Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών 2

Transcript

1 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΜελΕτη της γενετικης ποικιλοτητας στο ειδος Valencia letourneuxi (ΙχθΥες, VALENCIIDAE) Βογιατζή Ε. 1, 2, Μαγιόπουλος Ι. 1, 3, Καλογιάννη Ε. 4, Γιακουμή Σ. 4, Μαγουλάς Α. 1, Τσιγγενόπουλος Κ. 1 1 Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών 2 Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής, Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης 3 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης 4 Ινστιτούτο Εσωτερικών Υδάτων, Ελληνικό Κέντρο Θαλασσίων Ερευνών Περίληψη Το Valencia letourneuxi Sauvage, 1880, είναι ένα μικρόσωμο ψάρι του γλυκού νερού, ενδημικό στη Δυτική Ελλάδα, την Πελοπόννησο και τη Νότια Αλβανία. Το είδος χαρακτηρίζεται από μικρά πληθυσμιακά μεγέθη και αποτελεί ένα από τα πλέον απειλούμενα είδη στην Ευρώπη. Η μελέτη της γενετικής του ποικιλότητας είναι απαραίτητη προκειμένου να βρεθούν οι πιο άμεσα απειλούμενες μονάδες και να καθοριστούν οι πιο κατάλληλες στρατηγικές προστασίας και διατήρησης. Ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο εμπλουτισμού, απομονώθηκαν αλληλουχίες με μικροδορυφορικές επαναλήψεις (γενωμική βιβλιοθήκη) και σχεδιάστηκαν ζεύγη εκκινητών για αυτές. Από τα 20 αρχικά ζεύγη, 11είχαν τα καλύτερα αποτελέσματα κι ακολούθησε γονοτύπιση των δειγμάτων που είχαν συλλεχθεί από επτά διαφορετικές περιοχές του ελλαδικού χώρου. Από τις αναλύσεις προκύπτουν ενδείξεις μειωμένης γενετικής ποικιλότητας, γεγονός που ίσως οφείλεται σε φαινόμενα στενωπού (bottleneck). Επιπλέον, παρατηρείται μια γεωγραφική συσχέτιση μεταξύ των πληθυσμών, με πιθανή εξήγηση το φαινόμενο της γονιδιακής ροής στο παρελθόν, το οποίο με τη σειρά του σχετίζεται με τη γεωλογική ιστορία της περιοχής. Λέξεις κλειδιά: Valencia letourneuxi, μικροδορυφορικό DNA, γενετική δομή. GEnetic population structure in Valencia letourneuxi (pisces, VALENCIIDAE) Vogiatzi E. 1,2, Magiopoulos I. 1, 3, Kalogianni E. 4, Giakoumi S. 4, Magoulas A. 1, Tsigenopoulos C. 1 1 Institute of Marine Biology and Genetics, Hellenic Centre for Marine Research 2 Department of Molecular Biology and Genetics, Democritus University of Thrace 3 Biology Department, University of Crete 4 Institute of Inland Waters, Hellenic Centre for Marine Research Abstract The Greek Valencia toothcarp Valencia letourneuxi is a small-bodied freshwater fish species, endemic in Western Greece, the Peloponnese and Southern Albania. The species is characterised by low population densities and is one of the most endangered of Europe. The study of its genetic variation is a prerequisite for designating the evolutionarily significant units and for developing an effective conservation strategy. Using an enrichment protocol, a set of microsatellite-containing sequences was isolated and pairs of primers were designed. From the 20 initial pairs, 11 of them gave the best results and the next step consisted of genotyping the samples collected from seven different water bodies of Greece. The analysis showed evidence of reduced genetic variation, a fact that might be due to a bottleneck event. Moreover, a geographical correlation among populations is evident, with possible explanation the past gene flow and the geological history of the region. Keywords: Valencia letourneuxi, microsatellite DNA, genetic structure. 1. Εισαγωγή Το Valencia letourneuxi (Sauvage, 1880), είναι ένα μικρόσωμο ψάρι του γλυκού νερού (Εικ. 1), με μικρή διάρκεια ζωής (δύο με τρία χρόνια) και ταχεία ωρίμανση, που παρουσιάζει κρυπτικό χρωματισμό και σεξουαλικό διμορφισμό (Barbieri et al., 2000, 2002; Kottelat & Freyhoff, 2007)

