مذكػػػػػػػػػػػػػرة نػػػػػػػػػػػػاصف هػػػػػػػػػػػػدى سػػػػػػػػػارة فطريات سبخة: ادلقػػاومة األمسوزيػػػػة لفطر

Transcript

1 اجلمهػػػػوريػػػػػػػػػػة اجلزائػػػػػػػريػػػػػػة الديػػػػػػػمقراطيػػػػػػػػػػة الشعبيػػػػػػػػػػػػة وزارة التعليػػػػػم العالػػػػػػػػي و البحث العلمػػػػػػػي كلػػػػػػية علػػػػػػػوم الطبيعة و احلياة جامعػػػػػػػػة فرحػػػػػػػػات عبػػػػػػاس سطيػػػػػػػػف قسم األحياء الدقيػػػػػػػػػقة مذكػػػػػػػػػػػػػرة مقدمػػػػػة من طػػػػرؼ الطػػػالػػػػػبػػة: نػػػػػػػػػػػػاصف هػػػػػػػػػػػػدى سػػػػػػػػػارة لنيل شػػػػيادة ادلاجستري يف علم األحيػػػاء الدقيقة زبصص: اذلندسة ادليكروبيولوجػػػية فطريات سبخة: ادلقػػاومة األمسوزيػػػػة لفطر Aspergillus oryzae قدمت أما جلنة ادلنػػػاقشة ادلكونة من السادة: أسػػػػػػػػػػػتاذ جبامػػػػػعػػػػػػة سػػػػػػػطػػػػػػيػػػػػػػف رئيػػػػػسا األسػػػػػػػػػتاذ غػػػػوؿ مصطفػى أسػػػػػػػػػػػتاذ جبامػػػػػعػػػػػػة سػػػػػػػطػػػػػػيػػػػػػػف مشػػػػرفػا األسػػػػػػػػتاذ لػعروس العػػػػػػػػػريب أسػػػتػاذ زلاضر قسم أ جبامعة سطػػيػف ممتحػنػا األسػػػػػتاذ بلحطػاب رشيػػػػػػػد أسػػػتػاذ زلاضر قسم أ جبامعة سطػػيػف األسػػػػػتاذ زروؽ زلمد مييوب ممتحػنػا

2 2

3 إن الحمد هلل نحمده و نشكره على نعمة الق لم و نصيب العلم الذي وىبنا إياه فبدونو ما كان ليذا العمل أن ينجز و لواله ما كنا نجني ثمرة مجيودنا فلو الحمدحتى يرضى و لو الحمد إذا رضي. أتقدم بف ائق الشكر و التقدير إلى األستاذ المشرف الدكتور " لعروس العربي" على مساعدتو و توجيياتو و نصائحو النيرة. و أشكر جميع أعضاء لجنة المناقشة الذين قبلوا مناقشة ىذا البحث: األستاذ غول مصطفى الدكتور زروق محمد مييوب و الدكتور بلحطاب رشيد. كما أتقدم بالشكر الخاص إلى السادة: فرج اهلل سمير سعودي صالح الدين و السيدة شريات وىيبة و كل موظفي مؤسسة الري العمومية لبلدية العلمة على مساعدتيم في إنجاز ىذا البحث. و أشكرجميع األساتذة و الطلبة الذين أكرموا علينا بنصائحيم ومساعداتيم وأخص بالذكراألساتذة تكسانة عبد العزيز قندوز علي عريف فوزية جالل نجيحة و ساحلي عبد الحكيم. جزاىم اهللخي را 3

4 إلى أحب اثنين على قلبي يا أعز ما أملك في ىذا الوجود أم ي و أب ي العزيزين. إلى أخواي العزيزين صالح الدين و ىيثم. إلى كل أىلي و أقاربي دون استثناء و أخص بالذكرجدتاي العزيزتان ع ائ شة وجم يلة وخالتي فتيحة وخالي.عبد الحميد إلى ليندة سامية مونية رفيف يسرى فضيلة وىيبة ريمة وبنات عمي نزيية و نسمة إلى كل طلبة الماجستير والماستر والدكتوراه. ى دى س ارة 4

5 5

6 الفهػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػرس قػػائمػػػة ادلختصػػرات قػػائمػػػة األشكػػػػػػػػػػػػػػػال و اجلػػػػػػػػػػػػػػػػداول ادلقدمة... الفصل األول: مراجعة ادلصادر 01-1 تعريف السبخة ادلميزات الفيزيوكيميائية لل تبة السبخة ادلميزات 2-1- احليوية لل تبة السبخة عزؿ و تشخيص الفطريات من البيئات عالية ادللوحة الفطريات توزع و انتشار الفطريات يف الطبيعة فطريات ال تبة توزيع الفطريات يف ال تبة نشاط الفطريات يف ال تبة تنوع الفطريات يف الظروؼ الفسيولوجية تعريف الضغط األمسوزي تأثري الضغط األمسوزي العايل و ادلنخفض على منو و استقبلب الفطريات الفطريات ادلتحملة للجفاؼ و للضغط األمسوزي العايل

7 - 3 فسيولوجيا تأقلم الفطريات للنمو يف وجود ضغط أمسوزي عايل توازف األيونػػات ميوعة الغشاء الببلزمي استشعار ال تاكيز العالية للملح و االستجابة ذلا بتعبري جيين شليز إس تاتيجية احملاليل ادلتوافقة الكحوالت متعددة اذليدروكسيل و السكريات األمحاض األمينية و مشتقاهتا دراسة فطر Aspergillus oryzae التصنيف األيمهية 2-4- االقتصادية و الصناعية لفطر...23.A oryzae الفصل الثاين: ادلواد و الطرؽ -0 منطقة الدراسة جلب العينات تقدير خواص عينات ال تبة عزل و تشخيص الفطريات عزؿ الفطريات من ال تبة 2-3- تنقية و تشخيص الفطريات ادلعزولة التشخيص ادلورفولوجي التشخيص اجمليري

8 دراسة فطر 30...Aspergillus oryzae -1-4 ربديد النوع A.oryzae انتقاء العزلة األكثر ربمبل للملوحة العالية ( وسط صلب على قياس قطر ادلستعمرات( على وسط سائل )تقدير مردود الكتلة احليوية( الدراسة الفسيولوجية لفطر A. oryzae تأثري األوساط الزراعية تأثري درجة احلرارة تأثري األس اذليدروجيين تأثري مصادر الكربوف و اآلزوت...33 استخالص اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي * ربضري ادلعلق البوغي أوساط التخمر...34 * وسط 34...)MNM( Melin-Norkans medium * وسط أدىن 34...)MM( Minimum Medium التخمر يف وسط طبيعي )خنالة القمح( 35...)SSF( Solide State Fermentation * 35...S1-2-5 إنتاج الكتلة احليوية للعزلة 6- الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي ادلفرزة من طرؼ (S1).A...36 oryzae -1-6 ربضري ادلستخلص اخللوي

9 من وسط سائل من وسط صلب الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي...36 الفصل الثالػػث: النتػػػائػػػج جلب العينات قياس العوامل الفيزيوكيميائية عزل الفطريات و تشخيصها دراسة فطر 46...A. oryzae تشخيص الفطر الدراسة ادلورفولوجية الدراسة اجمليرية أوساط التشخيص دراسة تأثري ادللوحة على منو الفطر )انتقاء العزلة األكثر حتمال للملوحة العالية( تأثري ادللوحة على قطر ادلستعمرات ( وسط صلب( تأثري ادللوحة على مردود الكتلة احليوية )وسط سائل( الدراسة الفسيولوجية لفطر (S1) 54...A. oryzae تأثري األوساط الزراعية تأثري درجة احلرارة تأثري األس اذليدروجيين 57...pH 9

10 تأثري مصادر الكربوف و اآلزوت استخالص اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي بيئات التخمر التخمر على األوساط االصطناعية وسط 61...MNM التخمر على وسط طبيعي )خنالة القمح( الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي الكشف عن 1- Glycine betaine -2 و 64...Betaines الكشف عن )Polyols( والسكريات اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي ادلفرزة من طرؼ العزلة (S1).A...65 oryzae الفصل الرابػػػع: ادلنػػػػػػػػػػاقشػػة الفطريات ادلعزولة من السبخة تأثري ادللوحة على منو الفطر على منو الفطر...74.A oryzae الدراسة الفسيولوجية لفطر 76...A. oryzae الػمقاومػػػػػػة األمسوزيػػػػػػػػػة عند فطر 78...A. oryzae -1-4 ادلقاومة األمسوزية على األوساط االصطناعية ادلقاومة األمسوزية على الوسط الطبيعػػػػػي )عجينة خنالة القمح 80...)SSF اخلػػامتة ادللخػػػػػص

11 86...Abstract ادلراجػػػػع باللغة األجنبية ادلراجػػػػػػػػػع باللغة العربيػػػة ادللحػػػق

12 قػػػػػػػػػػائمة ادلختصرات Cyclic Adenosine monophosphat :c-amp Mean Square :MS )هزبغ الوتىسط( millisiemens :ms Phosphatidylcholine :PC Phosphatidylethanolamine :PEA Sum of Squares :SS )هجوىع الوزبؼبث( Solide State Fermentation :SSF Thin Layer Chromatography :TLC 12

13 قػػػائمة األشكػػػػػال: شكل 20 : ادلميزات األساسية لتأثري الضغط األمسوزي العايل و ادلنخفض عند مخرية S. cerevisiae شكل 20 : سلطط دلختلف ادلركبات اليت تدخل يف آليات االستجابة للضغط األمسوزي لدى حقيقيات النواة شكل 23 : شكل 24 : موقع مجع عينات ال تبة من سبخة البيضاء يف منطقة محا السخنة نسبة انتشار الفطريات حسب ف تات و مواقع أخذ العينات شكل 25 : مستعمرة.A oryzae منماة على وسط PDA عند درجة حرارة شكل 26 : الرأس البوغية لفطر.A oryzae ربت اجملير شكل 27 : تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر A. oryzae منمى على وسط.YESA شكل 28 : تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر A. oryzae منمى على وسط أدىن.MMA شكل 29 : تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر A. oryzae منمى على وسط YES السائل شكل 02 : تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر A. oryzae منمى على الوسط األدىن السائل شكل تأثري األوساط الزراعػػػية على شكل ادلستعمرات لفطر 55 A. oryzae :01 شكل 00: تأثري األوساط الزراعػػػية على منو الفطر..A oryzae 56 شكل 03: تأثري درجة احلرارة على منو الفطر....A oryzae 58 13

14 شكل 04: تأثري درجة األس اذليدروجيين على منو الفطر....A oryzae 58 شكل شكل :15 :16 تأثري مصادر الكربوف على منو الفطر A oryzae تأثري مصادر اآلزوت على منو الفطر.A oryzae شكل 17 : تأثري ال تاكيز ادلختلفة من ادللح على منو العزلة A. oryzae (S1) على وسط MNM السائل منو العزلة 18: شكل (S1) A.oryzae على عجينة خنالة القمح )SSF( فصل شكل 09 : Betaines باستعماؿكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة 66.)TLC( شكل 02 : فصل الكحوالت متعددة اذليدروكسيل و السكريات األساسية باستعماؿ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

15 قػػػػػػػػػػػػائػػػػػػمة اجلػػػػػػػداول: جدول 20 : تعػػػداد الكائنات احلية الدقيقة بداللة ادللوحة ال تكيب جدول 20 : الكيميائي لبعض البيئات عالية ادللوحة و مقارنتيا دباء البحر جدول 23 : أىم الفطريات احملبة و ادلتحملة للملوحة ادلعزولة من البيئات عالية ادللوحة.. 07 جدول 24 : جدول 25 : جدول 26 : جدول 27 : بعض أنواع احملاليل ادلتوافقة اليت تستعمليا الفطريات اخلصائص الفيزيوكيميائية لعينات ال تبة ادلأخوذة خبلؿ شيري مارس و جويلية قائمة الفطريات ادلعزولة بناء على األوساط ادلستخدمة و الف تة الزمنية اخلصائص ادلزرعية لفطر.A oryzae النامي على أوساط التشخيص بعد 7 أيا حضن يف درجات حرارة سلتلفة جدول 28 : اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي ادلفروة من طرؼ عزلة (S1).A oryzae 15

