνσεις: από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα ή από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα. Αυτά τα μόρια περνούν με παθητική διάχυση από το υδατικό μέσο ανοικτών διαύλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που εκτιμάται ότι έχουν διάμετρο ~9 nm. Ωστόσο, οι περισσότερες πρωτεΐνες και τα περισσότερα μόρια RNA δεν μπορούν να περάσουν από αυτούς τους ανοικτούς διαύλους. Τα μεγαλύτερα αυτά μακρομόρια περνούν από τον κεντρικό δίαυλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου, που έχει διάμετρο ~10-40 nm, με μια ενεργή διεργασία κατά την οποία κατάλληλες πρωτεΐνες και RNA αναγνωρίζονται και μεταφέρονται επιλεκτικά προς μία συγκεκριμένη κατεύθυνση (είτε από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα είτε από το κυτταρόπλασμα προς τον πυρήνα). μικρά μόρια και πρωτεΐνες MB<20-40 kda Πρωτεΐνες MB>40 kd και μόρια RNA ΕΙΚΟΝΑ 9.6: Κυκλοφορία μορίων μέσω των συμπλόκων των πυρηνικών πόρων. Τα μικρά μόρια μπορούν να διέλθουν ταχύτατα, με παθητική διάχυση, από ανοικτούς διαύλους του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Αντίθετα, τα μακρομόρια (πρωτεΐνες και RNA) μεταφέρονται με έναν επιλεκτικό μηχανισμό που απαιτεί κατανάλωση ενέργειας. 6

7 Η απεικόνιση των συμπλοκών των πυρηνικών πόρων με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκαλύπτει μια δομή με οκταπλή συμμετρία, οργανωμένη γύρω από έναν μεγάλο κεντρικό δίαυλο (Εικ. 9.7). Ο κεντρικός αυτός δίαυλος αποτελεί την οδό μέσω της οποίας διασχίζουν τον πυρηνικό φάκελο οι πρωτεΐνες και τα RNA. ΕΙΚΟΝΑ 9.7: Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνει σύμπλοκα πυρηνικών πόρων. Στην κάτοψη αυτή διακρίνονται μεμονωμένα σύμπλοκα πυρηνικών πόρων, τα οποία αποτελούνται από οκτώ δομικές υπομονάδες που περιβάλλουν έναν κεντρικό δίαυλο. Λεπτομερείς δομικές μελέτες, όπως η ανάλυση εικόνας βάσει υπολογιστή, έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη τρισδιάστατων δομικών μοντέλων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου (Εικ. 9.8). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου αποτελείται από 8 ακτίνες διατεταγμένες γύρω από έναν κεντρικό δίαυλο. Οι 8 ακτίνες συνδέονται με δακτυλίους στην πυρηνική και στην κυτταροπλασματική επιφάνεια, συγκροτώντας μια δομή που βρίσκεται αγκυροβολημένη στο εσωτερικό του πυρηνικού φακέλου σε θέσεις όπου συνενώνονται η εσωτερική και η εξωτερική πυρηνική μεμβράνη. Ινίδια πρωτεϊνών εκτείνονται τόσο από τον κυτταροπλασματικά όσο και από τον πυρηνικό δακτύλιο, σχηματίζοντας μια διακριτή καλαθοειδή δομή στην πλευρά του πυρήνα. ΕΙΚΟΝΑ 9.8: Μοντέλο του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Το σύμπλοκο: αποτελείται από ένα συγκρότημα οκτώ ακτίνων προσδεδεμένων σε δακτυλίους στην κυτταροπλασματική και στην πυρηνική πλευρά του πυρηνικού φακέλου. Το συγκρότημα δακτυλίων-ακτίνων περιβάλλει έναν κεντρικό δίαυλο. Από τον κυτταροπλασματικό δακτύλιο εκτείνονται κυτταροπλασματικά ινίδια, ενώ από τον πυρηνικό δακτύλιο εκτείνονται ινίδια που σχηματίζουν τον πυρηνικό κάλαθο. 7

