ΑΣΚΗΣΗ: MΕΤΡΗΣΗ ΜΕΤΑΣΥΝΑΠΤΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΣΕ ΤΟΜΕΣ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ.

Transcript

1 ΑΣΚΗΣΗ: MΕΤΡΗΣΗ ΜΕΤΑΣΥΝΑΠΤΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΣΕ ΤΟΜΕΣ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ. Η μετάδοση σημάτων μεταξύ των νευρώνων επιτυγχάνεται μέσω χημικών συνάψεων. Κατά τη χημική συναπτική διαβίβαση απελευθερώνεται από τον προσυναπτικό νευρώνα ο νευροδιαβιβαστής ο οποίος στη συνέχεια διαχέεται στη συναπτική σχισμή και προσδένεται σε υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης. Χαρακτηριστικό είναι ότι ο υποδοχέας, και όχι ο διαβιβαστής, είναι εκείνος που καθορίζει το κατά πόσον η συναπτική απόκριση είναι διεγερτική ή ανασταλτική. Διάφορα αμινοξέα έχουν αναγνωρισθεί ως υποψήφιοι νευροδιαβιβαστές στο κεντρικό νευρικό σύστημα, ΚΝΣ. Με βάση νευροφυσιολογικές μελέτες έχουν διακριθεί σε δύο κατηγορίες: τα διεγερτικά και τα ανασταλτικά. Τα κυριότερα διεγερτικά αμινοξέα είναι το γλουταμινικό και το ασπαραγινικό οξύ (ασπαρτικό οξύ), ενώ τα κυριότερα ανασταλτικά αμινοξέα είναι το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) και η γλυκίνη. Υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος Οι υποδοχείς γλουταμινικού χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τους υποδοχείς που ελέγχουν άμεσα διαύλους ιόντων (ιοντοτρόποι υποδοχείς) και τους υποδοχείς που ελέγχουν τους διαύλους έμμεσα, με τη βοήθεια δεύτερων αγγελιοφόρων (μεταβολοτρόποι υποδοχείς). Οι ιοντοτρόποι υποδοχείς γλουταμινικού ταξινομούνται περαιτέρω σε δύο μεγάλες υποομάδες, τους υποδοχείς NMDA και τους υποδοχείς μη NMDA, ανάλογα με τους αγωνιστές που τους ενεργοποιούν και τους ανταγωνιστές που τους αναστέλλουν. Ιοντοτρόποι υποδοχείς NMDA υποδοχείς Οι υποδοχείς NMDA ενεργοποιούνται από το ανάλογο αμινοξέος NMDA (Nmethyl-D-aspartate) και η δράση τους αναστέλλεται από τη φαρμακευτική ουσία 2- αμινο-5-φωσφονοβαλερικό οξύ (2-amino-phosphono-valeric acid, APV). O υποδοχέας NMDA αναστέλλεται επίσης από την ψευδαισθησιογόνο φαρμακευτική ουσία φαινοκυκλιδίνη (1-phenyl-1-cyclohexylpiperidine, PCP, γνωστή και ως «αγγελόσκονη»), καθώς επίσης και από τον ανταγωνιστή ΜΚ801. Οι δύο αυτές

2 ουσίες προσδένονται σε μία θέση η οποία βρίσκεται στο εσωτερικό του διαύλου. Οι υποδοχείς τύπου NMDA κατανέμονται ευρύτατα στο ΚΝΣ, ιδιαίτερα στον ιππόκαμπο, στα βασικά γάγγλια, στο έξω διάφραγμα και στο φλοιό. Ο υποδοχέας NMDA εμφανίζει τέσσερις χαρακτηριστικές ιδιότητες: α) ο υποδοχέας συνιστά έναν δίαυλο κατιόντων μεγάλης αγωγιμότητας, ο οποίος είναι διαπερατός από τα Ca 2+, Na + και K +, β) η είσοδος Ca 2+ διά μέσου του υποδοχέα-διαύλου που διεγείρεται από το NMDA θεωρείται ότι ενεργοποιεί ενδοκυττάρια ασβεστιοεξαρτώμενους «καταρράκτες» δεύτερων μηνυμάτων οι οποίοι εκκινούν βιοχημικές μεταβολές και συμβάλλουν σε ορισμένες μορφές μακροχρόνιας συναπτικής ενδυνάμωσης, γ) ο δίαυλος λειτουργεί μόνο παρουσία γλυκίνης, δ) ο δίαυλος είναι μοναδικός μέχρι τώρα, ανάμεσα στους διαύλους που ελέγχονται από διαβιβαστές, διότι ελέγχεται ταυτόχρονα από το γλουταμινικό οξύ και από την τάση του ρεύματος. Στο δυναμικό ηρεμίας (-65mV), η είσοδος του διαύλου NMDA φράσσεται από ένα ιόν Mg 2+ του εξωκυττάριου χώρου. Όταν όμως η μεμβράνη εκπολώνεται, παρουσία γλουταμινικού, το Mg 2+ εκτινάσσεται από το στόμιο του διαύλου με ηλεκτροστατική απώθηση, επιτρέποντας την είσοδο Ca 2+ και Na +. Έτσι, η ροή ιόντων διά μέσου του διαύλου είναι μέγιστη παρουσία γλουταμινικού οξέος και ταυτόχρονης εκπόλωσης του κυττάρου. Οι νευρώνες εμφανίζουν υποδοχείς γλουταμινικού οξέος τύπου NMDA και μη- NMDA. Η παρουσία Mg 2+ στο εσωτερικό του υποδοχέα-διαύλου που ενεργοποιείται από το NMDA εμποδίζει την διάνοιξη του διαύλου με αποτέλεσμα αυτός να μην συνεισφέρει σημαντικά στο μετασυναπτικό διεγερτικό δυναμικό (EPSP). Έτσι, το EPSP που παράγεται στο δυναμικό ηρεμίας οφείλεται κυρίως στην ενεργοποίηση των μη-nmda υποδοχέων. Ωστόσο, καθώς αυξάνεται η εκπόλωση του νευρώνα, το Mg 2+ απομακρύνεται από το στόμιο των διαύλων NMDA, ο δίαυλος ενεργοποιείται και άγονται ιόντα Ca 2+ και Na +. Κατά συνέπεια, το EPSP που παράγεται στο εκπολωμένο δυναμικό οφείλεται στην ενεργοποίηση όχι μόνο των διαύλων μη-nmda αλλά και των διαύλων NMDA.

3 μη-nmda υποδοχείς Οι μη- NMDA υποδοχείς ενεργοποιούνται από τις φαρμακευτικές ουσίες α- αμινο-3-υδροξυ-5-μεθυλο-ισοξαζολο-προπιονικό οξύ (α-amino-3-hydroxy-5-methyl- 4-isoxazolepropionic acid, AMPA), καϊνικό οξύ και κισκαλικό οξύ, ενώ η δράση τους αναστέλλεται από την 6-κυανο-7-νιτροκινοξαλινο-2,3-διόνη (6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-dione, CNQX). Οι υποδοχείς AMPA κατανέμονται επίσης ευρύτατα στο νευρικό σύστημα, στις ίδιες περιοχές με τους NMDA υποδοχείς. Πρόκειται για ιοντοτρόπους υποδοχείς οι οποίοι ελέγχουν διαύλους Na +. Έτσι, εμπλέκονται στην ανάπτυξη ιδιαίτερα ταχέων εκπολώσεων όταν συνδεθεί με αυτούς γλουταμινικό οξύ. Οι υποδοχείς μη-nmda ελέγχουν έναν δίαυλο κατιόντων μικρής σχετικά αγωγιμότητας ο οποίος είναι διαπερατός τόσο από τα Na + όσο και από τα K +, ενώ οι περισσότεροι υποδοχείς μη-nmda δεν είναι διαπερατοί από τα Ca 2+. Στο δυναμικό ηρεμίας οι υποδοχείς μη-nmda αποτελούν την κυρίαρχη συνιστώσα του EPSP στους νευρώνες. Μεταβολοτρόποι υποδοχείς Οι μεταβολοτρόποι υποδοχείς γλουταμινικού ενεργοποιούνται από το 1- αμινοκυκλοπεντανο-1,3-δικαρβοξυλικό οξύ (1-Amino-1,3-dicarboxycyclopentane, ACPD). Διαθέτουν επτά διαμεμβρανικές περιοχές και η διέγερση τους ενεργοποιεί συστήματα μεταγωγής σήματος, ιδιαίτερα της φωσφολιπάσης C. Παρόλα αυτά, η διέγερσή τους προκαλεί βραδείες αλλαγές της ιοντικής αγωγιμότητας, που προφανώς πρέπει να είναι αποτέλεσμα της ενεργοποίησης της φωσφολιπάσης C. Εντοπίζονται σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου, ιδιαίτερα στους οσφρητικούς βολβούς, στον ιππόκαμπο, στην ωχρά σφαίρα, στο θάλαμο, στη μέλαινα ουσία, στα άνω διδύμια και στην παρεγκεφαλίδα. Υποδοχείς του γ-αμινοβουτυρικού οξέος Το GABA αποτελεί τον κύριο ανασταλτικό νευροδιαβιβαστή στο νευρικό σύστημα των θηλαστικών. Ασκεί τις επιδράσεις του μέσω δύο υποδοχέων: τους GABA Α και GABA Β υποδοχείς.. Ο υποδοχέας GABA Α είναι ένας ιοντοτρόπος υποδοχέας και ελέγχει έναν δίαυλο Cl -. Ο GABA Α υποδοχέας αποτελείται από πέντε υποομάδες πρωτεϊνών, οι οποίες σχηματίζουν ένα σύμπλοκο. Μία από τις υπομονάδες του συμπλόκου έχει μία ειδική θέση δέσμευσης για το GABA. Στις

4 υπόλοιπες τέσσερις υπομονάδες δεσμεύονται τα βαρβιτουρικά, οι βενζοδιαζεπίνες, η πικροτοξίνη και ορισμένα στεροειδή. Η μπικουκουλίνη αναστέλλει συναγωνιστικά τον υποδοχέα GABA Α, ενώ η πικροτοξίνη αναστέλλει τον υποδοχέα μη συναγωνιστικά εμποδίζοντας τη ροή ιόντων Cl - διαμέσου του ιοντικού διαύλου. O υποδοχέας GABA Β είναι μεταβολοτρόπος και ενεργοποιεί έναν «καταρράκτη» δεύτερου αγγελιοφόρου, ο οποίος τελικά ενεργοποιεί έναν δίαυλο Κ +. Ο GABA Β υποδοχέας αναστέλλεται από τους ανταγωνιστές φακλοφαίνη και CGP Το GABA συντίθεται με μία απλή αντίδραση από το γλουταμινικό οξύ και αποθηκεύεται σε κυστίδια. Η απελευθέρωσή του ρυθμίζεται από αυτοϋποδοχείς που βρίσκονται στην προσυναπτική μεμβράνη και ανήκουν στους GABA Β υποδοχείς. Υποδοχείς Αγωνιστές Ανταγωνιστές ΝΜDA 1.Κεταμίνη 2.PCP 3.ΜΚ801 4.APV Μη-NMDA 1.AMPA 2.καϊνικό οξύ 3.κισκαλικό οξύ CNQX Μεταβολοτρόποι ACPD (1-αμινοκυκλοπεντανο-1,3- δικαρβοξυλικό οξύ) GABA A 1. GABA A 2.βενζοδιαζεπίνες 3.βαρβιτουρικά 4.πικροτοξίνη 5.στεροειδή Μπικουκουλίνη GABA B GABA B 1.CGP Φακλοφαίνη 3. CGP55845 Πίνακας. Οι κυριότεροι υποδοχείς γλουταμινικού οξέος και GABA του ιπποκάμπου και οι ουσίες οι οποίες τους διεγείρουν και τους αναστέλλουν.

5 Ενδοκυττάριες καταγραφές από πυραμιδικούς νευρώνες ιπποκάμπου. Τα πειραματόζωα (αρσενικοί επίμυες Wistar) τοποθετούνται σε αεροστεγή θάλαμο και αναισθητοποιούνται με χορήγηση αιθέρα. Εν συνεχεία, το ζώο θυσιάζεται, το κρανίο διανοίγεται και αποκαλύπτεται ο εγκέφαλος του ζώου. Αφού αφαιρεθούν οι μήνιγγες ο εγκέφαλος ανασηκώνεται, και αφού αποκοπούν τα υποκείμενα οπτικά νεύρα αφαιρείται από το κρανίο και τοποθετείται σε κρύο τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΤΕΝΥ) που συνεχώς οξυγονώνεται με μείγμα αεριού σύστασης 95% Ο2-5% CO2. Κατόπιν, αποχωρίζεται ο ιπποκάμπειος σχηματισμός, και των δύο ημισφαιρίων, από τις περιβάλλουσες δομές και εν συνεχεία τοποθετείται στη έδρα μικροτόμου όπου και λαμβάνονται εγκάρσιες τομές, τόσο από τη ραχιαία όσο και από την κοιλιακή μοίρα, πάχους 500 μm κατά μήκος του επιμήκους άξονά του (Εικόνα 1). Οι τομές, μεταφέρονται στο λουτρό καταγραφής όπου εναποτίθενται σε ειδικό φίλτρο χαρτιού προκειμένου να συγκρατούνται οι τομές στη βάση του λουτρού κατά τη διάρκεια του πολύωρου πειράματος. Οι τομές επωάζονται σε ατμόσφαιρα κορεσμένη σε Ο 2 και θερμοκρασία 33 ο C για τουλάχιστον 1h, ενώ παράλληλα διαβρέχονται συνεχώς από οξυγονωμένο ΤΕΝΥ. Eικόνα 1.

6 Ηλεκτρόδιο καταγραφής: Ηλεκτρόδιο διέγερσης Εικόνα 2. Ενδοκυττάρια καταγραφή από πυραμιδικό νευρώνα. Μartin & Kosik, Εικόνα 3. Διεγερτικά και ανασταλτικά μετασυναπτικά δυναμικά. A. υποδουδικό μετασυναπτικό δυναμικό που όταν ενισχυθεί προκαλεί δυναμικό ενέργειας. Β. ανασταλτικά μετασυναπτικά δυναμικά. Στην εικόνα 2 παρουσιάζεται σχηματικά ο τρόπος ενδοκυττάριας καταγραφής από ένα διεγερτικό (πυραμιδικό) νευρώνα της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου μετά

7 από διέγερση των παράπλευρων ινών του Schaffer (ηλεκτρόδιο διέγερσης). Η καταγραφή αποδίδεται από την κυματομορφή της εικόνας 3. Όπως προκύπτει και από την εικόνα αρχικά προηγείται υποουδική μετασυναπτική διέγερση του νευρώνα (excitatory postsynaptic potential, EPSP) που οδηγεί στη δημιουργία δυναμικού ενέργειας (εικόνα 3α). Το δυναμικό ενέργειας ακολουθείται από υπερπόλωση της μεμβράνης που διακρίνεται σε δύο φάσεις: μία γρήγορη (fast inhibitory postsynaptic potential, f-ipsp) και μία αργή (slow inhibitory postsynaptic potential, s-ipsp) (εικόνα 3β). Το διεγερτικό μετασυναπτικό δυναμικό οφείλεται στην έκλυση γλουταμινικού οξέος που προκαλείται από την ηλεκτρική διέγερση των ινών Schaffer. Το γλουταμινικό οξύ εν συνεχεία ενεργοποιεί γλουταμινεργικούς υποδοχείς επί των πυραμιδικών κυττάρων. Τα ανασταλτικά δυναμικά οφείλονται στην έκλυση του νευροδιαβιβαστή γ-αμινοβουτυρικό (GABA) από ενδονευρώνες της CA1 περιοχής που επίσης διεγείρονται από παράπλευρες ίνες της οδού Schaffer (εικόνα 4). Στη συνέχεια, οι GABAεργικοί νευρώνες εκλύουν GABA το οποίο δεσμεύεται σε εξειδικευμένους υποδοχείς επί των πυραμιδικών κυττάρων. Εικόνα 4. Διέγερση των αξόνων των παράπλευρων ινών Schaffer προκαλεί έκλυση γλουταμινικού οξέος και διέγερση τόσο πυραμιδικών νευρώνων (μαύρο) όσο και ενδονευρώνων (μπλε). Οι ενδονευρώνες στη συνέχεια εκλύουν GABA. 1. Shepherd G.M. (1998). The Synaptic Organization of the Brain. 4 th Edition, Oxford University Press. 2. Kandel E.R., Schwartz J.H., Jessel T.M., (1997). Νευροεπιστήμη και Συμπεριφορά. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης.

8 Στην παρούσα άσκηση θα χρησιμοποιήσετε το πρόγραμμα ανάλυσης κυματομορφών PCLAMP Θα σας δοθούν αρχεία ηλεκτροφυσιολογικών καταγραφών από πυραμιδικούς νευρώνες της CA1 περιοχής εγκεφάλου αρουραίου, παρουσία ανταγωνιστών διαύλων. Θα κληθείτε να μετρήσετε το πλάτος διεγερτικών και ανασταλτικών μετασυναπτικών καταγραφών, να κατασκευάσετε καμπύλες εισόδου-εξόδου και απαντήσετε σε ερωτήσεις που αφορούν την επίδραση συγκεκριμένων φαρμάκων στη μορφολογία των συναπτικών απαντήσεων.