ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Διατμηματικό Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών στην «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασμός & Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ 90 (Ηsp90) ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΥΝΟΔΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΗΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΥΠΟΞΙΑ ΣΕ ΟΓΚΟΥΣ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Χριστίνα Ανδρουτσοπούλου Ιατρός ΠΑΤΡΑ

2 UNIVERSITY OF PATRAS INTERDEPARTMENTAL PROGRAM OF POSTGRADUATE STUDΙES «MEDICINAL CHEMISTRY: Drug Design & Development» MASTER THESIS Expression of Heat Shock Protein 90 (Hsp90) and of downstreamregulated proteins in brain tumors under hypoxia Christina Androutsopoulou Medical Doctor Patra

3 Τριμελής Επιτροπή Μάρθα Ασημακοπούλου (ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ) Aναπληρώτρια καθηγήτρια τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Ιωάννης Ματσούκας Καθηγητής τμήματος Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών Βασιλική Ζολώτα Aναπληρώτρια καθηγήτρια τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Advisory Committee Martha Asimakopoulou (SUPERVISOR) Associate Professor (Medicine Department, Univ. Patras) John Matsoukas Professor (Chemistry Department, Univ. Patras ) Vassiliki Zolota Associate Professor (Medicine Department, Univ. Patras) 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ανατομίας του Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών, το διάστημα Με την ολοκλήρωσή της, θα ήθελα να ευχαριστήσω από βάθους ψυχής την κα Μάρθα Ασημακοπούλου, για την πολύτιμη βοήθεια, υποστήριξη και καθοδήγησή της. Οι συμβουλές της, οι παροτρύνσεις της και η μετάδοση του ενθουσιασμού της για το θέμα της εργασίας, υπήρξαν καταλυτικές για τις όποιες απογοητεύσεις μου στη διάρκεια της εκπόνησής της. Ευχαριστώ τον κ. Ιωάννη Ματσούκα, που με έκανε δεκτή στο Διατμηματικό Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα της Ιατρικής Χημείας, καθώς και για το ενδιαφέρον και τη στήριξη που προσφέρει σε όλους τους φοιτητές του. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την κα Βασιλική Ζολώτα που δέχτηκε πρόθυμα να είναι μέλος της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, και η οποία, η οποία κατόπιν συνεννοήσεως με την κα Ασημακοπούλου μου επέτρεψε να συλλέξω το υλικό μου από βιοψίες που έγιναν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Ρίου. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τα μέλη του Εργαστηρίου Ανατομίας για τη βοήθεια και την πολύτιμη παρέα τους στη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, τον αδερφό μου Γρηγόρη και τους γονείς μου, Δημήτρη και Ελένη, για την υλική και ηθική τους συμπαράσταση στα χρόνια των σπουδών μου και το Γιώργο για την υπομονή και την κατανόησή του. 4

5 5

6 Περιεχόμενα ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ....7 Περίληψη...9 Abstract...11 Στόχοι της μελέτης ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΟΓΚΟΙ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ 90 (Hsp90) ΚΑΙ ΥΠΟΞΙΑ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ Οικογένεια των Hsp90 πρωτεϊνών Hsp90 και καρκίνος Hsp90 και όγκοι εγκεφάλου Ο ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΗΙF-1α ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Λειτουργίες HIF-1α και γονίδια-στόχοι HIF-1α και καρκίνος

7 HIF-1α και όγκοι εγκεφάλου Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ pvhl..52 Λειτουργίες της pvhl ΣΧΕΣΗ ΤΩΝ Hsp90, HIF-1α και pvhl ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΥΠΟΞΙΑ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ O ρόλος του VEGF Αγγειογένεση και όγκοι εγκεφάλου.... Σφάλμα! Δεν έχει οριστεί σελιδοδείκτης.8 Υποδοχείς του VEGF (VEGFRs) VEGFR-3 και καρκίνος VEGFR-3 και όγκοι εγκεφάλου Σχέση Hsp90 και VEGFR ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά και μέθοδοι Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσεως Αποτελέσματα ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΝΣ MRI Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Magnetic resonance imaging Hsp90 Ηeat shock Protein 90 SEER CBTRUS EGFR PTEN WHO SHR TNF HRE VHL HIF VEGF PDGFB Surveillance Epidemiology and End Results Central Brain Tumor Registry of the United States Epidermal Growth Factor Receptor Phosphatase and tensin homolog World Health Organization Steroid Hormone Receptors Tumor necrosis factors Hypoxia Response Elements Von Hippel Lindau Ηypoxia Induced Factor Vascular Endothelial Growth Factor Platelet-derived growth factor subunit B GLUT-1 Glucose transporter 1 TGF-a PKC 17-AAG Transforming growth factor alpha Protein Kinase C 17-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin Nf2 Neurofibromin 2 bfgf VEGFR upa LOH Basic fibroblast growth factor Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Plasminogen Activator, Urokinase Loss of heterozygosity 8

9 Περίληψη (Λέξεις κλειδιά: όγκοι εγκεφάλου του ανθρώπου, υποξία, Hsp90, HIF-1α, pvhl, VEGFR-3) Οι όγκοι εγκεφάλου αποτελούν μια ιδιαίτερη ομάδα όγκων, λόγω των σοβαρών λειτουργικών διαφορών που μπορούν να προκαλέσουν στον ασθενή, της συχνής δυσκολίας στη χειρουργική τους αντιμετώπιση και των περιορισμένων θεραπευτικών δυνατοτήτων. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει μεγάλα άλματα στην κατανόηση αυτών των όγκων σε μοριακό και γενετικό επίπεδο, αλλά εξακολουθούν να υπάρχουν αρκετά κενά στις γνώσεις μας σχετικά με την ανάπτυξή τους και τη βιολογική τους συμπεριφορά. Η ογκογένεση έχει συσχετισθεί σε αρκετούς όγκους, ανάμεσά τους και ορισμένοι όγκοι εγκεφάλου, με την πρωτείνη θερμικού σοκ 90 (Hsp90). Σε πρόσφατες μελέτες, έχει αποδειχθεί η η συμμετοχή της ΗSP90 στην αποδόμηση της ογκοκατασταλτικής πρωτείνης pvhl. H pvhl είναι απαραίτητητη για την αποδόμηση του μεταγραφικού παράγοντα που ενεργοποιείται στην υποξία HIF-1α. Η σύνδεση της Hsp90 με τον HIF-1α έχει ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση του HIF-1α. Ο HIF-1α παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση αγγειογενετικών παραγόντων, όπως ο VEGF. Η μοναδική μελέτη που έχει βρεθεί να συσχετίζει τη Hsp90 με τον VEGFR-3 - τον υποδοχέα του VEGF που εκφράζεται στα λεμφαγγεία κατά την ενήλικο ζωή - είναι αυτή της Sanderson και των συνεργατών της (2006), στην οποία βρέθηκε πως οι ανταγωνιστές της Hsp90 μειώνουν τα επίπεδα έκφρασης του VEGFR-3. Έχοντας ως δεδομένα τα παραπάνω, στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των μορίων Hsp90, pvhl, HIF-1α και VEGFR-3 στους όγκους εγκεφάλου και οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ τους. Για την ανίχνευση των Hsp90, pvhl, HIF-1α και VEGFR-3, χρησιμοποιήθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος, σε τομές ιστού πάχους 4μm, εγκλεισμένου σε παραφίνη. Χρησιμοποιήθηκαν ειδικά αντισώματα για την ταυτοποίηση των υπό μελέτη 9

10 πρωτεϊνών. Εξετάσθηκαν συνολικά 89 óγκοι εγκεφάλου (33 αστροκυττώματα: 3 πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα, 4 διάχυτα αστροκυττώματα, 4 αναπλαστικά αστροκυττώματα, 22 πολύμορφα γλοιοβλαστώματα, 4 ολιγοδενδρογλοιώματα, 3 επενδυμώματα, 9 μυελοβλαστώματα, 38 μηνιγγιώματα). Επιπλέον, έγινε διαχωρισμός ανάλογα με την ηλικία των ασθενών: οι ασθενείς με ηλικία μικρότερη των 19 ετών αποτέλεσαν την ομάδα των παιδιατρικών όγκων, ενώ οι ασθενείς με ηλικία μεγαλύτερη των 19 ετών, αποτέλεσαν την ομάδα όγκων των ενηλίκων. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν και τομές ιστού φυσιολογικού εγκεφάλου. Κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 ανιχνεύθηκε στο 47,1% των μελετηθέντων αστροκυττωμάτων (το 11,8% παρουσίασε και πυρηνική χρώση), στο 50% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων, στο 100% των επενδυμωμάτων, στο 55,5% των μυελοβλαστωμάτων και στο 66,7% των μηνιγγιωμάτων, ενώ κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl ανιχνεύθηκε στο 53,1% των μελετηθέντων αστροκυττωμάτων, στο 50% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων και των επενδυμωμάτων, στο 55,5% των μυελοβλαστωμάτων και των μηνιγγιωμάτων. Στους αστροκυτταρικούς όγκους της παρούσας μελέτης, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συν-έκφραση της Hsp90 με τη pvhl. Πυρηνική χρώση του HIF-1α σημειώθηκε στο 60,7% των αστροκυττωμάτων, στο 75% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων, στο 66,7% των επενδυμωμάτων, στο 44,4% των μυελοβλαστωμάτων και στο 48,1% των μηνιγγιωμάτων. Σε μικρό αριθμό όγκων σημειώθηκε και κυτταροπλασματική χρώση. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης του HIF-1α με το βαθμό διαφοροποίησης (grade) των αστροκυτταρικών όγκων. Στα μυελοβλαστώματα, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συν-έκφραση της Hsp90 και του HIF-1α. Εκφραση του υποδοχέα VEGFR-3 στο τοίχωμα των αγγείων ανιχνεύθηκε στο 16% των αστροκυτταρικών όγκων και στο 44,4% των μυελοβλαστωμάτων. Δεν παρατηρήθηκε συν-έκφραση της Ηsp90 και του VEGFR-3 στο τοίχωμα των αγγείων. Αντίθετα, παρατηρήθηκε συν-έκφραση Hsp90 και πυρηνική έκφραση του VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα, στο 50% των διάχυτων αστροκυττωμάτων, στο 75% των πολύμορφων γλοιοβλαστωμάτων, στο 33,3% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων και στο 33,3% των μυελοβλαστωμάτων. Συν-έκφραση HIF- 1α και VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα παρατηρήθηκε σε 66,6% των πιλοκυτταρικών αστροκυτωμάτων, σε 33,3% των αναπλαστικών αστροκυττωμάτων, 10

11 σε 46,2% των πολύμορφων γλοιοβλαστωμάτων, στο 33,3% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων και στο 44,4% των μυελοβλαστωμάτων. Τέλος, συνέκφραση Hsp90/HIF-1α/VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα βρέθηκε σε 25% των πολύμορφων γλοιοβλαστωμάτων, στο 33,3% των ολιγοδενδρογλοιωμάτων και στο 33,3% των μυελοβλαστωμάτων. Στους αστροκυτταρικούς όγκους, η Ηsp90 φαίνεται πως οδηγεί στη σταθεροποίηση του HIF-1α μέσω της σύνδεσής της με τη pvhl. Στα μυελοβλαστώματα από την άλλη, ο HIF-1α ρυθμίζεται από τη Hsp90 με τρόπο ανεξάρτητο από τη pvhl. Βρέθηκε συσχέτιση της έκφρασης του VEGFR-3 με τη Hsp90 αλλά και τον HIF-1α σε ομάδα όγκων του εγκεφάλου, η βιολογική συμπεριφορά των οποίων θα πρέπει να διερευνηθεί. Περαιτέρω μελέτη κρίνεται απαραίτητη για την αποσαφήνιση των μηχανισμών με τους οποίους δρουν οι πρωτείνες Hsp90, pvhl, HIF-1α και VEGFR-3 στην ανάπτυξη των όγκων εγκεφάλου και ιδιαίτερα των αστροκυτταρικών γλοιωμάτων και των μυελοβλαστωμάτων, ώστε μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν ως προγνωστικοί και θεραπευτικοί στόχοι. Abstract (Key words: human brain tumors, hypoxia, Hsp90, HIF-1α, pvhl, VEGFR-3) Brain tumors constitute a special group of tumors, because of the functional impairments or disability in which they can result and the difficulty they present in their management. The understanding of the molecular aspects of brain tumors has been enhanced during recent years, but there are still significant gaps in our knowledge of their progression and biological behavior. In many tumors, including brain tumors, tumorigenesis has been associated with heat shock protein 90 (Hsp90). Recent studies have demonstrated that Hsp90 is essential for the degradation of tumor suppressor protein, pvhl. pvhl is essential for the degradation of Hypoxia Induced Factor 1α (HIF-1α). The binding of Hsp90 to HIF-1α, results in the stabilization of HIF-1α. HIF-1α plays an important role in the activation of angiogenic factors, such as VEGF. Correlation of Hsp90 with VEGFR-3 11

12 has been reported by Sanderson et al. (2006). They have shown that Hsp90 antagonists, reduce the expression VEGFR-3. Taking into consideration the above, the aim of the current study was to estimate the levels of expression of Hsp90, pvhl, HIF-1α and VEGFR-3 in brain tumors and the possible correlations among them. The expression of Hsp90, pvhl, HIF-1α and VEGFR-3 was determined immunohistochemically in 4 μm paraffin embedded tumor sections. Antibodies against Hsp90, pvhl, HIF-1 α, and VEGFR-3 were used. The tumors comprised 23 glioblastomas (GBMs), 4 anaplastic astrocytomas (AAs), 4 diffuse astrocytomas (DAs),3 pilocytic astrocytomas, 4 oligodendrogliomas, 4 ependymomas, 9 myeloblastomas and 38 meningiomas. The tumors were further divided according to the age of patients: patients younger than 19 years old, constituted the group of pediatric tumors and patients older than 19 years old, constituted the group of the adult tumors. Normal human brain tissue was included in the study. Cytoplasmic immunoreactivity of Hsp90 was detected in 47,1% of astrocytomas (11,8% also demonstrated nuclear immunoreactivity), 50% oligodendrogliomas, 100% of ependymomas, 55,5% of myeloblastomas and 66,7% of meningiomas, whereas cytoplasmic immunoreactivity of pvhl was observed in 53,1% astrocytomas, 50% of oligodendrogliomas and ependymomas, 55,5% of myeloblastomas. Hsp90 was correlated with pvhl in astrocytic tumours. HIF-1 α was detectable in the nucleus of 60,7% of astrocytic tumours, 75% of oligodendrogliomas, 66,7% of ependymomas, 44,4% of myeloblastomas and in 48,1% of meningiomas. Immunoreaction of HIF-1α was also observed in the cytoplasm of some tumors. In the context of astrocytic gliomas, HIF-1α immunoreactivity was associated with an ascending grade of malignancy. Statistically significant correlation of Hsp90 expression with HIF-1α expression was observed in medulloblastomas. Expression of VEGFR-3 receptor in the vessels was detected in 16% of astrocytic tumors and in 44,4% of medulloblastomas. There was no coexpression of Hsp90 and VEGFR-3, on the vessel wall. Co-expression of Hsp90 and nuclear expression of VEGFR-3 in tumor cells was found in 50% of diffuse astrocytomas, 75% of glioblastomas multiforme, 33,3% of oligodendrogliomas and 12

13 33,3% of medulloblastomas. Co-expression of HIF-1α and VEGFR-3 in tumor cells was observed in 66,6% of pylocytic astrocytomas, 33,3% of anaplastic astrocytomas, 46,2% of glioblastomas multiforme, 33,3% of oligodendrogliomas and in 44,4% of medulloblastomas. Finally, co-expression of Hsp90/HIF-1α/VEGFR-3 in tumor cells was observed in 25% of glioblastomas multiforme, 33,3% of oligodendrogliomas and in 33,3% of medulloblastomas. In astrocytic tumors, Hsp90 seems to stabilize HIF-1α, through binding to pvhl. On the other hand, in medulloblastomas, HIF-1α seems to be regulated by Hsp90, in a way that seems to be independent from pvhl. We found a correlation between the expression of VEGFR-3 and Hsp90 and HIF-1α in a group of brain tumors, the biological behavior of which must be studied. Further investigation is necessary to elucidate the role of these proteins in the development of brain tumors and specifically of astrocytic gliomas and medulloblastomas and their use as prognostic factors and therapeutic tools. 13

14 Στόχοι της μελέτης Αν και η ετήσια επίπτωση των όγκων του ΚΝΣ είναι περίπου 17,000 με 20,000 στις ΗΠΑ-αριθμός αρκετά χαμηλότερος από αυτόν των πιο συχνών καρκίνων εντοπισμένων σε πνεύμονα, μαστό ή άλλα όργανα, οι όγκοι του ΚΝΣ ξεχωρίζουν στην ογκολογία για αρκετούς λόγους. Πρώτον, επιτίθενται στην ίδια τη δομή της προσωπικότητας των ασθενών, προκαλώντας λειτουργικά ελλείμματα που επηρεάζουν το ίδιο το άτομο και την οικογένειά του. Δεύτερον, οι όγκοι του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), είναι δύσκολο να αντιμετωπιστούν όταν είναι διηθητικοί ή εντοπισμένοι σε περιοχές δύσκολα προσπελάσιμες χειρουργικά. Τρίτον, οι όγκοι σε οποιοδήποτε όργανο μπορούν δευτεροπαθώς να επιδράσουν στον εγκέφαλο ή στη σπονδυλική στήλη, οπότε υπάρχει μεγάλη αλληλεπίδραση μεταξύ της νευρο-ογκολογίας και της γενικής ογκολογίας. Και τέλος, τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει μεγάλα άλματα στην κατανόηση αυτών των όγκων σε μοριακό και γενετικό επίπεδο, καθιστώντας μεγάλο αριθμό τους αντιμετωπίσιμο (είτε ανακουφιστικά, είτε θεραπευτικά). Σύγχρονα διαγνωστικά εργαλεία με μεγάλη ευαισθησία, όπως η MRI (magnetic resonance imaging), αποκαλύπτουν τους όγκους σε πιο πρώιμα στάδια. Οι χειρουργικές τεχνικές είναι πιο προχωρημένες και συνήθως η πλήρης εκτομή ακολουθείται από ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, εάν ο όγκος είναι ευαίσθητος σε φάρμακα με βιολογικές δράσεις σχετικές με τη μοριακή ταυτότητά του. Στις ΗΠΑ, τα 2/3 όσων διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο με όγκους εγκεφάλου δε θα επιβιώσουν, ενώ οι υπόλοιποι θα επιβιώσουν με επηρεασμένη λειτουργικότητα. Η ακριβής αιτιολογία των όγκων εγκεφάλου δεν είναι γνωστή και η σχέση μεταξύ 14

15 κληρονομικών και περιβαλλοντικών συνθηκών είναι ασαφής. Ωστόσο, οι μοριακές μελέτες των τελευταίων χρόνων έχουν ρίξει φως στη διάγνωση, θεραπεία και πρόληψη των καρκίνων του εγκεφάλου (Buzdar and Freedman, 2007). Η ογκογένεση έχει συσχετισθεί σε αρκετούς όγκους με την πρωτείνη θερμικού σοκ 90 (Hsp90), η οποία έχει βρεθεί πως εκφράζεται σε όγκους μαστού, πνεύμονα, λευχαιμίες, στη νόσο Hodgkin (Ghobrial et al., 2005) και τα τελευταία χρόνια έχει συσχετισθεί και με τους όγκους εγκεφάλου (Hauser et al. 2006, Shervington et al. 2008). Σύμφωνα με μελέτες, υποδεικνύεται η συμμετοχή της Ηsp90 στην αποδόμηση της πρωτείνης VHL (pvhl) (McClellan et al., 2005), καθώς και ότι η pvhl είναι απαραίτητητη για την αποδόμηση του μεταγραφικού παράγοντα που ενεργοποείται στην υποξία (HIF-1α) (Iwai et al., 1999). Επιπλέον, η βιβλιογραφία δείχνει τη σχέση Hsp90 και HIF-1α (Gradin et al., 1996) και πως η διαταραχή της σχέσης Hsp90/HIF-1α επάγει την αποδόμηση του HIF-1α με τρόπο ανεξάρτητο από το οξυγόνο και τη pvhl (Isaacs et al., 2002). Είναι γνωστό ότι ο HIF-1α παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση αγγειογενετικών παραγόντων, όπως ο VEGF (Rankin and Giaccia, 2008). Ο VEGF έχει βρεθεί πως υπερεκφράζεται στους όγκους εγκεφάλου και κυρίως στα πολύμορφα γλοιοβλαστώματα (ιδιαίτερα γύρω από τις νεκρωτικές περιοχές), στα ολιγοδενδρογλοιώματα, στα μεικτά ολιγοαστροκυττώματα και στα μυελοβλαστώματα (Abdulrauf et al, 1998). Πλήθος ερευνητικών δεδομένων υπάρχει για τη σχέση της Hsp90 με τους υποδοχείς του VEGF, τον VEGFR-1 (Park et al. 2008, Sanderson et al. 2006), τον VEGFR-2 (Park et al. 2008, Le Boeuf et al. 2004, Sanderson et al. 2006), αλλά λίγα είναι γνωστά για τη σχέση Hsp90 και VEGFR-3, ο οποίος εκφράζεται κυρίως στα λεμφαγγεία κατά την ενήλικο ζωή (Tammela al, 2008). Η μοναδική μελέτη που έχει βρεθεί να συσχετίζει τη Hsp90 με τον VEGFR-3, είναι αυτή της Sanderson και των συνεργατών της (2006), στην οποία βρέθηκε πως οι ανταγωνιστές της Hsp90 μειώνουν τα επίπεδα έκφρασης της VEGFR-3. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η ανίχνευση της συν-έκφρασης της πρωτείνης θερμικού σοκ Hsp90 με τον HIF-1α, στους όγκους εγκεφάλου του ανθρώπου. Ταυτόγχρονα, μελετήθηκε η έκφραση της πρωτείνης VHL (pvhl) καθώς είναι 15

