Εργαστηριακή άσκηση 1: Διαχωρισμός λεμφοκυττάρων στο ολικό αίμα

Transcript

1 Εργαστηριακή άσκηση 1: Διαχωρισμός λεμφοκυττάρων στο ολικό αίμα Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

2 Εισαγωγή

3 Περιφερικό αίμα Το περιφερικό αίμα είναι το υγρό που κυκλοφορεί στο αγγειακό σύστημα το οποίο συνίσταται απο αρτηρίες, φλέβες και αιμοφόρα τριχοειδή. Ο ρόλος του αίματος ως μεταφορέας και ως ρυθμιστής της ομοιόστασης - Μεταφέρει οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες προς τα κύτταρα και τους ιστούς - Μεταφέρει διοξείδιο του άνθρακα και άχρηστα προϊόντα μακριά από τα κύτταρα/όργανα - Διανέμει ορμόνες, ένζυμα και βιταμίνες στα όργανα-στόχο - Ρυθμίζει τη θερμοκρασία του σώματος - Διατηρεί την οξεοβασική ισορροπία - Προστατεύει τον οργανισμό από την απώλεια αίματος διαμέσου του μηχανισμού της πήξης - Προστατεύει τον οργανισμό απο την εισβολή παθογόνων ουσιών διαμέσου της ανοσολογικής απόκρισης

4 Αιμοποίηση Όλοι οι κυτταρικοί πληθυσμοί του αίματος προέρχονται από αρχέγονα προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών, τα πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα (Pluripotent Hematopoietic Stem Cells). Τα πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα αυτοανανεώνονται και διαφοροποιούνται σε προγονικά κύτταρα της μυελικής και της λεμφικής σειράς (Common Myeloid Progenitors-CMP, Common Lymphoid Progenitors-CLP), δηλαδή κύτταρα που έχουν δεσμευτεί προς μια κατεύθυνση διαφοροποίησης και έχουν χάσει τη δυνατότητα αυτοανανέωσης.

5 Σύσταση του αίματος Το αίμα αποτελεί περίπου το 7% του βάρους του ανθρώπινου σώματος. Πχ. ένας ενήλικας άνδρας 70 κιλών έχει συνολικό όγκο αίματος 5-6 λίτρα Το αίμα συνίσταται απο το πλάσμα (άμορφο συστατικό) και τα έμμορφα κυτταρικά στοιχεία (ερυθροκύτταρα ή ερυθρά αιμοσφαίρια, λευκοκύτταρα ή λευκά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια) Τα έμμορφα συστατικά αποτελούν το 45% του όγκου του κυκλοφορούντος αίματος Λευκωματίνη, ινωδογόνο, ανοσοσφαιρίνες, λιπίδια, ορμόνες, βιταμίνες και άλατα <1% του συνολικού όγκου του αίματος 44% του συνολικού όγκου του αίματος <1% του συνολικού όγκου του αίματος. Πέντε διαφορετικοί κυτταρικοί τύποι

6 Έμμορφα συστατικά του αίματος Eρυθρά αιμοσφαίρια ή ερυθροκύτταρα (RBC): δίνουν στο αίμα το χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα του μέσω της αιμοσφαιρίνης που περιέχουν. Η λειτουργία τους αφορά τη διατήρηση των ιστών στη ζωή, καθώς μεταφέρουν σε αυτούς οξυγόνο από τους πνεύμονες και απομακρύνουν το διοξείδιο του άνθρακα προς την αντίθετη κατεύθυνση. Ο μέσος όρος ζωής τους είναι 120 ημέρες. Αμφίκοιλοι δίσκοι διαμέτρου 8 μm και πάχους 2 μm Δεν έχουν πυρήνα Λευκά αιμοσφαίρια, λευκοκύτταρα ή κοκκιοκύτταρα (WBC): είναι άχρωμα ή λευκού χρώματος κύτταρα. Η λειτουργία τους αφορά την άμυνα και την καταπολέμηση των λοιμώξεων μέσω της επίθεσης και της καταστροφής επιβλαβών ξένων ουσιών. Σφαιρικό σχήμα διαμέτρου 7-21 μm Έχουν πυρήνα Αιμοπετάλια ή θρομβοκύττρα (PLT): είναι κυτταρικά θραύσματα. Η λειτουργία τους την πήξη του αίματος και την αιμόσταση. Αριθμούν ανά κυβικό χιλιοστό αίματος. Ο μέσος όρος ζωής τους είναι 5-7 ημέρες. Σφαιρικό σχήμα μήκους 2-4 μm Δεν έχουν πυρήνα

7 Μονοκύτταρα Τύποι λευκοκυττάρων Υπάρχουν 5 κύριες κατηγορίες λευκοκυττάρων με διακριτό ρόλο: τα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και βασεόφιλα, τα μονοκύτταρα και τα λεμφοκύτταρα. Τα ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και βασεόφιλα είναι κοκκιώδη κύτταρα ενώ τα μονοκύτταρα και τα λεμφοκύτταρα, μη κοκκιώδη. Τα μονοπύρηνα αποτελούν το 3-8% των λευκών αιμοσφαιρίων, έχουν μέγεθος mm και σχήμα σφαιρικό, μοιάζουν πολύ με τα μεγάλα λεμφοκύτταρα από τα οποία διακρίνονται από το αφθονότερο κυτταρόπλασμα και τον κάπως μικρότερο πυρήνα. Τα ηωσινόφιλα έχουν ένα δίλοβο πυρήνα, είναι μεγαλύτερα από τα ουδετερόφιλα (διάμετρος 9μm στο αίμα και έως 14μm στο συνδετικό ιστό) και αναγνωρίζονται από τα μεγάλα επιμηκυσμένα ειδικά κοκκία που χρωματίζονται έντονα ερυθρά με την ηωσίνη. Φέρουν μικρή συσκευή Golgi, λίγα μιτοχόνδρια και κοκκία γλυκογόνου. Ηωσινόφιλα Λεμφοκύτταρα Βασεόφιλα Ουδετερόφιλα Τα βασεόφιλα είναι τα λιγότερα συνήθη λευκοκύτταρα κι αποτελούν λιγότερο από το 1% των λευκοκυττάρων στο περιφερικό αίμα. Το χαρακτηριστικό τους στοιχείο είναι τα μεγάλα έντονα βασεόφιλα κοκκία που χρωματίζονται μεταχρωματικά με τις βασικές χρωστικές (έντονο ερυθρόπορφυρό χρώμα) και επισκιάζουν το πυρήνα, ο οποίος είναι διαιρεμένος σε ακανόνιστους λοβούς (συνήθως δίλοβος) και φέρει έντονα συμπυκνωμένη χρωματίνη. Τα ουδετερόφιλα είναι τα περισσότερα από τα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα. Το ώριμο ουδετερόφιλο έχει διάμετρο 10-12μm, ένα χαρακτηριστικό πολύλοβο πυρήνα και κυτταρόπλασμα με πολλά κοκκία, λίγα μιτοχόνδρια, υπολειμματικά στοιχεία της συσκευής Golgi, στοιχειώδες αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο

8 Λεμφοκύτταρα Συμμετέχουν ενεργά στην ανοσολογική απόκριση Β κύτταρα Πλασματοκύτταρα Β κύτταρα μνήμης Παραγωγή στο μυελό των οστών Διαφοροποίηση στο μυελό των οστών Χυμική ανοσία Λεμφοκύτταρα Τ κύτταρα Τ βοηθητικά κύτταρα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα Παραγωγή στο μυελό των οστών Διαφοροποίηση στο θύμο αδένα Κυτταρική ανοσία Τ κύτταρα μνήμης Τα κύτταρα φυσικοί φονείς (natural killers = NK) είναι ένας υποπληθυσμός των λεμφοκυττάρων, ο οποίος αποτελεί το 5-10% των περιφερικών λεμφοκυττάρων του αίματος. Διακρίνεται τόσο από τα Τ όσο και από τα Β λεμφοκύτταρα με βάση τη μορφολογία τους (χαρακτηρίζονται ως μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα: large granulocytes lymphocytes = LGL)

9 Β-Λεμφοκύτταρα Τα Β-λεμφοκύτταρα είναι τα κύτταρα του οργανισμού που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των αντισωμάτων (ανοσοσφαιρινών). Οφείλουν το όνομά τους στο γεγονός ότι στα πτηνά διαφοροποιούνται σε ένα όργανο που ονομάζεται θύλακος του Fabricious (Bursa of Fabricious). Στον άνθρωπο δεν υπάρχει αντίστοιχο όργανο, αλλά η διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων γίνεται στο μυελό των οστών. Κάθε Β-λεμφοκύτταρο φέρει στην επιφάνειά του έναν υποδοχέα (BCR) που είναι εξειδικευμένος για τη σύνδεσή με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο Όταν το Β-λεμφοκύτταρο έλθει σε επαφή με το αντίστοιχο αντιγόνο, δίνεται το έναυσμα για τη διαφοροποίηση του σε πλασματοκύτταρο, ενός κυττάρου δηλαδή ικανού για την έκκριση ανοσοσφαιρινών. Τα πλασματοκύτταρα βρίσκονται στο τελικό στάδιο ωρίμανσης και δεν διαιρούνται. Επίσης παράγονται και Β-κύτταρα μνήμης που έχουν μεγαλύτερη διάρκεια ζωής από τα παρθένα κύτταρα και εκφράζουν τις ίδιες μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες με το πατρικό τους κύτταρο

10 Τ-Λεμφοκύτταρα Τα Τ-λεμφοκύτταρα κατέχουν κεντρικό ρόλο στην ανοσολογική απόκριση του οργανισμού στα ξένα αντιγόνα. Οφείλουν το όνομά τους στο γεγονός ότι διαφοροποιούνται στο θύμο αδένα (Thymus). Κάθε T-λεμφοκύτταρο φέρει στην επιφάνειά του έναν υποδοχέα (TCR) που είναι εξειδικευμένος για τη σύνδεσή με συγκεκριμένα αντιγόνα. που είναι συνδεδεμένα με μεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες ονομάζονται μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibility Complex (MHC) molecules). Τα μόρια MHC που συμμετέχουν στη διαδικασία αναγνώρισης του αντιγόνου, που ονομάζεται αντιγονοπαρουσίαση (antigen presentation), είναι γενετικά ποικιλόμορφες (πολυμορφικές) γλυκοπρωτεΐνες, που βρίσκονται στις κυτταρικές μεμβράνες Η επαφή του Τ-λεμφοκυττάρου με το αντίστοιχο για αυτό αντιγόνο δίνει το έναυσμα για τον πολλαπλασιασμό του και την έκκριση ουσιών που ονομάζονται κυτταροκίνες. Από τον πολλαπλασιασμό του Τ-λεμφοκυττάρου προκύπτουν και τα αντίστοιχα κύτταρα μνήμης, που θα επιτρέψουν την ταχύτερη ανοσολογική απάντηση, σε μελλοντική έκθεση του οργανισμού στο ίδιο αντιγόνο.

11 Μέθοδοι μελέτης του αίματος Το αίμα εξετάζεται με τη μελέτη ενός πολύ λεπτού επιχρίσματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Οι κύριες χρώσεις που χρησιμοποιούνται είναι οι Leishman, Wright και Giemsa οι οποίες είναι γνωστές ως χρωστικές τύπου Romanovsky. Οι παραπάνω χρώσεις αποτελούνται από κυανό του μεθυλενίου (βασική χρωστική), τα προϊόντα οξείδωσης του κυανού του μεθυλενίου που ονομάζονται αζούρια (βασική χρωστική) και ηωσίνη (όξινη χρωστική).

12 Μέτρηση του αριθμού των λεμφοκυττάρων Επίστρωση στην πλάκα Neubauer (ειδική μικροσκοπική αντικειμενοφόρος, η οποία διαιρείται σε τετράγωνα καθορισμένης περιοχής) Μέτρηση του αριθμού των λεμφοκυττάρων στο μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας φακό Χ40 Μέτρηση του αριθμού κυττάρων σε κάθε πεδίο ανάγεται σε συγκέντρωση (μέσος όρος μετρήσεων Χ 10 4 κύτταρα/ml)

13 Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης

14 Αρχή της μεθόδου Ο διαχωρισμός των λεμφοκυττάρων θα πραγματοποιηθεί με τη χρήση διαλύματος φικόλης το οποίο δημιουργεί κλίση πυκνότητας. To αίμα παρουσία διαλύματος φικόλης υφίσταται φυγοκέντρηση κατά την οποία τα ερυθρά αιμοσφαίρια ως πυκνότερα (ρ = 1,093 g/cm 3 ) αρχίζουν να κινούνται προς τον πυθμένα του σωλήνα και μόλις έλθουν σε επαφή με το διάλυμα φικόλης σχηματίζουν βαρύτερα συσσωματώματα, αποκτούν πυκνότητα αρκετά μεγαλύτερη της φικόλης, εισέρχονται μέσα στη μάζα της και σε λεπτά έχουν συσσωρευτεί στον πυθμένα του σωλήνα. Επίσης τα κοκκιοκύτταρα έχουν την ικανότητα να διέρχονται μέσα απο το διάλυμα της φικόλης. Με το τέλος της φυγοκέντρησης προκύπτει διάλυμα με διακριτές στιβάδες όπως φαινεται στο σχήμα 1. Τα λεμφοκύτταρα που έχουν μικρότερη πυκνότητα παραμένου στην στιβάδα μεταξύ του πλάσματος και της φικόλης. Πλάσμα Λεμφοκύτταρα, αιμοπετάλια, μονοκύτταρα Ficoll Κοκκιοκύτταρα Ερυθροκύτταρα Σχήμα 1. Οι κυτταρικές στιβάδες μετά από επιστίβαση και φυγοκέντρηση ολικού αίματος σε διάλυμα φικόλης

15 Απαιτούμενα Υλικά Σωληνάκια με αντιπηκτικό διάλυμα Σωληνάκια φυγοκέντρησης Αντικειμενοφόρες πλάκες Φυγόκεντρος Μικροσκόπιο Διάλυμα Ficoll Phosphate Buffer Saline (PBS) Χρωστική Giemsa Μεθανόλη

16 Πειραματική πορεία Λαμβάνεται αίμα σε αντιπηκτικό EDTA 2 ml ολικού αίματος αραιώνονται σε ίσο όγκο διαλύματος PBS (ph=7,4) και το προκύπτον εναιώρημα αναδεύεται καλά Το αραιωμένο αίμα επιστοιβάζεται ήπια σε δεύτερο σωλήνα φυγοκέντρησης που περιέχει 3 ml διαλύματος φικόλης Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε rpm για 40 min στους 20 C (χωρίς επιτάχυνση και επιβράδυνση). Αφαιρούμε προσεκτικά με πιπέττα pasteur το υπερκείμενο πλάσμα Συλλέγουμε με άλλη πιπέττα το στρώμα των λεμφοκυττάρων και το τοποθετούμε σε σωλήνα φυγοκέντρησης Ο όγκος των λεμφοκυττάρων αναμιγνύεται με τριπλάσια ποσότητα διαλύματος PBS Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 860 rpm, 10 min, 20 C. Aπομακρύνουμε το υπερκείμενο, το ίζημα επαναιωρείται σε 5 ml PBS και υποβάλλεται εκ νέου σε φυγοκέντρηση (860 rpm, 10 min, 20 C). Το προκύπτον ίζημα αποτελείται κατά 95% περίπου από λεμφοκύτταρα.

17 Ερυθροκύτταρα διέρχονται στο διάλυμα της φικόλης Εργαστήριο Ανοσολογίας 2019

18 Πλάσμα Πλάσμα Λεμφοκύτταρα Ficoll Λεμφοκύτταρα Ficoll Ερυθροκύτταρα Ερυθροκύτταρα Εργαστήριο Ανοσολογίας 2019

19 Παρατήρηση λεμφοκυττάρων στο μικροσκόπιο Πραγματοποιείται μετά απο χρώση Giemsa 1) Γίνεται επαναιώρηση του απομονωθέντος κυτταρικού πληθυσμού 2) Σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα απλώνετε ομοιόμορφα το δείγμα και αφήνετε να στεγνώσει 3) Γίνεται μονιμοποίηση σε μεθανόλη για 5-7 λεπτά και έπειτα αφήνετε να στεγνώσει το παρασκεύασμα 4) Παράλληλα, αραιώνετε τη χρωστική Giemsa 1:20 με απιονισμένο νερό 5) Καλύπτετε το παρασκεύασμα με τη χρωστική Giemsa για λεπτά 6) Ξεπλένετε με απιονισμένο νερό και αναμένετε να στεγνώσει το παρασκεύασμα. Αφού στεγνώσει, το παρασκεύασμά σας είναι έτοιμο για παρατήρηση στο μικροσκόπιο