Ξενιστές: Βακτήρια, ζύµες, κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα εντόµων

Transcript

1 Ξενιστές: Βακτήρια, ζύµες, κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα εντόµων

2 Τοποθέτηση του ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του δέκτη Εισαγωγή πλασµιδίου στα κύτταρα του φορέα Μετασχηµατισµός Άγνωστος μηχανισμός!!

3

4 Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων Γονίδιο για προστασία ενάντια σε αντιβιοτικά Ξένο DNA Περιοχή ενδιαφέροντος Ανασυνδυασμένο DNA Κολλώδη άκρα Υπάρχουν άλλες δυνατότητες στο στάδιο της λιγάσης με αρνητικό αποτέλεσμα; Τρυβλίο με αντιβιοτικό Ανάπτυξη μόνο ανασυνδυασμένων κυττάρων Κλωνοποίηση σε φορέα

5 Υπάρχει όμως και η περίπτωση αποικιών χωρίς ενθέματα! Υπάρχει όμως και η περίπτωση αποικιών με λάθος ενθέματα!

6 Εντοπισμός μη ανασυνδυασμένων πλασμιδίων HindIII EcoRI BamHI Τα κύτταρα τα οποία περιέχουν το πλασμίδιο pbluescript εμφανίζουν αντίσταση στην αμπικιλλίνη και παίρνουν μπλε χρώμα σε τρυβλία X-Gal puc18 Αφετηρία αντιγραφής LacZ κωδικοποιεί τη b-γαλακτοζιδάση Amp r προσδίδει αντίσταση στην αμπικιλλίνη

7 Εντοπισμός μη ανασυνδυασμένων πλασμιδίων

8 Ενεργότητα β-γαλακτοζιδάσης σε τρυβλία Bromo-chloro-indoyl-b-galactopyranosidase ή X-Gal (Καθαρό) b-γαλακτοζιδάση Bromo-chloro-indoyl (Βαθύ μπλε αδιάλυτο)

9 Φορέας Προσθήκη χρωμοσωμικού DNA σε ένα φορέα GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Χρωμόσωμα GAATTC CTTAAG Κοπή με EcoRI και προσθήκη DNA λιγάσης GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Ανασυνδυασμένος φορέας Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Αρνητικό σε b-γαλακτοζιδάση (Λευκές αποικίες σε X-Gal) Το LacZ γονίδιο κωδικοποιεί τη b-γαλακτοζιδάση Γονίδιο αντίστασης αμπικιλλίνης

10 Μη ανασυνδυασμένος φορέας GAATTC CTTAAG Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Θετικό σε b-γαλακτοζιδάση (Μπλε αποικίες σε X-Gal) Το LacZ γονίδιο κωδικοποιεί τη b-γαλακτοζιδάση Γονίδιο αντίστασης αμπικιλλίνης

11 Χωρίς ένθεμα Με ένθεμα Μετασχηματισμός E. coli ευαίσθητο σε αμπικιλλίνη Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Θετικό σε b-γαλακτοζιδάση (Μπλε αποικίες σε X-Gal) Αντίσταση σε αμπικιλλίνη, Αρνητικό σε b-γαλακτοζιδάση (Λευκές αποικίες σε X-Gal)

12 Τα βακτήρια μετά τη λιγάση αναπτύσσονται σε τρυβλία με αμπικιλλίνη και X-Gal Περιέχουν το μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

13 Τα βακτήρια μετά τη λιγάση αναπτύσσονται σε τρυβλία με αμπικιλλίνη και X-Gal Περιέχουν το μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο

14 Το ccdb γονίδιο εκφράζει μια πρωτεΐνη που αποτελεί παρεμποδιστή της DNA γυράσης στο E. coli σκοτώνοντας έτσι το κύτταρο

15

16 Ετερόλογη έκφρασης μίας πρωτεΐνης Αύξηση και έκφραση πρωτεΐνης Αύξηση κανονικού βακτηρίου Έκφραση ξένης πρωτεΐνης Αύξηση του τροποποιημένου βακτηρίου Χρόνος (ώρες)

