ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Μέτρηση επιπέδων CD20 σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα που λαμβάνουν θεραπεία με χορήγηση ριτουξιμάμπης

Transcript

1 ΧΑΤΖΗΣΤΑΥΡΗ ΕΙΡΗΝΗ ΑΜΑΡΥΛΛΙΣ ΠΤΥΧΙΟ Project No1 Πρακτικής Άσκησης ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Μέτρηση επιπέδων CD20 σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα που λαμβάνουν θεραπεία με χορήγηση ριτουξιμάμπης Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Αθηνών Β' Παθολογική Κλινική Ανοσολογικό-Ρευματολογικό Εργαστήριο Δ/ντης τμήματος: Ντουράκης Σ. Αναπλ. Καθηγητής: Βασιλόπουλος Δ. Βοηθός εργαστηρίου: Μακρή Αν

2 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ Χρήση κυτταρομετρίας ροής για μέτρηση λεμφοκυττάρων έπειτα από χρώση με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των αντιγόνων CD20. Η στιβάδα PBMC περιέχει μόνο τα λευκά αιμοσφαίρια και συλλέχθηκε από ολικό αίμα ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα που λαμβάνουν θεραπεία με χορήγηση ριτουξιμάμπης (rituximab). (1) Αρχή Μεθόδου Η κυτταρομετρία ροής είναι μία μέθοδος αυτοματοποιημένης κυτταρικής ανάλυσης. Για την μέτρηση δειγμάτων είναι απαραίτητο αυτά να βρίσκονται υπό μορφή κυτταρικού αιωρήματος, έτσι ώστε να διέρχονται ένα ένα από την κυψελίδα ροής (Εικόνα 1), όπως επίσης και να έχουν επισημανθεί με φθορίζουσες χρωστικές. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιεί τα βιοφυσικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, όπως η σκέδαση προσπίπτουσας ακτινοβολίας και η παραγωγή φθορίζουσας ακτινοβολίας. (2) Εικόνα 1. Σχηματική διάταξη της κυψελίδας ροής σε σχέση με την δέσμη laser.

3 Μία ακτίνα laser προσπίπτει πάνω στο κύτταρο και διαθλάται. Η σκέδαση αυτή του φωτός (ευθεία/forward scatter και πλάγια/side scatter) (Εικόνα 1) μετράται δίνοντας έτσι πληροφορίες για το μέγεθος και την κοκκίωση του κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατόν τα κύτταρα ενός δείγματος να απεικονισθούν σε στικτόγραμμα (Εικόνα 2) και να διαχωριστούν σε πληθυσμούς. (2) Εικόνα 2. Στικτόγραμμα (dot plot) ολικού αίματος. Διακρίνονται οι πληθυσμοί των λευκών αιμοσφαιρίων. Ο προσδιορισμός αντιγόνων των κυττάρων πραγματοποιείται εφόσον έχει γίνει σήμανση αυτών με μονοκλωνικά αντισώματα συνδεδεμένα με φθορίζουσες ουσίες. Όταν η ακτίνα laser πέσει πάνω στο κύτταρο, οι φθορίζουσες ουσίες εκπέμπουν ακτινοβολία χαρακτηριστική της κάθε φθορίζουσας ουσίας. Για αυτό και η κυτταρομετρία ροής προσφέρει το πλεονέκτημα του ταυτόχρονου προσδιορισμού 3 έως και 5 αντιγόνων, ακόμη και πάνω στο ίδιο κύτταρο. (2) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Προετοιμασία δειγμάτων Χρησιμοποιήθηκαν 3 tubes:

4 1 o tube: περιέχει μόνο αίμα (PBMC στιβάδα). Χρησιμεύει στη βαθμονόμηση του side scatter και του forward scatter έτσι ώστε τα μη δεσμευμένα με αντίσωμα κύτταρα να εμφανίζονται πριν την μονάδα στο στικτόγραμμα. 2 o tube: περιέχει αίμα (PBMC στιβάδα) και αντίσωμα CD20-FITC Biolegend (αντίσωμα έναντι του αντιγόνου CD20 των λεμφοκυττάρων συνδεδεμένο με φθορίζουσα ουσία) 3 ο tube: περιέχει αίμα (PBMC στιβάδα) και isotype IgG2bk (ισοτυπικό του συγκεκριμένου αντισώματος CD20, συνδεδεμένο με φθορίζουσα ουσία). Χρησιμοποιείται για την φασματική ρύθμιση έτσι ώστε το λογισμικό του κυτταρομετρητή να διαβάζει μόνο το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας της φθορίζουσας ουσίας που χρησιμοποιείται. (1) Πρωτόκολλο Προσθήκη 100μl PBMC σε κάθε tube (πριν από κάθε χρήση ανακατεύουμε το αίμα) Προσθήκη 5μl Ab (αντισώματος) (στο 2 o και 3 ο tube, αντίστοιχα το κάθε αντίσωμα) Ελαφρύ χτύπημα των tubes, μόνο με φορά από πάνω προς τα κάτω (δεν πρέπει να φύγει υγρό στα τοιχώματα του tube) 15 λεπτά σε σκοτεινό μέρος Προσθήκη 2ml QUICKLYSIS TM*5 /100μl PBMC (χρημοποιείται για λύση των ερυθρών) Ελαφρύ χτύπημα των tubes 15 λεπτά σε σκοτεινό μέρος Χρησιμοποιείται vortex πριν το τρέξιμο κάθε δείγματος (1) Ανάλυση, παρουσίαση και επεξεργασία δεδομένων Όπως φαίνεται και στην εικόνα 2, τα κύτταρα απεικονίζονται σε στικτόγραμμα με άξονες την ευθεία και πλάγια σκέδαση. Για τη διαλογή κυττάρων και την καλύτερη ανάλυση των δεδομένων τους δίνεται η δυνατότητα να επιλέξουμε έναν πληθυσμό (R1) από το αρχικό στικτόγραμμα και να τον αναλύσουμε ξεχωριστά σε ένα νέο στικτόγραμμα με τους ίδους άξονες (Εικόνα 3). Για κάθε πληθυσμό, επομένως και καινούριο στικτόγραμμα, που επιλέγουμε εμφανίζονται διάφορα στατιστικά στοιχεία που αφορούν τα κύτταρα του επιλεγμένου πληθυσμού. (1)

5 Εικόνα 3. Στικτόγραμμα στιβάδας PBMC. Στην περιοχή R1 παρατηρούμε τον πληθυσμό των λεμφοκυττάρων. Στην περιοχή R2 παρατηρούμε τα λεμφοκύτταρα που λόγω της σύνδεσής τους με αντίσωμα έναντι του αντιγόνου CD20 εμφανίζονται μετά την μονάδα. Στα στατιστικά στοιχεία από κάτω παρουσιάζονται τα ποσοστά των επιλεγμένων λεμφοκυττάρων με συνδεδεμένα αντισώματα CD20 έναντι του αρχικού πληθυσμού κάθε φορά (κάθε επιλεγμένης περιοχής). (1) Στην εικόνα 3, όπως είναι εμφανές στην R2 περιοχή, υπάρχει πληθυσμός λεμφοκυττάρων συνδεδεμένων με το αντίσωμα CD20. Στην εικόνα 4 όμως, παρατηρούμε ότι λεμφοκύτταρα συνδεδεμένα με το αντίσωμα δεν υπάρχουν.

6 Εικόνα 4. Επιλέχθηκε ο πληθυσμός των λεμφοκυττάρων (περιοχή R1), αλλά στο στικτόγραμμα της R1 δεν παρατηρείται πληθυσμός συνδεδεμένων με το αντίσωμα. (1) ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η θεραπεία ατόμων που πάσχουν από ρευματοειδή αρθρίτιδα με ριτουξιμάμπη έχει ως σκοπό την καταστροφή των Β-λεμφοκυττάρων και επιτυγχάνεται με την σύνδεσή της στο αντιγόνο CD20 των λεμφοκυττάρων προκαλώντας λύση τους. Πιστεύεται ότι η ρευματοειδής αρθρίτιδα οφείλεται στην στροφή των λεμφοκυττάρων έναντι του ίδιου του οργανισμού, επομένως καταστρέφοντας τα λεμφοκύτταρα αναμένεται η βελτίωση της κλινικής εικόνας του ασθενούς. Η έρευνα αυτή διεξάγεται για να διαπιστωθεί εάν η ριτουξιμάμπη έχει όντως αποτέλεσμα στα άτομα που πάσχουν από την ρευματοειδή αρθρίτιδα. (1) Τα στικτογράμματα των εικόνων 3 και 4 ανήκουν στον ίδιο ασθενή και αφορούν δείγματα με χρονική απόσταση περίπου 5 μηνών. Στο στικτόγραμμα της εικόνας 3, παρατηρείται πληθυσμός λεμφοκυττάρων συνδεδεμένων με το αντίσωμα (περιοχή R2), ενώ 5 μήνες αργότερα και ενώ ακολουθούνταν θεραπεία με ριτουξιμάμπη (στικτόγραμμα εικόνας 4) δεν παρατηρείται τέτοιος πληθυσμός. (1)

7 Συμπεραίνουμε επομένως ότι η δράση της ριτουξιμάμπης έχει ως αποτέλεσμα την λύση των λεμφοκυττάρων και κατ' επέκταση την κλινική βελτίωση των ασθενών, όπως μαρτυρούν και οι ίδιοι (σημαντική μείωση των συμπτωμάτων).

8 Βιβλιογραφία (1) Αρχείο εργαστηρίου (2) Αιματολογία στην κλινική πράξη, Γεράσιμος Α. Πάγκαλης, Έκδοση 2008, σελ Εικόνα 1 και 2 από το διαδύκτιο Εικόνα 3 και 4 από το αρχείο του εργαστηρίου