Εφαρμογές τεχνολογιών Μοριακής Βιολογίας στην Γενετική

Transcript

1 Εφαρμογές τεχνολογιών Μοριακής Βιολογίας στην Γενετική Πεφάνη Δάφνη Επίκουρη καθηγήτρια Εργαστήριο Βιολογίας

2

3 Αλληλούχιση (Sequencing) Προσδιορισμός της Αλληλουχίας ενός τμήματος DNA Mέθοδοι αλληλούχισης - Μέθοδος Sanger Αλληλούχιση επόμενης γενιάς (Next generation sequencing) -Επιτρέπει την παράλληλη αλληλούχιση εκατοντάδων χιλιάδων τμημάτων DNA

4 Μέθοδος Sanger Η σύνθεση της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας σταματάει με την εισαγωγή ενός διδεόξυριβονουκλεοτιδίου

5 Μέθοδος Sanger A ddatp + four dntps dda dadgdcdtdgdcdcdcdg C ddctp + four dntps dadgddc dadgdcdtdgddc dadgdcdtdgdcddc dadgdcdtdgdcdcddc G ddgtp + four dntps daddg dadgdcdtddg dadgdcdtdgdcdcdcddg T ddttp + four dntps dadgdcddt dadgdcdtdgdcdcdcdg

6 Μέθοδος Sanger

7 Μέθοδος Sanger Με την προσθήκη DNA πολυμεράσης ο εκκινητής επεκτείνεται μέχρι την προσθήκη ddntp Η προσθήκη ενός ddntp οδηγεί σε τερματισμό της σύνθεσης Με την κατάλληλη αναλογία dntp:ddntp, η σύνθεση της αλυσίδας θα λάβει χώρα σε όλο το μήκος του εκμαγείου Όλες οι αλυσίδες θα σταματήσουν με την προσθήκη ddntp

8 Μέθοδος Sanger Το σύνολο των τμημάτων του DNA αποτελούν το μάρτυρα αλληλούχισης Οι αντιδράσεις τερματισμού αναλύονται με ηλεκτροφόριση Κάθε αντίδραση αναλύεται σε διαφορετική στήλη

9 Μέθοδος Sanger Μεγαλύτερα τμήματα ddg Μικρότερα τμήματα ddg G A T C 3 G G T A A A T C A T G 5 Τα Sequencing gels διαβάζονται από κάτω προς τα πάνω (5 to 3 ).

10 Μέθοδος Sanger

11 Dye terminator Sequencing Μόρια χρωστικής συνδέονται με τα ddntp Καθώς τα νουκλεοτίδια που οδηγούν στον τερματισμό της αντίδραση ξεχωρίζουν λόγω της σύνδεσης με διαφορετικές χρωστικές στο 3 άκρο τους, οι τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις μπορούν να λάβουν χώρα σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα dda

12 Dye terminator Sequencing

13 Νext Generation Sequencing

14

15

16

17

18 Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση: Ηλεκτρικό φορτίο (Isoelectric point) Μοριακό βάρος (ΜW)

19 Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων

20 Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων

21

22

23

24

25

26 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry) H κυτταρομετρία ροής είναι μια τεχνική που επιτρέπει τη μελέτη κυτταρικών πληθυσμών μέσω ανάλυσης της σκέδασης του φωτός από τα κύτταρα καθώς και της εκπομπής του φθορισμού από αυτά Κάθε κύτταρο περνάει μπροστά από μία δέσμη laser. To σκεδασμένο φως και ο φθορισμός καταγράφονται και αναλύονται κατάλληλα Η ανάλυση παρέχει πληροφορίες για το μέγεθος, το είδος των κυττάρων ενώ με τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων για την έκφραση συγκεκριμένων δεικτών Μπορούν να αναλυθούν χιλιάδες κύτταρα σε μικρό χρόνο

27 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry) H δέσμη laser εστιάζεται έτσι ώστε να ακτινοβολεί ένα κύτταρο κάθε φορά Ο φθορισμός ανιχνεύεται κάθετα στη δέσμη laser O φθορισμός μπορεί να είναι ενδογενής (αυτό-φθορισμός) ή να προέρχεται από εξωγενής ενώσεις με τις οποίες μαρκάρονται οι κυτταρικοί πληθυσμοί προς ανάλυση

28 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry)

29 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry) Σκέδασή παράλληλα με τη δέσμη laser: ευαίσθητη στα οργανίδια του κυτταροπλάσματος Πλάγια σκέδαση: ευαίσθητη στο μέγεθος του κυττάρου

30 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry) Eφαρμογές: Διαχωρισμός κυττάρων του αίματος (διαφορετικό σχήμα, μέγεθος και σύσταση)

31 Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry) Eφαρμογές: Ανίχνευση αντιγόνων επιφανείας με αντισώματα που φέρουν φθοριοχρώματα

32 Cell Sorting

33