8 8

9 Επιλεκτική μεταφορά πρωτεϊνών από και προς τον πυρήνα Κάθε λεπτό μεταφέρονται επιλεκτικά μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος αρκετά εκατομμύρια μακρομόρια. Η βάση αυτής της επιλεκτικής κυκλοφορίας μορίων μέσω του πυρηνικού φακέλου έχει κατανοηθεί καλύτερα για πρωτεΐνες που εισάγονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Τέτοιου είδους πρωτεΐνες καλύπτουν όλες τις πτυχές της δομής και της λειτουργίας του γονιδιώματος και είναι, για παράδειγμα, ιστόνες, DNA πολυμεράσες, RNA πολυμεράσες, μεταγραφικοί παράγοντες, παράγοντες ματίσματος και πολλές άλλες πρωτεΐνες. Η στόχευση αυτών των πρωτεϊνών στον πυρήνα γίνεται μέσω ειδικών αλληλουχιών αμινοξέων που ονομάζονται σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS; Nuclear Localisation Signals), που αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς (nuclear transport receptors) και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Το πρώτο σήμα πυρηνικού εντοπισμού που έχει χαρτογραφηθεί λεπτομερώς χαρακτηρίστηκε από τον Alan Smith και τους συνεργάτες του το Αυτοί οι ερευνητές μελέτησαν το αντιγόνο Τ του ιού SV40 (Simian Virus 40) των πιθήκων, μια πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα του ιού SV40 και προωθεί την έναρξη της αντιγραφής του ιικού DNA σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με αυτόν τον ιό. Όπως αναμενόταν, εφόσον πρόκειται για μια πρωτεΐνη αντιγραφής, η φυσική θέση εντόπισης του αντιγόνου Τ βρέθηκε ότι είναι πυρηνική. Ωστόσο, η μετάλλαξη ενός και μόνο καταλοίπου λυσίνης εμποδίζει την εισαγωγή του αντιγόνου Τ στον πυρήνα και οδηγεί σε συσσώρευση του στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η παρατήρηση, σε συνδυασμό με άλλες μελέτες που ακολούθησαν, οδήγησε στην ταυτοποίηση του σήματος πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ, που αντιστοιχεί στην αλληλουχία επτά αμινοξέων Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Αυτή η αλληλουχία βρέθηκε ότι: (α) είναι αναγκαία για τη μεταφορά του αντιγόνου Τ στον πυρήνα, και (β) όταν ενσωματώνεται σε άλλες πρωτεΐνες που έχουν ως φυσική θέση εντόπισης τους το κυτταρόπλασμα, είναι ικανή να τις κατευθύνει και να οδηγήσει σε συσσώρευση τους στον πυρήνα. Σήματα πυρηνικού εντοπισμού έχουν πλέον ταυτοποιηθεί σε πολλές πρωτεΐνες. Ορισμένες από αυτές τις αλληλουχίες-σήματα, όπως είναι η αλληλουχία του αντιγόνου Τ, έχουν μικρή έκταση και είναι πλούσιες σε βασικά αμινοξέα (όπως λυσίνη και αργινίνη). Συχνά όμως τα αμινοξέα που σχηματίζουν το σήμα πυρηνικού εντοπισμού βρίσκονται κοντά το ένα στο άλλο, αλλά δεν είναι διαδοχικά μεταξύ τους. Για παράδειγμα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης (μιας πρωτεΐνης που συμμετέχει στη συγκρότηση της χρωματίνης) αποτελείται από δύο μέρη: ένα ζεύγος Lys-Arg και 4 κατάλοιπα λυσίνης που ακολουθούν έπειτα από ένα μεσοδιάστημα δέκα αμινοξέων (Εικ. 9.9). Τόσο η αλληλουχία Lys-Arg, όσο και η αλληλουχία Lys-Lys-Lys-Lys είναι απαραίτητες για την πυρηνική στόχευση. Ωστόσο, τα 10 αμινοξέα που μεσολαβούν ανάμεσα σε αυτές τις αλληλουχίες μπορούν να αντικατασταθούν με μεταλλαξιγένεση χωρίς να επηρεαστεί ο πυρηνικός εντοπισμός. Αυτό το σήμα πυρηνικού εντοπισμού που αποτελείται από δύο ξεχωριστά στοιχεία αλληλουχίας χαρακτηρίζεται ως διπαραγοντικό (bipartite). Παρόμοια διπαραγοντικά μοτίβα λειτουργούν ως σήματα εντοπισμού πολλών πυρηνικών πρωτεϊνών και είναι πιθανόν να συναντώνται συχνότερα απ' ότι το συνεχές, απλούστερο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ. Αν και πολλά διπαραγοντικά σήματα πυρηνικού εντοπισμού αποτελούνται από αλληλουχίες βασικών αμινοξέων, που συχνά ονομάζονται βασικά ή «κλασικά» σήματα πυρηνικού εντοπισμού, άλλα σήματα πυρηνικού εντοπισμού εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία αμινοξικής αλληλουχίας και δομής. Μερικά από αυτά τα σήματα αποτελούνται από μοτίβα αλληλουχίας που απέχουν κατά πολύ στην πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης και η ενεργότητά τους εξαρτάται από την κανονική αναδίπλωση της πρωτεΐνης στην τριτοταγή της δομή. Σήματα πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localisation Signal; NLS) 1. Μονοπαραγοντικά σήματα NLS: Διαδοχική (ενιαία) αλληλουχία αμινοξέων στα σήματα NLS: π.χ. η αλληλουχία του αντιγόνου-τ. 2. Διπαραγοντικά (bipartite) σήματα NLS: Tα αμινοξέα που σχηματίζουν το σήμα NLS βρίσκονται κοντά το ένα στο άλλο, αλλά δεν είναι διαδοχικά μεταξύ τους. π.χ. το σήμα NLS της νουκλεοπλασμίνης (συμμετέχει στη συγκρότηση της χρωματίνης) αποτελείται από 2 μέρη που χωρίζονται από ένα συνδετικό μεσοδιάστημα 10 αμινοξέων. Και οι δύο αυτές ξεχωριστές αλληλουχίες είναι απαραίτητες για την πυρηνική στόχευση. Τα 10 αμινοξέα που μεσολαβούν ανάμεσα σε αυτές τις αλληλουχίες μπορούν να αντικατασταθούν με μεταλλαξιγένεση χωρίς να επηρεαστεί ο πυρηνικός εντοπισμός. Τα διπαραγοντικά κλασσικά σήματα NLS είναι συχνότερα, άλλα υπάρχουν και σήματα NLS που εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία αμινοξικής αλληλουχίας και δομής. 9

10 ΕΙΚΟΝΑ 9.9: Σήματα πυρηνικού εντοπισμού. Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ αντιστοιχεί σε μια ενιαία αλληλουχία αμινοξέων. Αντίθετα, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της νουκλεοπλασμίνης είναι διπαραγοντικό, καθώς αποτελείται από δύο αλληλουχίες, μία Lys-Arg και μία Lys-Lys-Lys-Lys, μεταξύ των οποίων μεσολαβεί ένα μεσοδιάστημα 10 αμινοξέων. ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ: Η ταυτοποίηση των ημάτων πυρηνικού εντοπισμού Το ευρύτερο πλαίσιο: Η διατήρηση του πυρήνα ως διακριτού βιοχημικού διαμερίσματος απαιτεί έναν μηχανισμό διαχωρισμού μεταξύ πρωτεϊνών του πυρήνα και πρωτεϊνών του κυτταροπλάσματος. Μελέτες κατά τη δεκαετία του 1970 έδειξαν ότι μικρά μόρια διαχέονται ταχύτατα μέσω του πυρηνικού φακέλου, αλλά οι περισσότερες πρωτεΐνες δεν μπορούν να διέλθουν με αυτόν τον τρόπο. Επομένως, φαινόταν πιθανό ότι οι πυρηνικές πρωτεΐνες αναγνωρίζονται με κάποιον ειδικό τρόπο από τις θέσεις σύνθεσης τους στο ριβοσώματα του κυτταροπλάσματος και μεταφέρονται επιλεκτικά στον πυρήνα. Προηγούμενα πειράματα του Günter Blobel και των συνεργατών του είχαν αποδείξει ότι η στόχευση πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο γίνεται μέσω σηματοδοτικών αλληλουχιών μικρού μήκους. Ο Alan Smith και συνεργάτες (1984) διεύρυναν αυτή τη θεώρηση στη στόχευση των πυρηνικών πρωτεϊνών, καθώς ταυτοποίησαν μια μικρή αλληλουχία αμινοξέων που λειτουργεί ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού. Τα πειράματα: Για τις μελέτες πυρηνικού εντοπισμού σε ζωικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο μια ιική πρωτεΐνη, το αντιγόνο Τ του ιού SV40. Ο DNA ιός Simian Virus 40 (SV40) ανήκει στην οικογένεια των ιών πολυώμα, που το γονιδίωμα του είναι κυκλικό μεγέθους 5 kb. 10

