QUANTA Lite Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: Υψηλή. C1q CIC ELISA

Transcript

1 QUANTA Lite Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: Υψηλή C1q CIC ELISA Σκοπός χρήσης Αυτή η ανάλυση έχει σχεδιαστεί για in-vitro μέτρηση κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων (CIC) που δεσμεύουν το C1q, παρόντων στον ανθρώπινο ορό. Προορίζεται για τον προσδιορισμό των κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων στον ορό ασθενών με ποικίλα αυτοάνοσα νοσήματα και άλλες νόσους που σχετίζονται με τα κυκλοφορούντα ανοσοσυμπλέγματα και χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα. Παρέχονται επαρκή υλικά για να επιτραπεί η δοκιμασία έως 41 δειγμάτων εις διπλούν ή 89 μεμονωμένων, με μια καμπύλη βαθμονόμησης, καθώς και θετικός και αρνητικός ορός ελέγχου. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Η αλληλεπίδραση αντιγόνων-αντισωμάτων μπορεί να προκαλέσει τη δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων. Αυτό είναι μέρος της φυσιολογικής και αδιάλειπτης ανοσολογικής λειτουργίας του σώματος. Τα αντιγόνα μπορεί να είναι ενσωματωμένα στον ιστό ή ελεύθερα στο πλάσμα ή σε άλλα σωματικά υγρά, δημιουργώντας κυκλοφορούντα ανοσοσυμπλέγματα. Συνήθως τα κυκλοφορούντα ανοσοσυμπλέγματα απομακρύνονται αβλαβώς από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα. Ωστόσο, μεγάλες εναποθέσεις ανοσοσυμπλεγμάτων σε αγγειακές δομές με επακόλουθη ενεργοποίηση φλεγμονωδών οδών, όπως ενός συμπληρώματος, μπορούν να οδηγήσουν σε μια κατάσταση νόσου ανοσοσυμπλεγμάτων με συνοδευόμενη ιστική βλάβη. Η κατάληξη των συμπλεγμάτων αυτών εξαρτάται από πολλές μεταβλητές, στις οποίες συμπεριλαμβάνονται η φύση του αντιγόνου και η κλάση του αντισώματος, το μέγεθος του συμπλέγματος, ο ρυθμός παραγωγής τους και η λειτουργική ακεραιότητα του φαγοκυτταρικού συστήματος. Εξαιτίας του παθογόνου ρόλου των κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων σε πολλά νοσήματα, έχουν αναπτυχθεί ειδικές μέθοδοι για την ανίχνευσή τους. Αυτές χρησιμοποιούν τις ιδιαίτερες φυσικοχημικές ιδιότητες των κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων ή/και την ικανότητα προσκόλλησής τους στις επιφάνειες των κυττάρων, π.χ. στα κύτταρα Raji και τα αιμοπετάλια, ή σε μόρια όπως το C1q 1, 2, 3. Πράγματι, σύμφωνα με μια μελέτη του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, συνιστάται η εκτέλεση της μέτρησης των κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων 4. με τουλάχιστον δύο διαφορετικές μεθόδους ανάλυσης Η μέτρηση της συγκεντρώσεων ορού κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων που δεσμεύονται σε C1q με τη μέθοδο ELISA έχει προγνωστική σημασία 5. Είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για την παρακολούθηση των επιπέδων των κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, όπου τα επίπεδα ποικίλουν ανάλογα με τη δραστηριότητα της νόσου και τις κατασταλμένες αντιδράσεις συμπληρώματος 6. Αρχές της διαδικασίας Οι μικροκοιλότητες έχουν προηγουμένως επαλειφθεί με κεκαθαρμένο ανθρώπινο C1q. Οι βαθμονομητές, οι έλεγχοι και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών προστίθενται στις κοιλότητες και τα ανοσοσυμπλέγματα που δεσμεύουν το C1q δεσμεύονται από το C1q κατά την πρώτη επώαση. Έπειτα από την πλύση των κοιλοτήτων ώστε να απομακρυνθούν όλες οι αδέσμευτες πρωτεΐνες, προστίθεται