ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ»

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ»"

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ» ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΜΕ ΑΝΑΛΥΤΗ ΧΡΟΝΟΥ ΠΤΗΣΗΣ (LC-QTOF/MS) ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΤΗ ΠΑΓΙΔΑΣ ΙΟ- ΝΤΩΝ (LC-IONTRAP/MS) ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΞΤΡΑΝΗΣ ΚΑΙ ΥΔΡΟΞΥΑΙ- ΘΥΛΟ-ΑΜΥΛΟY ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ Κόλιας Βασίλειος-Νεκτάριος Φαρμακοποιός ΕΚΠΑ Ιούλιος 2014

2 2

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΠΑΝΤΕΡΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ι. ΝΤΟΤΣΙΚΑΣ Λέκτορας Ε. ΓΚΙΚΑΣ Επίκουρος Καθηγητής (επιβλέπων) 3

4 4

5 "Η έγκριση διατριβής ειδίκευσης από το Φαρμακευτικό Τμήμα του Πανεπιστημίου Α- θηνών, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα." (Ν. 5343/1932, άρθρο 202) 5

6 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή ειδίκευσης εκπονήθηκε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος ειδίκευσης στη Φαρμακευτική Ανάλυση -Έλεγχο Ποιότητας του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας του Φαρμακευτικού τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών. Το πειραματικό μέρος της εργασίας εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ του Ολυμπιακού Αθλητικού Κέντρου Αθηνών Σπύρος Λούης. H ανάθεση του θέματος και η επίβλεψη της διατριβής έγινε από τον Επίκουρο Καθηγητή Ευάγγελο Γκίκα σε συνεργασία με τον Διευθυντή του Εργαστηρίου Ελέγχου Ντόπινγκ, Δρ. Μανώλη Λυρή τους οποίους και ευχαριστώ για την ευκαιρία που μου έδωσαν να εργαστώ σε ένα τόσο καλά οργανωμένο και πλήρως εξοπλισμένο εργαστήριο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω και τη διδάκτορα Αργυρώ Φραγκάκη καθώς και τη διδάκτορα Πολυξένη Κιούση για την άψογη συνεργασία που είχα μαζί τους, για την εκπαίδευση που μου παρείχαν, την πολύτιμη βοήθειά τους καθώς και τη δημιουργία ενός ευχάριστου κλίματος εργασίας. Προς τα υπόλοιπα μέλη της Εξεταστικής Επιτροπής την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ε. Παντερή και τον Λέκτορα κ. Ιωάννη Ντότσικα, εκφράζω τις ευχαριστίες μου για το χρόνο που διέθεσαν για τη μελέτη της διατριβής αυτής και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. 7

8 8

9 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑ- ΖΩΝ ΜΕ ΑΝΑΛΥΤΗ ΧΡΟΝΟΥ ΠΤΗΣΗΣ (LC-QTOF/MS) ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΤΗ ΠΑΓΙ- ΔΑΣ ΙΟΝΤΩΝ (LC-IONTRAP/MS) ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΞΤΡΑΝΗΣ ΚΑΙ Υ- ΔΡΟΞΥΑΙΘΥΛΟ-ΑΜΥΛΟY ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Κόλιας Βασίλειος- Νεκτάριος Φαρμακοποιός Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου σάρωσης (screening), για την ανίχνευση της Δεξτράνης και του Υδρόξυαίθυλο- αμύλου σε ούρα α- θλητών με χρήση υγροχρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών και αναλυτή χρόνου πτήσης σε σειρά με τετράπολo (Liquid Chromatography- Quadrupole-Time of Flight, LC- QTOF) και με αναλυτή παγίδας (LC-IONTRAP/MS). Για τον ιοντισμό των ουσιών, έγινε χρήση ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό θετικής πολικότητας [electrospray ionization, (+)ESI]. Αρχικά, βελτιστοποιήθηκαν οργανολογικά οι παράμετροι μάζας και στους δύο αναλυτές με στόχο την μεγιστοποίηση του αναλυτικού σήματος. Στη συνέχεια, δοκιμάστηκε η χρωματογραφική συμπεριφορά των ουσιών με τη χρήση της υγροχρωματογραφίας υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων HILIC και επιλέχθηκαν οι χρωματογραφικές συνθήκες που δίνουν τον μέγιστο διαχωρισμό για τους αναλύτες. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε επικύρωση της μεθόδου σύμφωνα με τις Προδιαγραφές και τις τυποποιημένες μορφές εργασίας του Εργαστηρίου Ελέγχου Ντόπινγκ (ΤΜΕ022). Η επικύρωση της μεθόδου τόσο για τον αναλυτή χρόνου πτήσεως όσο και για τον αναλυτή παγίδας ιόντων περιελάμβανε τα εξής αναλυτικά χαρακτηριστικά: σχετικός χρόνος ανάσχεσης των ουσιών ως προς το εσωτερικό πρότυπο, ικανότητα προσδιορισμού των ουσιών στα 50 ppm, έλεγχο ειδικότητας της μεθόδου, τον υπολογισμό του λόγου σήματος προς θόρυβο, τον έλεγχο επιμόλυνσης, τις παρεμποδίσεις από το υπόστρωμα, την επίδραση από το υπόστρωμα, τον έλεγχο γραμμικότητας καθώς και τον έλεγχο επαναληψιμότητας. H μέθοδος κρίνεται κατάλληλη για τον προσδιορισμό της Δεξτράνης και του Υδρόξυαίθυλο- αμύλου. 9

10 ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών ΛΕΞΕΙΣ-ΚΛΕΙΔΙΑ: υγροχρωματογραφία υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων, αναλυτής χρόνου πτήσης, αναλυτής παγίδας ιόντων, δεξτράνη, HES 10

11 DEVELOPMENT OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-TIME OF FLIGHT (LC- QTOF/MS) AND IOTRAP (LC-IONTRAP/MS) MASS SPECTROMETRY METHODS FOR THE DETECTION OF DEXTRAN AND HYDROXYETHYL STARCH IN ATH- LETES URINE ABSTRACT Kolias Vasileios-Nektarios Pharmacist This Master Thesis presents the development and validation of a screening method for the detection of Dextran and Hydroxyethyl-starch with Liquid Chromatography- Mass Spectrometry employing a Time of Flight mass analyzer coupled with a quadrupole (LC-QTOF) as well as an Ion Trap analyzer (LC-IONTRAP/MS). Analytes were ionized with an electrospray ionization, performed in the positive mode [(+)ESI]. Initially, mass spectrometry parameters were optimized in order to maximize the analytical signal. In a second stage has been studied the chromatographic behavior of the analytes using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) and have been determined the chromatographic parameters that afforded the optimum resolution of the analytes. Finally, method validation was performed in accordance with the Specification and the Standardized Work Format of Doping Control Laboratory (TME022). The validation for both the time of flight and ion trap analyzers included the following analytical parameters: relative retention time, limit of detection (LOD), signal-to-noise ratio calculation, identification capability of substances at 50 ppm, carryover, specificity, matrix interferences, matrix effect, linearity and repeatability. As a result, the proposed method was considered suitable for the detection of Dextran and Hydroxyethyl starch in the human urine. 11

12 SUBJECT AREA: Detection of prohibited substances KEY WORDS: HILIC, time of flight analyzer, ion trap analyzer, dextran, HES 12

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 9 ABSTRACT 11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 13 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ - ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 27 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο :ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ Δεξτράνη (Dextran, DEX) Υδροξυαίθυλο-άμυλο (Hetastarch, HES) 48 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ: 51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΜΕ ΑΝΑΛΥΤΗ ΧΡΟΝΟΥ ΠΤΗΣΗΣ (LC-QTOF/MS) ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΤΗ ΠΑΓΙΔΑΣ ΙΟΝΤΩΝ (LC-ION TRAP MS) ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΔΙΟΓΚΩΤΙΚΩΝ ΟΓΚΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Εισαγωγή Διαλύματα αναφοράς Οργανολογία Προκατεργασία δειγμάτων Βελτιστοποίηση παραμέτρων φασματόμετρου μαζών Φάσματα πλήρους σάρωσης Φάσματα δίδυμης φασματομετρίας MS/MS Χρωματογραφικές συνθήκες Διαδικασίες διακρίβωσης οργάνων 61 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Αναλυτής χρόνου πτήσεως Σχετικός Χρόνος Ανάσχεσης (Relative Retention Time, RRT) Λόγος σήματος προς θόρυβο (S/N ratio) Ειδικότητα (Specificity) Ικανότητα προσδιορισμού απαγορευμένων ουσιών (Identification capability) Έλεγχος επιμόλυνσης αυτόματου δειγματολήπτη (Carryover) 70 13

14 5.1.6 Παρεμποδίσεις υποστρώματος (Matrix interferences) Επίδραση από το υπόστρωμα (matrix effect) Δοκιμασία ανίχνευσης σε πραγματικά θετικά δείγματα (Application to real samples) Δοκιμασία ελέγχου γραμμικότητας της μεθόδου Δοκιμασία ελέγχου επαναληψιμότητας της μεθόδου Πίνακας επικύρωσης της μεθόδου Αναλυτής παγίδα ιόντων Σχετικός Χρόνος Ανάσχεσης (Relative Retention Time, RRT) Ειδικότητα (Specificity) Ικανότητα προσδιορισμού απαγορευμένων ουσιών (Identification capability) Έλεγχος επιμόλυνσης (Carryover) Παρεμποδίσεις υποστρώματος (Matrix interferences) Επίδραση από το υπόστρωμα (Μatrix effect) Δοκιμασία ανίχνευσης σε πραγματικά θετικά δείγματα (Application to real samples) Δοκιμασία ελέγχου γραμμικότητας της μεθόδου Δοκιμασία ελέγχου επαναληψιμότητας της μεθόδου Πίνακας επικύρωσης της μεθόδου 87 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ 89 Βιβλιογραφία 93 14

15 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ - ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 1.1 Ορισμός του Ντόπινγκ 1,2 Για την απόδοση του όρου ντόπινγκ (doping) στα ελληνικά χρησιμοποιείται ο όρος φαρμακοδιέγερση. Ο όρος ντόπινγκ έχει υιοθετηθεί σε παγκόσμιο επίπεδο ώστε, εκτός της χορήγησης απαγορευμένων ουσιών να περιλαμβάνει και μεθόδους βελτίωσης της αθλητικής α- πόδοσης. Παρόλα αυτά, στην παρούσα εργασία, η οποία αφορά μόνο απαγορευμένες φαρμακευτικές ουσίες και όχι απαγορευμένες μεθόδους, χρησιμοποιείται ο όρος «φαρμακοδιέγερση» για την περιγραφή της λήψης απαγορευμένων φαρμάκων και ο όρος «έλεγχος φαρμακοδιέγερσης» για την περιγραφή του ελέγχου λήψης απαγορευμένων φαρμακευτικών ουσιών. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Κώδικα Αντιντόπινγκ (World Anti-Doping Code), ντόπινγκ είναι η παραβίαση ενός ή περισσότερων από τους κανονισμούς των άρθρων 2.1 έως 2.8 του Κώδικα, όπως συνοπτικά αναφέρονται παρακάτω: 1) Παρουσία απαγορευμένης ουσίας ή μεταβολιτών της ή δεικτών σε δείγμα του αθλητή 2) Χρήση ή απόπειρα χρήσης από τον αθλητή απαγορευμένης ουσίας ή απαγορευμένης μεθόδου 3) Άρνηση ή αποτυχία, χωρίς επαρκή δικαιολόγηση, συμμετοχής στη διαδικασία δειγματοληψίας κατόπιν ειδοποίησης, όπως περιγράφεται από τους ισχύοντες κανονισμούς α- ντιντόπινγκ ή η κατά οποιοδήποτε τρόπο αποφυγή της διαδικασίας δειγματοληψίας 4) Παραβίαση των ισχυόντων κανονισμών διαθεσιμότητας του αθλητή για έλεγχο εκτός συναγωνισμού, συμπεριλαμβανόμενων της αποτυχίας υποβολής απαιτούμενων πληροφοριών διαμονής και της μη εμφάνισης του αθλητή για έλεγχο. Οποιοσδήποτε συνδυασμός τριών αποτυχιών υποβολής πληροφοριών διαμονής και/ή μη εμφανίσεων του αθλητή για έ- λεγχο εντός χρονικής περιόδου δεκαοχτώ μηνών αποτελούν παραβίαση κανονισμών αντιντόπινγκ. 5) Αλλοίωση ή απόπειρα αλλοίωσης οποιουδήποτε τμήματος του ελέγχου ντόπινγκ. 6) Κατοχή απαγορευμένων ουσιών ή μεθόδων 7) Διακίνηση ή απόπειρα διακίνησης απαγορευμένων ουσιών 15

16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 8) Χορήγηση ή απόπειρα χορήγησης απαγορευμένης ουσίας εντός ή εκτός συναγωνισμού, ενθάρρυνση ή οποιασδήποτε μορφής συνενοχή σε παραβίαση ή απόπειρα παραβίασης οποιουδήποτε κανονισμού αντιντόπινγκ. Είναι χαρακτηριστικό ότι ο Κώδικας αναφέρεται σε απαγορευμένες κατηγορίες ουσιών και όχι σε συγκεκριμένες ουσίες. Με τον τρόπο αυτό, μπορεί να περιλαμβάνει κάθε χρονική στιγμή όλες τις ουσίες που μπορεί να θεωρηθεί ότι αποτελούν αθέμιτο τρόπο βελτίωσης της αθλητικής απόδοσης, ακόμη και αν η ίδια η ύπαρξή τους ή η χρήση τους στον αθλητισμό δεν είναι ακόμη γνωστή. 1.2 Κατάλογος απαγορευμένων ουσιών 3 Ο Κατάλογος των απαγορευμένων ουσιών αποτελεί απαραίτητο συμπλήρωμα του Κώδικα και σημαντικό παράγοντα εναρμόνισης των διεθνών πρακτικών στον Έλεγχο Ντόπινγκ. Περιλαμβάνει όλες τις κατηγορίες φαρμακευτικών ουσιών και τις μεθόδους που απαγορεύονται εντός και εκτός αγώνων. Αναθεωρείται μία φορά το χρόνο από τις Επιτροπές του WADA και η αναθεωρημένη έκδοση τίθεται σε ισχύ την 1η Ιανουαρίου του αντίστοιχου έτους ισχύος. Η ενσωμάτωση μιας φαρμακευτικής ουσίας σε μια από τις απαγορευμένες ουσίες του Καταλόγου κρίνεται, με βάση τη δράση ή τη χημική δομή της, από την Επιτροπή Εργασίας Καταλόγου Απαγορευμένων του WADA που αποτελείται από επιλεγμένους επιστήμονες. Παρακάτω παρατίθεται περίληψη του Καταλόγου Απαγορευμένων Ουσιών και Μεθόδων: Απαγορευμένες φαρμακευτικές ουσίες εντός και εκτός αγώνων. Ανδρογόνα Αναβολικά Στεροειδή (ΑΑΣ): 1. Εξωγενή ΑΑΣ, συμπεριλαμβανομένων, για παράδειγμα, των: αιθυλοϊστρενόλη, 1-ανδροστενοδιόνη, 1-ανδροστενοδιόλη, γεστρινόνη, δαναζόλη, δεϋδροχλωρομεθυλοτεστοστερόνη, δροστανολόνη, καλουστερόνη, κλοστεμπόλη, μεθαινολόνη, μεθανδιενόνη, μεθαστερόνη, μεστερολόνη, μπολδενόνη, μπολανδιόλη, οξυμεστερόνη, στανοζολόλη, 1-τεστοστερόνη, τρενμπολόνη, μεθυλοτριενολόνη, καθώς και άλλων ουσιών με παρόμοια χημική δομή ή παρόμοια φαρμακολογική και βιολογική δράση. 2. Τα ενδογενή ΑΑΣ συμπεριλαμβανομένων, για παράδειγμα, των: ανδροστενεδιόλη, ανδροστενεδιόνη, διυδροτεστοστερόνη, πραστερόνη (δεϋδροεπιανδροστερόνη) και τεστοστερόνη, καθώς και οι μεταβολίτες και τα ισομερή τους, όπως για παράδειγμα: 5α-ανδροστανο-3α,17α-διόλη, 5α-ανδροστανο-3α,17β-διόλη, ανδροστ-4-ενο-3α,17α-διόλη, ανδροστ-4-16

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ ενο-3α,17β-διόλη, 4-ανδροστενοδιόλη, επιτεστοστερόνη, 19-νορανδροστερόνη, 3α-υδροξυ- 5α-ανδροσταν-17-όνη κ.α. Για τα ενδογενώς παραγόμενα ανδρογόνα αναβολικά στεροειδή, θετικό αποτέλεσμα σε έλεγχο Ντόπινγκ (Αντικανονικό Αναλυτικό Εύρημα) δίνεται όταν η συγκέντρωση της ουσίας ή των μεταβολιτών της ή των δεικτών της και/ή οποιωνδήποτε άλλων σχετικών αναλογιών στο δείγμα αυτό, παρεκκλίνει από το εύρος των φυσιολογικών τιμών που προκύπτουν ενδογενώς, εκτός αν ο αθλητής μπορεί να αποδείξει ότι η συγκέντρωση οφειλόταν σε μια φυσιολογική ή παθολογική κατάσταση. Άλλοι αναβολικοί παράγοντες: 1. Συμπεριλαμβάνονται, αλλά δεν περιορίζονται, τα εξής: εκλεκτικοί τροποποιητές υποδοχέα ανδρογόνων (SARMs), ζερανόλη, ζιλπατερόλη, κλενβουτερόλη και τιμπολόνη. 2. Πεπτιδικές ορμόνες και σχετικές ουσίες: 3. Απαγορεύονται οι παρακάτω ουσίες, συμπεριλαμβανομένων και των αποδεσμευτικών τους παραγόντων: Αυξητική ορμόνη (GH), αυξητικοί παράγοντες τύπου ινσουλίνης όπως ο IGF-1, μηχανο-αυξητικοί παράγοντες (MGFs), χοριονική γοναδοτροπίνη (CG) και ωχρινοτρόπος ορμόνη (LH) στους άνδρες, παράγοντες που διεγείρουν την ερυθροποίηση, όπως η ερυθροποιητίνη (EPO), δαρβεποιητίνη (depo), αιματίδη, ινσουλίνη, κορτικοτροπίνη και άλλες ουσίες με παρόμοια χημική δομή ή παρόμοια φαρμακολογική και βιολογική δράση. Ένα δείγμα θεωρείται ότι περιέχει μια από τις παραπάνω αναφερθείσες ουσίες, όταν η συγκέντρωση της απαγορευμένης ουσίας ή των μεταβολιτών της και/ή οι σχετικές αναλογίες ή οι δείκτες στο δείγμα του αθλητή ικανοποιούν τα κριτήρια θετικού αποτελέσματος που έχουν τεθεί από τον WADA ή υπερβαίνουν το εύρος των φυσιολογικών τιμών, ώστε να μην αντιστοιχούν σε φυσιολογική, ενδογενή παραγωγή, εκτός αν ο αθλητής μπορεί να αποδείξει ότι η συγκέντρωση οφειλόταν σε μια φυσιολογική ή παθολογική κατάσταση. β2-αγωνιστές: Απαγορεύονται όλοι οι β2-αγωνιστές, συμπεριλαμβανομένων των R- και S- ισομερών τους. Συνεπώς, και η χορήγηση δι εισπνοής φορμοτερόλης, σαλβουταμόλης, σαλμετερόλης και τερβουταλίνης, απαιτεί προηγούμενη έγκριση από τον αρμόδιο φορέα για κατ εξαίρεση χρήση για θεραπευτικούς σκοπούς. Ακόμη και αν έχει χορηγηθεί έγκριση στον αθλητή για κατ εξαίρεση χρήση για θεραπευτικούς σκοπούς, όταν το εργαστήριο αναφέρει συγκέντρωση σαλ- 17

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ βουταμόλης μεγαλύτερη των 1000 ng/ml, αυτή θεωρείται ως Αντικανονικό Αναλυτικό Εύρημα, εκτός αν ο αθλητής αποδείξει, μέσω ελεγχόμενης φαρμακοκινητικής μελέτης, ότι το α- ποτέλεσμα τούτο ήταν συνέπεια της θεραπευτικής χρήσης σαλβουταμόλης με εισπνοή. Ανταγωνιστές και τροποποιητές ορμονών: Απαγορεύονται οι ακόλουθες κατηγορίες: 1. Αναστολείς της αρωματάσης συμπεριλαμβανομένων, αλλά μη περιοριζόμενων στους: αναστραζόλη, αμινογλουτεθιμίδιο, εξεμεστάνη, λετροζόλη, τεστολακτόνη, φορμεστάνη. Εκλεκτικοί τροποποιητές υποδοχέων οιστρογόνων (SERMs) συμπεριλαμβανομένων, αλλά μη περιοριζόμενων στους: ραλοξιφαίνη, ταμοξιφαίνη, τορεμιφαίνη. 2. Άλλες ουσίες με αντι-οιστρογονική δράση συμπεριλαμβανομένων, αλλά μη περιοριζόμενων στις: κλομιφαίνη, κυκλοφενίλιο, φουλβεστράντη. 3. Παράγοντες που τροποποιούν τις λειτουργίες της μυοστατίνης συμπεριλαμβανομένων, αλλά μη περιοριζόμενων στους αναστολείς της μυοστατίνης. Διουρητικά και άλλοι παράγοντες επικάλυψης: Απαγορεύονται οι παράγοντες επικάλυψης, οι οποίοι περιλαμβάνουν: διογκωτικά ό- γκου πλάσματος (π.χ. ενδοφλέβια χορήγηση αλβουμίνης, δεξτράνης, υδροξυαιθυλαμύλου και μαννιτόλης), διουρητικά, προβενεσίδη και άλλες ουσίες με παρόμοιες βιολογικές δράσεις. Στα διουρητικά περιλαμβάνονται τα: αιθακρυνικό οξύ, ακεταζολαμίδιο, αμιλορίδη, κανρενόνη, μετολαζόνη, τριαμτερένη και άλλες ουσίες με παρόμοια χημική δομή ή παρόμοια φαρμακολογική και βιολογική δράση (εκτός της δροσπερόνης και τοπικής χρήσης δορζολαμίνης και βρινζολαμίδης, τα οποία δεν απαγορεύονται). Η έγκριση κατ εξαίρεση χρήσης διουρητικού για θεραπευτικούς λόγους δεν ισχύει, εάν τα ούρα του αθλητή περιέχουν διουρητικό μαζί με μια εξωγενή απαγορευμένη ουσία, έστω και εάν η συγκέντρωση της ουσίας είναι μικρότερη από την ελάχιστα απαιτούμενη αναλυτική της προδιαγραφή. Απαγορευμένες μέθοδοι εντός και εκτός αγώνων 1. Αύξηση μεταφοράς οξυγόνου: Απαγορεύεται το ντόπινγκ αίματος συμπεριλαμβανομένης της χρήσης αυτόλογου, ομόλογου ή ετερόλογου αίματος ή προϊόντων ερυθρών αιμοσφαιρίων οποιασδήποτε άλλης προέλευσης. Η τεχνητή αύξηση της πρόσληψης, μεταφοράς ή απόδοσης οξυγόνου, συμπεριλαμβανομένης της, αλλά όχι περιοριζόμενης σε, χρήσης υπερφθοριο-χημικών ενώσεων, εφαπροξιράλης και τροποποιημένων προϊόντων αιμοσφαιρίνης (υποκατάστατα αίματος βασισμένα στην αιμοσφαιρίνη, προϊόντα μικροενκαψυλιωμένης αιμοσφαιρίνης). 2. Φαρμακολογικοί, χημικοί και φυσικοί χειρισμοί: 18

19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 3. Απαγορεύεται η αλλοίωση ή η απόπειρα αλλοίωσης με σκοπό τη μεταβολή της ακεραιότητας και της εγκυρότητας των δειγμάτων που συλλέγονται σε ελέγχους ντόπινγκ. Οι χειρισμοί περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται σε καθετηριασμό, αντικατάσταση και /ή νόθευση ούρων. 4. Οι ενδοφλέβιες εγχύσεις απαγορεύονται, εκτός από περιπτώσεις χειρουργικών χειρισμών, επειγόντων ιατρικών περιστατικών ή κλινικών εξετάσεων. Γονιδιακό ντόπινγκ: 1. Απαγορεύεται η μεταφορά κυττάρων ή γενετικών στοιχείων ή η χρήση κυττάρων, γενετικών στοιχείων ή φαρμακευτικών παραγόντων, με σκοπό τη ρύθμιση της έκφρασης ενδογενών γονιδίων, τα οποία έχουν την ικανότητα να αυξήσουν την αθλητική απόδοση. Απαγορεύονται οι αγωνιστές του Ενεργοποιημένου Υποδοχέα δ πολλαπλασιαστή Υπεροξυσωμάτων (PPARδ) και οι αγωνιστές του άξονα PPARδ-AMP-ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK). 2. Τα τεχνητά γονίδια εισάγονται στον οργανισμό των πειραματόζωων είτε με την απευθείας ενδομυϊκή ένεση DNA, είτε με τη χορήγηση γενετικά τροποποιημένων κυττάρων, είτε με τη χρήση ενός ιού ως φορέα των γονιδίων Όλες οι ανωτέρω τεχνικές γονιδιακής θεραπείας μπορούν να χρησιμοποιηθούν δυνητικά στο μέλλον από αθλητές με σκοπό την επίτευξη του αντίστοιχου αποτελέσματος. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η χρήση των τεχνικών γονιδιακής θεραπείας αφορά υγιή άτομα, συνεπώς οι πιθανοί κίνδυνοι για την υγεία να μην είναι πλήρως γνωστοί. Βέβαια κάποιοι κίνδυνοι είναι αναμενόμενοι και γνωστοί. Η χρήση ιών ως φορέων των γονιδίων για παράδειγμα θα μπορούσε να οδηγήσει σε μεταλλαξεογένεση. Απαγορευμένες Ουσίες και Μέθοδοι Μόνο Εντός Αγώνων: 1. Διεγερτικά: Απαγορεύονται όλα τα διεγερτικά (συμπεριλαμβανομένων αμφότερων των οπτικών ισομερών τους), εκτός των παραγώγων ιμιδαζολίου για τοπική χρήση και των διεγερτικών εκείνων που περιλαμβάνονται στο Πρόγραμμα Παρακολούθησης του Δεν απαγορεύεται η αδρεναλίνη ως συστατικό ιδιοσκευασμάτων για τοπική αναισθησία ή για τοπική χορήγηση (ρινική, οφθαλμική). Οι ουσίες εφεδρίνη και μεθυλεφεδρίνη απαγορεύονται, όταν η συγκέντρωσή τους στα ούρα είναι μεγαλύτερη από 10 μg/ml. Επίσης, η ουσία καθίνη απαγορεύεται, όταν η συγκέντρωσή της στα ούρα είναι μεγαλύτερη από 5 μg/ml. 19

20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 2. Ναρκωτικά: Τα φάρμακα της κατηγορίας αυτής καταστέλλουν τον έντονο πόνο. Ορισμένα παραδείγματα ναρκωτικών που απαγορεύονται είναι τα εξής: βουπρενορφίνη, δεξτρομοραμίδιο, διακετυλομορφίνη-διαμορφίνη (ηρωίνη), μεθαδόνη, μορφίνη, υδρομορφόνη κ.α. 3. Κανναβινοειδή: Απαγορεύονται τα κανναβινοειδή (όπως αυτά που περιέχονται σε μαριχουάνα, χασίς). 4. Γλυκοκορτικοστεροειδή: Απαγορεύονται όλα τα γλυκοκορτικοστεροειδή, όταν χορηγούνται από το στόμα, το ορθό, ενδοφλεβίως ή ενδομυικώς. Η χρήση τους προϋποθέτει έγκριση Κατ Εξαίρεση Χρήσης για Θεραπευτικούς Σκοπούς. Σύμφωνα με το Διεθνές Πρότυπο για την Κατ Εξαίρεση Χρήση για Θεραπευτικούς Σκοπούς, πρέπει να συμπληρώνεται από τον αθλητή μια δήλωση χρήσης για κορτικοστεροειδή, με οδούς χορήγησης ενδοαρθρικές, περιαρθρικές, περιτενόντιες, επισκληρίδιες, ενδοδερμικές και δια εισπνοής εκτός ορισμένων περιπτώσεων. Σκευάσματα τοπικής χρήσης όταν χρησιμοποιούνται για δερματικές, ωτικές, ρινικές, οφθαλμολογικές, στοματικές, φατνιακές και περιπρωκτικές βλάβες, δεν απαγορεύονται και δεν απαιτείται οποιαδήποτε διαδικασία Κατ Εξαίρεση Χρήσης για Θεραπευτικούς σκοπούς ή δήλωση χρήσης. Απαγορευμένες Ουσίες σε συγκεκριμένα αθλήματα 1) Αιθυλική αλκοόλη: Η αιθυλική αλκοόλη (αιθανόλη) απαγορεύεται μόνο εντός Αγώνων, στα ακόλουθα αθλήματα: αεροναυτική, τοξοβολία, αυτοκίνητο, boules, καράτε, μοντέρνο πένταθλο, μοτοσυκλετισμός, μπόουλινγκ, λεμβοδρομία ισχύος. Η ανίχνευση θα γίνεται με ανάλυση του εκνεόμενου αέρα και / ή αίματος. Το όριο συγκέντρωσης αλκοόλης (στο αίμα), υπέρβαση του οποίου συνιστά παράβαση ντόπινγκ, είναι τα 0,10 g/l. 2) β-αναστολείς: Οι ουσίες αυτές επιβραδύνουν τους ρυθμούς της καρδιάς και χρησιμοποιούνται σε αθλήματα που στηρίζονται στην ηρεμία του αγωνιζόμενου, για την εκτέλεση λεπτών και ακριβών κινήσεων. Οι β-αναστολείς απαγορεύονται μόνο Εντός Αγώνων, εκτός εάν καθορίζεται διαφορετικά στα παρακάτω αθλήματα: αεροναυτική, τοξοβολία, αυτοκίνητο, boules, μπιλιάρδο, bobsleigh, μπριτζ, curling, γκολφ, γυμναστική, μοτοσικλετισμός, μοντέρνο πένταθλο, μπόουλινγκ, λεμβοδρομία ισχύος, ιστιοπλοΐα, σκοποβολή, σκι σε χιόνι, άλμα σκι και χιονοσανίδα, πάλη. Οι β-αναστολείς περιλαμβάνουν, χωρίς να περιορίζονται, τα παρακάτω: ακεβουτολόλη, ατενολόλη, αλπρενολόλη, βηταξολόλη, βισοπρολόλη, βουνολόλη, ε- 20

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ σμολόλη, καρτεολόλη, καρβεδιλόλη, κελιπρολόλη, λαβηταλόλη, λεβοβουνόλη, μετιπρανολόλη, μεταπρολόλη, ναδολόλη, οξπρενολόλη, προπρανολόλη, πινδολόλη, σοταλόλη, τιμολόλη κ.α. Στον πίνακα 1.1 παρουσιάζονται συνοπτικά για ορισμένες χαρακτηριστικές κατηγορίες απαγορευμένων φαρμακευτικών ουσιών οι λόγοι λήψης (επιθυμητή επίδραση στην αθλητική απόδοση) και οι παρενέργειές τους. ΠΙΝΑΚΑΣ 1.1 Απαγορευμένες φαρμακευτικές ουσίες, Τύπος φαρμάκου Επιθυμητές ενέργειες Παρενέργειες Διεγερτικά Ψυχοκινητικά Αύξηση εγρήγορσης, Αναστολή Διαταραχές θερμορύθμισης, ταχυκαρδία, διεγερτικά (π.χ. αμ- φεταμίνες) εμφανίσεως κοπώσεως, Αύξηση αγωνιστικής διάθεσης και επιθετικότητας αρρυθμίες, αύξηση αρτηριακής πιέσεως, διαταραχές πεπτικού, ανορεξία, απώλεια βάρους, αϋπνία, κεφαλαλγία, ψυχική και σωματική εξάρτηση, ανοχή, απώλεια γενετήσιας επιθυμίας, απότομη εμφάνιση καμάτου, ξαφνικός θάνατος Συμπαθητικομιμητικές Αύξηση ροής αίματος στους Ανορεξία, ταχυκαρδία, υπέρταση αμίνες (π.χ. εφεδρίνες) μύες, αύξηση επιπέδου γλυκόζης στο αίμα, βρογχοδιαστολή Ναρκωτικά αναλγητικά Κάλυψη σωματικού άλγους Σωματική και ψυχική εξάρτηση, εθισμός Αναβολικά στεροειδή Αύξηση μυϊκής μάζας, δυνάμεως, επιθετικότητας Ελάττωση αισθήματος κόπωσης Άνδρες: ελάττωση ενδογενώς παραγόμενης τεστοστερόνης, ατροφία όρχεων, αζωοσπερμία, στείρωση Γυναίκες: δασυτριχισμός, αλλαγή Μείωση χρόνου αποκατάστασης μετά από έντονη προπόνηση χροιάς φωνής, ατροφία μήτρας, μεγέθυνση κλειτορίδας, αμηνόρροια, στείρωση Γενικά: αύξηση επιθετικότητας και θυμού, ψυχώσεις, αλωπεκία, ακμή, 21

22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ β- αναστολείς Ελάττωση συμπτωμάτων μυϊκής κόπωσης, προαγωνιστικής εντάσεως, μείωση μυϊκού τρόμου Διουρητικά Ελάττωση σωματικού βάρους, ελάττωση συγκεντρώσεως φαρμάκων στα ούρα Χοριονική γοναδοτροπίννούς Διέγερση παραγωγής ενδογε- τεστοστερόνης Αυξητική ορμόνη Αύξηση σωματικού μεγέθους και δυνάμεως Ερυθροποιητίνη Αύξηση αριθμού ερυθροκυττάρων Διογκωτικά όγκου πλάσματος Αύξηση όγκου του πλασματος του αίματος σε περιπτώσεις α- πώλειας αίματος αυξημένη γενετήσια επιθυμία, μείωση HDL, αύξηση LDL, βλάβη τοιχωμάτων αγγείων, αύξηση αρτηριακής πιέσεως, ηπατική δυσλειτουργία, χολοστατικός ίκτερος, δημιουργία κιρσωδών ανευρυσμάτων Βρογχοσπασμός, υπόταση, βραδυκαρδία, σεξουαλικές δυσλειτουργίες σε άνδρες, αίσθημα κόπωσης, μειωμένη αντοχή Αφυδάτωση, διαταραχές ηλεκτρολυτών, μυϊκές κράμπες Κεφαλαλγία, μεταβολές διαθέσεως, κατάθλιψη, οίδημα Ακρομεγαλία, μυοπάθεια, περιφερειακή νευροπάθεια, παθήσεις στεφανιαίων, καρδιομυοπάθεια Υπέρταση, καρδιακή ανεπάρκεια, ε- γκεφαλικά επεισόδια 1.3 Δειγματοληψία και έλεγχος ντόπινγκ 4,5 Το πρώτο στάδιο του ελέγχου ντόπινγκ είναι η λήψη του δείγματος. Οι συνήθεις επιλογές δειγμάτων είναι ούρα και αίμα. Για την ανίχνευση των περισσοτέρων απαγορευμένων φαρμακευτικών ουσιών επιλέγεται το δείγμα ούρων, λόγω ευκολίας λήψης, του σχετικά μεγάλου λαμβανόμενου όγκου και κυρίως επειδή η συγκέντρωση των φαρμάκων αναμένεται να είναι υψηλότερη από ότι στο αίμα. Για την εξασφάλιση της ανωνυμίας του αθλητή, το Εργαστήριο 22

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ Ελέγχου Φαρμακοδιέγερσης δεν εμπλέκεται στη διαδικασία δειγματοληψίας. Για τη δειγματοληψία έχουν καταρτιστεί λεπτομερείς διαδικασίες, οι οποίες είναι ενσωματωμένες, τόσο στο Διεθνές Πρότυπο για τους Ελέγχους, όσο και στη Νομοθεσία κάθε χώρας. Χρησιμοποιούνται ειδικές ασφαλείς συσκευασίες (security kits) που περιλαμβάνουν υάλινους περιέκτες και πώματα με μοναδική σήμανση. Μετά τη συλλογή του δείγματος ούρων σε ουροσυλλέκτη, ο αθλητής επιλέγει μια από τις ειδικές συσκευασίες και μοιράζει το περιεχόμενο του ουροσυλλέκτη στις φιάλες Α και Β. Τα δείγματα Α και Β αποστέλλονται κατόπιν στο Εργαστήριο Ελέγχου Φαρμακοδιέγερσης συνοδευόμενα από έγγραφα, τα οποία αφενός μεν εξασφαλίζουν την ανωνυμία του αθλητή, αφετέρου δε επιτρέπουν την παρακολούθηση και καταγραφή όλων των σταδίων μετακίνησης του δείγματος. Στο Εργαστήριο ανοίγεται και αναλύεται το δείγμα Α, και τα αποτελέσματα ανακοινώνονται στους αρμόδιους φορείς. Το ακέραιο δείγμα Β διατηρείται σε καταψύκτη ώστε, σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος για το δείγμα Α, να μπορεί να ζητηθεί από τον αθλητή το άνοιγμα και ανάλυση του δείγματος Β. Οι διαδικασίες αυτές υπόκεινται και σε αναθεώρηση και προσαρμογή στα πλαίσια της υποχρεωτικής διαπίστευσης του Εργαστηρίου κατά το πρότυπο ISO Τα διαπιστευμένα από τη ΔΟΕ εργαστήρια, συνολικά 28, βρίσκονται υπό διαρκή έ- λεγχο και είναι υποχρεωμένα να υποβάλλονται στην παραπάνω δοκιμασία 4 φορές το χρόνο (Reaccreditation Test). Αν ένα εργαστήριο αποτύχει στην ανάλυση των παραπάνω δειγμάτων, χάνει τη διαπίστευση μέχρι να επιτύχει ή μεταπίπτει σε κατάσταση περιορισμένης δικαιοδοσίας. Πρωτοπόρος του εργαστηριακού ελέγχου doping υπήρξε ο Γερμανός Manfred Donicke. Το Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ του Ολυμπιακού Αθλητικού Κέντρου Αθηνών (Ο.Α.Κ.Α.) διαπιστεύτηκε από τη ΔΟΕ το Η αξιοπιστία του εργαστηρίου αυξάνει σημαντικά με τη διαπίστευσή του από τον Εθνικό Φορέα Διαπίστευσης (ΕΣΥΔ). Παρακάτω συνοψίζονται οι διαδικασίες που απαιτούνται για την ανάλυση δειγμάτων προερχόμενων από ανθρώπους: 1. Μεταφορά των δειγμάτων στο εργαστήριο και έλεγχος της ακεραιότητας της συσκευασίας (Α και Β δείγματος) 2. Αποθήκευση του Β-δείγματος, σύμφωνα με τις οδηγίες του κώδικα της ΔΟΕ και χρησιμοποίηση του Α δείγματος, για τις διαδικασίες σάρωσης. 3. Εκτέλεση προ-αναλυτικών διαδικασιών (μέτρηση όγκου, ph, ειδικού βάρους). 4. Επιλογή της μεθόδου ελέγχου που θα ακολουθηθεί στην προσανατολιστική α- νάλυση (screening procedure) του Α δείγματος. 23

24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 5. Επιβεβαιωτική ανάλυση (confirmation ή quantification procedure) του δείγματος σε περίπτωση που θεωρηθεί ύποπτο για την ύπαρξη απαγορευμένης ουσίας μετά την προσανατολιστική ανάλυση. 6. Ανάλυση του Β - δείγματος, εφόσον βέβαια αυτό ζητηθεί από τον αθλητή ή την ομοσπονδία του. Έκδοση αποτελεσμάτων και συγγραφή αναλυτικής έκθεσης (report) στην περίπτωση θετικού δείγματος, στην οποία αναφέρεται η ονομασία της απαγορευμένης ουσίας που ανιχνεύτηκε, καθώς και ο κωδικός του θετικού δείγματος, στην περίπτωση ποιοτικού προσδιορισμού (confirmation procedure) και επιπλέον η ακριβής συγκέντρωση της ουσίας στο βιολογικό υγρό, στην περίπτωση ουσιών που απαιτείται ποσοτικός προσδιορισμός (quantification procedure). 1.4 Ελάχιστο απαιτούμενο όριο απόδοσης 6 Για την εναρμόνιση του τρόπου έκδοσης αποτελεσμάτων από τα Εργαστήρια Ελέγχου Φαρμακοδιέγερσης, ο WADA έχει καθορίσει ελάχιστα επίπεδα ανίχνευσης για κάθε κατηγορία απαγορευμένων ουσιών (Πίνακας 1.2) ΠΙΝΑΚΑΣ 1.2 Ελάχιστα Απαιτούμενα Επίπεδα Απόδοσης Κατηγορία απαγορευμένων ουσιών Διεγερτικά a Ναρκωτικά Αναβολικοί παράγοντες a Ειδικά παραδείγματα και εξαιρέσεις Οκτοπαμίνη Βουπρενορφίνη Φεντανύλη και παράγωγα Διχλωρομεθυλτεστοστερόνη Κλενβουτερόλη Μεθανδιενόνη b Μεθυλοτεστοστερόνη c Στανοζολόλη d Συγκέντρωση 100 ng/ml 1μg/ml 50 ng/ml 5 ng/ml 2 ng/ml 5 ng/ml 2 ng/ml 0.2 ng/ml 2 ng/ml 2 ng/ml 2 ng/ml 24

25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ Ορμονικοί ανταγωνιστές και τροποποιητές β2-αγωνιστές β-αναστολείς Διουρητικά Γλυκοκορτικοστεροειδή Κανναβινομιμητικά Φορμεστάνη 20 ng/ml 150 ng/ml 20 ng/ml 100 ng/ml 200 ng/ml 30 ng/ml 1 ng/ml a: Μητρική ουσία και μεταβολίτες b: Μεταβολίτης 17β-μεθυλο-5β-ανδροστ-1-ενο-3α,17α-διόλη c: Μεταβολίτης 17α-μεθυλο-5β-ανδροστανο-3α,17β-διόλη d: Μεταβολίτης 3 -υδροξυστανοζολόλη Αυτά τα Ελάχιστα Απαιτούμενα Επίπεδα Απόδοσης (Minimum Required Performance Level, MRPL), υποχρεωτικά για όλα τα Εργαστήρια, δεν αποτελούν όρια ανίχνευσης ή ποσοτικοποίησης, αλλά αναλυτικές προδιαγραφές τεχνικής απόδοσης των Εργαστηρίων κατά την πραγματοποίηση ελέγχων ρουτίνας. 25

26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο : ΦΑΡΜΑΚΟΔΙΕΓΕΡΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 26

27 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 2.1 Εισαγωγή Προκειμένου να διασφαλιστεί η αξιοπιστία και η εγκυρότητα μιας ανάλυσης απαιτείται να διεξαχθούν μια σειρά προσανατολιστικών (screening procedures) και επιβεβαιωτικών διαδικασιών (confirmation procedures). Η αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό των απαγορευμένων ουσιών επιλέγεται με βάση την κατηγορία στην οποία ανήκουν οι προσδιοριζόμενες ουσίες, την ποσότητα αυτών στο βιολογικό υγρό, το είδος του βιολογικού δείγματος (ούρα, αίμα), την πηγή προέλευσης του βιολογικού υγρού (άνθρωποι ή άλογα) αλλά και τον αριθμό των μεταβολιτών που απεκκρίνονται. Στον έλεγχο φαρμακοδιέγερσης συνηθισμένες τεχνικές σάρωσης αποτελούν οι εξής: Αεριοχρωματογραφία Φασματομετρία Μαζών (GC-MS) Αεριοχρωματογραφία με Ανιχνευτή Αζώτου-Φωσφόρου (GC-NPD) Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί (τεχνική ELISA και RIA) Υγροχρωματογραφία Φασματομετρία Μαζών (LC-MS) Ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) Η αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία είναι η τεχνική της Υγροχρωματογραφίας-Φασματομετρίας Μαζών με αναλυτή χρόνου πτήσης (LC/QTOF-MS) καθώς και α- ναλυτή παγίδας ιόντων (LC/IONTRAPMS). Για την διασύνδεση του υγροχρωματογράφου με το φασματόμετρο μαζών και την παραγωγή των ιόντων πραγματοποιείται ιοντισμός σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης όπως ο ιοντισμός μέσω ηλεκτροψεκασμού (ESI- electrospray ionization) που χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας. 2.2 Φασματομετρία μαζών με αναλυτή χρόνου πτήσης (Time-of-flight Mass Spectrometry TOF-MS) Ιστορική αναδρομή Το πρώτο φασματόμετρο χρόνου πτήσης κατασκευάστηκε από τους A.E.Cameron και D.F.Eggers το Περιλάμβανε μια παλμική πηγή ιόντων, ένα θάλαμο πτήσης άνευ εφαρμοζόμενου πεδίου (filed free region) και ένα παλμογράφο ως ανιχνευτή. Η διαχωριστική ικανότητα όμως αυτού του μηχανήματος ήταν πολύ χαμηλή. Η πρώτη δημοσίευση που περιελάμβανε την παρουσίαση πρακτικής 27

28 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ εφαρμογής ενός μηχανήματος TOF-MS χρονολογείται το Στη συνέχεια ξεκίνησε μια σειρά μελετών τη δεκαετία του 60 που έδωσε σημαντική ώθηση στην τεχνική αυτή, σύντομα όμως το ενδιαφέρον περιορίστηκε καθώς άρχισαν να χρησιμοποιούνται ευρύτερα τετραπολικοί αναλυτές ή αναλυτές μαγνητικού-ηλεκτρικού πεδίου που παρουσίαζαν υψηλότερη ευαισθησία και μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα. Κυριότερη αιτία ήταν η απουσία διαθέσιμων τεχνολογιών καταγραφής και επεξεργασίας των φασμάτων μαζών σε χρονικό εύρος της τάξης των μικροδευτερολέπτων (microsecond μs) που απαιτούσαν οι αναλυτές TOF προκειμένου να επιτύχουν υψηλή διαχωριστική ικανότητα. Οι τεχνικές αυτές είναι σήμερα διαθέσιμες και σε συνδυασμό με τις υπάρχουσες τεχνικές ιονισμού, την υψηλή ταχύτητα λήψεως φασμάτων και το χαμηλό κόστος, το TOFMS έχει επανεμφανιστεί ως πολλά υποσχόμενος αναλυτής μαζών Αρχή λειτουργίας 7,8,9,10,11,12,13 Η βασική αρχή λειτουργίας του φασματομέτρου μαζών με αναλυτή χρόνου πτήσης (TOF-MS), είναι ότι ιόντα που κινούνται προς την ίδια κατεύθυνση και έχουν διαφορετική μάζα, αλλά την ίδια κινητική ενέργεια, θα έχουν αντίστοιχα διαφορετική ταχύτητα, η οποία θα είναι αντιστρόφως ανάλογη της τετραγωνικής ρίζας του λόγου μάζα-προς-φορτίο (m/z). Έτσι, στο TOF-MS τα ιόντα μετά την παραγωγή τους επιταχύνονται και αποκτούν υψηλή κινητική ενέργεια μέσω της εφαρμογής καθορισμένου δυναμικού από ηλεκτροστατικό πεδίο που περιλαμβάνεται σε διάταξης επιτάχυνσης, και στη συνέχεια εισέρχονται εντός καθορισμένης διαδρομής απουσία εφαρμοζόμενου πεδίου και μετρώνται οι χρόνοι πτήσης τους. Οι χρόνοι πτήσης κατόπιν χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των λόγων m/z των αντίστοιχων ιόντων. Στο σχήμα 2.1 φαίνεται η επιτάχυνση σωματιδίων διαφορετικού μεγέθους και η κίνησή τους εντός του θαλάμου πτήσης, από όπου φαίνεται ότι τα ιόντα με μεγαλύτερη μάζα φτάνουν αργότερα στον ανιχνευτή. 28

29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Σχήμα 2.1 Αναλυτής χρόνου πτήσης (TOF-MS) Αναλυτικότερα, όταν εφαρμοστεί σταθερό δυναμικό V σε ένα ιόν φορτίου ez όπου e το στοιχειώδες φορτίο ενός ηλεκτρονίου και z ο αριθμός των θέσεων φόρτισης στο μόριο, το ιόν θα αποκτήσει κινητική ενέργεια E που δίνεται από τη σχέση: E = Vez (2-1) και θα κινηθεί παράλληλα προς το εφαρμοζόμενο πεδίο με ταχύτητα u, η οποία εξαρτάται από τη μάζα του ιόντος, m, και το φορτίο του 1 2 (όπου e είναι το φορτίο ενός ηλεκτρονίου), σύμφωνα με τη σχέση: Vez = mu (2-2), η οποία μπορεί 2 2eVz m 2eV να γραφτεί με τη μορφή: m = ή και 2 = 2 (2-3). u z u Όπως φαίνεται από τη σχέση (2-3), για δεδομένη κινητική ενέργεια, τα ιόντα που έχουν μικρή μάζα θα έχουν μεγαλύτερη ταχύτητα από τα ιόντα που έχουν μεγαλύτερη μάζα. Στο TOFMS, τα ιόντα που εξέρχονται από την πηγή επιταχύνονται προς γνωστή κινητική ενέργεια και αναγκάζονται με την εφαρμογή ηλεκτρικών παλμών να εισέλθουν σε θάλαμο πτήσης γνωστού μήκους L στον οποίο υπάρχει υψηλό κενό χωρίς την επίδραση πεδίου. Η χρονική στιγμή της εφαρμογής του παλμού ορίζεται ως t=0. Κατά τη διάρκεια της πτήσης τους, τα ιόντα διαχωρίζονται κατά μήκος του άξονα κίνησης με βάση την τιμή του λόγου m/z. Στο τέλος του θαλάμου πτήσης τα ιόντα προσκρούουν σε ένα ανιχνευτή και καταγράφονται οι αντίστοιχοι χρόνοι πτήσης. Ο χρόνος πτήσης δίνεται από τη σχέση: t = L/ u (2-4) οπότε για γνωστές τιμές εφαρμοζόμενου δυναμικού επιτάχυνσης και μήκους διαδρομής πτήσης, υπολογίζεται ο λόγος m/z, ο οποίος είναι ανάλογος του τετραγώνου του χρόνου πτήσης του αντίστοιχου ιόντος: m t = 2 (2-5) z 2Ve( ) L Κατά αυτό τον τρόπο, η εφαρμογή του παλμού δημιουργεί ένα μικρό σύνολο από ιόντα (σμήνος ιόντων), το οποίο κατά τη διάρκεια της πτήσης διαχωρίζεται σε μικρότερα σμήνη ανάλογα με τις 29

30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ επιμέρους ταχύτητες των ιόντων έτσι, ώστε η άφιξή τους στον ανιχνευτή να μπορεί να καταγραφεί με τη μορφή φάσματος μαζών. Για την αποφυγή ασάφειας στη μέτρηση των χρόνων πτήσης, ο χρόνος μεταξύ διαδοχικών παλμών πρέπει να είναι μεγαλύτερος από το χρόνο πτήσης του ιόντος με τη μεγαλύτερη τιμή m/z. Στην πραγματικότητα, παρατηρούνται δύο ειδών καθυστερήσεις: χρόνος που μεσολαβεί από τη στιγμή της εφαρμογής του παλμού μέχρι την εμφάνιση υψηλού δυναμικού στην παλμική πλάκα (ionpulser) και χρόνος που μεσολαβεί από τη στιγμή που ένα ιόν προσκρούει στον ανιχνευτή μέχρι την ψηφιοποίηση του λαμβανόμενου σήματος. Οι καθυστερήσεις αυτές, αν και μικρές, αυξάνουν τον παρατηρούμενο χρόνο πτήσης, οπότε ο πραγματικός χρόνος πτήσης θα είναι μικρότερος από τον παρατηρούμενο Διαχωριστική ικανότητα και ευαισθησία αναλυτών TOF-MS Διαχωριστική ικανότητα 14,15 Η διαχωριστική ικανότητα R ενός αναλυτή TOFMS δίνεται από τη σχέση: R = m = m t (2-6) 2 t όπου m είναι η μάζα του ιόντος, Δm το πλάτος στο μέσον του μέγιστου της κορυφής του ιόντος (full width half maximum - FWHM) στο φάσμα μαζών, t είναι ο χρόνος πτήσης του ιόντος και Δt το πλάτος στο μέσον του μέγιστου της κορυφής του ιόντος στον άξονα του χρόνου. Έτσι, αν χρησιμοποιούνται μονάδες χρόνου, η διαχωριστική ικανότητα των αναλυτών TOF-MS είναι η μισή σε σχέση με την τιμή που υπολογίζεται όταν χρησιμοποιούνται μονάδες μάζας. Το γεγονός αυτό προκύπτει και από τη σχέση 2.5, όπου φαίνεται ότι η μάζα του ιόντος είναι ανάλογη του τετραγώνου του χρόνου. Θεωρητικά, για πηγές συνεχόμενης παραγωγής ιόντων, οι χρόνοι πτήσης (που χρησιμοποιούνται για τον υ- πολογισμό της διαχωριστικής ικανότητας) του TOF-MS εξαρτώνται μόνο από το m/z και το εφαρμοζόμενο δυναμικό. Στην πράξη όμως επηρεάζονται σημαντικά από παράγοντες που οδηγούν σε διεύρυνση των χρωματογραφικών κορυφών και σε μείωση της ικανότητας διαχωρισμού γειτονικών κορυφών. Οι κυριότεροι από τους παράγοντες αυτούς είναι: Διασπορά χρόνου σχηματισμού των ιόντων στην πηγή Διασπορά ταχυτήτων (αν η αρχική ταχύτητα ιόντων δεν είναι μηδέν ή λόγω απώθησης μεταξύ ιόντων αλληλεπιδράσεις Coulomb) 30

31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Χρόνος επαναφοράς - Turn around time (χρόνος που μεσολαβεί ώστε τα ιόντα που αρχικά κινούνται σε κατεύθυνση αντίθετη προς αυτή του ανιχνευτή να επιβραδυνθούν σε μηδενική ταχύτητα και κατόπιν να επιταχυνθούν ξαναπερνώντας από την αρχική τους θέση) χρόνος επαναφοράς Διασπορά στο χώρο Ανομοιόμορφη επιτάχυνση Οι παραπάνω παράγοντες, που συνήθως δεν αλληλοσυσχετίζονται, έχουν ως αποτέλεσμα να εμφανίζεται διασπορά των κινητικών ενεργειών των ιόντων κατά την εφαρμογή του παλμού και συνεπώς και των ταχυτήτων τους έτσι, ώστε τελικά, ιόντα που έχουν ίδιες μάζες να φτάνουν στον ανιχνευτή σε ελαφρώς διαφορετικούς χρόνους. Αν ληφθεί υπόψη ότι οι χρόνοι αυτοί είναι της τάξης των microseconds, γίνεται εύκολα αντιληπτό ότι μια τέτοια διασπορά οδηγεί σε διεύρυνση των κορυφών των λαμβανόμενων φασμάτων και μείωση της διαχωριστικής ικανότητας. Ειδικότερα όσον αφορά το χρόνο επαναφοράς, ας υποτεθεί ότι δύο ιόντα ίδιου m/z επιταχύνονται από το ίδιο σημείο στη διάταξη επιτάχυνσης, αλλά προς αντίθετες κατευθύνσεις των αρχικών τους ταχυτήτων. Το ιόν που αρχικά κινείται προς τη «λάθος» κατεύθυνση (αντίθετα προς τον ανιχνευτή) θα γυρίσει προς τη σωστή κατεύθυνση με την εφαρμογή της ώθησης του ηλεκτροστατικού πεδίου και θα επιστρέψει στο σημείο εκκίνησης με ταχύτητα ίδια με του ιόντος που εξαρχής κινούνταν προς τη σωστή κατεύθυνση, με αποτέλεσμα τα δύο ιόντα να κινούνται πλέον προς την ίδια κατεύθυνση, με την ίδια ταχύτητα, αλλά με χρονική διαφορά μεταξύ τους ίση με το turnaround time. Η επίδραση των παραγόντων αυτών μπορεί να ελαχιστοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό με την εφαρμογή των συγκεκριμένων βελτιώσεων που αναφέρονται παρακάτω: Α) Εστίαση ιόντων στο χώρο Η μέθοδος διόρθωσης του φαινομένου διασποράς των ιόντων στο χώρο περιγράφηκε αρχικά από τους Wiley και McLaren τη δεκαετία του 50. Το ηλεκτροστατικό πεδίο επιτάχυνσης ρυθμίζεται έτσι, ώστε ιόντα (ίδιου m/z) που βρίσκονται πιο μακριά σε σχέση με τον ανιχνευτή επιταχύνονται κατά μήκος μεγαλύτερης διαδρομής (μεγαλύτερο χρονικό διάστημα) εντός της διάταξης επιτάχυνσης και τελικά αποκτούν μεγαλύτερες ταχύτητες από τα αντίστοιχα ιόντα που βρίσκονται αρχικά πιο κοντά στον ανιχνευτή. Έτσι, τελικά όλα τα ιόντα αυτά φθάνουν στον ανιχνευτή την ίδια χρονική στιγμή (για διαφορές αρχικής θέσης της τάξης των 2 mm). Β) Μείωση διασποράς αρχικών ταχυτήτων 31

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Μέσω χρονικής υστέρησης μεταξύ ιονισμού και εφαρμογής παλμού ώθησης, τα ιόντα διαφορετικών αρχικών ταχυτήτων που δημιουργούνται στην πηγή κατανέμονται σε διάφορα σημεία του χώρου κατά τη διάρκεια πλήρωσης του θαλάμου του επιταχυντή, οπότε οι αρχικές διαφορές ταχυτήτων μετατρέπονται σε διασπορά των ιόντων στο χώρο. Κατόπιν, τα ιόντα αυτά εστιάζονται όπως περιγράφηκε παραπάνω Γ) Μείωση του χρόνου επαναφοράς Υπάρχουν δύο τρόποι αντιμετώπισης του φαινομένου αυτού: η εφαρμογή ισχυρότερων ηλεκτροστατικών πεδίων κατά την επιτάχυνση και η αύξηση του χρόνου πτήσης των ιόντων. Και οι δύο όμως παρουσιάζουν προβλήματα: ένα ισχυρό ηλεκτροστατικό πεδίο οδηγεί σε μεγάλες διασπορές κινητικής ενέργειας μεταξύ των ιόντων, ενώ αύξηση του χρόνου πτήσης συνεπάγεται τεχνικές δυσκολίες (πολύ μεγάλο μέγεθος θαλάμου πτήσης, δυσκολία διατήρησης υψηλού κενού) Δ) Διατάξεις ενεργειακής εστίασης και εστίασης στο χώρο Στις βελτιώσεις αυτές ανήκει η χρήση του ιοντικού κατόπτρου ανάκλασης (ion reflectron), το οποίο περιγράφεται παρακάτω. Ε) Ορθογώνια επιτάχυνση ιόντων (orthogonal acceleration) Η διάταξη αυτή, η οποία εκμεταλλεύεται την απουσία διασποράς ταχυτήτων σε κατεύθυνση κάθετη προς τη δέσμη ιόντων που σχηματίζονται στην πηγή ιονισμού, περιγράφεται παρακάτω. Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαχωριστική ικανότητα ενός φασματομέτρου μαζών χρόνου πτήσης ιόντων είναι: Ο χρόνος απόκρισης του ανιχνευτή Η αβεβαιότητα χρονομέτρησης των γεγονότων εφαρμογής του παλμού (t=0) και καταγραφής σήματος στον ανιχνευτή Η βραχυχρόνια και μακροχρόνια σταθερότητα της παροχής ισχύος στο όργανο. Διακυμάνσεις υψηλής συχνότητας οδηγούν σε διεύρυνση των κορυφών και μείωση της διαχωριστικής ικανότητας, ενώ βραδείες μεταβολές οδηγούν σε μετατόπιση των μετρούμενων τιμών μαζών και ανάγκη συχνότερης βαθμονόμησης του οργάνου. Οι παράγοντες αυτοί οδηγούν σε διασπορά των καταγραφόμενων χρονικών στιγμών πρόσκρουσης στον ανιχνευτή για ιόντα της ίδιας μάζας ή κοντινών μαζών. Το πρόβλημα αυτό επιδεινώνεται από την έλλειψη ψηφιοποιητών με προδιαγραφές τέτοιες ώστε να ανταποκρίνονται στην υψηλή ταχύτητα λήψης φασμάτων και την ανάγκη μεγάλου γραμμικού δυναμικού εύρους. Η ψηφιοποίηση των καταγραφόμενων σημάτων λαμβάνει χώρα σε χρόνους της τάξης μερικών picosecond ή nanosecond. Στους περισσότερους αναλυτές TOFMS ένα φάσμα καταγράφεται σε περίπου 50 μs και αντιστοιχεί θεωρητικά σε λαμβανόμενα σήματα (τα οποία προστίθενται ώστε ο μέσος όρος τους να 32

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ αποτελεί ένα πλήρες φάσμα μαζών). Επίσης οι διαθέσιμες συσκευές μετατροπής του αναλογικού σήματος σε ψηφιακό παρουσιάζουν σημαντικά προβλήματα κορεσμού σε υψηλές συγκεντρώσεις ιόντων και θόρυβο, ο οποίος μειώνει το δυναμικό εύρος τους. Έτσι, ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί τα τελευταία έτη στη βελτίωση των χαρακτηριστικών των ανιχνευτών στους αναλυτές TOFMS και των ion optics των οργάνων. Ευαισθησία 16 Η ευαισθησία ενός αναλυτή TOF-MS εξαρτάται σημαντικά από τον Παράγοντα Κύκλου Λειτουργίας (DutyCycle), οποίος ορίζεται ως το ποσοστό χρόνου της συνολικής διάρκειας της ανάλυσης που απαιτείται μέχρι ένα ιόν δεδομένου m/z να καταγραφεί. Η ευαισθησία είναι ουσιαστικά το μέτρο του ποσοστού των ιόντων που ανιχνεύονται σε σχέση με τον αριθμό των ιόντων που επιταχύνεται και τελικά είναι συνάρτηση του Παράγοντα Κύκλου Λειτουργίας και της αποτελεσματικότητας του αναλυτή και του ανιχνευτή. Το βέλτιστο αποτέλεσμα λαμβάνεται όταν ο χρόνος που απαιτείται για την πλήρωση του θαλάμου του επιταχυντή με ένα σμήνος ιόντων, είναι ίδιος με το χρόνο που χρειάστηκε για να φτάσει το προηγούμενο πακέτο στον ανιχνευτή. Με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται ότι τα ιόντα με χαμηλό m/z κάθε νέου επιταχυνόμενου πακέτου (δηλαδή τα ταχύτερα κινούμενα ιόντα) δεν θα φτάσουν στον ανιχνευτή την ίδια χρονική στιγμή με τα βαρύτερα ιόντα του προηγούμενου ιοντικού πακέτου. Σχέση μεταξύ διαχωριστικής ικανότητας και ευαισθησίας Όπως προκύπτει από τα παραπάνω, οι τρεις πιο σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία και τη διαχωριστική ικανότητα των αναλυτών TOFMS αφορούν το χρόνο, το χώρο και την ενέργεια των σχηματιζόμενων ιόντων και καθένας τους επηρεάζει τελικά τη διασπορά του χρόνου ανίχνευσης. Έτσι, βελτίωση της εστίασης των ιόντων στο χώρο και στο χρόνο συνεπάγεται άφιξη μεγαλύτερου αριθμού ιόντων στον ανιχνευτή σε μικρότερη μονάδα χρόνου. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε αύξηση του λόγου σήμα-προς-θόρυβο και τη βελτίωση της ευαισθησίας. Όταν επιτευχθεί η βέλτιστη εστίαση των ιόντων, περαιτέρω αύξηση του αριθμού των ιόντων οδηγεί σε μείωση της διαχωριστικής ικανότητας Σε ακραίες περιπτώσεις η ταυτόχρονη ανίχνευση ιόντων που προέρχονται από χημικό θόρυβο οδηγεί στη μείωση του λόγου σήμα-προς-θόρυβο, συνεπώς οδηγεί σε περαιτέρω μείωση της διαχωριστικής ικανότητας, παρά την αύξηση της ευαισθησίας. Με παρεμφερή τρόπο η ανάγκη δημιουργίας διακριτών σμηνών ιόντων με παρόμοιες ταχύτητες και ενέργειες υπαγορεύει τη 33

34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ χρήση τεχνικών που θα αυξήσουν σημαντικά τη διαχωριστική ικανότητα, συχνά όμως εις βάρος της ευαισθησίας. Έτσι, και εδώ όπως και σε άλλους αναλυτές μαζών απαιτείται ένας συμβιβασμός μεταξύ της ευαισθησίας και της διαχωριστικής ικανότητας που επιδιώκεται Αναλυτής ορθογώνιας επιτάχυνσης (orthogonal acceleration),17 Η πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική βελτίωσης του Παράγοντα Κύκλου Λειτουργίας (ευαισθησία) στους αναλυτές TOFMS είναι η ορθογώνια επιτάχυνση (σχήμα 2.2). Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στο γεγονός ότι ιόντα με αρχικές ταχύτητες που έχουν φορά κάθετη στο θάλαμο πτήσης παρουσιάζουν μικρότερη διασπορά χρόνων πτήσης. Στη διάταξη αυτή, η δέσμη των ιόντων που προέρχεται από την πηγή αρχικά αφήνεται να γεμίσει το θάλαμο του επιταχυντή ιόντων στον οποίο δεν υπάρχει καμία επίδραση πεδίου (5-10% σε αναλογία του θαλάμου πτήσης). Όταν ο χώρος αυτός γεμίσει, εφαρμόζεται ένας ταχύς ( ns) παλμός δυναμικού μεταξύ των ηλεκτροδίων του επιταχυντή δημιουργώντας έτσι αναπαραγώγιμο ηλεκτρικό πεδίο. Σχήμα 2.2 Αναλυτής TOF-MS με ορθογώνια επιτάχυνση Υπό την επίδραση του πεδίου αυτού, όλα τα ιόντα που βρίσκονται εκείνη τη χρονική στιγμή στο θάλαμο του επιταχυντή ωθούνται μέσω σχισμής εντός δεύτερου θαλάμου. Στο δεύτερο θάλαμο, τα ιόντα υφίστανται ταυτόχρονα την ίδια επιτάχυνση, με φορά κάθετη προς την αρχική τους κατεύθυνση και εισέρχονται στο χώρο πτήσης. Με τον τρόπο αυτό, το κλάσμα της δέσμης ιόντων που λαμβάνεται είναι ανάλογο του μήκους της περιοχής εφαρμογής του παλμού κατά τον άξονα της αρχικής τροχιάς. Μόλις επιταχυνθεί το πρώτο πακέτο ιόντων τα ηλεκτρόδια ηρεμούν ώστε να ξαναγεμίσει 34

35 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ο χώρος επιτάχυνσης με νέο τμήμα της δέσμης ιόντων. Το ηλεκτροστατικό πεδίο είναι έτσι σχεδιασμένο ώστε η δύναμη που εφαρμόζεται να είναι αυστηρά κάθετη στον άξονα της δέσμης ιόντων. Καθώς τα ιόντα της δέσμης κινούνται αρχικά σχεδόν παράλληλα μεταξύ τους, έχουν μηδενική μέση ταχύτητα και ελάχιστη διασπορά ταχυτήτων στον άξονα κατά τον οποίο εφαρμόζεται η επιτάχυνση. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η βέλτιστη εστίαση των ιόντων στον άξονα του θαλάμου πτήσης. Επιπλέον, για δεδομένο εύρος μαζών αυξάνεται σημαντικά ο Παράγοντας Κύκλου Λειτουργίας χωρίς να μειωθεί η διαχωριστική ικανότητα (ο παράγοντας Δt στη σχέση (2-6) εξαρτάται πλέον μόνο από τη χρονική διάρκεια σχηματισμού του πακέτου ιόντων, ο οποίος εδώ λαμβάνει πολύ μικρή τιμή, με αποτέλεσμα να βελτιώνεται η διαχωριστική ικανότητα). Πρέπει να σημειωθεί ότι ο χρόνος ηρεμίας των ηλεκτροδίων (fill-up mode) πρέπει να είναι επαρκής ώστε να επιτραπεί στα ιόντα με m/z ίσο με το άνω όριο του εύρους μαζών να φτάσουν στο χώρο πριν την επόμενη εφαρμογή του παλμού (push-outmode). Οι ενέργειες της αρχικής συνεχούς δέσμης ιόντων και της πτήσης των ιόντων που επιταχύνονται μπορούν να ρυθμιστούν ανεξάρτητα έτσι, ώστε ο χρόνος που απαιτείται για το γέμισμα του επιταχυντή να είναι περίπου ίσος με το χρόνο πτήσης του ιόντος με το μέγιστο m/z και να επιτευχθεί ο βέλτιστος παράγοντας κύκλου λειτουργίας. Η συνιστώσα της ταχύτητας στην αρχική κατεύθυνση της δέσμης διατηρείται, ενώ η κάθετη συνιστώσα αυξάνει περίπου 10 φορές για ισοβαρή ιόντα. Στο τέλος της διαδρομής πτήσης τοποθετείται ο ανιχνευτής παράλληλα προς την αρχική κατεύθυνση της δέσμης ιόντων και κάθετα προς την κατεύθυνση της ταχύτητας των ιόντων στη ελεύθερη πεδίου διαδρομή. Το μήκος του ανιχνευτή πρέπει να είναι επαρκές ώστε να καταφθάσουν στην επιφάνειά του όλα τα ιόντα, τα οποία ταξιδεύουν διεσπαρμένα στο πλάτος του θαλάμου πτήσης λόγω διασποράς ταχυτήτων πριν την ορθογώνια επιτάχυνση. Ο παλμός χρησιμοποιείται και ως χρόνος t=0 για την έναρξη των ηλεκτρονικών συσκευών χρονομέτρησης Ανακλαστικό κάτοπτρο (reflectron ion mirror) 18,19 Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το ανακλαστικό κάτοπτρο είναι μια διάταξη που χρησιμοποιείται για τη μείωση της κατανομής ταχυτήτων για ιόντα με ίδιο m/z (αύξηση διαχωριστικής ικανότητας). Όπως φαίνεται στο σχήμα 2.3, η διάταξη αυτή, που αποτελείται ουσιαστικά από ένα ηλεκτροστατικό κάτοπτρο, δημιουργεί ένα ή περισσότερα πεδία επιβράδυνσης που αντιτίθενται στο πεδίο επιτάχυνσης. Τα ιόντα αναδύονται από το ανακλαστικό κάτοπτρο με ανεστραμμένες ταχύτητες (ανεστραμμένη διεύθυνση ανύσματος, ίδιο μέτρο). Καθώς ο χρόνος που απαιτείται για να ταξιδέψει ένα ιόν διαμέσου του κατόπτρου είναι αντιστρόφως ανάλογος της τετραγωνικής ρίζας της ενέργειας πτήσης του (σχέση 35

36 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 2-5), τα ιόντα με τη μεγαλύτερη ενέργεια (ταχύτερα) εισδύουν σε μεγαλύτερο βάθος στο κάτοπτρο και συνεπώς απαιτούν περισσότερο χρόνο για την ανάκλασή τους, επιτρέποντας τη χρονική σύμπτωσή τους με τα βραδύτερα ιόντα ίδιο m/z. Έτσι, με την κατάλληλη ρύθμιση του επιβραδυντικού πεδίου, γίνεται απόσβεση των αρχικών διασπορών ταχύτητας και διάταξης στο χώρο, ώστε ιόντα με ίδιο m/z να φτάνουν στον ανιχνευτή την ίδια χρονική στιγμή. Σχήμα 2.3 Αναλυτής TOF-MS με ανακλαστικό κάτοπτρο Συνήθως η γωνία εισόδου στο ανακλαστικό κάτοπτρο αποκλίνει ελάχιστα από τις 90 ο ώστε τα ιόντα να ακολουθούν διαφορετική διαδρομή μετά την ανάκλασή τους και να επιτραπεί η τοποθέτηση του ανιχνευτή σε σημείο που δεν παρεμβάλλεται στον άξονα των ιόντων που εξέρχονται από τον επιταχυντή. Ένα επιπλέον πλεονέκτημα του ανακλαστικού κατόπτρου είναι η αύξηση (σχεδόν διπλασιασμός) της διαδρομής πτήσης χωρίς αύξηση του μεγέθους του οργάνου. Η αύξηση της διαδρομής πτήσης αυξάνει τον παράγοντα t της σχέσης (2-6) διατηρώντας παράλληλα μικρό το Δt με τη βοήθεια του κατόπτρου, με συνέπεια τη σημαντική βελτίωση της διαχωριστικής ικανότητας του οργάνου Ανιχνευτές Συγκριτικά με την ανίχνευση ιόντων σε αναλυτές σάρωσης, η ανίχνευση ιόντων σε εφαρμογές TOFMS είναι απαιτητική λόγω της μικρής χρονικής κλίμακας των συμβάντων άφιξης των ιόντων (ion arrival events). Οι ανιχνευτές πρέπει να έχουν μεγάλο μέγεθος στη διάστασή τους που είναι παράλ- 36

37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ληλη στη δέσμη ιόντων διότι το μήκος τους πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσο με το πλάτος της επιταχυνόμενης ιοντικής δέσμης στην περιοχή πτήσης. Οι κυριότεροι τύποι ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται είναι ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστές (electron multipliers) και ανιχνευτές πλακών πολλαπλής διέλευσης (multi-channel plate detectors, MCP). Ο ανιχνευτής MCP αποτελείται από λεπτή πλάκα την οποία διαπερνά πλήθος μικροσκοπικών σωλήνων (microchannels), όπως φαίνεται στο σχήμα 2.4. Όταν ένα ιόν με επαρκή ενέργεια προσκρούσει στον ανιχνευτή MCP, ελευθερώνεται ένας παλμός ηλεκτρονίων στην άνοδο. Κάθε μικροσωλήνας του ανιχνευτή MCP λειτουργεί ως ένας ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής έτσι, ώστε για κάθε εισερχόμενο ιόν να αντιστοιχούν περίπου 10 εξερχόμενα ηλεκτρόνια, τα οποία επιταχύνονται και προσκρούουν σε ταλαντωτή που με τη σειρά του εκπέμπει φωτόνια. Το ηλεκτρικό σήμα που παράγεται με τη βοήθεια κατάλληλου φωτοπολλαπλασιαστή είναι ανάλογο του αριθμού των φωτονίων. Σχήμα 2.4 Ανιχνευτής πλακών πολλαπλής διέγερσης Για πολύ μεγάλη τιμή m/z η πιθανότητα δημιουργίας δευτερογενών ηλεκτρονίων μειώνεται, καθώς εξαρτάται από την ταχύτητα του εισερχόμενου ιόντος και όχι από την κινητική του ενέργεια. Έτσι, αυτός ο τύπος ανιχνευτών παρουσιάζει προβλήματα σε υψηλές τιμές m/z Ταχύτητα σάρωσης και διατάξεις ψηφιοποίησης Μια από τις προδιαγραφές των φασματομέτρων με αναλυτή χρόνου πτήσης στην οποία δίνεται έμφαση είναι ο αριθμός φασμάτων που καταγράφονται ανά δευτερόλεπτο. Αν υποτεθεί μέγιστος χρόνος πτήσης 50 μs τότε ο ρυθμός σάρωσης είναι 20 khz, που σημαίνει ότι φάσματα λαμβάνονται 37

38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ κάθε δευτερόλεπτο. Στην πραγματικότητα, ένα σύνολο από πρακτικούς και θεμελιώδεις περιορισμούς μειώνουν σημαντικά τον αριθμό «χρήσιμων» φασμάτων που καταγράφονται στα 100 φάσματα ανά δευτερόλεπτο, μέγεθος που εξακολουθεί να είναι σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με τα φασματόμετρα σάρωσης. Η τρέχουσα διαθέσιμη τεχνολογία ηλεκτρονικών υπολογιστών έχει τη δυνατότητα επεξεργασίας φασμάτων που λαμβάνονται σε αυτό το ρυθμό, αλλά οι μέθοδοι ψηφιοποίησης παλμού που είναι διαθέσιμες δεν καλύπτουν πλήρως τις ανάγκες των σημερινών αναλυτών TOFMS. Δύο διατάξεις ψηφιοποίησης παλμού είναι διαθέσιμες: ITRs (Integrating Transient Recorders) και TDCs (Time-to- Digital Converters). Παρακάτω αναφέρονται συνοπτικά τα χαρακτηριστικά της καθεμίας. Πρέπει να σημειωθεί ότι και οι δύο διατάξεις παρουσιάζουν σημαντικούς περιορισμούς γραμμικού δυναμικού εύρους. Α) Διάταξη TDC Τα συστήματα αυτά ανιχνεύουν χρονικά όλους τους παλμούς (start και stopevents) και αποθηκεύουν τους χρόνους αυτών των συμβάντων ή το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ τους. Κάθε παλμός επιτάχυνσης καταλήγει σε ένα φάσμα από χρόνους άφιξης ιόντων, και αυτά τα μεμονωμένα φάσματα αθροίζονται στη μνήμη ηλεκτρονικού υπολογιστή, ο οποίος κατασκευάζει ένα ιστόγραμμα που αποτελείται από αρκετές εκατοντάδες παλμούς ιόντων σε συνεχόμενα μεμονωμένα χρονικά διαστήματα. Τα TDCs είναι εφοδιασμένα με διατάξεις που δίνουν το έναυσμα έναρξης της καταγραφής, μόνο όταν η ένταση του εισερχόμενου σήματος είναι τουλάχιστον ίση με μια προκαθορισμένη τιμή. Η τεχνική αυτή λειτουργεί ικανοποιητικά όταν υπάρχει μικρή πιθανότητα να συμπέσει χρονικά η ά- φιξη δύο ή περισσοτέρων ιόντων. Όταν όμως αυτό συμβεί, καταγράφεται μόνο ένα stopevent (καθώς το δεύτερο εισερχόμενο σήμα δεν καταγράφεται αν το πρώτο σήμα δεν πέσει κάτω από το προκαθορισμένο όριο νεκρός χρόνος (deadtime)), οπότε σημειώνονται απώλειες καταγραφών και μετατοπίσεις κορυφών προς χαμηλότερες μάζες. Για το λόγο αυτό, οι συγκεκριμένες διατάξεις δεν είναι κατάλληλες για υψηλούς ρυθμούς άφιξης ιόντων. Παρόλα αυτά παρουσιάζουν βασικά πλεονεκτήματα: δεν καταγράφονται μηδενικά δεδομένα, υπάρχει πολύ μικρός θόρυβος υποβάθρου, οι συσκευές που χρησιμοποιούνται είναι σχετικά απλές και δίνουν καλή διαχωριστικότητα κορυφών χρονικά όταν συνδυαστούν με τις κατάλληλες διατάξεις. Β) Διάταξη ITR Αυτά τα συστήματα βασίζονται κυρίως σε ταχείς αναλογοψηφιακούς μετατροπείς ADC (analog-to-digital converter), σχήμα

39 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Σχήμα 2.5 Σύστημα ITR Το σήμα από τον ανιχνευτή λαμβάνεται σε δεδομένα χρονικά διαστήματα (της τάξης του 1ns) και ψηφιοποιείται με συχνότητα 1-3,6 GHz. Βασική αρχή λειτουργίας τους είναι ότι απαιτούνται τουλάχιστον δύο σημεία καταγραφής σε κάθε κύκλο ενός περιοδικού σήματος, ώστε να μην προκύψουν λανθασμένα σήματα. Πλεονέκτημά τους είναι ότι αποφεύγονται οι απώλειες δεδομένων σε υψηλούς ρυθμούς άφιξης ιόντων, καθώς το αυξομειούμενο σήμα μεταφράζεται σε ψηφιακή εικόνα μιας χρωματογραφικής κορυφής, αλλά τα συστήματα αυτά είναι ιδιαίτερα ακριβά, ενώ έχουν ιδιαίτερα υψηλό θόρυβο υποβάθρου λόγω αναλογικής ανίχνευσης. Για να αποφευχθεί ο κορεσμός τους από ταυτόχρονη καταγραφή δύο ή περισσότερων ιόντων συχνά χρησιμοποιείται η μέθοδος της πρόσθεσης των μεμονωμένων φηφιοποιηθέντων φασμάτων που έχουν αποθηκευθεί στη μνήμη της συσκευής. Διατάξεις ψηφιοποίησης και δυναμικό εύρος Ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά οποιουδήποτε φασματομέτρου μαζών είναι το δυναμικό εύρος, το οποίο συνήθως ορίζεται ως το εύρος, είτε αριθμού ιόντων, είτε συγκέντρωσης δείγματος στο οποίο λαμβάνεται γραμμική απόκριση από τον ανιχνευτή. Οι διατάξεις ITR έχουν ένα μεγάλο δυναμικό εύρος για μεμονωμένες κορυφές μαζών, αν και σε κάποιες περιπτώσεις παρουσιάζονται φαινόμενα κορεσμού. Από την άλλη πλευρά, το δυναμικό εύρος του TDC περιορίζεται σημαντικά από το «νεκρό χρόνο» - τη χρονική περίοδο μετά από κάθε καταγεγραμμένο γεγονός κατά την οποία δεν πραγματοποιείται καμία καταγραφή. Οι νεκροί χρόνοι συνήθως διαρκούν αρκετά ns, συνήθως όμως λιγότερο από το διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ δύο κορυφών μαζών που διαφέρουν κατά μία μονάδα m/z.έτσι, σε κάθε παλμό μπορεί να καταγραφεί μόνο ένα ιόν με αποτέλεσμα αν δύο ιόντα 39

40 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ με ίδιο m/z φτάσουν την ίδια χρονική στιγμή στον ανιχνευτή να καταγραφεί μόνο το πρώτο. Το αποτέλεσμα, είναι ότι οι κορυφές μαζών υψηλής έντασης παραμορφώνονται με εξάλειψη του μεγίστου και του δεξιού τμήματός τους, οπότε η ένταση της κορυφής παρουσιάζεται μειωμένη και το κεντροειδές της μετατοπίζεται αριστερά. Το φαινόμενο αυτό διορθώνεται σε κάποιο βαθμό με τη χρήση ενός συντελεστή διόρθωσης, που δίνεται από τη σχέση: C C ' i i = 1 C ' j / f (2-7) όπου Ci είναι ο μετρούμενος ρυθμός καταγραφών (σε ιόντα ανά χρονικό διάστημα ανά δευτερόλεπτο) για το χρονικό διάστημα i, Ci είναι ο διορθωμένος ρυθμός καταγραφών για αυτό το χρονικό διάστημα και f είναι η συχνότητα παλμών του TOF. Ο αλγόριθμος αυτός εφαρμόζεται σε όλα τα χρονικά διαστήματα του φάσματος από τα αριστερά προς τα δεξιά, και το άθροισμα των Cj αναφέρεται στα χρονικά διαστήματα που αντιστοιχούν στο νεκρό χρόνο αριστερά του διαστήματος i. Ο παραπάνω αλγόριθμος διορθώνει το σχήμα της κορυφής και επεκτείνει το δυναμικό εύρος κατά 10 φορές. Παρόλα αυτά, δε μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις δειγμάτων, όπου οι κορυφές μαζών έχουν πολύ μεγάλη ένταση. 2.3 Τεχνική LC/QTOF-MS Η συνδυαστική τεχνική της υγροχρωματογραφίας με τετραπολικό αναλυτή χρόνου πτήσης (LC/QTOF-MS) αποτελεί συνδυασμό ενός τετράπολου αναλυτή μαζών για επιλογή των πρόδρομων ιόντων και ενός αναλύτη χρόνου πτήσης για ανίχνευση των παραγόμενων ιόντων, δηλαδή των θραυσμάτων. Καθιστά εύκολο τον υπολογισμό μάζας με μόνο δύο σημεία αναφοράς. Η εξίσωση που χρησιμοποιείται στη συγκεκριμένη περίπτωση, ώστε να μετατραπεί η φυσική μετρούμενη ιδιότητα σε 2 τιμή μάζας, είναι: m t = 2Ve( ) z L, όπου L:απόσταση και Ve: δυναμικό επιτάχυνσης. Στο Σχήμα 2.6 παρατίθεται μια αντιπροσωπευτική διάταξη τετράπολου φασματόμετρου μαζών χρόνου πτήσης (QTOF-MS). 40

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Σχήμα 2.6 Απεικόνιση QTOFMS. Ο συνδυασμός της υγροχρωματογραφίας με την τεχνική qtof-ms παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα και βρίσκει τα τελευταία χρόνια πληθώρα εφαρμογών στην ανάλυση βιολογικών δειγμάτων ανθρώπων. 2.4 Συζευγμένη Φασματομετρία Μαζών (MS/MS) Στη δίδυμη φασματομετρία μαζών, τα ιόντα και ενώ έχουν αποκτήσει αρκετή εσωτερική ενέργεια δύναται να θραυσματοποιηθούν ώστε να δώσουν παραγόμενα ιόντα -τα θραύσματα- και ουδέτερα θραύσματα. Αυτά τα θραύσματα μπορούν να διακριθούν σύμφωνα με το χώρο όπου έγιναν οι θραυσματοποιήσεις. Εάν ο χρόνος ζωής του ιόντος είναι μεγαλύτερος από το χρόνο πτήσης, τότε το ιόν φτάνει στον ανιχνευτή χωρίς να πραγματοποιηθεί θραυσματοποίηση. Ενώ, εάν ο χρόνος ζωής του ιόντος είναι μικρότερος από το χρόνο που ξοδεύει το ιόν πριν την επιτάχυνση, το ιόν θραυσματοποιείται πριν να εκδιωχθεί από την πηγή. Οι θραυσματοποιήσεις διαχωρίζονται στις θραυσματοποιήσεις εντός της πηγής (ISD= In-sourcedecay) και εκτός της πηγής (PSD= post-sourcedecay). Το πρόδρομο ιόν και τα θραύσματα ιόντων έχουν την ίδια κινητική ενέργεια μετά την επιτάχυνση και έτσι φτάνουν στον ανιχνευτή ξεχωριστά, ανάλογα με το λόγο m/z. O χρόνος ζωής ενός ιόντος μπορεί να είναι ενδιάμεσος του χρόνου που ξοδεύει στην πηγή και στο χρόνο πτήσης του. Τα συγκεκριμένα αυτά ιόντα είναι αρκετά σταθερά ώστε να «αφήσουν» την πηγή αλλά περιέχουν αρκετή περίσσεια ενέργεια ώστε να επιτρέψουν τη θραυσματοποίηση τους στην ελεύθερη περιοχή του σωλήνα πτήσης, πριν να φτάσουν στον ανιχνευτή. Αυτό αντιστοιχεί στη θραυσματοποίηση μετασταθών ιόντων. 41

42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Η σύνδεση Q-TOF (Σχήμα 2.6) περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1996 ως μια τεχνική που συνδυάζει την ικανότητα σάρωσης ενός τετραπόλου με την διαχωριστική ικανότητα του αναλυτή TOF και μπορεί να παράγει απλά και καλής ποιότητας φάσματα, τόσο MS, όσο και MS/MS. Ένα τετράπολο Q1 συνδέεται με ένα δεύτερο αναλυτή q2 ο οποίος καλείται κυψελίδα συγκρούσεων [στην παρούσα εργασία η κυψελίδα συγκρούσεων (collision cell) ήταν ένα εξάπολο. Ο q2 συνδέεται με τον αναλυτή TOF σε ορθογώνια διάταξη. Στον Q1 γίνεται η επιλογή του επιθυμητού πρόδρομου ιόντος, το οποίο οδηγείται στον q2 όπου συγκρούεται με περίσσεια αδρανούς αερίου παράγοντας θυγατρικά ιόντα. Ο διαχωρισμός και η μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεται στον αναλυτή TOF. Η σύγκρουση του πρόδρομου ιόντος με αδρανές αέριο (collision induced dissociation, CID) στη προκειμένη περίπτωση έγινε με χαμηλή ενέργεια μικρότερη των 100 ev. Σημειώνεται ότι στα περισσότερα συστήματα Q-TOF υπάρχει ένα πρόσθετο τετράπολο ή ο- κτάπολο πριν το Q1, το οποίο βοηθά την εστίαση των ιόντων στο χώρο. 2.6 Τετραπολική παγίδα ιόντων MSD/TRAP MS 20,21,22,23,24,25 Η τετραπολική παγίδα ιόντων είναι ένας συνδυασμός ηλεκτρικού πεδίου που εγκλωβίζει ιόντα σε μια περιοχή κενού ή σωλήνα. Η παγίδα ιόντων είναι ένα τρισδιάστατο ανάλογο του απλού τετράπολου, στην οποία τα ιόντα υποβάλλονται σε δυνάμεις που ασκούνται από ένα πεδίο RF, αλλά αυτά συμβαίνουν σε τρεις και όχι δύο διαστάσεις. Η τετραπολική παγίδα ιόντων λειτουργεί τόσο σαν αποθήκη ιόντων στην οποία ιόντα μπορούν να συλλέγονται για ένα χρονικό διάστημα όσο και ως φασματόμετρο με μεγάλο εύρος μαζών και πολλαπλής διαχωριστικής ικανότητας. Προκειμένου να επιτευχθεί ικανοποιητική διακριτική ικανότητα, η παγίδα διατηρεί πίεση 1 mtorr του ρυθμιστικού αερίου Ηλίου (buffer ή bath gas). Ως συσκευή αποθήκευσης η παγίδα ιόντων εγκλωβίζει ιόντα, είτε θετικά είτε αρνητικά φορτισμένα. Η δυνατότητα εγκλεισμού ιόντων της παγίδας προκύπτει από τη δημιουργία ενός δυναμικού «παγίδευσης». Η βασική δομή μια παγίδας ιόντων αποτελείται από 3 ηλεκτρόδια όπως φαίνεται στο σχήμα 2.7. Τα 2 από τα 3 ηλεκτρόδια είναι σχεδόν πανομοιότυπα με υπερβολική γεωμετρία τα οποία μοιάζουν με μικρά πιάτα, λέγονται τερματικά ηλεκτρόδια και έχουν το καθένα από μια η περισσότερες οπές στο κέντρο για διέλευση ηλεκτρονίων και ιόντων. Το ένα τερματικό ηλεκτρόδιο αποτελεί την είσοδο από την οποία εισέρχονται τα ιόντα περιοδικά και το δεύτερο τερματικό αποτελεί την έξοδο των ιόντων προς τον ανιχνευτή. Το δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο έχει μια εσωτερική υπερβολική επιφάνεια και είναι τοποθετημένο συμμετρικά μεταξύ των δύο τερματικών ηλεκτροδίων όπως φαίνεται στο σχήμα

43 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Σχήμα 2.7 Τα 3 ηλεκτρόδια της παγίδας ιόντων ανοιχτά σε σειρά. 43

44 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Σχήμα 2.8 Τετραπολική παγίδα ιόντων (a) φωτογραφία μιας παγίδας ιόντων από τομή στο κέτρο κάθετο στον άξονα κυλινδρικής συμμετρίας, (b) σχηματική αναπαράσταση τρισδιάστατης δομής της παγίδας δείχνοντας τις ασύμπτωτες και τις διαστάσεις r o και z 0. Οι δυναμικές γραμμές του επαγόμενου ηλεκτρικού πεδίου του σχήματος 2.8 έχουν περικοπεί για πρακτικούς σκοπούς αλλά στην πραγματικότητα εκτείνονται στο άπειρο ακολουθώντας τις ασύμπτωτες. Οι ασύμπτωτες προκύπτουν από την υπερβολική γεωμετρία των τριών ηλεκτροδίων. Η γεωμετρία των ηλεκτροδίων ορίζεται έτσι ώστε να δημιουργούν την ιδανικότερη κατανομή του δυναμικού με σκοπό την δημιουργία του κατάλληλου πεδίου παγίδευση των ιόντων. Σχήμα 2.9 Σχηματική αναπαράσταση δυναμικών γραμμών του πεδίου της παγίδας ιόντων Τα πλεονεκτήματα της τετραπολικής παγίδας ιόντων είναι τα εξής: i) υψηλή ευαισθησία, ii) συμπαγής και απλός μηχανισμός σε μια συσκευή υψηλής απόδοσης, iii) δυνατότητα πολλαπλών ms n πειραμάτων, iv) δυνατότητα απομόνωσης ενός ή περισσοτέρων ιόντων (single ion monitoring-sim, multiple reaction monitoring-mrm). 2.7 Χρωματογραφία υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων HILIC 26,27,28,29,30,31,32,33 Η Υγροχρωματογραφία Υδρόφιλων Αλληλεπιδράσεων (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) αποτελεί μια σχετικά νέα χρωματογραφική τεχνική που βρίσκει ολοένα μεγαλύτερη εφαρμογή στην ανάλυση και το διαχωρισμό πολικών ενώσεων που παρουσιάζουν μικρή, ελάχι- 44

45 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ στη ή και καθόλου συγκράτηση στις πλέον χρησιμοποιούμενες στήλες αντιστρόφου φάσεως χρωματογραφίας (reversed phase liquid chromatography, RPLC). Βασίζεται στη χρησιμοποίηση μιας υδρόφιλης στατικής φάσης και μιας λιγότερο υδρόφιλης κινητής φάσης που αποτελείται από μίγμα νερού και οργανικού διαλύτη (συνήθως ακετονιτριλίου). Ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης των αναλυόμενων ουσιών με το υπόστρωμα δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως και σχετίζεται ουσιαστικά με φαινόμενα κατανομής των μορίων του αναλύτη ανάμεσα στην κινητή φάση και σε ένα πλούσιο σε νερό στρώμα που σχηματίζεται στην επιφάνεια του υψηλής πολικότητας υποστρώματος της στατικής φάσης. Το ακρωνύμιο HILIC προτάθηκε από τον Alpert για να περιγράψει τη χρησιμοποίηση μιας παραλλαγής της υγροχρωματογραφίας κανονικής φάσης (normal phase HPLC, NP-HPLC) για τον διαχωρισμό πεπτιδίων, νουκλεοτιδίων και άλλων πολικών ουσιών χρησιμοποιώντας μια υδρόφοβη στατική φάση πυριτία που στην επιφάνειά της έφερε αλυσίδες πολυ(υδροξυαιθυλο)-ασπαρταμιδίου και κινητή φάση νερό και υψηλό ποσοστό οργανικού διαλύτη. Εντούτοις, υπάρχουν και παλαιότερες αναφορές εφαρμογής της τεχνικής αυτής κυρίως στην ανάλυση σακχάρων και υδατανθράκων από το 1975, όταν ο Linden χρησιμοποίησε πληρωτικά υλικά που έφεραν τροποποιημένη πυριτία με πολυμερισμένες ομάδες στην επιφάνειά της. Από τις πιο πρόσφατες και με μεγάλη σήμερα εφαρμογή στατικές φάσεις είναι η στήλη ZIC - HILICπου φέρει ως πληρωτικό υλικό πορώδη πυριτία στην επιφάνεια της οποίας έχουν συνδεθεί μόνιμα ομάδες σουλφοβεταΐνης, που την καθιστούν μια υψηλής πολικότητας και μονίμως φορτισμένη στατική φάση με ιδιότητες αμφολύτη που συνολικά φέρει μηδενικό φορτίο. Τα πληρωτικά υλικά τέτοιου τύπου αναπτύχθηκαν αρχικά για τον διαχωρισμό ανόργανων αλάτων, μικρών ιοντιζόμενων μορίων και πρωτεϊνών. Η συγκράτηση του αναλύτη εξαρτάται από την πολικότητα του, χωρίς τα φαινόμενα προσρόφησης και ιοντικής αλληλεπίδρασης που παρατηρούνται σε υποστρώματα με μη τροποποιημένη πυριτία ή πυριτία που φέρει αμινομάδες. Μικρής έντασης ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις είναι δυνατόν να εμφανιστούν και σχετίζονται με την αρνητικά φορτισμένη σουλφονική ομάδα, αλλά είναι ανεξάρτητες του ph και μπορούν κατ επιλογή να ενισχυθούν ή να περιοριστούν με κατάλληλη προσθήκη αλάτων. Η εμπορική ονομασία είναι ZIC -HILIC, διατίθεται από την Merck και τα διαθέσιμα μεγέθη σωματιδίων του πληρωτικού υλικού είναι 3,5, 5,0, και 10 μm. HILIC Σχήμα 2.10 Η λειτουργική ομάδα σουλφοαλκυλοβεταΐνης που συναντάται στις στατικές φάσεις ZIC - 45

46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 2.5 Εφαρμογές της τεχνικής LC/TOF-MS 34,35,36,37,38 Η τεχνική LC/TOF-MS βρίσκει ευρεία εφαρμογή σε τομείς όπως είναι η τοξικολογία, ο περιβαλλοντικός έλεγχος και ο έλεγχος φαρμακοδιέγερσης, όπου υπάρχει η ανάγκη ταυτόχρονης σάρωσης εκατοντάδων ή χιλιάδων ουσιών με δεδομένα υψηλής ακρίβειας μάζας. Η τεχνική LC/TOF-MS ανταποκρίνεται σε αυτές τις απαιτήσεις, τόσο για την ανίχνευση, όσο και για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ουσιών αυτών. Στην περίπτωση του ελέγχου φαρμακοδιέγερσης οι αναλύσεις γίνονται κυρίως σε δείγματα ούρων στα οποία οι α- νιχνευόμενες ουσίες (μητρικές ουσίες ή μεταβολίτες) μπορούν να ανιχνευθούν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από ό,τι στο αίμα. Επίσης επιτρέπει τον απευθείας προσδιορισμό πολικών αναλυτών που εκκρίνονται στα ούρα. Η ανίχνευση των ουσιών πραγματοποιείται με μεγάλη εκλεκτικότητα και ευαισθησία με την εξέταση των λαμβανόμενων φασμάτων μαζών και τη χρήση χρωματογραφημάτων ακριβούς μάζας (accurate mass) με αφαίρεση του υποβάθρου, τη χρήση ουσίας βαθμονόμησης (substance calibration) και τη σύγκριση με χρωματογραφήματα και φάσματα πρότυπων ουσιών. Σήμερα η τεχνική LC/TOFMS θεωρείται μια από τις καλύτερες τεχνικές από άποψη κόστους-αποτελεσματικότητας για την ανίχνευση μη πτητικών ουσιών σε αναλύσεις ρουτίνας. Τα κυριότερα πλεονεκτήματά της είναι η εξαιρετικά καλή διαχωριστική ικανότητα ( ), το μεγάλο εύρος μαζών ( amu), η υψηλή ευαισθησία και η μεγάλη ταχύτητα σάρωσης (10 6 amu/s), με ρυθμό δειγματοληψίας MHz. Τα φασματόμετρα μαζών με αναλυτές «χρόνου πτήσης» παρέχουν το φάσμα μαζών ταχύτατα (π.χ. μπορούν να ληφθούν περισσότερα από 1000 φάσματα σε ένα δευτερόλεπτο). 46

47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο :ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ 3.1 Δεξτράνη 39,40,41,42,43,44,45 (Dextran, DEX) Πολυσακχαρίτης, πολυμερής της γλυκόζης, που σχηματίζεται από μικροοργανισμούς του είδους Leuconostoc mesenteroides, όταν επιδράσουν στο καλαμοσάκχαρο. Η ευθεία αλυσίδα αποτελείται από α-1, 6 γλυκοσιδικούς δεσμούς μεταξύ των μορίων της γλυκόζης, ενώ οι διακλαδώσεις αρχίζουν από α-1, 3 δεσμούς. Έχει μεγάλη μέγεθος (μπορεί να φτάσει τα 10 cm.), μοριακό τύπο (C6H10O5)n και όταν αναμειχθεί με νερό δίνει ένα παχύρρευστο διάλυμα. Οι δεξτράνες είναι διαθέσιμες σε διάφορα μοριακά βάρη που κυμαίνονται από 3000 Da έως Da. Η δεξτράνη δεν παρουσιάζει τοξικότητα και χρησιμοποιείται στην ιατρική ως υποκατάστατο του πλάσματος του αίματος (μέσα στον οργανισμό μετατρέπεται σε γλυκόζη που στη συνέχεια αφομοιώνεται από αυτόν) και στη χρωματογραφία. Οι μεγαλύτερες δεξτράνες (> Da) απεκκρίνονται ανεπαρκώς από τους νεφρούς και, συνεπώς, παραμένουν στο αίμα για όσο διάστημα εβδομάδων έως ότου μεταβολίζονται. Στη συνέχεια, έχουν παρατεταμένη αντιθρομβωτική και κολλοειδή επιδράση. Σε αυτή την οικογένεια, η δεξτράνη-40 (MW: Da), υπήρξε το πιο δημοφιλές μέλος για την αντιπηκτική θεραπεία. Κοντά στο 70% δεξτράνης- 40 απεκκρίνεται στα ούρα εντός των πρώτων 24 ωρών μετά από ενδοφλέβια έγχυση, ενώ το υπόλοιπο 30% θα πρέπει να διατηρούνται για αρκετές περισσότερες ημέρες. Χρησιμοποιείται από τους μικροχειρουργούς για να μειωθεί αγγειακή θρόμβωση. Η αντιθρομβωτική δράση της δεξτράνης δημιουργείται μέσω δέσμευσης της στα ερυθροκύτταρα, τα αιμοπετάλια και αγγειακό ενδοθήλιο, αυξάνοντας την ηλεκτραρνητικότητα τους και μειώνοντας έτσι συσσωμάτωση των ερυθροκυττάρων και την πρόσφυση των αιμοπεταλίων. Οι δεξτράνες μειώνουν επίσης τον παράγοντα πήξης VIII και τον παράγοντα Ag Von Willebrand, μειώνοντας έτσι τη λειτουργία των αιμοπεταλίων. Οι θρόμβοι που σχηματίζονται μετά τη χορήγηση των δεξτρανών λύονται πιο εύκολα λόγω αλλαγμένης δομής του θρόμβου (περισσότερα ομοιόμορφα κατανεμημένα αιμοπετάλια με χονδρόκοκκο ινώδες). Με την αναστολή της α-2 αντιπλασμίνης, η δεξτράνη χρησιμεύει ως ενεργοποιητής του πλασμινογόνου και ως εκ τούτου έχει θρομβολυτικά χαρακτηριστικά. Εκτός από αυτές τις ιδιότητες, οι μεγαλύτερου μοριακού βάρους δεξτράνες, οι οποίες δεν περνούν έξω από τα αγγεία και είναι πιθανοί οσμωτικοί παράγοντες, και ως εκ τούτου έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία επείγουσας υποβολαιμίας. Η αιμοδιάλυση που προκα- 47

48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο : ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ λείται από αύξηση του όγκου με τη χρήση δεξτράνης βελτιώνει τη ροή του αίματος, με αποτέλεσμα την περαιτέρω μείωση της θρόμβωσης. Παρόλα αυτά, καμία διαφορά δεν έχει παρατηρηθεί σε σχέση με την αντιθρομβωτική αποτελεσματικότητα σε σύγκριση της ενδοαρτηριακής και ενδοφλέβιας χορήγηση της δεξτράνης. Άλλες χρήσεις της δεξτράνης περιλαμβάνουν τη χρήση της με τη μορφή οφθαλμικών σταγόνων, ως λιπαντικό και ως παράγοντα διαλυτοποίησης ουσιών σε συγκεκριμένα ενδοφλέβια υγρά (π.χ. σιδήρου, δημιουργία συμπλόκου σιδηροδεξτράνης). Η δεξτράνη αποτελεί ωστόσο και απαγορευμένη ουσία από την παγκόσμια ομοσπονδία ντόπινγκ και ανήκει στον πίνακα S5 της λίστας απαγορευμένων ουσιών της WADA ως παράγοντας «κάλυψης». Οι αθλητές κάνουν παράνομη χρήση της δεξτράνης για τρεις κυρίως λόγους: α) για να διατηρήσουν τις τιμές της αιμοσφαιρίνης και του αιματοκρίτη στα φυσιολογικά επίπεδα, β) για να αυξήσουν την μικροκυκλοφορία με στόχο τη καλύτερη μεταφορά οξυγόνου στους μύες και στους ιστούς και γ) για αύξηση της ποσότητας των σωματικών υγρών, αντισταθμίζοντας την απώλεια υγρών λόγω αφυδάτωσης που θα μπορούσε να επιφέρει μείωση της απόδοσης. Σχήμα 3.1 Απεικόνιση του γενικού μοριακού τύπου των δεξτρανών 3.2 Υδροξυαίθυλο-άμυλο 46,47, 48,49,50,51,52 (Hetastarch, HES) Το υδρόξυαίθυλο άμυλο (HES / HAES) είναι ένα μη-ιονικό παράγωγο αμύλου. Είναι ένας από τους πιο συχνά χρησιμοποιούμενους παράγοντες αύξησης του όγκου του πλάσματος του αίματος με τα εμπορικά ονόματα Hespan από τον οίκο B. Braun Medical Α.Ε. και Voluven ή Volulyte από τον οίκο Fresenius Kabi. Το HES είναι ένας γενικός όρος και μπορεί στην κατηγορία αυτή να υπο-ταξινομούνται συγγενείς ουσίες, ανάλογα με το μέσο μοριακό βάρος, τη μοριακή υποκατάσταση, τη συγκέντρωση, την C2/C6 αναλογία και τη μέγιστη ημερήσια δόση. 48

49 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο : ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ Στη χειρουργική το HES χρησιμοποιείται με τη μορφή ενδοφλέβιου διαλύματος για την πρόληψη του σοκ που προκαλείται από σοβαρή απώλεια αίματος από τραύμα, χειρουργική επέμβαση είτε από κάποια άλλη αιτία. Φαίνεται όμως ότι έχει μικρότερα αποτελέσματα σε σχέση με άλλα σκευάσματα. Σχήμα 3.2 Απεικόνιση του μοριακού τύπου του Υδροξυαίθυλο αμύλου 49

50 50

51 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ: ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛ- ΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΜΕ ΑΝΑΛΥΤΗ ΧΡΟΝΟΥ ΠΤΗΣΗΣ (LC-QTOF/MS) ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΤΗ ΠΑΓΙΔΑΣ ΙΟΝΤΩΝ (LC-ION TRAP MS) ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΔΙΟΓΚΩΤΙΚΩΝ ΟΓΚΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ 4.1 Εισαγωγή Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη και επικύρωση μιας μεθόδου προσδιορισμού των ουσιών δεξτράνης και υδροξυαίθυλο-αμύλου με υγροχρωματογραφία υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών με αναλυτές χρόνου πτήσεως και παγίδας ιόντων. Η ανίχνευση των συγκεκριμένων ουσιών παρουσιάζει δυσκολίες στην κλασική χρωματογραφία με στήλη C18 διότι οι ουσίες αυτές είναι εξαιρετικά πολικές και εκλούονται με το μέτωπο του διαλύτη. Επίσης, παρουσιάζουν δυσκολίες και στην ανίχνευση καθώς λόγω του πολικού τους χαρακτήρα εμφανίζουν μεγάλη καταστολή σήματος κατά τον ιοντισμό τους με ηλεκτροψεκασμό (ESI). Στόχος ήταν η ανάπτυξη μιας μεθόδου ανίχνευσης των ουσιών αυτών εφαρμόζοντας μια παρασκευαστική πορεία που θα βασίζεται στην αραίωση και στην απευθείας έγχυση στο χρωματογραφικό σύστημα. Η καταλληλότητα της μεθόδου αξιολογείται μέσα από εκτενή πειράματα επικύρωσης τα οποία διενεργήθηκαν βάσει των προδιαγραφών του τρέχοντος Διεθνούς Προτύπου International Standard for Laboratories (ISL). 4.2 Διαλύματα αναφοράς Διαλύματα ποιοτικού προσδιορισμού: 1. Διάλυμα δεξτράνης 1000 ppm 2. Διάλυμα υδροξυλαιθυλο-αμύλου 1020 ppm 3. Διάλυμα δεξτράνης 100 ppm 4. Διάλυμα υδροξυλαιθυλο-αμύλου 102 ppm 51

52 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗ- ΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Διαλύματα ποσοτικού προσδιορισμού: Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της δεξτράνης και του υδροξυαίθυλο-αμύλου παρασκευάζονται δύο σειρές από πρότυπα διαλύματα ποσοτικού προσδιορισμού για κάθε ουσία, σε διάφορες συγκεντρώσεις, που ονομάζονται RMΔ. 1. RMΔ 718/1 (DEX C= 2568 ppm) 2. RMΔ 729/1 (HES C= 2490 ppm) 3. RMΔ 719/1 (DEX C= 2568 ppm) 4. RMΔ 730/1 (HES C= 2490 ppm) 5. RMΔ 720/1 (DEX C= 1284 ppm) 6. RMΔ 731/1 (HES C= 1245 ppm) 7. RMΔ 722/1 (DEX C= 400 ppm) 8. RMΔ 732/1 (HES C= 1245 ppm) 9. RMΔ 722/1 (DEX C= 400 ppm 10. RMΔ 733/1 (HES C= 401.5ppm 11. RMΔ 724/1 (DEX C= 1284 ppm) 12. RMΔ 734/1 (HES C= 401.5ppm) 4.3 Οργανολογία Για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν οι εξής συσκευές υγροχρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών: Agilent 6520 Q-TOF LC-MS Agilent 1100 LC/MSD Trap SL 4.4 Προκατεργασία δειγμάτων Η προκατεργασία 53,54,55,56,57 των δειγμάτων ούρων που ακολουθήθηκε ήταν η μέθοδος της αραίωσης-απευθείας έγχυσης στο χρωματογρατογραφικό σύστημα και τα στάδια που ακολουθούνται περιγράφονται στο Παράρτημα 26 της ΤΜΕ 123: 52

53 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗ- ΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΟΑΚΑ - ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΛΕΓΧΟΥ DOPING Κωδικός ΤΜΕ: 123 Ημερ.έγκρισης: Ημερ.απόσυρσης: Έκδοση Παραρτήματος:01 Υπογραφή: Υπογραφή: ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 26. ΦΟΡΜΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΑΥΤΟΤΗΤΑΣ PLASMA VOLUME EXPANDERS ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ ΜΕ LCiontrapMS Ημερομηνία: Παρτίδα: Δείγματα: α/α ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ OK ΕΚΤΕΛΕΣΤΗΣ 1 Επισήμανση "κωνικών" σωλήνων 2 Μετάγγιση ούρων 100 μlστα ύποπτα δείγματα 2,1 Προσθήκη 80 μl απιονισμένου ύδατος στα υποπτα δείγματα 3 Προετοιμασία τυφλού δείγματος (Blank) 3,1 100 μl ούρων αθλητή αρνητικού για απαγορευμένες ουσίες 3,2 Προσθήκη 80 μl απιονισμένου ύδατος 4 Προετοιμασία δείγματος ελέγχου HES 4,1 100 μl ούρων αρνητικών για απαγορευμένες ουσίες 4,2 Προσθήκη 50 μl πρότυπου δ/τος HETASTARCH 1020ppm (010 ) 4,3 Προσθήκη 30 μl απιονισμένου ύδατος 5 Προετοιμασία δείγματος ελέγχου DEX 5,1 100 μl ούρων αρνητικών για απαγορευμένες ουσίες 5,2 Προσθήκη 47 μl πρότυπου δ/τος Dextran 1000 ppm (010 ) 5,3 Προσθήκη 33 μl απιονισμένου ύδατος 6 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου σε όλα τα δείγματα 6,1 20μL β-cyclodextrin 2200ppm (010C05-010C07) 7 Προσθήκη 50μL Acetonitrile σε όλα τα δείγματα 8 Ανάδευση Vortex 100% για 7s 9 Φυγοκέντρηση για 15 mins 10 Μετάγγιση 100μL του υπερκείμενου υγρού σε vials με insert 11 Υπογραφή φορμών 12 Παράδοση σε υπεύθυνο ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ: Σχήμα 4.9 Φόρμα Παρασκευαστικών σταδίων για διογκωτικά όγκου πλάσματος Για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του εσωτερικού προτύπου επειδή αναμένονται μεταβολές στην ευαισθησία της μετρητικής διατάξεως μεταξύ των μετρήσεων και σε μη απόλυτα επαναλαμβανόμενη επίδραση του μητρικού υλικού του δείγματος. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η β-κυκλοδεξτρίνη επειδή αποτελεί ουσία η οποία δεν υπάρχει στο υπόστρωμα των ούρων, έχει δομή παραπλήσια με τους αναλύτες και ως εκ τούτου έχει και παραπλήσια χημική συμπεριφορά. 53

54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗ- ΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Εικόνα 4.1 Η δομή της β-κυκλοδεξτρίνης 4.5 Βελτιστοποίηση παραμέτρων φασματόμετρου μαζών α) Αναλυτής χρόνου πτήσεως (TOF): Αρχικά, δοκιμάστηκε η δυνατότητα ιοντισμού των αναλυτών σε αρνητικό και θετικό ιοντισμό και βρέθηκε να ιοντίζονται σε θετικό ιοντισμό, ενώ στον αρνητικό δεν ιοντίζονται. Για την μεγιστοποίηση του σήματος των ουσιών έγινε μη αυτόματη βελτιστοποίηση των δυναμικών θραυσματοποίησης (Fragmentor) και τριχοειδούς (Capillary voltage). Το μέγιστο αναλυτικό σήμα και για τις δυο ουσίες επετεύχθη με τις εξής τιμές: Fragmentor: +410 V Capillary Voltage: V Skimmer: 50 V Octapole RF: 500 V β) Αναλυτή παγίδα ιόντων (iontrap): Για την μεγιστοποίηση του σήματος των ουσιών έγινε χειροκίνητη βελτιστοποίηση των δυναμικών θραυσματοποίησης (Capillary Exit) και δυναμικό τριχοειδούς (Capillary voltage) ενώ οι υπόλοιπες παράμετροι υπολογίστηκαν με αυτόματο τρόπο με βάση το σήμα του ιόντος m/z 325,1 της δεξτράνης. Έτσι οι παράμετροι μάζας που προέκυψαν ήταν οι εξής: 54

55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗ- ΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Capillary Voltage: 5200V Octapole 2 DC: 2.63V Capillary Exit: 360V Dry Temp: 360 O C Skimmer: 15.0V Nebulizer: 25.00psi Octapole Rf: 65.0Vpp Dry Gas: 10.00L/min Octapole 1 DC: 10.25V Περιοχή σάρωσης: m/z Στη συνέχεια βελτιστοποιήθηκαν οι παράμετροι της παγίδας όπως: η χωρητικότητα (ICC Target), ο χρόνος παραμονής των ιόντων στην παγίδα (Accumulation time, Accu Time) και οι επαναλήψεις (Averages) με βάσει τις τιμές του σήματος των ουσιών στα 50ppm και 1000ppm.Οι τιμές που προέκυψαν ήταν οι εξής: ICC Target: Acuumulation Time: 100μsec Averages: Φάσματα πλήρους σάρωσης Αναλυτής χρόνου πτήσεως (TOF): Με εφαρμογή δυναμικού θραυσματοποίησης (Fragmentor voltage) 410V ελήφθησαν τα ακόλουθα φάσματα πλήρους σάρωσης: x ESI Scan (1.096 min) Frag=410.0V HES MS.d H2O Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) Σχήμα 4.1 Φάσμα πλήρους σάρωσης Υδροξυαιθυλο-αμύλου 55

56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ x10 3 +ESI Scan (1.027 min) Frag=400.0V DEXTRAN_500ppm.d H 2O -H 2O C 6H 10O Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) Σχήμα 4.2 Φάσμα πλήρους σάρωσης Δεξτράνης Αναλυτής παγίδα ιόντων (iontrap): Με εφαρμογή δυναμικού θραυματοποίησης (Capillary Exit Voltage) 360Vελήφθησαν τα εξής φάσματα πλήρους σάρωσης: Intens. x MS, min #(89-111) H 2O -H 2O Σχήμα 4.3 Φάσμα πλήρους σάρωσης Δεξτράνης m/z

57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Intens. x MS, min #(89-132) H 2O m/z Σχήμα 4.4 Φάσμα πλήρους σάρωσης Υδροξυαιθυλο-αμύλου 4.7 Φάσματα δίδυμης φασματομετρίας MS/MS Αναλυτής χρόνου πτήσεως (TOF): Στη συνέχεια εφαρμόστηκε η τεχνική της δίδυμης φασματομετρίας μαζών με στόχων την εύρεση τουλάχιστον τριών μεταπτώσεων για ανάπτυξη μεθόδου επιβεβαιωτικής διαδικασίας. Για το σκοπό αυτό έγινε απομόνωση του ιόντων 251,1 (width 1.3 m/z) για το HES και το 325,1 (width 1.3 m/z) για τη δεξτράνη και εφαρμόστηκε δυναμικό θραυματοποίησης 5eV. Τα ιόντα αυτά επιλέχθηκαν διότι δίνουν μεγάλο σήμα, επομένως έχουν καλύτερη ευαισθησία και επίσης δίνουν τουλάχιστον 3 ιόντα τα οποία είναι απαραίτητα για την μελλοντική ανάπτυξη επιβεβαιωτικής μεθόδου. Τα φάσματα που ελήφθησαν παρατίθενται στα παρακάτω σχήματα: x10 3 +ESI Product Ion (1.042 min) Frag=400.0V CID@5.0 ( [z=1] -> **) PLASMA_ALL_3.d Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) Σχήμα 4.5 Φάσμα MS/MS Δεξτράνης 57

58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ x ESI Product Ion (1.182 min) Frag=400.0V CID@5.0 ( [z=1] -> **) HES_4_MS_MS_URINE.d Σχήμα 4.6 Φάσμα MS/MS Hetastarch Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) Αναλυτής παγίδα ιόντων (iontrap): Στην παγίδα ιόντων η τεχνική της δίδυμης φασματομετρίας εφαρμόστηκε και στη σάρωση ουσιών, εκτός των επιβεβαιωτικών διαδικασιών, με στόχο την εξάλειψη του σήματος από τη μήτρα (λόγω έλλειψης του φίλτρου ακριβούς μάζας που υπάρχει στο TOF). Έτσι έγινε απομόνωση το ιόντος m/z 325,1 (width 2.0 m/z) και εφαρμογή amplitude rf =1.3 Hz για τη δεξτράνη και το 413,2 (width 2.0 m/z) και εφαρμογή amplitude rf =1.1 (Το ιόν 413,2 εμφανίζει μεγαλύτερο σήμα από το 251,1 στο iontrap). Τα φάσματα που ελήφθησαν παρατίθενται στα παρακάτω σχήματα: Intens MS2(413.2), min #(52-70) Glc m/z Σχήμα 4.7 Φάσμα MS/MS Hetastarch 58

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Intens H 2O +MS2(325.1), min #(77-89) m/z Σχήμα 4.8 Φάσμα MS/MS Δεξτράνης 4.8 Χρωματογραφικές συνθήκες Τόσο για τη μέθοδο του LC-MS QTOF όσο και του LC-MSD TRAP MS ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε με τη χρήση στήλης ZIC-HILIC υπό συνθήκες ισοκρατικής έκλουσης με αναλογία % διαλύτη Α: % Διαλύτη Β 35:65 (v/v), όπου ο διαλύτης Α είναι ρυθμιστικό διάλυμα μυρμηκικού αμμωνίου 5mM ρυθμισμένο με μυρμηκικό οξύ 0,1% (ph= 4.0) ενώ ο διαλύτης Β είναι ακετονιτρίλιο και ρυθμιστικό διάλυμα μυρμηκικού αμμωνίου 5mM ρυθμισμένο με μυρμηκικό οξύ 0,1% σε αναλογία 90:10 (v/v). HES Σχήμα 4.9 Χρωματογράφημα LC-QTOFMS σήματος ως προς το χρόνο όπου απομονώνεται το ιόν του HES με παράθυρο ακρίβειας μάζας τα 20 ppm. 59

60 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Dextran β-cd Σχήμα 4.10 Χρωματογράφημα LCQTOFMS σήματος ως προς το χρόνο όπου απομονώνεται το ιόν της β-cd. Intens. x HES Time [min] EIC 129 +MS2(413.2), Smoothed (3.0,1, GA) Σχήμα 4.11 Χρωματογράφημα LC-iontrap-MS σήματος ως προς το χρόνο όπου απομονώνεται η μετάπτωση 129 του ιόντος του HES. 60

61 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Intens. x Dextran β-cd Time [min] EIC 145 +MS2(325.1), Smoothed (3.0,1, GA) EIC 145 +MS2(325.1), Smoothed (3.0,1, GA) Σχήμα 4.11 Χρωματογράφημα LC-iontrap-MS σήματος ως προς το χρόνο όπου απομονώνεται η μετάπτωση 145 του ιόντος που είναι κοινή για τη δεξτράνη και τη β-cd που χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Στα 1,4 λεπτά είναι ο χρόνος έκλουσης της δεξτράνης και στα 2.1 λεπτά ο χρόνος έκλουσης της β-cd. 4.9 Διαδικασίες διακρίβωσης οργάνων Αναλυτής χρόνου πτήσεως 58 Η συντήρηση και η βαθμονόμηση του LCQTOF MS γίνεται με βάση τις διαδικασίες που περιλαμβάνονται στις τυποποιημένες μορφές εργασίας ΤΜΕ 123 και ΤΜΕ 124: i. Τι σημαίνουν οι όροι Με τον όρο διακρίβωση νοείται η διαδικασία κατά την οποία γίνεται ακριβής βαθμονόμηση του συστήματος ως προς τις τιμές m/z με βάση τις τιμές m/z γνωστών προτύπων ουσιών που εισάγονται στο φασματόμετρο μαζών είτε πριν είτε κατά τη διάρκεια της ανάλυσης ενός δείγματος ή μιας σειράς δειγμάτων. Με τον όρο tune (συντονισμός) νοείται η αυτοματοποιημένη (μέσω του λογισμικού) διαδικασία κατά την οποία όλες οι παράμετροι του φασματόμετρου μαζών ρυθμίζονται στις κατάλληλες τιμές με στόχο να επιτευχθεί η μέγιστη δυνατή απόκριση διατηρώντας ταυτόχρονα αποδεκτή διαχωριστικότητα και το αντίστροφο. 61

62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ii. Διαδικασία Διακρίβωσης a. Πότε πραγματοποιείται: Η διαδικασία της διακρίβωσης θα πρέπει να πραγματοποιείται 1-2 φορές ημερησίως. b. Πώς πραγματοποιείται: Η διαδικασία της διακρίβωσης πραγματοποιείται με απευθείας εισαγωγή στο φασματόμετρο μαζών του διαλύματος διακρίβωσης (CalB) που περιέχει 10 μάζες σε εύρος amu. Η διαδικασία πραγματοποιείται ως εξής: -Φορτώνεται το παράθυρο του tune -Ενεργοποιείται η παροχή του διαλύματος διακρίβωσης πατώντας το κουμπί CalB. -Αναμονή περίπου 2 min μέχρι να σταθεροποιηθούν οι εντάσεις των 10 κορυφών στο παράθυρο που δείχνει το φάσμα iii. Έλεγχος Διακρίβωσης Πραγματοποιείται πατώντας την επιλογή Check calibration στο παράθυρο του Calibration. Θα πρέπει το σφάλμα μαζών να παρουσιάζει ολίσθηση (drift) προς την ίδια κατεύθυνση μικρότερη από 10 ppm ανά ώρα και μικρότερο από 50 ppm σε 8 ώρες. iv. Διαδικασία Διόρθωσης Ακριβούς Μάζας Για την επίτευξη μετρήσεων μάζας υψηλής ακρίβειας εκτός από την διαδικασία της διακρίβωσης μπορεί να εφαρμοστεί η διαδικασία της διόρθωσης της ακριβούς μάζας. Κατά τη διαδικασία αυτή πραγματοποιείται αυτόματη διόρθωση των σφαλμάτων μάζας καθ όλη τη διάρκεια της ανάλυσης με τη συνεχή εισαγωγή στο φασματόμετρο μαζών διαλύματος που περιέχει δύο πρότυπες ουσίες (Διάλυμα μαζών αναφοράς, RefA) με μάζες και έτσι ώστε να καλύπτουν όλο το εύρος των μαζών που εργαζόμαστε Αναλυτής παγίδας ιόντων Η συντήρηση και η βαθμονόμηση 59 του LC-MSD TRAP MS γίνεται με βάση τις διαδικασίες που περιλαμβάνονται στις τυποποιημένες μορφές εργασίας ΤΜΕ 123 και ΤΜΕ 124: i. Διακρίβωση οργάνου MSD Ion Trap α) Η διακρίβωση του οργάνου MSD Ion Trap, αφορά τις λειτουργίες της σάρωσης (scan), απομόνωσης (isolation) και θραυσματοποίησης (fragmentation). Πραγματοποιείται σε περιοδική 62

63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ βάση και όχι μικρότερη από 1 μήνα, με αποδεκτή τιμή αυτή των 6 μηνών. Η διακρίβωση αυτή είναι αναγκαία να γίνει σε περίπτωση επισκευών στο φασματόμετρο μάζας (π.χ. αντικατάσταση ηλεκτρονικών που συνδέονται με την παγίδα ιόντων ή την αντικατάσταση της ίδιας της παγίδας). Η ίδια η παγίδα ιόντων είναι εξαιρετικά δύσκολο να επιμολυνθεί και συνήθως απαιτεί τουλάχιστον δύο χρόνια λειτουργίας πριν οποιαδήποτε απώλεια ευαισθησίας του οργάνου ή λανθασμένη απόδοση ιόντων αποδοθεί σε μολυσμένη παγίδα ιόντων Η διαδικασία περιγράφεται επακριβώς στο Agilent 1100 Series LC/MSD Trap Software Familirization Manual. Χρησιμοποιείται το διάλυμα βαθμονόμησης με περιεχόμενη ουσία την Reserpine, στο διάλυμα διακρίβωσης (ES Tuning Mix for LC/MSD Trap Agilent), (Π739) και απαιτεί τη συσκευή εισαγωγής stepper motor με σύριγγα (STS1). Το διάλυμα διακρίβωσης εισάγεται με τη συσκευή εισαγωγής με ροή 5 μl/min ή 300 μl/h, απευθείας στο χώρο του ESI, χωρίς κινητή φάση. Ο χρήστης θα πρέπει να αφαιρέσει το spacer της βελόνας εισαγωγής του ESI για καλύτερα αποτελέσματα. Οι λειτουργικές παράμετροι της παγίδας ιόντων έχουν ως εξής: Τιμή του Averages: 5 Rolling Averaging: 2 Nebulizer: 15 psi Dry Gas: 5 L/min Dry Temp: 325ºC ICC Target: Max. Accumulation Time: 30 ms. β) Scan Calibration Επιλέγεται το στοιχείο του Calibration στο κάτω μέρος της οθόνης του λογισμικού ελέγχου του MS Ion Trap. Επιλέγεται η εντολή «Scan Calibration» και γίνεται κλικ στο κουμπί εντολής «Start». Η αυτόματη διαδικασία διαρκεί περίπου 10 min, οπότε ο χρήστης θα πρέπει να έχει τουλάχιστον 100 μl στην σύριγγα του συστήματος εισαγωγής. Για να ολοκληρωθεί η διαδικασία αυτόματης βαθμονόμησης θα πρέπει να γίνει βαθμονόμηση σε τουλάχιστον 4 σημεία του m/z. Αν η διαδικασία ολοκληρωθεί επιτυχώς δεν θα πρέπει να έχει εμφανιστεί οποιοδήποτε μήνυμα λάθους στην οθόνη και επιλέγεται η εντολή «Save». Η επιβεβαίωση της καλής απόδοσης των τιμών m/z στον άξονα x, γίνεται με την καταγραφή ενός δείγματος της ουσίας βαθμονόμησης από το σύστημα. Η αναφορά του δείγματος αυτού που παράγεται τοποθετείται στον Φάκελο Β του οργάνου (Scan Calibrations). Η διαδικασία έχει ως εξής: Φορτώνεται η μέθοδος STD_NOR.ms (Method Load Method ) 63

64 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΔΡΟΦΙΛΩΝ ΑΛΛΗΛΕ- ΠΙΔΡΑΣΕΩΝ/ΔΙΔΥΜΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ Στις επιλογές του Sample Info συμπληρώνονται τα πεδία: Filename: Manual STD_NOR (όπου 04 έτος, 05 μήνας, 10 ημέρα). Subdirectory: S_CALIB Sample Name: ES Tuning Mix Pos Comment: std/nor, Επιλέγεται Acquisition Run Method Αφότου έχουν καταγραφεί τα δεδομένα του δείγματος αυτό φορτώνεται το αρχείο στο πρόγραμμα «Data Analysis». Επιλέγεται το χρωματογράφημα που έχει παραχθεί με σαρώνεται όλη η περιοχή του χρόνου και λαμβάνεται ένα μέσο φάσμα με την επιλογή της εντολής. Επιλέγεται η εντολή File Print με το πρότυπο αναφοράς (layout) Display Report (Landscape). Όλα τα ιόντα του διαλύματος ελέγχου (αναγράφονται και πάνω στη συσκευασία) θα πρέπει να είναι μέσα στη περιοχή του 0,2 amu. γ) Εκτός της επιβεβαίωσης της σωστής βαθμονόμησης ελέγχεται και η διαχωριστική ικανότητα του οργάνου, με το λογισμικό ελέγχου του. Επιλέγεται η εντολή και γίνεται κλικ στο ιόν 622. Το αποτέλεσμα εκτυπώνεται με την εντολή File Print. Θα πρέπει το ιόν 622 να διαχωρίζεται από το 623 με FWHM του 622 στην περιοχή του 0,45. δ) Το αποτέλεσμα κάθε ενέργειας εκτυπώνεται και φυλάσσεται στο φάκελο του οργάνου. 64

65 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 5.1 Αναλυτής χρόνου πτήσεως Η διαδικασία αξιολόγησης 60,61,62 πραγματοποιείται σύμφωνα με την ΤΜΕ022 Γενικές Ο- δηγίες Αξιολόγησης Αναλυτικών Μεθόδων και Υλικά Αναφοράς και η αναφορά περιλαμβάνει τα ακόλουθα αναλυτικά χαρακτηριστικά: 1. το σχετικό χρόνο ανάσχεσης (RRT) 2. Το λόγο σήματος προς θόρυβο (S/N ratio) 3. την ειδικότητα της αναλυτικής μεθόδου για κάθε ανιχνευόμενη ουσία (Specificity) 4. την ικανότητα προσδιορισμού απαγορευμένων ουσιών (Identification capability) στα 50 ppm 5. τον έλεγχο επιμόλυνσης (Carryover) 6. τις παρεμποδίσεις από το υπόστρωμα (Matrix Interferences) 7. την επίδραση από το υπόστρωμα (Matrix effect) 8. τις δοκιμασίες ανίχνευσης σε πραγματικά δείγματα 9. τη γραμμικότητα της μεθόδου 10. την επαναληψιμότητα της μεθόδου Σχετικός Χρόνος Ανάσχεσης (Relative Retention Time, RRT) O σχετικός χρόνος ανάσχεσης είναι το πηλίκο του χρόνου ανάσχεσης της ουσίας tr προς προσδιορισμό, προς τον χρόνο ανάσχεσης του εσωτερικού προτύπου (β-cyclodextrin). Για τον υπολογισμό του σχετικού χρόνου ανάσχεσης παρασκευάστηκαν 20 δείγματα ούρων τα οποία εμβολιάστηκαν με δεξτράνη και υδροξυαίθυλο άμυλο σε επίπεδο 50ppm. Οι χρόνοι ανάσχεσης (RT) για όλες τις προσδιοριζόμενες ουσίες, οι σχετικοί χρόνοι ανάσχεσης (RRT) και οι αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (SD) παρουσιάζονται στο Παράρτημα Ι. Για όλες τις προσδιοριζόμενες ουσίες οι σχετικοί χρόνοι ανάσχεσης (RRT) είναι αποδεκτοί καθώς παρουσιάζουν σφάλμα RSD (n = 20) < 6 %. 65

66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Λόγος σήματος προς θόρυβο (S/N ratio) Είναι ο λόγος μεταξύ του σήματος ως προς τον θόρυβο.εκτιμάται από την οπτική παρατήρηση των χρωματογραφημάτων (ύψος κορυφής ουσίας σε αυθαίρετες μονάδες / ύψος γραμμής βάσης στην αρχή της κορυφής σε αυθαίρετες μονάδες). Στην ποσοτικοποίηση απαγορευμένων ουσιών βάσει καμπύλης αναφοράς, πρέπει η συγκέντρωση του πρώτου προτύπου να εμφανίζει S/N μεγαλύτερο ή ίσο του 10. Ο υπολογισμός του λόγου σήματος προς θόρυβο έγινε με το πρόγραμμα Qualitative Analysis σε δείγματα ούρων που είχαν εμβολιαστεί με 50 ppm των ουσιών. Για τον προσδιορισμό του θορύβου χρησιμοποιήθηκε περιοχή διάρκειας 5 sec μετά το τέλος της χρωματογραφικής όπου με τη βοήθεια του προγράμματος υπολογίστηκε η τυπική απόκλιση των κορυφών που αποτελούν το θόρυβο. HES Dextran β-cd Εικόνα 5.1 Δεδομένα S/N για τις ουσίες σε συγκέντρωση 50 ppm στα ούρα. Επάνω: απεικονίζεται το HES με απομόνωση του ιόντος (ακρίβεια μάζας 20ppm). Κάτω: απεικονίζεται η δεξτράνη και η β-cd με απομόνωση του ιόντος (ακρίβεια μάζας 20ppm).Για όλες τις ουσίες S/N>10. Όπως φαίνεται και στις παραπάνω εικόνες μετά από απομόνωση των ιόντων και (με ακρίβεια μάζας 20 ppm παρατηρούμε ότι ο λόγος σήματος προς θόρυβο για τις ουσίες στα 50 ppm είναι μεγαλύτερος από 10 και συγκεκριμένα για το HES το S/N= 3060 και για τη δεξτράνη S/N=

67 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Ειδικότητα (Specificity) Είναι η ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει μόνο την επιλεγμένη απαγορευμένη ουσία, αποδεικνύεται με το διαχωρισμό ουσιών παρόμοιας δομής ή όπως αλλιώς ορίζεται στην Επικύρωση Διαδικασίας. Για τον έλεγχο ειδικότητας της μεθόδου παρασκευάζονται 2 κατηγορίες δειγμάτων. Η πρώτη κατηγορία αφορά τα CALMIX 5 και CALWADA 100 (δείγματα με σχεδόν όλες τις απαγορευμένες ουσίες από τη λίστα του WADA). Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει 2 μεταβολικά δείγματα θετικά στην ουσία Hetastarch και 1 θετικό δείγμα για Dextran. Τα δύο μεταβολικά για το υδροξυαίθυλο άμυλο προήλθαν από εθελοντές οι οποίοι είχαν λάβει το σκεύασμα Voluven ενώ το μεταβολικό δείγμα της δεξτράνης είναι ένα θετικό δείγμα αθλητή που αναλύθηκε σε άλλο εργαστήριο. Ως μεταβολικά δείγματα ορίζονται τα δείγματα που προέρχονται από χορήγηση των σκευασμάτων σε ανθρώπους. Η πρώτη σειρά δειγμάτων που αφορά τα CALMIX και CALWADA που περιέχουν όλες σχεδόν τις απαγορευμένες ουσίες δεν παρουσίασαν χρωματογραφική κορυφή στους χρόνους έ- κλουσης των ουσιών. Η δεύτερη σειρά δειγμάτων που αφορά τα μεταβολικά δείγματα επιβεβαιώνει τη μέθοδο καθώς στους αντίστοιχους χρόνους ανάσχεσης εμφανίζονται κορυφές λόγο της παρουσίας του ιόντος m/z = (+/- 20ppm). Επομένως η μέθοδος κρίνεται ειδική ως προς την ανίχνευση των 2 ουσιών. β-cd Δεν παρουσιάζεται κάποια κορυφή στο χρόνο έκλουσης της δεξτράνης CALΜΙΧ β-cd Δεν παρουσιάζεται κάποια κορυφή στο χρόνο έκλουσης της δεξτράνης CALWADA Εικόνα 5.2 Απομόνωση του ιόντος (με παράθυρο ακρίβεια μάζας 20 ppm) που αντιστοιχεί στη δεξτράνη και τη β-cd. Επάνω απεικονίζεται το CalMix και κάτω το CALWADA. Εμφανίζεται μόνο η κορυφή του εσωτερικού προτύπου και καμία άλλη κορυφή. 67

68 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Δεν παρουσιάζεται κάποια κορυφή στο χρόνο έκλουσης του HES CALΜΙΧ Δεν παρουσιάζεται κάποια κορυφή στο χρόνο έκλουσης του HES CALWADA Εικόνα 5.3 Απομόνωση του ιόντος (με παράθυρο ακρίβεια μάζας 20 ppm) που αντιστοιχεί στo HES. Επάνω απεικονίζεται το CalMix και κάτω το CALWADA. Δεν παρουσιάται καμία κορυφή στο χρόνο έκλουσης του υδροξυαίθυλο αμύλου. HES β-cd Εικόνα 5.4 Μεταβολικό Μ92. Επάνω απεικονίζεται το υδροξυλαιθυλο άμυλο και κάτω το εσωτερικό πρότυπο. 68

69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ HES β-cd Εικόνα 5.5 Μεταβολικό Μ92. Επάνω απεικονίζεται το υδροξυλαιθυλο άμυλο και κάτω το εσωτερικό πρότυπο. Δεξτράνη β-cd Εικόνα 5.6 Μεταβολικό Δεξτράνης. Στα 1.69 min είναι η κορυφή της δεξτράνης ενώ στα 2.07 min είναι η κορυφή του εσωτερικού προτύπου. Παρατηρούμε ότι ο χρόνος έκλουσης της δεξτράνης στο πραγματικό δείγμα διαφέρει κατά 0,15min από τον χρόνο έκλουσης της στο εμβολιασμένο δείγμα. Πιθανόν η αυτό συμβαίνει διότι η δεξτράνη εισερχόμενη στον οργανισμό μεταβολίζεται σε πολυπερές λίγο μικρότερου μοριακού βάρους. 69

70 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Ικανότητα προσδιορισμού απαγορευμένων ουσιών (Identification capability) Για την εκτίμηση της ικανότητας προσδιορισμού των υπό αξιολόγηση ουσιών (Identification capability) αναλύθηκαν 20 διαφορετικά λευκά δείγματα ούρων, στα οποία είχαν εμβολιαστεί πρότυπα μίγματα αναφοράς σε συγκέντρωση 50 ppm μαζί με τα αντίστοιχα λευκά δείγματα χωρίς εμβολιασμό. Το hydroxyethyl starch και η dextran είναι ανιχνεύσιμα σε συγκέντρωση 50 ppm και στα 20 εμβολιασμένα δείγματα ούρων. Ο λόγος σήματος προς το θόρυβο σε όλα τα δείγματα ήταν σε κάθε περίπτωση μεγαλύτερος από Έλεγχος επιμόλυνσης αυτόματου δειγματολήπτη (Carryover) Ο έλεγχος επιμόλυνσης περιλαμβάνει τον προσδιορισμό και την εφαρμογή εκείνων των συνθηκών που απαιτούνται για την ελαχιστοποίηση της επιμόλυνσης από δείγμα σε δείγμα της ανιχνευόμενης ουσίας κατά τη διάρκεια της παρασκευαστικής ή της αναλυτικής διαδικασίας. Ο έλεγχος επιμόλυνσης πραγματοποιείται με χρωματογραφική ανάλυση λευκών δειγμάτων ούρων αθλητών μεταξύ πυκνού πρότυπου διαλύματος για κάθε ανιχνευόμενη ουσία και παράθεση των χρωματογραφημάτων. Για τον έλεγχο τυχόν επιμόλυνσης αναλύθηκε ένα εμβολιασμένο δείγμα ούρων (1000 ppm) και 2 λευκά δείγματα, ένα πριν και ένα μετά την ανάλυση του εμβολιασμένου δείγματος σύμφωνα με το πρότυπο ISL. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου δεν παρατηρείται επιμόλυνση για HES και dextran m/z (DEX) m/z (HES) Δείγματα ούρων με τις ουσίες Λευκό δείγμα % Επιμόλυνση 0,00% 0,00% Σχήμα 5.1 Έλεγχος επιμόλυνσης 70

71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 1,6 min Στο χρόνο έκλουσης του HES δεν εμφανίζεται καμία κορυφή. 1,4 min β-cd Στο χρόνο έκλουσης της δεξτράνης δεν εμφανίζεται καμία κορυφή Εικόνα 5.7 Λευκό δείγμα 2 Δείγμα ελεύθερο ουσιών που ενέθηκε αμέσως μετά από δείγμα που ήταν εμβολιασμένο με τις ουσίες σε συγκέντρωση 1000ppm Παρεμποδίσεις υποστρώματος (Matrix interferences) Η αξιολογούμενη μέθοδος πρέπει να συνοδεύεται από έλλειψη παρεμποδίσεων κατά τη διάρκεια της ανίχνευσης απαγορευμένων ουσιών ή μεταβολιτών ή ακόμα και ενδογενών ουσιών τους από τη μήτρα του δείγματος. Ο έλεγχος παρεμποδίσεων περιλαμβάνει την ανάλυση 20 διαφορετικών λευκών δειγμάτων ούρων αθλητών και συγκριτική αξιολόγηση με τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δειγμάτων. Για τον έλεγχο των παρεμποδίσεων υποστρώματος αναλύθηκαν 20 διαφορετικά λευκά (blank) δείγματα. Η ανάλυση των 20 διαφορετικών αρνητικών δειγμάτων ούρων έδειξε ότι για τις προσδιοριζόμενες ουσίες δεν εμφανίστηκαν παρεμποδίζουσες κορυφές στους αντίστοιχους χρόνους ανάσχεσης με παράθυρο μάζας 20 ppm Επίδραση από το υπόστρωμα (matrix effect) Η επίδραση από το υπόστρωμα του δείγματος για κάθε προσδιοριζόμενη ουσία υπολογίστηκε με σύγκριση των εμβαδών κορυφών κάθε ουσίας σε πέντε δείγματα ούρων που εμβολιάστηκαν και των αντίστοιχων εμβαδών κορυφών προτύπων υδατικών διαλυμάτων στην ίδια συγκέντρωση 500ppm και για τις δύο ουσίες, σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: 1 [ΕΜΒΑΔΟΝ ΚΟΡΥΦΗΣ]ΣΤΑ ΟΥΡΑ / [ΕΜΒΑΔΟΝ ΚΟΡΥΦΗΣ]ΣΤΟ ΝΕΡΟ 71

72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Υπολογίστηκαν επίσης οι τυπικές αποκλίσεις της επίδρασης από το υπόστρωμα, ώστε να αξιολογηθούν οι διαφορές από τα πέντε διαφορετικά υποστρώματα ούρων Οι τιμές της % επίδρασης από το υπόστρωμα, καθώς και οι αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις παρουσιάζονται στο. Για τις 2 ουσίες που μελετήθηκαν, οι τιμές της % επίδρασης από το υπόστρωμα υπολογίστηκαν σε: 22% (±7%) για το HES και 26% (±13%) για τη Dextran. Εμβαδόν κορυφής του Υδρόξυαιθυλο Αμύλου στα Ούρα Εμβαδόν κορυφής του Υδρόξυαιθυλο Αμύλου στο Νερό % Καταστολή σήματος % % % % % MEAN , ,2 22% SD 94464, ,7 7% Εμβαδόν κορυφής της Δεξτράνης στα ούρα Εμβαδόν κορυφής της Δεξτράνης στο Νερό % Καταστολή σήματος % % % % MEAN % SD % Σχήμα 5.2 Έλεγχος επίδρασης του υποστρώματος, % καταστολή σήματος 72

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Δοκιμασία ανίχνευσης σε πραγματικά θετικά δείγματα (Application to real samples) Η αναπτυσσόμενη μέθοδος εφαρμόστηκε επίσης σε 2 μεταβολικά δείγματα (Μ92, Μ93), μετά τη χορήγηση σκευάσματος που περιείχε ΗΕS και σε 1 μεταβολικό (Μ1131) που περιείχε DEX. Η δοκιμασία ανίχνευσης σε δείγματα ούρων αθλητών που προηγουμένως είχαν λάβει σκεύασμα HES (Voluven ) και Dextran, επιβεβαιώνει τα προαναφερθέντα αποτελέσματα της αξιολόγησης της μεθόδου σάρωσης. m/z m/z (ISTD) (HES) Μ M m/z m/z (ISTD) (DEX) Μ Σχήμα 5.3 Απεικόνιση των areas των κορυφών για τα ιόντα της και της β-cd καθώς και του ιόντος του HES στα μεταβολικά δείγματα Δοκιμασία ελέγχου γραμμικότητας της μεθόδου Η επικύρωση της μεθοδολογίας που αναπτύχθηκε πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την ΤΜΕ22, όπως αυτή εφαρμόζεται στο Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ του ΟΑΚΑ σύμφωνα με τους κανονισμούς του ISL. Οι αποδεκτές τιμές από την ΤΜΕ22 αναφέρονται στα αντίστοιχα σημεία του κειμένου. Για τις καμπύλες αναφοράς, που χρησιμοποιούνται σε ποσοτικούς προσδιορισμούς διαδικασιών επιβεβαίωσης, απαιτούνται τουλάχιστον 4 διαφορετικές συγκεντρώσεις και τα στατιστικά στοιχεία υπολογίζονται βάση τουλάχιστον 4 διαφορετικών καμπυλών σύμφωνα με τις υποδείξεις του ISL. Ενώ για τις ουσίες που έχουν όριο το μεγαλύτερο σημείο της καμπύλης πρέπει να είναι διπλάσιο του ορίου, εκτός εάν το ISL ορίζει διαφορετικά. Επίσης ορίζεται ότι η περιοχή γραμμικότητας πρέπει να καλύπτει το 50% % του ορίου συγκέντρωσης των απαγορευμένων ουσιών. Η γραμμικότητα εκφράζεται με το συντελεστή προσδιορισμού R 2, όπου πρέπει R 2 0,97. 73

74 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Οι συγκεκριμένες ουσίες στον έλεγχο ντόπινγκ δεν έχουν συγκεκριμένο όριο που να επιβάλλει η WADA ούτε κάποιο ελάχιστο απαιτούμενο επίπεδο απόδοσης (MRPL) και δεν απαιτείται έλεγχος γραμμικότητας. Ωστόσο στην παρούσα μελέτη έγινε έλεγχος γραμμικότητας της μεθόδου για πιθανή μελλοντική επιβολή ορίου. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ουσιών έγινε χρήση της β-κυκλοδεξτρίνης ως εσωτερικό πρότυπο με στόχο τη διόρθωση πιθανών μεταβολών της ευαισθησίας του αναλυτή μαζών κατά τη διάρκεια του προσδιορισμού. Επίσης εκτός από τα διαλύματα αναφοράς παρασκευάστηκαν διαλύματα ελέγχου (control samples) για τον έλεγχο της καμπύλης αναφοράς. Για τον έλεγχο της γραμμικότητας της μεθόδου κατασκευάστηκαν καμπύλες αναφοράς με τη χρήση εμβολιασμένων δειγμάτων ούρων. Τα εμβολιασμένα δείγματα παρασκευάστηκαν με εμβολιασμό 100μL ούρων με την κατάλληλη ποσότητα προτύπων διαλυμάτων αναφοράς που ο- νομάζονται RMΔ και αραιώθηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιεγράφηκε στην παράγραφο 4.3 Οι συγκεντρώσεις που επιλέχθηκαν ήταν από τα 100 έως τα 1000 ppm τόσο για τη δεξτράνη όσο και για το υδροξυαίθυλο άμυλο και φαίνονται στους παρακάτω πίνακες. Προκειμένου να ελεγχθεί η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της μεθοδολογίας που αναπτύχθηκε, κατασκευάσθηκαν δείγματα ελέγχου με εμβολιασμό 100μL ούρων με την κατάλληλη ποσότητα προτύπων διαλυμάτων αναφοράς που ονομάζονται RMΔ και αραιώθηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιεγράφηκε στην παράγραφο 4.3 Προκειμένου να εκτιμηθεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων που προσδιορίζονται από την καμπύλη αναφοράς προσδιορίστηκε το % σφάλμα (% Er) για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης (back calculated values) καθώς και οι αντίστοιχες τιμές ακρίβειας για τα δείγματα ελέγχου. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σαν % Er. Σύμφωνα με την ΤΜΕ 22 αποδεκτή είναι η τιμή % Er 15% τόσο για τις τιμές τις καμπύλης αναφοράς όσο και για τα δείγματα ελέγχου, αλλά σε καμιά περίπτωση δεν πρέπει να υπερβαίνει την τιμή αυτή. Η εξίσωση που συσχετίζει τη συγκέντρωση του DEX με το σχετικό εμβαδόν της ουσίας ως προς το εσωτερικό πρότυπο είναι: Υ=0,00393(±0,00002)*C+0,01(±0,01). Ο συντελεστής προσδιορισμού της καμπύλης είναι: R 2 = 0,9998. Σύμφωνα με το διάγραμμα των υπολοίπων τα σημεία της καμπύλης δεν παρουσιάζουν κάποια τάση και επομένως το σφάλμα είναι τυχαίο και όχι συστηματικό. Οι υπολογιζόμενες από την εξίσωση συγκεντρώσεις (back calculated values) παρουσίασαν σφάλμα %Er<15% για όλες τις τιμές. Τα δείγματα ελέγχου επιβεβαιώνουν την καμπύλη αναφοράς παρουσιάζοντας σφάλμα %Εr<15%. 74

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 4,500 4,000 3,500 3,000 y = x R² = ,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0 Σχήμα 5.4 Καμπύλη αναφοράς εμβαδού επιφανείας της δεξτράνης σε συνάρτηση με τη συγκέντρωσή του στα ούρα 0,03 Διάγραμμα υπολοίπων 0,02 Υπόλοιπα 0,01 0 0,0-0,01 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0-0,02 Συγκέντωση (ppm) Σχήμα 5.5 Διάγραμμα των υπολοίπων. Παρατηρούμε ότι δεν υπάρχει κάποια τάση στα σημεία και ότι το σφάλμα είναι μόνο τυχαίο και όχι συστηματικό. Η εξίσωση που συσχετίζει τη συγκέντρωση του HES με το σχετικό εμβαδόν της ουσίας ως προς το εσωτερικό πρότυπο είναι: Υ=-1,599e-007(±1,861*10-8 )Χ 2 +0, (±2,088*10-5 )Χ+0,04340(±0,04340). Ο συντελεστής προσδιορισμού της καμπύλης είναι: R 2 = 0,993. Σύμφωνα με το διάγραμμα των υπολοίπων τα σημεία της καμπύλης δεν παρουσιάζουν κάποια τάση και επομένως το σφάλμα είναι τυχαίο και όχι συστηματικό. Οι υπολογιζόμενες από την εξίσωση συγκεντρώσεις (back calculated values) παρουσίασαν σφάλμα <15% για όλες τις 75

76 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ τιμές. Τα δείγμα ελέγχου παρουσιάζουν επίσης σφάλμα <15% επιβεβαιώνοντας την ακρίβεια της μεθοδολογίας που αναπτύχθηκε. Σχήμα 5.6 Καμπύλη αναφοράς σχετικού εμβαδού επιφανείας HES σε συνάρτηση με τη συγκέντρωσή του στα ούρα. Relative Area Σχήμα 5.7 Διάγραμμα των υπολοίπων. Παρατηρούμε ότι δεν υπάρχει κάποια τάση στα σημεία και ότι το σφάλμα είναι μόνο τυχαίο και όχι συστηματικό. 76

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Δοκιμασία ελέγχου επαναληψιμότητας της μεθόδου Για τον υπολογισμό της ενδιάμεσης ακρίβειας χρησιμοποιούνται δεδομένα από διαφορετικές αναλύσεις δειγμάτων ελέγχου, εφαρμόζοντας τη στατιστική επεξεργασία μονόδρομης ANOVA, βάση του τύπου: u pppppppp = SS bb_rrrrrr 2 + SS 2 ww_rrrrrr nn ( μονάδες συγκέντρωσης) 2 Όπου, SS bb_rrrrrr = within group mean of squares 2 μμέσσσσσσ ττττττέςς ττττττ ττττττττττττώνννννν μμμμμμμμμμύ ττττττ οοοοάδδδδδδ SS ww_rrrrrr = nn n = αριθμός των επαναλήψεων του δείγματος σε κάθε ανάλυση Η μέθοδος δεν κρίνεται επαναλήψιμη για καμία από τις δύο ουσίες καθώς τα δείγματα ελέγχου δεν επιβεβαίωσαν την καμπύλη αναφοράς στην 2 η και 3 η εργαστηριακή ημέρα λόγω α- στάθειας του διαλύματος του εσωτερικού προτύπου. Επομένως για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ουσιών πρέπει να κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς εκ νέου Πίνακας επικύρωσης της μεθόδου Στον ακόλουθο πίνακα παρουσιάζονται συνοπτικά τα χαρακτηριστικά επικύρωσης της μεθόδου. ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΜΕΘΟΔΟΥ (Specificity) ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ (Identification Capability) ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗΣ (Carry Over) ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΕΙΣ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ (Matrix Interferences) Η μέθοδος κρίνεται ειδική για την ανίχνευση των ουσιών. Η μέθοδος εμφανίζεται ικανή να ανιχνεύει τις 2 ουσίες στα 50 ppm. Δεν παρατηρείται επιμόλυνση τόσο για το hydroxyethyl starch όσο και για τη dextran με το χρησιμοποιούμενο χρωματογραφικό σύστημα. Δεν παρατηρούνται παρεμποδίσεις από το υπόστρωμα 77

78 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ (Matrix effect) ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΡΑΜΜΙΚΟΤΗΤΑ (Linearity) Οι επιδράσεις από το υπόστρωμα είναι της τάξης των 5% - 51% για το HES και 2% -7% για τη Dextran LOD 50 μg/ml για το Hetastarch και το Dextran. Η καμπύλη αναφοράς της δεξτράνης παρουσιάζει ικανοποιητική γραμμικότητα σε όλο το εύρος συγκεντρώσεων ενώ η καμπύλη αναφοράς του HES είναι πολυωνυμική 2 ου βαθμού Δήλωση Καταλληλότητας: η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί σε αναλύσεις σάρωσης ούρων α- θλητών για plasma volume expanders. 78

79 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 5.2 Αναλυτής παγίδα ιόντων Η διαδικασία αξιολόγησης πραγματοποιείται σύμφωνα με την ΤΜΕ022 Γενικές Οδηγίες Αξιολόγησης Αναλυτικών Μεθόδων και Υλικά Αναφοράς και η αναφορά περιλαμβάνει τα ακόλουθα αναλυτικά χαρακτηριστικά: 1. το σχετικό χρόνο ανάσχεσης (RRT) 2. την ειδικότητα της αναλυτικής μεθόδου για κάθε ανιχνευόμενη ουσία (Specificity) 3. την ικανότητα προσδιορισμού απαγορευμένων ουσιών (Identification capability) στα 50 ppm 4. τον έλεγχο επιμόλυνσης (Carryover) 5. τις παρεμποδίσεις από το υπόστρωμα (Matrix Interferences) 6. την επίδραση από το υπόστρωμα (Matrix effect) 7. τις δοκιμασίες ανίχνευσης σε πραγματικά δείγματα 8. τη γραμμικότητα της μεθόδου 9. την επαναληψιμότητα της μεθόδου Αξιολογήθηκαν οι ουσίες: Hetastarch και Dextran. Η αξιολόγηση της μεθόδου προσδιορισμού της ταυτότητας απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών με την τεχνική LC/IONTRAP-MS Σχετικός Χρόνος Ανάσχεσης (Relative Retention Time, RRT) O σχετικός χρόνος ανάσχεσης είναι το πηλίκο του χρόνου ανάσχεσης της ουσίας προς προσδιορισμό, προς τον χρόνο ανάσχεσης του εσωτερικού προτύπου (β-cyclodextrin). Οι χρόνοι ανάσχεσης (RT) για όλες τις προσδιοριζόμενες ουσίες, οι σχετικοί χρόνοι ανάσχεσης (RRT) και οι αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις (SD) παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ (Πίνακας 1). Για όλες τις προσδιοριζόμενες ουσίες οι σχετικοί χρόνοι ανάσχεσης (RRT) είναι σταθεροί με RSD (n = 20) < 1.2 %. 79

80 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Ειδικότητα (Specificity) Για τον έλεγχο ειδικότητας της μεθόδου παρασκευάζονται τα CALMIX 5 και CALWADA 100 (δείγματα με σχεδόν όλες τις απαγορευμένες ουσίες από τη λίστα του WADA). Η ανάλυση των 20 διαφορετικών αρνητικών δειγμάτων ούρων έδειξε ότι για τις προσδιοριζόμενες ουσίες δεν εμφανίστηκαν παρεμποδίζουσες κορυφές. Επομένως η μέθοδος χαρακτηρίζεται ως ειδική για τον προσδιορισμό των ουσιών Ικανότητα προσδιορισμού απαγορευμένων ουσιών (Identification capability) Για την εκτίμηση της ικανότητας προσδιορισμού των υπό αξιολόγηση ουσιών (Identification capability) αναλύθηκαν 20 διαφορετικά λευκά δείγματα ούρων, στα οποία είχαν εμβολιαστεί πρότυπα μίγματα αναφοράς σε συγκέντρωση 50 ppm μαζί με τα αντίστοιχα λευκά δείγματα χωρίς εμβολιασμό. Το hydroxyethyl starch και η dextran είναι ανιχνεύσιμα σε συγκέντρωση 50 ppm Έλεγχος επιμόλυνσης (Carryover) Για τον έλεγχο τυχόν επιμόλυνσης αναλύθηκε ένα εμβολιασμένο δείγμα ούρων (σε συγκέντρωση 1000 ppm) και 2 λευκά δείγματα, ένα πριν και ένα μετά την ανάλυση του εμβολιασμένου δείγματος. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου δεν παρατηρείται επιμόλυνση για HES και δεξτράνης. m/z 145 (325.1) Εμβαδόν κορυφής m/z 129 (413.2) Εμβαδόν κορυφής Δείγματα ούρων με τις ουσίες Λευκό δείγμα % Επιμόλυνση 0,00% 0,00% Σχήμα 5.8 Έλεγχος επιμόλυνσης 80

81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο : ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Εικόνα 5.8 Έλεγχος Επιμόλυνσης. Παρατηρούμε ότι στους χρόνους ανάσχεσης των ουσιών δεν εμφανίζεται καμία κορυφή Παρεμποδίσεις υποστρώματος (Matrix interferences) Για τον έλεγχο των παρεμποδίσεων υποστρώματος αναλύθηκαν 20 διαφορετικά λευκά (blank) δείγματα. Από την ανάλυση των 20 λευκών δειγμάτων παρατηρήθηκε ότι το υπόστρωμα (ούρα) δεν παρεμποδίζει τη σάρωση των αναλυτών ενδιαφέροντος Επίδραση από το υπόστρωμα (Μatrix effect) Η επίδραση από το υπόστρωμα του δείγματος για κάθε προσδιοριζόμενη ουσία υπολογίστηκε με σύγκριση των εμβαδών των κορυφών κάθε ουσίας σε πέντε δείγματα ούρων που εμβολιάστηκαν και των αντίστοιχων εμβαδών των κορυφών προτύπων υδατικών διαλυμάτων στην ίδια συγκέντρωση, σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: 1 [ΕΜΒΑΔΟΝ ΚΟΡΥΦΗΣ]ΣΤΑ ΟΥΡΑ / [ΕΜΒΑΔΟΝ ΚΟΡΥΦΗΣ]ΣΤΟ ΝΕΡΟ Υπολογίστηκαν επίσης οι τυπικές αποκλίσεις της επίδρασης από το υπόστρωμα, ώστε να αξιολογηθούν οι διαφορές από τα πέντε διαφορετικά υποστρώματα ούρων. Οι τιμές της % επίδρασης από το υπόστρωμα, καθώς και οι αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις παρουσιάζονται στο. Για τις 2 ουσίες που μελετήθηκαν, οι τιμές της % επίδρασης από το υπόστρωμα παρουσίαζαν διακυμάνσεις: από 32% - 46% για το HES και 9%- 42% για τη Δεξτράνη. 81

ΑΣΚΗΣΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΙ

ΑΣΚΗΣΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΙ ΑΣΚΗΣΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΙ Τίτλος Εργαστηριακής Άσκησης: Προσδιορισμός Σχετικής Μοριακής Μάζας (Μ r ) Πρωτεΐνης με την Xρησιμοποίηση Φασματομετρίας Μάζας Ηλεκτροψεκασμού

Διαβάστε περισσότερα

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Αναλυτική Μέθοδος- Αναλυτικό Πρόβλημα. Ανάλυση, Προσδιορισμός και Μέτρηση. Πρωτόκολλο. Ευαισθησία Μεθόδου. Εκλεκτικότητα. Όριο ανίχνευσης (limit of detection, LOD).

Διαβάστε περισσότερα

H φασματοσκοπία μάζας: αναλυτική τεχνική αναγνώρισης αγνώστων ενώσεων, ποσοτικοποίησης γνωστών και διευκρίνισης της δομής.

H φασματοσκοπία μάζας: αναλυτική τεχνική αναγνώρισης αγνώστων ενώσεων, ποσοτικοποίησης γνωστών και διευκρίνισης της δομής. ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΑΣ (mass spectrometry) H φασματοσκοπία μάζας: αναλυτική τεχνική αναγνώρισης αγνώστων ενώσεων, ποσοτικοποίησης γνωστών και διευκρίνισης της δομής. Βασίζεται στην αρχή ότι τα κινούμενα ιόντα

Διαβάστε περισσότερα

Εργαστηριακή άσκηση μαθήματος «Σύγχρονες Αναλυτικές Τεχνικές»

Εργαστηριακή άσκηση μαθήματος «Σύγχρονες Αναλυτικές Τεχνικές» ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Εργαστηριακή άσκηση μαθήματος «Σύγχρονες Αναλυτικές Τεχνικές» Προσδιορισμός Diuron σε θαλασσινό νερό με υγροχρωματογραφία διαδοχική φασματομετρία

Διαβάστε περισσότερα

Γενικό Λύκειο Παραλίας. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΣΑΣΙΑ ΘΕΜΑ: Διατροφή και αθλητισμός.

Γενικό Λύκειο Παραλίας. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΣΑΣΙΑ ΘΕΜΑ: Διατροφή και αθλητισμός. Γενικό Λύκειο Παραλίας. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΣΑΣΙΑ ΘΕΜΑ: Διατροφή και αθλητισμός. Υπεύθυνη καθηγήτρια: Λουκοπούλου Νεκταρία Η ομάδα μας: Βενετιάδη Νικολίτσα Καγκελάρη Χριστίνα Κολεγιάννης Χρήστος Καρρά Φωτεινή

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ. Δρ. Γ. Ε. Μηλιάδης. Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς g.miliadis@bpi.

ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ. Δρ. Γ. Ε. Μηλιάδης. Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς g.miliadis@bpi. ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ Δρ. Γ. Ε. Μηλιάδης Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς g.miliadis@bpi.gr Σχεδιασμός αναλυτικών μεθόδων: Οι παράγοντες που πρέπει να ληφθούν

Διαβάστε περισσότερα

ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ DOPING ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΜΗΜΑ : Α2, ΣΧΟΛΙΚΟΣ ΕΤΟΣ ΛΥΚΕΙΟ ΝΥΔΡΙΟΥ ΛΕΥΚΑΔΑΣ

ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ DOPING ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΜΗΜΑ : Α2, ΣΧΟΛΙΚΟΣ ΕΤΟΣ ΛΥΚΕΙΟ ΝΥΔΡΙΟΥ ΛΕΥΚΑΔΑΣ ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ DOPING ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΜΗΜΑ : Α2, ΣΧΟΛΙΚΟΣ ΕΤΟΣ 2015-2016 ΛΥΚΕΙΟ ΝΥΔΡΙΟΥ ΛΕΥΚΑΔΑΣ Ορισμός Doping Ντόπινγκ ορίζεται ως η παρουσία στο ανθρώπινο σώμα ουσιών που είναι απαγορευμένες

Διαβάστε περισσότερα

Γενετικό Ντόπινγκ. Τζιαμούρτας Ζ. Αθανάσιος. Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας της Άσκησης

Γενετικό Ντόπινγκ. Τζιαμούρτας Ζ. Αθανάσιος. Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας της Άσκησης Γενετικό Ντόπινγκ Τζιαμούρτας Ζ. Αθανάσιος Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας της Άσκησης Γενετικό Ντόπινγκ Ως γενετικό ντόπινγκ ορίζεται η μη θεραπευτική χρήση γονιδίων, γενετικών στοιχείων και / ή κυττάρων,

Διαβάστε περισσότερα

ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Σύμφωνα με τον κώδικα Αντι-ντόπινγκ (που τίθεται σε ισχύ το 2005) του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-ντόπινγκ οι κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών έχουν ως εξής: ΔΙΕΓΕΡΤΙΚΑ Τα

Διαβάστε περισσότερα

των διαφόρων οργανικών ενώσεων και για την εξακρίβωση της δομής των φυσικών ενώσεων

των διαφόρων οργανικών ενώσεων και για την εξακρίβωση της δομής των φυσικών ενώσεων Η αναλυτική τεχνική ταυτοποίησης και προσδιορισμού της αρχικής ουσίας από τις πληροφορίες που παρέχει το φάσμα μαζών ονομάζεται φασματομετρίαμαζών (mass spectrometry,ms). χρησιμοποιείται ευρύτατα για την

Διαβάστε περισσότερα

Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι Ενόργανες Μέθοδοι Ανάλυσης είναι σχετικές μέθοδοι και σχεδόν στο σύνολο τους παρέχουν την αριθμητική τιμή μιας φυσικής ή φυσικοχημικής ιδιότητας, η

Διαβάστε περισσότερα

Η απώλεια του καλίου μειώνει την διεγερσιμότητα των μυϊκών κυττάρων (μυϊκή κόπωση

Η απώλεια του καλίου μειώνει την διεγερσιμότητα των μυϊκών κυττάρων (μυϊκή κόπωση Ηλεκτρολύτες Η απώλεια του καλίου μειώνει την διεγερσιμότητα των μυϊκών κυττάρων (μυϊκή κόπωση Αυξάνεται με την οξεία, έντονη σωματική άσκηση (προσωρινή αύξηση), από υπερβολική χρήση νατρίου, ανεπαρκή

Διαβάστε περισσότερα

Theory Greek (Greece) Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 Μονάδες)

Theory Greek (Greece) Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 Μονάδες) Q3-1 Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 Μονάδες) Παρακαλείστε να διαβάσετε τις Γενικές Οδηγίες στον ξεχωριστό φάκελο πριν ξεκινήσετε το πρόβλημα αυτό. Σε αυτό το πρόβλημα θα ασχοληθείτε με τη Φυσική

Διαβάστε περισσότερα

Φασματομετρία μαζών. Αρχή Οργανολογία Τεχνικές Ομολυτική ετερολυτική σχάση Εφαρμογές GC/MS, LC/MS ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΩΝ ΟΡΙΣΜΟΙ

Φασματομετρία μαζών. Αρχή Οργανολογία Τεχνικές Ομολυτική ετερολυτική σχάση Εφαρμογές GC/MS, LC/MS ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΩΝ ΟΡΙΣΜΟΙ Φασματομετρία μαζών Αρχή Οργανολογία Τεχνικές Ομολυτική ετερολυτική σχάση Εφαρμογές GC/MS, LC/MS ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΩΝ ΟΡΙΣΜΟΙ 2 Εφαρμογές 1) Επαλήθευση ή διερεύνηση οργανικών ενώσεων κατά τη συνθετική τους

Διαβάστε περισσότερα

Οργανική Χημεία. Κεφάλαια 12 &13: Φασματοσκοπία μαζών και υπερύθρου

Οργανική Χημεία. Κεφάλαια 12 &13: Φασματοσκοπία μαζών και υπερύθρου Οργανική Χημεία Κεφάλαια 12 &13: Φασματοσκοπία μαζών και υπερύθρου 1. Γενικά Δυνατότητα προσδιορισμού δομών με σαφήνεια χρησιμοποιώντας τεχνικές φασματοσκοπίας Φασματοσκοπία μαζών Μέγεθος, μοριακός τύπος

Διαβάστε περισσότερα

Γ ΤΑΞΗ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β )

Γ ΤΑΞΗ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΘΕΜΑ Α ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙΔΑΣ Γ ΤΑΞΗ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΚΥΡΙΑΚΗ 13/04/2014 - ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ: ΔΕΚΑΤΡΕΙΣ (13) ΟΔΗΓΙΕΣ ΑΥΤΟΔΙΟΡΘΩΣΗΣ Στις ερωτήσεις Α1

Διαβάστε περισσότερα

Μάθημα: ΣΥΓΧΡΟΝΟΙ ΟΛΥΜΠΙΑΚΟΙ ΑΓΩΝΕΣ

Μάθημα: ΣΥΓΧΡΟΝΟΙ ΟΛΥΜΠΙΑΚΟΙ ΑΓΩΝΕΣ ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ Μάθημα: ΣΥΓΧΡΟΝΟΙ ΟΛΥΜΠΙΑΚΟΙ ΑΓΩΝΕΣ Υπεύθυνος Μαθήματος: ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΑΛΜΠΑΝΙΔΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Διάλεξη 5η ΝΤΟΠΙΝΓΚ ΚΑΙ ΟΛΥΜΠΙΑΚΟΙ ΑΓΩΝΕΣ ί Π ή Θ ά ημοκρίτειο Πανεπιστήμιο

Διαβάστε περισσότερα

4 ο ΓΕΝΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΛΑΜΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΜΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ ΕΦΗΒΟΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΑ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΤΟΣ: 2013 2014

4 ο ΓΕΝΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΛΑΜΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΜΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ ΕΦΗΒΟΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΑ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΤΟΣ: 2013 2014 4 ο ΓΕΝΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΛΑΜΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΜΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ ΕΦΗΒΟΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΑ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΤΟΣ: 2013 2014 ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΣ Ο αθλητισμός είναι η συστηματική σωματική καλλιέργεια και

Διαβάστε περισσότερα

Theory Greek (Greece) Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 Μονάδες)

Theory Greek (Greece) Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 Μονάδες) Q3-1 Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 Μονάδες) Παρακαλείστε να διαβάσετε τις Γενικές Οδηγίες στον ξεχωριστό φάκελο πριν ξεκινήσετε το πρόβλημα αυτό. Σε αυτό το πρόβλημα θα ασχοληθείτε με τη Φυσική

Διαβάστε περισσότερα

Γ ΚΥΚΛΟΣ ΣΥΓΧΡΟΝΩΝ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΤΙΚΩΝ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΩΝ Προτεινόμενα Θέματα Γ ΓΕΛ Φεβρουάριος Φυσική ΘΕΜΑ Α

Γ ΚΥΚΛΟΣ ΣΥΓΧΡΟΝΩΝ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΤΙΚΩΝ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΩΝ Προτεινόμενα Θέματα Γ ΓΕΛ Φεβρουάριος Φυσική ΘΕΜΑ Α Φυσική ΘΕΜΑ Α γενικής παιδείας Να γράψετε τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω προτάσεις Α-Α5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. Α. Σύμφωνα με το πρότυπο του Bohr για το άτομο του

Διαβάστε περισσότερα

Theory Greek (Cyprus) Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 μονάδες)

Theory Greek (Cyprus) Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 μονάδες) Q3-1 Μεγάλος Επιταχυντής Αδρονίων (LHC) (10 μονάδες) Σας παρακαλούμε να διαβάσετε προσεκτικά τις Γενικές Οδηγίες που υπάρχουν στον ξεχωριστό φάκελο πριν ξεκινήσετε την επίλυση του προβλήματος. Σε αυτό

Διαβάστε περισσότερα

Λύση Α. Σωστή η επιλογή α. Β.

Λύση Α. Σωστή η επιλογή α. Β. 1) Αρνητικά φορτισμένο σωμάτιο κινείται σε ομογενές ηλεκτρικό πεδίο μεγάλης έκτασης. Να επιλέξετε τη σωστή πρόταση. Αν η κατεύθυνση της κίνησης του σωματίου παραμένει σταθερή, τότε: α. Συμπίπτει με την

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ & ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΥ. ΚΕ 0918 «Βιοχημική Αξιολόγηση Αθλητών»

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ & ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΥ. ΚΕ 0918 «Βιοχημική Αξιολόγηση Αθλητών» ΕΠΕΑΕΚ ΑΝΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΟΥ Τ.Ε.Φ.Α.Α.ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ - ΑΥΤΕΠΙΣΤΑΣΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ & ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΥ ΚΕ 0918 «Βιοχημική Αξιολόγηση Αθλητών»

Διαβάστε περισσότερα

Ερευνητική Εργασία Β Λυκείου

Ερευνητική Εργασία Β Λυκείου Ερευνητική Εργασία Β Λυκείου Από την αρχαία Ελλάδα στη σύγχρονη εποχή, ο αθλητισμός και τα φαινόμενα της βίας και του ντόπινγκ Ντόπινγκ: Νομική Διάσταση Εργάστηκε η μαθήτρια: Κωνσταντίνου Θάλεια Υπεύθυνος

Διαβάστε περισσότερα

ΛΟΗ Β. PDF created with pdffactory trial version

ΛΟΗ Β. PDF created with pdffactory trial version Αξιολόγηση προσδιορισμών Αναλυτική επίδοση προσδιορισμού Επιλογή μεθόδου προσδιορισμού βάσει αναλυτικών χαρακτηριστικών και ελέγχου ποιότητας των μετρήσεων Διαγνωστική αξία ανάλυσης Επιλογή δοκιμασίας

Διαβάστε περισσότερα

ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ ΜΕΤΡΗΣΗΣ: ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ, ΦΩΣΦΩΡΙΣΜΟΥ, ΣΚΕΔΑΣΗΣ ΕΚΠΟΜΠΗΣ, ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ

ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ ΜΕΤΡΗΣΗΣ: ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ, ΦΩΣΦΩΡΙΣΜΟΥ, ΣΚΕΔΑΣΗΣ ΕΚΠΟΜΠΗΣ, ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ ΜΕΤΡΗΣΗΣ: ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ, ΦΩΣΦΩΡΙΣΜΟΥ, ΣΚΕΔΑΣΗΣ ΕΚΠΟΜΠΗΣ, ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ ΠΗΓΕΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΣΥΝΕΧΕΙΣ ΠΗΓΕΣ ΠΗΓΕΣ ΓΡΑΜΜΩΝ ΚΟΙΛΗΣ ΚΑΘΟΔΟΥ & ΛΥΧΝΙΕΣ ΕΚΚΕΝΩΣΕΩΝ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Δρ. Νικόλας Φωκιαλάκης Επίκουρος Καθηγητής Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ HPLC system ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 1

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 1 Πε ρ ι ε χ ο μ ε ν α ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 1 ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 1 1.1 Εισαγωγή...1 1.2 Δειγματοληψία...2 1.2.1 Μέθοδοι και τεχνικές δειγματοληψίας...2 1.3 Προκατεργασία-Φύλαξη δειγμάτων...12 1.3.1 Δοχεία

Διαβάστε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ:

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ: ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ οργανικών, οργανομεταλλικών και ανόργανων ουσιών. Ο ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ ΕΞΑΙΤΙΑΣ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΣΤΗ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΗ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 217-218 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ 1. Τι γνωρίζετε για τη νόσο των δυτών. Απάντηση: Η νόσος των δυτών είναι μία σοβαρή κατάσταση,

Διαβάστε περισσότερα

9/21/2011. Δημοσιογραφική Διάσκεψη. 20 Σεπτεμβρίου Σκοπός. Σύντομος απολογισμός δραστηριοτήτων Ερωτήσεις Συζήτηση

9/21/2011. Δημοσιογραφική Διάσκεψη. 20 Σεπτεμβρίου Σκοπός. Σύντομος απολογισμός δραστηριοτήτων Ερωτήσεις Συζήτηση Δημοσιογραφική Διάσκεψη 20 Σεπτεμβρίου 2011 Σκοπός Σύντομος απολογισμός δραστηριοτήτων Ερωτήσεις Συζήτηση 1 Σύντομος Απολογισμός Νομικό πλαίσιο/ Ίδρυση Κυπριακής Αρχής Αντί-Ντόπινγκ «Ποιοι είμαστε» Δραστηριότητες

Διαβάστε περισσότερα

Σύγχρονες έρευνες για τον ρόλο των εναλλακτικών βιολογικών υλικών στην ιατροδικαστική και τοξικολογία. ΡΑΪΚΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Αν.

Σύγχρονες έρευνες για τον ρόλο των εναλλακτικών βιολογικών υλικών στην ιατροδικαστική και τοξικολογία. ΡΑΪΚΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Αν. Σύγχρονες έρευνες για τον ρόλο των εναλλακτικών βιολογικών υλικών στην ιατροδικαστική και τοξικολογία ΡΑΪΚΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Αν. Καθηγητής Κλινική Τοξικολογία Βιολογικά Υλικά Αίμα-πλάσμα-ορός (ο χρόνος ανίχνευσης

Διαβάστε περισσότερα

Η ποιότητα συναντά την αποδοτικότητα. Φασματοφωτόμετρο DR6000 UV-VIS

Η ποιότητα συναντά την αποδοτικότητα. Φασματοφωτόμετρο DR6000 UV-VIS Η ποιότητα συναντά την αποδοτικότητα Φασματοφωτόμετρο DR6000 UV-VIS Συνδυασμός ποιότητας και οικονομικής απόδοσης Το νέο φασματοφωτόμετρο DR6000 UV-VIS παρέχει κορυφαία απόδοση στις εργαστηριακές διαδικασίες

Διαβάστε περισσότερα

Λειτουργία και Απόδοση του Πρότυπου Ανιχνευτή ΝΕΣΤΩΡ

Λειτουργία και Απόδοση του Πρότυπου Ανιχνευτή ΝΕΣΤΩΡ 12 Λειτουργία και Απόδοση του Πρότυπου Ανιχνευτή ΝΕΣΤΩΡ Εισαγωγή Στο παρόν Κεφάλαιο περιγράφεται η λειτουργία και απόδοση του πρότυπου ανιχνευτή ΝΕΣΤΩΡ κατά τη λειτουργία του στη βαθιά θάλασσα. Συγκεκριμένα

Διαβάστε περισσότερα

Φασματομετρία Μαζών (Mass. Πέτρος Ταραντίλης- Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς - Επίκουρος καθηγητής

Φασματομετρία Μαζών (Mass. Πέτρος Ταραντίλης- Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς - Επίκουρος καθηγητής Φασματομετρία Μαζών (Mass Spectrometry, MS) Πέτρος Ταραντίλης- Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς - Επίκουρος καθηγητής 1 Πορεία της παρουσίασης 1. Βασικές αρχές Ιονισμός των μορίων 2. Οργανολογία Παραγωγή

Διαβάστε περισσότερα

Η απορρόφηση των φωτονίων από την ύλη βασίζεται σε τρεις µηχανισµούς:

Η απορρόφηση των φωτονίων από την ύλη βασίζεται σε τρεις µηχανισµούς: AΣΚΗΣΗ 5 ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΑΚΤΙΝΩΝ-γ (1 o ΜΕΡΟΣ) - Βαθµονόµηση και εύρεση της απόδοσης του ανιχνευτή - Μέτρηση της διακριτικότητας ενέργειας του ανιχνευτή 1. Εισαγωγή Η ακτινοβολία -γ είναι ηλεκτροµαγνητική

Διαβάστε περισσότερα

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ Ίσως η τεχνική με τη μεγαλύτερη ποικιλία εφαρμογών και την εντυπωσιακότερη ανάπτυξη την τελευταία δεκαετία. Η τεχνική MS παρέχει πληροφορίες σχετικά με: Τη στοιχειακή σύσταση του δείγματος

Διαβάστε περισσότερα

Μέλη ομάδας: Βασίλης Καρβέλας Κατερίνα Μανιαδάκη Τάσος Κελλάρης Ανδρέας Κατσαρός

Μέλη ομάδας: Βασίλης Καρβέλας Κατερίνα Μανιαδάκη Τάσος Κελλάρης Ανδρέας Κατσαρός Μέλη ομάδας: Βασίλης Καρβέλας Κατερίνα Μανιαδάκη Τάσος Κελλάρης Ανδρέας Κατσαρός Πώς συσχετίζονται ο αθλητισμός με την υγεία; Τι είναι το ντόπινγκ; Πώς επηρεάζει το ντόπινγκ τους αθλητές; Υπάρχουν έλεγχοι

Διαβάστε περισσότερα

Γεώργιος Ν. Καλούδης Δικηγόρος Ειδικός Σύμβουλος Γ.Γ. Αθλητισμού Μέλος Δ. Σ. Ε.Σ.ΚΑ.Ν. ΕΠΙ ΤΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Η ΟΥΣΙΑ ΕΙΝΑΙ Ο ΑΘΛΗΤΗΣ

Γεώργιος Ν. Καλούδης Δικηγόρος Ειδικός Σύμβουλος Γ.Γ. Αθλητισμού Μέλος Δ. Σ. Ε.Σ.ΚΑ.Ν. ΕΠΙ ΤΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Η ΟΥΣΙΑ ΕΙΝΑΙ Ο ΑΘΛΗΤΗΣ Γεώργιος Ν. Καλούδης Δικηγόρος Ειδικός Σύμβουλος Γ.Γ. Αθλητισμού Μέλος Δ. Σ. Ε.Σ.ΚΑ.Ν. ΕΠΙ ΤΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Η ΟΥΣΙΑ ΕΙΝΑΙ Ο ΑΘΛΗΤΗΣ ΤΙ ΕΊΝΑΙ ΤΟ ΕΘΝΙΚΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΚΑΤΑΠΟΛΕΜΗΣΗΣ ΤΟΥ ΝΤΟΠΙΝΓΚ Το Εθνικό Συμβούλιο

Διαβάστε περισσότερα

Γεωργικά Φάρμακα ΙΙΙ

Γεωργικά Φάρμακα ΙΙΙ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΙΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Ενότητα 7: Αέριος χρωματογραφία GC Ουρανία Μενκίσογλου-Σπυρούδη Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγή στις Ηλεκτρικές Μετρήσεις

Εισαγωγή στις Ηλεκτρικές Μετρήσεις Εισαγωγή στις Ηλεκτρικές Μετρήσεις Σφάλματα Μετρήσεων Συμβατικά όργανα μετρήσεων Χαρακτηριστικά μεγέθη οργάνων Παλμογράφος Λέκτορας Σοφία Τσεκερίδου 1 Σφάλματα μετρήσεων Επιτυχημένη μέτρηση Σωστή εκλογή

Διαβάστε περισσότερα

11 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ

11 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ Α.Ε.Ι. ΠΕΙΡΑΙΑ Τ.Τ. ΤΜΗΜΑ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ Τ.Ε. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΤΩΝ ΡΕΥΣΤΩΝ 11 η ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ Σκοπός της άσκησης Σκοπός της άσκησης είναι να μελετηθεί η φυσική εκροή του νερού από στόμιο

Διαβάστε περισσότερα

ΣΤΥΤΙΚΗ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ.

ΣΤΥΤΙΚΗ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ. ΣΤΥΤΙΚΗ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ. Η στυτική δυσλειτουργία είναι ένα από τα συχνότερα νοσήματα των ανδρών στην σημερινή εποχή.σε νεαρότερες ηλικίες το 30% οφείλεται σε οργανικές αιτίες και το 70 % σε ψυχολογικά αίτια

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΑΣΜΕΙΟΣ ΕΛΛΗΝΟΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Ιδιωτικό Γενικό Λύκειο Όνομα: Ημερομηνία:./04/2014 ΤΑΞΗ : A Λυκείου ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ 1 ο ΘΕΜΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11: Ενδοκρινείς αδένες ΒΙΟΛΟΓΙΑ Α ΛΥΚΕΙΟΥ

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ. Λειτουργία των νεφρών. Συμπτώματα της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας

ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ. Λειτουργία των νεφρών. Συμπτώματα της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΝΕΦΡΟΥ Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια είναι η προοδευτική, μη αναστρέψιμη μείωση της νεφρικής λειτουργίας, η οποία προκαλείται από βλάβη του νεφρού ποικίλης αιτιολογίας. Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια

Διαβάστε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ (SPECTROMETRIC TECHNIQUES)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ (SPECTROMETRIC TECHNIQUES) ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ (SPECTROMETRIC TECHNIQUES) ΑΘΗΝΑ, ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2014 ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Στηρίζονται στις αλληλεπιδράσεις της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με την ύλη. Φασματομετρία=

Διαβάστε περισσότερα

ιαγώνισµα Β Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κυριακή 5 Απρίλη 2015 Φως - Ατοµικά Φαινόµενα - Ακτίνες Χ

ιαγώνισµα Β Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κυριακή 5 Απρίλη 2015 Φως - Ατοµικά Φαινόµενα - Ακτίνες Χ ιαγώνισµα Β Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κυριακή 5 Απρίλη 2015 Φως - Ατοµικά Φαινόµενα - Ακτίνες Χ Σύνολο Σελίδων: έξι (6) - ιάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες Βαθµολογία % Ονοµατεπώνυµο: Θέµα Α Στις ηµιτελείς προτάσεις

Διαβάστε περισσότερα

Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου ειδικής για τον έλεγχο σταθερότητας (stabilityindicating

Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου ειδικής για τον έλεγχο σταθερότητας (stabilityindicating Εθνικόν και Καποδιστριακόν Πανεπιστήμιον Αθηνών ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου ειδικής για τον έλεγχο σταθερότητας (stabilityindicating assay method) Ιωάννης

Διαβάστε περισσότερα

ΡΥΘΜΙΣΗ ΚΑΡΔΙΑΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ

ΡΥΘΜΙΣΗ ΚΑΡΔΙΑΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΡΥΘΜΙΣΗ ΚΑΡΔΙΑΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ Εργασία στο μάθημα της Βιολογίας Εισηγητής: Μ. Αντώνιος Καθηγητής: Πιτσιλαδής Βασίλης Σχ. έτος: 2016-2017 ΚΑΡΔΙΑ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΗΣ Η καρδιά είναι ένα μυώδες

Διαβάστε περισσότερα

Μετρήσεις Διατάξεων Laser Ανιχνευτές Σύμφωνης Ακτινοβολίας. Ιωάννης Καγκλής Φυσικός Ιατρικής Ακτινοφυσικός

Μετρήσεις Διατάξεων Laser Ανιχνευτές Σύμφωνης Ακτινοβολίας. Ιωάννης Καγκλής Φυσικός Ιατρικής Ακτινοφυσικός Μετρήσεις Διατάξεων Laser Ανιχνευτές Σύμφωνης Ακτινοβολίας Ιωάννης Καγκλής Φυσικός Ιατρικής Ακτινοφυσικός Maximum Permissible Exposure (MPE) - Nominal Hazard Zone (NHZ) Μέγιστη Επιτρεπτή Έκθεση (MPE) Το

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΡΟΛΟΓΙΑ: ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ, ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΚΑΙ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑ ΣΤΙΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ

ΜΕΤΡΟΛΟΓΙΑ: ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ, ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΚΑΙ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑ ΣΤΙΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΜΕΤΡΟΛΟΓΙΑ: ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ, ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΚΑΙ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑ ΣΤΙΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ E. Λαμπή, Χ. Αλεξόπουλος, Η. Κακουλίδης ΓΕΝΙΚΟ ΧΗΜΕΊΟ ΤΟΥ ΚΡΆΤΟΥΣ Ε X.Y. ΑΘΗΝΩΝ,

Διαβάστε περισσότερα

Φυσιολογία της Άσκησης

Φυσιολογία της Άσκησης 1 Φυσιολογία της Άσκησης Εργογόνα βοηθήματα Συμπληρώματα διατροφής Βασίλειος Σπ. Τράνακας MSc Διαιτολόγος Διατροφολόγος Καθηγητής Φυσικής Αγωγής & Αθλητισμού, Επιστημονικός συν. Τ.Ε.Ι. Κρήτης Εργογόνο

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΤΗΝ ΑΝΟΡΓΑΝΗ ΧΗΜΕΙΑ

ΦΥΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΤΗΝ ΑΝΟΡΓΑΝΗ ΧΗΜΕΙΑ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΙΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΦΥΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΤΗΝ ΑΝΟΡΓΑΝΗ ΧΗΜΕΙΑ Φασματοσκοπία Mossbauer ΠΕΡΙΚΛΗΣ ΑΚΡΙΒΟΣ Τμήμα Χημείας Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ Εισαγωγή ΙΣΤΟΡΙΚΉ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Ο Ρώσος βοτανολόγος M.S. Tswett χρησιμοποίησε για πρώτη φορά τη χρωματογραφία για τον διαχωρισμό διαφόρων φυτικών χρωστικών με τη βοήθεια

Διαβάστε περισσότερα

Πρωταθλητισμός και ντόπινγκ.

Πρωταθλητισμός και ντόπινγκ. 1 Πρωταθλητισμός και ντόπινγκ. Αναβολικές ουσίες, η λειτουργία τους στον ανθρώπινο οργανισμό και οι συνέπειές τους Ο όρος ντόπινγκ αναφέρεται στη χρήση ή χορήγηση απαγορευμένων φαρμακευτικών ουσιών και

Διαβάστε περισσότερα

Γ ΤΑΞΗ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β )

Γ ΤΑΞΗ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΘΕΜ ΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙΔΣ Γ ΤΞΗ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΙ ΕΠΛ (ΟΜΔ Β ) ΚΥΡΙΚΗ 13/04/2014 - ΕΞΕΤΖΟΜΕΝΟ ΜΘΗΜ: ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΙΔΕΙΣ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ: ΟΚΤΩ (8) ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ Στις ερωτήσεις 1 4 να γράψετε στο τετράδιο σας τον

Διαβάστε περισσότερα

Η ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ ΑΤΟΜΟΥ ΤΟΥ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ

Η ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ ΑΤΟΜΟΥ ΤΟΥ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ Η ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΤΟΥ ΑΤΟΜΟΥ ΤΟΥ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ ΑΣΚΗΣΗ 1 Άτομα αερίου υδρογόνου που βρίσκονται στη θεμελιώδη κατάσταση (n = 1), διεγείρονται με κρούση από δέσμη ηλεκτρονίων που έχουν επιταχυνθεί από διαφορά δυναμικού

Διαβάστε περισσότερα

1)Σε ένα πυκνωτή, η σχέση μεταξύ φορτίου Q και τάσης V μεταξύ των οπλισμών του, απεικονίζεται στο διάγραμμα.

1)Σε ένα πυκνωτή, η σχέση μεταξύ φορτίου Q και τάσης V μεταξύ των οπλισμών του, απεικονίζεται στο διάγραμμα. 1)Σε ένα πυκνωτή, η σχέση μεταξύ φορτίου Q και τάσης V μεταξύ των οπλισμών του, απεικονίζεται στο διάγραμμα. Να επιλέξετε τη σωστή απάντηση. Η χωρητικότητα του πυκνωτή είναι: α. 5 F, β. 1 / 5 μf, γ. 5

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Επιµέλεια: Οµάδα Φυσικών της Ώθησης

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Επιµέλεια: Οµάδα Φυσικών της Ώθησης ΕΘΝΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ 0 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Επιµέλεια: Οµάδα Φυσικών της Ώθησης ΘΕΜΑ A ΕΘΝΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ 0 Παρασκευή, 0 Μαΐου 0 Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΗ Στις ερωτήσεις Α -Α να γράψετε στο τετράδιό σας τον

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ

ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ 5 ΧΡΟΝΙΑ ΕΜΠΕΙΡΙΑ ΣΤΗΝ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΘΕΜΑΤΑ ΘΕΜΑ Α Στις ερωτήσεις Α-Α να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό της ερώτησης και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή φράση, η οποία

Διαβάστε περισσότερα

Greek. 1 Ερώτ ηση: Είμαι εξ ολοκλήρου υπεύθυνος για κάθε ουσία που χρησιμοποιώ, εισάγω με ένεση ή επιθέτω στο

Greek. 1 Ερώτ ηση: Είμαι εξ ολοκλήρου υπεύθυνος για κάθε ουσία που χρησιμοποιώ, εισάγω με ένεση ή επιθέτω στο Greek 1 Ερώτ ηση: Είμαι εξ ολοκλήρου υπεύθυνος για κάθε ουσία που χρησιμοποιώ, εισάγω με ένεση ή επιθέτω στο σώμα μου. Εξήγ ηση: Όλοι οι αθλητές πρέπει να είναι προνοητικοί και να ενημερώνονται διαρκώς

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΟΓΙΚΩΝ & ΨΗΦΙΑΚΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ. Εργαστήριο 8 ο. Αποδιαμόρφωση PAM-PPM με προσαρμοσμένα φίλτρα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΟΓΙΚΩΝ & ΨΗΦΙΑΚΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ. Εργαστήριο 8 ο. Αποδιαμόρφωση PAM-PPM με προσαρμοσμένα φίλτρα Τμήμα Πληροφορικής και Τηλεπικοινωνιών ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΟΓΙΚΩΝ & ΨΗΦΙΑΚΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ ΨΗΦΙΑΚΕΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΕΣ Εργαστήριο 8 ο Αποδιαμόρφωση PAM-PPM με προσαρμοσμένα φίλτρα Βασική Θεωρία Σε ένα σύστημα μετάδοσης

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΝΩΝ

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΝΩΝ ΑΡΧΗ ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΝΩΝ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΚΑΙ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 0 ΜΑΪΟΥ 204 - ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ:

Διαβάστε περισσότερα

Θεωρητική Εξέταση. Τρίτη, 15 Ιουλίου /3

Θεωρητική Εξέταση. Τρίτη, 15 Ιουλίου /3 Θεωρητική Εξέταση. Τρίτη 15 Ιουλίου 2014 1/3 Πρόβλημα 3. Απλό μοντέλο εκκένωσης αερίου (10 ) Η διέλευση ηλεκτρικού ρεύματος μέσα από ένα αέριο ονομάζεται εκκένωση αερίου. Υπάρχουν πολλοί τύποι εκκένωσης

Διαβάστε περισσότερα

1.Η δύναμη μεταξύ δύο φορτίων έχει μέτρο 120 N. Αν η απόσταση των φορτίων διπλασιαστεί, το μέτρο της δύναμης θα γίνει:

1.Η δύναμη μεταξύ δύο φορτίων έχει μέτρο 120 N. Αν η απόσταση των φορτίων διπλασιαστεί, το μέτρο της δύναμης θα γίνει: ΗΛΕΚΤΡΟΜΑΓΝΗΤΙΣΜΟΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΕΠΙΛΟΓΩΝ Ηλεκτρικό φορτίο Ηλεκτρικό πεδίο 1.Η δύναμη μεταξύ δύο φορτίων έχει μέτρο 10 N. Αν η απόσταση των φορτίων διπλασιαστεί, το μέτρο της δύναμης θα γίνει: (α)

Διαβάστε περισσότερα

MASS SPECTROMETRY ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ

MASS SPECTROMETRY ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ MASS SPECTROMETRY 100 279 50 238 308 0 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ Ίσως η τεχνική με τη μεγαλύτερη ποικιλία εφαρμογών και την εντυπωσιακότερη ανάπτυξη

Διαβάστε περισσότερα

09 Εκτός αγώνων έλεγχοι στο Ποδόσφαιρο

09 Εκτός αγώνων έλεγχοι στο Ποδόσφαιρο Ισχυρή συμμαχία κατά του ντόπινγκ στο ποδόσφαιρο Θεσσαλονίκη 04.09.2007 09 Εκτός αγώνων έλεγχοι στο Ποδόσφαιρο Γιώργος Μαυρωτάς Επιστημονική Ομάδα Ε.Σ.ΚΑ.Ν. Περιεχόμενα παρουσίασης Εισαγωγή Έλεγχοι εντός

Διαβάστε περισσότερα

Ορισμός Αναλυτικής Χημείας

Ορισμός Αναλυτικής Χημείας Ορισμός Αναλυτικής Χημείας Αναλυτική Χημεία ορίζεται ως ο επιστημονικός κλάδος, που αναπτύσσει και εφαρμόζει μεθόδους, όργανα και στρατηγικές, για να δώσει πληροφορίες σχετικά με τη σύσταση και φύση υλικών

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΝΩΝ

ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΝΩΝ ΑΡΧΗ 1ΗΣ ΣΕΛΙ ΑΣ Γ ΗΜΕΡΗΣΙΩΝ ΕΣΠΕΡΙΝΩΝ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΚΑΙ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 30 ΜΑΪΟΥ 2014 - ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ:

Διαβάστε περισσότερα

είναι τα μήκη κύματος του φωτός αυτού στα δύο υλικά αντίστοιχα, τότε: γ. 1 Β) Να δικαιολογήσετε την επιλογή σας.

είναι τα μήκη κύματος του φωτός αυτού στα δύο υλικά αντίστοιχα, τότε: γ. 1 Β) Να δικαιολογήσετε την επιλογή σας. Β.1 Μονοχρωματικό φως, που διαδίδεται στον αέρα, εισέρχεται ταυτόχρονα σε δύο οπτικά υλικά του ίδιου πάχους d κάθετα στην επιφάνειά τους, όπως φαίνεται στο σχήμα. Οι χρόνοι διάδοσης του φωτός στα δύο υλικά

Διαβάστε περισσότερα

Να αναρτηθεί στο διαδίκτυο και στην ιστοσελίδα του Ι.ΙΒ.ΕΑ.Α. Αθήνα, 12 Σεπτεμβρίου 2018 Α. Π. 3174

Να αναρτηθεί στο διαδίκτυο και στην ιστοσελίδα του Ι.ΙΒ.ΕΑ.Α. Αθήνα, 12 Σεπτεμβρίου 2018 Α. Π. 3174 Πληροφορίες: Β. Γιαννακοπούλου Να αναρτηθεί στο διαδίκτυο και στην ιστοσελίδα του Ι.ΙΒ.ΕΑ.Α. Αθήνα, 12 Σεπτεμβρίου 2018 Α. Π. 3174 Τηλέφωνο: 2106597702 Προς: Κάθε ενδιαφερόμενο Φαξ: 210 6597547 / 5 Email:

Διαβάστε περισσότερα

Ακτινοσκόπηση. Σοφία Κόττου. Επίκουρη Καθηγήτρια. Εργαστήριο Ιατρικής Φυσικής. Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών

Ακτινοσκόπηση. Σοφία Κόττου. Επίκουρη Καθηγήτρια. Εργαστήριο Ιατρικής Φυσικής. Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Ακτινοσκόπηση Σοφία Κόττου Επίκουρη Καθηγήτρια Εργαστήριο Ιατρικής Φυσικής Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Απρίλιος 2008 1 3. Η λειτουργία του ενισχυτή εικόνας Η φωτεινότητα της αρχικής εικόνας αυξάνεται

Διαβάστε περισσότερα

Ακτίνες Χ. Θέμα Δ. Για διευκόλυνση στους υπολογισμούς σας να θεωρήσετε ότι: hc J m

Ακτίνες Χ. Θέμα Δ. Για διευκόλυνση στους υπολογισμούς σας να θεωρήσετε ότι: hc J m Ακτίνες Χ Θέμα Δ 4_21796 Σε μια συσκευή παραγωγής ακτίνων Χ, τα ηλεκτρόνια εκπέμπονται από την κάθοδο χωρίς αρχική ταχύτητα, επιταχύνονται εξαιτίας της τάσης V μεταξύ ανόδου και καθόδου και φτάνουν στην

Διαβάστε περισσότερα

H ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ (SPECTROSCOPY-MRS) ΣΕ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟ ΤΟΜΟΓΡΑΦΟ 3Τ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ

H ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ (SPECTROSCOPY-MRS) ΣΕ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟ ΤΟΜΟΓΡΑΦΟ 3Τ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ H ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑΣ (SPECTROSCOPY-MRS) ΣΕ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟ ΤΟΜΟΓΡΑΦΟ 3Τ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Γ. Μπουλογιάννη 1, Α. Δρεβελέγκας 1, Ι. Χρυσογονίδης 2 1.Ιατρικό Διαβαλκανικό Κέντρο

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΟΓΙΚΩΝ & ΨΗΦΙΑΚΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΟΓΙΚΩΝ & ΨΗΦΙΑΚΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ Σχολή Θετικών Επιστημών Τεχνολογίας Τηλεπικοινωνιών Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τηλεπικοινωνιών ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΟΓΙΚΩΝ & ΨΗΦΙΑΚΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΕΣ ΙI Εργαστήριο 8 ο : Προσαρμοσμένα Φίλτρα Βασική

Διαβάστε περισσότερα

11. ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ

11. ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ 11. ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ Στον ανθρώπινο οργανισμό υπάρχουν δύο είδη αδένων, οι εξωκρινείς και οι ενδοκρινείς. Οι εξωκρινείς (ιδρωτοποιοί αδένες, σμηγματογόνοι αδένες κ.ά.) εκκρίνουν το προϊόν τους στην επιφάνεια

Διαβάστε περισσότερα

Τοξικολογία Τροφίμων. Εισαγωγή στις βασικές έννοιες

Τοξικολογία Τροφίμων. Εισαγωγή στις βασικές έννοιες Τοξικολογία Τροφίμων Εισαγωγή στις βασικές έννοιες Αξιολόγηση άρθρου Έννοιες Σημεία Μηχανισμούς Πορεία Ιδιαιτερότητες Ανάλυσης Τροφίμων Ενώσεις που έχουν δυσμενή επίδραση στον άνθρωπο και τα ζώα Ανίχνευση

Διαβάστε περισσότερα

Από πού προέρχεται η θερμότητα που μεταφέρεται από τον αντιστάτη στο περιβάλλον;

Από πού προέρχεται η θερμότητα που μεταφέρεται από τον αντιστάτη στο περιβάλλον; 3. ΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ Ένα ανοικτό ηλεκτρικό κύκλωμα μετατρέπεται σε κλειστό, οπότε διέρχεται από αυτό ηλεκτρικό ρεύμα που μεταφέρει ενέργεια. Τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά της ηλεκτρικής ενέργειας είναι

Διαβάστε περισσότερα

11. ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ

11. ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ 11. ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ Στον ανθρώπινο οργανισμό υπάρχουν δύο είδη αδένων, οι εξωκρινείς και οι ενδοκρινείς. Οι εξωκρινείς (ιδρωτοποιοί αδένες, σμηγματογόνοι αδένες κ.ά.) εκκρίνουν το προϊόν τους στην επιφάνεια

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Β Β.1 Α) Μονάδες 4 Μονάδες 8 Β.2 Α) Μονάδες 4 Μονάδες 9

ΘΕΜΑ Β Β.1 Α) Μονάδες 4  Μονάδες 8 Β.2 Α) Μονάδες 4 Μονάδες 9 Β.1 O δείκτης διάθλασης διαφανούς υλικού αποκλείεται να έχει τιμή: α. 0,8 β. 1, γ. 1,4 Β. Το ηλεκτρόνιο στο άτομο του υδρογόνου, έχει κινητική ενέργεια Κ, ηλεκτρική δυναμική ενέργεια U και ολική ενέργεια

Διαβάστε περισσότερα

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ. Αναστασία Δέτση Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ

ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ. Αναστασία Δέτση Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ Αναστασία Δέτση Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ (Mass Spectrometry, MS) Περίγραμμα παρουσίασης Εισαγωγή-Ιστορική αναδρομή Αρχή μεθόδου Μέθοδοι

Διαβάστε περισσότερα

Αναστρέψιμη αναστολή της λίμπιντο. Suprelorin. [οξική δεσλορελίνη]

Αναστρέψιμη αναστολή της λίμπιντο. Suprelorin. [οξική δεσλορελίνη] Αναστρέψιμη αναστολή της λίμπιντο Suprelorin [οξική δεσλορελίνη] Suprelorin Suprelorin, το πρώτο φάρμακο υπό μορφή εμφυτεύματος Βιοσυμβατό εμφύτευμα στο μέγεθος ενός πομπού Διαστάσεις: Διάμετρος 2,3 mm

Διαβάστε περισσότερα

ΠΕΙΡΑΜΑ FRANK-HERTZ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΕΝΟΣ ΑΤΟΜΟΥ

ΠΕΙΡΑΜΑ FRANK-HERTZ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΕΝΟΣ ΑΤΟΜΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑ FRANK-HERTZ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ ΕΝΟΣ ΑΤΟΜΟΥ Η απορρόφηση ενέργειας από τα άτομα γίνεται ασυνεχώς και σε καθορισμένες ποσότητες. Λαμβάνοντας ένα άτομο ορισμένα ποσά ενέργειας κάποιο

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΣΙΚΗ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Β Τάξης ΓΕΛ 4 ο ΓΕΛ ΚΟΖΑΝΗΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΠΕΔΙΟ ΣΤΕΦΑΝΟΥ Μ. ΦΥΣΙΚΟΣ

ΦΥΣΙΚΗ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Β Τάξης ΓΕΛ 4 ο ΓΕΛ ΚΟΖΑΝΗΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΠΕΔΙΟ ΣΤΕΦΑΝΟΥ Μ. ΦΥΣΙΚΟΣ ΦΥΣΙΚΗ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Β Τάξης ΓΕΛ 4 ο ΓΕΛ ΚΟΖΑΝΗΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΠΕΔΙΟ ΣΤΕΦΑΝΟΥ Μ. ΦΥΣΙΚΟΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΠΕΔΙΟ - ΜΑΓΝΗΤΙΚΟ ΠΕΔΙΟ Δυναμική ενέργεια δυο φορτίων Δυναμική ενέργεια τριών ή περισσοτέρων

Διαβάστε περισσότερα

Θέμα: Τεχνολογία και Αθλητισμός Υποθέμα: Φαρμακοδιέγερση

Θέμα: Τεχνολογία και Αθλητισμός Υποθέμα: Φαρμακοδιέγερση Θέμα: Τεχνολογία και Αθλητισμός Υποθέμα: Φαρμακοδιέγερση Σχολικό έτος:2016-2017 1 ο Γενικό Λύκειο Πετρούπολης Υπεύθυνος καθηγητής:κ.μανασής Βασίλης Για την εργασία αυτή επιμελήθηκαν οι μαθητές/τριες:βουζίκα

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΓΕΝ. ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΑΤΟΜΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΘΕΜΑ 1 ο.

ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΓΕΝ. ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΑΤΟΜΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΘΕΜΑ 1 ο. ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΓΕΝ. ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΑΤΟΜΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΘΕΜΑ 1 ο. Στις ερωτήσεις 1-5 επιλέξτε την πρόταση που είναι σωστή. 1) Το ηλεκτρόνιο στο άτοµο του υδρογόνου, το οποίο βρίσκεται στη θεµελιώδη κατάσταση: i)

Διαβάστε περισσότερα

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 10 η : Χημική κινητική. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής.

Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων. Ανόργανη Χημεία. Ενότητα 10 η : Χημική κινητική. Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής. Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων Ανόργανη Χημεία Ενότητα 10 η : Χημική κινητική Οκτώβριος 2018 Δρ. Δημήτρης Π. Μακρής Αναπληρωτής Καθηγητής Ταχύτητες Αντίδρασης 2 Ως ταχύτητα αντίδρασης ορίζεται είτε η αύξηση

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ HPLC

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ HPLC ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ HPLC ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΣΤΗΛΗ / ΣΤΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ Επίπεδη, μήκους 3-25 cm και διαμέτρου 0,5-5 mm. Μικροπορώδη σωματίδια πηκτής διοξειδίου

Διαβάστε περισσότερα

Παράρτημα III. Τροποποιήσεις των σχετικών παραγράφων της περίληψης των χαρακτηριστικών του προϊόντος και των φύλλων οδηγιών χρήσης

Παράρτημα III. Τροποποιήσεις των σχετικών παραγράφων της περίληψης των χαρακτηριστικών του προϊόντος και των φύλλων οδηγιών χρήσης Παράρτημα III Τροποποιήσεις των σχετικών παραγράφων της περίληψης των χαρακτηριστικών του προϊόντος και των φύλλων οδηγιών χρήσης Σημείωση: Οι σχετικές παράγραφοι της Περίληψης των Χαρακτηριστικών του

Διαβάστε περισσότερα

Εφαρμοσμένη Αθλητική Εργοφυσιολογία

Εφαρμοσμένη Αθλητική Εργοφυσιολογία Εφαρμοσμένη Αθλητική Εργοφυσιολογία Προπόνηση στον αγωνιστικό αθλητισμό Βασίλης Πασχάλης Επίκουρος καθηγητής ΤΕΦΑΑ - ΕΚΠΑ Εισαγωγή Θετικό προπονητικό stress: η προπόνηση που προκαλεί βελτίωση στην αθλητική

Διαβάστε περισσότερα

ΑΘΛΗΣΗ ΚΑΙ ΥΓΕΙΑ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΤΕΣΤΟΣΤΕΡΟΝΗΣ-ΑΝΑΒΟΛΙΚΩΝ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΡΗΓΑΣ MD, FEBU ΔΙΔΑΚΤΩΡ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΟΥΡΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ. ΕΥΡΩΚΛΙΝΙΚΗΣ ΑΘΗΝΩΝ Αθλητισμός Σωματική (φυσική κατάσταση,

Διαβάστε περισσότερα

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2ο: ΜΗΧΑΝΙΚΑ- ΗΛΕΚΤΡΟΜΑΓΝΗΤΙΚΑ ΚΥΜΑΤΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ.

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2ο: ΜΗΧΑΝΙΚΑ- ΗΛΕΚΤΡΟΜΑΓΝΗΤΙΚΑ ΚΥΜΑΤΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ. ΤΟ ΥΛΙΚΟ ΕΧΕΙ ΑΝΤΛΗΘΕΙ ΑΠΟ ΤΑ ΨΗΦΙΑΚΑ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΥΠΟΥΡΓΕΙΟΥ ΠΑΙΔΕΙΑΣ http://www.study4exams.gr/ ΕΧΕΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΘΕΙ ΑΝΑ ΕΝΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΝΑ ΤΥΠΟ ΓΙΑ ΔΙΕΥΚΟΛΥΝΣΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΣΑΣ ΚΑΛΗ ΕΠΙΤΥΧΙΑ ΣΤΗ

Διαβάστε περισσότερα

Cold Lazer LLLT η πράσινη θεραπεία του 21ου αιώνα

Cold Lazer LLLT η πράσινη θεραπεία του 21ου αιώνα Cold Lazer LLLT η πράσινη θεραπεία του 21ου αιώνα Τι είναι η Cold Laser LLLT Η θεραπεία με Laser, θεωρείται η πράσινη θεραπεία του 21ου αιώνα. Το Laser δεν περιέχει χημικές ουσίες, είναι καθαρή ενέργεια

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Λόγω των αυξημένων κρουσμάτων «ντόπινγκ» αθλητών τον 20ο και 21ο αιώνα οι αρμόδιοι διακρατικοί και κρατικοί φορείς αποφάσισαν ότι για να διατηρηθεί ο αθλητισμός καθαρός, έπρεπε

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΣΤΗ ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝ. ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ

ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΣΤΗ ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝ. ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ 05 2 0 ΘΕΡΙΝΑ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΣΤΗ ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝ. ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ ο Οδηγία: Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ερωτήσεις -4 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση..

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΞΕΝΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΞΕΝΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΞΕΝΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΞΕΝΟΒΙΟΤΙΚΗ ΟΥΣΙΑ χημική ουσία που δεν παράγεται στον οργανισμό και εισαγόμενη στον οργανισμό δεν αξιοποιείται για την εξασφάλιση ενέργειας ή σύνθεση

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Φατούρος Γ. Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής ΔΙΑΛΕΞΗ 2 - ΓΟΝΙΔΙΑ & ΑΣΚΗΣΗ

ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Φατούρος Γ. Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής ΔΙΑΛΕΞΗ 2 - ΓΟΝΙΔΙΑ & ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Φατούρος Γ. Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής ΔΙΑΛΕΞΗ 2 - ΓΟΝΙΔΙΑ & ΑΣΚΗΣΗ ΤΟ ΣΑΓΧΑΡΟ - ΔΕΣΟΞΥΡΙΒΟΖΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΟ ΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΑΣΚΗΣΗ; Ερώτηση 1: υπάρχουν γονίδια

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ. Οι ρυθμιστές του οργανισμού

ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ. Οι ρυθμιστές του οργανισμού ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΑΔΕΝΕΣ Οι ρυθμιστές του οργανισμού Είδη αδένων στον άνθρωπο o Εξωκρινείς αδένες: εκκρίνουν το προϊόν τους μέσω εκφορητικού πόρου είτε στην επιφάνεια του σώματος (π.χ. ιδρωτοποιοί και σμηγματογόνοι

Διαβάστε περισσότερα

2. Ατομικά βάρη στοιχείων από φάσματα μάζας

2. Ατομικά βάρη στοιχείων από φάσματα μάζας Σκοπός 2. Ατομικά βάρη στοιχείων από φάσματα μάζας Με βάση το φάσμα του αερίου νέου (Ne) και την εκατοστιαία φυσική αναλογία των ισοτόπων του, θα βρείτε μια μέθοδο μέτρησης των ισοτοπικών αφθονιών από

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2012

ΘΕΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2012 ΘΕΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 01 ΦΥΣΙΚΗ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΘΕΜΑ Α Στις ερωτήσεις Α1-Α3 να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό της ερώτησης και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη φράση η οποία

Διαβάστε περισσότερα