11 Το αντιγόνο Τ είναι μια πρωτεΐνη 94 kda απαραίτητη για την αντιγραφή του DNA του ιού SV40 και κανονικά εντοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων που έχουν μολυνθεί από τον ιό. Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο του A. Smith και της Janet Butel [Landford & Butel (1984) Cell 37: ] έδειξαν ότι μεταλλαγή του καταλοίπου Lys-128 είτε προς Thr ή προς Asn εμπόδιζε τη συσσώρευση του αντιγόνου Τ στον πυρήνα κυττάρων πιθήκου και τρωκτικών. Τα μεταλλαγμένα μόρια αντιγόνου Τ δεν μπορούσαν να μεταφερθούν στον πυρήνα, αλλά παρέμεναν στο κυτταρόπλασμα, γεγονός που υποδεικνύει ότι η Lys-128 αποτελεί τμήμα ενός σήματος πυρηνικού εντοπισμού. Ο Smith και συνεργάτες έλεγξαν αυτή την υπόθεση εφαρμόζοντας δύο διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις. Καταρχήν, προσδιόρισαν την επίδραση διαφόρων ελλειμμάτων στον υποκυτταρικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ και έδειξαν ότι μεταλλαγμένα αντιγόνα Τ με απαλοιφή αμινοξέων είτε μεταξύ των καταλοίπων 1 και 126 είτε μεταξύ του καταλοίπου 136 και του καρβοξυτελικού άκρου συσσωρεύονταν κανονικά στον πυρήνα, ενώ ένα μετάλλαγμα με απαλοιφή των καταλοίπων των αμινοξέων παρέμενε στο κυτταρόπλασμα. Κατά συνέπεια, υπεύθυνη για τον πυρηνικό εντοπισμό του αντιγόνου Τ φαινόταν να είναι η αλληλουχία των καταλοίπων PKKKRKV PKTKRKV ή PKNKRKV Πλασμιδιακά DNA που κωδικοποιούν για χιμαιρικές πρωτεΐνες οι οποίες φέρουν αλληλουχίες του SV40 σε σύντηξη με την κινάση του πυροσταφυλικού εισήχθησαν σε κύτταρα με μικροένεση. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε ο κυτταρικός εντοπισμός των υβριδικών πρωτεϊνών μέσω μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού. (Α) Η υβριδική πρωτεΐνη περιέχει ένα ακέραιο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του ιού SV40 (αλληλουχία ). (Β) Το σήμα πυρηνικού εντοπισμού έχει απενεργοποιηθεί με απαλοιφή των καταλοίπων των αμινοξέων 131 και 132. Για να προσδιορίσουν αν αυτή η αλληλουχία ήταν ικανή να υπαγορεύσει τη στόχευση άλλων πρωτεϊνών στον πυρήνα, οι ερευνητές κατασκεύασαν χιμαιρικά μόρια ενώνοντας την αλληλουχία του αντιγόνου Τ με πρωτεΐνες που υπό κανονικές συνθήκες εντοπίζονταν στο κυτταρόπλασμα. Τα πειράματα αυτά απέδειξαν ότι η προσθήκη της αλληλουχίας του αντιγόνου Τ είτε στη β-γαλακτοζιδάση είτε στην κινάση του πυροσταφυλικού αρκεί για να οδηγήσει σε συσσώρευση αυτών των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών στον πυρήνα. Επομένως, αυτή η μικρή αλληλουχία αμινοξέων του αντιγόνου Τ του ιού SV40 λειτουργεί ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού, δηλαδή είναι μια αλληλουχία αναγκαία και ικανή για τη στόχευση των πρωτεϊνών για εισαγωγή στον πυρήνα. Ο αντίκτυπος: Ο Smith και οι συνεργάτες του στην εργασία που δημοσίευσαν το 1984 διατύπωσαν την άποψη ότι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του αντιγόνου Τ του ιού SV40 «αντιπροσωπεύει μια πρότυπη μορφή παρόμοιων αλληλουχιών που συναντώνται και σε άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες». Αυτά τα σήματα αλληλουχιών υπαγορεύουν τη στόχευση πρωτεϊνών για εισαγωγή στον πυρήνα και κατά συνέπεια έχουν βασικό ρόλο στον καθορισμό της βιοχημικής ταυτότητας του πυρήνα και στη διατήρηση της θεμελιώδους οργάνωσης του ευκαρυωτικού κυττάρου σε διαμέρισμα πυρήνα και διαμέρισμα κυτταροπλάσματος. Τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού είναι πλέον γνωστό ότι αναγνωρίζονται από κυτταροπλασματικούς υποδοχείς που μεταφέρουν τις πρωτεΐνες-υποστρώματά τους μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Η 11

12 ταυτοποίηση των σημάτων πυρηνικού εντοπισμού αποτέλεσε λοιπόν ένα βήμα προόδου καθοριστικής σημασίας για την κατανόηση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα. Μηχανισμός πυρηνικής μεταφοράς. (a) Μόρια μικρότερα από 40 kda (και με διάμετρο 4-5 nm) περνούν διαμέσου του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου (NPC) χωρίς να απαιτούν πρωτεΐνες-μεταφορείς, αλλά με απλή διάχυση. Η επιλεκτική διαπεροτότητα του NPC παρεμποδίζει την απλή διάχυση των μεγαλυτέρων μορίων. Μεγαλύτερα μόρια όπως οι πρωτεΐνες ΜΒ>40 kda και RNAs δεσμεύονται σε Larger cargoes (such as proteins and some mrnas) δεσμεύονται σε υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς που αναγνωρίζουν αλληλουχίες-σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) και αλληλουχίες-σήματα πυρηνικής εξαγωγής. Η διέλευση μακρομορίων από τον πυρηνικό πόρο ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη Ran. Πρόκειται για έναν τύπο μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP, η διαμόρφωση και η ενεργότητα της οποίας ρυθμίζεται από την πρόσδεση και την υδρόλυση GTP. Παραδείγματα μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP είναι οι πρωτεΐνες Ras, αρκετοί από τους μεταφραστικούς παράγοντες που συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, οι πρωτεΐνες Arf και Rab, και οι πρωτεΐνες Rac, Rho και Cdc42. Τι απαιτείται για τη μεταφορά μεγαλυτέρων πρωτεϊνικών μορίων (ΜΒ>40 kda) και RNAs; 1. Πρωτεΐνη προς μεταφορά (πρωτεΐνη-φορτίο) που να φέρει ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) ή και σήμα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signal; NES) 2. Πρωτεΐνες-φορείς, π,χ. ιμπορτίνες και εξπορτίνες 3. Πρωτεΐνη Ran και καταλυτικός κύκλος Ran/GTP - Ran/GDP Τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού αναγνωρίζονται από υποδοχείς πυρηνικής μεταφοράς που ονομάζονται ιμπορτίνες (importins) επειδή μεταφέρουν πρωτεΐνες στο εσωτερικό του πυρήνα. Η διέλευση μακρομορίων από τον πυρηνικό πόρο ρυθμίζεται από μια πρωτεΐνη που ονομάζεται Ran. Πρόκειται για έναν τύπο μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP, η διαμόρφωση και η ενεργότητα της οποίας ρυθμίζεται από την πρόσδεση και την υδρόλυση GTP. Άλλα παραδείγματα μικρών πρωτεϊνών πρόσδεσης GTP είναι οι πρωτεΐνες Ras, αρκετοί από τους μεταφραστικούς παράγοντες που συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, οι πρωτεΐνες Arf και Rab, καθώς και οι πρωτεΐνες Rac, Rho και Cdc42. Όσον αφορά την πρωτεΐνη Ran, τα ένζυμα που ενεργοποιούν την υδρόλυση του GTP προς GDP εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, ενώ τα ένζυμα που ενεργοποιούν την ανταλλαγή GDP με GTP εντοπίζονται στην πυρηνική πλευρά (Εικ. 9.10). Επομένως, δεν υπάρχει ισόποση κατανομή των Ran/GTP από τις δύο πλευρές του πυρηνικού πόρου. Στο εσωτερικό του πυρήνα διατηρείται υψηλότερη συγκέντρωση μορίων Ran/GTP, που καθορίζει την κατεύθυνση της πυρηνικής μεταφοράς των πρωτεϊνών-φορτίων που αναγνωρίζουν οι ιμπορτίνες. 12