κεκαθαρμένη υπεροξειδάση προσδιοριζόμενη ως σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgG αίγας. Το σύζευγμα δεσμεύεται με το ακινητοποιημένο ανοσοσύμπλεγμα και το περίσσιο αδέσμευτο σύζευγμα απομακρύνεται με ένα επιπλέον βήμα πλύσης. Το δεσμευμένο σύζευγμα οπτικοποιείται με ένα υπόστρωμα 3,3,5,5 τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB), το οποίο δίνει ένα προϊόν αντίδρασης χρώματος μπλε, η ένταση του οποίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος ανοσοσυμπλέγματος στο δείγμα. Προστίθεται θειικό οξύ σε κάθε κοιλότητα για να σταματήσει η αντίδραση. Αυτό παράγει ένα τελικό κίτρινο χρώμα, το οποίο μετράται στα 450nm. Η συγκέντρωση κυκλοφορούντος ανοσοσυμπλέγματος στο δείγμα διαβάζεται από την καμπύλη βαθμονόμησης και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα θερμικώς συσσωρευμένης ανθρώπινης IgG ανά ml (μg Eq/mL). Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με ανθρώπινο αντιγόνο C1q (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Αρνητικός ορός ελέγχου, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς ανθρώπινα αντισώματα έναντι του C1q, προαραιωμένο, 1,2mL 3. C1q CIC ELISA Βαθμονομητής A, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 4. C1q CIC ELISA Βαθμονομητής B, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 5. C1q CIC ELISA Βαθμονομητής C, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 6. C1q CIC ELISA Βαθμονομητής D, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 7. C1q CIC ELISA Βαθμονομητής E, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 8. C1q CIC Θετικός ορός ελέγχου, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 9. Τύπου III Αραιωτικό δείγματος, 2 φιαλίδια χρώματος κίτρινου, που περιέχει Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL. Ανατρέξτε στην ενότητα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 10. HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20 και ένα συντηρητικό, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 11. HRP C1q CIC IgG Σύζευγμα, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 12. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 13. HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL 1

2 Προειδοποιήσεις 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% χλωραμφαινικόλης) στους Αραιωτικό δείγματος ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. Το Αραιωτικό δείγματος Επίσης περιέχουν Proclin 150. Για την πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 2. Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην προετοιμασία των πρότυπων ορών για αυτό το προϊόν έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικά για αντισώματα HIV, HBsAg και HCV από εγκεκριμένες μεθόδους FDA. Ωστόσο, καμία μέθοδος ελέγχου δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση για την απουσία των HIV, HBV, HCV ή άλλων μολυσματικών παραγόντων. Επομένως, ο C1q CIC Θετικός ορός ελέγχου, οι C1q CIC Βαθμονομητές A έως E και ο ELISA Αρνητικός ορός ελέγχου θα πρέπει να χειρίζονται 8 με τον ίδιο τρόπο ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και δύναται να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης ή απορρόφησης μέσω του δέρματος ή των ματιών. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Ξεπλύνετε τις λεκάνες απόπλυσης εάν χρησιμοποιούνται για την απόρριψη του αντιδραστηρίου, με άφθονο νερό ώστε να αποφευχθεί η συγκέντρωση των αζιδίων. 4. Το σύζευγμα HRP περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για την πρόληψη πιθανών εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μια ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν εισπνευσθεί, καταποθεί ή απορροφηθεί από το δέρμα. Για την πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το HRP διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) αποτελείται από ένα αραιωμένο διάλυμα θειικού οξέως. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή άλλα μείγματα που δύνανται να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και επομένως μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για την πρόληψη εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια που παρέχονται. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Προφυλάξεις 1. Αυτό το προϊόν είναι για In Vitro διαγνωστική χρήση. 2. Μόνο κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό πρέπει να χρησιμοποιεί το προϊόν αυτό. 3. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. Οποιαδήποτε παρέκκλιση μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της ανάλυσης και τα αποτελέσματα που αποκομίζονται. Πρέπει να δίνεται προσοχή στις συγκεκριμένες "Σημειώσεις" και προειδοποιήσεις σε κάθε σημείο αυτών των Οδηγιών Χρήσεως. 4. Αντιδραστήρια από κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας ΔΕΝ είναι εναλλάξιμα. Αν πραγματοποιείται μεγάλος αριθμός δοκιμών, θα πρέπει να ληφθεί μέριμνα, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια προέρχονται από την ΙΔΙΑ παρτίδα. Όλες οι ταινίες που χρησιμοποιούνται πρέπει να προέρχονται από την ίδια αλουμινένια συσκευασία. Η αντικατάσταση οποιουδήποτε συστατικού μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. 5. Για να αποφύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων, χρησιμοποιείτε μόνο καινούρια ή καθαρά πλαστικά/γυάλινα υλικά. Ποτέ μην επιστρέφετε μη χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια στα φιαλίδια. 6. Να μην αφήνετε τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων με ανοιχτά καπάκια. Τυχόν επακόλουθη εξάτμιση ή μόλυνση θα οδηγήσει σε ασυνεπή αποτελέσματα. 7. Το υπόστρωμα TMB δεν πρέπει να εκτίθεται στο φως ή στο νερό. 8. Μικροβιακά μολυσμένος, αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός και δείγματα που περιέχουν σωματιδιακή ύλη δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. 9. Η ανακριβής αραίωση του δείγματος δεν μπορεί να ελεγχθεί, καθώς οι έλεγχοι του κιτ είναι έτοιμοι για χρήση. Συνιστάται η χρήση βαθμονομημένων πιπετών και κατάλληλων δειγμάτων QC. 10. Η χρήση αυτόματων συστημάτων ανάλυσης, αραιωτών δειγμάτων και άλλου αυτόματου εξοπλισμού μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στα αποτελέσματα σε σύγκριση με την δια χειρός διαδικασία. Είναι ευθύνη κάθε εργαστηρίου να επικυρώσει πλήρως το σύστημα, και να διασφαλίσει ότι τα αποτελέσματα είναι εντός των ορίων όπως προσδιορίζονται σε αυτό το ένθετο και το σχετικό πιστοποιητικό QC. 11. Όλος ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται πρέπει να βαθμονομείται και να διατηρείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνθήκες αποθήκευσης 1. Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και δεν πρέπει να καταψύχεται. Ακατάλληλες θερμοκρασίες αποθήκευσης θα επηρεάσουν τα αποτελέσματα. 2. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 βδομάδα στους 2-8 C. 3. Η ημερομηνία λήξης του κιτ εμφανίζεται στην εξωτερική ετικέτα. Συλλογή δείγματος 1. Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται με φλεβοκέντηση να τους επιτρέπεται να πήζουν φυσικά και να διαχωρίζεται ο ορός. 2. Ο ορός μπορεί να αποθηκεύεται στους 2-8 C για έως και 7 ημέρες πριν από την ανάλυση 7, ενώ για παρατεταμένη αποθήκευση, πρέπει να διαιρείται και να αποθηκεύεται στους 20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. 3. Η επανειλημμένη τήξη και ψύξη πρέπει να αποφεύγεται. 4. Τα δείγματα ορού δεν πρέπει να αδρανοποιούνται με θέρμανση, καθώς αυτό μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. 2

3 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται Φυλλάδιο οδηγιών: Παρέχει πλήρεις λεπτομέρειες της ανάλυσης. Πιστοποιητικό QC: Υποδεικνύει την αναμενόμενη απόδοση της παρτίδας. Κοιλότητες Επικαλυμμένες με:c1q 12 ταινίες 8 αποσπώμενων κοιλοτήτων επικαλυμμένων με ανθρώπινο C1q. Κάθε πλάκα είναι συσκευασμένη σε μια επανασφραγιζόμενη αλουμινένια συσκευασία που περιέχει δύο αφυγραντικές σακούλες. ELISA Αρνητικός ορός ελέγχου: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. C1q CIC Βαθμονομητές: 5 φιαλίδια, που το καθένα περιέχει 1,2mL αραιωμένο ανθρώπινο ορό, με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις ανοσοσυμπλεγμάτων: 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,23 µg Eq/mL. Έτοιμο για χρήση. Τύπου III Αραιωτικό Δείγματος: 2 φιαλίδια που περιέχουν 50mL ρυθμιστικού διαλύματος για την αραίωση του δείγματος. Χρώματος κίτρινου, έτοιμο για χρήση. HRP Συμπύκνωμα Πλύσης: 1 φιαλίδιο που περιέχει 25mL ενός 40-άκις συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος για την πλύση των κοιλοτήτων. C1q CIC Θετικός ορός ελέγχου: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένης συσσωρευμένης ανθρώπινης IgG. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. HRP C1q CIC IgG Σύζευγμα: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL κεκαθαρμένης υπεροξειδάσης με προσδιοριζόμενη με ετικέτα αντίσωμα σε ανθρώπινη IgG. Χρώματος μπλε. Έτοιμο για χρήση. TMB Χρωμογόνο: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL TMB χρωμογόνο. Έτοιμο για χρήση. HRP Διάλυμα Διακοπής: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL Θειικού οξέος 0,344M. Έτοιμο για χρήση. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Αυτόματη συσκευή πλύσης πλάκας μικροπλακών: Αυτή η συσκευή συνιστάται, ωστόσο, η πλύση των πλακών μπορεί να γίνει δια χειρός. Συσκευή ανάγνωσης της πλάκας: Ικανή να μετρήσει οπτικές πυκνότητες στα 450nm αναφερόμενα στον αήρ. Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό: Αυτό θα πρέπει να είναι της καλύτερης διαθέσιμης ποιότητας Βαθμονομημένες μικροπιπέτες: Για την προσθήκη 1000, 100 & 10µL Πιπέτα πολλαπλών καναλιών: Συνιστάται για την προσθήκη όγκου 100µL συζεύγματος, υποστρώματος και διαλύματος διακοπής. Γυάλινα/πλαστικά σωληνάρια: Για την αραίωση του δείγματος Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Επάγετε το κιτ σε θερμοκρασία δωματίου Το κιτ έχει σχεδιαστεί για χρήση σε θερμοκρασία δωματίου (20-24 C). Αφαιρέστε το κιτ από την αποθήκευση και διατηρήστε σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 60 λεπτά. Οι κοιλότητες δεν πρέπει να αφαιρεθούν από την αλουμινένια συσκευασία πριν φτάσουν σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Στοιχεία του κιτ Αναδεύστε απαλά κάθε στοιχείο του κιτ πριν από τη χρήση. 