2 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 1: Άτομο του είδους V. letourneuxi (δείγμα από τις πηγές Βλυχού στη Βόνιτσα). Από ταξινομικής άποψης, το είδος ανήκει στην οικογένεια Valenciidae, η οποία περιλαμβάνει μόνο το γένος Valencia με δύο είδη: το V. hispanica (Valenciennes, 1846), ενδημικό της Ανατολικής Ιβηρικής χερσονήσου και το V. letourneuxi, αντικείμενο της παρούσης εργασίας, ενδημικό της Δυτικής Ελλάδας, της Πελοποννήσου και της Νότιας Αλβανίας (Economidis, 1991; Barbieri et al., 2000; Daoulas, 2003). Η κατακερματισμένη γεωγραφική κατανομή του είδους, οι ιδιαίτερες οικολογικές του απαιτήσεις και η χαμηλή του αφθονία, το καθιστούν είδος προς εξαφάνιση. Φέρεται να έχει ήδη εξαφανιστεί από τα τέσσερα υδάτινα συστήματα που είχε παλαιότερα εντοπιστεί στα νησιά Κέρκυρα και Λευκάδα, ενώ οι πληθυσμοί του στο νοτιότερο άκρο της γεωγραφικής του εξάπλωσης έχουν μεωθεί δραματικά (Bianco et al., 1996; Kalogianni et al., 2006). Μεταξύ των παραγόντων που θεωρούνται υπεύθυνοι για την πληθυσμιακή του μείωση συγκαταλέγονται η λειτουργία των φραγμάτων, η άντληση νερού για άρδευση και ύδρευση και η κατασκευή έργων υποδομής που επιφέρουν υποβάθμιση των ενδιαιτημάτων του. Αποτέλεσμα όλων αυτών ήταν να συμπεριληφθεί το είδος ως είδος προτεραιότητας για προστασία στην Κοινοτική Οδηγία για την Προστασία των Οικοτόπων (92/43/ EEC), και προσφάτως ως κρισίμως κινδυνεύον στον κατάλογο του IUCN (2005). Η προστασία της γενετικής ποικιλότητας είναι θέμα πρώτης προτεραιότητας για την προστασία και διατήρηση των οργανισμών καθώς αυτή είναι το αρχικό ακατέργαστο υλικό για την εξέλιξη και τις αλλαγές μεταξύ των πληθυσμών. Παράλληλα ο Παγκόσμιος Οργανισμός για τη Διατήρηση (World Conservation Union, IUCN) έχει αναγνωρίσει τη γενετική ποικιλότητα σαν ένα από τα τρία επίπεδα ποικιλότητας που απαιτούν διατήρηση (McNeely et al., 1990). Επομένως για ένα είδος όπως το V. letourneuxi η μελέτη της γενετικής του ποικιλότητας είναι απαραίτητη προκειμένου να καθοριστεί το επίπεδο του κινδύνου, να βρεθούν οι πιο άμεσα απειλούμενες μονάδες και ακολούθως να καθοριστούν οι καταλληλότερες στρατηγικές προστασίας. Ειδικά μάλιστα ένα είδος με μικρούς και απομονωμένους πληθυσμούς, όπως το V. letourneuxi, είναι περισσότερο εκτεθειμένο στην τυχαία γενετική παρέκκλιση και την ομομιξία τα οποία οδηγούν στην επιπλέον μείωση της ποικιλότητας (Avise, 1994). Οι μικροδορυφορικές περιοχές δεν είναι γενικά χρήσιμες για την μελέτη εξελικτικών γεγονότων στο βαθύ παρελθόν, λόγω του ταχύτατου ρυθμού μετάλλαξης και της εύκολης αλλαγής του μεγέθους τους. Όμως είναι πολύ καλοί δείκτες για τα σχετικά πρόσφατα εξελικτικά γεγονότα ακριβώς λόγω αυτού του ταχύτατου ρυθμού μετάλλαξης που τους επιτρέπει να καταγράφουν γρήγορα τις αλλαγές αυτές. Μάλιστα λόγω αυτού του ρυθμού μπορεί να εντοπισθεί και διαφορά μεταξύ των ατόμων σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό. Στην παρούσα εργασία μελετούμε τη γενετική ποικιλότητα του υπό εξαφάνιση είδους V. letourneuxi με τη χρήση μικροδορυφορικών περιοχών. Δείγματα έχουν συλλεχθεί από επτά περιοχές της Ελλάδας που είναι γνωστή η ύπαρξή του. Παράλληλα θα χρησιμοποιηθούν για σύγκριση και 3 άτομα από το συγγενικό είδος Aphanius fasciatus (Cyprinodontidae, Valenciennes, 1821)