13 ΕΙΚΟΝΑ 9.10: Κατανομή της Ran/GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου. Η άνιση κατανομή της Ran/GTP μεταξύ των δύο πλευρών του πυρηνικού φακέλου διατηρείται χάρη στον εντοπισμό της πρωτεΐνης ενεργοποίησης της GTPάσης Ran (Ran GAP, Ran GTPaseΑctivating Protein) στο κυτταρόπλασμα και του παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης Ran (Ran GEF, Ran Guanine nucleotide Exchange Factor) στον πυρήνα. Στο κυτταρόπλασμα, η Ran GAΡ (η οποία προσδένεται στα κυτταροπλασματικά ινίδια του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου) ενεργοποιεί την υδρόλυση του GTP που είναι προσδεδεμένο στη Ran, οδηγώντας σε μετατροπή της Ran/GTP σε Ran/GDP. Στον πυρήνα, η Ran GEF ενεργοποιεί την ανταλλαγή του GDP που είναι προσδεδεμένο στη Ran με GTP, οδηγώντας σε μετατροπή του Ran/GDP σε Ran/GTP. Κατά συνέπεια, το εσωτερικό του πυρήνα διατηρεί μια υψηλή συγκέντρωση Ran/GTP. Η πρωτεΐνη Ran ρυθμίζει τη διέλευση πρωτεϊνών από τον πυρηνικό πόρο ελέγχοντας την ενεργότητα των υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς. Η εισαγωγή πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου ξεκινά όταν μια συγκεκριμένη ιμπορτίνη προσδεθεί στο σήμα πυρηνικού εντοπισμού μιας προς μεταφορά πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 9.11). Κατόπιν, αυτό το σύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου προσδένεται σε πρωτεΐνες των κυτταροπλασματικών ινιδίων του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου και η μεταφορά προχωρεί με διαδοχική πρόσδεση σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου που βρίσκονται πλησιέστερα στην πυρηνική πλευρά του συμπλόκου του πόρου. Ιδιαίτερα σημαντικές για τη διεργασία αυτή είναι ορισμένες πρωτεΐνες (νουκλεοπορίνες) που επενδύουν τον κεντρικό δίαυλο του πόρου, που φέρουν πολλαπλές επαναλήψεις Phe-Gly και ονομάζονται πρωτεΐνες FG. Ακολούθως, στην πυρηνική πλευρά του πόρου, το σύμπλοκο ιμπορτίνης/φορτίου διίσταται καθώς προσδένεται σε αυτό η RanGTP. Η πρόσδεση αυτή προκαλεί μια αλλαγή στη διαμόρφωση της ιμπορτίνης, που εκτοπίζει από το σύμπλοκο την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα. 13

14 Στη συνέχεια, το σύμπλοκο ιμπορτίνης-ran/gtp εξάγεται από τον πυρήνα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου και επιστρέφει στο κυτταρόπλασμα, όπου το GTP υδρολύεται σε GDP. Με αυτόν τον τρόπο αποδεσμεύεται η ιμπορτίνη, που μπορεί πλέον να προσδεθεί σε μια νέα πρωτεΐνη-φορτίο στο κυτταρόπλασμα και να συμμετάσχει σε έναν νέο κύκλο πυρηνικής μεταφοράς. Η Ran/GDP που παράγεται στο κυτταρόπλασμα μεταφέρεται πίσω στον πυρήνα μέσω του δικού της μεταφορέα (που ονομάζεται NTF2), όπου και αναγεννάται η Ran/GTP. ΕΙΚΟΝΑ 9.11: Μεταφορά πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Η μεταφορά μιας πρωτεΐνης μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου αρχίζει με την αναγνώριση της αλληλουχίας πυρηνικού εντοπισμού της (NLS, Nuclear Localization Sequence) από έναν υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς (ιμπορτίνη). Το σύμπλοκο της πρωτεΐνης-φορτίου με την ιμπορτίνη προσδένεται σε ειδικές πρωτεΐνες του πυρηνικού πόρου στα κυτταροπλασματικά ινίδια. Στη συνέχεια, μεταφέρεται μέσω του πυρηνικού πόρου, καθώς προσδένεται διαδοχικά σε πρωτεΐνες που βρίσκονται όλο και βαθύτερα στο εσωτερικό του. Στην πυρηνική πλευρά του πόρου, το σύμπλοκο φορτίου/ιμπορτίνης διασπάται λόγω της πρόσδεσης Ran/GTP στην ιμπορτίνη. Η αλλαγή διαμόρφωσης της ιμπορτίνης εκτοπίζει την πρωτεΐνη-φορτίο και την απελευθερώνει στο εσωτερικό του πυρήνα. Το σύμπλοκο ιμπορτίνης-ran/gtp εξάγεται και πάλι από τον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου και η πρωτεΐνη ενεργοποίησης της GTPάσης (Ran GAP) υδρολύει το GTP, που φέρει η Ran, προς GDP, προκαλώντας απελευθέρωση της ιμπορτίνης στο κυτταρόπλασμα. 14

15 To NPC καθορίζει την αμφίδρομη πυρηνο-κυτταροπλασματική μεταφορά μορίων. (A) ΗΜ σάρωσης της δομής του NPC από την κυτταροπλασματική (επάνω) και από την πυρηνοπλασματική πλευράς (κάτω) στον πυρηνικό φάκελο ενός ωοκυττάρου του Xenopus laevis. (B) Η πυρηνική μεταφορά μέσω υποδοχέων διεξάγεται σε διαδοχικά στάδια. Ένας υποδοχέας (ιμπορτίνη) αναγνωρίζει το σήμα NLS μιας πρωτεΐνης-φορτίου και σχηματίζει ένα σύμπλοκο (1). Το σύμπλοκο δεσμεύεται στην κυτταροπλασματική πλευρά του NPC (2) και στη συνέχεια μετακινείται προς το εσωτερικό του διαύλου του NPC λόγω των χαμηλής συγγένειας αλληλεπιδράσεων του με τις νουκλεοπορίνες που φέρουν FG (FG-Nups) (3). Καθώς το σύμπλοκο εξέρχεται από τον NPC προς τον πυρήνα, διίσταται (4) και απελευθερώνει την πρωτεΐνη-φορτίο. Η διάσταση οφείλεται στη δέσμευση της πυρηνικής RanGTP στον υποδοχέα. Για την εξαγωγή του υποδοχέα, η RanGTP δεσμευμένη στο σύμπλοκο υποδοχέα-πρωτεΐνης υδρολύεται σε RanGDP από την ενεργοποιούσα Ran GTPάση, RanGAP, προκαλώντας την διάσταση του συμπλόκου. Ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης, RanGEF, εντοπίζεται στον πυρήνα και αναπαράγει την RanGTP σε υψηλές συγκεντρώσεις, ενώ η RanGDP μεταφέρεται πίσω στον πυρήνα από την NTF2 (δεν απεικονίζεται). 15

16 Μερικές πρωτεΐνες παραμένουν στο εσωτερικό του πυρήνα μετά την εισαγωγή τους από το κυτταρόπλασμα, πολλές άλλες όμως παλινδρομούν συνεχώς μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος. Μερικές από αυτές τις πρωτεΐνες λειτουργούν ως φορείς για τη μεταφορά άλλων μορίων, όπως μορίων RNA, ενώ άλλες συντονίζουν διάφορες λειτουργίες του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος (π.χ. ρυθμίζουν τις ενεργότητες μεταγραφικών παραγόντων). Η εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα υπαγορεύεται από ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων, που ονομάζονται σήματα πυρηνικής εξαγωγής (nuclear export signals). Τα σήματα πυρηνικής εξαγωγής, όπως και τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού, αναγνωρίζονται από υποδοχείς μέσα στον πυρήνα. Οι υποδοχείς των σημάτων πυρηνικής εξαγωγής, που ονομάζονται εξπορτίνες (exportins), βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου. Πολλές από τις εξπορτίνες, όπως και οι ιμπορτίνες, ανήκουν σε μια οικογένεια υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς που είναι γνωστοί με το όνομα καρυοφερίνες (karyopherins) (Πίνακας. 9.1). ΠΙΝΑΚΑΣ 9.1: Καρυοφερίνες με γνωστά υποστρώματα Η καρυοφερίνη Kapα / Kapβ1 ή ιμπορτίνη είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από 2 υπομονάδες, την ιμπορτίνη-α που αναγνωρίζει και δεσμεύεται σε ένα σήμα NLS μιας πρωτεΐνης, και από την ιμπορτίνη-β που αλληλεπιδρά με νουκλεοπορίνες και FG-NUPs καθώς το σύμπλοκο μετακινείται διαμέσου του κεντρικού διαύλου του NPC. Η εξπορτίνη Crm1 αναγνωρίζει σήματα NES πλούσια σε leu. Σήματα πυρηνικής εξαγωγής (Nuclear Export Signal; NES) Η εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα υπαγορεύεται από ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων, που ονομάζονται σήματα πυρηνικής εξαγωγής (NES; Nuclear Export Signals). Τα NES, όπως και τα NLS, αναγνωρίζονται από υποδοχείς μέσα στον πυρήνα. Οι υποδοχείς των NES, οι εξπορτίνες (nuclear export proteins ή exportins), βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και κατευθύνουν τη μεταφορά των πρωτεϊνών από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα μέσω του NPC. Πολλές από τις εξπορτίνες, όπως και οι ιμπορτίνες, ανήκουν σε μια οικογένεια υποδοχέων πυρηνικής μεταφοράς, τις καρυοφερίνες (karyopherins). Ένα σήμα πυρηνικής εξαγωγής είναι μια μικρή αλληλουχία υδρόφοβων αμινοξέων σε μια πρωτεΐνη η οποία θα πρέπει να μεταφερθεί από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα διαμέσου του NPC, με έναν από τους μηχανισμούς της πυρηνικής μεταφοράς. 16

17 Τα σήματα NES αναγνωρίζονται από υποδοχείς, τις εξπορτίνες. Τα πιο συχνά αλλά και εξελικτικά διατηρημένα σήματα NES αποτελούνται από την αλληλουχία αμινοξέων: LxxxLxxLxL όπου L είναι ένα υδρόφοβο κατάλοιπο, συνήθως λευκίνη (leu), και x οποιοδήποτε άλλο αμινοξύ. Η καρυοφερίνη CRM1 έχει ταυτοποιηθεί ως ο υποδοχές πυρηνικής εξαγωγής πρωτεϊνών που φέρουν σήματα NES πλούσια σε leu. Η πυρηνική εξαγωγή διαμεσολαβούμενη από την CRM1 μπορεί να παρεμποδιστεί αποτελεσματικά με τη χρήση του μυκητοκτόνου λεπτομυκίνης Β (LMB), καταδεικνύοντας την ύπαρξη αυτού του μηχανισμού πυρηνικής εξαγωγής. Μηχανισμός μεταφοράς προς τον πυρήνα (Nuclear import): Οι εξπορτίνες προσδένονται στην πρωτεΐνη Ran, μια πρωτεΐνη που απαιτείται για την εισαγωγή και για την εξαγωγή από τον πυρήνα (Εικ. 9.12). Ωστόσο, ενώ η πρόσδεση της Ran/GTP στις ιμπορτίνες προκαλεί διάσπαση των συμπλοκών μεταξύ των ιμπορτινών και των πρωτεϊνώνφορτίων τους, η πρόσδεση της στις εξπορτίνες συμβάλλει στον σχηματισμό σταθερών συμπλοκών μεταξύ των εξπορτινών και των αντίστοιχων πρωτεϊνών-φορτίων. Επομένως, η πρόσδεση της Ran/GTP στις εξπορτίνες καθορίζει τη μετακίνηση των πρωτεϊνών που περιέχουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής προς το κυτταρόπλασμα. Έτσι, στο εσωτερικό του πυρήνα σχηματίζονται σταθερά σύμπλοκα μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, στα οποία συμβάλλει και η πρόσδεση της Ran/GTP. Μετά τη μεταφορά αυτών των συμπλοκών στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, η υδρόλυση του GTP και η αποδέσμευση της Ran/GDP οδηγούν σε αποδέσμευση της πρωτεΐνης-φορτίου, που απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια, οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκ νέου. 9.1 Animation: Εισαγωγή και εξαγωγή Πρωτεϊνών μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου ΕΙΚΟΝΑ 9.12: Εξαγωγή πρωτεϊνών από τον πυρήνα. Στον πυρήνα σχηματίζονται σύμπλοκα μεταξύ πρωτεϊνών-φορτίων που φέρουν σήματα πυρηνικής εξαγωγής (NES, Nuclear Export Signals), εξπορτινών και Ran/GTP. Μετά τη διέλευση από το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου, η Ran GAP ενεργοποιεί την υδρόλυση του προσδεδεμένου GTP, οδηγώντας σε σχηματισμό Ran/GDP και απελευθέρωση της πρωτεΐνης-φορτίου και της εξπορτίνης στο κυτταρόπλασμα. H RAN GDP που προκύπτει αλληλεπιδρά με τον πυρηνικό παράγοντα μεταφοράς NTF2 και μετατοπίζεται πίσω στον πυρήνα μέσω του NPC όπου ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης RAN GEF, RCC1, αποκαθιστά τα επίπεδα της RAN GTP. Οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσω του NPC, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκ νέου. 17