16 γνωστή η συμμετοχή της στην αποδόμηση του HIF-1α. Επίσης, μελετήθηκε η πιθανή συσχέτιση της έκφρασης του υποδοχέα VEGFR-3 με την έκφραση της Hsp90 και HIF- 1α. 16

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΟΓΚΟΙ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Οι όγκοι εγκεφάλου αναλογούν σε ένα μικρό ποσοστό του συνόλου των καρκίνων (1.4%) και των σχετιζόμενων με καρκίνο θανάτων (2.4%). Ωστόσο, οι περισσότεροι από αυτούς τους όγκους αποβαίνουν μοιραίοι και ακόμα και οι καλοήθεις όγκοι μπορούν να εμπλακούν σε λειτουργίες βασικές για την καθημερινότητα του ατόμου. Η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (American Cancer Society) το 2006 υπολόγισε πως 18,820 άτομα στις ΗΠΑ διεγνώσθησαν με όγκο εγκεφάλου σε ένα έτος και 12,820 πέθαναν απ αυτόν. Οι όγκοι εγκεφάλου είναι η 10 η αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες συνολικά και η 5 η αιτία θανάτου από καρκίνο σε γυναίκες ηλικίας 20 με 39 χρόνων. Επιπλέον, ανάμεσα σε άτομα νεότερα από 20 χρόνων, οι όγκοι εγκεφάλου είναι ο πιο συχνός συμπαγής όγκος και η 2 η αιτία θανάτου από καρκίνο μετά τη λευχαιμία (Jemal et al., 2005). Λόγω της υψηλής θνησιμότητας-κυρίως σε ασθενείς διεγνωσμένους με γλοιοβλάστωμα-υπάρχει έντονο ενδιαφέρον ερευνητικά για την κατανόηση της αιτιολογίας των όγκων εγκεφάλου. Οι επιδημιολογικές μελέτες βοηθούν σε αυτό με δύο τρόπους: Πρώτον, οι περιγραφικές μελέτες χαρακτηρίζουν την επίπτωση των όγκων εγκεφάλου, τη θνησιμότητα και τα ποσοστά επιβίωσης με βάση τον ιστολογικό τύπο και δημογραφικά χαρακτηριστικά (π.χ., ηλικία, φύλο, γεωγραφική περιοχή). Δεύτερον, οι αναλυτικές μελέτες συγκρίνουν την πιθανότητα όγκου εγκεφάλου σε άτομα με ή χωρίς συγκεκριμένα χαρακτηριστικά (cohort studies) ή τα ιστορικά ανθρώπων με ή χωρίς όγκους εγκεφάλου (case-control studies) για να παρέχουν πληροφορίες για ένα μεγάλο εύρος πιθανών παραγόντων κινδύνου, συμπεριλαμβανομένων κληρονομούμενων και επίκτητων μεταλλάξεων σε γονίδια σχετιζόμενα με την καρκινογένεση, έκθεση σε ιονίσουσα ή μη ακτινοβολία, επαγγελματική απασχόληση, διατροφή, κάπνισμα, αλκοόλ, ατομικό ιατρικό ιστορικό και κάποιες κοινές λοιμώξεις. 18

19 Επιπρόσθετα στις επιδημιολογικές μελέτες, η μοριακή ταξινόμηση των όγκων εγκεφάλου θα μπορούσε να προσφέρει μεγαλύτερη κατανόηση του γενετικού ρόλου στην πρόοδο της νόσου και στην ευαισθησία στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία (Buzdar and Freedman, 2007). ΠΕΡΙΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Τα δεδομένα για τα στατιστικά στοιχεία των όγκων εγκεφάλου στις ΗΠΑ, συλλέγονται κυρίως από την Αρχή Επιτήρησης, Επιδημιολογίας και Αποτελεσματικότητας (SEER) του προγράμματος του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο ( National Cancer Institute) ( και από το πρόγραμμα Central Brain Tumor Registry (CBTRUS) ( Και οι δυο πηγές είναι βασικές, γιατί περιέχουν διαφορετικά δεδομένα: το SEER program αναφέρεται σε κακοήθεις πρωτοπαθείς όγκους εγκεφάλου, ενώ το CBTRUS αναφέρεται σε κακοήθεις και μη κακοήθεις όγκους. Επίπτωση Η πιο πρόσφατη στατιστική αναφορά (δεδομένα που συλλέχθηκαν από το 1998 ως το 2002) από το CBTRUS, εκτιμά την επίπτωση όλων των πρωτοπαθών κακόηθων και μη κακόηθων όγκων του ΚΝΣ (Κεντρικό Νευρικό Σύστημα) να είναι 14.8 ανά 100,000, ενώ με βάση το SEER program (από το 1994 ως το 2003) η ετήσια επίπτωση των όγκων του ΚΝΣ είναι 6.4 ανά 100,000. Αυτό το ποσοστό είναι ψηλότερο στους άντρες (7.6 ανά 100,000 άτομα) σε σχέση με τις γυναίκες (5.3 ανά 100,000 άτομα). Θνησιμότητα και επιβίωση Η American Cancer Society (ACS) εκτίμησε 12,820 θανάτους εξ αιτίας πρωτοπαθών κακόηθων όγκων του ΚΝΣ το 2006, που αντιστοιχεί σε ετήσια επίπτωση 4.60 ανά 100,000 άτομα σύμφωνα με το SEER. Σύμφωνα με δεδομένα του SEER, η πενταετής συνολική επιβίωση ήταν 33.2% για άντρες και 36.0% για γυναίκες. Αυτό το ποσοστό μειώνεται σημαντικά με την πρόοδο της ηλικίας. Παιδιά και νέοι κάτω από 20, έχουν πανταετή επιβίωση περίπου 65%, ενώ το ποσοστό πέφτει στο 28.1% ανάμεσα σε ενήλικες 45 με 54 ετών και μόνο σε 4.0% για ενήλικες 75 τών και 19

20 πάνω. Από όλους τους ιστολογικούς τύπους καρκίνου εγκεφάλου, το γλοιοβλάστωμα έχει τα χαμηλότερα ποσοστά διετούς και πενταετούς επιβίωσης για όλες τις ηλικιακές ομάδες. Η διετής επιβίωση είναι περίπου 30% για όσους διαγιγνώσκονται πριν την ηλικία των 45 και μειώνεται δραματικά με την αύξηση της ηλικίας, φτάνοντας να είναι κάτω από 2% για ηλικίες πάνω από 75 ετών (Εικόνα 1). Εικόνα 1 Διετής επιβίωση για επιλεγμένους όγκους εγκεφάλου, με βάση την ηλικία και την ιστολογική ομάδα. Πηγή: SEER πρόγραμμα, Η πενταετής επιβίωση ασθενών με γλοιοβλάστωμα είναι ακόμα χειρότερη, κυρίως για τους ηλικιωμένους (Εικόνα 2). 20

21 Εικόνα 2 Πενταετής επιβίωση για επιλεγμένους όγκους εγκεφάλου, με βάση την ηλικία και την ιστολογική ομάδα. Πηγή: SEER πρόγραμμα, Η πιθανότητα να διαγνωστεί κάποιος με πρωτοπαθή κακοήθη όγκο του εγκεφάλου στη διάρκεια της ζωής του είναι: 0.67% για άντρες και 0.51% για γυναίκες και η πιθανότητα να πεθάνει κανείς από αυτόν είναι ακόμα χαμηλότερη, 0.49% για άντρες και 0.39% για γυναίκες. Η επίπτωση και η θνησιμότητα έχουν αυξήσει τα ποσοστά τους από τα τέλη του Οι μεγαλύτερες αυξήσεις έχουν παρατηρηθεί στους ηλικιωμένους. Αυτή η αύξηση, μπορεί να αποδοθεί στην εισαγωγή διαγνωστικών εργαλείων, όπως η αξoνική και η μαγνητική τομογραφία, καθώς και στην αύξηση του προσδόκιμου ζωής και τη μεγαλύτερη διαθεσιμότητα νευροχειρουργών (Buzdar and Freedman, 2007). Διαφορές με βάση το φύλο, την ηλικία και την εθνικότητα Ηλικία Σύμφωνα με το CBTRUS, η μέση ηλικία εμφάνισης των πρωτοπαθών όγκων εγκεφάλου είναι τα 53 έτη. Ωστόσο, η μέση ηλικία εμφάνισης του γλοιοβλαστώματος και του μηνιγγιώματος, των δύο πιο συχνών τύπων όγκων στους 21

22 ενήλικες, είναι περίπου τα 62 έτη. Η ηλικιακή κατανομή ποικίλλει ανάλογα με την εντόπιση του όγκου και τον ιστολογικό τύπο. Για παράδειγμα, οι επιπτώσεις των αστροκυττωμάτων κορυφώνονται μεταξύ 65 και 74 χρόνων και μετά παρουσιάζουν πτώση, ενώ στο μηνιγγίωμα εξακολουθούν να αυξάνονται με την αύξηση της ηλικίας. Όπως και σε όλους τους καρκίνους, έτσι και εδώ, η αυξανόμενη επίπτωση με την ηλικία μπορεί να οφείλεται στην πιο μακροχρόνια έκθεση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες και στη συσσώρευση γενετικών μεταλλάξεων. Στο μυελοβλάστωμα ωστόσο, παρατηρείται κορύφωση (peak) της επίπτωσης σε παιδιά. Στον πίνακα 1, παρουσιάζονται συνοπτικά οι πιο συχνοί ιστολογικοί τύποι όγκων εγκεφάλου με βάση την ηλικία (Buzdar and Freedman, 2007). Πίνακας 1 Συχνότητα των όγκων του εγκεφάλου ανάλογα με την ηλικία (Πηγή: CBTRUS) Ηλικιακή Ομάδα* (σε χρόνια) Πιο συχνός ιστολογικός τύπος Δεύτερος πιο συχνός ιστολογικός τύπος 0-4 Μυελοβλάστωμα Πιλοκυτταρικό αστροκύττωμα 5-19 Πιλοκυτταρικό Μυελοβλάστωμα αστροκύττωμα Μηνιγγίωμα Όγκος Υπόφυσης Μηνιγγίωμα Κακοήθεις όγκοι του ελύτρου περιφερικών νεύρων και Γλοιοβλάστωμα 45 Μηνιγγίωμα Γλοιοβλάστωμα *Ηλικία κατά τη διάγνωση 22

23 Φύλο Το πιο συχνό επιδημιολογικό εύρημα στους όγκους εγκεφάλου είναι πως οι νευροεπιθηλιακοί όγκοι είναι πιο συχνοί στους άντρες, ενώ οι όγκοι των μηνίγκων είναι πιο συχνοί στις γυναίκες (Counsell and Grant 1998, Surawicz et al. 1999). Συγκεκριμένα, η επίπτωση του γλοιώματος είναι κατά 40% υψηλότερη στους άνδρες σε σχέση με τις γυναίκες, ενώ η επίπτωση του μηνιγγιώματος είναι κατά 80% υψηλότερη στις γυναίκες. Βιολογικοί ή κοινωνικοί παράγοντες μπορεί να σχετίζονται με αυτές τις διαφορές στα φύλα και αυτοί οι παράγοντες ίσως να έχουν σχέση και με την αιτιολογία των όγκων εγκεφάλου. Εθνικότητα Η ερμηνεία των γεωγραφικών και εθνικών διαφορών στην επίπτωση των όγκων εγκεφάλου οφείλεται τόσο στις διαφορές στην πρόσβαση στο σύστημα υγείας, όσο και σε διαφορές στην καταγραφή των περιστατικών. Επιπλέον, οι γεωγραφικές διαφορές που σχετίζονται με τους παράγοντες κινδύνου έχουν επίσης επίδραση στην επίπτωση του καρκίνου. Η επίπτωση των κακόηθων όγκων εγκεφάλου στην Ιαπωνία είναι λιγότερο από τη μισή σε σχέση με εκείνη της βόρειας Ευρώπης. Στις ΗΠΑ, τα γλοιώματα επηρεάζουν μεγαλύτερο ποσοστό λευκών απ ό,τι μαύρους, ενώ η επίπτωση των μηνιγγιωμάτων είναι ίση στις δύο φυλές (Buzdar and Freedman, 2007). Ιστολογικοί τύποι Οι πρωτοπαθείς όγκοι εγκεφάλου ταξινομούνται με βάση τα ιστολογικά χαρακτηριστικά τους και την εντόπισή τους και συχνά ταξινομούνται περαιτέρω με βάση τη διηθητικότητα ή την κακοήθειά τους. Πιο διηθητικές μορφές (που συχνά έχουν περισσότερες γενετικές μεταλλάξεις) ταξινομούνται ως υψηλής κακοήθειας. Στον πίνακα 2 συνοψίζονται οι όγκοι του ΚΝΣ (Κεντρικού Νευρικού Συστήματος) και παρακάτω αναλύονται οι πιο συχνοί από αυτούς τους όγκους. 23

24 Πίνακας 2 Συνοπτικά οι όγκοι του ΚΝΣ Όγκοι του νευροεπιθηλιακού ιστού Αστροκυτταρικοί όγκοι Ολιγοδενδρογλοιακοί όγκοι Μεικτά γλοιώματα Επενδυματικοί όγκοι Όγκοι του χοριοειδούς πλέγματος Γλοιακοί όγκοι αβέβαιης προέλευσης Νευρικοί και μεικτοί νευρο-γλοιακοί όγκοι Όγκοι της επίφυσης Όγκοι των περιφερικών νεύρων Σβάννωμα Νευροίνωμα Περινευρίνωμα Κακοήθεις όγκοι των περιφερικών νεύρων Όγκοι των μηνίγγων Όγκοι των μηνιγγοθηλιακών κυττάρων Μεσεγχυματικοί, μη μηνιγγοθηλιακοί όγκοι Πρώϊμες μελανοκυτταρικές αλλοιώσεις Όγκοι μη βέβαιης ιστογένεσης Λεμφώματα και αιμοποιητικά νεοπλάσματα Μεταστατικοί όγκοι 24

25 Γλοιώματα Αστροκυτταρικοί όγκοι Οι αστροκυτταρικοί όγκοι περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα νεοπλασμάτων που διαφέρουν σε μορφολογικά χαρακτηριστικά, στην εντόπιση στο ΚΝΣ, στη δυνατότητα ανάπτυξης, στην έκταση της διήθησης, στην τάση για περαιτέρω εξέλιξη, στην κατανομή σε ηλικία και φύλο. Συνήθως έχουν διηθητικό τρόπο ανάπτυξης, που καθιστά την πλήρη χειρουργική εκτομή αδύνατη. Τα χαμηλής κακοήθειας γλοιώματα παρουσιάζονται κυρίως σε νεαρούς ενήλικες (Behin et al. 2003), ενώ τα υψηλής κακοήθειας έχουν υψηλότερη επίπτωση στους ηλικιωμένους. Με συνδυασμένη χειρουργική εκτομή και ακτινοθεραπεία, η πενταετής επιβίωση των ασθενών με χαμηλής κακοήθειας γλοιώματα είναι περίπου 50%. Ασθενείς με υψηλής κακοήθειας γλοιώματα έχουν πολύ φτωχή πρόγνωση. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η χειρουργική και η ακτινοθεραπεία μπορούν να επιμηκύνουν την προσδοκώμενη επιβίωση από 5 ως 12 μήνες (Bergenheim& Henriksson 1998). Τα ολιγοδενδρογλοιώματα με απώλεις στα χρωμοσώματα 1p και 19q σχετίζονται με χημειοευαισθησία και μεγαλύτερη επιβίωση (Cairncross et al. 1998, Smith et al. 2000). Η ταξινόμηση των γλοιωμάτων είναι δύσκολη, γιατί πρόκειται για όγκους με μεγάλη ετερογένεια. Τα τελευταία χρόνια, χρησιμοποιείται το σύστημα ταξινόμησης κατά WHO, το οποίο βασίζεται στην κυτταρική πρέλευση του όγκου και στα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του. Βασικοί δείκτες της επιθετικής συμπεριφοράς του όγκου είναι η ατυπία, η μιτωτική δραστηριότητα, η κυτταροβρίθεια, η αγγειοβρίθρεια και η νέκρωση. Με βάση αυτούς τους δείκτες, τα γλοιώματα χωρίζονται κατά WHO στις κατηγορίες του πίνακα 3. 25

26 Πίνακας 3 Κατηγοριοποίηση των γλοιωμάτων κατά WHO και επιδημιολογικά στοιχεία για την επίπτωση, ηλικία φύλο και την επιβίωση των ασθενών σε ΗΠΑ και Ζυρίχη.Πηγή : Ohgaki H and Kleihues P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol 2005, 109: Με βάση λοιπόν τα προαναφερθέντα κριτήρια, τα αστροκυτταρικά γλοιώματα, διαχωρίζονται σε τέσσερις κύριες κατηγορίες-πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα (grade I), διάχυτα αστροκυττώματα (grade II), αναπλαστικά αστροκυττώματα (grade III) και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (grade IV) (Kleihues & Cavanee 2000). Τα χαμηλής κακοήθειας αστροκυττώματα αποτελούνται από δύο βασικούς τύπους: τα πιλοκυτταρικά και τα διάχυτα αστροκυττώματα. Τα πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα αναπτύσσονται αργά, είναι μη διηθητικά και συνήθως απαντώνται σε παιδιά και νεαρούς ενήλικες. Τα διάχυτα αστροκυττώματα από την άλλη πλευρά, χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό κυτταρικής διαφοροποίησης, αργή ανάπτυξη και διάχυτη διήθηση γειτονικών εγκεφαλικών δομών. Συνήθως προσβάλλουν 26

27 νεαρούς ενήλικες και έχουν μια ενδογενή τάση για εξέλιξη σε αναπλαστικά αστροκυττώματα και τελικά σε γλοιoβλαστώματα. Τα υψηλής κακοήθειας αστροκυττώματα αναπτύσσονται ταχέως και συχνά παρουσιάζουν νεκρωτικές περιοχές στο κέντρο του όγκου. Τα γλοιοβλαστώματα χωρίζονται σε πρωτοπαθή και δευτεροπαθή. Τα πρωτοπαθή είναι γλοιοβλαστώματα που σχηματίζονται de novo χωρίς κλινικά ή ιστολογικά στοιχεία προέλευσής τους από χαμηλής κακοήθειας γλοιώματα, ενώ τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα έχουν προέλθει από χαμηλής κακοήθειας αστροκυττώματα μετά από συγκεκριμένες γενετικές εξαλλαγές. Η υπερέκφραση και ενίσχυση του epidermal growth factor receptor (EGFR) και του Mdm-2, οι p16 εξαλείψεις, οι μεταλλάξεις PTEN (Phosphatase and tensin homolog), σχετίζονται με τα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα, ενώ οι μεταλλάξεις p53 σχετίζονται κυρίως με τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα (Kleihues et al. 1997) (Εικόνα 3). Διαφοροποιημένα αστροκύτταρα ή πρόδρομα κύτταρα Μεταλλάξεις p53 Υπερέκφραση PDGF Υπερέκφραση, ενίσχυση του EGFR Χαμηλής κακοήθειας αστροκύττωμα Υπερέκφραση, ενίσχυση του Mdm-2 LOH 19q Εξαλλαγές RB Απαλοιφή του p16 LOH 10p και 10 q Εικόνα 3 Μοντέλο για τα πιθανά βήματα στην εξέλιξη των γλοιωμάτων Αναπλαστικό Αστροκύττωμα LOH 10q Μεταλλάξεις PTEN Ενίσχυση του PDGF Δευτεροπαθές γλοιοβλάστωμα Μεταλλάξεις PTEN Εξαλλαγές RB Υπερέκφραση VEGF Πρωτοπαθές γλοιοβλάστωμα 27

28 Ολιγοδενδρογλοιώματα Τα ολιγοδενδρογλοιώματα αναπτύσσονται από ολιγοδενδροκύτταρα. Αυτός ο τύπος όγκου εμφανίζεται κυρίως στο μετωπιαίο ή κροταφικό λοβό του εγκεφάλου και είναι πιο συχνός στους ενήλικες από ό,τι στα παιδιά και στους άνδρες περισσότερο συχνός από ό,τι στις γυναίκες. Τα ολιγοδενδρογλοιώματα αποτελούν το 5-12% του συνόλου των νευρογλοιακών όγκων και το 5-7% όλων των ενδοκρανιακών όγκων. Παρά το γεγονός ότι είναι κλινικά λιγότερο επιθετικοί σε σχέση με τα αστροκυττώματα, τα ολιγοδενδρογλοιώματα είναι περισσότερο διεισδυτικά, προκαλούν συχνά μεταστάσεις και είναι συχνά πιο δύσκολο να αφαιρεθούν χειρουργικά. Ωστόσο, έχουν γενικά καλύτερη πρόγνωση και εμφανίζουν υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης από άλλα γλοιώματα. Όπως τα άλλα γλοιώματα, τα ολιγοδενδρογλοιώματα βαθμολογούνται από το 1 έως το 4, ανάλογα με τον βαθμό κακοήθειας και το ρυθμό ανάπτυξης. Ο WHO διακρίνει δύο τύπους ολιγοδενδρογλοιωμάτων, το βαθμού ΙΙ ολιγοδενδρογλοίωμα και το αναπλαστικό κακοήθες ολιγοδενδρογλοίωμα βαθμού ΙΙΙ (He et al., 2001). Αυτοί οι όγκοι παρουσιάζουν χαρακτηριστικές απώλειες περιοχών στα χρωμοσώματα 1, 9, 19, και 22. Ομόζυγη εξάλειψη του γονιδίου p16, απώλεια ετεροζυγωτίας στο χρωμόσωμα 10 και ενίσχυση του EGFR έχουν επίσης βρεθεί σε αυτούς τους όγκους (Buzdar and Freedman, 2007). Επενδυμώματα Οι όγκοι αυτοί αναπτύσσονται από τα επενδυματικά κύτταρα του ΚΝΣ, τα οποία περιβάλλουν τις κοιλίες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού. Τα επενδυμώματα μπορούν να εξαπλωθούν από τον εγκέφαλο προς το νωτιαίο μυελό μέσω του εγκεφαλο-νωτιαίου υγρού, προκαλώντας σημαντική διόγκωση των κοιλιών ή υδροκεφαλία. Τα επενδυμώματα αντιπροσωπεύουν το 4-6% του συνόλου των όγκων του εγκεφάλου και εμφανίζονται κυρίως μέχρι την ηλικία των 20 ετών. Στα παιδιά, το 30% των επενδυμώματων εμφανίζονται πριν από την ηλικία των 3 ετών και είναι πιο επιθετικά απ ό,τι στους ενήλικες. Σχεδόν το 90% των παιδιατρικών επενδυμωμάτων είναι ενδοκρανιακά με πιθανότερες θέσεις 28

29 εμφάνισης τον πρόσθιο ή οπίσθιο βόθρο. Σε αντίθεση με τους προαναφερόμενους όγκους, τα χαμηλού βαθμού επενδυμώματα (βαθμός Ι / ΙΙ) είναι ικανά να προκαλέσουν μεταστάσεις κατά μήκος του νευρικού άξονα. Έχουν χαρακτηριστεί τρεις κύριοι τύποι επενδυμωμάτων: α) Βαθμού Ι επενδυμώματα: τέτοια είναι το μιξοθηλοειδές επενδύμωμα και το υποεπενδύμωμα. Οι πιο συχνές γενετικές μεταλλάξεις σε αυτούς τους όγκους είναι εξαλείψεις στο χρωμόσωμα 17p και μονοσωμία στο χρωμόσωμα 22. Εμφανίζουν χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού. β) Βαθμού ΙΙ επενδυμώματα: αποτελούν τον πιο κοινό τύπο και εμφανίζονται κατά μήκος του συστήματος κοιλιών του ΚΝΣ με μεγαλύτερη συχνότητα στον οπίσθιο βόθρο. γ) Βαθμού ΙΙΙ ή αναπλαστικό επενδύμωμα: είναι υψηλού βαθμού γλοιώματα με υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, εμφανίζονται με μεγαλύτερη συχνότητα, επίσης, στον οπίσθιο βόθρο. (Louis et al., 2007). Μυελοβλαστώματα Τα μυελοβλαστώματα είναι υψηλής κακοήθειας όγκοι που προέρχονται από πρόωρες μορφές κυττάρων του ΚΝΣ. Εμφανίζονται στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας και στον οπίσθιο βόθρο. Αποτελούν το 3-5% όλων των όγκων του εγκεφάλου, όμως αντιπροσωπεύουν το 25% όλων των όγκων του εγκεφάλου κατά την παιδική ηλικία. Πιο συχνά η ηλικία εμφάνισης κυμαίνεται μεταξύ 3 και 8 ετών, αν και μυελοβλαστώματα έχουν επίσης παρατηρηθεί και σε ενήλικες. Λόγω της θέσης αυτών των όγκων, που έρχονται σε επαφή με την τέταρτη κοιλία, είναι συχνή η εμφάνιση μεταστάσεων στο σύστημα των κοιλιών και κατά μήκος του νευρικού άξονα (25-45% των περιπτώσεων), συνήθως μέσω του εγκεφαλονωταίου υγρού. Στο 5% των περιπτώσεων, μεταστάσεις υπάρχουν ήδη κατά τη διάγνωση (Louis et al., 2007). Λίγα είναι γνωστά για τη μακροπρόθεσμη επιβίωση ασθενών με μυελοβλάστωμα παιδικής ηλικίας, αλλά η θεραπεία με ακτινοβολία έχει εμπλακεί στην ανάπτυξη δευτεροπαθών κακοηθειών. Εξαλείψεις στο χρωμόσωμα 17p και 29

30 λιγότερο συχνά, εξαλείψεις στα χρωμοσώματα 2p, 6q, 10q, 11p, 11q, και 16q σχετίζονται με αυτούς τους όγκους (Buzdar and Freedman, 2007). Μηνιγγιώματα Τα μηνιγγιώματα είναι οι πιο συχνοί καλοήθεις ενδοκρανιακοί όγκοι. Αποτελούν περίπου το 20% όλων των πρωτοπαθών ενδοκράνιων όγκων Είναι πιο συχνοί σε μεσήλικες και ηλικιωμένους με υψηλότερη συχνότητα στις γυναίκες. Τα μη εξαιρέσιμα μηνιγγιώματα, καθώς και τα κακοήθη, μπορεί να έχουν μοιραία έκβαση και νέες στρατηγικές θεραπείας είναι απαραίτητες (Bergenheim and Henriksson, 1998). Η πλειοψηφία των μηνιγγιωμάτων (80-90%) είναι καλοήθη και ταξινομούνται ως WHO grade I, ενώ 5-15% των μηνιγγιωμάτων ταξινομούνται ως άτυπα και αντιστοιχούν σε WHO grade II. Το αναπλαστικό μηνιγγίωμα (grade III) είναι κακόηθες, σπάνιο και αποτελεί το 1-3% όλων των μηνιγγιωμάτων (Louis et al. 2000). Τα μηνιγγιώματα ομαδοποιημένα με βάση την πιθανότητα υποτροπής και το βαθμό κακοήθειας συνοψίζονται στον Πίνακα 4. Πίνακας 4 Μηνιγγιώματα ομαδοποιημένα κατά WHO Τα μηνιγγιώματα είναι ιστολογικά καλοήθεις όγκοι που προέρχονται από το αραχνοειδές στρώμα που περιβάλλει το ΚΝΣ. Διήθηση στο οστό και στον υποδόριο 30

31 ιστό μπορεί να συμβεί, αλλά διήθηση στο νευρικό παρέγχυμα συνήθως παρατηρείται μόνο σε κακοήθη μορφή, που είναι πολύ σπάνια. Η περιοχή εντόπισης αυτών των όγκων παίζει μεγάλο ρόλο στην πρόγνωση. Τα αναπλαστικά μηνιγγιώματα σχετίζονται με λιγότερο ευνοική πρόγνωση, διότι έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής και επιθετικής συμπεριφοράς. Κάποιες γενετικές διαφοροποιήσεις έχουν συσχετισθεί με τη δημιουργία καλόηθων μηνιγγιωμάτων και την εξέλιξη σε ατυπία και αναπλασία (Εικόνα 4). Αραχνοειδή κύτταρα Μετάλλαξη γονιδίου NF2 και απώλεια στο χρωμόσωμα 22q Απώλεια DAL-1 Καλόηθες μηνιγγίωμα (WHO grade I) Απώλειες στα 1q, 6q, 10q, 14q, 18q Άτυπο μηνιγγίωμα (WHO grade II) Περαιτέρω απώλειες στα 9q, 6q, 14 Eικόνα 4 Υποθετικό μοντέλο σχηματισμού καλόηθων Aναπλαστικό/Κακόηθες μηνιγγίωμα (WHO grade III) μηνιγγιωμάτων και της εξέλιξής τους σε άτυπα και αναπλαστικά 31

32 Σβαννώματα Είναι καλοήθεις όγκοι κρανιακών νεύρων και αποτελούν το 8% των πρωτοπαθών όγκων εγκεφάλου. Συμβαίνουν δυο φορές συχνότερα στις γυναίκες σε σχέση με τους άντρες και παρατηρούνται κυρίως σε ασθενείς μέσης ηλικίας. Τα κακοήθη σβαννώματα ξεκινούν από περιφερικά νεύρα και υποτροπές και μεταστάσεις συμβαίνουν γρήγορα. Σε μερικά σβαννώματα παρατηρούνται απώλειες στο χρωμόσωμα 1p και στο 22q (Buzdar and Freedman RS, 2007). ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Οι περισσότερες μελέτες παραγόντων κινδύνου αφορούν τα γλοιώματα και λιγότερο τα μηνιγγιώματα και παρουσιάζονται παρακάτω: Γενετικό υπόβαθρο Ο καρκίνος γενικά θεωρείται πως αναπτύσσεται μετά από συνάθροιση γενετικών μεταλλάξεων που επιτρέπουν στα κύτταρα να ξεφύγουν από τους φυσιολογικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς και από την καταστροφή από το ανοσοποιητικό σύστημα.κληρονομούμενες ή επίκτητες μεταλλάξεις σε γονίδια κρίσιμα για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, όπως το p53 θεωρούνται υποψήφιοι καρκινογόνοι παράγοντες. Γενετικοί παράγοντες σχετιζόμενοι με τους όγκους εγκεφάλου έχουν μελετηθεί (Wrensch et al, 2002). Θεωρείται πως τουλάχιστον το 5% με 10% των όγκων εγκεφάλου οφείλονται σε γενετική προδιάθεση. Η συχνότητα όγκων εγκεφάλου σε ασθενείς με κληρονομικά σύνδρομα όπως η οζώδης σκλήρυνση, η νευροινωμάτωση τύπου 1 και 2, οι αδενωματώδεις πολύποδες δείχνουν μια γενετική προδιάθεση στους όγκους (Bondy et al., 1994). Στα γλοιώματα, βρίσκονται συχνά μεταλλάξεις στο γονίδιο p53, ενώ λιγότερο συχνά ανιχνεύονται μεταλλάξεις σε άλλα σημαντικά γονίδια για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όπως τα p16, RB, and MDM2. Εκτός από τα γενετικά αίτια, οι όγκοι εγκεφάλου μπορεί να εμφανίζoνται στην ίδια οικογένεια και λόγω έκθεσης σε κοινούς περιβαλλοντικούς παράγοντες, κάτι που επιβεβαιώνεται από μελέτες σε αδέρφια (που παρουσίασαν μεγαλύτερη από την αναμενόμενη συχνότητα όγκων εγκεφάλου). Οι περισσότεροι 32

33 όγκοι εγκεφάλου εντός της οικογένειας σχετίζονται με αλληλεπιδράσεις γονιδίωνπεριβάλλοντος, όπου άτομα με γενετική προδιάθεση εμφανίζουν καρκίνο μετά από έκθεση σε εξωγενείς καρκινογόνους παράγοντες. Γενετικοί πολυμορφισμοί στο κυτόχρωμα (CYP2D6) και στις τρανσφεράσες της γλουταθειόνης έχουν συσχετισθεί με τα γλοιώματα και κάποιους άλλους όγκους εγεφάλου (Wrensch et al, 2002).. Ιονίζουσα και μη ιονίζουσα ακτινοβολία Η θεραπευτική ιονίζουσα ακτινοβολία είναι ο μόνος γνωστός περιβαλλοντικός παράγοντας που σχετίζεται επιβεβαιωμένα με όγκους εγκεφάλου. Σχετικά χαμηλές δόσεις (1.5 Gy) που χρησιμοποιούνται για μυκητίαση της κεφαλής (tinea capitis) και το δερματικό αιμαγγείωμα στα παιδιά, έχουν συσχετισθεί με αυξημένο κίνδυνο για μηνιγγιώματα και γλοιώματα. Επίσης, υπάρχει συσχέτιση του γλοιώματος σε ενήλικες που είχαν δεχθεί ακτινοθεραπεία για οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία ως παιδιά, αλλά και για άλλους παιδικούς καρκίνους. Η διαγνωστική ακτινοβολία στην ιατρική και στην οδοντιατρική δε φαίνεται να σχετίζεται με την ανάπτυξη των γλοιωμάτων, αλλά μπορεί να σχετίζεται με την ανάπτυξη των μηνιγγιωμάτων. Η εργασία σε πυρηνικές εγκαταστάσεις φαίνεται πως αυξάνει ελαφρά την πιθανότητα για καρκίνο εγκεφάλου. Παιδιά που ζουν σε σπίτια με αυξημένη έκθεση σε ηλεκτρομαγνητικά πεδία δείχνουν αυξημένη πιθανότητα για όγκους εγκεφάλου και λευχαιμία, αν και δεν έχει αποδειχθεί η αιτιολογική συσχέτιση. Η ανησυχία σχετικά με τις επιδράσεις των κινητών τηλεφώνων στην υγεία οδήγησε σε μια σειρά μελετών, οι οποίες δεν ανίχνευσαν κάποια σημαντική συσχέτιση με τον κίνδυνο ανάπτυξης όγκων εγκεφάλου. Βέβαια, πρέπει να γίνουν περαιτέρω μελέτες για τις μακροχρόνιες συνέπειες της χρήσης των κινητών ή για να βρεθεί αν υπάρχει μια μικρή ομάδα ανθρώπων πιο ευάλωτη στην ανάπτυξη όγκων εγκεφάλου από τη χρήση τους. Ο διεθνής οργανισμός ερευνών για τον καρκίνο (The International Agency for Research on Cancer) διεξήγαγε μελέτη που έδειξε πως η συχνή χρήση του κινητού τηλεφώνου για πάνω από 10 χρόνια σχετίζεται με τετραπλάσιο κίνδυνο για ανάπτυξη ακουστικού νευρινώματος, αλλά όχι άλλο τύπο 33

34 όγκου εγκεφάλου (Lonn et al., 2004). Οι περισσότερες μελέτες ως τώρα ήταν αρνητικές, αλλά το κινητό τηλέφωνο εξακολουθεί να προβληματίζει λόγω της ευρείας χρήσης του. Επαγγελματική έκθεση Δεν έχει γίνει σαφής σύνδεση των όγκων εγκεφάλου με ύποπτα καρκινογόνα στους χώρους εργασίας. Ωστόσο, η χρήση παρασιτοκτόνων και συγκεκριμένων αγροτικών προιόντων φαίνεται να σχετίζεται με τους όγκους εγκεφάλου, χωρίς όμως στατιστικά σημαντική συσχετιση. Τρόπος ζωής Ο ρόλος της διατροφής και ιδιαίτερα οι καρκινογόνες επιδράσεις των νιτρωδών συστατικών στον εγκέφαλο έχουν μελετηθεί. Οι παιδιατρικοί όγκοι εγκεφάλου θα μπορούσαν να οφείλονται σε προγεννητική ή μεταγεννητική έκθεση σε αυτά. Επίσης, είναι πιθανό η περιγεννητική έκθεση ή η έκθεση στην πρώιμη παιδική ηλικία να σχετίζεται με την ανάπτυξη όγκων εγκεφάλου στους ενήλικες, αλλά πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με την αλληλεπίδραση αυτή. Περίπου οι μισές από τις περιπτώσεις έκθεσης στα νιτρώδη συστατικά προέρχονται από ενδογενείς πεπτικές διαδικασίες. Ωστόσο, εξωγενείς πηγές όπως το κάπνισμα ή τα καλλυντικά ίσως επίσης να συμβάλουν στην έκθεση. Η άφθονη κατανάλωση φρούτων και λαχανικών που εμποδίζουν την ενδογενή παραγωγή νιτρωδών συστατικών, αλλά και η λήψη βιταμινών στη διάρκεια της κύησης ίσως να προστατεύουν από την ανάπτυξη γλοιωμάτων και άλλων όγκων εγκεφάλου. Στις μέχρι τώρα μελέτες δεν έχει υπάρξει συσχέτιση του καπνίσματος με τους όγκους εγκεφάλου. Ωστόσο, κάποιες μελέτες έχουν δείξει μικρή συσχέτιση με το κάπνισμα άφιλτρων τσιγάρων. Επίσης, φαίνεται πως η κατανάλωση κρασιού σχετίζεται με μειωμένη πιθανότητα για ανάπτυξη γλοιώματος. Ιατρικό ιστορικό και χρήση φαρμάκων Το σοβαρό τραύμα κεφαλής έχει ενοχοποιηθεί σαν πιθανή αιτία κάποιων τύπων όγκων εγκεφάλου, κυρίως μηνιγγιωμάτων και ακουστικών νευρινωμάτων, αλλά όχι 34

35 γλοιωμάτων. Επίσης, αυξημένη πιθανότητα ανάπτυξης όγκων εγκεφάλου πιθανόν να έχουν άτομα με ιστορικό επιληπτικών κρίσεων. Ωστόσο, η αιτιολογική συσχέτιση είναι δύσκολο να γίνει γιατί ήταν δύσκολο να προσδιορισθεί αν οι κρίσεις οφείλονταν στον όγκο ή αν ο όγκος οφειλόταν στις κρίσεις ή στα φάρμακα που χρησιμοποιούνταν για να τις ελέγξουν. Τα διουρητικά και τα αντιϊσταμινικά έχουν συσχετισθεί χωρίς στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα με την αυξημένη πιθανότητα για ανάπτυξη μηνιγγιωμάτων, αλλά δεν έχει υπάρξει καμιά συσχέτιση με τα γλοιώματα. Λοιμώδεις παράγοντες και ανοσολογική απόκριση Με εξαίρεση τις μελέτες για τα λεμφώματα εγκεφάλου που σχετίζονται με HIV, ελάχιστες επιδημιολογικές μελέτες έχουν διερευνήσει τον πιθανό ρόλο των ιών στις κακοήθειες του εγκεφάλου. Μελέτες έχουν συσχετίσει το Toxoplasma gondii με τα μηνιγγιώματα, ενώ άλλες δεν έχουν βρει πιθανή συσχέτιση.επίσης, σύμφωνα με κάποιες μελέτες, άτομα με έρπητα ζωστήρα και αλλεργίες αναπτύσσουν λιγότερο συχνά όγκους εγκεφάλου. Περισσότερες μελέτες όμως πρέπει να γίνουν για να υπάρξει σαφής συσχέτιση μεταξύ των όγκων εγκεφάλου και κοινών λοιμώξεων και αλλεργιών. Ορμονικοί υποδοχείς Τα μηνιγγιώματα, φαίνεται πως αποκτούν μια ποικιλία υποδοχέων στη διάρκεια της ογκογένεσης και οι καλύτερα επιβεβαιωμένοι είναι οι υποδοχείς προγεστερόνης. Αυτή η σχέση μεταξύ των μηνιγγιωμάτων και της έκφρασης ορμονο-υποδοχέων έχει χρησιμοποιηθεί για να εξηγήσει την επικράτηση των όγκων αυτών στις γυναίκες, με αναλογία 2:1 στον εγκέφαλο και 10:1 στη σπονδυλική στήλη. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Η συμπτωματολογία των ασθενών με όγκο εγκεφάλου έχει άμεση σχέση με την αύξηση της ενδοκράνιας πίεσης. Το συχνότερο σύμπτωμα σε αυτές τις περιπτώσεις 35

36 είναι η κεφαλαλγία. Η κεφαλαλγία αυτή μπορεί να συνοδεύεται από ναυτία και/ή εμέτους και ενίοτε και από διαταραχές στην όραση. Ένα άλλο σύμπτωμα με το οποίο μπορεί να πρωτοεκδηλωθεί ένας όγκος του εγκεφάλου είναι η εμφάνιση επιληπτικής κρίσης/σπασμών, σε άτομο χωρίς ιστορικό επιληψίας. Από την άλλη μεριά, σήμερα εξαιτίας της ραγδαίας εξέλιξης, που σημειώνεται στο χώρο της επιστήμης και της τεχνολογίας, είναι όλο και περισσότερες οι περιπτώσεις, στις οποίες η ανακάλυψη της παρουσίας ενός όγκου του εγκεφάλου, αποτελεί τυχαίο εύρημα, στο πλαίσιο διερεύνησης κάποιου άλλου προβλήματος. Πολύ σημαντικό ρόλο στην κλινική εκδήλωση των όγκων του εγκεφάλου παίζει η εντόπιση. Πιο συγκεκριμένα, όγκοι που εντοπίζονται στο μετωπιαίο λοβό, εκδηλώνονται συνήθως με διαταραχές συμπεριφοράς και ψυχισμού, μεταβολές στην προσωπικότητα, καθώς και διαταραχές βάδισης-αστάθεια, ούρησης και λόγου, κυρίως όσον αφορά στην έκφραση του λόγου. Βλάβες που εντοπίζονται στο βρεγματικό λοβό, χαρακτηρίζονται κυρίως από διαταραχές αισθητικότητας με ή χωρίς συνοδές κινητικές διαταραχές, και διαφόρων τύπων αγνωσίες, όπως σωματοαγνωσία, νοσοαγνωσία ή στερεοαγνωσία. Όγκοι που εδράζουν στον κροταφικό λοβό, εκδηλώνονται με διαταραχές της αντίληψης, κατανόησης του λόγου, καθώς και διαταραχές στην όραση. Οι εξεργασίες-μάζες αυτές εμφανίζονται συνήθως, για πρώτη φορά, με επιληπτική κρίση, αν και δυνητικά οποιαδήποτε βλάβη του εγκεφάλου, ανεξαρτήτως εντόπισης, μπορεί να πυροδοτήσει μία επιληπτική κρίση. Ο ινιακός λοβός, είναι υπεύθυνος για την όραση. Έτσι, οι βλάβες του εκδηλώνονται με οποιασδήποτε μορφής διαταραχές στην όραση και άλλοτε άλλου βαθμού ελλείμματα του οπτικού μας πεδίου. Η παρεγκεφαλίδα ουσιαστικά αποτελεί το ανώτατο συντονιστικό κέντρο της κίνησης του ανθρώπινου οργανισμού. Βλάβες στην παρεγκεφαλίδα προκαλούν αστάθεια, διαταραχές βάδισης, τρόμο, δυσαρθρία, δηλαδή δυσκολία στην άρθρωση και δυσδιαδοχοκινησία, δηλαδή αδυναμία συντονισμού των κινήσεων, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις εντοπισμού τελικού στόχου (Buzdar and Freedman, 2007). 36

37 ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΟΓΚΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Η βασική θεραπεία για τους όγκους εγκεφάλου είναι η χειρουργική εκτομή, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις προτείνονται και η ακτινοθεραπεία και οι χημειοθεραπείες. Τα κακοήθη γλοιώματα είναι σχετικά ανθεκτικά στην ακτινοβολία σε σχέση με πολλούς άλλους όγκους. Είναι σαφές πως οι όγκοι εγκεφάλου έχουν εκτεταμένες περιοχές, όπου τα καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε μη φυσιολογικά επίπεδα οξυγόνου. Η υποξία είναι γνωστό πως έχει αρνητική επίπτωση στο αποτέλεσμα της ακτινοθεραπείας, αφού τα υποξικά κύτταρα είναι ανθεκτικά στην ακτινοβολία. Τα γλοιώματα υψηλής κακοήθειας τείνουν να είναι ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία και σπάνια επιτυγχάνεται μακροπρόθεσμος έλεγχος του όγκου. Ωστόσο, η χημειοθεραπεία επιμηκύνει την επιβίωση για μερικούς τύπους όγκων εγκεφάλου, όπως τα ολιγοδενδρογλοιώματα και πρωτοπαθείς νευροεξωδερμικούς όγκους (μυελοβλάστωμα), ενώ χρησιμοποείται σπάνια και σε μη εξαιρέσιμα μηνιγγιώματα (Buzdar and Freedman, 2007). 37

38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ 90 (Hsp90) ΚΑΙ ΥΠΟΞΙΑ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΣΟΚ Όλοι οι οργανισμοί όταν βρίσκονται υπό συνθήκες στρες, όπως σε θερμικά ερεθίσματα, αφυδάτωση, παρουσία βαρέων μετάλλων, μολύνσεις από παθογόνους μικροοργανισμούς, αναπτύσσουν μηχανισμούς προσαρμογής, Ένας ιδιαίτερα μελετημένος μηχανισμός προσαρμογής είναι αυτός που επάγεται από το θερμικό σοκ (heat shock). Όλοι οι οργανισμοί, όταν βρεθούν σε περιβάλλον όπου τα επίπεδα της θερμοκρασίας δεν είναι τα επιτρεπτά για την επιβίωσή τους, αναπτύσσουν μηχανισμούς θερμοανθεκτικότητας. Ένας τέτοιος μηχανισμός είναι η συσσώρευση μιας ομάδας πρωτεϊνών που ονομάζονται θερμοεπαγώμενες πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες θερμικού σοκ (Heat shock proteins, Hsps). Οι Hsps ανευρίσκονται σε όλους τους οργανισμούς από τα βακτήρια έως τον άνθρωπο. Οι Hsps συμβάλλουν με δυο τρόπους στην αντιμετώπιση του σοκ. Πρώτον, μερικές από αυτές είτε διαθέτουν πρωτεολυτική ικανότητα είτε εμπλέκονται στη διαδικασία της πρωτεόλυσης, προάγοντας την αποικοδόμηση μη φυσιολογικών πρωτεϊνών. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι πολλές από αυτές έχουν την ικανότητα να επιδιορθώνουν μετουσιωμένες πρωτεΐνες μετά από την εφαρμογή κάποιας μορφής σοκ, όπως φαίνεται στην εικόνα 5. Δεύτερον, οι HSPs λειτουργούν και ως μοριακοί συνοδοί, προάγοντας τη σωστή αναδίπλωση των πρωτεϊνών και παρεμποδίζοντας την κατακρήμνιση τους (Parsell and Lindquist, 1993). 38

39 Εικόνα 5. Ο ρόλος των πρωτεΐνών θερμικού σoκ. Η θερμοκρασία αλλά και οι βλαβερές ουσίες οδηγούν στη μετουσίωση πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τη λανθασμένη αναδίπλωση τους. Από τη στιγμή που οι πρωτεΐνες χάσουν την τριτοταγή τους δομή, χάνουν και τη λειτουργικότητά τους. Όταν οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες ανιχθευθούν από το κύτταρο, ξεκινά η παραγωγή των θερμοεπαγώμενων πρωτεϊνών, οι οποίες δρούν ως μοριακοί συνοδοί και βοηθούν στην σωστή αναδίπλωση των μετουσιωμένων πρωτεϊνών ώστε να είναι και πάλι λειτουργικές. Πηγή: Sittler, A., et al. Geldanamycin activates a heat shock response and inhibits huntingtin aggregation in a cell culture model of Huntington s disease. Human Molecular Genetics Jun 1; 10(12): Η σύνθεση των πρωτεϊνών θερμικού σοκ, έχει ως συνέπεια οι οργανισμοί να αποκτούν αντοχή και να επάγουν τη θερμοανθεκτικότητα, ώστε να προστατεύονται από τις απαγορευτικές για την επιβίωσή τους θερμοκρασίες εξισορροπώντας την ομοιόσταση των κυττάρων. Ωστόσο, οι Hsps δεν εκφράζονται μόνο όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε θερμικό σοκ, αλλά και σε κύτταρα τα οποία δεν βρίσκονται υπό την επίδραση κάποιας περιβαλλοντικής πιέσεως ( Hendrick and Hartl, 1993). Γενικά, η αποτροπή της δημιουργίας λανθασμένων τριτοταγών πολυπεπτιδικών δομών απαιτεί την παρουσία ειδικών πρωτεϊνικών συμπλόκων, που ονομάζονται 39

40 τσαπερόνες ή μοριακοί συνοδοί (chaperones). Ως μοριακός συνοδός, χαρακτηρίζεται μια πρωτεΐνη, η οποία συνδέεται και σταθεροποιεί μια πρωτεΐνη που διαφορετικά θα ήταν ασταθής ( Liang and MacRae, 1997). Οι μοριακοί συνοδοί αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες-στόχους τους και συμβάλλουν στη σωστή αναδίπλωση πρωτεϊνών, προκειμένου να αποκτήσουν την τριτοταγή διαμόρφωση, που τις καθιστά λειτουργικές στη μεταφορά πρωτεϊνών δια μέσω μεμβρανών σε συγκεκριμένα οργανίδια του κυττάρου, στην αποικοδόμηση ορισμένων πρωτεϊνών και στην ορθή αναδίπλωση των πρωτεϊνών που έχουν μετουσιωθεί λόγω συνθηκών στρες π.χ. θερμικό σόκ. Οι δύο τύποι μοριακών συνοδών που έχουν εκτενώς μελετηθεί είναι: α)οι Hsp70 μοριακοί συνοδοί που εμπλέκονται σε μια ποικιλία διαδικασιών του κυττάρου όπως στη σωστή αναδίπλωση και συναρμολόγηση των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών, στον έλεγχο πρωτεϊνών που φέρουν λάθος στην αναδίπλωση, αλλά και πολυπεπτιδίων που έχουν δημιουργήσει συσσωματώματα, καθώς και στη μετακίνηση πρωτεϊνών δια μέσω μεμβρανών. Η δράση των Hsp70 βασίζεται στην ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με υδρόφοβες πρωτεϊνικές περιοχές και απαιτείται η παρουσία/υδρόλυση του ATP (Mayer and Bukau, 1999), β) το σύστημα των Hsp60 ή τσαπερονίνες. Οι τσαπερονίνες είναι μια ομάδα μοριακών συνοδών οι οποίοι απαντώνται στους προκαρυωτικούς οργανισμούς και στα μιτοχόνδρια και πλαστίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών (Hendrick and Hartl, 1993). Επιπροσθέτως, οι Hsp90 πρωτείνες αποτελούν ένα ακόμη σημαντικό σύστημα μοριακού συνοδού. Χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα πρωτεΐνες οι οποίες λειτουργούν ως μεταγραφικοί παράγοντες, όπως είναι οι υποδοχείς στεροειδών ορμονών και οι πρωτεϊνικές κινάσες. Η προτίμηση αυτή σε υπόστρωμα, είναι και ο παράγοντας που τις διαφοροποιεί από τις υπόλοιπες ομάδες μοριακών συνοδών. Ο βασικός ρόλος της Hsp90 πρωτείνης, είναι η συμμετοχή της στη σωστή αναδίπλωση πρωτεϊνών και σε συστήματα μεταγωγής σημάτων καθώς και ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου. Για τη δράση της, είναι αναγκαία η παρουσία/υδρόλυση του ATP (Wayne et al., 2011). 40

41 Οικογένεια των Hsp90 πρωτεϊνών Απαντώνται σε αφθονία τόσο στους ευκαρυωτικούς όσο και στους προκαρυωτικούς οργανισμούς και υπο φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης, αντιστοιχούν περίπου στο 1-2% της συνολικής πρωτεΐνης των κυττάρων. Ο βασικός ρόλος των Hsp90 πρωτεϊνών υπό φυσιολογικές συνθήκες είναι να υποβοηθούν στην ορθή αναδίπλωση πολυπεπτιδίων (Frydman J, 2001), αλλά επίσης εικάζεται ότι εμπλέκονται στη μεταφορά σήματος, στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και στην αποδόμηση πρωτεϊνών (Richter and Buchner, 2001). Αντίθετα με τoυς άλλους μοριακούς συνοδούς, χαρακτηρίζεται από υψηλό ποσοστό εξειδίκευσης ως προς τις πρωτεΐνες-στόχους. Μέχρι τώρα, έχει βρεθεί ότι αποτελούν υπόστρωμα, οι υποδοχείς προγεστερόνης, γλυκοκορτικοειδών, οιστρογόνων, ανδρογόνων και μεταλλοκορτικοειδών. Όσον αφορά τις κινάσες-υποστρώματα αυτές είναι η V-SRC, η Weel, ο elf-2a, η Casein kinase 2, η RAF-1, η Gcn2 και η Calcineurin (Buchner J, 1999). Το καλύτερα μελετημένο υπόστρωμα είναι οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών (Steroid Hormone Receptors, SHRs). Σε αντίθεση με άλλες πρωτεΐνες-υποδοχείς, οι SHRs αποτελούν ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, οι οποίες κινούνται παλινδρομικά μεταξύ του κυτταροπλάσματος και του πύρηνα. Οι Hsp90, συνδέονται εξειδικευμένα με τα SHRs, απουσία της ορμόνης, και τα διατηρούν σε μια διαμόρφωση με μεγάλη συγγένεια για την τελευταία. Η παρουσία των ορμονών προκαλεί την αποσύνδεση του συστήματος Hsp90- SHR, τον διμερισμό του υποδοχέα επιτρέποντας έτσι τη σύνδεσή του με συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA αλλά και τη ρύθμιση της μεταγραφής. Οι Hsp90 καθιστούν τους υποδοχείς ανενεργούς, χωρίς να είναι ικανοί να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή, γι αυτό το λόγο πιστεύεται ότι λειτουργούν ως καταστολείς, σε αυτή την περίπτωση (Buchner J, 1999). Έχει δειχθεί ότι οι Hsp90 πρωτείνες, αποτελούν μέρος ενός μηχανισμού πολυμοριακών συνοδών μαζί με τις Hsp70 και τη συνεργασία βοηθών-μοριακών συνοδών. Οι βοηθοί-μοριακοί συνοδοί ή αλλιώς πρωτεΐνες-συνέταιροι (Hsp90 41

42 partner proteins), περιλαμβάνουν τις εξής πρωτεΐνες: Hip (Hsp70 πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης), Hop (Hsp70/Hsp90 πρωτεΐνη οργάνωσης), p23 και Hsp40 ( ομόλογα της DnaJ), ανοσοφιλική FKBP51 και FKBP52 και η p50 (Cdc37), η οποία έχει ανιχνευθεί μόνο σε συστήματα με υποστρώμα κινάσες (Zhang et al., 2002). Η συνεργασία αυτή οδηγεί στην δημιουργία ενός συστήματος, το CCH (Cytoplasmic Chaperone Heterocomplex). Η Hsp90 μαζί με τουλάχιστον έξι πρωτεΐνεςσυνέταιρους συνδέονται στον υποδοχέα ορμονών. Η αλλαγή στη διαμόρφωση που υφίσταται το σύστημα είναι αναγκαία για την μετέπειτα σύνδεση της ορμόνης στον υποδοχέα. Μετά τη σύνδεση του υποκαταστάτη και την αποσύνδεση του συστήματος CCH, το ενεργοποιήμενο πλέον σύστημα ορμόνη-υποδοχέας λειτουργεί ως μεταγραφικός παράγοντας. Σε περίπτωση απουσίας του υποκαταστάτη, οι υποδοχείς συνδέονται με τη Hsp70 και ξεκινούν έναν καινούριο κύκλο (Zhang et al., 2002). Γενικά, η Hsp90 μαζί με τις πρωτείνες-συναιτέρους, παίζουν βασικό ρόλο στον κυτταρικό κύκλο, στην ανάπτυξη και την απόπτωση. Η αναστολή της δράσης της Hsp90, οδηγεί σε αποδόμηση αυτών των πρωτεινών μέσω του μοναπατιού ουβικουιτίνης πρωτεασώματος. Αυτή η διαδικασία οδηγεί με τη σειρά της στην παύση της ανάπτυξης και στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων (Neckers L, 2007). Hsp90 και καρκίνος H δομή μιας πρωτείνης καθορίζει το ρόλο της και είναι σημαντικό για τις πρωτείνες να διατηρήσουν τη δομή τους, για να φέρουν σε πέρας το ρόλο τους. Αυτές οι λειτουργίες επιτυγχάνονται από μοριακούς συνοδούς που διευκολύνουν την αναδίπλωση των πρωτεινών, συνδεόμενοι σε αυτές και ρυθμίζοντας την τριτοταγή τους δομή (Prodromou et al., 2000). Όπως ήδη αναφέρθηκε, η Hsp90 παίζει κομβικό ρόλο στη δομική ωρίμανση πολλών πρωτεινών-προιόντων ογκογονιδίων, όπως οι HER-2/ErbB2, Akt, Raf-1, Bcr-Abl και η μεταλλαγμένη p53. Η Hsp90 αλληλεπιδρά με αυτές τις πρωτείνες-πελάτες (client proteins) για να σχηματίσει ένα σύμπλεγμα 42

43 πολλαπλών μοριακών συνοδών (Kamal et al., 2003). Έχει βρεθεί πως η Hsp90 υπερεκφράζεται σε όγκους μαστού, πνεύμονα, λευχαιμίες, στη νόσο Hodgkin (Ghobrial et al., 2005), καθώς και στα Β κύτταρα των non-hodgkin λεμφωμάτων. Ο καρκίνος μαστού με αυξημένη έκφραση των Hsp90 και Hsp70 σχετίζεται με φτωχή πρόγνωση (Yano et al., 1996). Επιπλέον, η μεταγραφή της Hsp90 ενεργοποιείται άμεσα από το c-myc (myelocytomatosis cellular proto-oncogene) σε πολλούς όγκους και φαίνεται πως η Hsp90 έχει ρόλο στη διευκόλυνση εμφάνισης πολυμορφισμών και μεταλλάξεων που υποστηρίζουν την εξέλιξη ανθεκτικών κλώνων (Kamal et al., 2003). Στην εικόνα 6 συνοψίζονται οι κύριες λειτουργίες της HSP90 σε σχέση με τον καρκίνο. Απευαισθητοποίηση σε σήματα ανασταλτικά της αύξησης Αγγειογένεση Ενισχυμένη ανταπόκριση στα αυξητικά σήματα Hsp90 Αποφυγή της απόπτωσης Απεριόριστο δυναμικό πολλαπλασιασμού Αυξημένη διεισδυτικότητα στους ιστούς και μεταστάσεις Εικόνα 6 Λειτουργίες της Hsp90 και σχέση με τον καρκίνο. Πηγή : Neckers L, Heat shock protein 90: the cancer chaperone, J Biosci 32: ,

44 Hsp90 και όγκοι εγκεφάλου Η έκφραση της Hsp90 έχει παρατηρηθεί σε υψηλά επίπεδα σε αστροκυτταρικούς όγκους (Shervington et al 2008, Kato et al 1995). Σε μελέτες όπως σε αυτή των Shervington και συν. (2008), δεν ανιχνεύθηκε HSP90 στο φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό και τα 8 γλοιώματα που μελετήθηκαν, παρουσίασαν έκφραση της Hsp90.Ο Kato και οι συνεργάτες του (1995), έδειξαν την παρουσία Hsp90 σε μηνιγγιώματα, αστροκυττώματα, μυελοβλαστώματα, ενώ στα ολιγοδενδρογλοιώματα δεν υπήρξε χρώση. Ο Hauser και οι συνεργάτες του (2006), ανίχνευσαν τη Hsp90 σε υψηλό ποσοστό των μυελοβλαστωμάτων και η παρουσία της συσχετίσθηκε με κακή πρόγνωση, λόγω παρουσίας υψηλού ποσοστού ErbB2 υποδοχέων, οι οποίοι προστατεύονται από την αποδόμηση μέσω της Hsp90 (Gilbertson et al., 1995). Ο ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΗΙF-1α ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΗΙF-1α Για να διατηρήσουν την ομοιόσταση του οξυγόνου, οι ανώτεροι ευκαρυωτικοί οργανισμοί, έχουν υιοθετήσει ειδικούς μηχανισμούς για τη βελτίωση της πρόσληψης και κατανομής του oξυγόνου. Έτσι, οξυγονο-εξαρτώμενα σηματοδοτικά μονοπάτια, εμφανίζονται σχεδόν σε κάθε κύτταρο στα θηλαστικά (Bruick RK, 2003) και έχει βρεθεί πως ο μεταγραφικός παράγοντας Ηypoxic Factor-1 (HIF-1) έχει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική και συστηματική ομοιοστασία του οξυγόνου (Semenza GL, 2000). Ο HIF-1 επάγει τη μεταγραφή περισσότερων των 60 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των VEGF και ερυθροποιητίνης. Αυτές οι πρωτείνες αυξάνουν τη διαθεσιμότητα οξυγόνου με προαγωγή της ερυθροποίησης και της 44

45 αγγειογένεσης (Semenza GL, 2003). Ο HIF-1 υφίσταται αλλαγές διαμόρφωσης σε απάντηση στις διαφορετικές συγκεντρώσεις του οξυγόνου στο αίμα (Bruick and McKnight, 2001) και έχει βρεθεί πως αποτελείται από τις α και β υπομονάδες (Wang and Semenza, 1993). Η έκφραση των α υπομονάδων είναι ιδιαίτερα υψηλή στην υποξία και διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα στα περισσότερα κύτταρα κάτω από συνθήκες φυσιολογικής οξυγόνωσης. Αντίθετα, η β υπομονάδα εκφράζεται συνεχώς και η δραστηριότητά της ρυθμίζεται με έναν οξυγονο-ανεξάρτητο τρόπο (Wang and Semenza, 1993). Ρύθμιση του HIF-1α από τα επίπεδα οξυγόνου Ο HIF-1α, υποβάλλεται σε ταχεία αποδόμηση, παρουσία οξυγόνου, μέσω του πρωτεασώματος της ουβικουϊτίνης, διαδικασία που επάγεται από τη pvhl, ενώ η υποξία μπλοκάρει την αποδόμηση, οδηγώντας σε συσσώρευση του HIF-1α (Kallio et al., 1997). Η σχέση του HIF-1α με τη pvhl, ενεργοποιείται από την υδροξυλίωση υπολείμματος προλίνης από προλυλυδροξυλάσες (PHDs). O HIF-1α περιέχει 2 περιοχές υδροξυλίωσης, την Pro 402 και Pro 564 στην ODD περιοχή. Η υδροξυλίωση, καθιστά την ODD περιοχή αναγνωρίσιμη από τη pvhl, που αποτελεί τμήμα του πρωτεινικού συμπλέγματος ουβικουιτίνης-λιγάσης και οδηγεί σε αποδόμηση της HIF-1α (Hon et al., 2002), όπως φαίνεται χαρακτηριστικά στην εικόνα 7. 45

46 Εικόνα 7 Ο μοριακός μηχανισμός της σταθεροποίησης του HIF-1α. Α. BHLH, basic Helix-Loop-Helix; ODDD, οξυγονοεξαρτώμενη περιοχή αποδόμησης; PAS, Per- ARNT-Sim περιοχή; TAD, περιοχή μεταγραφής. Oι P402 και P564 αντιπροσωπεύουν τη θέση των υπολειμμάτων προλίνης που υδροξυλιώνονται παρουσία οξυγόνου. Το N803, αντιπροσωπεύει τη θέση του υπολείμματος ασπαραγίνης, η υδροξυλίωση της οποίας παρουσία οξυγόνου, σχετίζεται με τη σύνδεση στο p300/cbp. Β. Παρουσία οξυγόνου, οι διοξυγενάσες EGLN και FIH καταλύουν την υδροξυλίωση των υπολειμμάτων Pro402/Pro564 και Asn803 του HIF-1a αντιστοίχως. Η υδροξυλίωση των προλινών, επιτρέπει τη σύνδεση της pvhl, η οποία, αποτελώντας μέρος του συμπλέγματος E3-ουβικουιτίνης λιγάσης, στοχεύει στην αποδόμηση του HIF. Από την άλλη, η υδροξυλίωση της Asn803 εμποδίζει τη σύνδεση του p300/cbp στο CTAD, αναστέλλοντας τη μεταγραφική του δραστηριότητα. Σε συνθήκες υποξίας, η καταλυτική δραστηριότητα των EGLNs (PHDs) και FIH περιορίζεται και ο HIF-1α διαφεύγει της αποδόμησής του και συγκεντρώνεται στον πυρήνα του κυττάρου, όπου σχηματίζει σύμπλεγμα με την ARNT και το p300/cbp, οδηγώντας στην έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων-στόχων. Πηγή: HIF-1a (Mouse). Camenisch G et al, The Transctiption Factor, Genome Biol.13(3):R24,

47 Οι PHDs εξαρτώνται από το οξυγόνο για να λειτουργήσουν και έτσι, η υπομονάδα α υδροξυλιώνεται μόνο παρουσία οξυγόνου. Σε χαμηλά επίπεδα οξυγόνου, η ODD περιοχή δεν υδροξυλιώνεται, η pvhl δε συνδέεται και ο HIF-1α σταθεροποιείται και μετακινείται στον πυρήνα μέσω ενός σήματος στο C-τελικό άκρο, όπως φαίνεται στην εικόνα 8. Εικόνα 8 Οξυγονοεξαρτώμενη ρύθμιση της δραστηριότητας του HIF. Παρουσία οξυγόνου, οι ενεργοποιημένες PHDs και FIH οδηγούν στην απενεργοποίηση του HIF και επομένως, στην ανστολή της μεταγραφικής του δραστηριότητας. Στην υποξία, τα ένζυμα PHD και FIH απενεργοποιούνται και η αναστολή υδροξυλίωσης οδηγεί στη σταθεροποίηση του HIF-α και σε ενεργό C-TAD, το οποίο συνδέεται στο συν-ενεργοποιητή p300/cbp και στο HIF-1β. Πηγή: Marti HH, Erythropoietin and the hypoxic brain, J Exp Biol., 207(18): , Η αλληλεπίδραση των PHDs και pvhl με το HIF-1α, ρυθμίζεται επίσης από μια ακετυλ-τρανσφεράση, την ARD1. Η ακετυλίωση του K532 μέσα στην περιοχή ODD του HIF-alpha από την ARD1 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με τη pvhl (Marti HH, 2004). 47

48 Στο C-TAD, βρίσκεται μια άλλη περιοχή για την οξυγονοεξαρτώμενη ρύθμιση της α υπομονάδας. Πρόκειται για ένα ασπαραγινυλικό υπόλειμμα, που υδροξυλιώνεται, παρουσία οξυγόνου, από μια ασπαραγινυλική υδροξυλάση, τη FIH-1. Αυτό το ένζυμο έχει τις ίδιες απαιτήσεις υποστρώματος με τις PHDs και όταν ενεργοποιείται, εμπλέκεται στη σύνδεση των συμπαραγόντων CBP/p300 στο μεταγραφικό σύμπλοκο του HIF, αναστέλλοντας έτσι τη μεταγραφική του δραστηριότητα. Επιπλέον, η FIH-1 αλληλεπιδρά με τη pvhl και επιστρατεύει αποακετυλάσες ιστόνης στο σύμπλοκο, καταστέλλοντας σε ακόμα μεγαλύτερο βαθμό τη μεταγραφική δραστηριότητα του HIF (Marti HH, 2004). Η σταθεροποίηση και η μεταγραφική δραστηριότητα του HIF, ρυθμίζεται επίσης από τη φωσφoρυλίωση. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι κυτταροειδικοί και περιλαμβάνουν κινάσες, είτε της οδού phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt, είτε μέλη της οικογένειας mitogen-activated protein kinase (MAPK)/Erk. Περιοχές φωσφορυλίωσης HIF-1α έχουν αναγνωρισθεί και η ενεργοποίησή τους διευκολύνει την αλληλεπίδραση με τους CBP/p300. Το αν η φωσφορυλίωση των Akt και Erk επάγεται από υποξία, εξαρτάται από το είδος του κυττάρου (Minet et al., 2001). Η ενεργοποίηση του HIF-1α, είναι μια πολύ γρήγορη διαδικασία, αφού η σταθεροποίηση και η ενεργοποίησή του, συμβαίνουν μέσα σε ελάχιστα λεπτά μετά την έκθεση σε υποξία (Jewell et al., 2001). O HIF μπορεί να ενεργοποιηθεί in vitro, παρουσία οξυγόνου, με αναστολή της λειτουργίας των PHDs χρησιμοποιώντας μέταλλα όπως το κοβάλτιο, εμποδίζοντας έτσι την αποδόμηση της α υπομονάδας. Αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι ο HIF μπορεί να ενεργοποιηθεί παρουσία οξυγόνου και in vivo. Εφτά διαφορετικά ερεθίσματα έχουν προταθεί ως αίτια ενεργοποίησης του HIF παρουσία οξυγόνου, συμπεριλαμβανομένων αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών, ογκογονιδίων, μηχανικού stress και του νιτρικού οξέος (Dery et al., 2005). Οι αυξητικοί παράγοντες, φαίνεται πως αυξάνουν την πρωτεινική σύνθεση και τη μεταγραφική δραστηριότητα του HIF. Ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι πλήρως διασαφηνισμένος, αλλά πιθανόν εμπλέκονται οι οδοί μεταγωγής σήματος PI3K/Akt και MAPK/Erk, δρώντας ως επαγωγείς της μετάφρασης του HIF και αυξάνοντας τη 48

49 μεταγραφική του δραστηριότητα με φωσφορυλίωση. Επίσης, υπάρχουν μελέτες που δείχνουν πως ογκογονίδια όπως τα v-src και Ras επάγουν την ενεργοποίηση HIF με αναστολή της υδροξυλίωσης του HIF-1α (Chan et al., 2002). Λαμβάνοντας υπόψη τα πολλαπλά βήματα της οξυγονοεξαρτώμενης ρύθμισης του HIF, αντιλαμβανόμαστε ότι η ενεργοποίηση του HIF παρουσία οξυγόνου, είναι μια αδύναμη διαδικασία, αλλά ακόμα και έτσι, μπορεί να επιφέρει σημαντικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα, απορυθμίζοντας τη σηματοδότηση αυξητικών παραγόντων. Λειτουργίες HIF-1α και γονίδια-στόχοι Στη διάρκεια της εμβρυικής ανάπτυξης στα ποντίκια, ο HIF-1α εκφράζεται στην καρδιά, στα νεφρά, στο θύμο αδένα. Επίσης, mrna του HIF-1α έχει εντοπιστεί σε ιστούς ενηλίκων σε ανθρώπους και ποντίκια (Wiener et al., 1996). Πλέον, έχει αναγνωριστεί ένας μεγάλος αριθμός από γονίδια-στόχους του HIF-1α που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, γλυκόλυση, κυτταρική μετανάστευση, επιβίωση και απόπτωση. Ο HIF-1α είναι ο κύριος ρυθμιστής των γλυκολυτικών ενζύμων και φαίνεται πως παίζει σημαντικό ρόλο στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Sowter et al., 2003). Συνοπτικά οι λειτουργίες του HIF παρουσιάζονται στην εικόνα 9. 49

50 Εικόνα 9 Λειτουργίες του HIF (Hägg, 2008) HIF-1α και καρκίνος Οι υποξικοί όγκοι γενικά τείνουν να είναι πιο επιθετικοί και ανθεκτικοί σε θεραπεία. Αυτό, μπορεί εν μέρει να αποδοθεί στη δράση τoυ HIF (Ryan et al., 2000).Έχει μελετηθεί η συμμετοχή πολλών γονιδίων-στόχων τoυ HIF στην εξέλιξη του όγκου και από πολλές πλευρές, o HIF και τα ογκογονίδια αλληλεπικαλύπτονται. Για παράδειγμα, το ογκοκατασταλτικό γονίδιο PTEN, ρυθμίζει αρνητικά τη δραστηριότητα του HIF-1α με αναστολή σηματοδότησης της οδού PI3K. Η απώλεια του PTEN, επάγει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση στα κύτταρα των γλοιοβλαστωμάτων και η έκφραση των οποίων επάγεται επίσης από το HIF-1α (Zundel et al., 2000). Η υπερενεργοποίηση του HIF σε όγκους, μπορεί να οφείλεται στο υποξικό περιβάλλον του όγκου ή σε γενετικές μεταλλάξεις που διεγείρουν τη σταθεροποίηση του HIF, όπως η ενεργοποίηση ογκογονιδίων, η αυξημένη σηματοδότηση αυξητικών παραγόντων ή η απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως στη νόσο VHL (Ryan et al., 2000). 50

51 O HIF έχει αποδειχθεί πως έχει ρόλο στο νεφρικό καρκίνωμα. Η νόσος von Hippel- Lindau προκαλείται από μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο της pvhl και χαρακτηρίζεται από ανάπτυξη όγκων σε ΚΝΣ και στο νεφρό. Λόγω της απενεργοποιημένης pvhl, ο HIF είναι μόνιμα ενεργοποιημένος και οι όγκοι αυτοί παρουσιάζουν υψηλή αγγειοβρίθρεια (Kondo and Kaelin, 2001). Λόγω της δυνατότητας επαγωγής της αγγειογένεσης, της διεισδυτικότητας και της κυτταρικής επιβίωσης στους όγκους, ο HIF έχει προταθεί ως θεραπευτικός στόχος. HIF-1α και όγκοι εγκεφάλου Στη βιβλιογραφία, αναφέρεται η υπερέκφραση του HIF-1α και των γονιδίων-στόχων του σε διάφορους όγκους εγκεφάλου, όπως το αναπλαστικό αστροκύττωμα, το γλοιοβλάστωμα, το ολιγοδενδρογλοίωμα (Birner et al. 2001, Khatua et al. 2003, Søndergaard et al. 2003). Στα αστροκυττώματα, η έκφρασή του φαίνεται πως περιορίζεται μόνο στα υψηλής κακοήθειας, ενώ στους χαμηλής κακοήθειας αστροκυτταρικούς όγκους, η έκφρασή του είναι ελάχιστη ή μηδενική (Giannopoulou et al., 2006). Στο γλοιοβλάστωμα, τα καρκινικά κύτταρα γύρω από τις νεκρωτικές περιοχές, εκφράζουν υψηλά επίπεδα ρυθμιστών αγγειογένεσης επαγόμενων από την υποξία, όπως ο VEGF (Shweiki et al., 1992). Στο μυελοβλάστωμα, παρατηρείται υπερέκφραση του HIF-1α σε πυρήνα και κυτταρόπλασμα (Luo J, 2011). Στη μελέτη του Kaynar και των συνεργατών του (2008), που ερεύνησαν την έκφραση HIF-1α σε γλοιοβλαστώματα και σε μηνιγγιώματα, βρέθηκαν υψηλά επίπεδα της πρωτείνης και στους δύο τύπους όγκων, αλλά φαίνεται πως η ενεργοποίησή της επιτυγχάνεται με διαφορετικούς μηχανισμούς (Zagzag et al., 2000). Ο HIF-1α για να ενεργοποιηθεί, προϋποθέτει κυτταρική υποξία, με αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη επιθετικότητα του όγκου και τη δυνατότητα χρήσης του HIF-1α ως προγνωστικού δείκτη (Zagzag et al. 2006, Zagzag et al. 2008). 51

52 Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ VHL (pvhl) Το γονίδιο VHL βρίσκεται στη θέση 3p25 και σε μετάλλαξή του οφείλεται η νόσος Von Hippel Lindau, ένα αυτοσωμικό επικρατές γενετικό νόσημα, που οδηγεί σε διαφορετικά είδη καρκίνων (ή καλοήθεις όγκους) του εγκεφάλου (συχνότερα αιμαγγειοβλάστωμα), του οφθαλμού (αμφιβληστροειδής χιτώνας), νωτιαίου μυελού, νεφρών, παγκρέατος και άλλων οργάνων (Lonser et al, 2003). To γονίδιο VHL είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο σύμφωνα με την υπόθεση των δύο χτυπημάτων Knudson (Knudson AG, 1971): για ένα φυσιολογικό κύτταρο, η απενεργοποίηση και των δύο αντιγράφων του γονιδίου VHL είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη καρκίνου. Σε φορείς κληρονομικής μετάλλαξης του VHL, οι όγκοι τείνουν να εκδηλώνονται σε νεαρότερη ηλικία. Το γονιδιακό προιόν, η πρωτείνη VHL (pvhl), είναι τμήμα του συμπλέγματος Ε3 ουβικουιτίνης λιγάσης που ουβικουιτινοποιεί τον HIF-1α, oδηγώντας σε γρήγορη αποδόμηση. Το σύμπλεγμα αυτό, αποτελείται και από ορισμένες άλλες πρωτείνεςτην cullin2, elongin B, elongin C, NEDD8 και Rbx1. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, σε συνθήκες υποξίας, ο HIF-1α δεν υδροξυλιώνεται και αδυνατεί να συνδεθεί στη pvhl, με αποτέλεσμα τη σταθεροπoίησή του και την ενεργοποίησή του. Ωστόσο, η pvhl παίζει ρόλο και σε HIF-ανεξάρτητα μονοπάτια. Εμπλέκεται στη σταθερότητα των μικροσωληνίσκων, στην εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας, στην κυτταρική επιβίωση και απόπτωση και ιδιαίτερα στη στη νευρωνική απόπτωση (Sufan et al., 2004). Η pvhl εκφράζεται ευρέως στους ανθρώπινους ιστούς. Εκφράζεται ακόμα και σε όργανα που δεν έχουν σχέση με τη νόσο VHL (όπως στην υπόφυση, στο θυρεοειδή και στο κόλον), υποδεικνύοντας έναν ευρύτερο ρόλο της. Έχει βρεθεί ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις (αθηρωματικές περιοχές, μεταστάσεις όγκων, φλεγμονές), εκφράζουν ισχυρά τη pvhl, σε αντίθεση με τα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα (Sakashita et al., 1999). 52

53 Σε ανθρώπινα έμβρυα, έκφραση της pvhl εντοπίζεται στο ΚΝΣ, στα νεφρά στους όρχεις και στον πνεύμονα (Richards et al., 1996). Η ενδοκυττάρια εντόπιση της pvhl σχετίζεται με τη φάση του κυτταρικού κύκλου (Lee et al., 1999). Λειτουργίες της pvhl pvhl και μεταγραφή Με βάση in vitro μελέτες, ετέθη η υπόθεση πως η pvhl παίζει ρόλο στη φάση της επιμήκυνσης στη μεταγραφή (Duan, 1995), η οποία μεσολαβείται από την RNA polymerase II. Όταν στο κύτταρο είναι παρούσα η φυσιολογική pvhl, η πρόσδεσή της στις Elongins C και B (VCB complex), οδηγεί στη στάση της RNA polymerase σε αρκετές περιοχές ενός γονιδίου στη διάρκεια της μεταγραφής. Αποτυχία σύνδεσης της pvhl στις Elongins C and B, μπορεί να καταλήξει σε διαταραχή των μηχανισμών ελέγχου της επιμήκυνσης της μεταγραφής και σε αυξημένη μεταγραφή ορισμένων γονιδίων. Η σχέση της pvhl με τη ρύθμιση της επιμήκυνσης της μεταγραφής έχει αποδειχθεί και in vivo σε κύτταρα φαιοχρωμοκυττώματος (Kroll et al., 1999). pvhl και ουβικουιτινοποίηση Στο σύμπλεγμα VCB (Stebbins et al., 1999) η Elongin C συνδέεται με τις Elongin B και pvhl σε δύο διαφορετικά σημεία πρόσδεσης, ενώ οι Elongin B και pvhl δεν αλληλεπιδρούν. Tο σύπλεγμα VCB συνδέεται με τη Cul2 (εικόνα 10). Εικόνα 10 Το σύμπλεγμα VCB Πηγή: Kaelin WG Jr, Molecular basis of the VHL hereditary cancer syndrome, Nat Rev Cancer, 2(9): ,

54 Πιθανά υποστρώματα ουβικουιτινοποίησης από το σύμπλεγμα VCB, περιλαμβάνουν πρωτείνες που ρυθμίζουν τη σtαθερότητα παραγόντων επαγόμενων από υποξία, όπως: VEGF, PDGF-b, GLUT-1 και HIF-1α. Στους ασθενείς με νόσο VHL και το αιμαγγειοβλάστωμα και το νεφρικό καρκίνωμα, δείχνουν μεγάλη αγγειοβρίθρεια, κάτι που υποδεικνύει, πως η απενεργοποίηση του γονιδίου VHL, επάγει είτε την αύξηση έκφρασης αγγειογενετικών παραγόντων είτε τη μείωση έκφρασης αναστολέων της αγγειογένεσης (Los et al., 1997). Στο νεφρικό καρκίνωμα, με απώλεια λειτουργικής pvhl, έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα VEGF σε συνθήκες υποξίας, αλλά και φυσιολογικού οξυγόνου (Iliopoulos et al., 1996). Αυτό σημαίνει πως τα κύτταρα με απώλεια pvhl λειτουργούν σαν να στερούνται οξυγόνο, είτε αυτό συμβαίνει στην πραγματικότητα είτε όχι. Άρα, η αγγειοβριθής φύση των νεοπλασμάτων που σχετίζονται με VHL, μπορεί να οφείλεται εν μέρει, σε απορύθμιση έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με υποξία. Η pvhl συνδέεται με δύο μεταγραφικούς παράγοντες, τον HIF-1α και τον HIF-2α και οδηγεί στην αποδόμησή τους. Αυτές οι πρωτείνες είναι μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων παραγόντων σχετικών με την υποξία, όπως ο VEGF. Όπως ήδη αναφέρθηκε, ο HIF-1α αποδομείται ταχέως από το πρωτεάσωμα παρουσία οξυγόνου, αλλά σταθεροποείται με υποξία (Kallio et al., 1997). Σύμφωνα με το Maxwell και τους συνεργάτες του (1999), η αγγειοβρίθρεια των όγκων που σχετίζονται με τη νόσο VHL, σχετίζεται με την ενεργοποίηση του HIF. Αλληλεπίδραση με τη φιμπρονεκτίνη Η φιμπρονεκτίνη είναι εξωκυττάρια πρωτείνη που δεσμεύεται με μεμβρανικούς υποδοχείς. Τα καρκινικά κύτταρα παράγουν χαρακτηριστικά χαμηλά επίπεδα φιμπρονεκτίνης. Μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η αλληλεπίδραση της pvhl με τη φιμπρονεκτίνη πιθανόν σχετίζεται με την ογκοκατασταλτική της δραστηριότητα (Ohh et al., 1998). Αλληλεπίδραση με διάφορους παράγοντες ανεξάρτητα από την υποξία Η pvhl ρυθμίζει τα επίπεδα παραγόντων ανεξάρτητα από συνθήκες υποξίας, με πιο χαρακτηριστικούς: τον GLUT1, τον TGF-α, τον PDGFb και τις καρβονικές ανυδράσες (CA 9 και 12). 54

55 Επιπλέον, έχουν βρεθεί άλλες πρωτείνες που σχετίζονται με την pvhl, χωρίς όμως αυτή η συσχέτιση να έχει σημαντικές λειτουργικές συνέπειες. Σε αυτές περιλαμβάνονται: η VHL binding protein 1 (VBP-1)281, ο μεταγραφικός παράγοντας Sp1282, και η πρωτεϊνική κινάση C (PKC) (Sufan et al., 2004). ΣXEΣΗ ΤΩΝ Hsp90, HIF-1α ΚΑΙ pvhl Σύμφωνα με τη μελέτη των McClellan AJ και συν. (2005), η ΗSP90, συμμετέχει στην αποδόμηση της pvhl, αν και δεν είναι μέρος του συμπλέγματος των συνοδών μορίων που συμμετέχουν στην αναδίπλωσή της. Από την άλλη, η pvhl είναι απαραίτητητη για την αποδόμηση του HIF-1α (Iwai et al. 1999, Lisztwan et al., 1999). Επίσης, μελέτες δείχνουν τη σχέση Hsp90 και HIF-1α, με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση του μορίου HIF-1α (Gradin et al., 1996) και πως η διαταραχή της σχέσης Hsp90/HIF-1α επάγει την αποδόμηση του HIF-1α με τρόπο ανεξάρτητο από το οξυγόνο και τη pvhl (Isaacs et al., 2002). Συγκεκριμένα, στη μελέτη του Isaacs και των συνεργατών του (2002), χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα από νεφρικό καρκίνωμα, στα οποία απουσιάζει το λειτουργικό γονίδιο VHL, ενώ εκφράζουν σταθερά επίπεδα HIF-1α, παρουσία οξυγόνου. Μετά από καλλιέργεια με γελδαμυκίνη (Hsp90 ανταγωνιστής), παρατηρήθηκε ικανοποιητική ουβικουιτινοποίηση και αποδόμηση του HIF-1α μέσω πρωτεασώματος, παρουσία και απουσία οξυγόνου. Στα ίδια πειράματα, προκλήθηκαν σημειακές μεταλλάξεις του HIF-1α με στόχο τον αποκλεισμό της αλληλεπίδρασης με τη pvhl, αλλά ο HIF-1α, εξακολούθησε να υφίσταται αποδόμηση μέσω της γελδαμυκίνης. Επίσης, οι ανταγωνιστές της Hsp90, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης, αναστέλλουν τη μεταγραφική δραστηριότητα του HIF-1α και μειώνουν τα επίπεδα του mrna του VEGF, καθώς και την αγγειογενετική δραστηριότητα. 55

56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΥΠΟΞΙΑ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Ο ρόλος του VEGF Η συνεχής παροχή οξυγόνου είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων. Στα θηλαστικά, η ανάγκη για ένα λειτουργικό κυκλοφορικό σύστημα εμφανίζεται νωρίς στο αναπτυσσόμενο έμβρυο. Στον άνθρωπο, όλες σχεδόν οι βασικές αιτίες θανάτου περιλαμβάνουν μεταβολές στην αγγείωση των ιστών και την παροχή οξυγόνου. Η υποξία είναι η κινητήριος δύναμη για την αγγειογένεση, που αποτελεί μηχανισμό κατά της ιστικής ισχαιμίας (Boutin et al., 2008). H νεοαγγειογένεση, πραγματοποιείται κατά την εμβρυϊκή ζωή. Όμως, από μελέτες φαίνεται ότι νεοαγγειογένεση επιτελείται και σε ενήλικα άτομα, σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, με υπεύθυνο τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF), ο οποίος επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευσή πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων μυελού των οστών (Asahara et al., 1999). Τα μέλη της οικογένειας του VEGF είναι οι: VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD και ο αυξητικός παράγων του πλακούντα PlGF (Achen and Stacker, 1998). Η αγγειογένεση που ενεργοποείται από υποξία, διαμεσολαβείται κυρίως από το VEGF μέσω ενεργοποίησης του HIF (Bruick and McKnight, 2001). Λόγω της υποξίας που παρατηρείται στα κύτταρα των κακοήθων όγκων, ουσιαστικά όλοι οι όγκοι εκφράζουν υψηλά επίπεδα του VEGF, με αποτέλεσμα τη νεοαγγείωση και την αυξημένη διηθητικότητα του όγκου και τις μεταστάσεις. H αγγειογένεση περιλαμβάνει γεγονότα, όπως ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, μετανάστευση και πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, ωρίμανση και σταθεροποίηση του νέου αγγείου με επιστράτευση περικυττάρων και λείων μυϊκών κυττάρων (Tirziu and Simons, 2005). 56

57 Η παραγωγή αγγειογενετικών παραγόντων από τα καρκινικά κύτταρα είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη συμπαγών όγκων. Με μελέτες υβριδισμού in situ έχει αποδειχθεί η αύξηση της έκφρασης του mrna του VEGF σε πολλά είδη καρκίνου στον άνθρωπο, όπως μαστού, πνεύμονα (Ferrara et al., 2005), ωοθηκών (Spannuth et al., 2009), γλοιωμάτων του νευρικού συστήματος (Machein and Plate, 2000), παγκρέατος (Wey et al., 2005), μελανώματος (Geng et al., 2001), ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (Chiang et al., 2009), καρκινώματος του παχέος εντέρου (Jubb et al., 2003), γαστρικού καρκινώματος (Wang et al., 2007). Σε πολλούς όγκους, τα καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στην περιφέρεια του όγκου, όπου δεν υπάρχει υποξία, παράγουν αυξημένες ποσότητες VEGF. Σε αυτές τις περιπτώσεις, φαίνεται ότι η έκφραση του mrna του VEGF επάγεται από ενεργοποιημένα ογκογονίδια που ενεργοποιούνται στο μονοπάτι Ras (Neufeld et al., 1999) ή από απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών μορίων, όπως π.χ. p53 και θρομβοσπονδίνης-1 (Hanahan and Weinberg, 2000). Παρόλο που τα καρκινικά κύτταρα παρουσιάζονται ως η κύρια πηγή του VEGF, το στρώμα που σχετίζεται με τον όγκο ίσως να αποτελεί άλλο ένα σημαντικό σημείο παραγωγής VEGF, χωρίς αυτό να έχει ακόμη διαλευκανθεί (Ferrara N, 2001). Σε διαφορετικούς τύπους νεοπλασμάτων και σε διαφορετικά στάδια της νόσου είναι πιθανό να διαφέρουν οι μηχανισμοί της αγγειογένεσης, καθώς κάποιοι ερευνητές θεωρούν ότι ο VEGF μπορεί να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο μόνο κατά τα αρχικά στάδια της νόσου (Ferrara N., 2001). Αυτό επισημαίνει την αναγκαιότητα της περαιτέρω διερεύνησης των αγγειογενετικών μηχανισμών σε ξεχωριστά στάδια της νεοπλασίας. Η αγγειογένεση τα τελευταία χρόνια έχει αναγνωρισθεί ως καθοριστικής σημασίας παράγοντας στους μηχανισμούς διηθητικής επέκτασης και υποστροφής των κακοήθων όγκων, με σαφή προγνωστική αξία στον καθορισμό της βιολογικής συμπεριφοράς όχι μόνο του πρωτοπαθούς όγκου αλλά και των μεταστάσεών του (Dvorak et al, 1999). 57

58 Αγγειογένεση και όγκοι εγκεφάλου Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, ο VEGF υπερεκφράζεται στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (Plate et al., 1992). Στα χαμηλής κακοήθειας αστροκυττώματα, ο VEGF εκφράζεται σε μερικά μόνο κύτταρα, ενώ στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εκφράζεται σε αυξημένα επίπεδα και κυρίως γύρω από νεκρωτικές περιοχές. Ο VEGF υπερεκφράζεται επίσης στα ολιγοδενδρογλοιώματα, στα μικτά ολιγοαστροκυττώματα και στα μυελοβλαστώματα, οδηγώντας στον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Abdulrauf et al, 1998). Επίσης, η υποξία στα μηνιγγιώματα επάγει την ενεργοποίηση παραγωγής VEGF και μάλιστα τα επίπεδα έκφρασής του σχετίζονται με το βαθμό του οιδήματος γύρω από τον όγκο (Lopes MB, 2003). Στα γλοιώματα έχει βρεθεί και η έκφραση άλλων αγειογενετικών παραγόντων, όπως ο HGF/SC και ο bfgf (Oehring et al., 1999). Η αγγειοποιητίνη 1 (Ang-1), εκφράζεται και στα χαμηλής και στα υψηλής κακοήθειας γλοιώματα, σε αντίθεση με την αγγειοποιητίνη 2 (Ang-2), που εκφράζεται αποκλειστικά στα υψηλής κακοήθειας γλοιώματα και φαίνεται πως δρα συμπληρωματικά με τους VEGF και VEGFR-2 (Lopes MB, 2003). Υποδοχείς του VEGF (VEGFRs) Ο VEGF διεγείρει τα ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω τριών υποδοχέων του, με το μηχανισμό κινάσης της τυροσίνης (RTKs): του VEGFR-1 γνωστού και ως Flt-1 (fms-like tyrosin kinase-1), του VEGFR-2 γνωστού και ως KDR/Flk-1 (kinase insert domain-containing receptor/fetal liver kinase-1), του VEGFR-3 γνωστού και ως Flt-4 (fms-like tyrosin kinase-4). 58

59 Επιπλέον, ο VEGF συνδέεται και με άλλα μόρια της κυτταρικής μεμβράνης που αλληλεπιδρούν με υποδοχείς του και δρουν ως συν-υποδοχείς. Οι VEGFR-1 και VEGFR-2 παρουσιάζουν δομικές και λειτουργικές ομοιότητες με την οικογένεια των υποδοχέων των PDGFs και όπως και οι άλλοι υποδοχείς κινάσης τυροσίνης, οι VEGFRs διμερίζονται και υφίστανται αυτοφωσφορυλίωση όταν ο VEGF προσδεθεί σε αυτούς (Ferrara N, 2001). Ο VEGFR-3 είναι μία πρωτείνη μεγέθους 195 kda με υψηλή συγγένεια για τον VEGF-C και VEGF-D. Σε αντίθεση με τους VEGFR-1 και VEGFR-2, κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, υφίσταται πρωτεόλυση στην 5 η εξωκυττάρια περιοχή ομολογίας με την ανοσοσφαιρίνη, από όπου προκύπτουν δύο υπομονάδες, μία 120 kda και μία 75 kda. Οι δύο αυτές υπομονάδες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Έχουν απομονωθεί δύο ισομορφές του υποδοχέα που προέρχονται από εναλλακτικό μάτισμα. Η διαφορά εντοπίζεται στο μήκος των κυτταροπλασματικών τους περιοχών και πιθανώς στις σηματοδοτικές οδούς στα οποία εμπλέκονται (Borg et al., 1995). H μεταγωγή σήματος μέσω του VEGFR-3 παραμένει ανεξερεύνητη. Πέντε θέσεις φωσφορυλίωσης της τυροσίνης έχουν αναγνωριστεί στην καρβοξυτελική ουρά (Υ1230, Υ1231, Υ1265, Υ1337 και Υ1363). Απ όλες αυτές, η Υ1337 είναι γνωστό ότι δεσμεύεται με τις Shc και Grb2, ενεργοποιώντας το μονοπάτι των MAPK. Φαίνεται ότι είναι απαραίτητη η σηματοδότηση διαμέσου και των δύο υποδοχέων, VEGFR-2 και VEGFR-3, για τη μετανάστευση και πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων των λεμφαγγείων (ΛΕΚ) (Goldman et al., 2007). Η απώλεια του γονιδίου του VEGFR-3 έχει ως αποτέλεσμα την ανώμαλη αναδιαμόρφωση του πρωτογενούς αγγειακού πλέγματος και καρδιαγγειακή ανεπάρκεια, οδηγώντας σε εμβρυικό θάνατο. Ως εκ τούτου, ο πρώιμος εμβρυικός ρόλος του VEGFR-3 σχετίζεται με την ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος, καθώς εκφράζεται στο φλεβικό και λεμφαγγειακό ενδοθήλιο (Liersch and Detmar, 2007). Αργότερα, στο ενήλικο άτομο, η έκφραση του VEGFR-3 περιορίζεται στο λεμφικό ενδοθήλιο (Oliver and Detmar, 2002), όπως επίσης και σε κάποια ενεργοποιημένα μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα (Hamrah et al., 2003). Η 59

60 σηματοδότηση δια μέσω του VEGFR-3 απαιτείται για το σχηματισμό της λεμφαγγειακής κυκλοφορίας, καθώς η λεμφαγγειογένεση μπορεί να ανασταλεί, χρησιμοποιώντας μία διαλυτή μορφή VEGFR-3 (Makinen et al., 2001). O VEGFR- 3 εκφράζεται επίσης από αγγεία όγκων (Jussila and Alitalo, 2002). VEGFR-3 και καρκίνος Όπως ήδη αναφέρθηκε, στην εμβρυική ζωή, ο VEGFR-3 εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων και των αιμοφóρων αγγείων, ενώ στην ενήλικη ζωή η έκφρασή του περιορίζεται στο ενδοθήλιο των λεμφαγγείων. Παραταύτα σε παθολογικές καταστάσεις óπως στην επούλωση τραύματος και στον καρκίνο, ο VEGFR-3 ανιχνεύεται επίσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφóρων αγγείων (Tammela al, 2008). Πρóσφατες μελέτες υποδεικνύουν óτι ο VEGFR-3 εκφράζεται σε νεοπλάσματα στον άνθρωπο óπως καρκίνος του μαστού, προστατικóς καρκίνος, γλοιώματα (Yang et al. 2006, Grau et al. 2007, van Iterson et al. 2007). Σε πειραματικά μοντέλα óγκων, οι παραγóμενοι VEGF-C/VEGF-D απó τα κύτταρα του óγκου φάνηκε πως επάγουν την ανάπτυξη των λεμφικών τριχοειδών και τη διαστολή των αποχετευτικών περί τον óγκο λεμφαγγείων, διευκολύνοντας έτσι τη λεμφική μετάσταση (He et al., 2005). Η αγγειογένεση στον καρκίνο προάγεται απó πολλαπλά μονοπάτια που περιλαμβάνουν την έκφραση προαγγειογενετικών παραγóντων óπως ο VEGF και πιθανά μείωση της έκφρασης αναστολέων της αγγειογένεσης (Kerbel and Folkman, 2002). Πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν την άποψη πως οι VEGF-C/ VEGF-D και οι υποδοχείς τους συνεισφέρουν στην αγγειογένεση και στην ανάπτυξη τουλάχιστον κάποιων óγκων (Laakkonen et al., 2007). 60

61 VEGFR-3 και όγκοι εγκεφάλου Σε μελέτες έχει αποδειχθεί η παρουσία του VEGFR3 στα γλοιοβλαστώματα και έχει συσχετισθεί με τη φλεγμονή γύρω απ τον όγκο (Jenny et al., 2006). Eπίσης, σύμφωνα με μελέτες, ο VEGFR-3 στα γλοιώματα συσχετίζεται με το grade του όγκου, παρουσιάζοντας υψηλά επίπεδα έκφρασης στα γλοιοβλαστώματα και μέτρια επίπεδα έκφρασης στα χαμηλής κακοήθειας γλοιώματα (Grau et al., 2007). Γενικά, τα βιβλιογραφικά δεδομένα που συσχετίζουν το VEGFR-3 με τους όγκους εγκεφάλου είναι περιορισμένα, σε αντίθεση με το VEGFR-2, ο οποίος έχει μελετηθεί αρκετά. Σχέση Hsp90 και VEGFR-3 Η μελέτη της Sanderson και των συνεργατών της (2006), αναδεικνύει τις επιδράσεις των ανταγωνιστών της Hsp90 στην έκφραση των πρωτεινών-συνεταίρων (client proteins) της Hsp90 σε κυτταρικές λειτουργίες βασικές για την καρκινική αγγειογένεση. Η γελδαμυκίνη (αναστολέας της Hsp90), βρέθηκε πως αναστέλλει την έκφραση του VEGF-A από τα καρκινικά κύτταρα και απoκλείει τα σήματα πολλαπλασιασμού από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η 17-AAG επιπλέον, μειώνει σημαντικά τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, τη διηθητικότητα και την έκκριση upa (urokinase-type plasminogen activator), καθώς και την έκφραση των VEGFR-1, VEGFR-2, και VEGFR-3. 61

62 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 62

63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1.Υλικό Εξετάσθηκαν συνολικά 89 óγκοι εγκεφάλου. Για τους όγκους αυτούς έχει γίνει ιστολογική διάγνωση με χρήση της χρώσης αιματοξυλίνη ηωσίνη και η κατανομή τους στις διάφορες βαθμίδες διαφοροποίησης με βάση τα διαγνωστικά κριτήρια του συστήματος ταξινόμησης WHO. Πιο αναλυτικά, οι όγκοι που μελετήθηκαν, κατηγοριοποιούνται ως εξής : -Πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα (grade I): 3 περιστατικά (ηλικίας 2-12 ετών) -Διάχυτα αστροκυττώματα (grade II): 4 περιστατικά (ηλικίας ετών) -Αναπλαστικά αστροκυττώματα (grade IΙΙ): 4 περιστατικά (ηλικία 2,5-25 ετών) -Πολύμορφα γλοιοβλαστώματα (gradeiv): 22 περιστατικά (ηλικία 2,5-25 ετών) -Ολιγοδενδρογλοιώματα : 4 περιστατικά (ηλικία ετών) -Επενδυμώματα:4 περιστατικά (ηλικία ετών) -Μυελοβλαστώματα : 9 περιστατικά (ηλικία 3-31 ετών) -Μηνιγγιώματα : 38 περιστατικά (ηλικία ετών) Επιπλέον, έγινε διαχωρισμός ανάλογα με την ηλικία των ασθενών: οι ασθενείς με ηλικία μικρότερη των 19 ετών αποτέλεσαν την ομάδα των παιδιατρικών όγκων, ενώ οι ασθενείς με ηλικία μεγαλύτερη των 19 ετών, αποτέλεσαν την ομάδα όγκων των ενηλίκων (Fangusaro J, 2012). Οι παιδιατρικοί όγκοι που μελετήθηκαν περιλάμβαναν τρία πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα, δύο διάχυτα αστροκυττώματα, ένα αναπλαστικό αστροκύττωμα δύο πολύμορφα γλοιοβαλστώματα και έξι μυελοβλαστώματα. Τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων συνοψίζονται στους πίνακες 5 και 6. Επιπλέον, στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν τομές ιστού φυσιολογικού ιστού εγκεφαλικών ημισφαιρίων και παρεγκεφαλίδας. 63

64 Το υλικό των νεοπλασμάτων και του φυσιολογικού ιστού που χρησιμοποιήθηκε, ήταν εγκλεισμένο σε blocks παραφίνης. Από κάθε περιστατικό χρησιμοποιήθηκε ένας αντιπροσωπευτικός κύβος παραφίνης και τομές πάχους 4 5 μm τοποθετήθηκαν με τη χρήση μικροτόμου σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Οι óγκοι εγκεφάλου καθώς και οι τομές ιστού των φυσιολογικών εγκεφάλων που χρησιμοποιήθηκαν, προέρχονται απó το Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Νοσοσκομείου Πατρών. Πίνακας 5 Όγκοι των ενηλίκων της μελέτης της μελέτης Πίνακας 6 Παιδιατρικοί όγκοι Όγκοι ενηλίκων Αριθμός Παιδιατρικοί όγκοι Αριθμός ασθενών ασθενών Συνολικός αριθμός 75 Άντρες 39 Γυναίκες 36 Εύρος ηλικιών Ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά Αστροκυτταρικοί όγκοι 26 Grade I 0 Grade II 3 Grade III 2 Grade IV 21 Ολιγοδενδρογλοιώματα 4 Επενδυμώματα 4 Μυελοβλαστώματα 3 Μηνιγγιώματα 38 Συνολικός αριθμός 14 Άντρες 10 Γυναίκες 4 Εύρος ηλικιών 2,5-19 Ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά Αστροκυτταρικοί 8 όγκοι Grade I 3 Grade II 1 Grade III 2 Grade IV 2 Μυελοβλαστώματα 6 64

65 2.Αντισώματα-Μέθοδος Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην πειραματική διαδικασία φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 7). Πίνακας 7 Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Ανάδειξη αντιγόνου Κάλυψη πρωτεινικών θέσεων Πρωτογενές αντίσωμα Αραί ωση Επώαση Hsp90 Φούρνος μικροκυμμάτων 800watt x2min TBS-BSA Cell Signaling Rabbit mab 1/200 Ολονύχτια επώαση 300watt x7min pvhl Φούρνος μικροκυμμάτων 800watt x2min 300watt x7min TBS-BSA Acris Antibodies GmbH Monoclonal Mouse IgG2 1/100 Ολονύχτια επώαση HIF-1α Πεψίνη TBS-BSA Novus Biologicals Monoclonal 1/30 Ολονύχτια επώαση Mouse IgG2 Invitrogen Φούρνος Rabbit VEGFR- 3 μικροκυμμάτων 800watt x2min TBS-BSA Polyclonal anti-vegf 1/ min σε θερμ. δωματίου 300watt x7min receptor/cterm 65

66 Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη είναι η ανοσοϊστοχημική μέθοδος. Η πειραματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ανατομικής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος ανήκει στις μορφολογικές τεχνικές προσδιορισμού και εφαρμόζεται σήμερα πολύ συχνά στην εργαστηριακή και κλινικοεργαστηριακή έρευνα. Η μελέτη πραγματοποιείται σε τομές ιστού. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου σε σχέση με τις βιοχημικές και ανοσολογικές τεχνικές, που πραγματοποιούνται σε ομογενοποίημα ή εκχύλισμα ιστού, είναι ότι διατηρούν τη μορφολογία του ιστού. Η ανοσοϊστοχημική τεχνική βασίζεται στη χρησιμοποίηση μονοκλωνικών ή πολυκλωνικών αντισωμάτων που στοχεύουν σε αντιγονικούς επιτόπους της υπό ανίχνευση πρωτεΐνης του ιστού. Η παρουσία ή μη της πρωτεΐνης γίνεται εμφανής με κάποιο σύστημα ανίχνευσης που στηρίζεται στη χρήση φθοριζουσών ή χρωμοφόρων ουσιών. Μπορούμε αδρώς να διακρίνουμε δύο φάσεις στην πειραματική διαδικασία της ανοσοϊστοχημείας: α) Η πρώτη στοχεύει στην προετοιμασία του ιστού, στην ανάδειξη των αντιγονικών θέσεων και στην εξάλειψη του μη ειδικού σήματος ενώ β) η δεύτερη φάση αφορά στην τοποθέτηση του ειδικού αντισώματος και του συστήματος ανίχνευσης. Η προετοιμασία του ιστού περιλαμβάνει την αποπαραφίνωση των τομών (εάν πρόκειται για τομές παραφίνης) και τη σταδιακή ενυδάτωσή τους προκειμένου να εξασφαλισθεί υδατικό περιβάλλον στο εσωτερικό του ιστού, που είναι απαραίτητο στη δεύτερη φάση του πειράματος για την διεξαγωγή των ενζυμικών και ανοσολογικών αντιδράσεων. Η ανάδειξη των αντιγονικών θέσεων (antigen retrieval) έχει ως σκοπό την αποκάλυψη των αντιγονικών επιτόπων της υπό αναζήτηση πρωτεΐνης που πιθανόν έχουν καλυφθεί λόγω των διαδικασιών μονιμοποίησης του ιστού, και γίνεται με διάφορους τρόπους: i) χρήση φούρνου μικροκυμάτων, δηλαδή εμβάπτιση των πλακιδίων σε ειδικό διάλυμα και τοποθέτηση τους στο φούρνο. Η έκθεση του ιστού 66

67 στην ενέργεια των μικροκυμάτων αποσκοπεί στην αποκάλυψη (unmasking) των αντιγονικών επιτόπων. Η μέθοδος αυτή είναι η περισσότερο διαδεδομένη. ii) Θέρμανση των τομών στο υδατόλουτρο σε περιβάλλον κορεσμένο με υδρατμούς και θερμοκρασία o C. Η έκθεση του ιστού σε υψηλή θερμοκρασία, θεωρείται υπεύθυνη για την αντιγονική ανάδειξη. iii) Κατεργασία με ειδικά ένζυμα (π.χ. θρυψίνη). Η διαδικασία αυτή αποβλέπει στην αύξηση της διείσδυσης του αντισώματος στον ιστό. Η εξάλλειψη του μη ειδικού σήματος έχει ως στόχο τη μείωση της μη ειδικής χρώσης (background) και την αύξηση έτσι της ειδικότητας της μεθόδου. Γίνεται σε δύο βήματα. Στο πρώτο καταναλώνουμε την ενδογενή υπεροξειδάση του ιστού με διαλύματα Η 2 Ο 2 εάν το σύστημα ανίχνευσης χρησιμοποιεί το ένζυμο αυτό. Έτσι το σήμα που θα έχουμε στο τέλος της διαδικασίας προέρχεται μόνο από την αντίδραση του ενζύμου του συστήματος ανίχνευσης (ειδικό σήμα). Στο δεύτερο βήμα γίνεται η κάλυψη μη ειδικών αντιγονικών θέσεων (protein blocking). Το αντίσωμα που χρησιμοποιούμε, παρότι συνδέεται με τον αντιγονικό επίτοπο της υπό αναζήτηση πρωτεΐνης με μεγάλη συγγένεια, είναι δυνατόν να συνδεθεί ασθενώς και με άλλους αντιγονικούς επιτόπους. Σε αυτές τις μη ειδικές θέσεις δέσμευσης στοχεύει το protein blocking που γίνεται στο βήμα αυτό χρησιμοποιώντας διαλύματα βόειας αλβουμίνης ή ορό αλόγου ή άλλα πρωτεϊνικά μίγματα που διατίθενται. Τα πρωτεϊνικά μόρια των διαλυμάτων αυτών συνδέονται με τις μη ειδικές θέσεις εμποδίζοντας την πρόσδεση του αντισώματος εκεί. Στη δεύτερη φάση της πειραματικής διαδικασίας, γίνεται η ανάδειξη του ειδικού σήματος. Χρησιμοποιούνται, όπως αναφέρθηκε, πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία συνδέονται με αντιγονικούς επιτόπους της πρωτεΐνης που μελετούμε, με μεγάλη σταθερά σύνδεσης. Τα δύο αυτά είδη των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται, έχουν το καθένα τα δικά του μειονεκτήματα και πλεονεκτήματα. Τα πολυκλωνικά αντισώματα ουσιαστικά είναι μίγμα αντισωμάτων που το καθένα στρέφεται και προς διαφορετικό επίτοπο της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Λόγω της μεγάλης ετερογένειας τους τα πολυκλωνικά αντισώματα παρουσιάζουν αυξημένο ποσοστό μη ειδικής δέσμευσης. Όμως η σύνδεση πολλών αντισωμάτων στην 67

68 πρωτεΐνη-στόχο σε πολλούς και διαφορετικούς επιτόπους οδηγεί σε ενίσχυση του ειδικού σήματος. Η παρασκευή των πολυκλωνικών αντισωμάτων γίνεται με ένεση του πρωτεϊνικού μορίου σε κάποιο ζώο και λαμβάνονται από τον ορό του ζώου. Είναι προφανές ότι το μίγμα αντισωμάτων που λαμβάνουμε ποικίλει ανάλογα με το ζώο που έγινε η ένεση της πρωτεΐνης. Τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι μεταγενέστερα των πολυκλωνικών και είναι ειδικά για έναν μόνο αντιγονικό επίτοπο του πρωτεϊνικού μορίου στόχου. Παρασκευάζονται από καλλιέργειες υβριδικών κυττάρων (λεμφοκύτταρο κυτταρολεμφώματος) και παρουσιάζουν υψηλή ομοιογένεια. Το κύριο πλεονέκτημα τους είναι ότι λόγω ακριβώς της μεγάλης τους ειδικότητας δεν παρουσιάζουν μη ειδική δέσμευση και κατά συνέπεια το μη ειδικό σήμα είναι ελάχιστο. Έχουν όμως το μειονέκτημα της χαμηλότερης ευαισθησίας διότι είναι πιθανόν ο μοναδικός αντιγονικός επίτοπος στον οποίον στοχεύουν ή να καταστραφεί ή να «καλυφθεί» κατά τις διαδικασίες προετοιμασίας του ιστού. Υπάρχουν πολλά συστήματα ανίχνευσης τα οποία στηρίζονται είτε στη χρήση φθορίζουσων ουσιών είτε στη χρήση ενζύμων, όπου το προϊόν της κατάλυσής τους είναι μια χρωμοφόρος ουσία και μπορεί να παρατηρηθεί στο φωτονικό μικροσκόπιο. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα ένζυμα είναι η υπεροξειδάση και η αλκαλική φωσφατάση. Η υπεροξειδάση που χρησιμοποιείται ευρύτερα λειτουργεί προκαλώντας οξείδωση στο υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνη (DAB) και το χρωμοφόρο προϊόν της αντίδρασης είναι αυτό που παρατηρείται στο μικροσκόπιο. Η παρουσία ή μη της υπό μελέτη πρωτεΐνης στην παρούσα εργασία θα γίνει με το σύστημα ενίσχυσης-ανίχνευσης DAKO Envision ΤΜ. Στη συγκεκριμένη τεχνική, το δευτερεύον αντίσωμα είναι συνδεδεμένο σε σύμπλεγμα από μεγαλομόρια δεξτράνης που φέρει μεγάλο αριθμό μορίων ενζύμου.άρα, σε ένα μόριο πρωτεύοντος αντισώματος αντιστοιχούν πολλά μόρια υπεροξειδάσης, με αποτέλεσμα ισχυρότατη αντίδραση παραγωγής έγχρωμου προιόντος. 68

69 Όπως όλες οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται στην εργαστηριακή και κλινικοεργαστηριακή έρευνα, έτσι και η ανοσοϊστοχημεία χαρακτηρίζεται από πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Ορισμένα απ αυτά αναφέρονται παρακάτω. Πλεονεκτήματα ανοσοϊστοχημικών τεχνικών Η μέθοδος της ανοσοϊστοχημείας μας δίνει τη δυνατότητα να εξετάσουμε άμεσα την ετερογένεια του ιστού (π.χ. νεοπλάσματος) τη μορφολογία των κυττάρων, την εντόπιση της ανοσοχρώσης (πυρήνας κυτταρόπλασμα εξωκυττάριος χώρος) και άρα το κυτταρικό διαμέρισμα που εκφράζεται η πρωτεΐνη που μελετούμε. Επιπλέον, μας επιτρέπει να γνωρίζουμε ποιος κυτταρικός πληθυσμός εκφράζει τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη (διάκριση μεταξύ νεοπλασματικών κυττάρων και φυσιολογικών), γεγονός που είναι δύσκολο να το συμπεράνουμε χρησιμοποιώντας βιοχημικές τεχνικές. Μας επιτρέπει επίσης να γνωρίζουμε το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη π.χ. υποδοχέας. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία σε ασθενείς με νεοπλάσματα που λαμβάνουν ορμονική θεραπεία. Στην περίπτωση αυτή ένα νεόπλασμα με χαμηλή κυτταροβρίθεια θα έδινε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα με χρήση βιοχημικών μεθόδων. Η ανοσοϊστοχημεία είναι απλή, γρήγορη, και οικονομική τεχνική και άρα εύκολα εφαρμόσιμη. Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας είναι μόνιμα. Η χρώση μπορεί να διατηρηθεί για χρόνια και να χρησιμοποιηθεί σε αναδρομικές μελέτες αρκεί οι τομές να φυλάσσονται στο σκοτάδι. Επιτρέπει την ποσοτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων ιδίως με τις σύγχρονες τεχνικές ανάλυσης εικόνας. Μειονεκτήματα ανοσοϊστοχημικών τεχνικών Η διαδικασία της μονιμοποίησης είναι δυνατόν να αλλοιώσει τη δομή των πρωτεϊνών και να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα πράγμα που δεν συμβαίνει με τις βιοχημικές μεθόδους. 69

70 Η εκτίμηση της ανοσοχρώσης ενέχει στοιχεία υποκειμενικότητας καθιστώντας την ανοσοϊστοχημεία όχι την καταλληλότερη μέθοδο για ποσοτικούς προσδιορισμούς. Οι πληροφορίες που μας παρέχονται από την τεχνική αυτή αφορούν μόνο το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή που γίνεται η μελέτη ενώ δεν μας πληροφορούν για το ρυθμό έκφρασης. Επιπλέον δεν μας δίνει στοιχεία για τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ούτε για το επίπεδο της ενεργότητας των ένζυμων. Η χρήση του DAB είναι καρκινογόνος. Συμπερασματικά, μπορούμε να πούμε ότι η βελτίωση που διενεργείται στις τεχνικές ανάλυσης εικόνας καθώς και η χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας που επιτρέπει την εντόπιση της ανοσοχρώσης σε επίπεδο υποκυτταρικού διαμερίσματος θα πολλαπλασιάσουν στο εγγύς μέλλον τις χρήσεις της μεθόδου αυτής. Είναι γεγονός όμως ότι για την πολύπλευρη και πληρέστερη κατανόηση των πολύπλοκων βιολογικών φαινομένων απαιτείται η γνώση από την πλευρά του ερευνητή και άλλων τεχνικών εργαστηριακής έρευνας. Αναλυτικά τα στάδια της μεθόδου για την ανίχνευση των πρεωτεϊνών HSP90, pvhl, HIF-1α και VEGFR-3 ήταν τα ακόλουθα: Αποπαραφίνωση των τομών: ολονύχτια τοποθέτηση των τομών σε φούρνο θερμοκρασίας 56 ο C, εμβάπτιση 5 min στη ζεστή ξυλόλη Ι (56 ο C), 5 min στη ζεστή ξυλόλη ΙΙ (56 ο C), 5 min στη ζεστή ξυλόλη ΙΙΙ (56 ο C), και 5 min στην κρύα ξυλόλη (θερμ. δωματίου). Ενυδάτωση των τομών σε κατιούσα συγκέντρωση αλκοολών: Εμβάπτιση των τόμων σε αλκοόλες 100 ο, 96 ο, 80 ο, 70 ο, 5min στην καθεμία, και ξέπλυμα των πλακιδίων με απιονισμένο H 2 O στο τέλος. Ανάδειξη αντιγονικών θέσεων. Κάλυψη των τoμών με διάλυμα κιτρικού Να (10mΜ, pη=6) και τοποθέτηση στο φούρνο μικροκυμάτων (στα 800watt x2min και στα 300watt x7 min). Εν συνεχεία, επάνοδος των τομών σε θερμοκρασία δωματίου και ξέπλυμα με δ/μα TBS για 10 min, δύο φορές. 70

71 Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα Η 2 Ο 2 1% σε απιονισμένο H 2 O για 20 min. Εν συνεχεία ξέπλυμα των τομών με απιονισμένο Η 2 Ο (2 φορές x 10 min) και με διάλυμα TBS (2 φορές x 10 min). Protein blocking. Επικάλυψη των τομών με διάλυμα TBS-BSA 2% για 10 min. Τοποθέτηση του ειδικού αντισώματος για τo κάθε μόριο στην κατάλληλη αραίωση και για τον κατάλληλο χρόνο επώασης (Πίνακας 7). Έκπλυση των τομών με διάλυμα TBS (3 φορές x 10 min) Τοποθέτηση του αντιδραστηρίου Envision (DAKO rabbit, mouse Lot 44771) στο ρόλο του δεύτερου και τρίτου αντισώματος. Ξέπλυμα των τομών με διάλυμα TBS (3 φορές x 10 min) Ανίχνευση των θέσεων δέσμευσης της υπεροξειδάσης με επικάλυψη των τομών με διάλυμα τετραυδροχλωρικής διαμινοβενζίδίνης (DAB) (DAKO K5007) για χρόνο 5 min σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό χώρο. Έκπλυση των τομών με απιονισμένο Η 2 Ο 3 φορές x 5 min. Χρώση αντίθεσης των πυρήνων (counterstaining) με αιματοξυλίνη Harris και ξέπλυμα με τρεχούμενο νερό βρύσης για την απομάκρυνση της περίσσειας. Στιγμιαία εμβάπτιση στην όξινη αλκοόλη και ξέπλυμα με τρεχούμενο H 2 O. Διέλευση των τόμων από διαλύματα αλκοολών συνεχώς αυξανομένης συγκέντρωσης 70 ο, 80 ο, 96 ο, 100 ο. Εμβάπτιση σε ξυλόλη και επικόλληση των καλυπτρίδων. Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν : Διάλυμα Tris: 6,1 gr Tris σε 500 ml H 2 O, ρύθμιση του ph σε 7,6 με πυκνό HCl. Διάλυμα κιτρικού Να + : 2,1 gr κιτρικού Να+ σε 1 lit απιον. H 2 O, ρύθμιση του ph = 6 με π. HCl. Διάλυμα NaCl: 900 ml απιονισμένο H2O + 8,1 gr NaCl. Διάλυμα (Tris Buffer Saline) TBS 5 mm: 900 ml δ/τος NaCl ml δια/τος Tris Διάλυμα TBS/BSA 2%: 5 ml δ/τος TBS + 0,1 gr Bovine Serum Albumin Διάλυμα όξινης αλκοόλης: 105 ml απόλυτης αλκοόλης + 45 ml απιονισμένο H 2 O + 1,5 ml πυκνού HCl Διαλυμα Η 2 Ο 2 30% 71

72 Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσεως Η αξιολόγηση των τομών έγινε στο φωτονικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 1:20 και 1:40. Εκτιμήθηκε η ετερογένεια του νεοπλάσματος, η ένταση και η κατανομή της ανοσοχρώσης, που υποδηλώνει το επίπεδο έκφρασης της αντίστοιχης πρωτείνης, σε ό,τι αφορά το κυτταρικό διαμέρισμα και το είδος του κυττάρου που εμφανίζεται θετικό. Η ένταση της ανοσοχρώσεως αξιολογήθηκε ως ασθενής, μέτρια και ισχυρή (+,++,+++) με βάση τη διαβάθμιση του καφέ χρώματος του προϊόντος της οξείδωσης της DAB από την υπεροξειδάση. Η ακριβής εκτίμηση του ποσοστού των θετικών κυττάρων ανά τομή έγινε ως εξής: Χρησιμοποιώντας τελική μεγέθυνση 400Χ (objective eyepiece), επιλέχθησαν τυχαία 10 μη επικαλυπτόμενα πεδία, όπου ανά πεδίο καταμετρούνταν συνολικά 100 καρκινικά κύτταρα με τη βοήθεια τετραγωνισμένου πλαισίου. Για την εκτίμηση του ποσοστού των ανοσοθετικών κυττάρων σε κάθε αντίσωμα, χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης σήμανσης (Labeling index, LI), που ορίζεται ως το ποσοστό των θετικών (σημασμένων) κυττάρων στο σύνολο των κυττάρων που καταμετρούνται. Εξαιρέθηκαν τα ανοσοθετικά κύτταρα σε αιμοφόρα αγγεία των όγκων. Ο όγκος θεωρήθηκε θετικός για την υπό μελέτη πρωτείνη, όταν ο LI ήταν μεγαλύτερος ή ίσος του Στατιστική Ανάλυση Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SPSS Statistics, version 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Οι συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνών εκτιμήθηκαν με τη χρήση του συντελεστή συσχέτισης Spearman rankorder correlation coefficient. Για τον έλεγχο της πιθανής συσχέτισης μεταξύ των διαφόρων ομάδων των κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων ως προς την έκφραση των μορίων που μελετώνται, οι μεταβλητές αναλύθηκαν με τα τεστ Kruskal-Wallis (για v ανεξάρτητα δείγματα) και Mann Whitney (για 2 ανεξάρτητα δείγματα). Σε όλες τις αναλύσεις που έγιναν θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντικό το p<

73 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συνοπτικά τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στους πίνακες 8-11 και στα σχήματα 1-5. Ακολούθως, παρουσιάζονται αναλυτικά τα αποτελέσματα της μελέτης μας: 1 α. Έκφραση των υπό μελέτη πρωτεϊνών σε τομές φυσιολογικού ιστού Σε τομές φυσιολογικού ιστού εγκεφαλικών ημισφαιρίων παρατηρήθηκαν τα εξής: δεν ανιχνεύθηκε έκφραση της Hsp90 σε κύτταρα γλοίας δεν ανιχνεύθηκε ανοσοχρώση για pvhl ανιχνεύθηκε σε ελάχιστα κύτταρα κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση για HIF-1α δεν ανιχνεύθηκε ανοσοχρώση για VEGFR-3 Σε τομές φυσιολογικού παρεγκεφαλιδικού ιστού, δε σημειώθηκε έκφραση Hsp90, pvhl, HIF-1α, ενώ ανιχνεύθηκε πυρηνική χρώση στον υποδοχέα του VEGFR-3. α β Εικόνα 11 Τομές φυσιολογικού ιστού εγκεφαλικών ημισφαιρίων ανθρώπου. Οι νευρώνες είναι θετικοί και η γλοία αρνητική για Hsp90 (α). Νευρώνες και γλοία είναι αρνητικοί για HIF-1α (β). 73

74 2 α. Έκφραση Hsp90 σε αστροκυτταρικούς όγκους Κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 ανιχνεύθηκε σε 16/34 (47,1%) αστροκυτταρικούς όγκους της μελέτης. Επίσης, σε 4/34 περιστατικά (11,8%) παρατηρήθηκε και πυρηνική χρώση. Δύο από αυτά τα περιστατικά με την πυρηνική χρώση συν-έκφρασαν και τον VEGFR-3 (στα άλλα δύο δεν έγινε διερεύνηση για VEGFR-3). Σε 10/34 αστροκυτταρικούς όγκους, το ενδοθήλιο των αγγείων ήταν έντονα ανοσοθετικό για την Hsp90. Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική σχέση της έκφρασης Hsp90 και του βαθμού διαφοροποίησης του όγκου (grade), καθώς και μεταξύ της έκφρασης της Hsp90, του φύλου και της ηλικίας (p 0,05). Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης Hsp90 και pvhl (p=0,01). Εικόνα 12 Πολύμορφο γλοιοβλάστωμα ενήλικα (βαθμός κακοήθειας IV). Έντονη (+++) κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 σε ατρακτοειδή κύτταρα (υπάρχει και πυρηνική χρώση σε κάποια κύτταρα). Εκφραση της Hsp90 και στο ενδοθήλιο των αγγείων, x β. Έκφραση Hsp90 σε ολιγοδενδρογλοιώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 ανιχνεύθηκε σe 2/4 (50%) των ολιγοδενδρογλοιωμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (p 0,05). 74

75 2 γ. Έκφραση Hsp90 σε επενδυμώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 ανιχνεύθηκε στα 4/4(100%) των επενδυμωμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (p 0,05). 2 δ. Έκφραση Hsp90 σε μυελοβλαστώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 ανιχνεύθηκε σε 5/9 (55,5%) των μυελοβλαστωμάτων της μελέτης. Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης της Hsp90 και του HIF-1α (p=0,026), όπως μπορούμε να δούμε στο σχήμα 7. 2 ε. Έκφραση Hsp90 σε μηνιγγιώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 ανιχνεύθηκε σε 24/36 (66,7%) των μηνιγγιωμάτων. Σε ένα μόνο μηνιγγίωμα παρατηρήθηκαν θετικά αγγεία. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. α Εικόνα 13 Έντονη (+++) κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 σε μηνιγγίωμα, x

76 3 α. Έκφραση pvhl σε αστροκυτταρικούς όγκους Κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl ανιχνεύθηκε σε 17/32 (53,1%) των αστροκυτταρικών όγκων που μελετήθηκαν. Σε 2/32 (6,3%) περιπτώσεις, το ενδοθήλιο των αγγείων ήταν έντονα ανοσοθετικό για τη pvhl. Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης Hsp90 και pvhl (p=0,01), ενώ δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. α β Εικόνα 14 Διάχυτο αστροκύττωμα (βαθμός κακοήθειας ΙΙ) σε ενήλικα, με μέτρια κυτταροπλασματική έκφραση (++) για τη Hsp90 (α) και ασθενή (+) κυτταροπλασματική χρώση για τη pvhl (β), σε διαδοχικές τομές, x β. Έκφραση pvhl σε ολιγοδενδρογλοιώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl ανιχνεύθηκε σε 2/4 (50%) των ολιγοδενδρογλοιωμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. 3 γ. Έκφραση pvhl σε επενδυμώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl ανιχνεύθηκε σε 2/4(50%) των επενδυμωμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την 76

77 έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών πρωτείνες ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. 3 δ. Έκφραση pvhl σε μυελοβλαστώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl ανιχνεύθηκε σε 5/9 (55,5%) των εξετασθέντων μυελοβλαστωμάτων. Σε ένα μυελοβλάστωμα παρατηρήθηκαν θετικά αγγεία. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. 3 ε. Έκφραση pvhl σε μηνιγγιώματα Κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl ανιχνεύθηκε σε 20/36 (55,5%)μηνιγγιώματα. Σε 2/36 (5,6%) μηνιγγιώματα, παρατηρήθηκε θετικότητα στα αγγεία. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. α β Εικόνα 15 Έντονη (+++) κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 (α) και της pvhl (β), σε διαδοχικές τομές μηνιγγιώματος, x

78 4 α. Έκφραση HIF-1α σε αστροκυτταρικούς όγκους Πυρηνική χρώση βρέθηκε σε 17/28 (60,7%) από τους αστροκυτταρικούς όγκους και κυτταροπλασματική χρώση ανιχνεύθηκε σε 2/28 (7,1%) αστροκυτταρικούς όγκους. Στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε με το βαθμό διαφοροποίησης (grade) (p=0,032), αλλά όχι με την ηλικία ή το φύλο. Εικόνα 16 Έντονη (+++) πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση του HIF-1α σε πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, x β. Έκφραση HIF-1α σε ολιγοδενδρογλοιώματα Πυρηνική χρώση βρέθηκε σε 3/4 (75%) από τα εξετασθέντα ολιγοδενδρογλοιώματα και κυτταροπλασματική χρώση ανιχνεύθηκε σε 1/4 (25%) ολιγοδενδρογλοιώματα. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. 78

79 α β γ δ Εικόνα 17 Ισχυρή (+++) κυτταροπλασματική έκφραση της Hsp90 (α), μέτρια (++) κυτταροπλασματική έκφραση της pvhl (β) και έντονη (+++) πυρηνική χρώση και κυτταροπλασματική χρώση του HIF-1α (γ) στο ίδιο ολιγοδενδρογλοίωμα. Σε άλλη θέση στο ίδιο περιστατικό παρατηρείται μέτρια (++) πυρηνική χρώση του HIF-1α (δ), x γ. Έκφραση HIF-1α σε επενδυμώματα Πυρηνική χρώση βρέθηκε σε 2/3(66,7%) από τα επενδυμώματα και κυτταροπλασματική χρώση ανιχνεύθηκε σε 1/3 (33,3%) επενδυμώματα. Δεν 79

80 παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. α β γ Εικόνα 18 Επενδύμωμα, όπου παρατηρείται έντονη (+++) κυτταροπλασματική χρώση για τη Hsp90 (α), τη pvhl (β) και πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση για τον HIF-1α (γ), x

81 4 δ. Έκφραση HIF-1α σε μυελοβλαστώματα Πυρηνική χρώση βρέθηκε σε 4/9 (44,4%) από τα μυελοβλαστώματα. Στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης του Hsp90 και του HIF- 1α (p=0,026). α β Εικόνα 19 Διαδοχικές τομές μυελοβλαστώματος ενήλικα, με έντονη (+++) κυτταροπλασματική χρώση της Hsp90 (α) και μέτρια (++) και σε ορισμένα κύτταρα έντονη (+++) πυρηνική χρώση του HIF-1α (β), x

82 4 ε. Έκφραση HIF-1α σε μηνιγγιώματα Πυρηνική χρώση βρέθηκε σε 13/27 (48,1%) από τα μηνιγγιώματα. Κυτταροπλασματική χρώση μόνο ανιχνεύθηκε σε 3/27 (11,1%), ενώ 1/27 ήταν θετικό για πυρηνική και κυτταροπλάσματική χρώση. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την έκφραση των υπόλοιπων πρωτεϊνών ή με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. α β γ Εικόνα 20 Διαδοχικές τομές μηνιγγιώματος, όπου παρατηρείται έντονη (+++) κυτταροπλασματική χρώση για τη Hsp90 (α), η απουσία χρώσης για τη pvhl (β) και η πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση για το HIF-1α (γ), x

83 6 α. Έκφραση του υποδοχέα VEGFR-3 σε αστροκυτταρικούς όγκους Σε 14/25 (56%) των όγκων ανιχνεύθηκε πυρηνική χρώση, στο ένα παρατηρήθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση και στα 4/25 (16%) τα αγγεία ήταν θετικά (στο κυτταρόπλασμα των ενδοθηλιακών κυττάρων και των λείων μυικών κυττάρων των αγγείων των όγκων). Δεν παρατηρήθηκε συν-έκφραση της Ηsp90 και του VEGFR-3 στο τοίχωμα των αγγείων. Αντίθετα, παρατηρήθηκε συν-έκφραση Hsp90 και πυρηνική έκφραση του VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα, στο 1/3 (33,3%) των διάχυτων αστροκυττωμάτων, σε 12/16 (75%) των πολύμορφων γλοιοβλαστωμάτων και στο 1/3 (33,3) ολιγοδενδρογλοιωμάτων. των Συν-έκφραση HIF-1α και VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα, παρατηρήθηκε σε 2/3 των πιλοκυτταρικών αστροκυττωμάτων (66,6%), σε 1/3 (33,3%) των αναπλαστικών αστροκυττωμάτων, σε 6/13 (46,2%) των πολύμορφων γλοιοβλαστωμάτων και σε 1/3 (33,3%) των ολιγοδενδρογλοιωμάτων. Συν-έκφραση για Hsp90/HIF-1α/VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα βρέθηκε σε 3/12 (25%) των πολύμορφων γλοιοβλαστωμάτων και σε 1/3 (33,3%) των ολιγοδενδρογλοιωμάτων. 6 β. Έκφραση του υποδοχέα VEGFR-3 σε μυελοβλαστώματα Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε σε 6/9 (66,7%) των μυελοβλαστωμάτων. Σε 4/9 (44,4%) περιστατικά, τα αγγεία παρουσίασαν ανοσοθετικότητα, ενώ σε ένα μυελοβλάστωμα παρατηρήθηκε πυρηνική χρώση στα κύτταρα του όγκου και στα αγγεία του. Συν-έκφραση Hsp90 και VEGFR-3 στα καρκινικά κύτταρα βρέθηκε σε 3/9 (33,3%), ενώ σε 4/9 (44,4%) των μυελοβλαστωμάτων, παρατηρήθηκε η συν-έκφραση HIF-1α και VEGFR-3. Συν-έκφραση για Hsp90/HIF-1α/VEGFR-3 βρέθηκε σε 3/9 (33,3%) στα καρκινικά κύτταρα των μυελοβλαστωμάτων. 83

84 α β γ Εικόνα 21 Διαδοχικές τομές παιδιατρικού μυελοβλαστώματος, όπου φαίνεται η έντονη (+++) κυτταροπλασματική χρώση της Hsp90 (α), η πυρηνική χρώση του HIF-1α (+++) (και κυτταροπλασματική χρώση) (β) και η εστιακή πυρηνική χρώση για τον υποδοχέα VEGFR-3 (δ), x

85 α β γ Εικόνα 22 Παιδιατρικό μυελοβλάστωμα, όπου φαίνεται η έντονη (+++) κυτταροπλασματική χρώση για τη Hsp90 (α), η απουσία έκφρασης της pvhl (β) και η πυρηνική χρώση στα κύτταρα των όγκων, καθώς και η θετική έκφραση στο τοίχωμα των αγγείων για τον VEGFR-3 (γ), x

86 Πίνακας 8 Έκφραση των πρωτεινών της μελέτης στο σύνολο των όγκων ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ±ΤΥΠΙΚΗ ΑΠΟΚΛΙΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ HSP90 pvhl HIF-1α ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ 19,76±27,88 16,97±22,83 37,14±33,82 ΠΙΛΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade I) ΔΙΑΧΥΤΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade II) ΑΝΑΠΛΑΣΤΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade III) ΠΟΛΥΜΟΡΦΑ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ (Grade IV) 3,33±2,89 30,00±17,32 30,67±25,32 20,50±39,67 3,00±4,69 5,00±5,78 15,00±19,15 12,50±15,40 6,67±11,55 23,81±29,49 17,81±24,89 48,59±34,53 ΕΠΕΝΔΥΜΩΜΑΤΑ 67,50±22,17 37,50±43,49 47,00±39,84 ΟΛΙΓΟΔΕΝΔΡΟΓΛΟΙΩΜΑΤΑ 37,50±47,87 12,50±18,92 35,00±28,87 ΜΥΕΛΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ 40,00±41,53 16,67±20,00 25,50±32,52 ΜΗΝΙΓΓΙΩΜΑΤΑ 47,29±36,97 30,29±31,55 23,36±28,13 Δε βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη μέση τιμή των Hsp90, pvhl και HIF-1α μεταξύ των ομάδων των όγκων (p 0,05). 86

87 Πίνακας 9 Έκφραση των πρωτεινών της μελέτης στους όγκους ενηλίκων ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ±ΤΥΠΙΚΗ ΑΠΟΚΛΙΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ HSP90 pvhl HIF-1α ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ 22,27±29,35 16,87±24,62 42,5±34,89 ΔΙΑΧΥΤΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade II) ΑΝΑΠΛΑΣΤΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade III) 40,50±55,86 3,67±5,51 0,50±5,78 10,00±14,14 10,00±14,14 20# ΠΟΛΥΜΟΡΦΑ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ (Grade IV) 23,50±30,39 19,06±26,59 49,60±33,71 ΕΠΕΝΔΥΜΩΜΑΤΑ 67,50±22,17 37,50±43,49 47,00±39,84 ΟΛΙΓΟΔΕΝΔΡΟΓΛΟΙΩΜΑΤΑ 37,50±47,87 12,50±18,92 35,00±28,87 ΜΥΕΛΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ 56,67±49,33 10,00±17,32 7,67±10,69 ΜΗΝΙΓΓΙΩΜΑΤΑ 47,29±36,97 30,29±31,55 23,36±28,13 #: LI για ένα περιστατικό 87

88 Πίνακας 10 Έκφραση πρωτεινών της μελέτης στους παιδιατρικούς όγκους ΜΕΣΗ ΤΙΜΗ±ΤΥΠΙΚΗ ΑΠΟΚΛΙΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ HSP90 pvhl HIF-1α ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ 10,00±16,96 22,63±18,15 21,63±27,68 ΠΙΛΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade I) ΔΙΑΧΥΤΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade II) ΑΝΑΠΛΑΣΤΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade III) ΠΟΛΥΜΟΡΦΑ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ (Grade IV) 3,33±2,89 33,33±20,82 30,67±25,32 1 # 1 # 1 # 20,00±28,28 15,00±21, ±14,14 20±7,07 40±42,43 ΕΠΕΝΔΥΜΩΜΑΤΑ ΔΔ ΔΔ ΔΔ ΟΛΙΓΟΔΕΝΔΡΟΓΛΟΙΩΜΑΤΑ ΔΔ ΔΔ ΔΔ ΜΥΕΛΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ 31,67±39,20 20,00±21,91 36,20±36,72 ΜΗΝΙΓΓΙΩΜΑΤΑ ΔΔ ΔΔ ΔΔ *ΔΔ: δε διερευνήθηκε #: LI για ένα περιστατικό Δε βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ ενηλίκων και παιδιών όσον αφορά την έκφραση Hsp90, pvhl και HIF-1α (p 0,05). 88

89 Πίνακας 11 Θετικοί όγκοι της μελέτης στο σύνολο των δειγμάτων-συγκεντρωτικός πίνακας (για LI 10%) ΘΕΤΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ HSP90 pvhl HIF-1α ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ 16/34(47,1%) 17/32(53,1%) 17/28(60,7%) ΠΙΛΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade I) ΔΙΑΧΥΤΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade II) ΑΝΑΠΛΑΣΤΙΚΑ ΑΣΤΡΟΚΥΤΤΩΜΑΤΑ (Grade III) ΠΟΛΥΜΟΡΦΑ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ (Grade IV) 0 3/3(100%) 2/3(66,7%) 1/4(25%) 1/4(25%) 0/4 3/4 (75%) 2/4(50%) 1/3(33,3%) 12/23(52,2%) 11/21(52,4%) 14/18(77,8%) ΕΠΕΝΔΥΜΩΜΑΤΑ 4/4(100%) 2/4(50%) 2/3(66,7%) ΟΛΙΓΟΔΕΝΔΡΟΓΛΟΙΩΜΑΤΑ 2/4(50%) 2/4(50%) 3/4 (75%) ΜΥΕΛΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ 5/9(55,6%) 5/9(55,6%) 4/9 (44,4%) ΜΗΝΙΓΓΙΩΜΑΤΑ 24/36(66,7%) 20/36(55,6%) 13/27(48,1%) 89

90 Σχήμα 1 Θετικοί αστροκυτταρικοί όγκοι για Hsp90, pvhl, HIF-1α, σε ενήλικες και παιδιά Σχήμα 2 Θετικά μυελοβλαστώματα για Hsp90, pvhl, HIF-1α, σε ενήλικες και παιδιά 90