3. Αραίωση ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης Προσθέστε 25mL συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης σε 975mL αποσταγμένου νερού (αραίωση 1 προς 40) σε ένα καθαρό δοχείο και αναδεύστε. Σημείωση: Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 εβδομάδα στους 2-8 C, επομένως αραιώστε μόνο την κατάλληλη ποσότητα. Εάν το ολόκληρο πιάτο δεν θα οργανωθεί μέσα σε αυτό περίοδος, μια μικρότερη ποσότητα μπορεί να προετοιμαστεί με την προσθήκη 2.0mL της συμπύκνωσης 78mL αποσταγμένο ή εξιοντισμένο νερό για κάθε 16 φρεάτια που θα χρησιμοποιηθούν. Εάν το ρυθμιστικό διάλυμα παρουσιάσει οποιαδήποτε σημάδια μικροβιακής μόλυνσης ή γίνει θολό, απορρίψτε το και ετοιμάστε ένα νέο διάλυμα. 4. Αραίωση δείγματος Αραιώστε 10µL από κάθε δείγμα με 1000µL αραιωτικό δείγματος (1:101) και αναδεύστε καλά. Σημείωση: Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών. 5. Χειρισμός ταινιών και πλαισίου Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό κοιλοτήτων στη συσκευή συγκράτησης των ταινιών. Τοποθετήστε από την κοιλότητα A1, γεμίζοντας τις στήλες από τα αριστερά προς τα δεξιά κατά μήκος της πλάκας. Κατά τον χειρισμό της πλάκας, συμπιέστε τις επιμήκεις άκρες του πλαισίου ώστε να μην πέσουν οι κοιλότητες. Σημείωση: Επιστρέψετε τις αχρησιμοποίητες κοιλότητες στην αλουμινένια συσκευασία αμέσως με τις δύο αφυγραντικές σακούλες και επανασφραγίστε σφικτά ώστε να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση στην υγρασία. Μεριμνήστε έτσι ώστε να μην τρυπήσετε ή σκίσετε την αλουμινένια συσκευασία, δείτε παρακάτω. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Η έκθεση των κοιλοτήτων στην υγρασία ή η μόλυνση από σκόνη ή άλλο σωματιδιακή ύλη θα έχει ως επακόλουθο τον εκφυλισμό του αντιγόνου, που θα οδηγήσει σε φτωχή ακρίβεια της ανάλυσης και δυνητικά ψευδή αποτελέσματα. Διαδικασία ανάλυσης 1. Προσθήκη δείγματος Προσθέστε 100µL βαθμονομητή, ελέγχου ανάλυσης και αραιωμένου (1:101) δείγματος στις κατάλληλες κοιλότητες της πλάκας που παρέχεται. Σημείωση: Τα δείγματα πρέπει να προστίθενται όσο το δυνατόν ταχύτερα στην πλάκα ώστε να ελαχιστοποιείται η απόκλιση της ανάλυσης και ο χρονομετρητής να ξεκινά μετά την προσθήκη του τελευταίου δείγματος. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 3

4 2. Πλύση Η διαδικασία πλύσης είναι κρίσιμη και απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή. Μία ακατάλληλα ξεπλυμένη πλάκα θα δώσει ανακριβή αποτελέσματα, με ανεπαρκή ακρίβεια και πολλές παρεμβολές. Μετά την επώαση απομακρύνετε την πλάκα και πλύνετε τις κοιλότητες 3 φορές με µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης ανά κοιλότητα. Πλύνετε την πλάκα είτε χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο μηχάνημα πλύσης των πλακών είτε δια χειρός όπως υποδεικνύεται παρακάτω. Μετά από την τελική αυτόματη πλύση, αναποδογυρίστε την πλάκα και χτυπήστε απαλά τις κοιλότητες ώστε να στεγνώσουν σε απορροφητικό χαρτί. Οι πλάκες μπορούν να πλυθούν δια χειρός κατά τα ακόλουθα: α. Aδειάστε το περιεχόμενο της πλάκας στην λεκάνη απόπλυσης. β. Xτυπήστε απαλά τις κοιλότητες ώστε να στεγνώσουν σε απορροφητικό χαρτί. γ. Γεμίστε κάθε κοιλότητα με µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης χρησιμοποιώντας μια πιπέτα πολλαπλών καναλιών. δ. Αναδεύστε απαλά την πλάκα σε μια επίπεδη επιφάνεια. ε. Επαναλάβετε το α - δ δύο φορές. φ. Επαναλάβετε το α. και β.. 3. Προσθήκη υποστρώματος Προσθέστε 100µL υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα, σκουπίστε το πάνω μέρος των κοιλοτήτων με ένα χαρτομάντιλο για να απομακρύνετε τυχόν πιτσιλιές. Σημείωση: Για να αποφύγετε τυχόν μόλυνση, ποτέ μην επιστρέφετε το περίσσιο υπόστρωμα στο μπουκάλι του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 4. Πλύση Επαναλάβετε το βήμα Προσθήκη Υποστρώματος (TMB) Προσθέστε 100µL υποστρώματος TMB σε κάθε κοιλότητα, σκουπίστε το πάνω μέρος των κοιλοτήτων με χαρτομάντιλο για να απομακρύνετε τυχόν πιτσιλιές. Σημείωση: Για να αποφύγετε τυχόν μόλυνση, μην επιστρέφετε το περίσσιο TMB στο μπουκάλι του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. 6. Διακοπή Προσθέστε 100 µl διαλύματος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Αυτό προκαλεί μια αλλαγή χρώματος από μπλε σε κίτρινο. 7. Μέτρηση οπτικής πυκνότητας Μετρήστε την οπτική πυκνότητα (ΟΠ) κάθε κοιλότητας στα 450nm σε ένα μετρητή μικροκοιλοτήτων, εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. Έλεγχος ποιότητας 1. Έλεγχος ποιότητας Για να είναι έγκυρη μια ανάλυση, πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα παρακάτω κριτήρια: Οι βαθμονομητές και οι θετικοί και αρνητικοί οροί ελέγχου πρέπει να συμπεριλαμβάνονται σε κάθε εκτέλεση. Οι τιμές που αποκομίζονται για όλους του ορούς ελέγχου θα πρέπει να είναι εντός του εύρους που προσδιορίζεται στο Πιστοποιητικό QC. Το σχήμα της καμπύλης πρέπει να είναι παρόμοιο με της καμπύλης βαθμονόμησης, που εμφανίζεται στο Πιστοποιητικό QC. Εάν τα παραπάνω κριτήρια δεν ικανοποιούνται, η ανάλυση είναι άκυρη και η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. 2. Υπολογίστε τις μέσες οπτικές πυκνότητες (Για αναλύσεις που γίνονται εις διπλούν μόνο) Για κάθε βαθμονομητή, έλεγχο και δείγμα υπολογίστε την μέση ΟΠ των διπλότυπων ενδείξεων. Το ποσοστό του συντελεστή μεταβλητότητας (% Σ.Μ.) για κάθε διπλότυπη ΟΠ θα πρέπει να είναι λιγότερο 15%. 3. Σχεδιασμός καμπύλης βαθμονόμησης Η καμπύλη βαθμονόμησης μπορεί να σχεδιαστεί είτε αυτόματα είτε δια χειρός όπως προκύπτει σχεδιάζοντας τη συγκέντρωση ανοσοσυμπλέγματος σε µg Eq/mL στη λογαριθμική κλίμακα έναντι της τιμής ΟΠ στη γραμμική κλίμακα για κάθε βαθμονομητή: Αυτόματα - χρησιμοποιήστε καταλλήλως επικυρωμένα λογισμικά, και την εφαρμογή καμπύλης που ταιριάζει καλύτερα στα δεδομένα. Διά χειρός - χρησιμοποιήστε λογαριθμικό/γραμμικό χαρτί γραφήματος, σχεδιάστε μια ομαλή καμπύλη δια μέσου των σημείων (όχι ευθεία γραμμή ή από σημείο σε σημείο). 4. Αντιμετώπιση ανώμαλων σημείων Εάν οποιοδήποτε σημείο δεν βρίσκεται εντός της καμπύλης μπορεί να απαλειφθεί. Εάν η απουσία του σημείου αυτού σημαίνει ότι η καμπύλη έχει ένα σχήμα ανόμοιο με εκείνο της καμπύλης βαθμονόμησης του δείγματος ή παραπάνω από ένα σημείο φαίνεται να είναι ανώμαλο, τότε πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση. 5. Υπολογισμός του επιπέδου κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων σε ορούς ελέγχου και δείγματα Μετρήστε το επίπεδο του δεσμευμένου ανοσοσυμπλέγματος στους ορούς ελέγχου και τα αραιωμένα δείγματα απευθείας από την καμπύλη βαθμονόμησης. Οι τιμές πρέπει να κυμαίνονται εντός του εύρους που δίνεται στο Πιστοποιητικό QC. Σημείωση: Οι τιμές του βαθμονομητή έχουν ρυθμιστεί με παράγοντα του 100 ώστε να ερμηνεύσουν μια αραίωση δείγματος 1:101. Δεν απαιτείται περαιτέρω διόρθωση. 6. Βαθμονόμηση ανάλυσης Η ανάλυση έχει βαθμονομηθεί σε µg Eq/mL με χρήση εσωτερικών βαθμονομητών αναφοράς, οι τιμές των οποίων αντιστοιχίστηκαν σε μια ανάλυση που βαθμονομήθηκε χρησιμοποιώντας την αναφορά του ΠΟΥ για την προετοιμασία συσσωρευμένης ανθρώπινης IgG. 4