17 Στρατηγική ετερόλογης έκφρασης μίας πρωτεΐνης Εάν η έκφραση μιας ξένης πρωτεΐνης λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης του βακτηρίου Η ανάπτυξη θα είναι αργή και φτωχή Παρόλο που το 40 % του βακτηρίου μπορεί να είναι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, θα έχουμε χαμηλή απόδοση εξαιτίας της χαμηλής βιομάζας Επιπλέον μικρή απόδοση εξαιτίας της επιλογής μεταλλαγμένων στελεχών που δεν εκφράζουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη.

18 Στρατηγική ετερόλογης έκφρασης μίας πρωτεΐνης Αύξηση κανονικού βακτηρίου Αύξηση και έκφραση πρωτεΐνης Έκφραση της ξένης πρωτεΐνης Επαγωγή έκφρασης της ξένης πρωτεΐνης Χρόνος (ώρες)

19 Στρατηγική ετερόλογης έκφρασης Για την παραγωγή σε μεγάλες ποσότητες ξένης πρωτεΐνης: Έλεγχος έκφρασης της ξένης πρωτεΐνης Αύξηση του βακτηρίου μεταξύ μέσης και τέλους της εκθετικής φάσης ανάπτυξης Επαγωγή έκφρασης μίας πρωτεΐνης Ανάγκη για ρυθμιζόμενους φορείς έκφρασης Χρήση επαγόμενου υποκινητή στο φορέα έκφρασης για τον έλεγχο της μεταγραφής

20 Φορέας έκφρασης εφοδιάζει τη κωδικοποιούσα περιοχή του cdna με έναν υποκινητή και ένα RBS Ρυθμιζόμενος υποκινητής RBS (Ribosome Binding Site) RES (restriction enzyme site) Αφετηρία αντιγραφής Ap r γονίδιο Φορέας έκφρασης

21 Επαγώγιμοι υποκινητές σε φορείς έκφρασης Πληθώρα ρυθμιζόμενων υποκινητών Περισσότεροι ελέγχονται από το χειριστή laco (lac operator) π.χ. υποκινητές που επάγονται από τη λακτόζη ή ανάλογα αυτής απενεργοποιώντας τον lac καταστολέα Ανάλογο λακτόζης: isopropylthio-b-d-galactopyranoside (IPTG) Δε μεταβολίζεται οπότε είναι ένας ισχυρός επαγωγέας για την έκφραση γονιδίων

22 Χρωμόσωμα E. coli Lac καταστολέας Lac υποκινητής Lac χειριστής Περιοχή έκφρασης T7 RNA πολυμεράσης Γονίδιο Lac καταστολέα Υποκινητής που αναγνωρίζεται από τη T7 RNA πολυμεράση Lac χειριστής Γονίδιο που εκφράζει ξένη πρωτεΐνη Lac καταστολέας Αδυναμία έκφρασης ξένης πρωτεΐνης Η κατάλληλη RNA πολυμεράση (Τ7) της ξένης πρωτεΐνης δε μεταγράφεται! Γονίδιο Lac καταστολέα Γονίδιο αντίστασης E. coli RNA πολυμεράση σε αντιβιοτικά pet Lac καταστολέας Φορέας έκφρασης

23 Αύξηση κανονικού βακτηρίου Αύξηση και έκφραση πρωτεΐνης Έκφραση της ξένης πρωτεΐνης Χρόνος (ώρες) Επαγωγή έκφρασης της ξένης πρωτεΐνης με τη προσθήκη IPTG

24 Lac υποκινητής Χρωμόσωμα E. coli Lac χειριστής Περιοχή έκφρασης T7 RNA πολυμεράσης Lac καταστολέας Χ Γονίδιο Lac καταστολέα IPTG Καταστολέας Lac ανενεργός Υποκινητής που αναγνωρίζεται από τη T7 RNA πολυμεράση Lac χειριστής Γονίδιο που εκφράζει ξένη πρωτεΐνη T7 RNA πολυμεράση Προσθήκη IPTG στο υγρό της καλλιέργειας Έκφρασης ξένης πρωτεΐνης E. coli RNA πολυμεράση Γονίδιο Lac καταστολέα Χ Lac καταστολέας Γονίδιο αντίστασης σε αντιβιοτικά pet Φορέας έκφρασης