3 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ 2. Υλικά και Μέθοδοι Συνολικά μελετήθηκαν δείγματα από 119 ψάρια του είδους V. letourneuxi και από τρία ψάρια του συγγενικού είδους A. fasciatus. Όλα τα άτομα του V. letourneuxi προέρχονται από τον ελληνικό χώρο και συγκεκριμένα από επτά υδάτινα συστήματα. Στoν Πίνακα 1 παρατίθενται τα συστήματα από τα οποία έγινε συλλογή δειγμάτων και ο αριθμός των ατόμων ανά δείγμα. Πίνακας 1: Τοποθεσίες συλλογής δειγμάτων και μέγεθος δείγματος. Περιοχή Αριθμός ατόμων Πηγές Χιλιαδούς (Μόρνος, Φωκίδα) 26 Αχέροντας (Ήπειρος) 25 Σκάλα Λούρου (Ήπειρος) 22 Πηγές Βλυχού (Βόνιτσα, Αιτ/νία) 20 Άραχθος (Ήπειρος) 12 Πηνειός (Πελοπόννησος) 8 Κέρκυρα 6 Τα δείγματα συλλέχθηκαν από προσωπικό του Ινστιτούτου Εσωτερικών Υδάτων του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε., εκτός από τα δείγματα του Πηνειού και της Κέρκυρας που στάλθηκαν από το Ζωολογικό Κήπο του Λονδίνου (ο αρχικός πληθυσμός Κέρκυρας αποτελέστηκε από 14 άτομα που συλλέχθηκαν το 1994 και το 1995, ενώ ο αρχικός πληθυσμός Πηνειού αποτελέστηκε από 15 άτομα που συλλέχθηκαν το 1994 και άλλα οκτώ που συλλέχθηκαν το 2000). Τα δείγματα του A. fasciatus προέρχονταν από την Κέρκυρα (δύο άτομα από την Αλυκή Λευκίμμης) και από το σύστημα του Ευήνου (ένα άτομο από την Κάτω Βασιλική). Για την εξαγωγή DNA χρησιμοποιήθηκαν τμήματα του ουραίου πτερυγίου και του μυϊκού ιστού των ψαριών. Η εξαγωγή έγινε ακολουθώντας το πρωτόκολλο των Miller et al. (1988). Ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο εμπλουτισμού (enrichment protocol) είχε κατασκευαστεί και υπήρχε διαθέσιμη στο ΙΘΑΒΙΓ μια γενωμική βιβλιοθήκη για το είδος (Tsigenopoulos et al., 2003). Ακολούθησε έλεγχος σε πήκτωμα αγαρόζης - οι primers με τα καλύτερα αποτελέσματα παραγγέλθηκαν ως σημασμένοι και πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των συνθηκών PCR, με τελικό στόχο τη γονοτύπιση όλων των ατόμων του είδους με ηλεκτροφόρηση σε αυτόματο αναλυτή αλληλουχιών (ABI sequencer 3700). 3. Αποτελέσματα Τα 11 ζεύγη εκκινητών (primers) που είχαμε στη διάθεσή μας ομαδοποιήθηκαν με βάση το μέγεθος των τμημάτων DNA που πολλαπλασιάζουν και την απόσταση μεταξύ τους (προκειμένου να απέχουν τουλάχιστον βάσεις) και τη σήμανσή τους με φθορίζουσα χρωστική διαφορετικής απορρόφησης. Ακολούθησε η διαδικασία εύρεσης των κατάλληλων συνθηκών για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για κάθε αντίδραση ξεχωριστά. Συγκεκριμένα οι ποσότητες από κάθε αντιδραστήριο που χρησιμοποιήθηκαν (όπως και σε κάθε αντίδραση PCR στην συγκεκριμένη εργασία) ήταν: ~20 ng/μl DNA, 1Χ Taq Buffer, 1,5 ή 2,5 mm MgCl 2, 2,7μΜ dntps, 4 μμ του κάθε εκκινητή και 0,2U Taq polymerase. Στις αναλύσεις που ακολούθησαν, τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με διάφορα λογισμικά προγράμματα, όπως το GENETIX 4.05 (Belkhir 2000) και FSTAT (Goudet 1995). Οι περισσότεροι εμφάνισαν μικρό αριθμό αλληλομόρφων στους διαφορετικούς πληθυσμούς. Όσον αφορά στα αλληλόμορφα, ο αριθμός τους ποικίλει από 3 έως 11 ανά τόπο, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 2. (Ο πληθυσμός της Βόνιτσας ήταν αυτός που χρησιμοποιήθηκε αρχικά για τη δημιουργία της Γενωμικής Βιβλιοθήκης)