16 16

17 ادلقػػػػػػدمػػػػػة تعترب ال تبة موطن للعديد من الكائنات احلية الدقيقة بكل أنوعيا. سبثل الفطريات نسبةكبرية منيا و ىي تلعب دورا أساسيا يف صيانة و تسيري النظم البيئية اليت ربيط باإلنساف كاستمرار الدورة الطبيعية و ذلك بتحويل ادلواد العضوية ادليتة ( خاصة بقايا النباتات( إىل مواد قابلة لبلستعماؿ عن طريق ربليليا باإلنزديات احملررة بالوسط. و منذ وقت طويل و إىل يومنا ىذا يستغل اإلنساف ىذه القوة احملللة للفطريات الستعماذلا يف شىت اجملاالت مثل صناعة الغذاء إنتاج األمحاض و الكحوالت العضوية ادلضادات.)2003 إلجيابياهتا عالية. احليوية الربوتينات و غريىا Schutyser( يعترب التحويل احليوي للمخلفات الزراعية إحدى أىم العمليات اليت تقو هبا الكائنات احلية الدقيقة نظرا فمن جية تقلل من التلوث الذي تسببو ىذه ادلخلفات و من ناحية أخرى إنتاج مواد ذات جودة يتأثر نشاط و تنوع الفطريات يف ال تبة بعوامل حيوية و غري حيوية abiotic( ( biotic and و يعترب ادلناخ العامل غري احليوي األكثر أيمهية و الذي يتضمن درجة احلرارة الرطوبة ph و ادللوحة. و يؤدي التغري يف أحد ىذه العوامل إىل تشكيل ما يسمى بالظروؼ البيئية القاسية ( envirenments.)extreme و تعترب ادللوحة العالية أحد أىم ىذه العوامل واليت تؤثر على نشاط و فسيولوجية اخلبليا الفطرية حيث تسبب ارتفاع الضغط األمسوزي وبالتايل تؤدي إىل اخنفاض احملتوى ادلائي اخللوي. ربدث مشكلة ملوحة ال تبة نتيجة لزيادة تراكم األمبلح فييا خصوصا أمبلح ادلغنيسيو و أمبلح الصوديو. حيث ترجع ىذه الزيادة إىل ارتفاع معدؿ تبخر ادلياه. تشغل ال تبة ادلاحلة حوايل % 7 من مساحة اليابسة و ىي تتميز خبصائص فيزيائية غري مبلئمة لنمو الكائنات احلية إال أف األحباث أظيرت أف بعض الكائنات احلية الدقيقة الظروؼ إذ و خاصة الفطريات قادرة على النمو و التكيف دلثل ىذه ترجع ىذه القدرة إىل تطوير رلموعة سلتلفة من اآلليات الفسيولوجية للتأقلم. إنتاج احملاليل ادلتوافقة وخاصة الكحوالت متعددة اذليدروكسيل الفطريات Kogej( و آخروف 2005 (. و للزراعة. - وتعترب آلية تراكم و/أو أىم ىذه االس تاتيجيات ادلتبعة من طرؼ يعزى اىتما الباحثني دبشكلة ادللوحة بسبب ربوؿ مناطق زراعية شاسعة سنويا إىل مناطق غري صاحلة السؤاؿ الذي يطرح نفسو ىو: إذا كانت ىذه ال تبة غري صاحلة للزراعة فيل ديكن استغبلذلا و االستفادة منيا بطرؽ أخرى غري مباشرة يف رلاالت سلتلفة و لئلجابة على السؤاؿ اتبعنا اإلس تاتيجية التالية : عزؿ و تشخيص ادليكوفلورا الكلية ل تبة سبخة ركزت الدراسة على فطر مفيد ىو Aspergillus oryzae و - محا السخنة خبلؿ مومسني )مارس و جويلية( مث حيث أجري لو اختبار ربمل ادللوحة لتحديد ال تكيز ادللحي األقصى الذي يتحملو و انتقاء العزلة األكثر ربمبل. كما أجريت عليو دراسة فسيولوجية لتحديد ظروؼ منوه ادلثلى )درجة احلرارة ph مصادر الكربوف و اآلزوت(. يف ادلرحلة الثانية سوؼ تقنية كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة.)TLC( يتم التحري عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي و تعريفيا باستعماؿ 17

18 18

19 -0 تعريف السبخة: يطلق لفظ سبخة على األراضي ادلنخفضة و ادلستوية أين ت تاكم فييا مياه األمطار و ال تسبات لكي ربمي األراضي الزراعية من الفيضانات. و تعرؼ ال تبة السبخة بأهنا تربة غنية باألمبلح ادل تسبة نتيجة تبخر احملتوى ادلائي سللفا وراءه أمبلحا سلتلفة ال تاكيب الكيميائية وتتحدد الرسوبيات يف ال تبة السبخة يف ثبلث طبقات ىي: الطبقة العلوية ادلعروفة بقشرة السبخة و الطبقة الوسطى القابلة لبلنضغاط و الطبقة السفلية ادلعروفة بقاعدة السبخة. )ادلييدب 2002 Anonyme.) ادلميزات الفيزيوكيميائية للرتبة السبخة: تتطلب طبيعة ال تبة السبخة احملتوية على كمية كبرية من األمبلح إجراء ادلزيد من الدراسات لغرض ربديد اخلواص احلقيقية لل تبة السبخة ألهنا تربة غري عادية. ولذلك فقد اق تح بعض الباحثني إجراء التجارب باستخدا ادلياه ادلاحلة بدال من ادلياه العذبة كتعديل و ديكن تقسيم ادلعادف ادلكونة لل تبة السبخة إىل قسمني: * ادلعادن الناشئة من التبخر: مثل معدف كربونات الكالسيو الذي ي تسب يف بداية تركيز ادلياه ادلاحلة يف رسوبيات السبخة CaCO 3 على سطحيا. و باإلضافة إىل معدف الذي يعترب أكثر معادف التبخر شيوعا. معدف CaSO 4.2H 2 O كربيتات الكالسيو CaSO4 الذي ي تسب ربت سطح السبخة كبلورات سلتلفة احلجم و الشكل و معدف الذي ي تسب على السطح و تبلغ مساكتو عدة سنتيم تات و معدف SrSO 4 الذي يعترب ثانويا NaCl حيث يرتبط دبعدف الكلس و كذلك بعض ادلعادف الثانوية األخرى 2002(. )ادلييدب 19

20 * ادلعادن الناجتة عن تفاعل مياه السبخة و الرسوبيات: MgCO 3 من ضمن ىذه ادلعادف: ) 2 3 CaMg(CO و معدف الذي يتواجد بنسب كبرية يف الرسوبيات CaMg (CO 3 ) 2 الغنية بادلغنزيو. حيث ينتج عن تفاعل ادلغنزيو مع الكالسيو مغنزيو كربونات وفق ادلعادلة التالية: 2002( )ادلييدب 2MgCO 3 + Ca ++ Mg ++ + CaMg (CO 3 ) ادلميزات احليوية للرتبة ادلاحلة: ال تبة ىي موطن ديناميكي جملموعة متنوعة من الكائنات احلية فيي سبنح الدعامة ادليكانيكية للنباتات باإلضافة إىل كوهنا مصدر غذاء ( Heritage و آخروف 1999(. و خيتلف توزع األحياء الدقيقة يف ال تبة حسب ادلاء و كمية ادلادة العضوية ادلتوفرة اليت تنتج من ربلل النباتات و احليوانات ادليتة وىي غالبا ما تكوف مرتبطة جبزيئات ال تبة ( Stuart 2005(. أظيرت الدراسات أف األحياء الدقيقة فقط ذلا القدرة على العيش يف ظروؼ Archaea بيئية قاسية ( درجة حرارة ملوحة(. من ضمنيا بدائيات النواة خاصة رلموعة النواة اليت حقيقية و تتضمن خاصة الطحالب و الفطريات Cantrell) و آخروف.)2006 تعترب الكثافة ادليكروبية لل تبة ادلاحلة ضعيفة مقارنة بال تبة اخلصبة إذ يبلحظ أف ىناؾ عبلقة عكسية بني ادليكروفلورا الكلية و ال تاكيز العالية للملح.)2004 Fraj ( تتواجد الكائنات احلية الدقيقة احملبة و ادلتحملة للملوحة دبجاالهتا الثبلث : حقيقية النواة )Eucaryotes( بدائيات النواة )Procaryotes( و Archaea يف ىذه األوساط عالية ادللوحة Caumette( 1994( إال أف حساسيتيا للملوحة زبتلف حسب األنواع و كما يتضح من خبلؿ اجلدوؿ )01( فإف ىناؾ تباين يف توزيع األحياء الدقيقة من خبلؿ درجة ربمليا للملوحة و يبلحظ أف للفطريات قدرة عالية على التحمل مقارنة مع البكترييا اليت تكوف أكثر حساسية.)2004 Fraj ( 20

21 جدول 20: تعداد الكائنات احلية الدقيقة بداللة ادللوحة Feraj( 2004( ms / Cm : الكائنات احلية الدقيقة الرتبة ادلاحلة 00.3 الرتبة اخلصبة غرام من )كائن / الرتبة اجلافة( الفطريات 27 )02 0 x ) احملللة البكترييا للسيلسلوز )02 3 x( بكترييا اآلزوت 39 Azotobacter )02 3 x( اجملموع 83.7 )02 3 x( 21

22 و تشخيص الفطريات من البيئات عالية ادللوحة :Hypersaline envirenments عزل تعرؼ البيئات عالية ادللوحة باألوساط اليت يكوف تركيز ادللح فييا أعلى من تركيزه يف ماء البحر و الذي يقارب 0.5M. و ىي تنقسم إىل ربت رلموعتني: و سبثل ادلياه ادلنحدرة من البحر حبيث تكوف ذلا نفس ال تكيبة الكيميائية إال أهنا أكثر تركيزا :Thalassohaline نتيجة تبخر مياه البحر كما تتميز بدرجة أس ىيدروجيين متعادلة إىل قاعدية قليبل. أما Athalassohaline فيي تشمل ادلياه ادلتشكلة يف ىيئة برؾ ماحلة وخيتلف تركيبيا بشكل كبري عن تركيب مياه البحر وتكوف درجة ph حوايل و مثاذلا البحر ادليت و البحريات )2010 Johnson( 02(. )جدوؿ 6 جدول : ال تكيب الكيميائي لبعض البيئات عالية ادللوحة و مقارنتيا دباء البحر) Johnson 2010( 20 البحر ادليت حبرية ادللح العظمى ماء البحر Na + )M( Mg +2 )M( 0.01 < Ca +2 (M) K + )M( Cl - )M( <0.01 SO 4 )M( ph 22

23 Natrun Owens تشغل ىذه األوساط الطبيعية نسبة كبرية من سطح الكرة األرضية ومن أمثلتيا: حبريات وادي يف مصر حبرية Magadii يف كينيا و البحريات العظمى ادلوجودة يف الواليات ادلتحدة ( حبرية Mono و حبرية.)Big Soda و باإلضافة إىل ىذه البيئات الطبيعية قد تكوف البيئات عالية ادللوحة اصطناعية Searles مثل: حقوؿ الري البحريات ادلصنعة لغرض إنتاج ملح البحر باإلضافة إىل األغذية ادلملحة لغرض احلفظ MacDonald) و آخروف.)1990 تعترب البيئات عالية ادللوحة ظروؼ قاسية لنمو الكائنات احلية إال أنو وجد أف الكائنات احلية الدقيقة بشكل أساسي قادرة على التكيف دلثل ىذه الظروؼ ( Johnson 2010(. فقد أظيرت 2000 أوؿ دراسة سنة 1914 تواجد البكترييا إال أنو م يتم عزؿ إي كائن من حقيقيات النواة. و يف سنة بينت التقارير األوىل أنو ديكن للفطريات أف تكوف كائنات ناشطة يف ىذه األوساط و منذ ذلك احلني مت اكتشاؼ العديد من األنواع الفطرية اجلديدة و أنواع أخرى كانت معروفة سابقا كملوثات غذائية يف ىذه البيئات القاسية حوؿ العا م Gunde-Cimerman( و آخروف 2009(. حيث مت العزؿ يف البداية من عينات ماء أخذت من حبريات صغرية مومسية على طوؿ الساحل األدرياتيكي) Adriatic ( الشمايل Gunde-Cimerman( و آخروف بعد ذلك 2000(. مت العزؿ من العديد من ادلناطق مثل: حبريات Cabo Rojo يف الساحل اجلنويب الغريب لػػ Puetto Rico ومياه البحر ادليت. كما سبت دراسة الفلورا الفطرية لساحل البحر األمحر دبحافظة القنفذة يف ادلملكة العربية السعودية ( و آخروف قشقري و احلازمي (. إىل جانب ادلياه 2008 Mbata Cantrell ادلاحلة تعترب السبخات كذلك من أىم البيئات عالية ادللوحة حيث تشغل مساحة واسعة وقد مت عزؿ العديد من الفطريات احملبة و ادلتحملة للملوحة من ىذه ادلناطق مثل سبخة العوشزية دبنطقة القصيم بادلملكة العربية السعودية ( اخليمي 2007(. و بصفة عامة تتمثل الفطريات ادلعزولة من ىذه األوساط يف أجناس سلتلفة منيا احملبة ومنيا ادلتحملة للملوحة. وىي تتباين يف نسبة تواجدىا إال أف كل ىذه الدراسات أظيرت أف اجلنسني Penicillium و Aspergillus ىي األكثر ترددا ( جدوؿ.)03 23

24 Cantrell جدول 23: أىم الفطريات احملبة و ادلتحملة للملوحة ادلعزولة من البيئات عالية ادللوحة ( و ) 2008 Mbata 2006 آخروف 2006 قشقري و احلازمي حبريات Cabo Rojo البيئات عالية البحر ادليت ساحل البحر األمحر سبخة العوشزية ادللوحة Ulocladium botrytis Aspergillu sp. Aspergillu sp. Gymanscella sp. Aspergillu sp. Cladosporium sp. Blastomyce sp. Eurotium sp. Cladosporium sp. Curvularia sp. Curvularia sp. Choetomium Phomopsi sp. Dreschlera sp. Chrysosporium sp. Choetomium sp. globosum Aspergillus versicolor Phoma exigua C. globosum Cochliobolu sp. Hortaea werneckii Pythium sp. H.werneckii Fennelia sp. الفطريات Aureobasidium Penicillium sp. Humicola sp. Fusarium sp. Glimaniella sp. pullulans ادلعزولة Myrothecium Humicola sp. roridum Hormodendrum sp. Penicillium sp. Mucor sp. Sporothrix sp. Penicillium sp. Phoma sp. Scopulariopsi sp. Rhizoctonia sp. Phialophora sp. Syncephalastrum sp. Periconia sp. 24

25 الفطريات: 0- - توزع و انتشار الفطريات يف الطبيعة : 0-0 تنتشر الفطريات يف الطبيعة بشكل واسع تكوف حيث ذلا القدرة على النمو يف مناطق بيئية سلتلفة. إذ تتكاثر العديد من الفطريات بشكل رئيسي عن طريق تكوين األبواغ البلجنسية )الكونيديا Conidia أو األبواغ احلافظية )Sporongiospores واليت تنتقل عرب اذلواء إىل مسافات طويلة شلا يسمح ذلا بالبقاء يف بيئات ديكن أف تكوف سلتلفة عن بيئاهتا األصلية. و بناء على ىذا تكوف ذلا القدرة على التأقلم السريع ألي بيئة خاصة ذبد نفسيا Rocio ( فييا لذلك فيي تنتشر يف كل األوساط سواء يف ال تبة أو اذلواء أو ادلاء و آخروف 2010.) فطريات الرتبة: توزيع الفطريات يف الرتبة: ال تبة ىي وسط معقد يتكوف من معادف غري عضوية وسللفات عضوية تعمل كروابط لقنوات وثقوب ربتوي على ادلاء و اذلواء. فجذور النباتات تتخلص من أنسجتيا اخلارجية و تفرز موادا عضوية )خاصة الكربوىيدرات األمحاض األمينية الفيتامينات و األمحاض العضوية( كما يسقط النبات أوراقو و فروعو ادليتة فوؽ ال تبة )زلمد.)2003 تقل أعداد الفطريات و تنوعيا بصفة عامة كلما تعمقنا يف ال تبة حيث ينتج ذلك عن التغريات الطبيعية و الكيميائية يف صفات ال تبة. ويرتبط توزيع الفطريات يف الطبيعة على وجود ادلادة العضوية حيث تزداد يف التنوع والعدد على ادلخلفات النباتية ادلتحللة يف الطبقة العليا من ال تبة بينما تقل يف الطبقات السفلى مثل األنواع التابعة لؤلجناس : Trichoderma Fusarium Mucor Penecillium و غريىا. أما يف عمق ال تبة يقل عدد و نوع الفطريات بدرجةكبرية وقد يرجع ذلك إىل قلة التيوية )علي.)

26 نشاط الفطريػػات يف الرتبة: تعترب الفطريات عنصرا ىاما من ضمن ميكروفلورا ال تبة إذ تتواجد بنسبة أكرب مقارنة مع البكترييا وسبثل.)2003 الفطريات ادل تشلة النسبة األكرب من رلموع فطريات ال تبة Barratt( و آخروف ويزداد نشاط ىذه الفطريات كلما ازدادت خصوبة البيئة اليت تنمو فييا. و حيث إهنا كائنات حية غري ذاتية التغذية فإهنا تعتمد يف منوىا على مصادركربونية عضوية لذلك يرتبط نشاطيا بتوزيع ادلادة العضوية على اليابسة ( زلمد.)2003 تشكل الفطريات عوامل أساسية لتحليل ادلادة العضوية يف ال تبة اجلافة و ىي تلعب دورا ضعيفا خبلؿ دورة اآلزوت. حيث يكمن دورىا األساسي يف معدنة الكربوف العضوي إذ سبلك قدرة عالية جدا على ربليل كميات Roger ( عالية N/C كبرية من ادلادة العضوية اليت ربتوي على كمية ضعيفة من اآلزوت حيث تكوف النسبة و ترجع ىذه القدرة على التحليل المتبلؾ الفطريات أنظمة أنزديية خاصة. )2006 Deacon(.)2001 Garcia يتداخل نشاط الفطريات يف ال تبة مع نشاط غريىا من األحياء الدقيقة األخرى كالبكترييا و الطحالب و الربوتوزوا وأيضا مع جذور النباتات. وعليو ديكن سبييز رلموعتني: فطريات ال تبة اجلذور و فطريات )Mycorhizae( حيث تتميز فطريات ال تبة بقدرهتا على النمو اعتمادا على البقايا العضوية دوف ادلرور دبرحلة التعايش أو التطفل. ىذه ادلرحلة تكوف ضرورية للفطريات اجلذرية. لقد وجد أف بعض الفطريات غري قادرة على ربليل ادلركبات ادلعقدة مثل : السيليلوز واللجنني واستعماذلا كمصادر كربونية لذلك فيي تعتمد يف منوىا على النباتات. ىذه الفائدة تعترب يف نفس الوقت مشكلة بالنسبة للنبات العائل ومع ذلك فقد أثبت أنو يف ال تبة الفقرية من حيث اآلزوت و ادلعادف تعمل الفطريات على تزويد النبات هبذه األساسيات.)1969 Smith( 26

27 0-2- تنوع الفطريات يف الظروؼ الفسيولوجية: تتأثر الفطريات كغريىا من الكائنات احلية األخرى بالتغريات البيئية احمليطة هبا إذ تؤدي ىذه التغريات إىل خلق ظروؼ قاسية لنمو الفطريات حيث ال يقتصر التأثري على معدؿ النمو فقط بل يؤدي إىل اختبلفات يف منط النمو وربدث التغريات غالبا يف درجة احلرارة ph أو ادللوحة 2009(. و آخروف Kumar( تعريف الضغط األمسوزي: حيدث الضغط األمسوزي عن طريق إجراء تغريات يف تراكيز اجلزيئات ادلنحلة يف الوسط احمليط باخللية و اليت تسمى "Osmotica" و بالتايل التغيري يف احملتوى ادلائي ادلتوفر. تؤدي الزيادة يف تراكيز اجلزيئات ادلنحلة إىل )a w ( ارتفاع الضغط األمسوزي )األمسوالرية )Osmolarity شلا يؤدي إىل اخنفاض النشاطية ادلائية و اجليد ادلائي. و العكس صحيح إذ يؤدي اخنفاض تراكيز اجلزيئات الذائبة يف الوسط إىل اخنفاض األمسوالرية و بالتايل ارتفاع النشاطية ادلائية ( w a( و ذلك راجع النتقاؿ ادلاء دائما عرب غشاء نصف منفذ من الوسط األقل Sorbitol KCl NaCl تركيز إىل الوسط األعلى تركيز. يتكوف الضغط األمسوزي سلربيا عن طريق إضافة أو أو إىل وسط النمو) Hohmann و.)2003 Mager تأثري الضغط األمسوزي على منو و استقالب الفطريات: تعترب األغشية البيولوجية أغشية نفاذة للماء أكثر منيا للجزيئات األخرى ادلنحلة يف الوسط. وعليو فإف زيادة تراكيز ىذه اجلزيئات يف الوسط اخلارجي للخلية احلية Stress( )hyperosmotic يسمح خبروج ادلاء من اخللية يف )شكل 01( أف حني اخنفاض األمسوالرية يف الوسط )hypoosmotic Stress( يسمح بانتقاؿ ادلاء إىل داخل اخللية و Hohmann( Mager 2003 (.تعمل ىذه التغريات يف احملتوى ادلائي و كذلك يف حجم اخللية Hohmann( ودلا تسببة من طرؼ تدفق و انتقاؿ ادلاء من و إىل اخللية على إحداث تغريات يف البنية و.)2003 Mager كما يعمل الضغط ادللحي على إحداث خلل يف اجليد األمسوزي عند الفطريات شلا حيدث عجز 27

28 مائي كما يؤدي تدفق الصوديو إىل استقبلبات مسية و آخروف 2006(. فعلى سبيل ادلثاؿ يكوف اذليكل Tang( اخللوي خليوط األكتني )Actine( مستقطبا خبلؿ مراحل منو اخلمرية و اليت تعترب ادليزة األساسية للتربعم ادلباشر أثناء االنقسا ( االنشطار( اخللوي و تشكيل نتوءات أثناء التزاوج ويؤدي الضغط األمسوزي كغريه من الضغوط األخرى إىل فقداف سريع خليوط األكتني من اخلبليا األ و بالتايل كبح و إيقاؼ النمو. كما الضغط حيدث Hohmann األمسوزي خلل يف الغشاء الببلزمي على مستوى تركيبتو و نفاذيتو و كذلك خصائصو ادليكانيكية ) 2003 و Mager (. أثبتت الدراسات أف للضغط األمسوزي تأثري كبري على مستوى التعبري اجليين لؤلنزديات اليت تلعب دورا يف استقبلب الدىوف. باإلضافة إىل ذلك يف يؤثر زيادة التعبري اجليين للمورثات اليت تدخل يف بناء Ergosterol و PC يف حني ينخفض تعبري ادلورثات ادلشفرة لؤلنزديات اليت تدخل يف البناء احليوي ؿ PEA و ديكن أف تؤدي ىذه التغريات إىل تغيري يف ميوعة الغشاء و/ أو نفاذيتو كما.)2003 Mager Hohmann(.)Transporters تؤثر على نشاطية بروتينات النقل ادلوجودة يف الغشاء Osmosensors( و أظيرت كما الدراسات بأف زيادة الضغط األمسوزي يف الوسط أثناء التخمرات الصناعية بإضافة NaCl يؤدي إىل زيادة إفراز و إنتاج إنز ن glucose oxidase من طرؼ Aspergillus niger يف حني وجد ارتفاع نشاطية إنز ن glucoamylase ادلفرز من طرؼ Aspergillus oryzae حبوايل 20 مرة عند اخنفاض الضغط األمسوزي أي ارتفاع احملتوى ادلائي دلادة خنالة القمح ( و آخروف.)2010 Rocio 28

29 شكل ادلميزات األساسية لتأثري الضغط األمسوزي العايل وادلنخفض عند مخرية :01 ( 2003 Mager و Hohmann) S.cerevisiae الفطريات ادلتحملة للجفاؼ و الضغط األمسوزي العايل: على الرغم من أف ىناؾ أسباب بيئية للتفرقة بني ىاتني اجملموعتني من الفطريات إال أف الفروؽ الفسيولوجية بينيما ليست كبرية. كما أف بعض الفطريات تظير ربمبل لكل من ظروؼ اجلفاؼ وارتفاع الضغط األمسوزي يف آف واحد وتش تؾ يف قابليتيا على النمو يف البيئات ذات النشاط ادلائي ادلنخفض )علي 1998(. وديكن تعريف الفطريات ادلتحملة للجفاؼ و تلك ادلتحملة للضغوط األمسوزية العالية بأهنا تلك القادرة على النمو يف البيئة Hocking و Pitt ( 0.85 a w ذات النشاط ادلائي ( w a( يقل عن إال أف بعضيا ينمو عند م لث 0.75 a w.)1985 فطر Aspergillus candidus و A. flavus أما فطر Penecillium chrysogenum فينمو عند.0.78 a w كما 29

30 أف بعض اخلمائر تنمو جيدا يف البيئات ادللحية و السكرية على حد سواء وىي تلعب دورا ىاما يف الصناعات.)1998 الغذائية كما أف بعضيا تسبب خسائر فادحة يف األغذية السكرية خبلؿ زبزينيا )علي بينما سبلك NaCl الفطريات ادلتحملة للملوحة القدرة على النمو يف وسط خايل من NaCl و كذلك يف وجود ب تاكيز عالية تصل إىل 4,5M مثل الفطر اخليطي Cladosporium glycolicum و مخرية Debaryomyces hansenii. )2005 Echigo 2001 Arora( 3- فسيولوجيا تأقلم الفطريات للنمو يف وجود ضغط أمسوزي عايل: يعترب التأقلم اخللوي للظروؼ البيئية القاسية كاألوساط عالية ادللوحة عملية بيولوجية أساسية حلياة الكائنات Gander و منوىا) Park و 1998(. وللكائنات احلية الدقيقة ومن بينيا الفطريات القدرة على التأقلم للظروؼ.)02 عالية الضغظ األمسوزي باتباع اس تاذبيات سلتلفة و آخروف )شكل 2007( Gunde-Cimerman ( -0-3 توازن األيونات: يؤدي تراكم األيونات و اجلزيئات غري ادلتأينة يف سيتوببلز اذليفات الفطرية نتيجة دخوذلا من الوسط اخلارجي ادلرتفع األمسوزية إىل خفض الضغط ادلائي الداخلي وتعترب ىذه الوسيلة طريقة سريعة لتعديل الضغط ادلائي الداخلي حبيث يستطيع الفطر ضبط األمسوزية داخل ىيفاتو دوف أف يقو بتخليق كميات إضافية من الكحوالت عديدة اذليدروكسيل )Polyoles(.)1998 )علي تعترب مخرية Debaryomyces hansenii أكثر الفطريات دراسة من حيث ىذه اآللية حيث أثبتت الدراسات على مخرية.D hansenii ادلعزولة من مياه البحر أهنا تتأثر بشكل ضعيف لل تاكيز العالية من ادللح.NaCl كما Na + وجد أف معامل تدفق + K/ Na + يلعب دورا يف ىذه العملية. بعد ذلك أظيرت األحباث أف أيوف الصوديو Na + غري سا بالنسبة للخمرية ويف وجود تراكيز عالية من NaCl تبدي اخلمرية منوا مثاليا وتكدس أيونات بشكل أكرب مقارنة مع مخرية Saccharomyces cerevisieae عبلوة على ذلك وجود Na + يف الوسط حيمي 30

31 اخلبليا من عوامل ضغط إضافية Gunde-Cimerman( و آخروف 2009( كما يظير أف كبل من D.hansenii و Wellemia ichthyophaga قادرة على تكديس كميات كبرية من أيونات مقارنة مع اخلمرية Hortae Na + werenckii األكثر ربمبل للملوحة العالية 2005(. و آخروف Kogej( شكل : سلطط دلختلف ادلركبات اليت تدخل يف آليات االستجابة للضغط األمسوزي لدى حقيقيات النواة 02 )2000 Roberts( 31

32 -0-3 ميوعة الغشاء البالزمي: يعترب التغري يف خصائص الغشاء الببلزمي من بني أىم اآلليات اليت تتبعيا الفطريات نظرا للوظائف احليوية ادليمة اليت يقو هبا Turk( وآخروف 2004(. تلعب الليبيدات الغشائية دورا ميما يف التحكم يف ميوعة الغشاء حيث ديكن أف ترجع القدرة على ربمل ادللوحة العالية إىل التغريات يف أمناط ىذه الليبيدات وبالتايل ال تكيب اجلزيئي للغشاء و احملفزة بواسطة تراكيز ادللح العالية. تتدخل عدة عوامل يف احملافظة على ميوعة الغشاء : نوع سبلسل األمحاض الدىنية )طوذلا و درجة تشبعيا( كمية الستريوالت و طبيعة رلاميع الرأس القطبية للفوسفوليبيد وآخروف 2004(. حيث أظيرت الدراسات العلمية أف كبل من مخرييت D.hansenii و H.werenckii Turk( ربافظ على ميوعة غشائيا السيتوببلزمي بشكل أكرب مقارنة مع اخلمرية S.cerevisiae األكثر حساسية للملح. كما وجد أف نسبة الستريوالت إىل الفوسفوليبيدات عند كلتا اخلمريتني تكوف أقل بكثري مقارنة مع مخرية.S.cereviseae ىذه النتائج تبني أف احلفاظ على ىذه النسبة منخفضة ربت ضغط أمسوزي عايل يسمح بالتأقلم و النمو. باإلضافة إىل ذلك تعمل األمحاض الدىنية الغشائية يف التأثري على خصائصو إذ تستطيع خبليا مخرية H.werenckii أف ترفع مستويات األمحاض الدىنية الفوسفوليبيدية غري ادلشبعة وذلك بتشفري ثبلث أنزديات خاصة ىي : و Oleic acid يف حني يعترب محض األولييك.Elongase D12-Desaturase D9-Saturase احلمض الدىين الفعاؿ يف الغشاء الببلزمي خلمرية D.hansenii حيث يصاحب وجود ال تاكيز العالية للملح ارتفاع يف نسبة احلمض الدىين غري ادلشبع ( Gunde-Cimerman و آخروف (. باإلضافة إىل ذلك فإف 2009 بعض أيونات الصوديو و الكلور ذبد طريقيا إىل داخل اخللية وىذا بدوره يرفع من الضغط األمسوزي ذلذه اخلبليا ويساعد على استمرار تدفق ادلاء من خارج اخللية إىل داخليا. و لقد وجد أف تركيز ىذه األيونات زلدودا وال يصل إىل درجة تضر بربوتوببلز اخللية. من و الواضح أف ىذا ال تكيز احملدود من األيونات يتم 32

33 - التحكم فيو عن طريق كفاءة الغشاء السيتوببلزمي حيث سبر ىذه األيونات و غريىا من خبلؿ ىذا الغشاء. و مازالتكيفية التحكم يف حركتيا رليولة )علي.) استشعار الرتاكيز العالية للملح و االستجابة ذلا بتعبري جيين مميز: تعترب القدرة على التحسس للتغريات يف تراكيز + Na يف الوسط ضرورة بيولوجية حلياة اخللية Gunde-( و آخروف تستشعر الفطريات للتغريات اخلارجية و خاصة الضغط األمسوزي عن طريق.)2009 Cimerman مسارات تأشريية pathway(.)signaling حيث بينت الدراسات األوىل على ادلورثات اليت تش تؾ يف التنظيم اجلزيئي لئلستجابة اخللوية للضغط األمسوزي أف ادلسار الرئيسي الذي يدخل يف العملية و االستجابة ذلا يسمى: pathway( )High osmolarity glycerol signaling والذي سبت دراستو عند اخلمائر «HOG» H.werenckii( و.)S.cerevisiae حيث يتحكم ىذا ادلسار يف ادلورثات اخلاصة باالستجابة للضغوط األمسوزية و ىي: gdp1 و gdp2 اليت تشفر ألنزديات البناء احليوي للغليسريوؿ glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2000 Roberts( و glycerol-3-phosphatase على ال تتيب و آخروف 2009 Gunde-Cimerman. 2010( و آخروف Rocio 33

34 )Mitogen Activated Protein( باإلضافة إىل مسارkinase MAP الذي يدخل كوسيط يف ادلسار حيث تعمل ادلنشطة بفسفرة عدد من ادلواد من ضمنيا بروتينات ربفيز عملية استنساخ MAPKs HOG c-amp ادلورثات و بالتايل الربوتينات اليت تش تؾ يف عملية االستجابة. كما يظير أف لػػ الذي يعتمد على تأثريا على التعبري اجليين ربت الضغط األمسوزي إال أف ىذه االستجابة ال تنحصر فقط على Kinases الضغط األمسوزي وإمنا بصفة عامة ىي استجابة دلختلف الضغوط األخرى مثل : العوز الغذائي الصدمة احلرارية والضغط التأكسدي وغريىا.كما وجد أف الضغط األمسوزي ديكن أف حيفز إنتاج مركبات مثل: Phosphatidylinositol-3,5-biphosphate الذي يساىم كمرسوؿ ثانوي يف تنشيط االستجابة للضغط و آخروف 2010(. ومن جية أخرى أظيرت الدراسة على مخرية أهنا S.cerevisiae األمسوزي Rocio( تستجيب للضغط األمسوزي العايل بتحفيز التعبري اجليين للمورثتني msn2p و.msn4p حيث يتدخل يف ىذه وMsn1p )High osmolarity induced transcription( العملية عوامل استنساخ أساسية ىي: Hot1p )Msn2/4p و اليت تساىم يف رفع قوة ارتباط العوامل ادلنظمة للنسخ )منشطات النسخ أثناء االستجابة لؤلمسوالرية العالية.)2000 Roberts( :Compatible Solutes -4-3 إسرتاتيجية احملاليل ادلتوافقة.)2005 تطور الفطريات العديد من آليات التأقلم للضغط األمسوزي العايل Vargas( وآخروف من بني ىذه اآلليات تكديس و زبليق جزيئات معقدة ىذه ادلركبات ال تسبب أي ضرر حليوية اخلبليا الفطرية حىت عند 1998 زيادة تركيزىا و لذلك يطلق علييا اسم " احملاليل ادلتوافقة "compatible solutes )علي Yancey.)2006 Vries و Dyksterluis 2005 تشمل احملاليل ادلتوافقة العديد من ادلركبات مثل : الكحوالت عديدة اذليدروكسيل )polyols( األمحاض األمينية و )proline مشتقات األمحاض األمينية betaine( glycine و )ectoine سكريات glutamate( 34

35 Davis 2005 Dagmar ( methylsulfonium و )Sucrose باإلضافة إىل مركبات و و آخروف Trehalose( آخروف 2000(. ويتضح أف بعض ىذه اجلزيئات ال سبلك نشاط إستقبليب و إمنا تدخل يف إحدى التفاعبلت اليت ذلا القدرة على محاية اخلبليا Yancey( 2005(. تتأقلم الفطريات ادلتحملة للملوحة بشكل رئيسي عن طريق اإلنتاج و التكديس ادلتزايد للغليسريوؿ و أنواع أخرى من احملاليل ادلتوافقة اليت تتضمن : الكحوالت متعددة Mannitol و Xylitol Arabitol Inositol Erythritol اذليدروكسيل )Polyols( مثل: باإلضافة إىل ادلركبات اآلزوتية مثل : و األمحاض األمينية 2007(. و آخروف Kogej( Glycine betaine الكحوالت ادلتعددة اذليدروكسيل Polyols و السكريات: تعرؼ الفطريات ومن ضمنيا اخلمائر بقدرهتا على النمو و التأقلم يف البيئات عالية الضغط األمسوزي بواسطة التكديس الداخلي ألنواع من ادلركبات ادلعتدلة و ذات وزف جزيئي صغري واليت ربمي اخلبليا من ضغط االنفجار) pressur.)turgor تنتج اخلبليا الفطرية الكحوالت عديدة اذليدروكسيل )Polyols( حىت يف غياب الضغط األمسوزي وتستجيب للضغط األمسوزي عن طريق تكديس الكحوالت األساسية و األكثر آخروف و 1998(. تعمل ىذه احملاليل ادلتوافقة بطريقتني سلتلفتني آليا : األوىل ىي "التعديل فعالية Yong( األمسوزي" حيث تسيل احتجاز ادلاء يف السيتوببلز إذ تسمح أليونات الصوديو بالدخوؿ إىل الفجوات الطريقة بعكس اخللوية الثانية وىي " احلماية من الضغط األمسوزي" حيث تتفاعل الكحوالت متعددة اذليدروكسيل فيما بينيا حلماية ال تكيبة اخللوية و األنزديات وكذلك ادلركبات اخللوية األخرى من ال تاكيز العالية.)1998 Gander Park و و آخروف 1995 حيث يعتقد أهنا تقو حبماية األنزديات من للملح Hans( التأثريات ادلثبطة الناذبة عن زيادة تركيز أيونات الصوديو و ادلاغنيسيو )علي.)1998 يعترب الغليسريوؿ احمللوؿ األكثر أيمهية و استعماال من طرؼ الفطريات النامية يف األوساط ادلاحلة ( Park و 1998 إذ يتميز بقلة ارتباطو بالربوتينات وبالتايل فيو ال يسبب تثبيطا.)2002 Aharon Gander 35

36 لؤلنزديات. ففي مخرية Saccharomyces roxii توجد نسبة عالية من الغليسريوؿ تقدر حبوايل %15-9 من )3M-2 M( الوزف اجلاؼ للخبليا )علي 1998(. كما أثبت أنو يف وجود تراكيز عالية من ادللح تكوف نسبة تكديس الغليسريوؿ عند كل من H.werenckii و S.cerevisiae و D.hansenii أكرب من نسبة Trehalose تكديس.Trehalose إال أنو ربت ضغط ملحي متوسط فإف اخلبليا تكدس نسبة أكرب من مقارنة مع الغليسريوؿ. قد ترجع ىذه األيمهية للغليسريوؿ بشكل رئيسي لكوف بنائو احليوي حيفز يف وجود تراكيز عالية من أيونات + Na و جزئيا إىل ارتفاع التعبري اجليين للمورثات ادلسؤولة عن ذلك Gunde-( 2009(. و آخروف Cimerman باإلضافة إىل الغليسريوؿ وجد أف بعض الفطريات مثل مخرية H.werenckii تكدس رلموعة متنوعة من arabitol erythritol ادلركبات العضوية تتضمن : و واليت تتغري كمياهتا حسب تركيز ادللح يف mannitol الوسط وكذلك حسب مرحلة منو الفطر. ومع ذلك ترجع كمية الكحوالت ادلتعددة اذليدروكسيل إىل الغليسريوؿ خبلؿ كل مراحل النمو حيث ي تاكم بالدرجة األوىل خبلؿ ادلرحلة اللوغاريتمية مث يقل بشكل erythritol حاد خبلؿ مرحلة االستقرار. من جية أخرى تزداد كمية تدرجييا خبلؿ ادلرحلة اللوغاريتمية لتصل إىل أعلى مستوى خبلؿ مرحلة االستقرار Gunde-Cimerman( و آخروف.)2009 ومن ناحية أخرى Trehalose يتضح أف لسكر فعاال دورا يف محاية الغشاء السيتوببلزمي لؤلبواغ يف وجود ضغط أمسوزي عايل إذ يؤدي غيابو إىل جفاؼ وتغريات مورفولوجية يف الغشاء حيث تكوف Trehalose الفوسفولبيدات مركبات معقدة متبلورة. بينما يعمل وجود على محاية ىذه األغشية من التلف وذلك عن طريق تعويض رلاميع اذليدروكسيل يف اجملاميع ادلتأينة بالغشاء )علي أمحد. )1998 وجد كما أف فطر Aureobasidium يستجيب للضغط األمسوزي العايل عن طريق تكديسكمياتكبرية من.)2002 و Ray( Trehalose و ومع ذلك تعترب السكريات Torzilli Glucose Glycerol Mannitol 36

37 الثنائية Trehalose( و )Sucrose زلاليل متوافقة زلدودة وتتواجد بنسبة ضعيفة مقارنة مع احملاليل األخرى و.)04 )2002 ىي معروفة بدورىا يف استقرار األغشية ( Oren )جدوؿ األمحاض األمينية و مشتقاهتا: Proline م تظير األمحاض األمينية أي دور يف الوقاية األمسوزية عند الفطريات األسكية إال أنو وجد أف.)1986 Laracy Beever يلعب دور يف التنظيم األمسوزي بالنسبة لبعض الفطريات البيضية و الزيقية ( و glutamate betaine β-glutamate وتعترب األمحاض األمينية ادلشحونة مثل: glutamate و من احملاليل ادلتوافقة اليت ال ت تاكم بكميات عالية يف ال تاكيز ادللحية اليت تفوؽ 0.4M Oren( 2002(. وقد بينت دراسة أجريت على مخرية D.hansenii أف نشاط glutamate يف وجود تركيز ملحي عايل يقتصر على كونو عامبل Gunde-Cimerman( إضافيا يف احلماية من الضغط و آخروف 2009(. باإلضافة إىل ذلك وجد أف فطر glycine betaine Penicillium fellutanum يكدس كبل من و Gander و Park ( choline-o-sulfate.)1998 Phosphatidylcholine يدخل Choline يف تركيب األغشية لدى حقيقيات النواة على شكل glycine betaine وآخروف وىو يعترب 1999(. مادة أولية أساسية يف البناء احليوي لػ Boncompagni( Huiming( والذي يعترب زللوال ميما متوافقا عند حقيقيات النواة لكونو حيمي اخلبليا من الضغط األمسوزي و آخروف.)04 )جدوؿ )

38 )2000 Roberts( : جدول 24 بعض أنواع احملاليل ادلتوافقة اليت تستعمليا الفطريات نوع احملاليل ادلتوافقة الرتكيبة الكيميائية Glycerol myo-inositol Erythritol الكحوالت متعددة اذليدروكسيل )Polyols( Sorbitol Mannitol Trehalose السكريات 38

39 Sucrose Glycine betaine Proline Glutamate األمحاض األمينية و مشتقاهتا Choline Dimethyl glycine 39

40 -4 دراسة فطر :Aspergillus oryzae. )2007 ( Weber و Webster التصنيف: يصنف نوع Aspergillus oryzae حسب -0-4 Eucomycota Ascomycota Plectomycetes Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus A.oryzae ادلملكة: الشعبة: الصف: الرتبة: العائلة: اجلنس: النوع: األمهية االقتصادية و الصناعية لفطر :A.oryzae -0-4 فطر يعترب Aspergillus من أكثر الفطريات شيوعا حيث يتواجد على عدد كبري جدا من األوساط الطبيعية. تعيش أغلب أنواعو م تشلة وعليو فيي زلط اىتما العديد من الباحثني نظرا لدورىا اإلجيايب كعوامل سلمرة حيث تستعمل ذباريا يف إنتاج بعض األمحاض العضوية و الكحوالت و بعض ادلركبات احملتوية على الكربيت. و من ناحية أخرى فإف بعضيا تسبب مرض Aspergillosis عند اإلنساف و احليواف باإلضافة إىل ذلك ذلا دور يف ربليل ادلنتوجات الزراعية و ادلنتوجات ادلخزنة و مسيتيا Klish(.)

41 يعترب النوع A.oryzae من الفطريات اخليطية. يتواجد بصفة ىو و واسعة يف ال تبة حيث يستعمل يف آسيا يف صناعة األغذية ادلخمرة مثل: الصويا و غريىا. على مدى 2000 سنة على مطلع القرف العشرين استعمل ألوؿ مرة كمصدر إلنز ن α-amylase أوؿ إنز ن منتج على السلم الصناعي من أجل االستعماؿ A.oryzae Heterologous ( الغذائي و منذ ذلك احلني أصبح يستعمل يف إنتاج العديد من اإلنزديات األصلية و ادلصنعة إىل حد اآلف و لئلنتاج الغذائي. م يعرؼ بأف A.oryzae شلرض إال أف بعض عزالتو قد تكوف )enzymes قادرة على إنتاج كميات ضئيلة من ادلستقلبات الثانوية ذات مسية منخفضة إىل متوسطة مثل: - acid Kojic acid Cyclopiazonic و ديكن التحكم يف إنتاج ىذه ادلركبات 3- β - nitro propionic acid )2007 و احلد منيا عن طريق استعماؿ ظروؼ مناسبة Olempska( و بالرغم من كوف.A oryzae و.A ينتمياف لنفس اجملموعة Flavi و ربت اجلنس Circumdati فإف.A oryzae خيتلف عن.A flavus من flavus حيث عد إنتاجو لسمو.Aflatoxines الدراسات إال أف احلديثة أظيرت أف بعض عزالت ىذا الفطر سبلك مورثات بنيوية و تنظيمية تدخل يف تصنيع Machida( إال أف ذلك يتم ربت ظروؼ ربفيزية Aflatoxines و آخروف )2007 Olempska ادلميزات ترجع ىذه إىل الطاقم اجليين للفطر بأنو أكرب وجد الذي مقارنة مع الطاقم اجليين لكل من و حبوايل على ال تتيب. وىو حيتوي على تتابعات خاصة غنية % 29 %34 و A. nidulans A. fumigatus بادلورثات ادلسؤولة عن االستقبلب )metabolisme( وخاصة اليت تدخل يف بناء ادلستقلبات الثانوية )أنزديات.)2005 Machida( اإلماىة استقبلب األمحاض األمينية و نواقل األمحاض األمينية / سكريات( و آخروف Recombinant ( حديثا يستعمل A.oryzae كحامل )عائل( للتعبري اجليين إلنتاج الربوتينات ادلعدلة وراثيا آخروف إذ تسمح ىذه اآلليات اجلزيئية بتطوير استعماؿ فطر A.oryzae يف إنتاج Lui ( )proteines و )2009 إنزديات ذبارية Kitamoto( 2005(. و آخروف 41

42 باإلضافة إىل ذلك يتميز A.oryzae خبصائص بيولوجية أساسية كالنمو اخليطي وتشابك ادليسيليو و البنيات البلجنسية التكاثرية وتعدد اخلبليا و اليت م تدرس يف األحياء الدقيقة وحيدة اخللية مثل cerevisiae:.s. Kitamoto( و آخروف 2005( Cutin ( تعترب أنزديات Cutinases مسؤولة عن إماىة و ربليل احلشوة الدىنية متعددة األس ت يف النباتات )lipid polyester matrix و بالتايل ديكن استغبلذلا يف إماىة اجلزيئات متعددة األس ت الصغرية مثل ادلواد الببلستيكية. وقد مت استخبلص ىذه اإلنزديات من فطر A.oryzae وأثبتت قدرهتا على ربمل الدرجات العالية للحرارة اليت تصل إىل 59 مقارنة مع نفس اإلنز ن ادلستخلص من فطر Fusarium solani و اليت كانت 56 و آخروف 2009 (.كما يستعمل كعامل بروبيوتيك يف تغذية الدواجن Kyungwoo( و آخروف.) 2006 Lui( لفطر و من جية أخرى A.oryzae فإف أيمهية طبية و صيدالنية كبرية نظرا لقدرتو على مواد مضادة انتاج Suzuki( Oryzachlorin و Asperfuran للفطريات مثل : باإلضافة إىل مضادات حيوية مثل : Penicilline و آخروف Anke و آخروف Junichiro و آخروف ) ىذه ادلميزات تدعم فكرة أف فطر A. oryzae ىو الكائن احلي الدقيق ادلناسب لعمليات التخمر و االستعماؿ يف البيوتكنولوجيا احلديثة و آخروف.)2005 Masayuki( 42

43 43

44 0- منطقة الدراسة : سبخة البيضاء ىي إحدى ادلستنقعات الطبيعية ادللحية ادلؤقتة. وىي ترتبط دبرج رطب متواصل و مفتوح مشاال على منطقة نباتية زلبة للملوحة )Halophytes( تسمى شط.Chott تقع بني خطي عرض وبني خطي طوؿ بالقرب من منطقة محا السخنة ( والية سطيف( تبلغ مساحتيا حوايل 5 48 شرقا صلصالية ىكتار. تتميز ال تبة احمليطة بادلوقع بكوهنا أقل ملوحة إىل ماحلة قاعدية ذات تركيبة متدرجة.)2004 Anonyme( 0- جلػػػب العينات: أخذت عينات الدراسة 12 سم على عمق ويف ظروؼ معقمة على مرحلتني: * ادلرحلة األوىل: أخذت ثبلث عينات تربة من مناطق سلتلفة من منتصف السبخة يف هناية شير مارس * ادلرحلة الثانية : أخذت ست عينات تربة ثبلث منيا من منطقة زراعية تبعد حوايل 100 م ت عن منتصف السبخة و ثبلث عينات من منتصف السبخة يف هناية شير جويلية. مجعت العينات يف قارورات معقمة 2010 و حفظت يف الثبلجة يف درجة حرارة 03(. 4 )شكل 0-0- تقدير خواص عينات الرتبة: ) بعد Electrical conductivity قدرت اخلصائص الفيزيوكيميائية ph( و درجة التوصيل الكيربائية ربضري مستخلص ال تبة ادلخفف إىل حيث أضيف مقدار غرا من ال تبة إىل 50 ملل من ادلاء ادلقطر 10 1/5 دقيقة Montoroi( و نقلت إىل دورؽ ببلستيكي. مت تقليب زلتويات الدورؽ مرة كل 30 دقائق دلدة 10. )

45 شكل موقع مجع عينات ال تبة من سبخة البيضاء يف منطقة محا السخنة )2004 Anonyme( :23 45

46 * تقدير بعض العناصر بالرتبة : مت تقدير بعض العناصر يف ال تبة و ىي: الوطنية للموارد ادلائية ( الفرع اجليوي الشرقي( باستخدا الذايت Ca.SO HCO 3- Cl - Mg +2 K + Na + يف الوكالة 4 ( SKALAR) و جياز جيازcolorimetre Sperctro و جياز التحليل Sherwood Model 410 و 2000) Turbidimétrie Colorimetre (DR و. Volumétrie -3 عزل و تشخيص الفطريات: -0-3 عزل الفطريات من الرتبة: Potato عزلت فطريات ال تبة باستخدا الطريقة ادلباشرة و طريقة التخافيف حيث مت الزرع على وسط %1.09 % 0.43 مضاؼ إليو تركيز من NaCl حسب ما يعادلو يف العينة وىي: )PDA) Dextrose Agar و PDA خايل من NaCl كشاىد. %0.4 الطريقة ادلباشرة: نقلتكمية 1 غ من ال تبة إىل طبق ب تي معقم مث مزجت مع وسط الزرع حىت تتوزع * بشكل متجانس مع الوسط. حضنت األطباؽ يف درجة حرارة 28 حلني ظيور ادلستعمرات. * طريقة التخافيف : مزجت 1 غ من ال تبة يف 9 مل من ادلاء ادلقطر ادلعقم و حضرت سلسلة التخافيف ( 10 ( زرعكل زبفيف بطريقتني ( ادلزج و النشر( و دبكررين لكل زبفيف. حضنت األطباؽ يف درجة حرارة حلني ظيور ادلستعمرات Suhail( 2007(. و آخروف 28 46

47 0-3 تنقية و تشخيص الفطريات ادلعزولة: تنقى الفطريات على نفس الوسط الذي عزلت منو بشكل متكرر حىت احلصوؿ على مستعمرات نقية مث تنقل للتشخيص. تشخص الفطريات ادلعزولة إىل مستوى اجلنس أو النوع إذا أمكن ذلك اعتمادا على اخلصائص ادلورفولوجية و - Malt )DCPA) Dichloran Chloramphenicol Peptone Agar اجمليرية وأوساط خاصة بالتشخيص وىي: (AFPA) Aspergillus Flavus Parasiticus Agar (MA) Malt Agar (MEA) Extract Agar مع استعماؿ Parnela مفاتيح التشخيص لكل من Pitt و و آخروف )1990( و Botton )1985( Hocking )1991 ( Pitt (1972 ( آخروف) 1988 ( Barnett و Hunter و.)1997( Champion التشخيص ادلورفولوجي: اعتمد يف التشخيص ادلورفولوجي على دراسة اخلصائص ادلزرعية ( سرعة النمو لوف ادلستعمرة و خلفيتيا إفراز الصبغات وجود األجسا مسطحة مستوية رلعدة ملتوية...( احلجرية ( اللوف و احلجم( ال تكيب السطحي للمستعمرة )قطنية إفراز قطرات الرائحة...( التشخيص اجملهري: يراعى يف التشخيص اجمليري ميزة ادليسيليو ( وجود اللوف أو غيابو مقسم أو غري مقسم وشليزاتو الشكلية( األبواغ ( لوهنا حجميا وشكليا ادلظيري( وجود أو غياب األجسا الثمرية. 47

48 دراسة فطر :Aspergillus oryzae حتديد النوع :A. oryzae مت ربديد النوع الفطري.A oryzae باالعتماد على طريقة Pitt و )1985( Hocking وذلك باستعماؿ األوساط.MEA و )CYA( Czapek Yeast Agar اخلاصة بالتشخيص وىي: )G25N( Glycerol Nitrate Agar و اليت تعتمد بالدرجة األوىل على تركيب الوسط و درجة احلرارة اليت ربضن فييا األطباؽ ادلزروعة و ىي: 5 25 و 37. سبت مبلحظة ادلستعمرات النامية بعد 7 أيا من احلضن و ذلك دبراعاة الصفات التالية: قطر ادلستعمرة الصفات ادلورفولوجية و الصفات اجمليرية انتقاء العزلة األكثر حتمال للملوحة العالية: على وسط صلب ( قياس قطر ادلستعمرات(: استعملت أطباؽ ب تي بقطر 90 ملم لدراسة تأثري ادللوحة على منو الفطر و لقحت األطباؽ ( ثبلث مكررات( بقرص 5 بقطر فطري ملم من حواؼ مستعمرة و العمر 7 أيا حديثة حضنت يف درجة حرارة أيا. 7 دلدة 30 * غنػػػػي: وسط Yeast Extract Sucrose S2 S1 منيت العزالت الثبلث لفطر A.oryzae على وسط و و ىي S3 2M 1.5M 1M 0.8M 0.6M 0.4M 0.2M 0M( الصلب ب تاكيز سلتلفة من ادللح )YESA( Agar Minimum و آخروف 2009(. و مني الفطر بنفس ال تاكيز على وسط أدىن Tang) )3.5M و 3M 2.5M )MM ( Medium بنفس الطريقة السابقة. 48

49 على وسط سائل ( تقدير مردود الكتلة احليوية(: * وسط غين: 0.5M 0M ( منيت العزالت الثبلث لفطر A.oryzae يف وسط YES السائل ب تاكيز سلتلفة من ادللح 100 حيث لقحت احلوجبلت احلاوية على مل من الوسط بقرص )3.5M و 3M 2.5M 2M 1.5M 1M 7 فطري بقطر 5 ملم من حواؼ كل مستعمرة حديثة. و حضنت يف درجة أيا 30 مدة يف رجاج بسرعة Beever( بثبلث مكررات. و مني الفطر بنفس ال تاكيز وبنفس الطريقة على وسط أدىن )MM( و 100 rpm بعد انتياء ف تة احلضن يرشح ادليسيليو عرب ورؽ N 1 Whatman ويقاس الوزف الرطب مث.)1986 Laracy 24 ساعة Tang( جيفف عند درجة حرارة 80 دلدة و آخروف 2009( مث يقدر النمو بقياس دلائي احملتوى وفق ادلعادلة التالية: ) 1979 و آخروف Frances ( احملتوى ادلائي )A-2( )A-1( = : وزف ورقة ال تشيح. : وزف ادليسيليو الرطب. : وزف ادليسيليو اجلاؼ. )A( )1( )2( حيث : 49

50 -3-4 الدراسة الفسيولوجية لفطر : A. oryzae دلعرفة تأثري الظروؼ البيئية على منو الفطر أحدثت تغريات يف ظروؼ تنمية ادلستعمرة : درجة احلرارة نوع الوسط و مصادر الكربوف و اآلزوت. لقحت األوساط بقرص فطري بقطر 5 ملم مأخوذ من حافة ph مستعمرة حديثة بثبلث مكررات. وللداللة على درجة منو الفطر مت ربديد متوسط قطر ادلستعمرات وقدر متوسط وزف ادليسيليو ادلنمى على وسط سائل حسب ادلعادلة السابقة تأثري درجة احلرارة: مني الفطركما ذكر سابقا YESA على وسط و حضنت األطباؽ يف عدة درجات حرارة سلتلفة: 15 5 Ahmed دلدة أيا ( 2009(. و آخروف تأثري األوساط الزراعية: دلعرفة الوسط ادلثايل لنمو الفطر مني ىذا األخري يف عدة أوساط زراعية سلتلفة و ىي:. )PDA( - وسط Potato Dextrose Agar.)MEA( Malt Extract Agar.)YESA( Yeast Extract Saccharose Agar - وسط - وسط.(CYA(.Czapek Czapek Yeast Extract Agar.MY20.Saboraud - وسط - وسط - وسط - وسط ادلستعمرات Zain) و آخروف حضنت األطباؽ دلدة أسبوع يف درجة حرارة 30. و قدر منو الفطر بقياس قطر.)

51 :ph تأثري األس اذليدروجيين لتحديد قيمة ph ادلثالية لنمو فطر A.oryzae مني الفطر يف حوجبلت بسعة 250 ملل ربتوي على 100 ملل 9 8,5 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 من وسط YES السائل. ويتم تعديل الوسط بعدة قيم 4.5 ىي من ph.1n NaOH 1N HCl و 11 و ذلك بإضافة تعقم احلوجبلت يف درجة 121 مدة 15 دقيقة مث تلقح Ahmed أيا ( بقرص فطري بقطر ملم ربضن احلوجبلت يف درجة حرارة بثبلث مكررات 7 دلدة (. بعد انتياء ف تة احلضن يقدر النمو الفطري حسب الطريقة ادلذكورة سابقا Frances( و وآخروف 1979 آخروف Tang و آخروف.) تأثري مصادر الكربون و اآلزوت: استعمل ذلذه الدراسة الوسط األساسي medium( )base مع استعماؿ )%1( من مصادر الكربوف التالية: سكريات أحادية ( غلوكوز( سكريات ثنائية ( سكروز( سكريات متعددة ( النشاء السيليلوز( األمحاض العضوية ( محض السي تيك( و ) 1.7 غ/ؿ( من مصادر األزوت التالية: البلعضوية Cl( NH 4 و.)Glycine و العضوية ( البيبتوف و )NH 4 NO 3 لقحت األطباؽ بقرص ملم من الفطر بثبلث مكررات لكل مصدر و حضنت يف درجة 10 دلدة 30 5 أيا. و بعد انتياء ف تة احلضن يتم قياس قطر ادلستعمرات و مبلحظة اخلصائص الشكلية Attrassi( و آخروف.)

52 5- استخالص اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي: * حتضري ادلعلق البوغي:.)2010( حيضر ادلعلق البوغي حسب طريقة Cai و آخروف حيث يسكب 10 مل من ادلاء ادلقطر العزلة S1 ادلعقم على طبق ب تي احملتوي على بعمر سبعة أيا. األبواغ تكشط باستعماؿ شرحية معقمة ربضر مث Raina 7-1- سلسلة من التخافيف ( ( و يقدر عدد األبواغ بتطبيق العبلقة التالية ( و آخروف.)2009 مقلوب معامل التخفيف X عدد األبواغ )بوغة / عدد ادلستعمرات ػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػ ػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػ احلجم ادلستعمل مل( = -0-5 أوساط التخمر: إلجراء عملية التخمر استخدمت أوساط اصطناعية ىي ( وسط و وسط أدىن ) و (MM ( )MNM( وسط طبيعي )خنالة القمح(. * وسط :MNM وسط استخد MNM السائل حسب طريقة Bois و آخروف )2005( مع إضافة أعلى تركيز ملحي ديكن للفطر ربملو حسب طريقة و آخروف (. يلقح الوسط بعد تعقيمو بػ 1 مل من ادلعلق (1997 Nieto البوغي ب تكيز بوغة / ملل احملضر سابقا مث ربضن كل حوجلة بسعة مل ربتوي على 100 مل من 250 الوسط يف درجة دلدة أسبوع يف رجاج بسرعة rpm و آخروف. )2010 وأجريت عملية Xiao( التخمر بنفس الطريقة السابقة مع استخدا الوسط األدىن )MM(. 52

53 * التخمر على وسط طبيعي )خنالة القمح(: تستعمل ىذه الطريقة إلنتاج األنزديات من طرؼ الفطريات اخليطية ألف مورفولوجية و فسيولوجية ىذه األعفاف سبكنيا من االخ تاؽ و النمو يف سلتلف ادلركبات الصلبة. يستعمل يف ىذا النوع من التخمر العديد من ادلخلفات الزراعية كمصادر للتغذية و كدعامة فيزيائية و بالتايل إنتاج أنواع سلتلفة من ادلواد ادلخمرة و األنزديات..)2004( استعمل يف ىذا التخمر عجينة خنالة القمح احملضرة حسب طريقة Ruijter و آخروف حيث مزجت مع ادلاء ادلقطر بنسبة 1 ل ت/ )1 كيلوغرا من الوزف اجلاؼ ) مع تعديل الطريقة حيث عوض إضافة M من 3M مت إضافة و ىو أعلى تركيز يتحملو الفطر. حضرت أقراص من العجينة مث وضع كل قرص NaCl 0.6 يف طبق ب تي بعد ذلك عقمت دلدة ساعة و نصف مث لقحت األطباؽ بػ بوغة / مل مث حضنت يف 30 مدة 48 ساعة Ruijter( و آخروف 1 ملل من ادلعلق البوغي )2004 :S1 إنتاج 0-5- الكتلة احليوية للعزلة بعد انتياء مدة احلضن يرشح ادليسيليو عرب ورؽ ترشيح Whatman N 1 ويغسل مرتني بػمحلوؿ NaCl متعادؿ )نفس تركيز احملضر يف وسط الزرع( الذي يكوف باردا و احملضر بنفس تركيب وسط Isoozmotic الزرع مع انعدا مصدر الكربوف. جيمع ادليسيليو بعد ذلك و جيمد حىت مرحلة إجراء التحاليل Gunde-( 2007(. و آخروف Cimerman 53

54 6- الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي ادلفرزة من طرؼ العزلة : S1-0-6 حتضري ادلستخلص اخللوي: على وسط سائل: حيث وزف 0.3 )2005( حضر ادلستخلص اخللوي حسب طريقة Bois و آخروف غرا من ادليسيليو ادلتحصل عليو )إنتاج الكتلة اخللوية( أضيف إليو 6 مل من خليط )كلوروفور : ميثانوؿ : ماء مقطر( ( 3 :5 : 12 /حجم/ حجم ( مث حضن يف 30 مدة 65 دقيقة بعد ذلك أجريت عملية الطرد ادلركزي بسرعة حجم 10 / 14000rpm دقائق. أخذ اجلزء الطايف و أضيف إليو 125 ميكرول ت من ادلاء ادلقطر لتحفيز عملية الفصل مث أجريت عملية طرد مركزي ثانية بسرعة / rpm دقائق. جيمع اجلزء الطايف و ذبرى لو عملية تكثيف عرب جياز ادلكثف الدوراين ( Buchii )Rotavapor عند درجة حرارة 40 يضاؼ للمستخلص ادلركز 1 مل. من ادلاء ادلقطر و حيفظ يف درجة ) 20 - ( قبل إجراء التحاليل TLC على وسط صلب :SSF (1994) حضر ادلستخلص حسب طريقة Witteveen و آخروف عن و آخروف )2004( Ruijter حيث يتم كشط ادليسيليو من األطباؽ اجملمدة و فصلو عن الوسط بعد ذلك يوزف 0.3 غ من ادليسيليو اجملفف و حيضر منو ادلستخلص بنفس الطريقة ادلذكورة سالفا الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي: مت الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي عن طريق الفصل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة حيث تعترب ىذه التقنية شائعة االستعماؿ يف الفصل و الكشف عن ادلستقلبات الثانوية وىي تعتمد. (TLC( على توزع ادلادة بني درجة ادمصاصيا على ادلرحلة الثابتة )سيليس( وذوباهنا يف ادلرحلة ادلتحركة )ادلذيب( ويقاس )Rf( Rapport frontale ىذا التوزيع حبساب معامل االنسياب الذي يكوف خاص بكل مركب. 54

55 استخدمت ألواح ىبل سليكا )20x20 سنتيم ت( (DC-Pet-Folien-Kieselgel with F indicator 254nm( اجلاىزة لبلستعماؿ مسك )0.2 ملم( لفصل زلتوياتكل مستخلص على حدا. وذلك بوضع حجم ميكرو ل ت 20 على خط االنطبلؽ الويمهي لؤللواح وعلى نفس اخلط يوضع 5µl من اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي القياسية التالية : Glycerol Glucose Sucrose Fructose Trehalose Myo-Inositol Mannitol Sorbitol و.Glycine betain سبت العملية ربت التجفيف الضعيف )باستعماؿ رلفف الشعر( مث أجريت اذلجرة على مسافة 15 سم يف أنظمة سلتلفة من ادلذيبات العضوية وذلك حسب اجلزيئات ادلراد الكشف عنيا: -0 الكشػف عن :Glycine betaine استعملت أنظمة اذلجرة التالية: )4:1( حجم / حجم. Phenol : H 2 O * بعد اذلجرة ترش الصفيحة دبلوف بروموكريزوؿ األخضر ب تكيز % 0.1 مث ذبفف يف درجة حرارة 100 دلدة (. آخروف و Lai 10 دقائق ( )1:3( حجم /حجم. NH 4 OH : Methanol * بعد اذلجرة تعرض الصفيحة إىل خبار اليود I2. يكثف ظيور األلواف بالرش بواسطة زللوؿ مشبع لػ NaH 2 S و آخروف.) 1990 Ghoul ( Methanol :Acetone : HCl * )9:1:1( حجم /حجم / حجم. بعد جفاؼ الصفيحة تعرض يف األوؿ لبخار اليود و تبلحظ البقع بعد ذلك ترش دبحلوؿ ساخن من.I2.)1998 حجم/ حجم( ب تكيز ( % 0.2 Lai و آخروف )80:20( isopropanol : pyridine( يف ninhydrine الكشف عن 0- الكحوالت متعددة اذليدروكسيل )Polyols( و السكريات : استعملت أنظمة اذلجرة التالية: * O )9:1( Acetone :H 2 حجم /حجم )50:5:20:5( حجم /حجم /حجم /حجم Methylene Chlorid : Acetate : Methanol :H 2 O * 55

56 1994(. و آخروف Rapior( )9:1( حجم /حجم. 1-butanol : H 2 O * 1985(. و آخروف Kester( ( )3:2:1 حجم/حجم/حجم 1-propanol :ethylacetate :H 2 O* * O )60:15:15:10( ethylacetate : acetate :methanol :H 2 حجم /حجم /حجم /حجم Caprioli( و.)2004 آخروف حجم/ حجم/ حجم. بعد اذلجرة ترش الصفيحة بػػ % 0.5 )15:30:20( butanol : pyridine : H 2 O*. ) 2002 Trozilli Managbanag( يف )NaOH 1N و KMnO 4 ( بعد انتياء اذلجرة زبرج الصفائح و ذبفف مث تبلحظ األلواف و موقع البقع يف الضوء ادلرئي و ربت األشعة فوؽ البنفسجية UV يف طوؿ ادلوجة نانوم ت و 366 نانوم ت. 254 الدراسة اإلحصائية: أجري التحليل اإلحصائي باستعماؿ برنامج ANOVA بإجراء اختبار SAS9 * ادلتبوع باختبار.Student 56

57 57

58 النتائػػػػػػج: جلػػػػػػػب العيػػنػػات قياس العوامل 0- الفيزيائية: أظير التحليل الفيزيوكيميائي لعينات ال تبة ادلأخوذة خبلؿ شيري مارس و جويلية أف قيم األس اذليدروجيين بالنسبة للعينة ادلأخوذة خبلؿ شير مارس و بني و بالنسبة لعينات )ph( كانت 8.25 ال تبة ادلأخوذة يف شير جويلية من وسط السبخة و على زليطيا على ال تتيب. بينما كانت درجة ادللوحة لعينة ال تبة لشير مارس ما يعادؿ 4.34 غ/ؿ من.NaCl أما العينات ادلأخوذة خبلؿ شير جويلية فأظيرت 10 ms درجة ملوحة بالنسبة ل تبة منتصف السبخة و ل تبة زليط السبخة و ذلك ما يعادؿ 10.9 غ/ؿ و 4 ms 57 ms 4.13 غ/ؿ من NaCl على ال تتيب. أما بالنسبة لدرجات احلرارة فقد كاف ىناؾ اختبلؼ بني ادلومسني حيث سجلت 19 خبلؿ شير مارس بينما تراوحت بني 32 و 29 خبلؿ شير جويلية.كما أظيرت دراسة العناصر يف عينات ال تبة وجود اختبلؼ واضح يف تركيز األمبلح حيث يكوف مرتفعا خبلؿ شير جويلية ويف + )Na ( عينات منتصف السبخة مقارنة مع عينات زليط السبخة وخاصة تركيز الكلوريد ( - )Cl و الصوديو 05(. )جدوؿ 58

59 جدول العينات 25: اخلصائص الفيز يوكيميائية لعينات ال تبة ادلأخوذة خبلؿ شيري مارس و جويلية. مػػػػارس جويػػػليػػة اخلصائص الفيزيوكيميائية ادلوقع منتصػف السبخػة منتصػف حميط السبخة السبخػة ph T )ms( CE التشبع )%( )meq /l( CO 3 H )meq /l( SO )meq /l( Cl )meq /l( Ca )meq /l( Mg )meq /l( Na )meq /l( K + 59

60 -0 عزل الفطريات و تشخيصها : مت يف ىذه الدراسة عزؿ الفطريات على أوساط سلتلفة ىي: PDA مضاؼ إليو NaCl حسب و PDA.%0.4 %1.09 %0.43 ما يعادلو يف العينة وىي : وقد مت عزؿ فطريا جنسا 21 باإلضافة إىل ثبلث مخائر ويبلحظ أف فطر Aspergillus ىو السائد بنسبة 43% يليو فطر Penicillium بنسبة % 24 مث جنس Alternaria بنسبة %7 أما النسبة ادلتبقية فيي موزعة على فطريات أخرى سلتلفة )جدوؿ 06(. أما بالنسبة لف تات أخذ العينات فيبلحظ انتشار واسع للفطريات خبلؿ شير مارس مقارنة مع شير جويلية وذلك بنسب % و % على ال تتيب.كما يتضح من خبلؿ ادلقارنة بني مواقع أخذ العينات خبلؿ شير جويلية أف نسبة تواجد الفطريات يف منتصف السبخة أكرب منيا يف زليط السبخة وذلك بنسب % و على ال تتيب )شكل.) % 60

61 جدول )26(: قائمة الفطريات ادلعزولة بناء على األوساط ادلستخدمة و الف تة الزمنية مارس جويلية العينات PDA+C PDA+M2 PDA PDA PDA+M1 Rhodotorula sp. Penicillium sp.1 A. niger S4 A.niger S5 A.unguis A.flavus S3 A. flavus S1 Phoma sp. 2 Phoma sp. 3 Phoma sp. 4 Cladophialophora Cladosporium sp. Ulocladium - Alternaria rapheni A. brassicicola A. alternata Phoma sp. 1 Eurotium repens Aspergillus flavips / chartaumium Alternaria solani Aspergillus niger S1 A. parasiticus S1 A. parasiticus S2 Fusarium compactum Aurobasidium sp. Mucor sp 2. Penicillium citreonigrun A. niger S2 A.niger S3 ع 1 A.parasiticus S3 A.parasiticus S4 A.flavus S2 Aspergillu sp. 1 Pythomyces sp. Sporodactylon sp. Fusarium sp. 1 Mucor sp. 1 61

62 Yeast sp. 1 Yeast sp. 2 A. alternata A.rapheni Cladosporium herbarum Alternaria alternata A. tenuissiana Fusarium sp. 2 Fusarium sp. 3 F. sacchari Stachybotris atra Alternaria tenuissia Deudriphium sp. Biosporalis australiensis A.niger S 6 / / Penicillium sp. 2 A.niger S 7 Aspergillu sp. 2 A.parasiticus S5 Aspergillu sp. 3 Fusarium poae A. parasiticus S6 A.niger S6 A.niger S7 A.parasiticus S7 A.parasiticus S8 A.parasiticus S9 A.flavus S4 A.unguis A.sydwii A.glaucus Trichothesium roseum Eupenicillium hirayamae Penicillium nigricans ع 0 Penicillium sp. 4 Penicillium sp. 3 Aspergillu sp. 4 A.parasiticus S10 Penicillium sp. 5 P. notatum A. candidus Alternaria alternata Penicillium sp. 6 Urosporemum A. fumigatus A.tenuis ع 3 / A. flavus S2 picroides Alternaria Aspergillus terrus 62

63 A.flavus S4 A. parasiticus S5 clamydospora Helicomyces sp. A. ochraceus S1 A.ochraceus S2 A.oryzae S1 ع 3 Cladosporium sp. Phoma sp. 5 A. flavus S3 A.oryzae S2 A.oryzae S3 ع 4 / A.ochraceus S3 A.parasiticus S6 / A.candidus / A.candidus / A.ochraceus S4 ع 5 / / Rhizopus ع 6 / / / / / ع 0 ع 0 ع 3 : عيػػػنات مأخػػػوذة من وسط السبخة خبلؿ شير مارس و شير جويلية. ع 6 : ع 4 ع 5 عيػػػنات مأخػػػوذة من زليط السبخة لشير جويلية. مضاؼ إليو NaCl ب تكيز عينات وسط السبخة لشير مارس وPDA+M0 : لشير PDA وسط :PDA+M1 جويلية. مضاؼ إليو NaCl ب تكيز عينات زليط السبخة. : وسط PDA PDA+C 63

64 شكل )24(: نسبة انتشار الفطريات حسب ف تات و مواقع أخذ العينات نسبة انتشار الفطريات حسب ف تات أخذ العينات: جويلية )S(. و مارس )J( -1 نسبة انتشار الفطريات حسب مواقع أخذ العينات: منتصف السبخة و زليط السبخة.)C( )M( -2 64

65 دراسػػة فطر :Aspergillus oryzae تشخيص الفطر: الدراسة ادلورفولوجية : يتضح من خبلؿ ادلبلحظة العينية دلستعمرة الفطر النامية على وسط PDA مستعمرة ناعمة إىل شكل مسحوقي ذات ميسيليو ىوائي و غنية باألجسا احلجرية حيث تكوف يف البداية ذات لوف أبيض مث سبيل إىل االصفرار أما اخللفية فتظير صفراء شاحبة )شكل 05 ( الدراسة اجملهرية : يتضح من خبلؿ ادلبلحظة اجمليرية للفطر باجملير الضوئي أنو يتكوف من حامل كونيدي طويل حيمل رأس بوغية كبرية شبو كروية علييا زوائد )Phialides( م تاصة مع بعضيا البعض بشكل منتظم ربمل أبواغ الفطر أما ادليسيليو فيو متشابك و يظير شفاؼ. تظير األبواغ بلوف أصفر سلضر داكن إىل زيتوين ذات شكل بيضوي )شكل.) أوساط التشخيص: يتضح من خبلؿ نتائج التشخيص بعد مبلحظة الصفات ادلورفولوجية على وسط PDA و أوساط التشخيص يف درجات حرارة سلتلفة أف نوع Aspergillus ادلعزوؿ ىو A.oryzae حيث يبدي الفطر مستعمرات كثيفة و بيضاء غنية باألجسا احلجرية على وسط MEA أما على وسط CYA فتظير ادلستعمرة صفراء ذات ميسيليو ىوائي وغنية باألبواغ و األجسا احلجرية. بينما كاف منو الفطر على وسط ضعيفا حيث لوحظت مستعمرة بيضاء صغرية يف كل درجات احلرارة ادلختربة )جدوؿ GN25.)07 65

66 ب- ب- الواجية الشكل اخللفية مستعمرة 25: A. oryzae منماة على وسط PDA 30 عند درجة - - أ - شكل الرأس البوغية 26: لفطر A.oryzae ربت اجملير X4 تكبري -: تكبري - أ-: X40 66

67 جدول : اخلصائص ادلزرعية لفطر A.oryzae النامي على أوساط التشخيص بعد 7 أيا من احلضن 27 درجة احلرارة اخلصائص ادلزرعية قطر ادلستعمرة )ملم( - مستعمرة قطنيةكثيفة منتفخة مع مبلحظة 42 - ) م( وسط التشخيص وجود عدد كبري من األجسا احلجرية كبرية احلجم بلوف فضي مسود ذات حواؼ غنية باألبواغ الصفراء. 25- CYA - مستعمرة قطنيةكثيفة ذات مركز مصفر داكن مائل إىل اللوف الزيتوين ذات حواؼ بيضاء ناصعة. مع مبلحظة وجود صبغة صفراء شفافة. و عدد قليل جدا من األبواغ غياب النمو / 5 - مستعمرة قطنية كثيفة بيضاء مسطحة MEA مع وجود أبواغ صفراء بعدد قليل باإلضافة إىل وجود أجسا حجرية ذات لوف فضي مسود. مستعمرة صفراء - غنية باألبواغ غياب النمو. / 5- - مستعمرة بيضاء ذات ميسيليو ىوائي GN25 خفيف. - - مستعمرة بيضاءكثيفة ذات حواؼ شفافة. غياب النمو /

68 0-3- دراسة تأثري ادللوحة على منو الفطر) انتقاء العزلة األكثر حتمال للملوحة العالية(: تأثري ادللوحة على قطر النمو )وسط صلب(: * على وسط غين: أظيرت نتائج تنمية العزالت على وسط YESA يف عدة تراكيز من ادللح وجود فرؽ معنوي جدا يف حيث تبدي العزالت الثبلث أقصى منو ذلا عند ال تاكيز ادللحية من 0 M إىل M 0.6 النمو) < )p 90 بنمو بلغ ملم مث يتناقص النمو تدرجيياكلما زاد تركيز NaCl يف الوسط. و يظير االختبلؼ بني العزالت (S1) عند ال تكيزM العزلة سجلت 0.8 إذ أكرب قيمة للنمو )87.5 ملم( مقارنة مع العزلتني و (S2) (S3) حيث قدر النمو عند نفس ال تكيز بػ 50 ملم و 44.3 ملم على ال تتيب بعد ذلك يستمر التناقص إىل أف يصل (S2) و أدىن قيمة مسجلة عند ال تكيز 3M بػ ملم بالنسبة للعزلة )S1( و ملم بالنسبة لػلعزلة ملم بالنسبة للعزلة M بينما م يبلحظ أي منو للعزالت الثبلت عند ال تكيز (S3)..)07 )الشكل 3.5 * على وسط أدىن: يظير من خبلؿ التحليل اإلحصائي وجود فرؽ معنوي جدا بني تأثري ال تاكيز ادللحية ادلختلفة و النمو الفطري حيث تنمو العزالت الثبلث بشكل جيد يف وسط أدىن خايل من إذ سجلت NaCl. (p< 0.000( أكرب قيمة لقطر ادلستعمرات 60 ملم بعد ذلك يتناقص النمو بشكل متفاوت كلما زاد تركيز ادللح يف الوسط. ويبلحظ أف العزلة (S1) تبدي ربمبل أكثر للملح عند ال تكيز 1.5M ادلستعمرة قطر إذ بلغ 42 ملم مقارنة مع و العزلتني (S2) اليت سجلت ال تتيب. على ملم و 28 ملم بينما ينعد النمو عند ال تكيز 3.5M 24.5 (S3) 08(. )شكل 68

69 قطر المستعمرات )ملم( قطر المستعمرات )ملم( ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5 2 2,5 3 3,5 NaCl (M) S1 S2 S3 YESA A.oryzae شكل 27: تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر منمى على وسط S1 S2 S ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5 2 2,5 3 3,5 NaCl (M) شكل تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر.A oryzae منمى على وسط أدىن :28 MMA 69

70 تأثري ادللوحة على مردود الكتلة احليوية )وسط سائل(: * على وسط غين: تنمو عزالت A.oryzae بشكل جيد يف وسط YES اخلايل من ادللح ويتبني من خبلؿ النتائج ادلتحصل علييا أف وسط الزرع حبيث قدر النمو األعظمي عند العزلة S1 A.oryzae زلفز لنموكل عزالت YES S3 ) غ( بعدىاكلما زاد تركيز ادللح بالوسط تزايد تثبيط النمو.)p<0.0001( إال أنو يبلحظ أف العزلة تبدي ربمبل أكرب عند ال تاكيز )1M ( يتوقف النمو عند ال تكيز 3.5M )شكل *على وسط أدىن: حيث سجلت أكرب كتلة حيوية مقارنة مع العزلتني و S1 S2.)09 أظيرت النتائج أف أحسن منو للفطر يكوف يف الوسط اخلايل من NaCl إىل أف بالنسبة للعزالت الثبلث إال أف أحسن منو قدر عند العزلة S1 و S3 مع مقارنة S2 ) 8.20 غ( اللتني بلغ منويمها 5.15 غ و 5.35 غ على ال تتيب. بعدىا كلما زاد تركيز ادللح يف الوسط كلما تناقص النمو إىل أف يتوقف عند ال تكيز 3.5M.)p<0.0001( ويبلحظ أف العزلة S1 تبدي ربمبل أكرب عند ال تاكيز العالية. حيث سجلت أكرب منو عند ال تكيز 1.5M بينما ) 4.01 غ( كاف منو كل من S2 ) 3.02 غ( و و S3 ) 2.24 غ( على ال تتيب عند نفس القيمة.)10 )الشكل )1.5M( * انطبلقا من النتائج ادلتحصل علييا و اعتمادا التحليل اإلحصائي مت انتقاء العزلة S1 إلجراء الدراسة. حيث وجد أهنا األكثر ربمبل للملوحة على الوسط الصلب ( األدىن و الغين(. إذ سجلت أعلى متوسط منو قدر بػػ ملم مقارنة مع و S2 اللتني سجلتا معدؿ منو ملم و ملم على ال تتيب بينما م S3 يكن ىناؾ فرؽ بني العزلتني و S1 S3 على الوسط السائل ( األدىن و الغين(. حيثكاف متوسط منويمها 4.7 غ و S2 بػػػػ 4.9 غ على ال تتيب يف حني قدر متوسط منو العزلة 4.3 غ. 70

71 وزن الميسيليوم )غ( العسلة S1 العسلةS2 العسلة S3 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 NaCl (M) S1 S2 S3 A.oryzae شكل 29: تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر منمى على وسط YES السائل 71

72 وزن الميسيليوم )غ( العسلة S1 العسلة S2 العسلةS S1 S2 S ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 NaCl (M) شكل 02: تأثري عدة تراكيز من ادللح على منو العزالت الثبلث لفطر A.oryzae منمى على الوسط األدىن MM السبئل 72

73 - 3-3 الدراسة الفسيولوجية لفطر )S1( :A.oryzae تأثري نوع األوساط الزراعية على منو الفطر: يبلحظ من خبلؿ النتائج أف نوع الوسط الزراعي يؤثر بشكل كبري على شكل ادلستعمرات حيث تظير ادلستعمرة النامية على وسط YESA بلوف مائل إىل الربتقايل كثيفة و منتظمة النمو مع وجود عدد قليل من األجسا احلجرية. بينما تبدو ادلستعمرة على وسط MY20 بيضاء و كثيفة. أما ادلستعمرات النامية على Czapek Saboraud األوساط MEA PDA و فتبدو بلوف أصفر و متبعثرة وغنية باألجسا احلجرية كما تبلحظ قطرات بلوف برتقايل بالنسبة للوسط. Czapek أما على وسط CYA فتظير ادلستعمرة بيضاء كثيفة و غنية باألجسا احلجرية )شكل.)11 وقد أظيرت نتائج الدراسة اخلاصة باختبار األوساط الزراعية على منو فطر.A oryzae اختبلفا واضحا.)p<0.0001( وقد تبني بأف الوسطني يمها األكثر مبلئمة للنمو حيث سجل 90 ملم مقارنة YESA و MY20 Sabouraud األوساط مع األخرى ادلستعملة يلييا وسط و وسط PDA الذينكاف منو الفطر جيدا علييما Czapek ملم و 75 بػ نوعا ما إذ قدر ملم على ال تتيب. أما على وسط فكاف منو الفطر ضعيفا إذ قدر بػ (. ملم (شكل 73

74 00: شكل تأثري األوساط الزراعية على شكل ادلستعمرات لفطرoryzae.A 74

75 شكل تأثري األوساط الزراعػػػية على منو الفطر A. oryzae :10 75

76 تأثري درجة احلرارة: تعترب احلرارة من العوامل البيئية ادليمة اليت تؤثر على النمو حيث أظيرت نتائج تنمية الفطر على درجات سلتلفة من احلرارة تباينا كبريا )0.0001>p(. إذ م يبلحظ أي منو للفطر عند درجة احلرارة 5 إال أنو أظير منوا خفيفا قدر بػ 32 ملم عند الدرجة 15 بعدىا تكوف العبلقة طردية بني عاملي احلرارة و النمو. فكلما ارتفعت درجة احلرارة زاد النمو )قطر ادلستعمرة( إىل أف يصل إىل أقصاه يف اجملاؿ بني -30 حيث سجل ملم بعد ذلك 90 يتناقص النمو كلما ارتفعت درجة احلرارة )عبلقة عكسية( إىل أف ينعد 35 عند الدرجة )شكل 40.) تأثري األس اذليدروجيين :)ph( من خبلؿ الدراسة الفيزيولوجية اليت أجريت دلعرفة قيم األس اذليدروجيين ادلثلى لنمو الفطر و اليت مشلت اختبار قيم سلتلفة لػ ph ت تاوح بني و قياس وزف = ph ادليسيليو النامي. وقد تبني أف الوسط ذو ىو الوسط األنسب. حيث وصل أقصاه النمو إىل ) غ( إال أنو بعد ذلك ينخفض معدؿ النمو كلما أصبح الوسط أكثر قاعدية إىل أف ينعد عند القيمة )شكل 14 (

77 قطر المستعمرات )ملم( وزن الميسيليوم )غ( درجة الحرارة ) م( شكل 13: تأثري درجة احلرارة على منو الفطر A. oryzae ,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8, درجة األس الهيدروجيني )ph( منو الفطر A. oryzae شكل 14: تأثري درجة األس اذليدروجيين على 77

78 تأثري ادلصادر الكربونية و اآلزوتية: تأثري ادلصادر الكربونية: بينت النتائج أف للفطر قابلية عالية للنمو على مصادركربونية سلتلفة غري أنو يظير تفاوتا يف النمو من حيث قطر ادلستعمرة وكثافة ادليسيليو الظاىر. بنمو مثايل للفطر أين أبدى أقصى منو لو ( ملم( يليو كل من الغلوكوز و السكروز حيث 90 - يسمح النشاء قدر منو الفطر بػػػ ملم و 73 ملم على ال تتيب. بينما لوحظ أف السيليلوز أو األمحاض العضوية ال تشكل 46 مصادر مناسبة للنمو. فقد أظير الفطر أدىن منو لو يف وجود ىذه ادلصادر )36 24 ملم و ملم( على ال تتيب )شكل 15( تأثري ادلصادر األزوتية : أظيرت نتائج تنمية الفطر على عدة مصادر آزوتية وجود فرؽ معنوي جدا )0.0001>p( وقد تبني 21( Glycine أف البيبتوف ىو ادلصدر اآلزويت العضوي األكثر مبلئمة )55 ملم( مقارنة مع ملم(. بينما كاف منو الفطر ضعيفا على العمو يف وجود ادلصادر البلعضوية ادلختربة. حيث سجل ملم بالنسبة لػ 18 و NH 4 Cl 20 ملم بالنسبة لػػ NH 4 NO 3 )شكل 16 (. 78

79 15: شكل تأثري مصادر الكربوف على منو الفطر.A oryzae تأثري مصادر 16: شكل اآلزوت على منو الفطر.A oryzae 79

80 4- استخالص اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي: -1-4 بيػػئات التخمر: التخمر على األوساط االصطناعية: MNM وسط :MNM إف الغرض من ىذه الدراسة ىو التأكد من قابلية الفطر ادلدروس على ربديد أعلى تركيز ملحي ديكن ربملو. النمو على وسط و 0M ( NaCl MNM أظيرت نتائج تنمية العزلة (S1) A.oryzae على وسط يف تراكيز سلتلفة من 3M. قدرة الفطر على النمو يف تراكيز ملحية عالية تصل إىل 3.5) M 3M 2.5M 2M 1.5M 1M 0.5M إال أف أحسن منو أبداه الفطركاف يف الوسط اخلايل من ادللح حيث قدر بػ 5.4 غ بعدىا ينخفض النموكلما مث 2.5M ارتفع تركيز ادللح يف الوسط. و النمو استقرار قد لوحظ نوعا ما يف اجملاؿ احملصور بني 1.5M 3.5M يستمر التناقص ليصل أدىن قيمة لو ) 0.63 غ( عند ال تكيز M بينما م يبلحظ أي منو عند ال تكيز 3 )شكل 17(. :SSF التخمر على وسط طبيعي )خنالة القمح( ديكن للعزلة (S1) A. oryzae النمو بشكل جيد على وسط عجينة خنالة القمح ذات تركيز 3M من مقارنة بالشاىد. حيث أنو بعد ساعة 48 من احلضن يبلحظ امتبلء األطباؽ. و تظير ادلستعمرات بلوف NaCl أصفر داكن مائل إىل األخضر الزيتوين ذات شكل مسحوقي و غنية باألبواغ مع غياب تا لؤلجسا احلجرية. أما يف غياب ادللح فتظير ادلستعمرة بيضاء كثيفة و قطنية ( 18(. الشكل 80

81 وزن الميسيليوم )غ( ,5 1 1,5 2 2,5 3 NaCl (M) A. oryzae (S1) شكل 17: تأثري ال تاكيز ادلختلفة من ادللح على منو العزلة على وسط MNM السائل 81

82 شكل (S1) A.oryzae منو العزلة على عجينة خنالة القمح.)SSF( :18 82

83 5- الكشف عن اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي: فحص ادلستخلص اخللوي ادلتحصل عليو من عدة أوساط ( MNM MM خنالة القمح( بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة و شوىدت الصفائح يف الضوء ادلرئي و ربت األشعة فوؽ البنفسجية UV عند طويل ادلوجة و 254 نانوم ت قبل و بعد ادلعاملة الكيميائية بكواشف خاصة. وقد تبني من خبلؿ النتائج 366 ادلتحصل علييا قدرة العزلة (S1).A oryzae على إنتاج و تكديس عدة مركبات من ضمنيا اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي واليت مت تشخيص بعضيا اعتمادا على ادلعطيات النظرية ادلتعلقة دبعامل االنسياب و لوف البقع. بعد ادلعاملة الكيميائية. و كذلك على اجلزيئات القياسية (Standards) Glycine betaine الكشف عن 0- :Betaines و من بني أنظمة اذلجرة ادلستعملة يبلحظ أف النظا )Methanol : Aceton : HCl ) ىو الذي يسمح بالكشف والفصل اجليد لػ وسطي خنالة القمح و MNM و اليت ظيرت باللوف الزىري بادلقارنة مع Betaines يف ادلعيار القياسي ادلستعمل )شكل 19(. بينما م تبلحظ أي بقعة بالنسبة للوسط األدىن. الكشف عن 0- الكحوالت متعددة اذليدروكسيل )Polyols( و السكريات: عند فحص ادلستخلص اخللوي ادلتحصل عليو عن طريق تنمية الفطر على وسط MNM يبلحظ أف النظا H2O) (Butanol : ىو األفضل للفصل من بني أنظمة اذلجرة اجملربة حيث مسح بالكشف عن أربعة أنواع من الكحوالت متعددة اذليدروكسيل ىي: و. إال أنو لوحظ Mannitol Xylitol Sorbitol Glycerol ظيور كل من Myo-inositol و سكر Trehalose عند استعماؿ النظا ( O.)butanol : pyridine: H 2 بينما م يبلحظ أي فرؽ بني األنظمة ادلستعملة لفحص ادلستخلص اخللوي ادلتحصل عليو من تنمية الفطر على الوسط األدىن إذ مسح كل نظا بالكشف عن مركب واحد ومن بني ىذه ادلركبات مت تعريف inositol Myo- )MM( و Glycerol )شكل 20 (. 83

84 * وسط عجينة خنالة القمح: يتبني من خبلؿ مبلحظة األلواح أف نظا اذلجرة )O )Butanol : H 2 ىو األحسن لفصل ادلركبات ادلفرزة من طرؼ الفطر النامي على الوسط الطبيعي حيث كشف عن حوايل 7 مركبات ىي : Rhibitol Glycerol. يليو النظا O( :Acetic acid : methanol : H 2 Xylitol Arabitol Mannitol Fructose Erythritol الذي مسح بالكشف عن أربع مركبات من بينيا Glycerol و Fructose باإلضافة إىل ( Methylene chloride Myo-inositol Galactose و.Trehalose وقد مسح نظا O( butanol : pyridine : H 2 ) بالكشف عن و (Rf = 0,74( Dulcitol بينما مسح نظا (1-propanol : methanol : H 2 O ) بالكشف عن Fructose Mannitol و Glycerol )شكل 20 (. :A. oryzae (S1) اجلزيئات ادلقاومة للضغط األمسوزي ادلفرزة من طرؼ عزلة -6 يبلحظ من خبلؿ النتائج ادلتحصل علييا أف للفطر القدرة على إفراز اجلزيئات بكمية عالية يف غياب الضغط األمسوزي خاصة يف الوسط الطبيعي )85.71%( يليو وسط ( MNM 64.28%( مث الوسط األدىن بنسبة 14.28%. بينما يف وجود ضغط أمسوزي )3M( فيستمر الفطر يف إفراز سوى بعض اجلزيئات األساسية. أما بالنسبة للوسط األدىن فيبلحظ أف اجلزيئات ادلفرزة عند ال تكيز 0M ىي نفس اجلزيئات ادلفرزة عند ال تكيز 3M Glycerol وادلتمثلة يف Myo-inositol و )جدوؿ 08 (. 84

85 GB 0M 3M 0M 3M MNM MNM SSF SSF 0.70 Methanol : Acetone : HCl (9:1:1 ح:ح:ح) )TLC( فصل شكل 19 : Betaines باستعماؿ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة 85

86 أ) 3M 0M Mannitol Glycerol Glycerol 0M 3M 0M 3M SSF SSF MNM MNM SSF SSF ػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػ ػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػػ Dulcitol Arabitol Galactose Propanol : ethylacetate : H 2 O Methylenechloride : acetate : methanol : H 2 O 50:5:20:5) ح:ح:ح:ح) 3:2:1) ح:ح:ح ( شكل 02 فصل الكحوالت متعددة اذليدروكسيل و السكريات األساسية باستعماؿ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة :) 86

87 ب) 3M 0M 3M 0M 3M 0M Sorbitol 3M 0M 3M 0M SSF SSF MNM MNM MNM MN SSF SSF MNM MNM Glycerol Erythritol Rhibitol mannitol sorbitol Xylitol Fructose Arabitol Arabitol Butanol : H 2 O Butanol : H 2 O Butanol : H 2 O 9:1) ح:ح ( 9:1) ح:ح ( 9:1) ح:ح ( شكل 20 (: فصل الكحوالت متعددة اذليدروكسيل و السكريات األساسية باستعماؿ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة 87

88 ج) Treh Inos Fruc 0M 3M 0M 3M 0M 3M MM MM MNM MNM SSF SSF Butanol : pyridine : H 2 O 15:30:20) ح:ح:ح ( شكل 20 (: فصل الكحوالت متعددة اذليدروكسيل و السكريات األساسية باستعماؿ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة 88