25 Επαγώγιμοι υποκινητές σε φορείς έκφρασης Ο περισσότερο κοινός φορέας έκφρασης είναι ο pet Ο υποκινητής στο φορέα έκφρασης αναγνωρίζεται από τη T7 RNA πολυμεράση Ο υποκινητής αυτός δεν αναγνωρίζεται από τη RNA πολυμεράση του E. coli Το γονίδιο που κωδικοποιεί την T7 RNA πολυμεράση η οποία ρυθμίζεται από το laco έχει εισαχθεί στο γονιδίωμα του E. coli. Ο υποκινητής του φορέα έκφρασης επίσης ρυθμίζεται από το laco Οπότε το IPTG επάγει την έκφραση της T7 RNA πολυμεράσης Του ξένου γονιδίου ή cdna Δύο επίπεδα ελέγχου

26 Σημειακές μεταλλάξεις με PCR Η τεχνική PCR χρησιμοποιείται για την αλλαγή της αμινοξικής αλληλουχίας με καθορισμένο τρόπο Μεταβολή στη αλληλουχία βάσεων του DNA προξενεί μεταβολή στην αλληλουχία αμινοξέων Κατασκευή εκκινητών που δεσμέυονται στο γονίδιο αλλά μεταφέρουν την επιθυμητή μετάλλαξη ATG TTT AAA TGG GAG CGC MET PHE LYS TRP GLU ARG Μετάλλαξη ATG TTT AAA GGG GAG CGC MET PHE LYS GLY GLU ARG

27 Θεση-κατευθυνόµενη µεταλλαξιγένεση

28 Σημειακές μεταλλάξεις με PCR G T TG AC Προσθήκη DpnI αποικοδόμηση του μητρικού κλώνου λόγω αναγνώρισης μεθυλιωμένου DNA C A

29 Κλωνοποίηση - PCR Για την απομόνωση ενός άγνωστου γονιδίου βάση της αμινοξικής του ακολουθίας Κατασκευή εκκινητών με βάση την αλληλουχία των αμινοξέων Χρήση PCR και παραλαβή προϊόντος Met-Lys-Trp-Met ATGAA(A/G)TGGATG Lys-Met-Phe-Trp AA(A/G)ATGTT(T/C)TGG

30 Γενετικός κώδικας

31 Γενετικά Τροποποιηµένοι Οργανισµοί

32 Φορείς: πλασµίδια,επισώµατα, βακτηριοφάγοι (ιοί) Ξενιστές: Βακτήρια, ζύµες, κύτταρα θηλαστικών, κύτταρα εντόµων

33 Περιεχόµενα Προϊόντα γενετικά τροποποιηµένων κυττάρων Έκφραση γονιδίων Συστήµατα ξενιστή-φορέα Γενετική αστάθεια Μεταβολική µηχανική Πρωτεϊνική µηχανική

34 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Bακτήρια Zύµες Μύκητες Κύτταρα θηλαστικών Σύστηµα κυττάρων εντόµου-ιού Διαγονιδιακά ζώα Διαγονιδιακά φυτά

35 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Βακτήρια Escherichia coli Πλεονεκτήµατα Μεγάλο εύρος γνώσεων Υψηλοί ρυθµοί ανάπτυξης Ανάπτυξη σε φθηνά και απλά θρεπτικά υλικά Μειονεκτήµατα Ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες Κυτταρικά έγκλειστα Δεν γλυκοζυλιώνει Αποικοδόµηση της πρωτεΐνης

36 Έκκριση και απέκκριση

37 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Βακτήρια Ø Περιορισµοί: Το επιθυµητό γονίδιο δεν πρέπει να περιέχει ιντρόνια. Ø Το επιθυµητό γονίδιο µπορεί να περιέχει αλληλουχίες που κωδικοποιούν σήµατα τερµατισµού της µεταγραφής για το E.coli. Ø Escherichia coli Codon bias: Η αποτελεσµατικότητα του t-rna να αναγνωρίζει τα διαφορετικά κωδικόνια διαφέρει σε κάθε οργανισµό.

38 Επαγωγή με χρήση συνθετικών μορίων που δε μεταβολίζονται π.χ. IPTG (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyran

39 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Ζύµες Saccharomyces cerevisae Πλεονεκτήµατα FDA GRAS- Εφαρµογή στα τρόφιµα Έκκριση πρωτεϊνών Γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών Πλεονεκτήµατα Aνάπτυξη σε µεθανόλη Έκκριση πρωτεϊνών Υψηλή κυτταρική πυκνότητα-μεγαλύτερη κατ όγκο παραγωγή Pichia pastoris Μειονεκτήµατα Χαµηλά επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης Υπεργλυκοζυλίωση Μειονεκτήµατα Υψηλή θερµότητα µεταβολισµού Υψηλές απαιτήσεις σε οξυγόνο Δύσκολος έλεγχος της διεργασίας Αποικοδόµηση της πρωτεΐνης

40 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Κύτταρα θηλαστικών Πλεονεκτήµατα ØΣωστές µετα-µεταφραστικές διαδικασίες ØΈκκριση πρωτεϊνών Μειονεκτήµατα ØΑκριβά θρεπτικά υλικά ØΧαµηλά επίπεδα έκφρασης ØΘνησιγενείς κυτταρικές σειρές ØΠαθογόνοι φορείς? Σειρές κυττάρων CHO: κύτταρα ωοθήκης κινεζικού χάµστερ Φορείς: Ιοί ανώτερων θηλαστικών

41 Κύτταρα ωοθήκης Κινέζικου Hamster (CHO)? 1 Βιομηχανία δισεκατ $ 2 Για την αντιμετώπιση σοβαρών ασθενειών (καρκίνος, αυτοάνοσα νοσήματα) 1 Βιομηχανική παραγωγή 3 : max όγκος εργασίας βιοαντιδραστήρα: 20,000L Τύποι μορίων(rdna) Επιθυμητός τρόπος: Fed-batch; μέχρι 20 ημέρες Στόχος: αύξηση της απόδοσης παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών [mabs: <60pg/cell/day max: 100pg/cell/day 3 ] 1. Kyriakopoulos & Kontoravdi (2013). Eur. J. Pharm. Sci., 48(3): Evaluate Pharma (2013). 3. De Jesus & Wurm (2011). Eur. J. Pharm. Biopharm, 78(2): rdna

42 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Συστήµατα Εντόµου-Ιού Πλεονεκτήµατα ØΥψηλά επίπεδα έκφρασης ØΑσφάλεια ØΤαχύτητα Μειονεκτήµατα ØΠολυπλοκότητα ØΜετάλλαξη του ιού Ξενιστές: Spodoptera frugipedra, Trichoplusia ni Ιός: Autographa califomica, πυρηνικός πολυεδρικός ιός

43 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Διαγονιδιακά ζώα Πλεονεκτήµατα ØΕξειδικευµένες µετα-µεταφραστικές διαδικασίες ØΥψηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών Μειονεκτήµατα ØΠροβλήµατα υγείας των ζώων ØΜετάδοση ιών ØΔαπανηρά συστήµατα Πρόβατα, αίγες, χοίροι

44 Συστήµατα ξενιστή-φορέα Διαγονιδιακά φυτά Πλεονεκτήµατα ØΧαµηλό κόστος ØΑσφάλεια Μειονεκτήµατα ØΧαµηλά επίπεδα έκφρασης ØΑτελής γλυκοζυλίωση ØΧρονοβόρες καλλιέργειες Καλαµπόκι Αντικείµενο έρευνας: Καλλιέργειες φυτικών κυττάρων