ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ. Γεωγραφική διαφοροποίηση και. γενετική ποικιλότητα πληθυσμών χερσόβιων ισοπόδων.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ Γεωγραφική διαφοροποίηση και γενετική ποικιλότητα πληθυσμών χερσόβιων ισοπόδων. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μαρία Καμηλάρη Βιολόγος, M.Sc. ΠΑΤΡΑ, ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2015

2 UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENT OF BIOLOGY DIVISION OF ANIMAL BIOLOGY Geographic differentiation and genetic diversity of terrestrial isopods populations PhD Thesis Maria Kamilari Biologist, MSc. Patras, September 2015

3

4 Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο

5 Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής χρηματοδοτήθηκε μερικώς από το πρόγραμμα Καραθεοδωρή C567 της Επιτροπής Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών, για το χρονικό διάστημα από 7/2010 έως 12/

6 Σε όλους όσους με βοήθησαν, ταλαιπωρήθηκαν και χάρηκαν μαζί μου... 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Science never solves a problem without creating ten more. GEORGE BERNHARD SHAW Επιστήμη... ποτέ δε λύνει ένα πρόβλημα χωρίς να δημιουργήσει 10 καινούρια. GEORGE BERNHARD SHAW 7

8 Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, κα Έλενα Κλώσσα- Κίλια, κ. Γιώργο Κίλια και κ. Σπύρο Σφενδουράκη για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν και την ελευθερία με την οποία μου επέτρεψαν να εργάζομαι στο εργαστήριο, να οργανώσω την έρευνά μου και να φέρω εις πέρας το θέμα της διατριβής μου. Επίσης ευχαριστώ τους Δρ. Σίνο Γκιώκα, Δρ. Βασίλη Χονδρόπουλο, Δρ. Άρη Παρμακέλη και Δρ. Νίκο Πουλακάκη που δέχτηκαν να συμμετέχουν στην 7μελή εξεταστική μου επιτροπή. Στο πλαίσιο της ερευνητικής μου εργασίας είχα την τύχη να εργάζομαι τόσο στο εργαστήριο Ζωολογίας όσο και στο εργαστήριο Γενετικής. Ως εκ τούτου είχα την ευκαιρία να συνεργαστώ με πολλούς ανθρώπους διαφορετικών αντικειμένων, να μάθω πολλά από αυτούς και να περάσουν πολύ ευχάριστα όλα αυτά τα χρόνια... Ελπίζοντας λοιπόν να μην ξεχνώ κανέναν, ευχαριστώ για το ευχάριστο κλίμα, τα αμέτρητα γέλια, τα ομαδικά ξενύχτια στο εργαστήριο και όλες τις στιγμές που περάσαμε μαζί το Μιχάλη Ροβάτσο, το Στέφανο Μαρτιμιανάκη, το Γιώργο Τρυφωνόπουλο, τη Χαρά Παπαϊωάννου, τη Χριστίνα Κασσάρα, την Εβίτα Πίττα, τον Ονούφριο Μεττούρη, την Όλγα Τζωρτζακάκη, τη Σπυριδούλα Κράιτσεκ, το Γιάννη Τσιρώνη, την Ανδριάννα Σταμοπούλου, τη Γωγώ Γουβη, την Άρτεμις Μιχαήλ, τον Περικλή Παγκάνο. Ευχαριστώ θερμά για την εμπιστοσύνη και τη συνεργασία σε ερευνητικά προγράμματα και εργασίες τους Δρ. Στέφανο Νταϊλιάνη, Δρ. Σίνο Γκιώκα, Δρ. Βασίλη Χονδρόπουλο, Δρ. Στέλλα Φραγγεδάκη, Δρ. Κώστα Φλυτζάνη και τη Δρ. Ιωάννα Ντάικου. Ένα μόνο ευχαριστώ δεν είναι αρκετό για τη Δρ. Νίνα Φραγκοπούλου και Δρ. Κώστα Φλυτζάνη που σε διαφορετικές χρονικές αλλά πολύ σημαντικές στιγμές ήταν συνεχώς παρόντες με τις συμβουλές και την καθοδήγηση τους σε πληθώρα προβληματισμών και διλλημάτων όλα αυτά τα χρόνια. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω τον Dr. Jerome Murienne και Mr. Pierre Solbes για πολύτιμες συμβουλές στο πλαίσιο της ανάλυσης των δεδομένων της διατριβής μου, καθώς και για την απομακρυσμένη πρόσβαση στις εγκαταστάσεις πληροφορικής και υπολογιστών του εργαστηρίου Laboratoire Evolution et Diversite Biologique στην Τουλούζη της Γαλλίας. Χωρίς την πολύτιμη βοήθειά τους ένα σημαντικό μέρος των αναλύσεων δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τον Dr. Stefano Taiti για την αποστολή δειγμάτων Trachelipus από την Ιταλία. Ευχαριστώ από καρδιάς τη συντονίστρια κα Ελένη Κουμούτσου και τον Δρ. Γρηγόρη Ιατρού πρόεδρο του Φορέα Διαχείρισης Χελμού-Βουραϊκού όπου εργάζομαι από τον Απρίλιο του 2013, για την εξαιρετική συνεργασία και την κατανόησή τους 8

9 όλο αυτό το διάστημα, που συνέβαλλαν ουσιαστικά στην ολοκλήρωση του Διδακτορικού μου. Δε θα μπορούσα να παραλείψω τους γονείς μου Θανάση και Ευαγγελία, την αδερφή μου Ελένη και φυσικά τη γιαγιά μου Μαίρη που τόσα χρόνια με στηρίζουν ηθικά, ψυχολογικά και οικονομικά. Ξέρω πως κάνουν τα θέλω μου θέλω τους ακόμα και όταν δεν το πολυθέλουν Τέλος θέλω να ευχαριστήσω το Δημήτρη Δόγανο που χωρίς τη βοήθεια και την αμέριστη συμπαράστασή του από το ξεκίνημα της διατριβής μου τίποτα δε θα ήταν δυνατό! Η βοήθειά του στις δειγματοληψίες ανά την Ελλάδα, οι πολύτιμες συζητήσεις και προτάσεις και η συνεχής του στήριξη ήταν κάτι περισσότερο από καθοριστικά για το οτιδήποτε έχω καταφέρει τα τελευταία έξι και πλέον χρόνια. Ο καλός του λόγος και η ανοιχτή του αγκαλιά ήταν όλα αυτά τα χρόνια το αγχολυτικό μου. 9

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ...15 ABSTRACT...19 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...23 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ Εξελικτική Ταξινομική (Evolutionary Taxonomy) Φαινετική ή Αριθμητική Ταξινομική (Phenetic or Arithmetic Taxonomy) Φυλογενετική ή Κλαδιστική Ταξινομική (Phylogenetic or Cladistic Taxonomy) ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ...27 Είδος...27 Βιολογικός ορισμός του είδους (Biological species concept) (Mayr 1942) Εξελικτικός ορισμός του είδους (Evolutionary species concept) (Meglitsch 1954, Simpson 1961)...27 Φυλογενετικός ορισμός του είδους (Phylogenetic species concept) (Cracraft 1989) Μορφολογικός ορισμός του είδους (Simpson 1961) ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗΣ...29 Χαρακτήρας...29 Ομοπλασία...29 Πλησιομορφία...29 Απoμορφία...29 Μονοφυλετική ομάδα / μονοφυλετικός κλάδος...30 Παραφυλετική ομάδα...30 Αδελφά είδη...30 Φυλογενετικό δένδρο...30 Κλαδόγραμμα

11 4. ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗ - ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ - ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ Μοριακοί δείκτες Το μιτοχρονδιακό DNA Πυρηνικοί δείκτες Μοριακό ρολόι - Χρονολόγηση κλάδων ΠΑΛΑΙΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΕΩΛΟΓΙΑΣ ΠΑΛΑΙΟΚΛΙΜΑ Γεωδυναμική και γεωτεκτονική εξέλιξη του αλπικού συστήματος στον ελληνικό χώρο Παλαιογεωγραφική εξέλιξη των Ελληνίδων ζωνών Διαμόρφωση του ελλαδικού χώρου Η περιοχή της Ροδόπης Ανατολική ηπειρωτική Ελλάδα, δυτικές Κυκλάδες, Εύβοια Νότιο Αιγαίο - Πελοπόννησος Η περιοχή του Αιγαίου Διαμόρφωση του ελλαδικού χώρου κατά το Πλειστόκαινο (2,58 0,0117 mya) Παλαιοκλίμα ΓΕΝΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΞΗ ΤΩΝ ΙΣΟΠΟΔΩΝ Ιστορικά στοιχεία και στοιχεία εξέλιξης Τα Χερσαία Ισόποδα Εξωτερική μορφολογία Γενικά περί Οικολογίας Και Βιολογίας του γένους Trachelipus Budde- Lund, Γενικά περί Οικολογίας Και Βιολογίας του γένους Trachelipus Budde- Lund, Οικολογία Αναπαραγωγή Ανάπτυξη Συστηματική - γεωγραφική κατανομή Διαγνωστικοί Χαρακτήρες Του Γένους Trachelipus

12 Κυριότεροι διαγνωστικοί χαρακτήρες μεταξύ των ειδών Trachelipus ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΟΒΛΗΜΑ...86 Β. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Τα μιτοχονδριακά γονίδια της μελέτης Το πυρηνικό γονίδιο της μελέτης ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Πειραματική Πορεία Εξαγωγή Ολικού DNA Ηλεκτροφόρηση Ολικού DNA Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) Καθαρισμός του πολλαπλασιασμένου τμήματος των γονιδίων COI, 16S rrna και NaK ATPase Καθορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων των επιλεγμένων τμημάτων των μιτοχονδριακών γονιδίων (Sanger sequencing) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Στοίχιση Αλληλουχιών Επεξεργασία των Στοιχισμένων Αλληλουχιών Έλεγχος Δεδομένων για Ομοπλασία και Κορεσμό Υπολογισμός Γενετικής Ποικιλότητας και Καθορισμός Απλοτύπων Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΑΙΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ Επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης Ανεξάρτητη ή συνδυασμένη ανάλυση Η μέθοδος της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) Η μέθοδος της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood) Μπεϊεσιανή συμπερασματολογία

13 6. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΧΡΟΝΩΝ ΑΠΟΣΧΙΣΗΣ Ανάλυση μοριακού ρολογιού Υπολογισμός χρόνου απόσχισης κλάδων H περίπτωση του Αιγαίου (Kamilari et al. 2014) Το γένος Trachelipus στην ηπειρωτική και νησιωτική Ελλάδα Σύγκριση και επιλογή του πιθανότερου σεναρίου Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΙΓΑΙΟΥ Γενικά στοιχεία Γενετικές αποστάσεις Φυλογενετικές αναλύσεις Εκτίμηση χρόνων απόσχισης ΤΟ ΓΕΝΟΣ TRACHELIPUS ΣΤΗΝ ΗΠΕΙΡΩΤΙΚΗ ΚΑΙ ΝΗΣΙΩΤΙΚΗ ΕΛΛΑΔΑ Γενικά στοιχεία Μιτοχονδριακό και πυρηνικό DNA Γενετικές αποστάσεις Φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των μελετηθέντων ειδών και σύγκριση των προτύπων των φυλογενετικών αναλύσεων Μιτοχονδριακό DNA Πυρηνικό DNA Συνδυασμένη ανάλυση πυρηνικού και μιτοχονδριακών γενετικών τόπων Εκτίμηση χρόνων απόσχισης Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΛΗΘΟΣ ΑΠΛΟΤΥΠΩΝ ΚΟΡΕΣΜΟΣ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ Διαφοροποίηση του γενετικού τόπου 16S rrna Διαφοροποίηση του γενετικού τόπου COI

14 3.3. Διαφοροποίηση του γενετικού τόπου NaK ATPase ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Σύγκριση των προτύπων του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA Φυλογενετικές σχέσεις ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ ΚΑΙ ΧΡΟΝΟΙ ΑΠΟΣΧΙΣΗΣ ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΩΝ ΚΛΑΔΩΝ Trachelipus squamuliger Trachelipus aegaeus - Trachelipus cavaticus Trachelipus n. sp Trachelipus palustris και Trachelipus arcuatus Η περίπτωση της βόρειας Εύβοιας και της χερσονήσου της Μαγνησίας Η περίπτωση της ευρύτερης περιοχής του Χελμού (Βουραϊκός Σόλος-Μανεσαίικος-Χελμός-Πλανητέρο- Φενεός) Trachelipus camerani Διαφοροποίηση εντός των βασικών φυλογενετικών κλάδων ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

15 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα χερσόβια ισόποδα (Oniscidea) αντιπροσωπεύουν έναν μονοφυλετικό κλάδο της τάξης ισοπόδων (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). Είναι η μόνη ομάδα καρκινοειδών που έχουν πλήρως προσαρμοστεί να ζουν στη στεριά, με εξάπλωση σε όλα τα ενδιαιτήματα. Εμφανίζονται από το επίπεδο της θάλασσας έως και σε ψηλά υψόμετρα, από τα δάση μέχρι και στις ερήμους, με εξαίρεση τις πολικές περιοχές. Η πλειοψηφία των χερσόβιων ισοπόδων χρειάζεται ένα υψηλό βαθμό υγρασίας του αέρα για την επιβίωσή της, εξαιτίας της περιορισμένης δυνατότητάς τους να διατηρήσουν το νερό. Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει σχετικά στενόοικους οργανισμούς οι οποίοι διαβιούν σε οικοτόπους που υπόκεινται σε απειλή λόγω των ανθρώπινων δραστηριοτήτων, όπως τα υγρά δάση και οι παρόχθιες διαπλάσεις. Περιλαμβάνει περί τα 50 είδη που εξαπλώνονται σε όλη την Παλαιαρκτική, με 8 είδη να έχουν καταγραφεί στην Ελλάδα, 4 εκ των οποίων είναι ενδημικά στη χώρα (ελληνικά ενδημικά: Τ. palustris, Τ. aegaeus, Τ. cavaticus, Τ. n. sp., ευρωπαϊκά είδη: Τ. camerani Τ, Τ. squamuliger, Τ. razzauti, Τ. arcuatus). Η κατανομή των ειδών είναι ασυνεχής λόγω του αυξανόμενου κατακερματισμού των ενδιαιτημάτων τους και της επέκτασης της γεωργικής γης και της αποψίλωσης των δασών. Η επίδραση της προϊούσας κλιματικής αλλαγής ενδέχεται να περιορίσει περαιτέρω τη ροή γονιδίων μεταξύ των πληθυσμών Trachelipus, καθώς τα ξηρά ενδιαιτήματα αναμένεται να αυξηθούν στην Ελλάδα. Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ αυτών των οργανισμών είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες καθώς πιο συστηματικές αναλύσεις έχουν αρχίσει να διενεργούνται σχετικά πρόσφατα. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού δευτερευόντων φυλετικών μορφολογικών χαρακτήρων των αρσενικών ατόμων, ωστόσο οι πρόσφατες αναλύσεις με μοριακούς δείκτες καταδεικνύουν ότι η ταξινόμηση των ειδών με βάση τη μορφολογία μπορεί να υποτιμά τα πραγματικά επίπεδα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών. Επιπλέον, μέσα σε διάφορα γένη ή ομάδες ειδών, οι 15

16 χρησιμοποιούμενοι μορφολογικοί χαρακτήρες δεν παρέχουν σαφή ταξινομική ανάλυση, κι έτσι έχουν παρουσιαστεί πολλές αλλαγές στην ονοματολογία των περιγεγραμμένων ειδών στη βιβλιογραφία. Ο κύριος στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών, η διαπίστωση κάποιου ενδεχόμενου γεωγραφικού ή/και παλαιογεωγραφικού προτύπου και η αποσαφήνιση της κατανομής κάθε είδους εντός της ελληνικής επικράτειας, προκειμένου να εκτιμηθεί καλύτερα μια πιθανή γεωγραφική δομή στα πρότυπα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών, και να επανεξεταστεί η συστηματική τους. Μετά την απομόνωση ολικού DNA, χρησιμοποίησα τρεις μοριακούς δείκτες: τους μιτοχονδριακούς δείκτες 16S rrna και την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρέως για τις φυλογενετικές μελέτες στο διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο, και τον πυρηνικό γενετικό τόπο της α υπομονάδας της αντλίας NaK (NaK ATPase a-subunit), η οποία είναι μία Ρ-τύπου αντλία, συμμεταφορέας ιόντων για τη διατήρηση της διαφοράς του ηλεκτροχημικού δυναμικού μεταξύ των κυτταρικών μεμβρανών, και είναι απαραίτητη για την κυτταρική σηματοδότηση και τη δευτερογενή μεταφορά. Λόγω της κακής συντήρησης αρκετών δειγμάτων, προτείνω ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο απομόνωσης DNA, το οποίο έδωσε πολύ θετικά αποτελέσματα αναφορικά με την ποιότητα του απομονωμένου DNA. Μετά τον πολλαπλασιασμό των τριών γενετικών δεικτών με τη μέθοδο της PCR, υπολόγισα τις γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών και ειδών, καθώς και τις μεταξύ τους φυλογενετικές σχέσεις. Για τη φυλογενετική ανασύσταση χρησιμοποίησα τις μεθόδους της Μέγιστης Φειδωλότητας (MP), της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (BI) για κάθε γενετικό τόπο και για τις συνδυασμένες αναλύσεις. Προκειμένου να αξιολογηθεί η βιογεωγραφική ιστορία και να εκτιμηθεί η χρονολόγηση των γεγονότων διαφοροποίησης μεταξύ των ειδών και των πληθυσμών, εφάρμοσα ένα βαθμονομημένο μοριακό ρολόι εξετάζοντας 12 16

17 εναλλακτικές υποθέσεις με το πρόγραμμα BEAST [α: παλαιογεωγραφικά γεγονότα (όπως η διαμόρφωση της Μεσαιγαιακής Τάφρου 12-9 εκ. χρόνια πριν και η κρίση αλατότητας κατά το Μεσσήνιο 5,971-5,33 εκ. χρόνια πριν), β: διαφορετικές παραμέτρους δέντρων (tree priors: διαδικασία της γέννησηςθανάτου, διαδικασία Yule), γ: διαφορετικά ρολόγια (σταθερό μοριακό ρολόι, μη συσχετιζόμενο λογαριθμικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης, μη συσχετιζόμενο εκθετικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης) και δ: διαφορετικούς ρυθμούς υποκατάστασης για τoυς μιτοχονδριακούς δείκτες COI και 16S rrna (COI = 1,56% -1,72% Poulakakis & Sfenthourakis 2008, 16Sr RNA = 0,14% Held 2001). Οι διαφορετικές υποθέσεις που δοκιμάστηκαν κατατάχθηκαν με βάση τους οριακούς εκτιμητές πιθανοφάνειας που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Path Sampling και Stepping Stone. Όλες οι φυλογενετικές μέθοδοι (MP, ML, BI) - κατέληξαν σε δέντρα με κοινές τοπολογίες κλάδων και καταδεικνύουν ασυμφωνία με την ισχύουσα ταξινόμηση. Ορισμένοι πληθυσμοί που θεωρούνται πως ανήκουν στο ίδιο είδος παρουσιάζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις και ομαδοποιούνται σε διακριτούς κλάδους. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι αυτό των πληθυσμών του είδους Τ. palustris που ομαδοποιούνται σε τρεις διαφορετικούς κλάδους με πολύ μεγάλη γενετική απόσταση (Kimura 2-P) και στους τρεις γενετικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν (COI = 27,2%, 16S rrna = 15,2%, NaK ΑΤΡ = 4,3%). Σε γενικές γραμμές, οι γενετικές αποστάσεις που καταγράφονται στην παρούσα μελέτη είναι αρκετά μεγάλες σε σύγκριση με εκείνες που έχουν αναφερθεί για τα διάφορα είδη και γένη, ακόμη και σε άλλες μελέτες χερσόβιων ισοπόδων. Από την άλλη πλευρά, διαφορετικοί πληθυσμοί από την Κρήτη που ανήκουν στα είδη Τ. cavaticus και Τ. aegaeus, ομαδοποιούνται μαζί και παρουσιάζουν μικρές γενετικές αποστάσεις (COI: 12,3%, 16S rrna: 6,4%, NaK: 2,9%). Υπό το φως αυτών των αποτελεσμάτων, κρίνεται απαραίτητη η αναθεώρηση της ταξινόμησης των ειδών Trachelipus που απαντώνται στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα της διατριβής μου προτείνουν την ύπαρξη δύο ενδεχομένων κρυπτικών ειδών αφενός για τους πληθυσμούς T. palustris που 17

18 ομαδοποιούνται στον κλάδο της δυτικής ηπειρωτικής Ελλάδας και της βόρειαςβορειοδυτικής Πελοποννήσου και αφετέρου για του πληθυσμούς που ομαδοποιούνται στον κλάδο της βόρειας Εύβοιας και της χερσονήσου της Μαγνησίας Αντίθετα, με βάση τα αποτελέσματα της διατριβής προτείνω τη συγχώνευση των κρητικών πληθυσμών Τ. cavaticus και Τ. aegaeus σε ένα μόνο είδος (αυτό θα ήταν Τ. aegaeus δεδομένου ότι έχει προτεραιότητα). Τα φυλογενετικά δέντρα με την ισχυρή στατιστική υποστήριξη συμφωνούν με την παλαιογεωγραφική ιστορία της ελληνικής περιοχής από την εποχή του Μειόκαινου (23,03 εκ. χρόνια πριν). Οι γεωγραφικές κατανομές των ειδών φαίνεται να ακολουθούν την τεκτονική και κινηματική ανασυγκρότηση της περιοχής της ηπειρωτικής Ελλάδας, του Αιγαίου και της δυτικής Τουρκίας απεικονίζοντας τη σχέση μεταξύ των ορογενετικών διεργασιών, της ηπειρωτικής επέκτασης και της ανύψωσης των μεταμορφωμένων πετρωμάτων στις κινήσεις των τεκτονικών πλακών στην περιοχή. Τα αποτελέσματα της χρονολόγησης των κλάδων επιβεβαιώνουν τόσο τα γεωλογικά γεγονότα όσο και την ανασυγκρότηση του ελλαδικού χώρου που ευθύνονται για την σημερινή γεωγραφία και γεωλογία της περιοχής. Η Διατριβή μου αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων σε πληθυσμούς χερσόβιων καρκινοειδών στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα κατέληξαν στην οριοθέτηση της γεωγραφικής εξάπλωσης των ειδών και την ανασύσταση των φυλογενετικών τους σχέσεων υπό το πρίσμα της παλαιογεωγραφικής ιστορίας και της σύγχρονης γεωγραφίας της νησιωτικής και ηπειρωτικής περιοχής. Τόσο οι φυλογενετικές σχέσεις όσο και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών φαίνεται να συνηγορούν στην περαιτέρω διερεύνηση της συστηματικής των ειδών του γένους. Η Διατριβή μου καταδεικνύει ότι η μορφολογία περιγράφει ανεπαρκώς την πραγματική ποικιλότητα μεταξύ των ειδών. Ως εκ τούτου, η ταξινόμηση των ειδών με βάση τους διαγνωστικούς χαρακτήρες και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα για τα είδη Trachelipus θα πρέπει να επανεξεταστεί υπό το φως των νέων αυτών μοριακών φυλογενετικών αναλύσεων. 18

19 ABSTRACT Terrestrial isopods (Oniscidea) represent a monophyletic suborder of the order Isopoda (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). They are the only group of crustaceans fully adapted to live on land and occur in all the ecosystems from sea level to high mountains, from forests to deserts, excluding the polar areas. The majority of terrestrial isopods need a high degree of air humidity for survival, due to their limited ability to preserve water. The genus Trachelipus comprises of relatively stenoecious animals living in habitats generally threatened by human activities, such as humid forest sites and riparian habitats. It includes some 50 species distributed around the Palaearctic, with 8 species recorded from Greece, 4 endemic to the country (i.e. Greek endemics: T. palustris, T. aegaeus, T. cavaticus, T. n. sp.; European species: T. camerani, T. squamuliger, T. ratzauti, T. arcuatus). The distribution of species is discontinuous due to the increasing fragmentation of its habitats and the expansion of agricultural land and dry woodland. Projected climatic change will restrict further gene flow between Trachelipus populations, as dry habitats are expected to expand in Greece. The phylogenetic relationships among these animals are still largely unknown because robust analyses have started to appear only relatively recently. Species-level taxonomy has been based mainly on a few secondary sexual characters of males, although recent analyses based on molecular markers have indicated that species definitions based on morphology may underestimate the true levels of divergence among populations. Furthermore, within several genera or species groups, morphological characters do not provide clear-cut taxonomic resolution, so that many changes in the interpretation of nominal species have appeared in the literature. In my PhD Thesis I performed a phylogenetic analysis of Trachelipus spp. distributed in Greece using a population by population approach. I have sampled 123 populations from several sites in mainland and insular Greece and 19

20 I have also incorporated samples of European origin in order to check both for the morphological and the genetic homology. My main goal was to study the phylogeny of these species, to reveal any possible geographical and/or palaeogeographical pattern and to particularize the distribution of each species within the Greek territory in order to better estimate possible geographic structure in the patterns of divergence among populations, and to throw new light in their systematics. After total DNA extraction, I employed three DNA markers; the mitochondrial 16S rrna and the Cytochrome Oxidase subunit I, that are widely used for the phylogenetic studies at the species and the population level, and the nuclear sodium potassium ATPase a-subunit, which is a P-type ATPase ion co-transporter responsible for maintaining electrochemical potential differences across cell membranes, and is essential for cell signalling and secondary transport. Due to the poor preservation of several specimens, I propose a modified DNA extraction protocol, which returned highly positive results in terms of the quality of the total extracted DNA. After PCR amplification of the gene markers I calculated the genetic divergence within and among the populations and species studied, as well as their phylogenetic relationships. The methods for phylogenetic reconstruction that I used were Maximum Parsimony (MP), Maximum Likelihood and Bayesian Inference (BI) for each sequence data and the concatenated datasets. In order to evaluate the biogeographic history and to estimate the chronology of diversification events among the species and their populations I have implement a calibrated molecular clock using 12 alternative scenarios in BEAST [(i.e. palaeogeographical events such as the formation of the Mid- Aegean Trench 12-9 mya and the Messinian Salinity Crisis 5,971 5,33 mya), different tree priors (i.e. birth-death process; Yule process), different clocks (strict, Uncorrelated Exponential Relaxed Clock and Uncorrelated Lognormal relaxed clock) and different rates of substitution for COI and 16S rrna markers (COI = 1.56% 1.72% after Poulakakis & Sfenthourakis 2008; 16Sr RNA = 0,14% 20

21 after Held 2001)]. The different scenarios implemented where tested and ranked using the Maximum Likelihood Estimators as they were calculated using the path sampling and stepping stone analyses. Αll phylogenetic methods (MP, ML, BI) - produced trees with quite congruent topologies that reveal incongruence with current taxonomy. Some populations that are considered conspecific exhibit large genetic distances and cluster in different clades. The most prominent example is that of T. palustris populations that cluster into three different clades that exhibit very large genetic divergence (Kimura 2-p) in all three genetic markers used (COI= 27.2%; 16S rrna=15.2%; NaK ATPase=4.3% ). In general, it can be argued that the genetic distances recorded in the present study are quite large compared with those reported for different species and even genera in other studies of terrestrial isopods. On the other hand, the Cretan populations that belong to T. cavaticus and T. aegaeus are clustered together and exhibit low genetic distances (COI: 12.3%, 16S rrna: 6.4%, NaK: 2.9%). Under the light of these results, a revision of the Greek Trachelipus species taxonomical status is in need. The results of my Thesis corroborate the possibility of probably two cryptic species for the T. palustris populations; one would include the populations distributed to N. Evia and the peninsula of Magnisia and the second would apply to the populations distributed to the N- NW Peloponnese and Western Greece area. On the other hand the results of my Thesis point to the merger of Cretan populations of Τ. cavaticus and T. aegaeus to a single species (this would be T. aegaeus since it has priority). The highly-structured phylogenetic trees agree with the palaeogeographic history of the Greek territory since the Miocene (23,03 mya). The distribution of the species seem to follow the tectonic and kinematic reconstruction of the Aegean region of Greece and western Turkey depicting the linkage between the subduction-related mountain building, continental extension, and the resulting formation and exhumation of metamorphic rocks to plate motions and mantle dynamics in the area. The chronology results of the clades also corroborate to the geological events and the reconstruction of the 21

22 Greek territory that account for the today s geography and geology of the region. My Thesis comprises the first comprehensive phylogenetic study of terrestrial crustacean populations in Greece with positive results concerning the delineation of both the distributional range and the phylogeography of these animals with respect to the palaeogeographic history and the current geography of insular and mainland Greece. Both the phylogeny presented in my Thesis and the genetic distances separating the populations appear to justify the necessity of further investigation into the systematics of the Greek Trachelipus species. My study brought evidence that morphology inadequately describes the real variation inside and among species. Hence, diagnoses based on the morphological characters used so far for the delineation of Trachelipus species should be reconsidered under the light of these more extensive molecular phylogenetic analyses. 22

23 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Science is wonderfully equipped to answer the question - How? - But it gets terribly confused when you ask the question -Why? - ERWIN CHARGAFF Η επιστήμη είναι θαυμάσια προικισμένη στο να απαντά στο ερώτημα Πώς- Όμως γίνεται τρομερά δυσνόητη όταν τίθεται το ερώτημα Γιατί;... ERWIN CHARGAFF 23

24 Εισαγωγή 1. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ Η πρώτη προσπάθεια ομαδοποίησης των Ως ταξινομική (taxonomy) ορίζεται το σύνολο των θεωριών και των πρακτικών οργανισμών ανάγεται στην μεθόδων που χρησιμοποιούνται για την κλασική αρχαιότητα, όπου ο περιγραφή της ποικιλομορφίας των Αριστοτέλης με βάση τη μορφολογική ομοιότητά τους διαμόρφωσε το «φυσικό σύστημα κατάταξης». οργανισμών. Η ταξινομική κατατάσσει αυτήν την ποικιλομορφία σε ένα σύστημα λέξεων που μεταφέρει πληροφορίες σχετικά με το είδος και τις σχέσεις μεταξύ των οργανισμών. Με άλλα Τον 18 ο αιώνα ο Linnaeus λόγια, η ταξινομική περιλαμβάνει την ανέπτυξε το πρώτο ολοκληρωμένο ταξινομικό σύστημα με την καινοτομία της διπλής ονοματολογίας, περιγραφή και την κατάταξη των οργανισμών σε ταξινομικές κατηγορίες καθώς και τη θεωρία και την ιστορία της κατάταξης αυτής (Wiley 1981). που δημοσίευσε το 1758 στην δεύτερη έκδοση του έργου Η ταξινόμηση περιλαμβάνει την του «Systema Naturae» και αποτέλεσε το θεμέλιο λίθο της σύγχρονης ταξινόμησης. κατάταξη και την ονοματολογία. Κατάταξη (classification) ονομάζεται η κατηγοριοποίηση των οργανισμών σε ομάδες μέσα σε ένα οργανωμένο ταξινομικό σύστημα, ενώ ονοματολογία (nomenclature) ονομάζεται η χρήση συγκεκριμένων χαρακτηριστικών ονομάτων για κάθε ομάδα που διακρίνει η ταξινόμηση (Simpson 1961). Η ταξινόμηση βασίστηκε σε ποικίλες μεθοδολογικές προσεγγίσεις Εξελικτική Ταξινομική (Evolutionary Taxonomy) Η μέθοδος αυτή βασίστηκε στην ιεραρχική απεικόνιση των τάξων (π.χ. βασίλειο, φύλο, τάξη, οικογένεια, γένος, είδος) με διακλαδιζόμενα φυλογενετικά δένδρα ή δενδρογράμματα προτύπων καταγωγής (phylogenetic 24

25 Εισαγωγή trees), έτσι ώστε να αντικατοπτρίζουν το πρότυπο της καταγωγής από κοινό πρόγονο και τον βαθμό της διαφοροποίησης (απόκλισης). Καθώς όμως τα πρότυπα καταγωγής και ο βαθμός διαφοροποίησης δεν ακολουθούν τους ίδιους ρυθμούς εξέλιξης η μέθοδος αυτή αποδείχτηκε ανεπαρκής (Avise 2000) Φαινετική ή Αριθμητική Ταξινομική (Phenetic or Arithmetic Taxonomy) Η βασική παραδοχή της φαινετικής είναι ότι όσο περισσότεροι ανεξάρτητοι χαρακτήρες δύο οργανισμών μοιάζουν μεταξύ τους τόσο πιο συγγενικοί θα είναι αυτοί, καθώς από στατιστική σκοπιά είναι απίθανο να έχει συμβεί σύγκλιση ή παράλληλη εξέλιξη σε πολλούς χαρακτήρες ταυτοχρόνως. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί το σύνολο των χαρακτήρων των οργανισμών, εκφρασμένων με κάποιο είδος ποσοτικής μαθηματικής κωδικοποίησης και βασίζει τις φυλογενετικές σχέσεις στη συνολική ομοιότητα των οργανισμών όπως αυτή υπολογίζεται μέσω στατιστικών μεθόδων (τεχνικών ομαδοποίησης)(avise 2000) Φυλογενετική ή Κλαδιστική Ταξινομική (Phylogenetic or Cladistic Taxonomy) Η ταξινομική ιεράρχηση βασίζεται στην εξελικτική θεωρία και έχει συγκεκριμένη δομή. Η ταξινομική ιεράρχηση έχει τέτοια δομή, ώστε να απεικονίζει την αλυσίδα των σύγχρονων και των προγονικών ειδών. Η εξελικτική αλληλουχία των οργανισμών λέγεται φυλογένεση (phylogeny). Η φυλογενετική συστηματική είναι μια προσέγγιση της συστηματικής η οποία αφενός προσπαθεί να ανακτήσει τις φυλογενετικές (γενεαλογικές) σχέσεις μεταξύ ομάδων οργανισμών και αφετέρου παράγει ταξινομήσεις οι οποίες αντανακλούν ακριβώς αυτές τις γενεαλογικές σχέσεις (Avise 2000). 25

26 Εισαγωγή Η ιστορία της φυλογενετικής Η κλαδιστική ανάλυση διακρίνει συστηματικής είναι σχετικά μικρή, τους χαρακτήρες σε προγονικούς αν και οι απαρχές της θα πρέπει να (πλησιόμορφους) και παράγωγους αναζητηθούν ήδη από τον Δαρβίνο. (απόμορφους). Μόνον οι απόμορφοι Μέχρι όμως τη διατύπωση ενός ολοκληρωμένου πλαισίου αρχών από το Γερμανό εντολολόγο Willi χαρακτήρες που μοιράζονται μεταξύ τους κάποια τάξα (συναπομορφίες) χρησιμεύουν Hennig στη δεκαετία του 1950, και στην κατασκευή κλαδογραμμάτων στην ουσία μέχρι τη μετάφραση του έργου του στην αγγλική γλώσσα το 1966 (Phylogenetic systematics), η συστηματική των οργανισμών (cladograms) ή φυλογενετικών δέντρων. Ένα κλαδόγραμμα αποτελεί μία υπόθεση που αφορά τις φυλογενετικές σχέσεις, άρα είναι αξιόπιστο μόνο όταν είναι αξιόπιστες βασιζόταν σε έναν συνδυασμό οι υποθέσεις, τα δεδομένα και οι αντικειμενικών δεδομένων και της αναλυτικές μέθοδοι κατασκευής του. εμπειρίας του κάθε ειδικού στην υπό εξέταση ομάδα. Επίσης, η κλαδιστική μέθοδος προϋποθέτει διακλαδισμένο και όχι «δικτυωτό» πρότυπο εξελικτικής διαφοροποίησης, αν και σε κάποιους οργανισμούς, όπως τα φυτά, ο υβριδισμός είναι κοινό φαινόμενο. Τέλος, το κλαδόγραμμα συνήθως περιλαμβάνει αρτίγονους οργανισμούς και παρουσιάζει γεγονότα ειδογένεσης, αλλά όχι εξαφανίσεων, με συνέπεια να αποτελεί μια υπεραπλουστευμένη απεικόνιση του προτύπου της εξέλιξης (Avise 2000). 26

27 Εισαγωγή 2. ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Είδος Η δομική μονάδα της ταξινόμησης και της συστηματικής κατάταξης είναι το είδος (ετυμολογικά προκύπτει από το ρήμα είδω = γνωρίζω, διακρίνω). Στο είδος, ως έννοια των βιολογικών επιστημών, έχουν αποδοθεί διαχρονικά αρκετοί ορισμοί, ανάλογα με τα κριτήρια που χρησιμοποιούσαν οι εκάστοτε ερευνητές, για να προσεγγίσουν την ποικιλότητα των οργανισμών (Avise & Ball 1990, Templeton 2001, De Queiroz 2007). Το κριτήριο του βιολογικού είδους δεν μπορεί να εφαρμοστέι για οργανισμούς που αναπαράγονται μονογονικά ή παρθενογενετικά. Ο ορισμός δεν ισχύει όταν αναφερόμαστε σε αλλοπάτριους πληθυσμούς που δεν διασταυρώνονται στη φύση επειδή δεν έρχοπνατι σε επαφή, αν και δυνητικά μπορούν (π.χ. όταν βρεθούν στο εργαστήριο). Επίσης, δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε απολιθωμένα είδη. Βιολογικός ορισμός του είδους (Biological species concept) (Mayr 1942). Ομάδες φυσικών πληθυσμών, οι οποίες διασταυρώνονται μεταξύ τους δίνοντας γόνιμους απογόνους και είναι αναπαραγωγικά απομονωμένες από παρόμοιες ομάδες και καταλαμβάνουν ένα συγκεκριμένο οικολογικό θώκο στη φύση. Ο ορισμός αυτός βασίζεται σε ένα καθαρά βιολογικό κριτήριο, δηλαδή την αναπαραγωγική απομόνωση. Εξελικτικός ορισμός του είδους (Evolutionary species concept) (Meglitsch 1954, Simpson 1961). Ομάδα ατόμων που ανήκουν σε μία ανεξάρτητη εξελικτική γραμμή προγονικών και απογονικών πληθυσμών που διατηρεί την ταυτότητά της από άλλες παρόμοιες γραμμές και η οποία έχει τις δικές τις εξελικτικές τάσεις. 27

28 Εισαγωγή Φυλογενετικός ορισμός του είδους (Phylogenetic species concept) (Cracraft 1989). Η μικρότερη διακριτή ομάδα οργανισμών που μπορεί να διαγνωσθεί ως ξεχωριστή από άλλες τέτοιες ομαδοποιήσεις και μέσα στην οποία υπάρχει πρότυπο προέλευσης και καταγωγής. Η έννοια αυτή εφαρμόζεται τόσο σε αμφιγονικά όσο και σε μονογονικά αναπαραγόμενους οργανισμούς. Μορφολογικός ορισμός του είδους (Simpson 1961) Μία ομάδα ατόμων που διακρίνεται μορφολογικά από άλλες. Τα κριτήρια για την αναγνώριση μορφολογικών ειδών διαφέρουν από ομάδα σε ομάδα. Η έννοια αυτή έχει περιορισμένη εφαρμογή καθώς παρεμβάλλεται η υποκειμενικότητα του ερευνητή και συχνά γίνονται λάθη εξαιτίας συγκλίνουσας ή αποκλίνουσας εξέλιξης. 28

29 Εισαγωγή 3. ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗΣ Ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων γίνεται στη βάση των προτύπων των χαρακτήρων που εμφανίζονται στους Χαρακτήρας Ως χαρακτήρας εννοείται οποιοδήποτε χαρακτηριστικό ενός οργανισμού μπορούμε να περιγράψουμε με τον οποιονδήποτε τρόπο. Πρόκειται για γενική έννοια, η οποία μπορεί σύγχρονους οργανισμούς ή και να περιλαμβάνει από μορφολογικά σε παλαιοντολογικά ευρήματα. χαρακτηριστικά μέχρι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες, ή ακόμα και στοιχεία συμπεριφοράς και κοινωνικής οργάνωσης. Στη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων αξιοποιούνται μόνο οι χαρακτήρες κοινής προέλευσης (εξελικτικής και οντογενετικής) που ονομάζονται ομόλογοι. Οι ομόλογοι χαρακτήρες που εμφανίζονται σε ποικιλία καταστάσεων (πολυμορφικοί) συνιστούν το βασικό εργαλείο της φυλογενετικής ανάλυσης. Χαρακτήρες οι οποίοι προέρχονται από οικολογική σύγκλιση ή παράλληλη εξέλιξη ονομάζονται ανάλογοι. Ομοπλασία Η λανθασμένη θεώρηση ενός χαρακτήρα ως ομόλογου. Μπορεί να οφείλεται σε ανάλογους χαρακτήρες ή σε απώλεια χαρακτήρα που εκλαμβάνεται και κωδικοποιείται ως διαφορετικός χαρακτήρας. Πλησιομορφία Κατάσταση που έχει διατηρηθεί αμετάβλητη από τον τελευταίο, τουλάχιστον, κοινό πρόγονο των μελετηθέντων τάξων. Απoμορφία Κατάσταση που μεταβάλλεται μεταξύ δύο κόμβων (σημείων διακλάδωσης ενός κλαδογράμματος). 29

30 Εισαγωγή Μονοφυλετική ομάδα / μονοφυλετικός κλάδος Μια ομάδα οργανισμών που περιλαμβάνει όλους τους απογόνους του πιο πρόσφατου κοινού προγόνου όλων των κλάδων που ανήκουν σε αυτήν. Παραφυλετική ομάδα Μια ομάδα οργανισμών που δεν περιλαμβάνει όλους τους απογόνους του πιο πρόσφατου κοινού προγόνου των μελών της ομάδας. Πολυφυλετικές ομάδες, Οι ομάδες που περιλαμβάνουν αντιπροσώπους διαφορετικών κλάδων (δηλαδή. δεν αποτελούνται από απογόνους του πλέον πρόσφατου κοινού προγόνου όλων των μελών τους). Αδελφά είδη Είδη, συνήθως με συμπατρική εξάπλωση, αλλά αναπαραγωγικά απομονωμένα, με παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά σε βαθμό που είναι δύσκολος ο διαχωρισμός τους. Φυλογενετικό δένδρο Αφορά ένα διακλαδισμένο διάγραμμα που αποδίδει τις φυλογενετικές σχέσεις των ακραίων τάξων και οι αποστάσεις μεταξύ των διακλαδώσεων αντιστοιχούν σε συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Κλαδόγραμμα Aφορά ένα διακλαδισμένο διάγραμμα που αποτυπώνει μια υπόθεση για τις φυλογενετικές σχέσεις των ακραίων τάξων βάσει ενός συνόλου χαρακτήρων και του οποίου τα μήκη, καθώς και οι οριζόντιες αποστάσεις, των κλάδων δεν αποδίδουν κάτι. 30

31 Εισαγωγή 4. ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗ - ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ - ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ Η φυλογένεση αφορά τη μελέτη της συγγένειας διαφορετικών οργανισμών όπως αυτή αντικατοπτρίζεται στην εξελικτική ιστορία τους. Βασικό στοιχείο της φυλογενετικής έρευνας είναι οι λεγόμενες «ομολογίες», δηλαδή οι κληρονομούμενες ιδιότητες, και οι λεγόμενες «αναλογίες» που αφορούν όμοιους τρόπους και κοινές προσαρμογές σε συνθήκες ζωής. Συνεπώς, τα συστήματα φυλογενετικής ταξινόμησης βασίζονται κυρίως σε βιολογικά χαρακτηριστικά των οργανισμών εξετάζοντας κοινά γνωρίσματα, όπως οι ακολουθίες βιομορίων (αμινοξέα, νουκλεοτίδια, πρωτεΐνες, DNA κτλ.). Η φυλογεωγραφία είναι το πεδίο έρευνας που ασχολείται με τις αρχές και τις διαδικασίες που καθορίζουν τα γεωγραφικά πρότυπα κατανομής των γενεαλογικών γραμμών εντός του είδους καθώς και μεταξύ στενά συγγενικών ειδών. Λαμβάνει υπόψη το σύνολο των ιστορικών και φυλογενετικών παραγόντων της χωρικής κατανομής των γονιδιακών γενεαλογικών γραμμών (Avise 2000). Ο όρος «φυλογεωγραφία» ήταν σύλληψη των Avise et al. (1987) προκειμένου να περιγράψουν μια αρχή με τεχνικές και θεωρητικές ρίζες που συνδέονται με το πεδίο της μοριακής γενετικής.. Με τον όρο αυτόν προσπάθησαν να ενοποιήσουν τα επιστημονικά πεδία της φυλογένεσης και της γενετικής πληθυσμών. Ωστόσο, ο de Candolle (1820) ήταν ο πρώτος που πρότεινε πως η τρέχουσα γεωγραφική εξάπλωση των ζωντανών οργανισμών οφείλεται τόσο σε οικολογικούς όσο και σε ιστορικούς παράγοντες. Η προσέγγιση της επιρροής των ιστορικών παραμέτρων πραγματοποιείται μέσω των ερευνών της ιστορικής βιογεωγραφίας (Wiley 1988α, 1988b, Morrone & Crisci 1995, Edwards 1996). Οι περισσότερες μελέτες τέτοιου τύπου συγκρίνουν τη γεωγραφική εξάπλωση τάξων στο επίπεδο του είδους ή πάνω από αυτό. Με την ανάπτυξη των μοριακών μεθόδων είναι πλέον εφικτό να διερευνηθούν πρότυπα γεωγραφικής ποικιλότητας με τη χρήση μοριακών δεικτών και να συναχθούν 31

32 Εισαγωγή ενδοειδικά φυλογεωγραφικά πρότυπα. Υπ αυτήν την έννοια, είναι δελεαστικό να εφαρμοστούν οι μέθοδοι της ιστορικής βιογεωγραφίας και κάτω από το επίπεδο του είδους, συγκρίνοντας έτσι ενδοειδικά φυλογεωγραφικά πρότυπα διαφόρων τάξων που εξαπλώνονται στην ίδια περιοχή. Ο κύριος στόχος τέτοιων μελετών είναι η διερεύνηση σύμφωνων προτύπων γεωγραφικής εξάπλωσης μεταξύ γενεαλογικών γραμμών ανάμεσα σε διαφορετικά είδη, τα οποία (γεωγραφικά πρότυπα) θα καταδείκνυαν την επιρροή ενός κοινού ιστορικού παράγοντα (Avise et al. 1987, Taberlet 1998). Τα περισσότερα είδη εμφανίζουν σε κάποιο βαθμό πληθυσμιακή δομή που μπορεί να ερμηνευτεί με γεωγραφικά και χρονολογικά πρότυπα. Κύριοι στόχοι της φυλογεωγραφίας είναι η αποκρυπτογράφηση των χωρικών και χρονικών συνιστωσών της δομής των πληθυσμών και η ερμηνεία των εξελικτικών και οικολογικών διαδικασιών που ευθύνονται για την εκάστοτε δομή (Beheregaray 2008). Η φυλογεωγραφία είναι ένα συνδυαστικό επιστημονικό πεδίο που χρησιμοποιεί τη γενετική πληροφορία προκειμένου να ερευνήσει τη γεωγραφική κατανομή των γενεαλογικών γραμμών (Avise 2000). Με βάση την προσεκτική δειγματοληψία σε άτομα και την προσεκτική επιλογή των γενετικών τόπων, οι φυλογεωγράφοι μπορούν να ελέγξουν βιογεωγραφικές υποθέσεις, να περιγράψουν την εξέλιξη αναπαραγωγικά απομονωμένων πληθυσμών και να καταλήξουν σε συμπεράσματα αναφορικά με την προέλευση, την κατανομή και τη διατήρηση της βιοποικιλότητας. Δεδομένου ότι η δομή των γενεαλογιών των πληθυσμών επηρεάζεται από τη δημογραφική τους ιστορία, μπορούν να διατυπωθούν υποθέσεις και πιθανά σενάρια για τις αλλαγές που συντελούνται συν τω χρόνω στο φυσικό περιβάλλον των πληθυσμών, χρησιμοποιώντας τη σημερινή γενετική τους πληροφορία (Beheregaray 2008). Ως εκ τούτου, η φυλογεωγραφία έχει συνεισφέρει σημαντικά σε πολλά πεδία της βιολογίας και των γεωεπιστημών, όπως η ειδογένεση (Avise et al. 2000, Moritz et al. 2000, 2006, Hewitt 2001, Kohn 2005), η ιστορική βιογεωγραφία (Avise 2000, Riddle & Hafner 2006), η ανθρώπινη εξέλιξη (Torroni et al. 1996, Beaumont 2004, Olivieri 2006, Templeton 2007), η 32

33 Εισαγωγή εξελικτική βιολογία (Avise & Ball 1990, O Brien & Mayr 1991, Riddle 1996, Moritz & Faith 1998, Richards et al. 1998, Eizirik et al. 2001, Fraser & Bernatchez 2001), η μελέτη και η ταξινόμηση της βιοποικιλότητας (Avise & Ball 1990, Tamberlet 1998, Beheregaray & Caccone 2007), η παλαιοοικολογία (Cruzan & Templeton 2000), η παλαιοκλιματολογία (Hewitt 2000) και η ηφαιστειολογία (Emerson 2002, Beheregaray 2003). Οι φυλογεωγραφικές μελέτες έρχονται αντιμέτωπες με δύο βασικές δυσκολίες: την τυχαιότητα των γενετικών διαδικασιών και την ενδεχομένως πολύπλοκη ιστορία των μελετώμενων τάξων (Knowles & Maddison 2002, Knowles 2004). Η ανάλυση και η επεξήγηση της κατανομής των γενεαλογιών απαιτούν συνήθως εκτενή δεδομένα από τη γεωλογία, τη μοριακή και την πληθυσμιακή γενετική, την ηθολογία, τη φυλογένεση, τη δημογραφία, την παλαιοντολογία, τη γεωλογία και την ιστορική γεωγραφία (Avise 2000). Γίνεται κατανοητό, λοιπόν, πως η φυλογεωγραφία εδράζεται σε ένα κρίσιμο σταυροδρόμι μεταξύ μικροεξελικτικών και μακροεξελικτικών αρχών, τις οποίες και προσπαθεί να συγκεράσει. Οι φυλογεωγραφικές μελέτες προσπαθούν να ερμηνεύσουν τον τρόπο και το βαθμό στον οποίο οι διάφορες ιστορικές διαδικασίες που σχετίζονται με τη δημογραφία των πληθυσμών έχουν αφήσει τα εξελικτικά τους αποτυπώματα στη σύγχρονη γεωγραφική κατανομή των γονιδιακών γραμμών των οργανισμών (Avise 2000). Η φυλογεωγραφία καλύπτει ποικίλα εναλλακτικά σενάρια σχετικά με την ερμηνεία των χωρικών διευθετήσεων των οργανισμών και των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. Παραδείγματος χάριν, ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι συχνά ανταγωνιστικοί παράγοντες που καθορίζουν, ο καθένας με τον δικό του τρόπο, την προέλευση του χωρικού διαχωρισμού των ταξινομικών μονάδων. Κατά το βικαριανισμό, οι πληθυσμοί ή άλλες ανώτερες ταξινομικές μονάδες, διαχωρίζονται όταν η λίγο έως πολύ συνεχής κατανομή της προγονικής μορφής κατακερματίζεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως φαινόμενα ορογένεσης, αποχωρισμός ηπειρωτικών μαζών, ευστατικές ή ισοστατικές μεταβολές κτλ. (Croizat 1982, Nelson & Ladiges 1991, Avise 2000). Κατά τη διασπορά, μια ταξινομική μονάδα αποκτά τη σημερινή της κατανομή 33

34 Εισαγωγή μέσω ενεργητικής ή παθητικής διασποράς από ένα ή περισσότερα προγονικά κέντρα προέλευσης (Briggs 1989, 1992, 2000). Ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι ιστορικά φαινόμενα, ο σχετικός ρόλος των οποίων στις διάφορες περιπτώσεις μπορεί να σταθμιστεί στο πλαίσιο της φυλογενετικής ανάλυσης Μοριακοί δείκτες Η φυλογεωγραφία (Avise 2000), αναλύει τη γεωγραφική εξάπλωση των γενεαλογικών γραμμών. Σταθμός στην ανάπτυξή της υπήρξε η μεγάλη ανάπτυξη νέων τεχνικών κατά τη δεκαετία του 1980, η οποία κατέστησε δυνατό τον προσδιορισμό της ποικιλότητας του DNA μεταξύ ατόμων ενός είδους, και με αυτόν τον τρόπο επέτρεψε την ανασύσταση της γενεαλογίας τους. Οι χωρικές σχέσεις τέτοιων γενεαλογιών μπορούν να απεικονιστούν γεωγραφικά και να αναλυθούν προκειμένου να εξαχθεί η εξελικτική ιστορία πληθυσμών, υποειδών και ειδών. Συγκεκριμένα, η δυνατότητα ανάλυσης των μιτοχονδριακών αλληλουχιών τροφοδότησε κατά κύριο λόγο αυτές τις νέες έρευνες. Σήμερα το εύρος των τεχνικών DNA, σε συνδυασμό με άλλες αναλυτικές μεθόδους, καθώς και παλαιοκλιματολογικές και γεωλογικές μελέτες, παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τη γενετική ποικιλότητα και την εξέλιξη των πληθυσμών (Hewitt 2001, Emerson & Hewitt 2005). Οι φυλογενετικές μελέτες που αφορούν σε ζωικούς οργανισμούς ή βασίζονται κυρίως στη μελέτη του μιτοχονδιακού DNA, ενώ αντίστοιχα οι μελέτες που αφορούν σε φυτικούς οργανισμούς από το DNA του χλωροπλάστη (Avise 2000). Και στις δύο περιπτώσεις, ωστόσο, υπάρχει πληθώρα άλλων διαθέσιμων μοριακών δεικτών. Φυλοεξαρτώμενοι δείκτες μπορούν να ανιχνεύσουν τις ιστορικές διαφορές στη δημογραφία μεταξύ των φύλων, πράγμα που, για παράδειγμα, υπήρξε ιδιαίτερα πληροφοριακό στη μελέτη της ανθρώπινης φυλογεωγραφίας. Για ανίχνευση βαθύτερων φυλογενετικών σχέσεων χρειάζονται πιο αργοί μοριακοί δείκτες ενώ, από την άλλη, για πρόσφατα γεγονότα, πιθανότατα μόλις λίγων δεκάδων χιλιάδων ετών, 34

35 Εισαγωγή απαιτούνται αλληλουχίες πιο μεταβλητές ή πιο γρήγορα εξελισσόμενες (Emerson & Hewitt 2005) Το μιτοχρονδιακό DNA Την τελευταία εικοσαετία, οι μιτοχονδριακοί δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε μελέτες που αφορούν στη δομή των πληθυσμών και τη γονιδιακή ροή, τον υβριδισμό, τη βιογεωγραφία και τις φυλογενετικές σχέσεις (Moritz et al. 1987, Avise 2000), αφού το μιτοχονδριακό γονιδίωμα διαθέτει μια σειρά από χαρακτηριστικά που το καθιστούν ιδιαίτερα χρήσιμο σύστημα για την ανίχνευση γενετικών διαφορών σε διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο. To mtdna των ζώων αποτελεί το καλύτερα μελετημένο τμήμα ευκαρυωτικού DNA. Αυτό οφείλεται στην ευκολία απομόνωσής του σε σχέση με οποιοδήποτε τμήμα του πυρηνικού DNA. Η ευκολία αυτή έγκειται στην ασυνήθιστα μικρή πυκνότητά του σε κλίση CsCl, στο μεγάλο αριθμό αντιγράφων του και στην παρουσία του σ ένα οργανίδιο διαφορετικό του πυρήνα. Επιπλέον, εξαιτίας του μικρού μεγέθους του και της απουσίας των πολύπλοκων χαρακτηριστικών του ndna, όπως τα εσώνια, οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, τα μεταθετά στοιχεία, είναι εύκολος ο χαρακτηρισμός του (εύρεση γονιδίων και σειράς αυτών, αλληλούχηση). Από τη μεριά της συγκριτικής ανάλυσης, το mtdna έχει το πλεονέκτημα να υπάρχει σε όλο το ζωικό βασίλειο και να έχει εξαιρετικά παρόμοιο γονιδιακό περιεχόμενο (όλα τα μετάζωα και ορισμένα πρωτόζωα έχουν την ίδια ομάδα 37 γονιδίων) (Wilson et al. 1985). Το περιεχόμενο και το μέγεθος του μορίου έμεινε σχετικά σταθερό για περισσότερο από 800 εκατομμύρια χρόνια, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα χαρακτηριστικά αυτά αποτελούν επιλέξιμο εξελικτικό πλεονέκτημα. 35

36 Εισαγωγή Οι εξελικτικές μεταλλακτικές αλλαγές του ζωικού mtdna είναι σχετικά απλές και είναι κυρίως υποκαταστάσεις βάσεων και μεταλλάξεις μήκους, με τις τελευταίες να συγκεντρώνονται κυρίως στις μικρές μη κωδικές περιοχές. To μόριο του mtdna αποτελεί το πιθανότερο εύρημα σε οργανικά κατάλοιπα ζωικών ειδών που έχουν εξαφανιστεί. Ο μεγάλος αριθμός μορίων ανά κύτταρο σε σχέση με οποιοδήποτε τμήμα του ndna αυξάνουν την πιθανότητα εύρεσης τμημάτων του ικανών για ανάλυση αλληλουχίας (Wilson et al. 1985). Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) εμφανίζει πολλά πλεονεκτήματα τόσο από εξελικτική όσο και από τεχνική άποψη (Hurst & Jiggins 2005), τα οποία μπορούν να συνοψιστούν στα ακόλουθα: 1. Το mtdna εμφανίζεται σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων στα κύτταρα (Futuyma 1991) και ο μητρικός, κυρίως, τρόπος κληρονομικότητας (Zhao et al. 2004) δεν αφήνει περιθώρια για ανασυνδυασμό, με ελάχιστες εξαιρέσεις (Zouros et al. 1994, Ladoukakis & Zouros 2001a,b, Rokas et al. 2003). Έτσι, οι διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται είναι καθαρά αποτέλεσμα μεταλλαγών (Hagelberg et al. 1994, 1999). 2. Είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένο μόριο σε σχέση με το πυρηνικό γονιδίωμα (Hagelberg et al. 1994, 1999) 3. Είναι απλοειδές, οπότε δεν απαιτείται κλωνοποίηση πριν από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας (Hurst & Jiggins 2005). 4. Απουσιάζουν ψευδογονίδια και εσώνια από το μιτοχονδριακό DNA (Avise et al. 1987). 5. Ο γρήγορος ρυθμός εξέλιξης του mtdna το καθιστά πολύτιμο εργαλείο για εξελικτικές και φυλογενετικές μελέτες τόσο στο διαειδικό όσο και στο ενδοειδικό επίπεδο (Avise et al. 1987). Ο ρυθμός εξέλιξης, βέβαια, δεν είναι σταθερός για όλες τις ομάδες οργανισμών. Μέχρι σήμερα έχουν διατυπωθεί διάφορες υποθέσεις για την ερμηνεία των διαφορών που παρατηρούνται στον ρυθμό αντικατάστασης μεταξύ των διαφόρων εξελικτικών γραμμών. Οι παράγοντες που συχνά επιστρατεύονται για τον σκοπό αυτό, διακρίνονται σε 2 κατηγορίες: 36

37 Εισαγωγή 1. Τους εξαρτώμενους από τη γενεά, όπως η διάρκεια γενεάς, η αδυναμία επιδιόρθωσης λαθών κατά την αντιγραφή (που οδηγεί στη συσσώρευση μεταλλάξεων) και 2. Τους ανεξάρτητους από τη γενεά, όπως ο μεταβολικός ρυθμός (τα εξώθερμα έχουν χαμηλότερο ρυθμό από τα ενδόθερμα) και το μέγεθος του σώματος. Ωστόσο υπάρχουν και τα μειονεκτήματα της χρήσης του mtdna, τα οποία συνοψίζονται ακολούθως: 1. Η πλαστικότητα στην οργάνωση αλλά και στους τρόπους αλληλεπίδρασης με το συνεξελισσόμενο ndna μέσω της μεγάλης ποικιλομορφίας των κύριων μη κωδικών και άλλων ρυθμιστικών περιοχών (Saccone et al. 1999, 2000, 2002). 2. Η ετεροπλασμία, δηλαδή η πιθανή πατρική κληρονόμηση ή κάποια μετάλλαξη η οποία μπορεί να δημιουργήσει ή να αυξήσει την πιθανότητα της παρουσίας δυο ή περισσότερων γενοτύπων σ ένα άτομο (Avise 2000). 3. Η ομοπλασία. Ένας ιδανικός μοριακός χαρακτήρας δεν ακολουθεί αντίστροφη, παράλληλη ή συγκλίνουσα εξέλιξη. Δυστυχώς το mtdna δεν ικανοποιεί αυτή τη συνθήκη αφού σε διάφορες μελέτες εμφανίζονται να «ενεργοποιούνται» και να «απενεργοποιούνται» πολυάριθμες θέσεις περιορισμού κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, φαινόμενο που πιθανόν οφείλεται σε παροδικές μεταπτώσεις νουκλεοτιδίων. Αν ορισμένες θέσεις του mtdna θεωρηθούν χαρακτήρες και οι εξελικτικές αλλαγές στις θέσεις αυτές είναι ιδιαίτερα γρήγορες σε σχέση με τον χρόνο διαχωρισμού των εξεταζόμενων τάξων, τότε ο μικρός αριθμός εναλλακτικών χαρακτήρων που ενδεχομένως εμφανίζονται οφείλεται σε ομοπλαστικές αλλαγές. 37

38 Εισαγωγή 4. Η χρονική κλίμακα. Ορισμένες νουκλεοτιδικές θέσεις στο mtdna είναι εξελικτικά περισσότερο ευμετάβλητες σε σχέση με άλλες, πιθανόν εξαιτίας χαλαρότερων επιλογικών πιέσεων. 5. Ενσωμάτωση του mtdna στο πυρηνικό γονιδίωμα. Οι περιοχές που ενσωματώνονται συχνότερα είναι εκείνες που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Cytb, COI, COII) και rrna, μη κωδικές περιοχές δηλαδή περιοχές που «χρησιμοποιούνται» περισσότερο από το mtdna. Oι ενσωματωμένες περιοχές εμφανίζουν ποικίλο βαθμό ομολογίας με τα μιτοχονδριακά τους αντίστοιχα, ανάλογα με το τάξον και την περιοχή που έχει ενσωματωθεί στον πυρήνα. Οι ενσωματωμένες στον πυρήνα περιοχές, ευρισκόμενες κάτω από διαφορετικούς μεταλλακτικούς περιορισμούς, εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα εξέλιξης σε σχέση με τις αυθεντικές μιτοχονδριακές αλληλουχίες. Χαρακτηριστικά, όπως η μεταλλακτική πιέση στα μιτοχόνδρια, δεν ισχύουν στα πυρηνικά αντίγραφα. Γενικά, οι μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενσωματωμένες περιοχές συμπεριφέρονται ως μοριακά «απολιθώματα», εξελισσόμενες με πολύ βραδύτερο ρυθμό σε σχέση με τα μιτοχονδριακά τους ομόλογα, και ότι βρίσκονται πλησιέστερα στις προγονικές μορφές των ομολόγων αυτών σε νουκλεοτιδικό επίπεδο (Zhang & Hewitt 1996) Πυρηνικοί δείκτες Τα πυρηνικά γονίδια χρησιμοποιούνται τα τελευταία χρόνια ως μοριακοί δείκτες για φυλογενετικές μελέτες, συνήθως σε συνδυασμό με μιτοχονδριακά γονίδια. Οι γενετικοί τόποι που αρχικά χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ριβοσωμικά γονίδια που κωδικοποιούν τη μεγάλη (28S) και τη μικρή υπομονάδα (18S) του ριβοσώματος, τα οποία αξιοποιήθηκαν κυρίως για την επίλυση των φυλογενετικών σχέσεων σε ανώτερες ταξινομικές βαθμίδες (Olsen 38

39 Εισαγωγή & Woese 1993). Καθώς όμως η στοίχιση αυτών των γονιδίων αποδεικνύεται ιδιαίτερα δύσκολη και αμφιλεγόμενη, σε κάποιες περιπτώσεις τα τελευταία χρόνια επιλέγονται πυρηνικά γονίδια τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Steppan et al. 2004). Αυτοί οι γενετικοί τόποι έχουν το πλεονέκτημα της πολύ ευκολότερης στοίχισης και επιπλέον διαφέρουν μεταξύ τους στους εξελικτικούς ρυθμούς με αποτέλεσμα να μπορούν να αξιοποιηθούν για την επίλυση σχέσεων σε διαφορετικά ταξινομικά επίπεδα. Ωστόσο και στους πυρηνικούς δείκτες εμφανίζονται μειονεκτήματα: Ο χαμηλός αριθμός αντιγράφων σε σύγκριση με τα ριβοσωμικά πυρηνικά και τα μιτοχονδριακά γονίδια που μπορεί να οδηγήσει σε προβλήματα στον πολλαπλασιασμό του επιθυμητού γονιδίου μέσω της PCR. Ο εκφυλισμός της τρίτης θέσης στα κωδικόνια, που δυσκολεύει το σχεδιασμό εκκινητών. Το μεγάλο μήκος των εσωνίων που μπορεί να καταστήσει εξαιρετικά δύσκολο ή ακόμα και αδύνατο τον πολλαπλασιασμό (PCR) του επιθυμητού γονιδίου. Η εξαγωγή φυλογεωγραφικών συμπερασμάτων βασίζεται στη μελέτη της αναδομημένης γενεαλογικής ιστορίας των γονιδίων (γονιδιακών δένδρων) από διαφορετικούς πληθυσμούς. Επειδή όμως στο παρελθόν είναι δυνατόν να έχουν λάβει χώρα πολλά γεγονότα, όπως επέκταση πληθυσμών, φαινόμενα στενωπού, μετανάστευση κτλ, και πολλές γενεαλογικές γραμμές ενδέχεται να έχουν χαθεί τυχαία, η ιστορία των ειδών πιθανότατα να μην ταυτίζεται με την ιστορία του γονιδιακού δένδρου. Με άλλα λόγια ένα δέντρο βασισμένο σε ένα γονίδιο (gene tree) δεν αντιστοιχεί στο πραγματικό δέντρο των ειδών αλλά αποδίδει την εξελικτική πορεία/ιστορία αυτού του γονιδίου. Για το λόγο αυτόν, και για να αποφευχθεί η εξαγωγή λανθασμένων συμπερασμάτων, απαιτείται ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων των υπό εξέταση ταξινομικών μονάδων να βασίζεται, όχι σε ένα, αλλά σε περισσότερα γονίδια. Κάθε αλληλουχία DNA έχει τη δική της γενεαλογία και η εξελικτική ιστορία κάθε οργανισμού είναι το σύνολο των διαφορετικών γονιδιακών γενεαλογιών. 39