4 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ Πίνακας 2: Ο αριθμός των αλληλομόρφων για κάθε τόπο σε κάθε πληθυσμό. Πληθυσμοί Τόποι Αχέροντας Μόρνος Λούρος Βόνιτσα Άραχθος Κέρκυρα Πηνειός Aphanius Total VL VL VL VL VL VL VL VL VL VL VL Πίνακας 3 : Εκτιμώμενη και παρατηρούμενη ετεροζυγωτία για κάθε πληθυσμό (ο τόπος VL068 εξαιρείται), το ποσοστό των τόπων που είναι πολυμορφικοί (όταν η συχνότητα του πιο συχνού αλληλομόρφου είναι ως 0,99) και Ν ο μέσος αριθμός των αλληλομόρφων ανά τόπο σε κάθε πληθυσμό. Πληθυσμοί H αναμενόμενη H παρατηρούμενη P(0.99) Ν Αχέροντας 0,1816 0,1704 0,80 2,7 Μόρνος 0,2737 0,3488 0,89 2,67 Λούρος 0,1365 0,1377 0,60 2,20 Βόνιτσα 0,1582 0,1500 0,60 1,90 Άραχθος 0,2652 0,2755 0,80 2,2 Κέρκυρα 0,1528 0,2296 0,33 1,44 Πηνειός 0,1761 0,2249 0,44 1,89 Aphanius 0,3036 0,3571 0,57 2,00 Εκ πρώτης όψεως, είναι φανερό ότι σε όλους τους πληθυσμούς οι ετεροζυγώτες είναι σαφώς περισσότεροι απ ότι αναμενόταν θεωρητικά. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι οι πληθυσμοί του V. letourneuxi δεν βρίσκονται σε ισορροπία Hardy Weinberg. Από τις παραπάνω τιμές μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα για τη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμών υπολογίζοντας τις τιμές των F statistics, οι οποίες δείχνουν το βαθμό ομομιξίας μεταξύ ατόμων σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό καθώς και το πλεόνασμα (εάν είναι αρνητική η τιμή) ή το έλλειμμα ετεροζυγωτίας (εάν η τιμή της Fis είναι θετική). Για τους περισσότερους τόπους και πληθυσμούς, το Fis παίρνει αρνητικές τιμές κάτι που υποδηλώνει ότι υπάρχει πλεόνασμα ετεροζυγωτών. Πάντως η στατιστική μελέτη έδειξε ότι όλες οι τιμές δεν είναι στατιστικά σημαντικές, εκτός από την τιμή του τόπου VL115 στον πληθυσμό του Μόρνου. Με τη χρήση του προγράμματος Genetix 4.05 υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών κατά Cavalli-Sforza & Edwards (1967). Ενδεικτικά αναφέρουμε ότι εμφανίζονται έντονες διαφοροποιήσεις στις γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών του είδους V. letourneuxi. Εισάγοντας τις παραπάνω αποστάσεις στο πρόγραμμα PHYLIP προκύπτει το φυλογενετικό δέντρο της Εικόνας

5 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Εικ. 2: Φυλογενετικό δέντρο Neighbor-Joining βασισμένο σε γενετικές αποστάσεις Cavalli-Sforza & Edwards (1967). 4. Συζήτηση Όπως ήδη αναφέρθηκε, η προστασία της γενετικής ποικιλότητας είναι θέμα πρώτης προτεραιότητας για την προστασία και διατήρηση των οργανισμών. Το βασικό συμπέρασμα που προκύπτει μελετώντας τις συχνότητες των αλληλομόρφων για τους πληθυσμούς του V. letourneuxi είναι ότι παρουσιάζουν πολύ μικρή γενετική ποικιλότητα, τουλάχιστον για τους τόπους που μελετήθηκαν. Αυτό μπορεί να είναι μια ένδειξη πραγματικής μειωμένης ποικιλότητας. Γνωρίζοντας ότι το συγκεκριμένο είδος είναι κρισίμως κινδυνεύον και οι πληθυσμοί του είναι περιορισμένοι (Barbieri et al., 2000; Das 1985; Kalogianni et al., 2006) αναμένουμε την περιορισμένη γενετική ποικιλότητα που διαπιστώσαμε εδώ. Ένα ακόμα στοιχείο που διαφαίνεται από την παρούσα εργασία είναι ότι οι πληθυσμοί δε βρίσκονται σε ισορροπία Hardy Weinberg για όλους τους γενετικούς τόπους και μάλιστα με πλεόνασμα των ετεροζυγωτών. Αυτό σε συνδυασμό με την περιορισμένη γενετική ποικιλότητα θα μπορούσε να σημαίνει ότι οι πληθυσμοί πέρασαν από μια σχετικά πρόσφατη πληθυσμιακή στενωπό (population bottleneck). Επιπροσθέτως, αν ο πληθυσμός μετά τη στενωπό είναι αρκετά μικρός, η τυχαία γενετική παρέκκλιση (genetic drift) θα προκαλέσει την εξαφάνιση των σπάνιων αλληλομόρφων και άρα θα μειώσει περαιτέρω τη γενετική ποικιλότητα. Μάλιστα σύμφωνα με τους Luikart & Cornuet (1998) το πλεόνασμα των ετεροζυγωτών ίσως να είναι ένας καλός δείκτης για την ύπαρξη του φαινομένου της στενωπού