5 Περιορισμοί της διαδικασίας 1. Αυτό το κιτ χρησιμοποιείται μόνο για να βοηθήσει στην διάγνωση. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι ορισμένες ασθένειες πρέπει να επιβεβαιωθούν από κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 2. Τα αποτελέσματα που αποκομίζονται από αυτή την ανάλυση δεν είναι διαγνωστική απόδειξη της παρουσίας ή της απουσίας νοσήματος. 3. Να σημειωθεί ότι οι οροί μπορεί να περιέχουν παρεμβαλλόμενες ουσίες όπως χηλικά αντιδραστήρια, DNA, anti-c1q αυτοαντισώματα, ρευματοειδή παράγοντα ή μονομερή ανοσοσφαιρίνη. Αναμενόμενες Τιμές Το φυσιολογικό εύρος προσδιορίστηκε σε ορό από 200 φυσιολογικούς ενήλικες αιμοδότες και λήφθηκαν οι ακόλουθες τιμές, εκφρασμένες σε Ισοδύναμο μg ανά ml (μg Eq/mL). Το παρακάτω εύρος τιμών παρέχεται μόνο ως οδηγός. Οι αναλύσεις ELISA είναι πολύ ευαίσθητες και ικανές να ανιχνεύσουν μικρές διαφορές σε πληθυσμούς δειγμάτων. Συνιστάται ο ξεχωριστός προσδιορισμός του φυσιολογικού εύρους από κάθε εργαστήριο, βάση των τεχνικών πληθυσμού και εξοπλισμών που χρησιμοποιούνται. Αναμενόμενες Τιμές < 4,4µg Eq/mL Αρνητικό αποτέλεσμα 4,4 -<10,8µg Eq/mL Αμφίβολο >10,8µg Eq/mL Θετικό αποτέλεσμα Φυσιολογικές Τιμές Τα επίπεδα C1q-CIC μετρήθηκαν στον ορό 200 φυσιολογικών ενήλικων αιμοδοτών και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο παρακάτω γράφημα. Τα C1q-CIC απαντώνται σποραδικά στον φυσιολογικό πληθυσμό, ως αποτέλεσμα μόλυνσης και οι τιμές τους μπορεί να είναι αυξημένες μετά από το φαγητό. Για την επίτευξη μιας λογικής αποκοπής των "πραγματικών φυσιολογικών", τα αυξημένα δείγματα αποκλείστηκαν με τρεις επαναληπτικούς κύκλους. Από αυτούς προέκυψε μια αποκοπή της τάξης των 4,4µg Eq/mL. Ένα ποσοστό αμφιβολίας ορίστηκε μεταξύ 4,4 και 10,8µg Eq/mL, με τα θετικά να είναι 10,8µg Eq/mL. Βάσει αυτού, 9/200 φυσιολογικά δείγματα ευρέθησαν θετικά με τιμές που κυμαίνονται μεταξύ 11,6-13,5µg Eq/mL. Normal sample distribution No. of samples >10 C1q CIC ug Eq/mL Αυτό το φυσιολογικό εύρος παρέχεται μόνο ως οδηγός. Συνιστάται ο ξεχωριστός προσδιορισμός του φυσιολογικού εύρους από κάθε εργαστήριο. Χαρακτηριστικά απόδοσης Ακρίβεια Η ακρίβεια εντός της ανάλυσης και μεταξύ των αναλύσεων μετρήθηκε με τη χρήση τριών δειγμάτων εντός του εύρους της ανάλυσης. Η μέση συγκέντρωση και ο % Σ.Μ. για κάθε δείγμα δίνονται παρακάτω: ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ n=3 Συγκέντρωση µg Eq/mL % Σ.Μ. Δείγμα 1 5,4 13,0 Δείγμα 2 28,7 7,1 Δείγμα 3 50,7 3,9 ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΕΝΤΟΣ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ n=3 Συγκέντρωση µg Eq/mL % Σ.Μ. Δείγμα 1 5,3 7,2 Δείγμα 2 24,0 5,5 Δείγμα 3 67,4 7,5 ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Η ευαισθησία προσδιορίστηκε ως η μέση συγκέντρωση + 2 ΤΑ (τυπική απόκλιση) βάσει 20 προσδιορισμών του αραιωτικού δείγματος και λήφθηκε μια τιμή της τάξης του 0,1μg Eq/mL. 5

6 ΣΧΕΤΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ, ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ, ΣΥΜΦΩΝΙΑ Η σχετική ειδικότητα, η ευαισθησία και η συμφωνία προσδιορίστηκαν έναντι ενός εναλλακτικού κιτ CIC-C1q EIA με χρήση 48 δειγμάτων δοκιμασίας, συμπεριλαμβανομένων 29 δειγμάτων από ενήλικες αιμοδότες και 12 δειγμάτων από επιβεβαιωμένους ασθενείς ΣΕΛ. BINDAZYME C1q-CIC EIA Εναλλακτικό EIA + Αμφίβολο Αμφίβολο Σχετική ευαισθησία 95,0% Σχετική ειδικότητα 75,0% Σχετική συμφωνία 83,3% Για τον υπολογισμό της σχετικής ευαισθησίας, ειδικότητας και συμφωνίας, οι αμφίβολες τιμές θεωρούνται θετικές. Ο συσχετισμός των τιμών από τα δύο κιτ έδωσε ένα R 2 της τάξης του 0,80. ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Τα αρνητικά και θετικά δείγματα κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων που δεσμεύονται σε C1q αναλύθηκαν για να ελεγχθεί η πιθανή επίδραση των παρεμβαλλόμενων ουσιών. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο των ουσιών αυτών βασίστηκε στο κιτ Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Ιαπωνία. Ουσία Χολερυθρίνη F (Ελεύθερη) Χολερυθρίνη C (Σύζευγμα) Αιμοσφαιρίνη σε κατάσταση Αιμόλυσης Εντερικός χυλός Ρευματοειδής παράγοντας Συγκέντρωση 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 Μονάδες 500 IU/mL Δεν παρατηρήθηκε καμία παρεμβολή στις παραπάνω συγκεντρώσεις χολερυθρίνης, αιμοσφαιρίνης ή εντερικού χυλού. Ωστόσο, ο ρευματοειδής παράγοντας (ΡΠ) δεν παρεμβάλλεται και τα δείγματα στα οποία υπάρχει υποψία ύπαρξης ρευματοειδή παράγοντα θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμασία διαλογής με κατάλληλη ανάλυση ΡΠ πριν από τον προσδιορισμό του C1q CIC. ΕΥΡΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ Το εύρος μέτρησης αυτού του κιτ είναι 1,23-100µg Eq/mL. Σχεδιάγραμμα Πλάκας A B Γ Δ E Φ Γ Χ Περίληψη της διαδικασίας 1. Προσθέστε 100µL από κάθε βαθμονομητή, ορό ελέγχου και 1:101 αραιωμένο δείγμα στις κατάλληλες κοιλότητες. Επωάστε για 30 λεπτά. Ξεπλύνετε. 2. Προσθέστε 100µL συζεύγματος σε κάθε κοιλότητα. Επωάστε για 30 λεπτά. Ξεπλύνετε. 3. Προσθέστε 100µL υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα. Επωάστε για 30 λεπτά. 4. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Μετρήστε την απορρόφηση στα 450nm QUANTA Lite είναι σήμα κατατεθέν της INOV Diagnostics, Inc Copyright 2011 All Rights Reserved 6

7 Βιβλιογραφία 1. Hay FC et al.: Routine assay for the detection of immune complexes of known immunoglobulin class using solid phase C1q. Clin. Exp. Immunol., 1976; 24: Stanilova SA, Slavov ES: Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by three assays - CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-c3 ELISA. J. Immunol. Meth, 2001; 253: Van Hoeyveld E, Bossuyt X: Evaluation of seven commercial ELISA kits compared with the C1q solidphase binding RIA for detection of circulating immune complexes. Clin. Chem, 2000; 46: Lambert PH: WHO collaborative study for the evaluation of immune complexes in serum. Clin Lab Immunol., 1978; 1: Espinoza LR and Osterland CK.: Circulating immune complexes. Their clinical significance. Future publishing Co., Abrass CK et al.: Correlation and Predictive Accuracy of Circulating Immune Complexes with Disease Activity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum., 1980; 23: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: GRC August 2012 Revision 3 7