18 Μεταφορά από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα ή Πυρηνική εξαγωγή (Nuclear protein export). Πυρηνικές πρωτεΐνες εξαγωγής (Nuclear export proteins), οι εξπορτίνες δεσμεύονται στον πυρήνα στην πρωτεΐνη προς εξαγωγή καθώς επίσης και στην RAN/GTP και μετακινούνται διαμέσου του NPC προς το κυτταρόπλασμα. Ενώ η πρόσδεση της Ran/GTP στις ιμπορτίνες προκαλεί διάσπαση των συμπλοκών μεταξύ των ιμπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, η πρόσδεση της στις εξπορτίνες συμβάλλει στον σχηματισμό σταθερών συμπλοκών μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων. Επομένως, η πρόσδεση της Ran/GTP στις εξπορτίνες καθορίζει τη μετακίνηση των πρωτεϊνών που περιέχουν σήματα NES προς το κυτταρόπλασμα. Έτσι, στο εσωτερικό του πυρήνα σχηματίζονται σταθερά σύμπλοκα μεταξύ των εξπορτινών και των πρωτεϊνών-φορτίων τους, στα οποία συμβάλλει και η πρόσδεση της Ran/GTP. Μετά τη μεταφορά αυτών των συμπλοκών στην κυτταροπλασματική πλευρά του πυρηνικού φακέλου, η ενεργοποιούσα RAN GTPάση, RANGAP, προκαλεί την υδρόλυση της GTP από την RAN σε συνεργασία με δύο πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την RAN GTP (RAN GTP-binding proteins RANBP1 & RANBP2; δεν απεικονίζονται) στην κυτταροπλασματική πλευρά του με αποτέλεσμα αποδέσμευση της πρωτεΐνης-φορτίου, που απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Η συγκέντρωση της RAN GTP στο κυτταρόπλασμα είναι χαμηλή. Το σύμπλοκο RAN GDP που προκύπτει αλληλεπιδρά με τον πυρηνικό παράγοντα μεταφοράς NTF2 και μετατοπίζεται πίσω στον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου όπου ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης RAN GEF (Guanine nucleotide ecchange factor), RCC1, αποκαθιστά τα επίπεδα της RAN GTP. Στη συνέχεια, οι εξπορτίνες ανακυκλώνονται και επιστρέφουν στον πυρήνα μέσω του πυρηνικού πόρου, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκ νέου. Ρύθμιση της εισαγωγής πρωτεϊνών στον πυρήνα Η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα είναι ένα ακόμη επίπεδο στο οποίο μπορούν να ελεγχθούν οι ενεργότητες των πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι λειτουργικοί μόνο όταν βρίσκονται μέσα στον πυρήνα και επομένως η ρύθμιση της εισαγωγής και της εξαγωγής των πρωτεϊνών αυτών προς και από τον πυρήνα συνιστά έναν νέο τρόπο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Η ρυθμιζόμενη εισαγωγή στον πυρήνα μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνικών κινασών έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής συμπεριφοράς, καθώς παρέχει έναν μηχανισμό μέσω του οποίου σήματα που λαμβάνονται στην επιφάνεια του κυττάρου μπορούν να μεταδοθούν στον πυρήνα. Η σημασία της ρυθμιζόμενης εισαγωγής στον πυρήνα αποδεικνύεται από το ότι η αλλαγή στη συγγένεια της αλληλεπίδρασης δύο μόλις πρωτεϊνών του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου προς τον υποδοχέα πυρηνικής μεταφοράς έχει συμβάλει στον εξελικτικό διαχωρισμό των ειδών Drosophila melanogaster και Drosophila simulans. Σε έναν συγκεκριμένο μηχανισμό ρύθμισης, οι μεταγραφικοί παράγοντες (ή άλλες πρωτεΐνες) συνδέονται με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που καλύπτουν τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού τους και οδηγούν σε παραμονή των παραγόντων αυτών στο κυτταρόπλασμα, εφόσον τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού δεν είναι πλέον αναγνωρίσιμα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB, που ενεργοποιείται σε κύτταρα των θηλαστικών από πολλά διαφορετικά εξωκυτταρικά σήματα (Εικ. 9.13). Στο κυτταρόπλασμα μη διεγερμένων κυττάρων, ο NF-κB σχηματίζει ένα ανενεργό σύμπλοκο με μια πρωτεΐνη-αναστολέα (την ΙκΒ). Η πρόσδεση της ΙκΒ καλύπτει το σήμα πυρηνικού εντοπισμού του NF-κB, εμποδίζοντας τη μεταφορά του στον πυρήνα. Σε διεγερμένα κύτταρα, η πρωτεΐνη ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικοδομείται πρωτεολυτικά μέσω της ουβικιτίνης, επιτρέποντας στον NF-κB να εισέλθει στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων του. 18

19 ΕΙΚΟΝΑ 9.13: Ρύθμιση της εισαγωγής μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα. Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κΒ διατηρείται στο κυτταρόπλασμα υπό μορφή ανενεργού συμπλόκου με την πρωτεΐνη ΙκΒ, η οποία καλύπτει την αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού του (NLS). Όταν δεχτεί τα κατάλληλα εξωκυτταρικά σήματα, η ΙκΒ φωσφορυλιώνεται και αποικοδομείται μέσω πρωτεόλυσης, επιτρέποντας την εισαγωγή του NF-κΒ στον πυρήνα. Ο μεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα διατηρείται στο κυτταρόπλασμα λόγω της φωσφορυλίωσης ενός καταλοίπου σερίνης που βρίσκεται κοντά στην αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού του. Η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση του καταλοίπου αυτού οδηγεί σε έκθεση του NLS και επιτρέπει μεταφορά του Pho4 στον πυρήνα. Η εισαγωγή άλλων μεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα ρυθμίζεται άμεσα μέσω της φωσφορυλίωσής τους και όχι μέσω σύνδεσης με πρωτεΐνες-αναστολείς. Για παράδειγμα, ο μεταγραφικός παράγοντας Pho4 του σακχαρομύκητα φωσφορυλιώνεται σε ένα κατάλοιπο σερίνης που βρίσκεται δίπλα στο σήμα πυρηνικού εντοπισμού του. Η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή προκαλεί αναστολή του παράγοντα Pho4, γιατί παρεμποδίζει την εισαγωγή του στον πυρήνα. Υπό κατάλληλες συνθήκες, όμως, η ρυθμιζόμενη αποφωσφορυλίωση αυτής της θέσης επιτρέπει τη μετατόπιση του παράγοντα Pho4 στον πυρήνα και την ενεργοποίηση του. Επομένως η ρύθμιση της νουκλεοκυτραοπλασματικής μεταφοράς είναι δυναμική και διαφορετική. Διαμοριακές και ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις (NF-κB ή p53, αντίστοιχα) ρυθμίζουν τη μεταφορά μιας πρωτεΐνηςφορτίου. Η πυρηνική εισαγωγή του ετεροδιμερούς p65-p50 του μεταγραφικού παράγοντα ΝF-κB ρυθμίζεται από μια διαμοριακή κάλυψη του NLS. Ο αναστολέας του NF-κB, IκBα παρεμποδίζει άμεσα το NLS του p65-p50, με αποτέλεσμα τον κυτταροπλασματικό εντοπισμό του ετεροδιμερούς. 19

20 Όμως όταν ένα κύτταρο δεχθεί προφλεγμονώδη ερεθίσματα, η ΙκΒα φωσφορυλιώνεται και αποδομείται από το πρωτεόσωμα, και επομένως το ετεροδιμερές του NF-κΒ, p65-p50 απελευθερώνεται και μετατοπίζεται (μεταφέρεται) στον πυρήνα με το μηχανισμό των ιμπορτινών α/β διαμέσου του NPC. Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 παλινδρομεί μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος, και αυτή η κίνηση εξαρτάται από τη φάση του κυτταρικού κύκλου. Υπό συνθήκες κυτταρικού στρες, η p53 συγκρατείται στον πυρήνα με έναν μηχανισμό κάλυψης του σήματος NES. Η p53 σχηματίζει ομοτετραμερή με αποτέλεσμα το σήμα NES να αποκρύπτεται και να παρεμποδίζεται μ αυτόν τον τρόπο η αλληλεπίδραση της με την εξπορτίνη Crm1/kapβ. Η νουκλεοκυτταροπλασματική μεταφορά της p53 ισχυροποιείται επίσης λόγω της επαγόμενης από στρες πολύ-adpριβοσυλίωση της, η οποία παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση της με την Crm1. Ελαττώματα που παρεμποδίζουν την πυρηνική διατήρηση της p53 σχετίζονται με έναν αριθμό νεοπλασμάτων, αναδεικνύοντας τη σημασία του κατάλληλου κυτταρικού εντοπισμού μιας πρωτεΐνης. Η πυρηνική εισαγωγή / εξαγωγή είναι βασικές διαδικασίες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά και οι όποιες υπόκεινται σε ρύθμιση Ενώ πολλές πρωτεΐνες μεταφέρονται επιλεκτικά από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, τα περισσότερα μόρια RNA εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εφόσον οι πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα, η εξαγωγή από τον πυρήνα μορίων mrna, rrna, trna και mirna αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η εξαγωγή αυτών των μορίων RNA μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου είναι, όπως και η εισαγωγή πρωτεϊνών, μια ενεργή, εξαρτώμενη από ενέργεια, διεργασία που απαιτεί αλληλεπίδραση των υποδοχέων μεταφοράς με το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου. 20

21 Μεταφορά των μορίων RNA Ενώ πολλές πρωτεΐνες μεταφέρονται επιλεκτικά από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, τα περισσότερα μόρια RNA εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Εφόσον οι πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα, η εξαγωγή από τον πυρήνα μορίων mrna, rrna, trna και mirna αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα της γονιδιακής έκφρασης στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η εξαγωγή αυτών των μορίων RNA μέσω του συμπλόκου του πυρηνικού πόρου είναι, όπως και η εισαγωγή πρωτεϊνών, μια ενεργή, εξαρτώμενη από ενέργεια, διεργασία που απαιτεί αλληλεπίδραση των υποδοχέων μεταφοράς με το σύμπλοκο του πυρηνικού πόρου. Ιμπορτίνες και εξπορτίνες της οικογένειας των καρυοφερινών είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά των περισσότερων μορίων trna, rrna, mirna και μικρών πυρηνικών RNA μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενου από Ran/GDP. Ωστόσο, τα μόρια mrna εξάγονται από τον πυρήνα μέσω ενός συμπλόκου δύο πρωτεϊνών (γνωστού με το όνομα «εξαγωγέας mrnas»), από τις οποίες η μία εμφανίζει συγγένεια με τον μεταφορέα της Ran/GDP, δηλαδή τον NTF2. Αυτός ο μηχανισμός μεταφοράς των μορίων mrna φαίνεται να είναι ανεξάρτητος της πρωτεΐνης Ran. Μικρά RNAs όπως τα trnas και mirnas εξάγονται με σχετικά απλές πορείες, με τη δέσμευση τους σε υποδοχείς εξαγωγείς (καρυοφορίνες), όπως οι ιμπορτίνες και οι εξπορτίνες και Ran/GTP. Τα μεγαλύτερα μόρια όπως τα rrnas και τα snrnas συγκροτούνται σε πολύπλοκα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια (Ribonucleoproteins; RNP) και στρατολογούν τις καρυοφερίνες διαμέσου μιας κατηγορίας ειδικών προσαρμοστικών πρωτεϊνών και χρησιμοποιούν Ran/GTP. Η εξαγωγή των mrnas είναι μοναδική καθώς εκτός από τη συγκρότηση σε RNPs, είναι συζευγμένη με τη μεταγραφή (σακχαρομύκητες) και με το μάτισμα (μετάζωα), και δεν χρησιμοποιούν Ran/GTP, αλλά διεξάγεται μέσω ενός συμπλόκου δύο πρωτεϊνών, γνωστού με το όνομα «εξαγωγέας mrnas»). Οι κύριες πορείες πυρηνικής εξαγωγής μορίων RNA: trna, microrna (mirna), snrna, mrna, rrna. Σε κάθε περίπτωση απεικονίζεται το μετάγραφο RNA μετά την επεξεργασία, την ωρίμανση, και την συγκρότηση τους σε σύμπλοκα με παράγοντες εξαγωγής [οι προσαρμοστικές πρωτεΐνες εξαγωγής (export adaptors) εμφανίζονται μπλε, οι πρωτεϊνικοί υποδοχείς μεταφοράς (export receptors) με κίτρινο]. Απεικονίζονται επίσης τα επικρατή δομικά χαρακτηριστικά στα προrnas (μονόκλωνες/δίκλωνες περιοχές RNA, βρόγχοι, εξόνια και ιντρόνια, 5' cap και 3' πολυ(a) ουρά). Στην πορεία εξαγωγής mrna, απεικονίζεται η ονομασία των πρωτεϊνών των μεταζώων και σακχαρομυκήτων, και τα mrnas μαζί με επιπλέον προσαρμοστικές πρωτεΐνες και παράγοντες δέσμευσης RNA (RNA-binding factors) με οβαλ πορτοκαλί. Στην πορεία του rrna, απεικονίζονται ο γενικός εξαγωγέας στα ευκαρυωτικά, CRM1, και δύο βοηθητικές πρωτεΐνες εξαγωγής, Mex67Mtr2 και Arx1, που έχουν μελετηθεί στον σακχαρομύκητα. CBC, Σύμπλοκο δέσμευσης cap (Capbinding complex); Exp, Εξπορτίνη (exportin). 21

22 Τα RNA μεταφέρονται μέσω του πυρηνικού φακέλου υπό μορφή συμπλοκών ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNP; Ribonucleoprotein complexes) (Εικ. 9.14). Τα ριβοσωμικά RNA συνδέονται αρχικά με ριβοσωμικές πρωτεΐνες και με ειδικές πρωτεΐνες επεξεργασίας RNA μέσα στον πυρηνίσκο, δημιουργώντας τις δύο ριβοσωμικές υπομονάδες 60S και 40S. Οι υπομονάδες αυτές στη συνέχεια μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 9.31) μέσω ενός μηχανισμού στον οποίο συμμετέχει η καρυοφερίνη Crm1. Η εξαγωγή τους από τον πυρήνα επιτυγχάνεται μέσω της αναγνώρισης σημάτων πυρηνικής εξαγωγής που περιέχονται σε πρωτεΐνες του συμπλόκου κάθε ριβοσωμικής υπομονάδας. Τα μόρια pre-mrna και mrna συνδέονται με ένα σύνολο τουλάχιστον 20 πρωτεϊνών κατά την επεξεργασία τους στον πυρήνα έως και τη μεταφορά τους στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η μεταφορά επιτυγχάνεται μέσω του συμπλόκου του εξαγωγέα mrna, που στρατολογείται στο επεξεργασμένο mrna. Τα μόρια trna και πρόδρομες μορφές των μορίων mrna εξάγονται από τον πυρήνα άμεσα συνδεδεμένα με την εξπορτίνη t και την εξπορτίνη 5, που είναι οι αντίστοιχοι μεταφορείς τους. ΕΙΚΟΝΑ 9.14: Μεταφορά ενός συμπλόκου ριβονουκλεοπρωτεΐνης. Τα κύτταρα των σιελογόνων αδένων των εντόμων παράγουν ευμεγέθη σύμπλοκα ριβονουκλεοπρωτεΐνης (RNΡ), τα οποία περιέχουν kb RNA και έχουν συνολική μάζα περίπου 30 εκατομμύρια Da. Σε αυτή τη σειρά φωτογραφιών ηλεκτρονικού μικροσκοπίου παρουσιάζονται (Α) η πρόσδεση ενός τέτοιου RNΡ σε ένα σύμπλοκο πυρηνικού πόρου και (Β-Δ) η αποδίπλωση του RNA κατά τη μεταφορά του στο κυτταρόπλασμα [Mehlin H, et al. (1992) Cell 69: 605]. 22

23 Μεταφορά μορίων trna και mirna Τα trnas εξάγονται από την εξπορτίνη-t που δρα ως υποδοχέας τους. Η μεταφορά trna απαιτεί Ran/GTP. Η εξαγωγή trna μπορεί να επηρεαστεί από τροποποιήσεις του trnas. Τα trnas μπορούν να επαναεισαχθούν στον πυρήνα. Τα πρωτογενή μετάγραφα mirnas (pre-mrnas) εξάγονται από τον πυρήνα με τη δράση της εξπορτίνης-5 και η επεξεργασία τους διεξάγεται στο κυτταρόπλασμα Η εξαγωγή trnas διεξάγεται από την εξπορτίνη-t που δρα ως υποδοχέας τους και απαιτεί Ran/GTP. Η εξαγωγή trna μπορεί να επηρεαστεί από τροποποιήσεις του trnas. Τα trnas μπορούν να επαναεισαχθούν στον πυρήνα. Τα πρωτογενή μετάγραφα mirnas (pre-mrnas) εξάγονται από τον πυρήνα με τη δράση της εξπορτίνης-5 και η επεξεργασία τους διεξάγεται στο κυτταρόπλασμα Πυρηνική εξαγωγή μορίων trna και mirna (α) Η μεταγραφή ενός γονιδίου trna από την RNA πολυμεράση III (Pol III) παράγει ένα πρωτογενές μετάγραφο, που μερικές φορές περιέχει ένα ιντρόνιο, με επιμηκύνσεις των 5 και 3 άκρων. Μετά την επεξεργασία των 5 και 3 άκρων, τροποποιήσεις βάσεων (κόκκινοι κύκλοι) και την προσθήκη των νουκλεοτιδίων CCA στο 3 άκρο, τα παραγόμενα trnas μπορούν να ακολουθήσουν διαφορετικές πορείες εξαγωγής. Τα trna που περιέχουν ένα ιντρόνιο ή ελεύθερα ιντρονίου trnas (με ένα αμινοξύ ή όχι) μεταφέρονται με την πορεία που εξαρτάται από την εξπορτίνη-t/los1, μεταξύ άλλων την αλληλουχία CAA. Μετά την εξαγωγή στο κυτταρόπλασμα και τη διάσταση του trna από τον υποδοχέα, το trna που περιέχει ένα ιντρόνιο υφίσταται μάτισμα από τις πρωτεΐνες ματίσματος που εντοπίζονται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, στους σακχαρομύκητες. Το ώριμο trna διοχετεύεται στη συνέχεια στα ριβοσώματα από παράγοντες αποδέσμευσης όπως Cex1 και eef1. (β) Για τα mirna, απεικονίζεται μόνον η παραγωγή του πρωτογενούς mrna (προ-mrnas) που μεταγράφεται από την Pol II. Τα mirnas μπορεί να κωδικοποιούνται από ένα γονίδιο mirna 23

24 που εντοπίζεται στο ιντρόνιο ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη (αριστερός κλάδος) ή από ένα ξεχωριστό γονίδιο mirna (δεξιός κλάδος). Και στις 2 περιπτώσεις, το πρωτογενές μετάγραφο διασπάται από το σύμπλοκο Drosha-DGCR8 σχηματίζοντας ένα προ-mrna που φέρει μια δομή μίσχου-βρόγχου (stem-loop structure). Επιπλέον, παράγεται ένα mirna που έχει υποστεί μάτισμα μετά από την αποκοπή ενός ιντρονικού mrna. Το προ-mirna που φέρει μια προεξοχή 2 νουκλεοτιδίων στο 3' άκρο του αναγνωρίζεται ειδικά από την εξπορτίνη-5 και μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα, όπου διίσταται από τον υποδοχέα του μετά την υδρόλυση του RanGTP. Μετά την αποδέσμευση του από την εξπορτίνη-5, το Dicer διασπά επιπλέον το prοmirna και παράγει ένα μονόκλωνο mirna, το οποίο συγκροτείται σε ένα επαγόμενο σύμπλοκο αποσιώπησης RNA (RNA-induced silencing complex; RISC). Με μπλε χρώμα φαίνεται η περιοχή του RNA που αντιστοιχεί σε ένα ώριμο mirna. 24