σε έναν πληθυσμό. Μελετώντας τις γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών παρατηρείται τέλος μια γεωγραφική συσχέτιση. Το FCA διάγραμμα και το φυλογενετικό δέντρο δείχνουν τρεις κύριες «ομάδες» πληθυσμών. Η ύπαρξη των ομάδων αυτών ίσως να αντανακλά την πιο πρόσφατη γονιδιακή ροή που είχαν οι πληθυσμοί μιας ομάδας σε σχέση με τους πληθυσμούς άλλων ομάδων. Ένα ακόμα συμπέρασμα είναι επίσης η δυνατότητα χρήσης μοριακών δεικτών και γενετικών τόπων σε συγγενικά είδη, όπως το A. fasciatus, με αντίστοιχη απόκριση. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Avise, J.C., Molecullar Markers, Natural History and Evolution. Chapman & Hall, London. Barbieri, R., Daoulas, Ch., Psarras, Th., Stoumboudi, M.Th. & Economou, A.N., The biology and ecology of V. letourneuxi Sauvage 1880 (Valenciidae) prospects for conservation. Mediterranean Marine Science, 1(2): Barbieri, R., Stoumboudi, M.Th. & Economou, A.N., Threatened fishes of the world: Valencia letourneuxi Sauvage, 1880 (Valenciidae). Environmental Biology of Fishes, 65:

6 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ Belkhir, K. Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N. & Bonhomme, F., GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier (France). Bianco, P.G., Ahnelt, H. & Economidis, P.S., The freshwater fishes from Eastern and Large Mediterranean Islands with Comments on their safety status. Acta Universitatis Carolinae Biologica, 40: Cavalli-Sforza, L.L. & Edwards, A.W.F., Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. Evolution: Daoulas, C., New records of Economidichthys pygmaeus (Holly, 1929) (Gobiidae) and Valencia letourneuxi (Sauvage, 1880) (Valenciidae) in Western Greece. Proceedings of the 11th Panhellenic Ichthyological Congress, Preveza, pp Das, J., On the biology and ecology of Valencia letourneuxi (Sauvage, 1880) (Teleostei, Cyprinodontiformes) in the Aheron-Kokitos-River-Drainage in northwestern Greece. Bonner Zoologische Beitraege. 36: Economidis, P.S., Check list of fresh water fishes of Greece (recent status of threats and protection). Bulletin of the Hellenic Society for the protection of nature, Spec Publ, pp. 48. Goudet, J., Fstat version 1.2: a computer program to calculate Fstatistics. Journal of Heredity, 86: Kalogianni, E., Giakoumi, S., Zogaris, S., Barbieri, R., Stoumboudi, M.Th., Zimmerman, B. & Economou, A.N., Population Decline of the Endangered Fish Species Valencia letourneuxi In Western Greece Strategies for Conservation. 1st European Congress of Conservation Biology, Book of Abstracts, p Kottelat, M. & Freyhof, J., Handbook of European freshwater fishes. Kottelat, Cornol, Switzerland & Freyhof, Berlin, Germany (Eds), Kottelat Publ., 646 pp. Luikart, G., & Cornuet, J.M., Empirical evaluation of a test for identifying recently bottlenecked populations from allele frequency data. Conservation Biology, 13: Mcneely, J. A., Miller, K. R., Reid, W.V., Mittermeier, R. A. & Werner, T. B., Conserving the World s Biological Diversity. IUCN, World Resources Institute, Conservation International, WWF-US and the World Bank, Washington, DC. Miller, S.A., Dykes, D.D. & Polesky, H.F., A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research, 16:1215. Tsigenopoulos, C.S., Hellemans, B., Chistiakov, D.A., Libertini, A., Kotoulas, G. & Volckaert, F., Eleven new microsatellites of the sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Molecular Ecology Notes, 3: