ΑΣΚΗΣΗ 11 ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΦΑΓΟΚΥΤΩΣΗΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΠΡΩΤΟΖΩΟΥ TETRAHYMENA THERMOPHILA

Transcript

1 ΑΣΚΗΣΗ 11 ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΦΑΓΟΚΥΤΩΣΗΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΠΡΩΤΟΖΩΟΥ TETRAHYMENA THERMOPHILA Εισαγωγή Για τη δοκιμασία που περιγράφεται στο πείραμα αυτό χρησιμοποιούνται καλλιέργειες του πρωτοζώου Tetrahymena thermophila. Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο 5, η φαγοκύτωση αποτελεί μορφή ενδοκύτωσης που, στα πρωτόζωα, εξυπηρετεί τη διατροφή και όχι την άμυνα έναντι μικροοργανισμών-εισβολέων, όπως στους ανώτερους οργανισμούς. Και στις δυο περιπτώσεις, πάντως, τα φαγοσώματα που σχηματίζονται μετακινούνται στο εσωτερικό των κυττάρων και συντήκονται με λυσοσώματα με αποτέλεσμα την υδρόλυση του περιεχομένου τους. Ο μονοκύτταρος ευκαρυωτικός οργανισμός Tetrahymena χαρακτηρίζεται εξωτερικά από την ύπαρξη βλεφαρίδων, η συνέχεια των οποίων διακόπτεται μόνο στην περιοχή του κυτοστόματος όπως φαίνεται στο Σχήμα 11.1Α. Το κυτόστομα είναι η περιοχή του κυττάρου από την οποία κυρίως γίνεται η φαγοκύτωση, η μεμβράνη δε των φαγοσωμάτων προέρχεται από τη σύντηξη κυστιδίων που μεταφέρονται στην περιοχή του κυτοστόματος και όχι από εγκόλπωση της πλασματικής μεμβράνης, όπως στην περίπτωση των κυττάρων των θηλαστικών. Εκτός από τη φαγοκύτωση, σε κύτταρα Tetrahymena έχουν μελετηθεί δυο ακόμα σημαντικές πορείες κυκλοφορίας μεμβρανών, η συστατική έκκριση λυσοσωμικών ενζύμων και η ρυθμιζόμενη έκκριση βλεννοκυστών. Οι βλεννοκύστεις περιέχουν πρωτεΐνες που, όταν εκκριθούν, περιβάλλουν με τη μορφή βλέννας το κύτταρο και προστατεύουν τον οργανισμό από την αιτία που προκάλεσε την έκκριση. Τα κύτταρα παραμένουν ζωντανά εντός του πρωτεϊνικού περιβλήματος, από το οποίο τελικώς διαφεύγουν. Τέλος, η έκκριση λυσοσωμικών ενζύμων συνδέεται με τη φαγοκύτωση με τον τρόπο που 289

2 φαίνεται στο Σχήμα 11.1Β. Γενικότερα, τα κύτταρα Tetrahymena έχουν χρησιμοποιηθεί ευρύτατα για μελέτες 2,3 όπως αυτές του καταλυτικού RNA ή της τελομεράσης (βραβεία Nobel Χημείας, 1989 και Φυσιολογίας/Ιατρικής, 2009, αντίστοιχα), ενώ σημαντικό είναι και το γεγονός ότι έχει ολοκληρωθεί η αλληλούχιση του γονιδιώματος του μακροπυρήνα του πρωτοζώου. Σχήμα 11.1 (Α) Κύτταρο Tetrahymena. Οι βλεφαρίδες, με συντονισμένη κίνηση, επιτρέπουν στο πρωτόζωο να κινείται στο υδατικό περιβάλλον του. (Β) Φαγοκύτωση και έκκριση λυσοσωμικών ενζύμων σε κύτταρα Tetrahymena. BC, κυτόστομα, LY, λυσόσωμα. Το λυσόσωμα εφοδιάζει αφ ενός τα φαγολυσοσώματα, αφ ετέρου τον εξωκυττάριο χώρο με λυσοσωμικά ένζυμα 1. Καλλιέργειες του πρωτοζώου Για τη μελέτη της φαγοκύτωσης, κύτταρα T. thermophila CU438.1, η προμήθεια των οποίων έγινε από το Tetrahymena Stock Center του Πανεπιστημίου Cornell, αναπτύσσονται σε θρεπτικό μέσο Neff s που περιέχει: 0.25% πρωτεόζη-πεπτόνη, 0.25% εκχύλισμα ζύμης, 0.5% γλυκόζη και 1% διαλύματος FeSO 4 -EDTA. Στο ίδιο θρεπτικό μέσο διατηρούνται και οι καλλιέργειες διατήρησης (stock), σε σωλήνες pyrex που περιέχουν 8mL μέσου και βρίσκονται σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 27 C. Oι καλλιέργειες διατήρησης ανανεώνονται κάθε 12 ημέρες. Οι καλλιέργειες εργασίας παρασκευάζονται μετά από εμβολιασμό νέου αποστειρωμένου μέσου με καλλιέργεια διατήρησης (0.5mL καλλιέργειας διατήρησης για 10mL καλλιέργειας εργασίας), οι δε εμβολιασμοί γίνονται υπό ασηπτικές συνθήκες, σε θάλαμο νηματικής ροής. Οι καλλιέργειες εργασίας 290

3 αναπτύσσονται στο θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας και υπό συνεχή ανάδευση (70-80rpm) σε γυροτροπικό αναδευτήρα. Στη διάρκεια της ανάπτυξης των καλλιεργειών εργασίας και μέχρι το τέλος της λογαριθμικής φάσης, γίνεται μέτρηση των κυττάρων ώστε να κατασκευαστεί καμπύλη ανάπτυξης: λαμβάνεται μικρό δείγμα καλλιέργειας υπό ασηπτικές συνθήκες και τα κύτταρα ακινητοποιούνται με προσθήκη φορμόλης 1% σε αναλογία 1:0.05 πριν γίνει μέτρηση του αριθμού τους στο μικροσκόπιο. Για τη μέτρηση χρησιμοποιείται αιματοκυτόμετρο Neubauer. Στην περίπτωση που οι καλλιέργειες είναι πυκνές, το προς μέτρηση δείγμα αραιώνεται με γνωστό όγκο διαλύματος NaCl 0.9%.Στη συνέχεια, κατασκευάζεται η καμπύλη ανάπτυξης ως διάγραμμα του αριθμού των κυττάρων της καλλιέργειας ή του λογαρίθμου του ή της συγκέντρωσης των κυττάρων συναρτήσει του χρόνου και αναγνωρίζονται σ αυτήν οι διαδοχικές φάσεις ανάπτυξης της καλλιέργειας. Μικροσκοπική μελέτη και ποσοτικοποίηση της φαγοκύτωσης Η μελέτη της φαγοκύτωσης γίνεται σε μέσο ασιτίας: μετά από 46 ώρες ανάπτυξης (περίπου στο τέλος της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης), τα κύτταρα καταβυθίζονται με φυγοκέντρηση στα 1,000xg για 10min, εκπλένονται και αναδιασπείρονται σε ανόργανο μέσο Tris 10mM, ph 7.4. Και η διαδικασία αυτή γίνεται σε ασηπτικές συνθήκες, ενώ αποστειρωμένο είναι και το ανόργανο μέσο (έκπλυσης και τελικής αναδιασποράς). Στις συνθήκες αυτές τα κύτταρα αφήνονται για 24 ώρες, μέτρηση δε των κυττάρων δείχνει ότι η καλλιέργεια δεν αναπτύσσεται περαιτέρω σε συνθήκες ασιτίας. Μετά την παρέλευση των 24 ωρών, γίνεται η μελέτη της φαγοκύτωσης. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιούνται σωματίδια latex διαμέτρου 0.80μm (Latex beads, deep blue dyed). Τα σωματίδια προστίθενται σε μικρή ποσότητα καλλιέργειας με πυκνότητα 1.0x10 6 κύτταρα/ml που τοποθετείται σε σωλήνα eppendorf. Τα σωματίδια προστίθενται σε αναλογία 0.002% και η καλλιέργεια παραμένει σε θερμοκρασία δωματίου και υπό ήπια ανάδευση στη διάρκεια του πειράματος. Η μέτρηση των φαγοσωμάτων που σχηματίζονται γίνεται στο μικροσκόπιο, μετά από ακινητοποίηση των κυττάρων με γλουταραλδεΰδη 2.5% σε αναλογία 1:60. Η λήψη των δειγμάτων αρχίζει 1min μετά την προσθήκη των σωματιδίων και συνεχίζεται για τουλάχιστον 60min, επειδή στο χρονικό αυτό διάστημα ολοκληρώνεται και η αποβολή του περιεχομένου των φαγοσωμάτων από τα κύτταρα του πρωτοζώου. Ενδεικτικές φωτογραφίες από ένα τέτοιο πείραμα υπάρχουν στο κεφάλαιο 5. Στο Σχήμα 5.29Α φαίνονται κύτταρα T. thermophila 30min μετά την προσθήκη των σωματιδίων και στο Σχήμα 5.31Α κύτταρο στο οποίο έχει αρχίσει η αποβολή των σωματιδίων (στην περίπτωση των σωματιδίων latex, το περιεχόμενο των σωματιδίων δεν υδρολύεται από τα λυσοσωμικά ένζυμα). 291

4 Η ποσοτικοποίηση της φαγοκύτωσης γίνεται με μέτρηση του αριθμού των επισημασμένων φαγοσωμάτων στο εσωτερικό συγκεκριμένου αριθμού κυττάρων (τουλάχιστον 70) και, στη συνέχεια, με την κατασκευή πίνακα, στον οποίο εμφανίζονται το ποσοστό των κυττάρων που περιέχουν από 0 μέχρι και πάνω από 15 επισημασμένα φαγοσώματα και ο μέσος όρος φαγοσωμάτων/κύτταρο. Ενδεικτικός είναι ο πίνακας που ακολουθεί. χρόνος (min) συνολικός αριθμός κυττάρων αριθμός κυττάρων που περιέχουν 0, 1-5, 6-10, 11-15, >15 φαγοσώματα >15 συνολικός αριθμός φαγοσωμάτων φαγοσώματα/κύτταρο Με βάση τον πίνακα, κατασκευάζεται διάγραμμα των φαγοσωμάτων/κύτταρο συναρτήσει του χρόνου. Το διάγραμμα απεικονίζει το ρυθμό της φαγοκύτωσης, μπορούν δε να μελετηθούν οι μεταβολές του ρυθμού φαγοκύτωσης υπό την επίδραση, πριν, μετά ή κατά τη διάρκεια της προσθήκης των σωματιδίων, παραγόντων που επηρεάζουν την πορεία της φαγοκύτωσης. Για παράδειγμα, η προσθήκη αναστολέων της ενεργότητας PLC των φωσφοϊνοσιτιδίων (βλ. Άσκηση 9) μειώνει τον ρυθμό φαγοκύτωσης σε κύτταρα Tetrahymena, καθώς το συγκεκριμένο ένζυμο είναι απαραίτητο για την έναρξη της πορείας. Μελέτη της χρονικής εξέλιξης της πορείας μπορεί να γίνει με κατασκευή του διαγράμματος φαγοσώματα/κύτταρο συναρτήσει του χρόνου που παρήλθε από την προσθήκη των σωματιδίων. Η ίδια μελέτη μπορεί να γίνει και με χρήση μαύρης σινικής μελάνης, τα σωματίδια της οποίας επίσης φαγοκυτώνονται από τα κύτταρα Tetrahymena. Στην περίπτωση αυτή, η μελάνη προτείνεται να αραιωθεί με θρεπτικό μέσο σε αναλογία 2:3 (μελάνη/μέσο) και, επίσης, προτείνεται να χρησιμοποιηθεί σε αναλογία 20%. Τέλος, σε πειράματα φαγοκύτωσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν και μαγνητισμένα σωματίδια σιδήρου-δεξτράνης (επίσης σε τελική συγκέντρωση 20%), όταν σκοπός του πειράματος είναι η απομόνωση φαγοσωμάτων. Η απομόνωση των φαγοσωμάτων στην περίπτωση αυτή γίνεται με χρήση μαγνήτη μετά από ομογενοποίηση των κυττάρων, η δε παρασκευή των σωματιδίων περιγράφεται στη συνέχεια. Μελέτη και ποσοτικοποίηση της φαγοκύτωσης σε κύτταρα Tetrahymena μπορεί να γίνει και με κυτταρομετρία ροής, με χρήση οπσονισμένων φθοριζόντων κυττάρων E. coli 4 (βλ. Άσκηση 6). Για τη 292

5 μελέτη αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα από τα kit του εμπορίου που συνήθως χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της φαγοκύτωσης σε ανθρώπινα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος, διάγραμμα δε κυτταρομετρίας ροής κάτω από τις συνθήκες αυτές φαίνεται στο Σχήμα Σχήμα 11.2 Διάγραμμα κυτταρομετρίας ροής για κύτταρα T. thermophila CU438.1 μετά από φαγοκύτωση φθοριζόντων κυττάρων E. coli (κυτταρομετρητής Epics XL/MCL, Beckman Coulter). Παρασκευή σωματιδίων για απομόνωση φαγοσωμάτων Για την παρασκευή μαγνητισμένων σωματιδίων σιδήρου-δεξτράνης, διαλύονται 9g δεξτράνης σε 40mL νερού σε θερμοκρασία 65 C και υπό συνεχή ανάδευση. Παράλληλα, παρασκευάζεται διάλυμα FeCl 3 / FeCl 2 με διάλυση 9.04g FeCl 3. 6H 2 O και 3.64g FeCl 2. 4H 2 O σε 20mL νερού millipore, χωρίς θέρμανση. Τα δυο διαλύματα αναμιγνύονται υπό ανάδευση και θερμαίνονται στους 65 C. Στη συνέχεια, η θερμοκρασία μειώνεται στους 40 C και στο διάλυμα προστίθενται πολύ αργά 100mL NH 4 OH 7.5% (η προσθήκη πρέπει να διαρκέσει πάνω από μια ώρα). Η θερμοκρασία αυξάνεται και πάλι στους 65 C για 3min και, όταν το μίγμα επανέλθει σε θερμοκρασία δωματίου, φυγοκεντρείται στα 400xg για 3min. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης, που περιέχει τα σωματίδια που μας ενδιαφέρουν (διαμέτρου 1μm), αφήνεται για 12 ώρες σε ποτήρι τοποθετημένο πάνω σε μαγνήτη. Την επόμενη ημέρα, απομακρύνεται με αναρρόφηση το υπερκείμενο, χωρίς το ποτήρι να απομακρυνθεί από το μαγνήτη και το ίζημα (που περιέχει τα μαγνητισμένα σωματίδια) εκπλένεται δυο φορές με διάλυμα Tris 0.1M, ph 7.4 και, στη συνέχεια, μεταφέρεται με το ίδιο διάλυμα σε σωλήνα φυγοκέντρου. Μετά από φυγοκέντρηση στα 400xg για 3min, παραλαμβάνεται και χρησιμοποιείται το υπερκείμενο. 293

6 Βιβλιογραφία 1 Kiy T, Vosskuhler C, Rasmussen L, Tiedtke A (1993) Three pools of lysosomal enzymes in Tetrahymena thermophila. Exp Cell Res, 205: Thompson GA, Nozawa Y (1978) Tetrahymena: A system for studying dynamic membrane alterations within the eukaryotic cell. Biochim Biophys Acta, 472: classroom_teaching%20biochemistry%20in%20a%20chemistry%20department.pdf. 4 Δελή Δ, Σπυριδάκης Σ, Ψαρρά Κ, Γαλανοπούλου Ν (2006) Μελέτη της φαγοκύτωσης στο πρωτόζωο Tetrahymena με κυτταρομετρία ροής. Πρακτικά Κλινικού Φροντιστηρίου, 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας,