ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΤΗΛΕΜΑΧΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΤΗΛΕΜΑΧΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ IN VITRO ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ΚΑΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ EV-C ΛΑΡΙΣΑ 2017

2 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ IN VITRO ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ΚΑΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ EV-C II

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΜΑΡΚΟΥΛΑΤΟΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ): Καθηγητής Εφαρμοσμένης Μικροβιολογίας με έμφαση στη Βιοτεχνολογία Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΛΕΒΕΙΔΙΩΤΟΥ ΣΤΕΦΑΝΟΥ ΣΤΑΜΑΤΙΝΑ Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων ΜΟΣΙΑΛΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Επίκουρος Καθηγητής Βιοτεχνολογίας Μικροβίων Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΛΕΒΕΙΔΙΩΤΟΥ ΣΤΕΦΑΝΟΥ ΣΤΑΜΑΤΙΝΑ Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων ΜΑΡΚΟΥΛΑΤΟΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ Καθηγητής Εφαρμοσμένης Μικροβιολογίας με έμφαση στη Βιοτεχνολογία Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΚΟΜΙΩΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Καθηγητής Οργανικής Χημείας με έμφαση στη σύνθεση βιοδραστικών μορίων Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΚΟΥΡΕΤΑΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Καθηγητής Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών-Τοξικολογίας Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΑΜΟΥΤΖΙΑΣ ΓΡΗΓΟΡΙΟΣ Επίκουρος Καθηγητής Βιοπληροφορικής στη Γενωμική Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΓΚΑΡΤΖΟΝΙΚΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων ΜΟΣΙΑΛΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Επίκουρος Καθηγητής Βιοτεχνολογίας Μικροβίων Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας III

4 Δημητρίου Τηλέμαχος ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ IN VITRO ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ΚΑΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ EV-C Στους γονείς μου, Γιώργο και Αγλαΐα και στα αδέρφια μου, Δόμνα και Θαλασσινό IV

5 ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΤΗΛΕΜΑΧΟΣ 2017 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ IN VITRO ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ΚΑΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ EV-C ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΠΡΟΚΑΤΑΡΤΙΚΕΣ ΣΕΛΙΔΕΣ: 14 ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΣΕΛΙΔΩΝ: 201 ΑΡΙΘΜΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ: 25 ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ: 58 ΑΡΙΘΜΟΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΠΟΜΠΩΝ: 175 V

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ: Οι εντεροϊοί ανήκουν στην οικογένεια Picornaviridae. Το γένωμα τους είναι μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας μήκους περίπου 7.500bp και περιβάλλεται από ένα εικοσαεδρικό πρωτεϊνικό καψίδιο. Οι εντεροϊοί που προσβάλλουν τον άνθρωπο ταξινομούνται σε τέσσερις ομάδες: EV-A, EV-B, EV-C και EV-D. Οι πολιοϊοί, το σημαντικότερο μέλος της ομάδας C, διακρίνονται σε τρεις ορότυπους (PV1, PV2, PV3) και είναι οι αιτιολογικοί παράγοντες της παραλυτικής πολιομυελίτιδας. Από το 1960 χρησιμοποιούνται δύο εμβόλια για την εξάλειψη της ασθένειας, αρχικά το IPV (inactivated polio vaccine) και κατόπιν το πιο αποτελεσματικό OPV (oral polio vaccine). Ωστόσο, το OPV εμφάνισε το μειονέκτημα της εμβολιοσυνδεόμενης παραλυτικής πολιομυελίτιδας (VAPP: Vaccine-associated paralytic poliomyelitis) και της κυκλοφορίας των εμβολιοπροερχόμενων πολιοϊών (VDPVs: Vaccine Derived Polioviruses) μέσω της συσσώρευσης μεταλλάξεων ή και ανασυνδυασμών στο γένωμα των εξασθενημένων εμβολιακών στελεχών Sabin. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη μεθόδων με σκοπό τη μελέτη του μηχανισμού παρασκευής in vitro ανασυνδυασμένων στελεχών πολιοϊών και εντεροϊών της ομάδας EV-C. Στο πρώτο μέρος της διατριβής σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε μια Multiplex-PCR για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών. Τα αποτελέσματα της τεχνικής αυτής σε πρότυπα αλλά και κλινικά στελέχη ανέδειξαν την τεχνική αυτή ως ένα χρήσιμο εργαλείο για την γρήγορη και ακριβή ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε μια τεχνική αλληλούχησης ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών χρησιμοποιώντας μόνο τέσσερις PCR αντιδράσεις. Η δυνατότητα αυτή παρέχεται μέσω της χρήσης ενός ειδικού εκκινητή (DOP), μέσω του οποίου πραγματοποιήθηκε αρχικά μια προενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος. Στο τρίτο μέρος της διατριβής σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε σε κλινικά δείγματα μια Multiplex-PCR για την ανίχνευση ανασυνδυασμών από τη VP1 έως και τη 3D γενωμική περιοχή εμβολιοσυνδεόμενων πολιοϊών. Τα αποτελέσματα της Multiplex-PCR απέδειξαν την ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει και να ταυτοποιεί σπάνιους αλλά και κύριους τύπους ανασυνδυασμού με τη χρήση μόνο τεσσάρων Multiplex-PCR αντιδράσεων. Στο τέταρτο μέρος της διατριβής σχεδιάστηκε μια ειδική Stem-Loop RT-PCR μέθοδος για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας των εντεροϊών μέσω ανίχνευσης VI

7 του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε αρχικά στο πρότυπο στέλεχος Sabin 1, όπου ανιχνεύτηκε η αντιγραφική ενεργότητα του στελέχους σε υψηλό αλλά και χαμηλό ιικό τίτλο, αρκετά νωρίτερα από την εμφάνιση της χαρακτηριστικής εικόνας CPE, των ενεργών εντεροϊών σε κυτταροκαλλιέργεια. Επιπλέον, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την διάκριση μεταξύ αντιγραφικά ενεργών και ανενεργών πρότυπων στελεχών CAV που δεν εμφάνιζαν CPE σε κυτταροκαλλιέργειες. Στο τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε η μελέτη των ανασυνδυασμών που προέκυψαν έπειτα από ταυτόχρονη μόλυνση κυττάρων Rd με πρότυπο στέλεχος Sabin 1 και CAV13. Παράλληλα, με τη χρήση ειδικών προγραμμάτων βιοπληροφορικής σχεδιάστηκαν πιθανά μοντέλα της δευτεροταγούς δομής των RNA μορίων στις θέσεις ανασυνδυασμού. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής επαλήθευσαν την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης ετεροτυπικών ανασυνδυασμών στην 2Α ή 2Β γενωμική περιοχή και εμφάνισαν μια ένδειξη που επιβεβαιώνει τη σύνδεση μεταξύ ανασυνδυασμού και δευτεροταγούς δομής του RNA μορίου. VII

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ: Μετά το τέλος μιας μεγάλης και σημαντικής περιόδου πέντε ετών αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω τα άτομα που συνέβαλλαν, ο καθένας με το δικό του μερίδιο, για την διεξαγωγή και ολοκλήρωση της διατριβής αυτής. Αρχικά θα ήθελα να εκφράσω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον επιβλέποντα καθηγητή μου Παναγιώτη Μαρκουλάτο. Είναι το λιγότερο που μπορώ να πω για έναν αξιόλογο επιστήμονα, μέντορα και καθηγητή που είχα την τύχη να συνεργάζομαι για επτά ολόκληρα χρόνια. Έχω να θυμάμαι την αρχική μύηση στον κόσμο της ιολογίας, τη συνεχή αναζήτηση για διερεύνηση και επίλυση επιστημονικών ζητημάτων, τη συνεχή καθοδήγηση και τη συμπαράσταση στις όποιες δυσκολίες εμφανίστηκαν. Μα πάνω από όλα οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ για το αίσθημα εμπιστοσύνης προς το πρόσωπό μου που διέκρινα από την αρχή της συνεργασίας μας, αίσθημα που με έκανε να αγαπήσω το εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιολογίας και τον κόσμο της Ιολογίας ακόμη περισσότερο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης την καθηγήτρια Σταματίνα Λεβειδιώτου- Στεφάνου και τον επίκουρο καθηγητή Δημήτρη Μόσιαλο για την αποδοχή τους να συμμετέχουν στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή και για την βοήθειά τους κατά τη διάρκεια της διατριβής. Να ευχαριστήσω και τους καθηγητές Δημήτρη Κομιώτη, Δημήτρη Κουρέτα, την επίκουρη καθηγήτρια Κωνσταντίνα Γκαρτζονίκα και τον επίκουρο καθηγητή Γρηγόρη Αμούτζια για τη συμμετοχή τους στην επταμελή εξεταστική επιτροπή. Ευχαριστώ όλα τα άτομα του εργαστηρίου Μικροβιολογίας Ιολογίας που συνεργάστηκα καθ όλη τη διάρκεια των επτά χρόνων, ένα μεγαλύτερο ευχαριστώ όμως για τους φίλους που έκανα μέσα στο εργαστήριο και φρόντισαν να περνούν οι δύσκολες ώρες ευκολότερα και οι ευχάριστες ακόμα καλύτερα. Δεν είναι άλλοι από τους Ζαχαρούλα Κυριακοπούλου, Ειρήνη Ρούτερ, Δημήτρη Τσακογιάννη, Αντώνη Φίκατα, Γιώργο Μοσχονά και Φώτη Τέκο. Ευχαριστώ επίσης τη Μαρία Δάσκου για την υπομονή της όλη αυτή την επίπονη και δύσκολη περίοδο του διδακτορικού, αλλά κυρίως που ήταν δίπλα μου συντροφεύοντας την κάθε στιγμή τόσο εντός όσο και εκτός του εργαστηρίου. Όμως το τελευταίο και μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στην οικογένειά μου, στους γονείς μου Γιώργο και Αγλαΐα και στα αδέρφια μου Δόμνα και Θαλασσινό. Γιατί εκτός από την οικονομική και ψυχολογική βοήθεια που μου παρείχαν καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου, με θωράκισαν με αξίες από τα πρώτα χρόνια της ζωής μου. Το ότι βρίσκομαι σε αυτό το σημείο σήμερα τους το οφείλω αποκλειστικά. VIII

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ: 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΠΟΛΙΟΜΥΕΛΙΤΙΔΑΣ ΕΜΒΟΛΙΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Ταξινόμηση των πολιοϊών Εντεροϊοί της Ομάδας C (EV-Cs) Δομή και αντιγονικότητα των ιικών σωματιδίων Οργάνωση του ιικού γενώματος ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Προσκόλληση στον κυτταρικό υποδοχέα και είσοδος του ιού στο κύτταρο Μετάφραση του ιικού RNA και επεξεργασία της ιικής πολυπρωτεΐνης Αντιγραφή του ιικού RNA Καψιδίωση και απελευθέρωση νέων ιικών σωματιδίων ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Μεταλλάξεις Ανασυνδυασμός ΕΜΒΟΛΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ IPV OPV VAPP VDPV ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Πρότυπα Στελέχη Κλινικά Περιβαλλοντικά Στελέχη Άγνωστα κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΩΝ Κυτταροκαλλιέργειες Μέτρηση κυττάρων Ενοφθαλμισμός των δειγμάτων σε κυτταροκαλλιέργειες Σειριακές Αραιώσεις IX

10 2.4. ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ SABIN 1 ΚΑΙ CAV ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ RNA ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ Εκκινητές για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ στελεχών Sabin Εκκινητές για την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των στελεχών Sabin Εκκινητές για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας των εντεροϊών Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV Εκκινητές για την Real-Time PCR ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Αντίστροφη μεταγραφή με χρήση τυχαίων εκκινητών Αντίστροφη μεταγραφή με χρήση ειδικού εκκινητή ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) PCR για την ανίχνευση του θετικής πολικότητας RNA κλώνου PCR για την ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου Nested-PCR για την ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου PCR για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV DOP PCR MULTIPLEX PCR Ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών Ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ στελεχών Sabin REAL-TIME PCR Real-Time PCR για τον υπολογισμό του ιικού τίτλου του στελέχους CAV Real-Time PCR για τη μελέτη της κατανομής των προϊόντων της DOP-PCR ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR Αντίδραση τοποϊσομεράσης (TOPO-TA cloning) Μετασχηματισμός των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων Colony-PCR Επιβεβαίωση της ένθεσης του τμήματος DNA με RFLP ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ Καθαρισμός και διόρθωση των αλληλουχιών Ομοπαράθεση των αλληλουχιών X

11 Στοίχιση των αλληλουχιών Ανάλυση ανασυνδυασμών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MULTIPLEX-PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Εφαρμογή της μεθόδου σε πρότυπα στελέχη EV-B και EV-C Εφαρμογή της μεθόδου σε κλινικά δείγματα Επαλήθευση της ειδικότητας της μεθόδου μέσω αλληλούχησης των προϊόντων Εφαρμογή της μεθόδου σε άγνωστα περιβαλλοντικά δείγματα Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα ENY ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DOP-PCR Αλληλούχηση των προϊόντων της DOP-PCR Real-Time PCR για την μελέτη της κατανομής των προϊόντων της DOP-PCR MULTIPLEX-PCR ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ SABIN ΣΤΕΛΕΧΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Ανίχνευση της ειδικότητας του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου Ανίχνευση ενεργότητας των προτύπων στελεχών Coxsackie A ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ CAV ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV PCR αντιδράσεις για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV Επεξεργασία των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών Ανάλυση των ανασυνδυασμών Ανάλυση της δευτεροταγούς δομής των RNA μορίων στις περιοχές των ανασυνδυασμών ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ DOP-PCR ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΟΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ABSTRACT ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ XI

12 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ: Πίνακας : Νέα ταξινόμηση των εντεροϊών και οι αντίστοιχοι ορότυποί τους... 4 Πίνακας : Πρότυπα στελέχη εντεροϊών Πίνακας : Κλινικά στελέχη διαφόρων εντεροϊών Πίνακας : Κλινικά εμβολιοπροερχόμενα στελέχη Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών σε Sabin στελέχη Πίνακας : Εκκινητές για την ενίσχυση ολόκληρου γονιδιώματος Sabin στελεχών Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 51 Πίνακας : Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην Real-Time PCR Πίνακας : Τα ζεύγη εκκινητών που εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV Πίνακας : Τα ζεύγη εκκινητών που εφαρμόστηκαν για την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των Sabin στελεχών Πίνακας : Τα 4 group των Multiplex-PCR αντιδράσεων Πίνακας : Τα αποτελέσματα της Multiplex-PCR στα πρότυπα στελέχη για κάθε εκκινητικό ζεύγος Πίνακας : Αποτέλεσμα ομοπαράθεσης με BLAST για το δείγμα EP Πίνακας : Αποτέλεσμα της Real-Time PCR στα προϊόντα της DOP-PCR Πίνακας : Ποσοστιαία διαφορά μεταξύ παρατηρούμενου και αναμενόμενου Ct σε σχέση με το μέγεθος του προϊόντος Πίνακας 3.3.1: Συγκεντρωτικά αποτελέσματα των 4 Multiplex-PCR αντιδράσεων Πίνακας 3.4.1: Κινητική ανίχνευσης κλώνου αρνητικής και θετικής πολικότητας ιικού τίτλου 10 5 CCID Πίνακας 3.4.2: Κινητική ανίχνευσης κλώνου αρνητικής και θετικής πολικότητας ιικού τίτλου 1 CCID Πίνακας 3.4.3: Κινητική ανίχνευσης κλώνου αρνητικής και θετικής πολικότητας ιικού τίτλου 10-2 CCID Πίνακας : Έλεγχος της ειδικότητας στο επίπεδο της RT Πίνακας : Έλεγχος της ειδικότητας στο επίπεδο της PCR για τον θετικής και αρνητικής πολικότητας κλώνο Πίνακας : Αποτελέσματα των 9 PCR αντιδράσεων για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV Πίνακας : Συγκεντρωτικός πίνακας των ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 97 XII

13 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ: Εικόνα 1.1.1: Jonas Salk ο δημιουργός του πρώτου εμβολίου (IPV)... 2 Εικόνα : Φυλογενετικό δέντρο Πολιοϊών και των ιών Coxsackie A της ομάδας EV-C.. 5 Εικόνα : Οι 3 άξονες συμμετρίας σε ένα εικοσαεδρικό καψίδιο (Carter & Saunders, 2013)... 6 Εικόνα : Τρισδιάστατη δομή του πολιοϊού τύπου Εικόνα : Δομικά χαρακτηριστικά των πολιοϊών. (Harrison, 2013)... 8 Εικόνα : Η 5 αμετάφραστη περιοχή των πολιοϊών... 9 Εικόνα : Οργάνωση του γενώματος των πολιοϊών Εικόνα : Σύνοψη του κύκλου ζωής του πολιοϊού Εικόνα : Αλληλεπίδραση των πολιοϊών με τον κυτταρικό υποδοχέα Εικόνα : Μοντέλο εισόδου των πολιοϊών στο κύτταρο Εικόνα : Μοντέλα σχηματισμού συμπλόκων έναρξης της μετάφρασης Εικόνα : Πρωτεόλυση της πολυπρωτεΐνης Εικόνα : Ο μηχανισμός αντιγραφής του ιικού RNA Εικόνα : Μοντέλο αλλαγής μεταξύ μετάφρασης και σύνθεσης του (-)RNA κλώνου.. 19 Εικόνα : Μορφογένεση του πολιοϊού Εικόνα 1.4.1: Μοντέλο του Sabin για την παθογένεια των πολιοϊών Εικόνα : Μηχανισμός αλλαγής μήτρας για τον ανασυνδυασμό μεταξύ RNA γενωμάτων Εικόνα 1.7.1: Παγκόσμιος χάρτης που απεικονίζει την κυκλοφορία του άγριου τύπου PV το 1988 και το Εικόνα 1.7.2: Χάρτης των κρουσμάτων πολιομυελίτιδας για το Εικόνα : Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Εικόνα : Πλάκα μικροτιτλοποίησης για τις σειριακές αραιώσεις των δειγμάτων Εικόνα : Δομή του ENTNS1-RT εκκινητή Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση των τύπων και θέσεων ανασυνδυασμού που ανιχνεύονται σε κάθε Group της Multiplex-PCR Εικόνα : Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της Multiplex-PCR Εικόνα 3.2.1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της DOP-PCR με το ζεύγος UG16/HEV C Εικόνα 3.2.2: Σχηματική αναπαράσταση των προϊόντων της DOP-PCR Εικόνα 3.3.1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της Multiplex-PCR για το Group Εικόνα 3.4.1: Ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου σε Sabin CCID Εικόνα 3.4.2: Ανίχνευση του θετικής πολικότητας RNA κλώνου σε Sabin CCID XIII

14 Εικόνα 3.4.3: Ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου σε Sabin 1 1CCID 50 έπειτα από Nested-PCR Εικόνα : Ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου στα πρότυπα στελέχη CAV Εικόνα 3.5.1: Αποτελέσματα της Real-Time PCR για τις γνωστές συγκεντρώσεις του στελέχους Sabin Εικόνα 3.5.2: Πρότυπη καμπύλη δειγμάτων Sabin 1 γνωστών αρχικών συγκεντρώσεων Εικόνα 3.5.3: Αποτελέσματα της Real-Time PCR για τις άγνωστες συγκεντρώσεις του στελέχους CAV Εικόνα : Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πρώτης PCR Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec Εικόνα : Απεικόνιση της δευτεροταγούς δομής της 2A γενωμικής περιοχής Εικόνα : Απεικόνιση της δευτεροταγούς δομής της 2Β γενωμικής περιοχής Εικόνα : Απεικόνιση της ανίχνευσης πιθανών ψευδοκόμβων XIV

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΠΟΛΙΟΜΥΕΛΙΤΙΔΑΣ ΕΜΒΟΛΙΩΝ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΠΟΛΙΟΜΥΕΛΙΤΙΔΑΣ ΕΜΒΟΛΙΩΝ Η πολιομυελίτιδα είναι μια από τις αρχαιότερα γνωστές ασθένειες. Η πρώτη αναφορά της ασθένειας εμφανίζεται σε μια αιγυπτιακή στήλη της 2 ης χιλιετίας π.χ. που απεικόνιζε ένα νεαρό με ατροφικό άκρο (Johnson, 1998). Οι πρώτες κλινικές περιγραφές της πολιομυελίτιδας εντοπίζονται γύρω στο 1800, με αναφορές σε κρούσματα παράλυσης που εκδήλωναν παράλληλα και πυρετό. Η συνεισφορά των Von Heine το 1840 και Medin μεταγενέστερα οδήγησαν στην ονομασία της παραλυτικής πολιομυελίτιδας ως ασθένεια Heine-Medin. Οι Charcot και Joffroy, ήταν οι πρώτοι που περιέγραψαν τις παθολογικές αλλαγές στους πρόσθιους κερατοειδείς κινητικούς νευρώνες της σπονδυλικής στήλης εξαιτίας της πολιομυελίτιδας (Pallansch et al., 2013). Ο 20 ος αιώνας διετέλεσε την αρχή μιας νέας εποχής στην έρευνα γύρω από την πολιομυελίτιδα και άρχισε να γίνεται αντιληπτή η μολυσματική φύση της ασθένειας. Ο Wickman ανακάλυψε την μεταδοτική φύση της πολιομυελίτιδας, τη σημασία στην μετάδοση του πολιοϊού των μολυσμένων ατόμων που δεν εμφάνιζαν συμπτώματα και τον ρόλο της εντερικής μόλυνσης στην παθογένεια της ασθένειας(pallansch et al., 2013). Ο ρόλος του γαστρεντερικού σωλήνα στην είσοδο και εξάπλωση του ιού της πολιομυελίτιδας επιβεβαιώθηκε αργότερα από τον Trask (Trask et al., 1938). Στην κλασσική μελέτη, οι Landsteiner και Popper απέδειξαν την μολυσματική φύση της πολιομυελίτιδας μεταδίδοντας επιτυχώς την κλινική εικόνα και την παθολογία της σε πίθηκους εμβολιάζοντας τους με ομογενοποιημένο ιστό κεντρικού νευρικού συστήματος από ανθρώπους με πολιομυελίτιδα (Pallansch et al., 2013). Παρά την αρχική πρόοδο που είχε σημειωθεί, ένας αριθμός παραβλέψεων και παρανοήσεων αποπροσανατόλισε τις προσπάθειες των επιστημόνων για έλεγχο της ασθένειας. Οι λανθασμένες αντιλήψεις βασίζονταν στην πεποίθηση ότι ο ιός ήταν αποκλειστικά νευρότροπος, ότι ο ρινοφάρυγγας ήταν η κύρια οδός εισόδου του ιού στο ΚΝΣ και ότι ο ιός εξαπλώνονταν στο νευρικό σύστημα πριν την ιαιμία και μέσω του οσφρητικού νεύρου. Επιπρόσθετα, απέτυχαν αρκετές προσπάθειες ανοσοποίησης, με ορισμένες να επιφέρουν καταστροφικά αποτελέσματα (J. R. Paul, 1971). Ως αποτέλεσμα, δημιουργήθηκε ένα κλίμα απαισιοδοξίας στα μέσα του 20 ου αιώνα σχετικά με το ενδεχόμενο ελέγχου της πολιομυελίτιδας, ακόμα και μεταξύ των επιστημόνων που εργάζονταν στον τομέα αυτό. Το 1945, ο Burnet έγραψε χαρακτηριστικά: «Το πρακτικό πρόβλημα της πρόληψης της 1

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΠΟΛΙΟΜΥΕΛΙΤΙΔΑΣ ΕΜΒΟΛΙΩΝ παιδικής παράλυσης δεν έχει λυθεί. Είναι ακόμη αμφίβολο εάν θα μπορέσει να λυθεί ποτέ.» (Burnet, 1945). Μια δεκαετία αργότερα όμως, η ανακάλυψη ότι ο ιός εισέρχονταν μέσω της στοματογαστρικής οδού και ότι η μόλυνση του ΚΝΣ ακολουθούσε την ιαιμία ήταν αρκετά για να τονώσουν τις ελπίδες για αποτελεσματική ανοσοποίηση (Bodian, 1955). Στηριζόμενος σε έρευνες άλλων, ο Enders (Enders et al., 1949) διεξήγαγε μια μελέτη ορόσημο που αποδείκνυε ότι ο πολιοϊός μπορούσε να αναπαραχθεί σε μη-νευρική καλλιέργεια ιστών. Οι επιπτώσεις της μελέτης αυτής είχαν αντίκτυπο σε όλο τον τομέα της ιολογίας καθώς έδειχναν, αρχικά, ότι ο πολιοϊός αναπτύσσονταν σε διάφορες καλλιέργειες ιστών που δεν αντιστοιχούν με τους ιστούς που μολύνονταν κατά τη διάρκεια της ασθένειας και, δεύτερον, ότι ο πολιοϊός κατέστρεφε κύτταρα με συγκεκριμένη κυτταροπαθογόνο δράση. Τεστ οροεξουδετέρωσης έδειξαν ότι ο πολιοϊός φέρει τρείς ορότυπους (Bodian et al., 1949), και ορολογικά τεστ (Aycock, 1928) επιβεβαίωσαν ότι τα περισσότερα μολυσμένα άτομα δεν εκδηλώνουν κλινικά συμπτώματα. Οι έρευνες αυτές οδήγησαν στη δημιουργία ενός σκελετού πάνω στον οποίο στηρίχτηκαν μεταγενέστερες έρευνες για την ανάπτυξη ενός εμβολίου και διασαφήνισαν ένα πλήθος συγκεχυμένων δεδομένων, όπως την φαινομενική παρουσία δευτερευόντων συμπτωμάτων της πολιομυελίτιδας (Pallansch et al., 2013). Εικόνα 1.1.1: Jonas Salk ο δημιουργός του πρώτου εμβολίου (IPV) Διάφορα εμβόλια παράγονταν διαδοχικά, με τα πιο γνωστά να είναι το IPV (Salk inactivated polio vaccine), το οποίο χορηγούταν μέσω της ενδομυϊκής οδού (αδειοδοτήθηκε το 1955 στις ΗΠΑ) και το ζωντανόεξασθενημένο Sabin εμβόλιο OPV (oral polio vaccine) μέσω της στοματικής οδού (αδειοδοτήθηκε το ). Η σημασία των εμβολίων αυτών και των ατόμων που τα παρήγαγαν μπορεί να γίνει αντιληπτή από το γεγονός ότι περισσότεροι Αμερικανοί γνώριζαν το όνομα του Jonas Salk παρά του προέδρου των ΗΠΑ. Ο πραγματικός αντίκτυπος των εμβολίων αυτών θα γίνει αντιληπτός όταν η πολιομυελίτιδα εξαλειφθεί από τον πλανήτη. Η εξάλειψη αναμφίβολα θα δώσει ένα δραματικό τέλος στη βίαιη ιστορία της πολιομυελίτιδας. Η μελέτη των πολιοϊών είχε μια συνεχή σημαντική επιρροή πάνω στον τομέα της μοριακής ιολογίας. Ο πολιοϊός ήταν ο πρώτος ζωικός ιός που κλωνοποιήθηκε αλληλουχήθηκε πλήρως (Kitamura et al., 1981; Racaniello & Baltimore, 1981b), το πρώτο RNA ζωικού ιού του οποίου δημιουργήθηκε ένας μολυσματικός κλώνος (Racaniello & και 2

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Baltimore, 1981a) και ο πρώτος ανθρώπινος ιός που είχε αποτυπωθεί η τρισδιάστατη δομή του μέσω κρυσταλλογραφίας με ακτίνες-χ (Hogle et al., 1985). Το 1989, ο Mendelsohn (Mendelsohn et al., 1989) ταυτοποίησε τον υποδοχέα του πολιοϊού, CD155, οδηγώντας στην γένεση διαγονιδιακών ποντικιών που έφεραν τον υποδοχέα (Koike et al., 1991; Ren et al., 1990) ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Οι πολιοϊοί ανήκουν στην οικογένεια ιών Picornaviridae. Είναι ιοί χωρίς έλυτρο και το γένωμά τους αποτελείται από μονόκλωνο RNA (ssrna) θετικής πολικότητας. Η οικογένεια αυτή των ιών περιλαμβάνει κι άλλους παθογόνους ιούς των ανθρώπων και των θηλαστικών όπως π.χ. ιός της ηπατίτιδας Α και FMDV (foot and mouth disease virus). Το όνομα της οικογένειας αυτής των ιών είναι σύνθετο, περιγράφοντας έτσι το μικρό μέγεθος των ιών (pico), και τον τύπο του νουκλεϊκού οξέος που απαρτίζει το ιικό γένωμα (RNA) Ταξινόμηση των πολιοϊών Η οικογένεια των ιών Picorna αποτελείται από τριάντα ένα γένη: Ampivirus, Aphthovirus, Aquamavirus, Avihepatovirus, Avisivirus, Cardiovirus, Cosavirus, Dicipivirus, Enterovirus, Erbovirus, Gallivirus, Harkavirus, Hepatovirus, Hunnivirus, Kobuvirus, Kunsagivirus, Limnipivirus, Megrivirus, Mischivirus, Mosavirus, Oscivirus, Parechovirus, Pasivirus, Passerivirus, Potamipivirus, Rabovirus, Rosavirus, Sakobuvirus, Salivirus, Sapelovirus, Senecavirus, Sicinivirus, Teschovirus, Torchivirus and Tremovirus (Adams et al., 2016; Knowles et al., 2012). Όλοι οι ιοί της οικογένειας Picorna μολύνουν σπονδυλωτά. Οι πολιοϊοί ανήκουν στο γένος των εντεροϊών και διαχωρίζονται σε τρεις ορότυπους: PV 1, 2 και 3. Οι ιοί Picorna είναι από τους πιο απλούς RNA ιούς, έχοντας ένα ισχυρά δομημένο καψίδιο. Παρ όλο το περιορισμένο γενετικό υλικό και τα δομικά εμπόδια, η εξέλιξη στους ιούς Picorna είχε σαν αποτέλεσμα ένα μεγάλο αριθμό εύκολα διακριτών μελών. Η ποικιλία αυτή έχει καταχωρηθεί αντιγονικά ως ορότυπος. Κάθε ορότυπος συσχετίζεται με την ανοσολογική απόκριση του ανθρώπου ξενιστή, την προστασία από την ασθένεια, τη χρήση των υποδοχέων και, σε μικρότερη κλίμακα, το φάσμα της κλινικής νόσου. Οι συσχετισμοί αυτοί, παρ όλα αυτά, έχουν μόνο μερική σχέση με την αρχική ταξινόμηση των εντεροϊών σε πολιοϊούς, ιούς coxsackie A ή Β και ιούς echo, η οποία έγινε με βάση την βιολογική ενεργότητα και νόσο: ανθρώπινη νόσος του ΚΝΣ με χαλαρή παράλυση (πολιοϊοί) - χαλαρή παράλυση σε νεογνά ποντίκια, ανθρώπινη νόσος του ΚΝΣ και στοματικές φλύκταινες (ιοί 3

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ coxsackie A) σπαστική παράλυση σε νεογνά ποντίκια και ανθρώπινη καρδιακή νόσος και νόσος του ΚΝΣ (ιοί coxsackie B). Ανάμεσα στις ομάδες αυτές, οι ιοί μπορούν να ξεχωρίσουν βάσει της αντιγονικότητας τους όπως αυτή προσδιορίζεται με την βοήθεια αντί-ορών (Pallansch et al., 2013) Το αρχικό σχήμα ταξινόμησης κατέρρευσε με την ταυτοποίηση ιών οροτυπικά ταυτόσημων με γνωστούς ιούς echo που βρέθηκαν να προκαλούν νόσο σε ποντικούς και ανθρώπους. Αυτή και άλλες ανακολουθίες στο σύστημα ταξινόμησης οδήγησε στην αρίθμηση νέων οροτύπων εντεροϊών ξεκινώντας με τον EV68. Αυτές οι αντιγονικές ομαδοποιήσεις, που προσδιορίζουν τον ορότυπο, έγιναν περισσότερο πολύπλοκες καθώς αυξάνονταν ο αριθμός των διαφορετικών ιών. Η διάκριση μεταξύ οροτύπων άρχισε να περιπλέκεται καθώς ανακαλύπτονταν ιοί που σχετίζονταν ελάχιστα αντιγονικά με γνωστούς ορότυπους. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, ο ορότυπος παραμένει μια εντεροϊούς(racaniello, 2013) Εντεροϊοί της Ομάδας C (EV-Cs) Γένος Εντεροϊών Enterovirus A 25 Enterovirus B 63 Enterovirus C 23 Enterovirus D 5 Enterovirus E 4 Enterovirus F 6 Enterovirus G 16 Enterovirus H 1 Enterovirus J 6 Rhinovirus A 80 Rhinovirus B 32 Rhinovirus C 55 Αριθμός Οροτύπων Πίνακας : Νέα ταξινόμηση των εντεροϊών και οι αντίστοιχοι ορότυποί τους (Πηγή: ICTV-2013) ανοσολογική ιδιότητα που διαχωρίζει τους διαφορετικούς Το είδος των εντεροϊών της ομάδας C αποτελείται από 23 διαφορετικούς ορότυπους. Οι ορότυποι αυτοί χωρίζονται σε τρεις διακριτές υποομάδες: Τους Πολιοϊούς, με τα αντίστοιχα εμβολιακά στελέχη σε παρένθεση: PV-1(Sabin 1), PV-2(Sabin 2), PV-3 (Sabin 3) Τους ιούς Coxsackie A: CAV1, CAV11, CAV13, CAV17, CAV19, CAV20, CAV21, CAV22, CAV24 Και τους νέους εντεροϊούς που έχουν ταυτοποιηθεί και ταξινομηθεί με βάση το νέο σύστημα ταξινόμησης: EV 95, EV 96, EV 99, EV 102, EV 104, EV 105, EV 109, EV 113, EV 116, EV 117, EV 118 4

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Όπως φαίνεται και στο φυλογενετικό δέντρο της εικόνας οι πολιοϊοί εμφανίζουν μεγάλη συγγένεια με τους ιούς Εικόνα : Φυλογενετικό δέντρο Πολιοϊών και των ιών Coxsackie A της ομάδας EV-C. Το δέντρο αυτό δημιουργήθηκε βάσει ολόκληρου του γονιδιώματος των πρότυπων στελεχών (Tapparel et al., 2009) Coxsackie A της ομάδας C. Η αυξημένη συγγένεια μεταξύ των πολιοϊών και των συγκεκριμένων ιών Coxsackie A μεταφράζεται και ως αυξημένη πιθανότητα για εμφάνιση ετεροτυπικών ανασυνδυασμών μεταξύ των δυο ιών, καθώς όπως θα αναλυθεί και παρακάτω, η αυξημένη ομολογία μεταξύ δυο γενωμάτων είναι μια από τις απαραίτητες συνθήκες για την δημιουργία του ανασυνδυασμού. Η αυξημένη αυτή πιθανότητα έχει επιβεβαιωθεί με την ανίχνευση και ταυτοποίηση πολλών ετεροτυπικών ανασυνδυασμών μεταξύ πολιοϊών και ιών Coxsackie A (Combelas et al., 2011) Δομή και αντιγονικότητα των ιικών σωματιδίων Τα ιοσωμάτια του πολιοϊού είναι σφαιρικά με διάμετρο περίπου 30 nm. Τα σωμάτια είναι απλά και αποτελούνται από πρωτεϊνικό περίβλημα που περιβάλει το γυμνό RNA. Τα ιοσωμάτια δεν έχουν λιπιδικό έλυτρο και η μολυσματικότητά τους είναι μικρή σε οργανικούς διαλύτες. Οι πολιοϊοί είναι σταθεροί σε όξινο περιβάλλον και διατηρούν τη μολυσματικότητά τους σε τιμές ph 3 και μικρότερες. Τα καψίδια των πολιοϊών απαρτίζονται από τέσσερις δομικές πρωτεΐνες: VP1, VP2, VP3 και VP4. Σύμφωνα με μελέτες των Caspar και Klug πάνω στις αρχές δόμησης των ιών (Caspar & Klug, 1962), ο καλύτερος τρόπος για να συναρμολογηθεί ένα κέλυφος με μη ταυτόσημες υπομονάδες είναι να διαταχθούν οι πρωτεΐνες με εικοσαεδρική συμμετρία. Ένα εικοσάεδρο είναι ένα στερεό σώμα που αποτελείται από είκοσι τριγωνικές πλευρές και δώδεκα κορυφές. Ο μικρότερος αριθμός υπομονάδων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι 60. Χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη τριών αξόνων συμμετρίας. Στο κέντρο των πενταμερών βρίσκεται ο πενταμερής (5Χ) άξονας συμμετρίας, ενώ μεταξύ των πενταμερών 5

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ βρίσκονται ο τριμερής (3Χ) και ο διμερής (2Χ) άξονας συμμετρίας. Τα αποτελέσματα μελετών περίθλασης ακτινών Χ, ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και βιοχημικών Εικόνα : Οι 3 άξονες συμμετρίας σε ένα εικοσαεδρικό καψίδιο (Carter & Saunders, 2013) μελετών στα ιοσωμάτια και τα προϊόντα διαχωρισμού τους οδήγησε στην υπόθεση ότι τα καψίδια των πολιοϊών αποτελούνται από 60 δομικές πρωτεΐνες διατεταγμένες σε εικοσαεδρική κατανομή(rueckert et al., 1969). Η αντίληψή μας για την δομή του καψιδίου των πολιοϊών έκανε ένα μεγάλο άλμα το 1985 όταν και καθορίστηκαν μέσω κρυσταλλογραφίας ακτινών Χ οι ατομικές δομές του πολιοϊού τύπου 1 (Hogle et al., 1985). Η βασική δομική μονάδα του καψιδίου των πολιοϊών είναι το πρωτομερές (P1), το οποίο περιέχει ένα αντίγραφο από κάθε δομική πρωτεΐνη VP1, VP2, VP3 και VP4. Το κέλυφος σχηματίζεται από την VP1 έως τη VP3 και η VP4 υπάρχει στην εσωτερική επιφάνεια. Η VP1, VP2 και VP3 δεν έχουν καμία αλληλουχική ομολογία, ωστόσο και οι τρείς πρωτεΐνες έχουν την ίδια τοπολογία: σχηματίζουν ένα αντιπαράλληλο οκταπλό πλέγμα β - βαρελιού. Η περιοχή αυτή είναι μια γωνιακή δομή που σχηματίζεται από δύο αντιπαράλληλα β -φύλλα. Το ένα β -φύλλο σχηματίζει τον «τοίχο» της γωνίας και το δεύτερο, που έχει μια κάμψη στο κέντρο, σχηματίζει τόσο τον «τοίχο» όσο και το «πάτωμα» της γωνίας. Το σχήμα αυτό διευκολύνει το πακετάρισμα των δομικών μονάδων για να σχηματίσουν ένα πυκνό και άκαμπτο πρωτεϊνικό περίβλημα. Το πακετάρισμα των περιοχών των β -βαρελιών ενισχύεται από ένα δίκτυο επαφών πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στο εσωτερικό του καψιδίου, συγκεκριμένα γύρω από τον πενταπλό άξονα. Το δίκτυο αυτό, που σχηματίζεται από τις Ν-τελικές προεκτάσεις των VP1, VP2, VP3 και VP4, είναι απαραίτητο για την σταθερότητα του ιοσωματίου. Η VP4 διαφέρει σημαντικά από τις άλλες τρεις πρωτεΐνες στο ότι παρουσιάζει μια εκτεταμένη διαμόρφωση. Η πρωτεΐνη αυτή είναι παρόμοια στη θέση και τη διαμόρφωση με τις Ν-τελικές αλληλουχίες των VP1 και VP3 και λειτουργεί σαν μια αποσπώμενη Ν-τελική επέκταση της VP2 παρά σαν μια ανεξάρτητη πρωτεΐνη του καψιδίου. Οι κύριες δομικές διαφορές μεταξύ των VP1, VP2 και VP3 οφείλονται στους βρόγχους που συνδέουν τα β -strands και τις Ν- και C-τελικές αλληλουχίες που εξέχουν της περιοχής του β -βαρελιού. Αυτές οι αμινοξικές αλληλουχίες δίνουν σε κάθε ιό Picorna την ξεχωριστή μορφολογία και αντιγονικότητα. Τα C-τελικά άκρα βρίσκονται στην επιφάνεια 6

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ του ιοσωματίου και τα N-τελικά στο εσωτερικό του, δείχνοντας ότι προκύπτουν σημαντικές αναδιατάξεις του P1 προδρόμου κατά τον πρωτεολυτικό τεμαχισμό. Τα καρβοξυτελικά άκρα των τριών πρωτεϊνών VP1, VP2 και VP3 καθώς και οι περισσότερες από τις θηλιές τους περιέχουν τις κύριες αντιγονικές θέσεις (N-Ags) του ιού. Υπάρχουν τέσσερις αντιγονικές θέσεις, οι N-AgI, N-AgII, N-AgIIIA και N-AgIIIB, (Pfister et al., 1999). Η N-AgI είναι συνεχόμενη και αποτελείται από τα αμινοξέα 97, της VP1 Η N-AgII είναι διακοπτόμενη και αποτελείται από τα αμινοξέα της VP1 και τα αμινοξέα , 270 της VP2. Η N-AgIIIA αποτελείται από τα αμινοξέα 58-60, 66, 70 και73 της VP3 καθώς και 236 της VP2 και της VP1. H N-AgIIIB από τα αμινοξέα και 144 της VP3 και το αμινοξύ 72 της VP2. Ως προς την επιφάνεια του ιοσωματίου ανάλυση των δομών των πολιοϊών αποκάλυψε ότι εμφανίζουν μια συρρικνωμένη τοπογραφία. Μια προεξοχή (plateau), με σχήμα αστεριού, βρίσκεται στον πενταπλό άξονα συμμετρίας, περιβαλλόμενος από μία αυλάκωση (canyon) και ακόμη μια προεξοχή στον τριπλό άξονα συμμετρίας. Αρχικά προτάθηκε ότι η αύλακα αποτελεί την θέση πρόσδεσης στους υποδοχείς, υπόθεση η οποία αποδείχθηκε σωστή στη συνέχεια. Στο εσωτερικό των ιοσωματίων, στον πενταπλό άξονα συμμετρίας, τα Ν-τελικά άκρα πέντε μορίων της VP3 πρωτεΐνης σχηματίζουν ένα κυλινδρικό παράλληλο β -φύλλο. Η δομή αυτή περιβάλλεται από πέντε τριπλά πλέγματα β - φύλλων σχηματισμένα από το Ν-τελικό άκρο των VP4 και VP1. Η ομάδα του μυριστικού οξέος συνδεδεμένη στο Ν-άκρο της VP4 επάγει την αλληλεπίδραση μεταξύ των δυο αυτών δομών (Chow et al., 1987). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πενταμερών σταθεροποιούνται από ένα πλέγμα β -φύλλων, που συντίθεται από τέσσερα β -πλέγματα του VP3 βαρελιού και ένα πλέγμα από το Ν-άκρο της VP1 που περιβάλλει ένα διπλό πλέγμα β -φύλλου του Ν- άκρου της VP2 ενός γειτονικού πενταμερούς (Filman et al., 1989). Εικόνα : Τρισδιάστατη δομή του πολιοϊού τύπου 1, όπου φαίνονται η αύλακα και η προεξοχή που σχηματίζουν οι δομικές πρωτεΐνες (Hogle et al., 1985) 7

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Εικόνα : Δομικά χαρακτηριστικά των πολιοϊών. (Harrison, 2013) Α. Η οργάνωση των δομικών πρωτεϊνών στο γένωμα του ιού. Β. Σχηματική αναπαράσταση του καψιδίου του πολιοϊού, όπου φαίνεται το πακετάρισμα των VP1, VP2 και VP3 πρωτεϊνών. Η VP4 βρίσκεται στο εσωτερικό του καψιδίου. C. Τρισδιάστατα μοντέλα των δομικών πρωτεϊνών VP1, VP2, VP3 και VP4. D. Διάγραμμα που απεικονίζει το πώς τα οχτώ β -πλέγματα κάθε πρωτεΐνης σχηματίζουν μια σφηνοειδή δομή με βρόγχους που συνδέουν τα πλέγματα μεταξύ τους. Ε. Διάγραμμα τύπου ribbon των VP1, VP2 και VP3 όπου φαίνεται η κοινή δομή β -βαρελιού. Έχει προταθεί ότι τα καψίδια των Picorna ιών σταθεροποιούνται μέσω αλληλεπιδράσεων με το γενωμικό RNA, πρόταση βασιζόμενη σε μελέτες του ιού bean pod, ο οποίος σχετίζεται με τους ιούς Picorna. Οι πληροφορίες που είναι διαθέσιμες σχετικά με την διάταξη του RNA των ιών Picorna είναι ελάχιστες. Στην ατομική δομή του πολιοϊού P2, έχει παρατηρηθεί ότι οι βάσεις του RNA συσσωρεύονται με συντηρημένα αρωματικά κατάλοιπα της VP4 (Lentz et al., 1997). Η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην σταθερότητα του καψιδίου ή την απέκδυση. 8

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Οργάνωση του ιικού γενώματος Το γένωμα των πολιοϊών είναι ένα μονόκλωνο θετικής πολικότητας RNA. Το ιικό RNA είναι μολυσματικό καθώς μεταφράζεται κατά την είσοδό του στο κύτταρο με σκοπό να παράγει όλες τις ιικές πρωτεΐνες που απαιτούνται για την αναπαραγωγή του ιού. Το γενωμικό RNA των πολιοϊών είναι μοναδικό επειδή είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο στο 5 άκρο με μια πρωτεΐνη που ονομάζεται VPg (Virion Protein, genome linked) (Flanegan et al., 1977; Y. F. Lee et al., 1977). Η VPg είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με το 5 -ουριδυλιωμένο τμήμα του ιικού RNA με δεσμό Ο 4 -(5 -ουριδύλιο)-τυροσίνης. Η VPg δεν είναι απαραίτητη για την μόλυνση κυττάρων από τους πολιοϊούς. Εάν αφαιρεθεί από το ιικό RNA με πρωτεϊνάση, δεν παρατηρείται μείωση της ειδικής μολυσματικότητας του ιού. Το mrna των πολιοϊών διαφέρει από το ιικό RNA μόνο στην έλλειψη της VPg. Τα ιικά mrna που αλληλεπιδρούν με τα κυτταρικά ριβοσώματα δεν φέρουν τη VPg πρωτεΐνη, αλλά περιέχουν μόνο ουριδινο-5 - φωσφορικό (pu) στα 5 άκρα τους (Nomoto, Kitamura, et al., 1977; Pettersson et al., 1977). Η αφαίρεση της VPg από το ιικό RNA καταλύεται από μια πρωτεΐνη του ξενιστή που ονομάζεται ένζυμο διαχωρισμού (Ambros et al., 1978). Η VPg βρίσκεται στις νεοσυντιθέμενες RNA αλυσίδες του αντιγραφικού ενδιάμεσου RNA και στα αρνητικής πολικότητας RNAs, κάτι που οδήγησε στην ανακάλυψη ότι η VPg είναι ένας εκκινητής για τη σύνθεση του RNA (Nomoto, Detjen, et al., 1977; Pettersson et al., 1978). Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής Εικόνα : Η 5 αμετάφραστη περιοχή των πολιοϊών μαζί με το IRES το οποίο φαίνεται σε μεγέθυνση (Carter & Saunders, 2013) αλληλουχίας απεκάλυψε αρχικά ότι οι 5 μη-κωδικές περιοχές των πολιοϊών είναι μακριές και υψηλά δομημένες. Η περιοχή αυτή του γονιδιώματος περιέχει αλληλουχίες που ελέγχουν την αντιγραφή και τη μετάφραση του γενώματος. Η 5 μηκωδική περιοχή περιέχει την εσωτερική ριβοσωμική θέση εισόδου (IRES-Internal Ribosome Entry Site) που κατευθύνει τη μετάφραση των mrna με εσωτερική σύνδεση στα ριβοσώματα (Racaniello, 2013). 9

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Η 3 μη-κωδική περιοχή των πολιοϊών είναι μικρή και φέρει επίσης μια δευτεροταγή δομή, που εμπλέκεται στον έλεγχο της σύνθεσης του ιικού RNA (Jacobson et al., 1993). Ωστόσο, δεν απαιτείται ολόκληρη η 3 μη-κωδική περιοχή των πολιοϊών για τη μόλυνση των κυττάρων (Brown et al., 2005; Todd et al., 1997). Τόσο το ιικό RNA όσο και το mrna των πολιοϊών φέρει μια πολύ(α) ουρά (Y. Yogo & Wimmer, 1972). Το αρνητικής πολικότητας RNA φέρει μια 5 πολύ(u) ουρά, η οποία αντιγράφεται για να σχηματίσει την πολύ(α) του θετικού κλώνου (Yoshiaki Yogo et al., 1974). Ιικό RNA από το οποίο έχει αφαιρεθεί η πολύ(α) ουρά δεν είναι πια μολυσματικό (Spector & Baltimore, 1974). Τα αποτελέσματα βιοχημικών μελετών σε κύτταρα μολυσμένα με πολιοϊούς προέβλεψαν την παρουσία ενός μοναδικού και μεγάλου ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) στο ιικό RNA, το οποίο επεξεργάζεται στη συνέχεια για να σχηματίσει τις μεμονωμένες ιικές πρωτεΐνες (Summers & Maizel, 1968). Η υπόθεση αυτή επαληθεύτηκε όταν καθορίστηκε η νουκλεοτιδική αλληλουχία του γενώματος των πολιοϊών, κάτι που αποκάλυψε ότι το ιικό RNA κωδικοποιεί ένα μοναδικό ORF (Kitamura et al., 1981; Racaniello & Baltimore, 1981b). Η αρχική πολυπρωτεΐνη τεμαχίζεται κατά την μετάφραση, έτσι ώστε το πλήρες προϊόν να μην εμφανίζεται. Ο τεμαχισμός γίνεται από πρωτεϊνάσες που κωδικοποιούνται από το ιικό γένωμα για να αποδώσουν στο τέλος 11 με 12 τελικά προϊόντα τεμαχισμού. Μερικά από τα πρόδρομα ατεμάχιστα μόρια έχουν επίσης ορισμένες λειτουργίες κατά την αντιγραφή. Εικόνα : Οργάνωση του γενώματος των πολιοϊών. Πάνω: διάγραμμα του ιικού RNA γενώματος, με την VPg πρωτεΐνη στο 5 άκρο, το 5 UTR, τα γονίδια των πρωτεϊνών, την 3 UTR και την πολύ(α) ουρά. Κάτω: Ο τεμαχισμός της αρχικής πολυπρωτεΐνης αρχικά σε τρεις περιοχές Ρ1,Ρ2 και Ρ3, στη συνέχεια στα ενδιάμεσα των ιικών πρωτεϊνών και τέλος στις τελικές πρωτεΐνες του ιού (Racaniello, 2013) 10

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Η πολυπρωτεΐνη χωρίζεται σε τρείς περιοχές: Ρ1, Ρ2 και Ρ3. Η Ρ1 περιοχή κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες του ιικού καψιδίου, ενώ οι Ρ2 και Ρ3 περιοχές κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην περαιτέρω πρωτεϊνική επεξεργασία (2 Αpro, 3C pro, 3CD pro ) και την αντιγραφή του γενώματος (2Β, 2C, 3AB, 3B VPg, 3CD pro, 3D pol )(Racaniello, 2013) 1.3. ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Η αντιγραφή των πολιοϊών γίνεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Το πρώτο βήμα είναι η σύνδεση σε ένα κυτταρικό υποδοχέα. Το RNA τότε απεκδύεται, μια διαδικασία που περιλαμβάνει δομικές αλλαγές στο καψίδιο. Όταν εισέλθει το θετικής πολικότητας ιικό RNA στο κυτταρόπλασμα, μεταφράζεται με σκοπό να παραχθούν ιικές πρωτεΐνες απαραίτητες για την αντιγραφή του ιικού γενώματος και την παραγωγή νέων ιοσωματίων. Οι ιικές πρωτεΐνες συνθέτονται από μια πρόδρομη πολυπρωτεΐνη, η οποία τεμαχίζεται κατά την σύνθεσή της. Οι τεμαχισμοί γίνονται κυρίως από δύο ιικές πρωτεϊνάσες: την 2A pro και την 3C pro ή 3CD pro. Μεταξύ των πρωτεϊνών που συντίθενται είναι και οι ιικές RNAεξαρτώμενες RNA πολυμεράσες και οι βοηθητικές πρωτεΐνες οι οποίες απαιτούνται για την αντιγραφή του γενώματος και τη σύνθεση του mrna. Το πρώτο βήμα της αντιγραφής του γενώματος είναι η αντιγραφή του θετικού RNA κλώνου έτσι ώστε να σχηματιστεί ένας ενδιάμεσος αρνητικός κλώνος, το βήμα αυτό ακολουθείται από την παραγωγή επιπρόσθετων θετικών κλώνων. Τα γεγονότα αυτά συμβαίνουν σε μικρά μεμβρανικά κυστίδια που επάγονται από αρκετές ιικές πρωτεΐνες. Όταν πλέον ο αριθμός των πρωτεϊνών του καψιδίου είναι αρκετός, αρχίζει η καψιδίωση. Η πρόδρομη πρωτεΐνη Ρ1 τεμαχίζεται ώστε να παράγει ένα ανώριμο πρωτομερές, το οποίο στη συνέχεια συγκροτείται σε πενταμερή. Τα νέο-συντεθειμένα, θετικής πολικότητας RNA συνδέονται στα πενταμερή και σχηματίζουν το μολυσματικό ιό (Racaniello, 2013). Ο χρόνος που απαιτείται για έναν πλήρη κύκλο ενός πολιοϊού ποικίλλει από 5 έως 10 ώρες, κάτι που εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως η θερμοκρασία, το ph, το κύτταρο ξενιστής και η πολυπλοκότητα της μόλυνσης (Racaniello, 2013). Τα στάδια του κύκλου ζωής που περιγράφηκαν πιο πάνω αναλύονται στη συνέχεια: 11

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Εικόνα : Σύνοψη του κύκλου ζωής του πολιοϊού: (De Jesus, 2007) Σύνδεση σε κυτταρικό υποδοχέα (1) και απέκδυση του ιικού γενώματος (2) Αφαιρείται η VPg από το ιικό RNA, το οποίο στη συνέχεια μεταφράζεται (3) Η πολυπρωτεΐνη τεμαχίζεται κατά τη σύνθεσή της και παράγονται οι μεμονωμένες ιικές πρωτεΐνες (4) Η σύνθεση του RNA γίνεται σε μεμβρανικά κυστίδια. Ο ιικός (+) RNA κλώνος αντιγράφεται από τις ιικές RNA πολυμεράσες για να σχηματιστούν πλήρους μήκους (-) RNA κλώνοι (5), οι οποίοι αντιγράφονται στη συνέχεια για να παραχθεί επιπρόσθετο (+) RNA (6) Στα αρχικά στάδια της μόλυνσης, ο νέο-συντεθειμένος (+) RNA κλώνος μεταφράζεται για να παράγει επιπρόσθετες ιικές πρωτεΐνες (7) Στα τελευταία στάδια της μόλυνσης, οι (+) κλώνοι εισέρχονται στο μορφογενετικό μονοπάτι (8) Τα νέο-συντεθειμένα ιικά σωμάτια απελευθερώνονται από το κύτταρο με λύση (9). 12

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Προσκόλληση στον κυτταρικό υποδοχέα και είσοδος του ιού στο κύτταρο. Οι πολιοϊοί ξεκινούν τη μόλυνση των κυττάρων με τη σύνδεσή τους σε έναν υποδοχέα της μεμβράνης του κυττάρου ξενιστή. Η φύση των υποδοχέων αυτών παρέμενε άγνωστη μέχρι το 1989 που ταυτοποιήθηκε ο υποδοχέας των πολιοϊών (Mendelsohn et al., 1989). Πολλοί τύποι μορίων κυτταρικής επιφάνειας λειτουργούν ως κυτταρικοί υποδοχείς για τους ιούς. Συγκεκριμένα για τους πολιοϊούς ο κυτταρικός υποδοχέας είναι ο CD155 ή PVR (poliovirus receptor). Η κλωνοποίηση του γονιδίου του υποδοχέα των πολιοϊών απεκάλυψε ότι ο υποδοχέας είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη και μέλος της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, με τρείς εξωκυτταρικές Ig-like περιοχές: μια ακραία μεμβρανική τύπου-v περιοχή ακολουθούμενη από δύο τύπου C2 περιοχές (εικόνα ). Αποτελέσματα τριών διαφορετικών πειραμάτων έδειξαν ότι η πρώτη Ig-like περιοχή είναι η περιοχή που φέρει τη θέση σύνδεσης των πολιοϊών. Μοντέλα των συμπλόκων πολιοϊών- PVR που παρήχθησαν από δεδομένα κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας δείχνουν ότι η πρώτη περιοχή έρχεται σε επαφή με την επιφάνεια του ιού. Ορθόλογα του pvr γονιδίου βρίσκονται στα γονιδιώματα ενός αριθμού θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένου και αυτών που δεν είναι ευάλωτα σε μολύνσεις πολιοϊών (Ida- Β Εικόνα : Αλληλεπίδραση των πολιοϊών με τον κυτταρικό υποδοχέα. Α: μοντέλο του PVR όπου φαίνονται οι Ig-like περιοχές. Ο υποδοχέας έρχεται σε επαφή με τον ιό μόνο μέσω της περιοχής 1 (Belnap et al., 2000). Β: Αναδημιουργία εικόνας του πολιοϊού τύπου 1 και η διαλυτή μορφή του PVR, απουσία των διαμεμβρανικών και κυτταροπλασματικών περιοχών. Υπάρχουν 60 θέσεις πρόσδεσης σε κάθε ιικό καψίδιο. Τα σύμπλοκα παρήχθησαν με κορεσμένη ποσότητα PVR και όλες οι θέσης σύνδεσης του καψιδίου είναι κατειλημμένες (Belnap et al., 2000). 13

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Hosonuma et al., 2003). Η αμινοξική αλληλουχία της περιοχής 1 του PVR ποικίλει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των μη-ευάλωτων θηλαστικών, ειδικά στις περιοχές που είναι γνωστό ότι έρχονται σε επαφή με τους πολιοϊούς. Η απουσία θέσης σύνδεσης πολιοϊών σε αυτά τα μόρια PVR εξηγεί γιατί η μόλυνση των πολιοϊών είναι περιορισμένη στους πίθηκους. Οι αύλακες στο καψίδιο των πολιοϊών είναι οι θέσεις αλληλεπίδρασης με τους κυτταρικούς υποδοχείς. Μεταλλάξεις στα αμινοξέα που σχηματίζουν την αύλακα μπορούν να αλλάξουν την συγγένεια σύνδεσης με τους υποδοχείς (Colston & Racaniello, 1994, 1995; Harber et al., 1995; Liao & Racaniello, 1997). Όπως φαίνεται και στην εικόνα τα μοντέλα αλληλεπίδρασης των ιών με τους υποδοχείς τους έδειξαν ότι μόνο η περιοχή 1 του PVR διεισδύει στην αύλακα. Αρχικά επικρατούσε η άποψη ότι οι αύλακες των πολιοϊών ήταν πολύ βαθιές και στενές για να επιτρέψουν τη διείσδυση στα μόρια αντισωμάτων, τα οποία περιέχουν παρακείμενες περιοχές ανασοσφαιρινών (Rossmann, 1989). Αυτός ο φυσικός φραγμός πιστεύονταν ότι έκρυβε κρίσιμα αμινοξέα για την δέσμευση των υποδοχέων από το ανοσοποιητικό σύστημα. Ωστόσο, έπειτα από μελέτες φαίνεται ότι το σχήμα της αύλακας των πολιοϊών δεν παίζει ενδεχομένως κάποιο ρόλο στην απόκρυψη του ιού από το ανοσοποιητικό σύστημα (Racaniello, 2013). Η αλληλεπίδραση του πολιοϊού με τον υποδοχέα του οδηγεί σε μείζονες δομικές αλλαγές του ιού. Τα επακόλουθα σωματίδια που ονομάζονται altered ή σωμάτια Α, περιέχουν το ιικό RNA αλλά έχουν χάσει την εσωτερική πρωτεΐνη του καψιδίου VP4. Επιπροσθέτως, το Ν-άκρο της VP1, που συνήθως βρίσκεται στο εσωτερικό του καψιδίου, βρίσκεται πλέον στην επιφάνεια του σωματίου Α (Fricks & Hogle, 1990). Η αλληλουχία αυτή της VP1 είναι υδροφοβική και τα σωμάτια Α έχουν μια αυξημένη συγγένεια προς τις μεμβράνες σε σχέση με τα ιοσωμάτια. Το λιπόφιλο Ν-άκρο της VP1 εισέρχεται στη συνέχεια στην κυτταρική μεμβράνη, σχηματίζοντας έναν πόρο μέσω του οποίου το ιικό RNA μπορεί να μεταφερθεί στο κυτταρόπλασμα. Το RNA δεν είναι γνωστό εάν εισέρχεται στο Εικόνα : Μοντέλο εισόδου των πολιοϊών στο κύτταρο. Το αρχικό ιοσωμάτιο δεσμεύεται στον PVR και υφίσταται μια αλλαγή στην διαμόρφωση επαγόμενη από τον υποδοχέα, η οποία οδηγεί στην παραγωγή των τροποποιημένων σωμάτιων Α. Το ιικό RNA που φαίνεται σαν καμπυλωτή γραμμή εξέρχεται από το σωμάτιο από την πλασματική μεμβράνη ή διαμέσω των ενδοσωμάτων (Racaniello, 2013). 14

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ κυτταρόπλασμα από την κυτταρική μεμβράνη ή από την μεμβράνη των ενδοσωμάτων (ενδοκύττωση). Είναι όμως σίγουρο ότι η ενδοκύττωση από μόνη της δεν μπορεί να οδηγήσει στην απέκδυση του πολιοϊού, καθώς οι αλλαγές στην στερεοδιαμόρφωση του πολιοϊού που οδηγούν στην απέκδυσή του επάγονται από τον PVR (Racaniello, 2013). Δεν είναι γνωστό εάν η VP4 που απελευθερώνεται από το ιικό καψίδιο εγκαταλείπει το κύτταρο ή συμμετέχει στο σχηματισμό του πόρου. Είναι όμως ξεκάθαρο ότι η πρωτεΐνη αυτή απαιτείται στα αρχικά στάδια της εισόδου του ιού στο κύτταρο. Ένας ιός που φέρει μετάλλαξη στο 28 ο αμινοξύ της VP4 μπορεί να συνδεθεί σε κύτταρα και να μετατραπεί σε σωμάτιο Α, αλλά αναστέλλεται σε επακόλουθο στάδιο κατά την είσοδο του ιού (Moscufo et al., 1993). Μεταλλάξεις στην ίδια θέση της VP4 μειώνουν την αγωγιμότητα του πόρου και της μετατόπισης του ιικού RNA, οδηγώντας στην πεποίθηση ότι η VP4 διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό του πόρου (Racaniello, 2013) Μετάφραση του ιικού RNA και επεξεργασία της ιικής πολυπρωτεΐνης Κατά την είσοδό του στο κυτταρόπλασμα το θετικής πολικότητας RNA πρέπει να μεταφραστεί καθώς δεν μπορεί να αντιγραφεί από κάποια κυτταρική RNA πολυμεράση και δεν έχει εισέλθει στο κύτταρο κανένα ιικό ένζυμο του καψιδίου. Το θετικής πολικότητας RNA δεν φέρει δομές 5 -καλύπτρας, είναι όμως ομοιοπολικά συνδεδεμένο με την VPg πρωτεΐνη, η οποία αφαιρείται κατά την είσοδο του RNA στο κύτταρο (Ambros & Baltimore, 1980). Η αλληλούχηση του θετικού κλώνου του πολιοϊού αποκάλυψε μια αμετάφραστη περιοχή 741 νουκλεοτιδίων στο 5 άκρο που περιέχει εφτά AUG κωδικόνια (Kitamura et al., 1981; Racaniello & Baltimore, 1981b). Έτσι διαπιστώθηκε ότι τα ριβοσώματα δεν ανιχνεύουν τις 5 -αμετάφραστες περιοχές, αλλά δεσμεύονται σε μια εσωτερική αλληλουχία. Η αλληλουχία αυτή που προάγει τη σύνδεση με την 40S ριβοσωμική υπομονάδα ονομάστηκε εσωτερική θέση εισόδου του ριβοσώματος IRES (Internal Ribosome Entry Site). Εικόνα : Μοντέλα σχηματισμού συμπλόκων έναρξης της μετάφρασης. Πάνω φαίνεται η 5 -καλύπτρα- εξαρτώμενη έναρξη ενώ κάτω φαίνεται η IRESεξαρτώμενη έναρξη της μετάφρασης. Το eif3-40s σύμπλοκο στρατολογείται στο RNA μέσω αλληλεπίδρασης του eif4g με το IRES (Racaniello, 2013). 15

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Τα IRES των ιών έχουν κατηγοριοποιηθεί σε πέντε ομάδες με βάση ένα αριθμό κριτηρίων όπως: η αρχική αλληλουχία, η δευτεροταγής δομή, η τοποθεσία του κωδικονίου έναρξης και η ενεργότητα σε διάφορα κύτταρα. Οι πολιοϊοί φέρουν IRES που ανήκει στην πρώτη ομάδα. Στα τύπου Ι IRES το κωδικόνιο έναρξης βρίσκεται 50 με 100 νουκλεοτίδια πριν το 3 -άκρο του IRES. Η έναρξη της μετάφρασης μέσω του τύπου Ι IRES περιλαμβάνει τη σύνδεση της 40S ριβοσωμικής υπομονάδας στο IRES και την ανίχνευση του κωδικονίου έναρξης. Η 40S υπομονάδα μπορεί να συνδεθεί απ ευθείας στο RNA, ή στρατολογείται στο IRES μέσω αλληλεπίδρασης με μεταφραστικές πρωτεΐνες έναρξης. Στην δεύτερη περίπτωση, η 40S υπομονάδα στρατολογείται στο IRES μέσω αλληλεπίδρασης με την eif3 συνδεδεμένη στην C- τελική περιοχή της eif4g, που συνδέεται απευθείας στο IRES (εικόνα ). Οι πρωτεΐνες των πολιοϊών συντίθενται από τη μετάφραση ενός μοναδικού, μεγάλου μήκους ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) που κωδικοποιείται από το θετικής πολικότητας ιικό RNA γένωμα και ακολουθεί τεμαχισμός της πολυπρωτεΐνης από πρωτεϊνάσες που κωδικοποιούνται από τον ιό. Η στρατηγική αυτή επιτρέπει τη σύνθεση πολλαπλών πρωτεϊνικών προϊόντων από ένα μοναδικό RNA. Η πολυπρωτεΐνη δεν είναι εμφανής στα μολυσμένα κύτταρα καθώς επεξεργάζεται κατά τη σύνθεσή της. Η πρόδρομη πολυπρωτεΐνη επεξεργάζεται συμμεταφραστικά από ενδομοριακές αντιδράσεις (in cis) που ονομάζονται αρχικοί τεμαχισμοί, ακολουθούμενοι από δευτερεύουσες επεξεργασίες in cis ή in trans (διαμοριακές). Το γένωμα των πολιοϊών κωδικοποιεί για δυο πρωτεϊνάσες: την 2Α pro και την 3C pro ή 3CD pro. Σε μολυσμένα κύτταρα με πολιοϊό ο αρχικός τεμαχισμός της πολυπρωτεΐνης μεταξύ Ρ1 και Ρ2 γίνεται από την 2Α pro. Στην πρόδρομη πρωτεΐνη των πολιοϊών η θέση τεμαχισμού για την 2Α pro είναι μεταξύ της τυροσίνης και της γλυκίνης. Η 3C pro είναι η πρωτεϊνάση που κάνει τον αρχικό τεμαχισμό μεταξύ 2C και 3Α περιοχής. Σε αντίθεση με την 2Α pro, η 3C pro τεμαχίζει και σε δεύτερο στάδιο τα Ρ1 και Ρ2 πρόδρομα μόρια. Η 3C pro των πολιοϊών τεμαχίζει μόνο διπεπτίδια Gln-Gly. Τόσο η 3C pro όσο και η 2Α pro είναι ενεργές στο πολυπεπτίδιο κατά τη σύνθεσή του και απελευθερώνονται από την πολυπρωτεΐνη με αυτό-τεμαχισμό. Αφού απελευθερωθούν οι πρωτεϊνάσες, τεμαχίζουν την πολυπρωτεΐνη in trans. Ο αρχικός τεμαχισμός στον καταρράκτη επεξεργασίας της πολυπρωτεΐνης ξεκινάει με την απελευθέρωση του Ρ1 πρόδρομου από την συντιθέμενη Ρ2-Ρ3 μέσω της 2Α pro. Στη συνέχεια η 3CD pro απελευθερώνεται από το Ρ3 πρόδρομο με αυτοκαταλυτικό τεμαχισμό. Η πρωτεϊνάση αυτή, 16

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Εικόνα : Πρωτεόλυση της πολυπρωτεΐνης. Τα τρίγωνα δείχνουν τα σημεία πρωτεόλυσης από τις 3C pro /3CD pro και οι κύκλοι από την2a pro όπου τα μαύρα σχήματα δείχνουν γεγονότα πρωτεόλυσης που συμβαίνουν με γρήγορο ρυθμό και τα άσπρα σχήματα με αργό ρυθμό (S. Mueller et al., 2005) που περιέχει ολόκληρη την αλληλουχία της ιικής RNA πολυμεράσης, κάνει δευτερεύοντες τεμαχισμούς στα διπεπτίδια γλουταμινικού-γλυκίνης στον τύπου 1 πολιοϊό πιο αποτελεσματικά σε σχέση με την 3C pro. Τόσο η 3C pro όσο και η 3CD pro επεξεργάζονται τις πρωτεΐνες των Ρ2 και Ρ3 περιοχών με παρόμοια δραστικότητα. Σε μία αλληλουχία γεγονότων διάσπασης in-trans από την 3CD pro, οι μη-δομικές πρωτεΐνες 2A, 2BC, 3AB, 2B, 2C, 3A, 3B (VPg), 3C pro, 3D pol και οι πρωτεΐνες του καψιδίου VP0, VP1 και VP3 απελευθερώνονται από τις πρόδρομες μορφές τους. Η 3D pol αλληλουχία μέσα στην 3CD pro απαιτείται για την αναγνώριση δομικών μοτίβων στην κατάλληλα διαμορφωμένη Ρ1, επιτρέποντας δραστική επεξεργασία από το 3C pro μέρος του ενζύμου. Στο τελευταίο στάδιο της πρωτεόλυσης, που συμβαίνει κατά την συναρμολόγηση των ιικών σωματιδίων, η VP0 τεμαχίζεται, πιθανόν μέσω ενός αυτοκαταλυτικού μηχανισμού, ώστε να παράγει τις VP4 και VP2. Η παρουσία πολλαπλών δράσεων σε μια μοναδική πρωτεΐνη δεν υπάρχει στις ευκαρυωτικές πρωτεϊνάσες και είναι ένα παράδειγμα του πως η χωρητικότητα των μικρών ιικών γενωμάτων μπορεί να μεγιστοποιηθεί (Racaniello, 2013) Αντιγραφή του ιικού RNA Η αντιγραφή του ιού ξεκινάει κατά την είσοδό του στο κύτταρο ξενιστή. Αν και η διαδικασία της αντιγραφής του πολιοϊού είναι ένα αντικείμενο μελέτης για τα τελευταία χρόνια, δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Ένα απλό μοντέλο της αντιγραφής θα μπορούσε να είναι το εξής: 17

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ιικό RNA(+) σύνθεση RNA(-) RF σύνθεση RNA(+) RI RNA(+) όπου: RF (replicative form) δίκλωνο RNA πλήρους μήκους RI (replicative intermediate) κλώνος RNA(-) μερικά υβριδισμένος σε πολλαπλούς αναπτυσσόμενους κλώνους RNA(+). Η σύνθεση του ιικού RNA είναι ασύμμετρη. Η σύνθεση των θετικών κλώνων είναι 30 με 50 φορές μεγαλύτερη σε σχέση με την σύνθεση των αρνητικών. Το ένζυμο που καταλύει την αντίδραση της αντιγραφής είναι η RNA εξαρτώμενη RNA πολυμεράση. Η RNA πολυμεράση του ιού (3D pol ) παράγεται έπειτα από τεμαχισμό της πρόδρομης πρωτεΐνης 3CD pro, η οποία είναι άκρως δραστική ως πρωτεϊνάση αλλά δεν έχει δράση πολυμεράσης. Η 3D pol είναι ένα ένζυμο που εξαρτάται από εκκινητή. Σε πειράματα in vitro η 3D pol δεν αντιγράφει το RNA των ιών χωρίς έναν ολίγο(u) εκκινητή. Τον ρόλο του εκκινητή στους πολιοϊούς έχει η πρωτεΐνη VPg, η οποία είναι συνδεδεμένη στο ιικό RNA, αλλά επίσης και στο 5 -άκρο τον νεοσυντιθέμενων θετικών και αρνητικών κλώνων. Η VPg αρχικά ουριδιλιώνεται και στη συνέχεια επεκτείνεται έτσι ώστε να σχηματίσει πολύ(u). Το εκμαγείο για την ουριδιλίωση της VPg είναι μια δομή φουρκέτας του RNA, το cre (cis-acting replication element), που βρίσκεται στην κωδική περιοχή των πολιοϊών (A. V. Paul et al., 2000; Rieder et al., 2000; Yin et al., 2003). Εικόνα : Ο μηχανισμός αντιγραφής του ιικού RNA (Carter & Saunders, 2013) Η σύνθεση του ιικού mrna και του ιικού γενώματος γίνονται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων ξενιστών. Μία μόλυνση με πολιοϊό οδηγεί σε αναδιάταξη των ενδοκυτταρικών μεμβρανών των μολυσμένων κυττάρων. Έτσι το ΕΔ και το σύμπλεγμα Golgi καταστρέφονται κατά τη διαδικασία αυτή και το κυτταρόπλασμα γεμίζει με κυστίδια διπλής μεμβράνης (Dales et al., 1965; Schlegel et al., 1996). Η ιική σύνθεση του RNA γίνεται στην επιφάνεια των κυστιδίων αυτών (Bienz et al., 1987; Cho et al., 1994; Egger et al., 2000). Ο μεμβρανικός εντοπισμός των ιικών πρωτεϊνών αντιγραφής του RNA διασφαλίζει υψηλές τοπικές 18

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ συγκεντρώσεις των συστατικών της αντιγραφής αυξάνοντας τα επίπεδα δραστικότητας των αντιδράσεων της αντιγραφής. Τουλάχιστον δύο ιικές πρωτεΐνες, η 2C και 3AB, φέρουν το σύμπλοκο της αντιγραφής στα μεμβρανικά κυστίδια. Η 3ΑΒ είναι μια υδρόφοβη πρωτεΐνη που αγκυροβολεί τον πρωτεϊνικό εκκινητή VPg στην μεμβράνη για τη σύνθεση του RNA. Η 3AB δεσμεύει την 3D pol και την 3CD pro, στρατολογώντας έτσι το σύμπλοκο της αντιγραφής στις μεμβράνες. Η πρωτεΐνη 2C φέρει μια RNA-δεσμευτική περιοχή, η οποία επίσης θα μπορούσε να αγκυροβολήσει το ιικό RNA στις μεμβράνες και στο σύμπλοκο της αντιγραφής (Echeverri & Dasgupta, 1995). Το γενωμικό RNA των ιών δεν λειτουργεί μόνο ως mrna αλλά και ως μήτρα για τη σύνθεση του αρνητικής πολικότητας RNA. Πιστεύεται ότι υπάρχει ένας μηχανισμός που αποτρέπει την ταυτόχρονη διεξαγωγή και των δυο διαδικασιών, δηλαδή της μετάφρασης του mrna και της σύνθεσης των αρνητικών κλώνων RNA. Προτάθηκε έτσι ένας μηχανισμός όπου η δομή cloverleaf (τριφυλλιού) στο 5 άκρο της μη κωδικής περιοχής του (+)RNA ρυθμίζει πότε το RNA αντιγράφεται και πότε μεταφράζεται (Gamarnik & Andino, 1998). Στο μοντέλο αυτό, στις αρχές της μόλυνσης, η σύνδεση της πολύ-r(c)-δεσμευτικής πρωτεΐνης (PCBP-βοηθητική κυτταρική πρωτεΐνη) στην δομή αυτή επάγει τη μετάφραση. Όταν η 3CD pro συντεθεί, δεσμεύεται στη δομή cloverleaf, καταστέλλει την μετάφραση και επάγει τη σύνθεση του RNA. Ωστόσο, από πειραματικά στοιχεία, προκύπτει ότι ορισμένες φορές οι δυο αυτές διαδικασίες συμβαίνουν ταυτόχρονα, με αποτέλεσμα τη σύγκρουση της RNA πολυμεράσης με το ριβόσωμα(racaniello, 2013). Εικόνα : Μοντέλο αλλαγής μεταξύ μετάφρασης και σύνθεσης του (-)RNA κλώνου. Οι ιικές πρωτεΐνες 3CD pro, VPg, PABP και PCBP αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με τα άκρα του RNA, σχηματίζοντας ένα κυκλικό RNP. Κατά την αναστολή της μετάφρασης, αρχικά, απομακρύνονται τα ριβοσώματα από το ιικό RNA. Στη συνέχεια, η VPg-pUpU αλληλεπιδρά με το 3 άκρο του ιικού RNA και σχηματίζει το κυκλικό πρωταρχικό RNA σύμπλοκο αντιγραφής. Η σύνθεση του (-)RNA κλώνου ξεκινάει με την επιμήκυνση του VPg-pUpU από την 3D pol (Racaniello, 2013). 19

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Καψιδίωση και απελευθέρωση νέων ιικών σωματιδίων Κατά τη σύνθεση της Ρ1 πρωτεΐνης, της πρόδρομης καψιδιακής πρωτεΐνης, σχηματίζονται οι κεντρικές περιοχές β-βαρελιού και οι διαμοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιφανειών των περιοχών αυτών οδηγούν στο σχηματισμό των δομικών μονάδων. Όταν η Ρ1 απελευθερώνεται από την 2Α πρωτεΐνη, οι δεσμοί VP0-VP3 και VP3- VP1 τεμαχίζονται από την πρωτεϊνάση 3CD pro. Αυτές οι θέσεις τεμαχισμού βρίσκονται σε ευέλικτες περιοχές μεταξύ των β-βαρελιών. Στο ώριμο καψίδιο, το καρβοξυτελικό άκρο της VP1, VP2 και VP3 βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια του καψιδίου, ενώ το αμινοτελικό άκρο τους βρίσκεται στο εσωτερικό, όπου συμμετέχουν σε ένα εκτεταμένο δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πρωτομερών. Η επεξεργασία αυτή παράγει το πρώτο συγκροτημένο ενδιάμεσο, το 5S πρωτομερές, την ανώριμη δηλαδή δομική μονάδα που αποτελείται από ένα αντίγραφο των VP0, VP3 και VP1. Πέντε πρωτομερή στη συνέχεια σχηματίζουν ένα πενταμερές, με συντελεστή καθίζησης 14S. Το τελευταίο μορφογενετικό βήμα περιλαμβάνει τον τεμαχισμό των περισσότερων VP0 μορίων σε VP4 + VP2. Η πρωτεϊνάση που πραγματοποιεί αυτόν τον τελευταίο τεμαχισμό ωρίμανσης δεν έχει ταυτοποιηθεί ακόμα. Ο δεσμός της VP0 που κόβεται βρίσκεται στο εσωτερικό των άδειων καψιδίων και ώριμων ιοσωματίων και δεν είναι προσιτός σε ιικές ή κυτταρικές πρωτεϊνάσες. Η διαδικασία καψιδίωσης του πολιοϊού Εικόνα : Μορφογένεση του πολιοϊού. Η πρόδρομη πρωτεΐνη Ρ1 τεμαχίζεται σε VP0+VP3+VP1 πρωτεΐνες οι οποίες σχηματίζουν το πρωτομερές 5S. Τα πρωτομερή σχηματίζουν τα πενταμερή 14S και αυτά με τη σειρά τους τα άδεια ιικά καψίδια 80S. Τέλος, το (+)RNA εισέρχεται στο καψίδιο και η VP0 τεμαχίζεται σε VP2 + VP4 σχηματίζοντας έτσι το μολυσματικό 160S ιοσωμάτιο (Racaniello, 2013). είναι ειδική, καταλήγοντας στο πακετάρισμα μόνο των θετικών κλώνων RNA και όχι των ιικών mrna, αρνητικών ιικών RNA ή οποιοδήποτε κυτταρικό RNA (Nomoto, Kitamura, et al., 1977; Novak & Kirkegaard, 1991). Κάτω από πειραματικές συνθήκες ο κύκλος ζωής των πολιοϊών είναι πολύ γρήγορος, καταλήγοντας στο θάνατο του κυττάρου ξενιστή 20

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ περίπου 7-8 ώρες μετά τη μόλυνση. Είναι κοινώς αποδεκτό ότι οι πολιοϊοί εξέρχονται από το κύτταρο ξενιστή με λύση του (Tucker et al., 1993) ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ Σχετικά με την παθογένεια των πολιοϊών έχουν προταθεί κυρίως τρία μοντέλα (Minor, 1999): -το μοντέλο του Flexner το οποίο προτάθηκε το 1910, σύμφωνα με το οποίο η φυσιολογική οδός μετάδοσης της ασθένειας στους ανθρώπους είναι μέσω της ρινοφαρυγγικής οδού. -το μοντέλο του Bodian το οποίο προτάθηκε το 1950, σύμφωνα με το οποίο ο ιός μετά την είσοδό του στον οργανισμό εγκαθιδρύει μία αρχική μόλυνση στους λεμφαδένες του εντέρου και κατόπιν σε πιο μακρινούς λεμφαδένες ώσπου τελικά να εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος και από εκεί σε άλλους ευαίσθητους ιστούς περιλαμβανομένου του κεντρικού νευρικού συστήματος (Bodian, 1955). -το μοντέλο του Sabin το οποίο προτάθηκε την ίδια χρονική περίοδο με το μοντέλο του Bodian, φαίνεται πως είναι πιο κοντά στην πραγματική κατάσταση. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο ο ιός εγκαθιδρύει αρχικά μία μόλυνση στις βλεννώδεις επιφάνειες του φάρυγγα και του εντερικού σωλήνα. Στη συνέχεια ο ιός μπορεί να μεταδοθεί από τον βλεννογόνο στους τοπικούς λεμφαδένες από τους οποίους μπορεί να απομονωθεί αλλά αυτό δεν σημαίνει απαραιτήτως ότι ο ιός μπορεί να αντιγράφεται εκεί. Κατόπιν εισέρχεται στην κυκλοφορία του αίματος, προκαλώντας μία χαμηλού βαθμού ιαιμία και έτσι μπορεί πλέον να μολύνει πιο απομακρυσμένους λεμφικούς ιστούς ή άλλες ευαίσθητες περιοχές. Η αντιγραφή του ιού σε αυτές τις δευτερογενείς θέσεις παράγει την δευτερογενή ή κύρια ιαιμία κατά την οποία ο ιός μπορεί να Εικόνα 1.4.1: Μοντέλο του Sabin για την παθογένεια των πολιοϊών (Pallansch et al., 2013) 21

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ανιχνευθεί στο αίμα λόγω του μεγάλου ιικού φορτίου και τελικά είναι πιθανόν να εισέλθει στο κεντρικό νευρικό σύστημα το οποίο εξαρτάται από την κατάσταση ανοσίας του ατόμου ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Οι μηχανισμοί οι οποίοι ευθύνονται για την μεγάλη γενετική ποικιλομορφία των πολιοϊών είναι δύο(domingo & Holland, 1997): οι μεταλλάξεις που συμβαίνουν κατά την αντιγραφή του ιικού RNA ο μοριακός ανασυνδυασμός Μεταλλάξεις Η μοριακή βάση του υψηλού ρυθμού συσσώρευσης μεταλλάξεων κατά την αντιγραφή του ιικού RNA εντοπίζεται i) στην επιρρεπή σε λάθη RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση η οποία υπολογίζεται ότι έχει συχνότητα λάθους ένα στα 10 3 έως 10 4 νουκλεοτίδια και ii) στην απουσία επιδιορθωτικών μηχανισμών. Έτσι, οι πολιοϊοί εμφανίζουν έναν υψηλό ρυθμό συσσώρευσης μεταλλάξεων (6,3 Χ 10-4 μεταλλάξεις ανά βάση ανά κύκλο αντιγραφής) το οποίο αποτελεί χαρακτηριστικό όλων των λυτικών RNA ιών. Αυτό το χαρακτηριστικό έχει τις εξής συνέπειες για τους πολιοϊούς (Wimmer et al., 1993): 1.Έχουν εξελιχθεί ώστε να έχουν ένα μικρό γένωμα. 2.Αντιγράφονται κοντά στο όριο της καταστροφής λόγω μεταλλάξεων. 3.Υπάρχουν ως πληθυσμοί πολλών διαφορετικών γενοτύπων και γι αυτό χαρακτηρίζονται ως quasi-species (περίπου είδη). 4.Η γενετική ετερογένεια επιτρέπει στους πολιοϊούς να προσαρμόζονται γρήγορα σε ένα νέο περιβάλλον. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις είναι νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις. Μεταξύ αυτών, οι μεταπτώσεις (η αντικατάσταση πυριμιδίνης από πυριμιδίνη ή πουρίνης από πουρίνη) αποτελούν το 80% των μεταλλάξεων, ενώ το υπόλοιπο 20% είναι μεταστροφές (η αντικατάσταση πυριμιδίνης από πουρίνη ή το αντίθετο). Η μετάλλαξη Α G είναι η πιο συχνά παρατηρούμενη. Οι υπόλοιπες μεταλλάξεις όπως ελλείψεις και διπλασιασμοί είναι πιο σπάνιες (Figlerowicz et al., 2003). Ένα ενδιαφέρον χαρακτηριστικό της εξέλιξης του γενώματος των πολιοϊών είναι ο διαφορετικός ρυθμός εξέλιξης των διαφόρων περιοχών του. Υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί όσον αφορά τις αντικαταστάσεις αμινοξέων σε συγκεκριμένες περιοχές των δομικών πρωτεϊνών (πχ στις περιοχές αυτές που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα 22

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ή στην αλληλεπίδραση με τα ενεργά κέντρα ιικών ενζύμων). Η διατήρηση της αλληλουχίας σε αυτές τις περιοχές οφείλεται στο γεγονός ότι δεν είναι εκτεθειμένες στο εξωτερικό του καψιδίου και συνεπώς ξεφεύγουν της αντιγονικής πίεσης. Αντίθετα, οι περιοχές των δομικών πρωτεϊνών που συμμετέχουν στον σχηματισμό των αντιγονικών θέσεων χαρακτηρίζονται από υψηλό ρυθμό συσσώρευσης νουκλεοτιδικών και αμινοξικών υποκαταστάσεων λόγω της αντιγονικής πίεσης που υφίστανται. Αποτέλεσμα αυτού, είναι ότι ο ιός μπορεί να διαφύγει της αναγνώρισης από το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού. Επίσης, cis-acting γενετικά στοιχεία που εμπλέκονται στην ιική αντιγραφή (cloverleaf και CRE) ή στην ιική μετάφραση (IRES) δέχονται ακόμα πιο λίγες μεταλλάξεις. Συγκεκριμένα, σε αυτά τα γενετικά στοιχεία είναι συχνό το φαινόμενο της συνμεταβλητότητας (covariance) κατά το οποίο οι μεταλλάξεις εμπλέκουν βάσεις που επιτρέπουν την διατήρηση της δευτεροταγούς δομής τους. Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός που ερμηνεύει τον διαφορετικό ρυθμό εξέλιξης των διαφόρων γενωμικών περιοχών είναι ο ομοτυπικός ανασυνδυασμός μεταξύ διαφορετικών συνυπαρχόντων γενεαλογιών, ο οποίος όμως δεν μπορεί να αναγνωριστεί. Η ευκολία με την οποία συμβαίνει ο ετεροτυπικός ανασυνδυασμός δείχνει ότι ο ομοτυπικός συμβαίνει ακόμα πιο συχνά (Cherkasova et al., 2002). Οι κανόνες που ελέγχουν την εγκαθίδρυση των μεταλλάξεων σε έναν ιικό πληθυσμό είναι λιγότερο κατανοητοί. Γενικά, μία μετάλλαξη μπορεί να μειώνει ή να αυξάνει την αρμοστικότητα του ιού για μία συγκεκριμένη οικολογική θέση ή να την αφήνει ανεπηρέαστη. Οι νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις που οδηγούν σε αλλαγές στο «νόημα» των κωδικονίων (μη-συνώνυμες μεταλλάξεις) είναι λιγότερο πιθανό να είναι ουδέτερες σε σύγκριση με τις υποκαταστάσεις που δεν επηρεάζουν το «νόημα» των κωδικονίων (συνώνυμες μεταλλάξεις). Η εγκαθίδρυση μεταλλάξεων που παρέχουν ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα είναι εύκολα κατανοητή στα πλαίσια της θετικής επιλογής του Δαρβίνου. Αντίθετα, μεταλλάξεις που παρέχουν ένα επιλεκτικό μειονέκτημα εξαλείφονται μέσω της αρνητικής επιλογής (Domingo & Holland, 1997). Η πιθανότητα εγκαθίδρυσης μιας μετάλλαξης εξαρτάται όχι μόνο από τις σχετικές αλλαγές στην αρμοστικότητα του ιού αλλά σε μεγάλο βαθμό και από το μέγεθος του πληθυσμού. Συνεχείς κυτταροκαλλιέργειες που εμπλέκουν μικρούς ιικούς πληθυσμούς, μία κατάσταση η οποία είναι τυπική της φυσιολογικής μόλυνσης των πολιοϊών, είναι πιθανόν ότι οδηγεί στη συσσώρευση ουδέτερων μεταλλάξεων ή μεταλλάξεων που οδηγούν σε εξασθενημένο φαινότυπο (ένα φαινόμενο γνωστό ως Muller s ratchet). Έτσι, οι συνεχόμενες αλλαγές στις ιικές γενεαλογίες δεν είναι απαραιτήτως προσαρμοστικού 23

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ χαρακτήρα αλλά είναι πιθανόν ότι οφείλονται στην τυχαία δειγματοληψία (Domingo & Holland, 1997) Ανασυνδυασμός Ο γενετικός ανασυνδυασμός των RNA ιών αρχικά περιγράφτηκε για τους πολιοϊούς από τον Hirst το Επακόλουθες μελέτες προσδιόρισαν ότι η ανταλλαγή γενετικών στοιχείων συμβαίνει με συχνότητα ισότιμη με αυτή της ενσωμάτωσης μεταλλάξεων κατά την αντιγραφή, και επίσης ότι η συχνότητα του ανασυνδυασμού εξαρτάται από το βαθμό της ομολογίας μεταξύ των πατρικών RNA κλώνων και από την απόσταση μεταξύ των γενετικών δεικτών. Ο King το 1988 υπολόγισε ότι το 10-20% των ιικών γενωμάτων υφίστανται γενετικό ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια ενός μόνο κύκλου αναδιπλασιασμού (Duggal et al., 1997). O ανασυνδυασμός παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των RNA ιών. Βοηθάει στην εξάλειψη δυσμενών μεταλλάξεων που συσσωρεύονται κατά την ιική αντιγραφή και συνεπώς συμβάλλει στην διατήρηση ενός γενοτύπου αγρίου τύπου. Επίσης, συμβάλλει στην δημιουργία ιικών στελεχών καλύτερα προσαρμοσμένων για επιβίωση όπως π.χ. η βελτιωμένη ικανότητά τους να αντιγράφονται στον γαστρεντερικό σωλήνα σε σχέση με τα πατρικά στελέχη. Τέλος, επιταχύνει την εξέλιξη μέσω της ανταλλαγής ολόκληρων γενετικών μονάδων μεταξύ διαφορετικών στελεχών του ίδιου γένους ή και ακόμα μεταξύ στελεχών που ανήκουν σε διαφορετικά γένη (Wimmer et al., 1993). O ανασυνδυασμός των RNA γενωμάτων λαμβάνει χώρα σε κύτταρα συν-μολυσμένα με διάφορα ιικά στελέχη είτε του ίδιου οροτύπου (homotypic) είτε διαφορετικών οροτύπων (heterotypic). Έχουν προταθεί δύο διαφορετικοί πιθανοί μηχανισμοί που οδηγούν σε γενετικό ανασυνδυασμό: Α. Ο αντιγραφικός μηχανισμός (replicative): Σύμφωνα με το μηχανισμό αυτό το εκμαγείο αλλάζει κατά τη διάρκεια της αντιγραφής, δηλαδή η σύνθεση του συμπληρωματικού κλώνου ξεκινά πάνω σε ένα ιικό RNA και ξαφνικά σταματά και συνεχίζεται πάνω σε ένα άλλο ιικό RNA. Γι αυτό το λόγο αυτός ο μηχανισμός είναι γνωστός και ως μηχανισμός αλλαγής μήτρας (template switch). Όταν η μετάβαση από το ένα στο άλλο εκμαγείο είναι ακριβής, ο ανασυνδυασμός είναι ομόλογος. Αυτού του είδους ο ανασυνδυασμός παρατηρείται στα περισσότερα βιώσιμα ανασυνδυασμένα στελέχη τα οποία έχουν ανασυνδυαστεί μέσα στην κωδική περιοχή τους. Αντίθετα, μία μη ακριβής μετάβαση οδηγεί σε μη-ομόλογο ανασυνδυασμό όπως π. χ σε ελλείψεις και διπλασιασμούς. Αυτού του είδους ο ανασυνδυασμός είναι πιο πιθανός στις μη-κωδικές 24

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ περιοχές του ιικού γενώματος. Ο ανασυνδυασμός συμβαίνει κατά την σύνθεση των (-)RNA κλώνων για δύο κυρίως λόγους. Η συχνότητα του ανασυνδυασμού εξαρτάται σημαντικά από την διαθεσιμότητα των RNA μορίων που δρουν ως δέκτες και οι (+)RNA κλώνοι σε σύγκριση με τους (-)RNA κλώνους είναι πολύ περισσότεροι στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων. Επίσης οι (-)RNA κλώνοι βρίσκονται μέσα στο κύτταρο σε δίκλωνη μορφή (replicative intermediate) και σε αυτή τη μορφή δεν είναι διαθέσιμοι να συμμετέχουν σε γεγονότα ανασυνδυασμών (Racaniello, 2013). Όσον αφορά τον αντιγραφικό μηχανισμό, πρέπει να υπάρχουν κάποιοι παράγοντες που διευκολύνουν τον τερματισμό της RNA σύνθεσης πάνω στο πρώτο εκμαγείο, τον διαχωρισμό του αναπτυσσόμενου κλώνου (πιθανόν μαζί με την RNA πολυμεράση) και την αναγνώριση της σωστής θέσης σύνδεσης πάνω στο δεύτερο εκμαγείο. Οι θέσεις ανασυνδυασμού βρίσκονται σε γενωμικές περιοχές που έχουν τη δυνατότητα να σχηματίσουν δευτεροταγείς δομές. Η μη τυχαία κατανομή των θέσεων ανασυνδυασμού οφείλεται στην ύπαρξη προτιμούμενων θέσεων για ανασυνδυασμό. Η ανάλυση ενός μεγάλου αριθμού ομοτυπικών ανασυνδυασμένων στελεχών πολιοϊών απέδειξε επίσης ότι οι ανασυνδυασμοί σχετίζονται με χαρακτηριστικές ιδιότητες των μητρικών RNA αλληλουχιών όπως εγγύς περιοχές στη θέση ανασυνδυασμού με αυξημένη ομολογία και υψηλή περιεκτικότητα σε U-A (King, 1988). Επιπλέον, η ανάλυση των μελετών των γενετικών ανασυνδυασμών τόσο in vitro αλλά και in vivo, οδήγησε στην παρατήρηση ότι η θερμοκρασία επηρεάζει αρκετά την θέση στην οποία συμβαίνει ο ανασυνδυασμός μεταξύ δυο PV RNA κλώνων (Duggal & Wimmer, 1999). Γενικά, φαινόμενα ανασυνδυασμών μεταξύ των εντεροϊών είναι συχνά (Simmonds & Welch, 2006) και έχει προταθεί ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν για καψιδιακές πρωτεΐνες υπεύθυνες για τους διάφορους Εικόνα : Μηχανισμός αλλαγής μήτρας για τον ανασυνδυασμό μεταξύ RNA γενωμάτων. Οι μαύρες γραμμές αντιστοιχούν στα δύο RNA μόρια. Οι αυτοσυμπληρωματικές περιοχές παριστάνονται ως a και a. Η διακεκομμένη γραμμή αντιστοιχεί στο νεοσυντιθέμενο RNA μόριο (Agol, 1997) 25

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΜΒΟΛΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ ορότυπους φαίνεται να εξελίσσονται με συγγενικά ανεξάρτητο τρόπο σε σχέση με τα μηδομικά πρωτεϊνικά γονίδια (Lukashev et al., 2003). Έχει βρεθεί ότι ο ανασυνδυασμός συμβαίνει κυρίως στις περιοχές του ιικού γενώματος που κωδικοποιούν τις μη-δομικές πρωτεΐνες του ιού (Cuervo et al., 2001; Guillot et al., 2000; Lukashev, 2005), αν και έχουν παρατηρηθεί αρκετές περιπτώσεις ανασυνδυασμών στις VP1 και VP2 δομικές περιοχές (Blomqvist et al., 2003; Blomqvist et al., 2010; Kyriakopoulou et al., 2006; Liu et al., 2000; Martín et al., 2002; J. E. Mueller et al., 2009; Zhang et al., 2010). Μία πιθανή ερμηνεία αυτού του φαινομένου στηρίζεται στο γεγονός ότι οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν το καψίδιο είναι οι πιο ποικιλόμορφες μεταξύ των τριών οροτύπων των πολιοϊών. Τέλος θα πρέπει να σημειωθεί ότι αν και η πλειονότητα των ανασυνδυασμένων στελεχών χαρακτηρίζονται μόνο από μία θέση ανασυνδυασμού, υπάρχουν περιπτώσεις στις οποίες έχουν εντοπιστεί πολλαπλά σημεία ανασυνδυασμού (Georgescu et al., 1995; Karakasiliotis et al., 2005) Β. Ο μη-αντιγραφικός μηχανισμός (non replicative): Σύμφωνα με το μηχανισμό αυτό, ένα ανασυνδυασμένο RNA γένωμα προκύπτει από την σύνδεση προσυντεθειμένων RNA τμημάτων προερχόμενων από την διάσπαση διαφορετικών πατρικών RNA μορίων. Θεωρητικά υπάρχουν τρεις πιθανοί τρόποι με τους οποίους μπορεί να προκύπτουν αυτά τα RNA τμήματα: i) από την πρώιμη λήξη της αντιγραφής, ii) από την αποικοδόμηση του ιικού RNA από κυτταρικές RNases, iii) από δραστικότητα ριβοενζύμου του ίδιου του ιικού RNA (Agol, 2002). Κατόπιν, η σύνδεση των RNA τμημάτων είναι πιθανόν ότι εμπλέκει είτε μία RNA λιγάση είτε κάποια δραστικότητα ριβοενζύμου (Agol, 1997) ΕΜΒΟΛΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ IPV Το απενεργοποιημένο εμβόλιο (inactivated polio vaccine) προέκυψε από την μετατροπή άγριων παθογόνων στελεχών σε μη-μολυσματικά κατόπιν επεξεργασίας τους με φορμαλδεΰδη. Το IPV είναι ασφαλές και επάγει μία προστατευτική ανοσολογική απόκριση στα εμβολιασμένα άτομα εφόσον ο εμβολιασμός επαναλαμβάνεται σε τακτά χρονικά διαστήματα. Στα θετικά του προστίθεται και το στοιχείο ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ακόμη και σε άτομα με ανοσοανεπάρκεια και ανοσοκαταστολή. Δυστυχώς όμως, το IPV επάγει ανεπαρκή τοπική ανοσία. Επίσης είναι ακριβότερο σε σχέση με το OPV και 26

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΜΒΟΛΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ εμφανίζει μειωμένη γαστρεντερική ανοσία σε σχέση με τη φυσική μόλυνση. Τέλος, εγκυμονούν ορισμένοι κίνδυνοι καθώς για την παραγωγή του χρησιμοποιούνται πολιοϊοί αγρίου τύπου (Blondel et al., 1998) OPV Το OPV (oral polio vaccine) αποτελείται από εξασθενημένα στελέχη πολιοϊών (P1/Sabin, P2/Sabin και P3/Sabin) τα οποία αναπτύχθηκαν από τον A.B Sabin ύστερα από το πέρασμα πολιοϊών αγρίου τύπου σε ιστούς πιθήκων in vitro και in vivo κάτω από μία ποικιλία συνθηκών οι οποίες διέφεραν για κάθε έναν από τους τρεις ορότυπους. Τα εξασθενημένα στελέχη P1/Sabin (P1/LSc, 2ab) και P2/Sabin (P2/P712, Ch, 2ab) προήλθαν από τα άγρια νευροτοξικά στελέχη P1/Mahoney/41 και P2/P712/56 αντίστοιχα τα οποία απομονώθηκαν από τα κόπρανα υγιών παιδιών. Το εξασθενημένο στέλεχος P3/Sabin (P3/Leon 12a 1,b) προήλθε από το άγριο νευροτοξικό στέλεχος P3/Leon/37 το οποίο απομονώθηκε από τον εγκέφαλο και τον νωτιαίο μυελό ενός θύματος της παραλυτικής πολιομυελίτιδας (Friedrich, 1996). Η μοριακή βάση της εξασθένησης (όπου ο ιός καθίσταται λιγότερο ικανός να προκαλεί ασθένεια) ή της μεταστροφής των εμβολιακών στελεχών (όπου ο ιός επανακτά την ικανότητα να προκαλεί ασθένεια) έχει μελετηθεί συγκρίνοντας την αλληλουχία του εμβολιακού στελέχους του κάθε οροτύπου με αυτή ενός συγγενούς στελέχους, είτε του προδρόμου του εμβολιακού στελέχους είτε ενός νευρομολυσματικού στελέχους που απομονώθηκε από περίπτωση εμβόλιο-συνδεόμενης παραλυτικής πολιομυελίτιδας - VAPP (vaccine-associated paralytic poliomyelitis) (Blondel et al., 1998). Το γένωμα του εμβολιακού στελέχους P3/Sabin διαφέρει από αυτό του προδρόμου του (P3/Leon/37) σε 11 βάσεις από τις οποίες όμως μόνο οι δύο είναι ισχυροί καθοριστές του εξασθενημένου/ νευρομολυσματικού φαινότυπου: μία νουκλεοτιδική υποκατάσταση στη θέση 472 της 5 αμετάφραστης περιοχής και μία αμινοξική υποκατάσταση στη θέση 91 της VP3 περιοχής. Επίσης, η αμινοξική υποκατάσταση στη θέση 6 της VP1 είναι πιθανόν να παίζει κάποιο ρόλο στον εξασθενημένο φαινότυπο (Stanway et al., 1984). Στην περίπτωση του εμβολιακού στελέχους P2/Sabin, μία νουκλεοτιδική υποκατάσταση στη θέση 481 της 5 αμετάφραστης περιοχής και μία αμινοξική υποκατάσταση στη θέση 143 της VP1 περιοχής είναι οι κύριοι καθοριστές του εξασθενημένου / νευρομολυσματικού φαινότυπου (Macadam et al., 1993). 27

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΜΒΟΛΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ Το γένωμα του εμβολιακού στελέχους P1/Sabin διαφέρει από αυτό του προδρόμου του (P1/Mahoney/41) σε 54 βάσεις. Οι καθοριστές του εξασθενημένου φαινότυπου του P1/Sabin βρέθηκε ότι κατανέμονται σε όλο το γένωμα καθιστώντας την ανάλυσή τους πιο περίπλοκη από αυτή των άλλων δύο οροτύπων. Μία νουκλεοτιδική υποκατάσταση στη θέση 480 της 5 αμετάφραστης περιοχής και πιθανόν μία δεύτερη στη θέση 189 της ίδιας περιοχής έχει βρεθεί ότι συμβάλλουν στον εξασθενημένο φαινότυπο. Τέσσερις επιπλέον αμινοξικές υποκαταστάσεις στην περιοχή που κωδικοποιεί για τις δομικές πρωτεΐνες συμβάλλουν στον εξασθενημένο φαινότυπο. Οι δύο από αυτές (τα αμινοξέα 65 της VP4 και 134 VP1) βρίσκονται στο εσωτερικό του ιικού καψιδίου ενώ οι άλλες δύο (τα αμινοξέα 106 της VP1 και 225 της VP3) βρίσκονται στο εξωτερικό του. Επιπλέον ασθενείς καθοριστές του εξασθενημένου / νευρομολυσματικού φαινότυπου βρίσκονται στο 3 τελικό άκρο του ιικού γενώματος και συγκεκριμένα στη θέση 73 της 3D pol περιοχής (McGoldrick et al., 1995). Τo OPV έχει αρκετά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με το IPV. Κατ αρχήν το OPV χορηγείται από το στόμα και όχι σε ενέσιμη μορφή όπως γίνεται στην περίπτωση του IPV. Επιπλέον το OPV επάγει μία ισχυρή και μεγάλης διάρκειας ανοσολογική απόκριση συμπεριλαμβανομένης τοπικής ανοσίας στο έντερο. Ένα επιπλέον πλεονέκτημα του OPV μπορεί να θεωρηθεί η διασπορά των ζωντανών στελεχών του εμβολίου από τα εμβολιασμένα άτομα σε άλλα άτομα του στενού περιβάλλοντός τους με αποτέλεσμα την επίτευξη ευρύτερης ανοσοποίησης. Γι αυτούς τους λόγους το OPV επικράτησε έναντι του IPV στο μεγαλύτερο μέρος του κόσμου και βοήθησε στην εξάλειψη της πολιομυελίτιδας από τις περισσότερες χώρες (Dowdle et al., 2003). Το OPV όμως, έχει και ορισμένα μειονεκτήματα. Αρχικά απαιτείται η χρήση του εμβολίου πρώτα σε πιθήκους για δοκιμές ασφαλείας. Επίσης, αντενδείκνυται για άτομα με ανοσοανεπάρκεια ή ανοσοκαταστολή. Τέλος, επειδή πρόκειται για ζωντανό ιό υπάρχει η πιθανότητα πρώτον να μεταλλαχθεί σε νευροτοξική μορφή, προκαλώντας εμβολιοσυνδεόμενη παραλυτική πολιομυελίτιδα (VAPP) και δεύτερον να οδηγήσει στην εμφάνιση εμβόλιο-προερχόμενων πολιοϊών (VDPV) προκαλώντας εκ νέου κρούσματα πολιομυελίτιδας VAPP VDPV Όπως θα αναπτυχθεί και παρακάτω, τα κρούσματα πολιομυελίτιδας φθίνουν συνεχώς και ως αποτέλεσμα έχουν αναπτυχθεί νέες οδηγίες με σκοπό τη μεταστροφή από το εμβόλιο ΟPV στην αποκλειστική χρήση του ενδομυϊκού εμβολίου (IPV). Το κύριο αναμενόμενο όφελος της αλλαγής αυτής είναι η εξάλειψη της VAPP (εμβολιοσυνδεόμενη παραλυτική πολιομυελίτιδα Vaccine-associated paralytic poliomyelitis) (Alexander et al., 28

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΜΒΟΛΙΑ ΚΑΤΑ ΤΩΝ ΠΟΛΙΟΪΩΝ 2004), η οποία επηρεάζει είτε άτομα που πρόσφατα εμβολιάστηκαν με το OPV είτε μηεμβολιασμένα άτομα τα οποία όμως ζουν σε άμεση επαφή με εμβολιασμένα άτομα. Ο παθογόνος χαρακτήρας αυτών των νευρομολυσματικών στελεχών σχετίζεται γενικά με δύο ειδών μεταλλάξεις. Σε στελέχη που έχουν απομονωθεί από VAPP περιπτώσεις έχουν εντοπιστεί ανάστροφες μεταλλάξεις στα σημεία που αποτελούν τους καθοριστές του εξασθενημένου φαινότυπου, ή κατασταλτικές μεταλλάξεις σε άλλα σημεία εκτός των καθοριστών του εξασθενημένου φαινότυπου. Η απομόνωση νευρομολυσματικών στελεχών από VAPP περιπτώσεις χωρίς ανάστροφες μεταλλάξεις σε σημαντικούς καθοριστές του εξασθενημένου φαινότυπου έχει οδηγήσει στην άποψη ότι πιθανόν οι μεταλλάξεις αυτές θα μπορούσαν να αυξήσουν την νευρομολυσματικότητα ή να συμμετέχουν με κάποιο τρόπο στην εγκαθίδρυση της ασθένειας (Friedrich, 1996). Επίσης, η τρισθενής φύση του OPV παρέχει ιδανικές συνθήκες για ομοτυπικό ανασυνδυασμό μεταξύ των εξασθενημένων στελεχών των τριών οροτύπων του πολιοϊού. Ο ανασυνδυασμός επιτρέπει στον ιό να εξαλείψει τις μεταλλάξεις οι οποίες συνδέονται με την εξασθένηση και παρέχει καλύτερη προσαρμογή στο περιβάλλον. Κατά συνέπεια ο ανασυνδυασμός ανιχνεύεται πιο συχνά σε δείγματα προερχόμενα από Sabin 2 και Sabin 3 στελέχη και σπανιότερα από Sabin 1(Baicus et al., 2011; Cherkasova et al., 2002; Combiescu et al., 2007; Furione et al., 1993; Lipskaya et al., 1991). Μια συνεχιζόμενη χρήση του OPV εμβολίου, εκτός από τους κινδύνους που επιφέρει η VAPP, μπορεί να επιφέρει μια έξαρση εμβολιοπροερχόμενων πολιοϊών (VDPV). Οι VDPV προέρχονται από το OPV, αλλά διαφέρουν από τα στελέχη του OPV και τους πολιοϊούς που απομονώνονται από άτομα έπειτα από εμβολιασμό με OPV, έχοντας περισσότερες του 1% νουκλεοτιδικές αλλαγές στην κωδική περιοχή της VP1 (Kew et al., 2005). Τέτοια στελέχη ευθύνονται για εξάρσεις πολιομυελίτιδας στην νήσο Ισπανιόλα (Kew et al., 2002), στις Φιλιππίνες (Shimizu et al., 2004), στην Αίγυπτο (Yang et al., 2003), στη Μαδαγασκάρη (Rousset et al., 2003) και στη Νιγηρία (Adu et al., 2007). Οι VDPV μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις ομάδες: α) στελέχη VDPV που κυκλοφορούν στο περιβάλλον (cvdpv), β) VDPV που απομονώνονται από άτομα με ανοσοανεπάρκεια (ivdpv) και γ) αμφιλεγόμενοι VDPV (avdpv) στους οποίους η πηγή της μόλυνσης είναι άγνωστη. Μελετώντας τα γενετικά χαρακτηριστικά των ανασυνδυασμένων cvdpv γενωμάτων, ανακαλύφθηκε ότι όλα τα γενώματα είχαν διατηρήσει τουλάχιστον ολόκληρη την περιοχή των OPV στελεχών που κωδικοποιεί για τις καψιδιακές πρωτεΐνες και μερικό ή 29

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ όλο το υπόλοιπο γονιδίωμα, ιδιαίτερα η περιοχή των μη-δομικών πρωτεϊνών, προέρχεται από EV-Cs (Joffret et al., 2012; Kew et al., 2002; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2007; Rakoto- Andrianarivelo et al., 2008; Shimizu et al., 2004; Yang et al., 2003). Τα περισσότερα από αυτά έδειχναν το 3 -μέσο των γενωμάτων τους να προέρχεται από μη-opv αλληλουχίες με τις θέσεις ανασυνδυασμού να εντοπίζονται στις πρωτεΐνες 2Α ή 2Β (Kew et al., 2002; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2007; Shimizu et al., 2004; Yang et al., 2003). Ωστόσο, οι θέσεις ανασυνδυασμού μπορούσαν να βρίσκονται σε διαφορετικό σημείο της Ρ2 ή Ρ3 περιοχής (Joffret et al., 2012; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2008). Επιπροσθέτως, πολλά cvdpv τύπου 2 δείγματα εμφάνιζαν ένα μεγάλο μέρος της 5 μη-κωδικής περιοχής τους να προέρχεται από μη-opv EV-Cs. Στην περίπτωση αυτή, μερικά από τα δείγματα αυτά διατηρούσαν μόνο την κωδικοποιούσα περιοχή του καψιδίου από τα αρχικά OPV στελέχη. Πιο πολύπλοκες γενωμικές δομές βρέθηκαν στη Μαδαγασκάρη κατά το ξέσπασμα του cvdpvs τύπου 2 εμφάνιζαν ένα μωσαϊκό τετραμερές ανασυνδυασμένο γονιδίωμα που αποτελούταν από μη-opv αλληλουχίες στην 5 μη-κωδική περιοχή και στις Ρ2, Ρ3 περιοχές, αμφίπλευρες καψιδιακές αλληλουχίες του OPV τύπου 2 και OPV τύπου 3 στο 3 άκρο του γενώματος (Rakoto-Andrianarivelo et al., 2007). Η ανακάλυψη ότι μερικά ανασυνδυασμένα γενώματα cvdpv είχαν διατηρήσει μόνο τις κωδικοποιούσες περιοχές του καψιδίου από τα αρχικά OPV στελέχη (Georgescu et al., 1995; Guillot et al., 2000; Joffret et al., 2012; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2008; Yang et al., 2003), απέδειξε ότι όλα τα υπόλοιπα μέρη του γονιδιώματος μπορούν να μοιράζονται μεταξύ άλλων EV-Cs. Το καψίδιο των εντεροϊών, που σπανίως υπόκειται σε ανασυνδυασμό (Simmonds, 2006), φαίνεται ως η κύρια ιική δομή που καθορίζει τον τύπο του ιού ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Η ανθρωπότητα είχε την τύχη να έχει περισσότερα του ενός εξαιρετικά εμβόλια για την αντιμετώπιση της πολιομυελίτιδας, καθώς ήταν διαθέσιμα τόσο το νεκρό ενδομυϊκό εμβόλιο του Salk όσο και το εξασθενημένο από στόματος εμβόλιο του Sabin. Και τα δύο εμβόλια οδήγησαν στην παραγωγή αντισωμάτων έναντι των PVs με την επακόλουθη προστασία από τη νόσο (Pallansch et al., 2013). Παρόλο που υπήρχε μια συνεχόμενη προάσπιση του ενός ή του άλλου εμβολίου για αρκετά χρόνια, είναι ξεκάθαρο ότι το καθένα έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του. Τώρα, που τα κρούσματα πολιομυελίτιδας φθίνουν συνεχώς, έχουν αναπτυχθεί νέες οδηγίες στις ΗΠΑ από το CDC (Centers for Disease Control and Prevention) και την ACIP (Συμβουλευτική Επιτροπή 30

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Εφαρμογών Ανοσοποίησης), με μια στροφή από το στοματικό εμβόλιο (ΟPV) στην αποκλειστική χρήση του ενδομυϊκού εμβολίου (IPV) (σε ηλικία 2 μηνών, 4 μηνών, 6 έως 18 μηνών και 4 έως 6 χρονών). Το κύριο αναμενόμενο όφελος της αλλαγής αυτής ήταν η εξάλειψη της VAPP και μελέτες στη συνέχεια απέδειξαν ότι αυτό ήταν επιτυχές (Alexander et al., 2004). Το πρόγραμμα εμβολιασμού κατά των πολιοϊών αποδείχθηκε επιτυχημένο. Ως αποτέλεσμα της χρήσης του OPV, δεν προέκυψε κανένα περιστατικό παραλυτικής πολιομυελίτιδας από αγρίου τύπου πολιομυελίτιδα από το 1980 στις ΗΠΑ ή σε ολόκληρη την Αμερική από το 1991, θέτοντας έτσι ένα θεωρητικό και πρακτικό πλαίσιο για την παγκόσμια εξάλειψη του πολιοϊού. Η απόλυτη εξάλειψη του πολιοϊού φαίνεται αληθοφανής με δεδομένο τις βιολογικές ιδιότητες και τη διαθεσιμότητα δραστικών εμβολίων. Η επιβίωση του πολιοϊού εξαρτάται από σχεδόν συνεχή επαφή για τη μεταφορά του από άτομο σε άτομο, καθώς δεν υπάρχουν μη ανθρώπινες δεξαμενές και ο ιός αντέχει για ένα σχετικά μικρό χρόνο στο περιβάλλον. Οι εμβολιασμοί ρουτίνας με OPV ή με IPV στις περισσότερες ανεπτυγμένες χώρες ήταν επιτυχείς στην εξουδετέρωση της τοπικής κυκλοφορίας του ιού. Όμως πολλές αναπτυσσόμενες χώρες παρέμεναν ενδημικές επί δεκαετίες μετά την εισαγωγή των εμβολίων κατά των πολιοϊών. Λίγο περισσότερο από δύο δεκαετίες μετά την διαθεσιμότητα του OPV, επιχειρήθηκε η εξάλειψη της νόσου, ξεκινώντας από την Αμερική (de Quadros et al., 1992). Το 1988, ο ΠΟΥ, βασιζόμενος εν μέρει στην ταχεία πρόοδο των ενεργειών της εξάλειψης στην Αμερική, εξέδωσε ένα ψήφισμα για την παγκόσμια εξάλειψη του πολιοϊού πριν το τέλος του 20 ου αιώνα. Το ψήφισμα αυτό επιβεβαιώθηκε το Μάιο του 1999 και του 2004 και παροτρύνθηκε μια επιτάχυνση των ενεργειών με συγκεκριμένη εστίαση στις απομείναντες ενδημικές περιοχές. Οι ενέργειες αυτές περιλαμβάνουν επιπρόσθετες περιοδείες της Εθνικής Ημέρας Εμβολιασμού, εκτεταμένη επιτήρηση στις κοινωνίες υψηλού κινδύνου και «ξεκαθάρισμα» των εστιακών δεξαμενών. Εικόνα 1.7.1: Παγκόσμιος χάρτης που απεικονίζει την κυκλοφορία του άγριου τύπου PV το 1988 και το Πηγή: WHO-Centers for Disease Control, unpublished data. 31

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Τα στοιχεία αυτά της στρατηγικής εξάλειψης των PVs αποδείχθηκαν επιτυχημένα σε πολλά σημεία του κόσμου. Από τη στιγμή που ξεκίνησε το πρόγραμμα, πολλές χώρες απαλλάχθηκαν από την κυκλοφορία εντόπιων PVs. Αυτό φαίνεται από την εικόνα 4.1, όπου το 1988 ο PV βρισκόταν σε όλες τις ηπείρους (εκτός από την Αυστραλία), με εκτιμήσεις για πάνω από περιστατικά κάθε χρόνο, ενώ το 2005 ο αριθμός των χωρών με αποδεδειγμένα ή εκτιμώμενα κρούσματα πολιοϊών ήταν μόνο 15 και η Αμερική, Ευρώπη και η Άπω Ανατολή ήταν πιστοποιημένα απαλλαγμένες από PVs (Anonymous, 1999). Το 2003, οι μόνες έξι χώρες με ενδημικά περιστατικά PV βρίσκονταν στην Νότια Ασία (Ινδία, Πακιστάν και Αφγανιστάν), Αφρική (Νιγηρία, Νίγηρας και Αίγυπτος). Ως αποτέλεσμα της αδιαφορίας πολλών χωρών και της αναστολής των εμβολιασμών στις βόρειες περιοχές της Νιγηρίας από το 2003 έως το 2005, ένας μοναδικός γενότυπος του πολιοϊού τύπου 1 εξαπλώθηκε σε 18 χώρες της δυτικής, κεντρικής και ανατολικής Αφρικής, στη Μέση Ανατολή ακόμα και την Ινδονησία. Σε αρκετές από αυτές τις χώρες, η μετάδοση του ιού συνεχίστηκε για περισσότερο από 6 μήνες, κάτι που σήμαινε ότι η κυκλοφορία των PVs ανασυστάθηκε. Έτσι εντάθηκαν οι ενέργειες ελέγχου της περαιτέρω εξάπλωσης και εξάλειψης του ιού σε αυτές τις περιοχές που άλλοτε ήταν απαλλαγμένες από πολιοϊούς (CDC, 2005). Για το έτος 2016 τα κρούσματα πολιομυελίτιδας έχουν ελαττωθεί σε 42 σε τέσσερις μόνο ενδημικές χώρες: Πακιστάν, Αφγανιστάν, Λάος και Νιγηρία. Αξίζει να σημειωθεί πως όλες αυτές οι περιπτώσεις πολιομυελίτιδας ήταν αποτέλεσμα μόλυνσης με WPV1 ή cvdpv, καθώς από το 1999 δεν έχει υπάρξει κρούσμα με WPV2 και από το 2012 με WPV3. Ένδειξη η οποία οδήγησε στην διακήρυξη της εξάλειψης του πολιοϊού τύπου 2 το Σεπτέμβριο του Ως αποτέλεσμα, ακολούθησε η κατάργηση της χορήγησης του Sabin 2 στελέχους τον Απρίλιο του 2016, μέσω του OPV εμβολίου στις μαζικές εκστρατείες εμβολιασμού και μεταστροφή από το τρισθενές OPV (topv) στο δισθενές OPV (bopv). Η κίνηση αυτή έγινε με σκοπό την αποφυγή περαιτέρω περιπτώσεων πολιομυελίτιδας λόγω του τύπου 2 cvdpv. Πέντε κρούσματα εμβόλιο-συνδεόμενης πολιομυελίτιδας λόγω του τύπου 2 cvdpv το 2012 είχαν ως αποτέλεσμα να αφήσουν παράλυτα 37 παιδιά στο Πακιστάν και σε 5 χώρες της Αφρικής (Κένυα, Τσαντ, Δημοκρατία του Κονγκό, Νιγηρία και Σομαλία)(Jorba et al., 2016). Επόμενο σημείο σταθμός αναμένεται να είναι η κατάργηση και του Sabin 3 στελέχους με σκοπό την εξάλειψη και του WPV3 στελέχους από τον πλανήτη. 32

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Εικόνα 1.7.2: Χάρτης των κρουσμάτων πολιομυελίτιδας για το Πηγή: Global Polio Eradication Initiative. Με μπλε χρώμα εμφανίζονται τα κρούσματα πολιομυελίτιδας από αγρίου τύπου στελέχη, ενώ με πορτοκαλί τα εμβολιοπροερχόμενα κρούσματα. Το μέγεθος της κουκκίδας αντιστοιχεί στον αριθμό των κρουσμάτων. 33

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 1.8. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του μηχανισμού παρασκευής ανασυνδυασμένων στελεχών μεταξύ πολιοϊών και πολιοϊών/εντεροϊών της ομάδας C. Για να είναι δυνατή η μελέτη των in vitro ανασυνδυασμών ήταν απαραίτητος ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη ενός αριθμού τεχνικών και μεθόδων. Έτσι στο πρώτο μέρος της μελέτης σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν μέθοδοι για τη γρήγορη ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών, για την αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος, για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας των εντεροϊών και για τη μέτρηση του ιικού τίτλου. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ πολιοϊών και μεταξύ πολιοϊών/ev-cs χρησιμοποιώντας ειδικά εκκινητικά ζεύγη. Στην περίπτωση των In vitro ανασυνδυασμών μεταξύ πολιοϊών και εντεροϊών της ομάδας C, ήταν απαραίτητη και η μελέτη της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Έτσι χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα προγράμματα βιοπληροφορικής πραγματοποιήθηκε ανάλυση της αλληλουχίας των ανασυνδυασμένων στελεχών και συσχέτιση των ανασυνδυασμών αυτών με την πιθανότητα ύπαρξης δευτεροταγών δομών στο RNA μόριο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά τη διάρκεια της διατριβής, εκδόθηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, στα πλαίσια της στρατηγικής περί εκρίζωσης της πολιομυελίτιδας, οδηγία για την καταστροφή των κλινικών εμβολιοπροερχόμενων δειγμάτων και του πρότυπου στελέχους Sabin 2. Ακολουθώντας την οδηγία του ΠΟΥ το εργαστήριο μας κατέστρεψε τα κλινικά δείγματα στις 17 Δεκεμβρίου 2015 και τα δείγματα Sabin 2 στις 30 Μαΐου Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που περιλάμβαναν είτε τα κλινικά εμβολιοπροερχόμενα δείγματα, είτε το πρότυπο στέλεχος Sabin 2, έχουν διεξαχθεί πριν τις αντίστοιχες ημερομηνίες καταστροφής. 34

49 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Πρότυπα Στελέχη Κατά τη διάρκεια του πειραματικού μέρους της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω στελέχη που παρουσιάζονται στον πίνακα Τα στελέχη αυτά προέρχονται από το Ινστιτούτο Παστέρ Παρισίων, από τον οργανισμό ATCC (Rockville, Maryland, USA) και από το NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control, United Kingdom). Από τα στελέχη αυτά 11 ανήκουν στην ομάδα EV-C (CAV1, CAV11, CAV13, CAV17, CAV18, CAV20, CAV21, CAV24, Sabin 1, Sabin 2 και Sabin3) ενώ τα υπόλοιπα 30 ανήκουν στην ομάδα EV-B. Ορότυπος Στέλεχος Αριθμός Καταχώρησης Ορότυπος Στέλεχος Αριθμός Καταχώρησης CAV1 Tompkins AF Echo 9 Barty X92886 CAV9 Griggs D00627 Echo 12 Travis X79047 CAV11 Belgium 1 AF Echo 13 Del Carmen AY CAV13 Flores AF Echo 14 Tow AY CAV17 G-12 AF Echo 15 Ch AY CAV18 G-13 AF Echo 16 Harrington AY CAV20 IH-35 AF Echo 17 CHHE-29 AY CAV21 Coe D00538 Echo 20 JV-1 AY CAV24 EH 24/70 D90457 Echo 21 Farina AY CBV1 Japan M16560 Echo 24 decamp AY CBV2 Ohio-1 AF Echo 25 JV-4 AY CBV3 Nancy M88483 Echo 26 Coronel AY CBV4 JVB X05690 Echo 27 Bacon AY CBV5 Faulkner AF Echo 29 JV-10 AY CBV6 Schmitt AF Echo 30 Bastianni AF Echo 1 Farouk AF Echo 31 Caldwell AY Echo 2 Cornelis AY Echo 33 Toluca-3 AY Echo 3 Morrisey AY Sabin 1 LSc, 2ab V01150 Echo 4 Pesacek AY Sabin 2 P712, Ch, 2ab X00595 Echo 5 Noyce AF Sabin 3 Leon 12a-1-b K00043 Echo 7 Wallace AY Πίνακας : Πρότυπα στελέχη εντεροϊών. Παρουσιάζονται ο ορότυπός τους, το στέλεχος καθώς επίσης και ο αριθμός καταχώρησης στη βάση δεδομένων GenBank. 35

50 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Κλινικά Περιβαλλοντικά Στελέχη Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω κλινικά περιβαλλοντικά δείγματα για τον έλεγχο των μεθόδων που αναπτύσσονταν πάνω στα πρότυπα στελέχη. Τα στελέχη αυτά χωρίζονται στις παρακάτω υποκατηγορίες: Είκοσι (20) κλινικά στελέχη διαφόρων οροτύπων, τα οποία παρουσιάζονται αναλυτικά στον πίνακα και προέρχονται από τη συλλογή δειγμάτων του εργαστηρίου Μικροβιολογίας Ιολογίας και το National Reference Center for Enteroviruses, Cantacuzino Institute, Bucharest, Romania. Ορότυπος Στέλεχος Προέλευση Κλινική Εικόνα Έτος Απομόνωσης CAV9 65/89/1 Cantacuzino Inst, Romania Παροδική παράλυση 1989 CAV9 113/73/2 Cantacuzino Inst, Romania Μόνιμη παράλυση 1973 CAV9 611/80/1 Cantacuzino Inst, Romania Παροδική παράλυση 1980 CAV9 A9/He2 Περιβάλλον / Κύπρος CAV9 A9/He5 Περιβάλλον / Κύπρος CBV1 98/74/2 Cantacuzino Inst, Romania Παροδική παράλυση 1974 CBV1 99/74/1 Cantacuzino Inst, Romania Παροδική παράλυση 1974 CBV2 118/95/2 Cantacuzino Inst, Romania Άγνωστη 1995 CBV3 77/78/13 Cantacuzino Inst, Romania Μηνιγγοεγκεφαλίτιδα 1978 CBV4 69/86/1 Cantacuzino Inst, Romania Γαστρεντερικές διαταραχές 1986 CBV4 169/75/1 Cantacuzino Inst, Romania Γαστρεντερικές διαταραχές 1975 CBV5 14/70/1 Cantacuzino Inst, Romania Μηνιγγίτιδα 1970 CBV5 254/77/1 Cantacuzino Inst, Romania Παράλυση προσώπου 1977 CBV5 7/73/19 Cantacuzino Inst, Romania Επιπεφυκίτιδα 1973 CBV6 86/73/1 Cantacuzino Inst, Romania Παροδική παράλυση 1973 E 5 156/98/1 Cantacuzino Inst, Romania Άγνωστη 1998 E 6 Tsikan Ελλάδα Άσηπτη μηνιγγίτιδα 2001 E 13 Das Ελλάδα Άσηπτη μηνιγγίτιδα 2001 E Ελλάδα Ψευδογριπικά συμπτώματα 1980 E 30 Kar Ελλάδα Άσηπτη μηνιγγίτιδα 2001 Πίνακας : Κλινικά στελέχη διαφόρων εντεροϊών. Παρουσιάζονται ο ορότυπός τους, το στέλεχος, η προέλευσή τους, η κλινική εικόνα των ατόμων εκ των οποίων απομονώθηκαν καθώς επίσης και το έτος απομόνωσης. Δέκα (10) εμβολιοπροερχόμενα δείγματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης ανασυνδυασμών μεταξύ των στελεχών Sabin. Τα δείγματα αυτά προέρχονταν από βιολογικούς καθαρισμούς της Ελλάδος και της Κύπρου, από υγιή 36

51 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ εμβολιασμένα άτομα και από εμβολιασμένα άτομα που εμφάνιζαν VAPP. Τα δείγματα αυτά παρουσιάζονται στον πίνακα : Στέλεχος Προέλευση Γενωμική περιοχή, τύπος και θέση ανασυνδυασμού Αριθμός Καταχώρησης Βιβλιογραφία K/2002 Ουδετεροπενία VP1, S3/S2, EF (Dedepsidis et al., 2008) 742 Περιβάλλον 2A, S1/S3, C, S3/S2, EU (Pliaka et al., 2010) EP23 VAPP 2C, S3/S1, AY (Paximadi et al., 2006) LK3 Περιβάλλον 2C, S3/S2, C, S2/S1, DQ (Paximadi et al., 2008) 2C, S2/S1, I34 VAPP 3D, S1/S2, AY (Karakasiliotis et al., 2005) 3D, S2/S1, EP9 Υγιής OPV 3A, S2/S1, AY (Paximadi et al., 2006) ID VAPP 3C, S2/S1, EU (Karakasiliotis et al., 2004) 738 Περιβάλλον 3C, S3/S2, D, S2/S1, EU (Pliaka et al., 2010) IF Υγιής OPV 3D, S2/S1, AY (Karakasiliotis et al., 2004) 584 Περιβάλλον 2C, S3/S2, D, S2/S1, EU (Pliaka et al., 2010) Πίνακας : Κλινικά εμβολιοπροερχόμενα στελέχη. Παρουσιάζονται το στέλεχος, η προέλευσή τους, ο ορότυπός τους, η θέση και το τύπος ανασυνδυασμού που φέρουν καθώς επίσης και ο αριθμός καταχώρησης στη βάση δεδομένων GenBank Άγνωστα κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα Μετά την ανάπτυξη των μεθόδων και τον έλεγχο τους μέσω των κλινικών περιβαλλοντικών δειγμάτων, οι μέθοδοι αυτοί εφαρμόστηκαν σε άγνωστα κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα αρχικά για την ανίχνευση εντεροϊών, για την ταυτοποίησή τους και στη συνέχεια για τον έλεγχο ανασυνδυασμών. Τα δείγματα αυτά χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: δείγματα Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού (ΕΝΥ) και περιβαλλοντικά δείγματα από βιολογικούς καθαρισμούς της περιφέρειας Θεσσαλίας. Συνολικά ελέγχθηκαν 61 ΕΝΥ που προέρχονταν από ασθενείς με κλινική εικόνα άσηπτης μηνιγγίτιδας: 36 δείγματα ΕΝΥ προέρχονταν από το Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μηνιγγίτιδας (ΕΚΑΜ) και καλύπτουν μια χρονική περίοδο από το 2007 έως το 2012 και τα 37

52 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ υπόλοιπα 25 δείγματα ΕΝΥ προέρχονταν από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ιωαννίνων και καλύπτουν μια χρονική περίοδο από το 2008 έως το Ενώ τα περιβαλλοντικά δείγματα ήταν 10 και προέρχονταν από βιολογικούς καθαρισμούς της περιφέρειας Θεσσαλίας: Γιάννουλη, Καρδίτσα, Λάρισα, Τρίκαλα, Τύρναβος και του οικισμού Μαύρικα ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Η συγκέντρωση των περιβαλλοντικών δειγμάτων είναι ένα απαραίτητο βήμα πριν την απομόνωση των ιών, καθώς ο όγκος των δειγμάτων είναι μεγάλος (κυμαίνεται από 500 έως 1500ml) και η συγκέντρωση των ιών σε αυτά αρκετά χαμηλή. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της έκλουσης προσρόφησης σε ηλεκτραρνητικά φίλτρα. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε σε θάλαμο βιολογικής προστασίας (Biological Safety Cabinet, BSC) επιπέδου 2 (Biological Safety Level 2, BSL 2). Αρχικά 500ml από κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκαν σε 1000rpm για 2 min. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και το ph του ρυθμίστηκε στο 3.8 με την προσθήκη 3Ν HCl. Έπειτα, τα ιοσωμάτια φορτίστηκαν θετικά παρουσία Mg 2+, προσθέτοντας MgCl 2 (Merck, Germany) τελικής συγκέντρωσης 0,05Μ. Στη συνέχεια ακολούθησε αργή ανάδευση και φιλτράρισμα σε ηλεκτραρνητικό φίλτρο διαμέτρου 47mm και πόρου 3μm (MF-Milipore). Το φίλτρο, στην επιφάνεια του οποίου προσροφούνται τα ιικά σωμάτια, μεταφέρθηκε σε αποστειρωμένο ποτήρι ζέσεως 250ml, όπου προστέθηκαν 10ml διαλύματος 0,05M Tris ph:9, εμπλουτισμένο με 3% βόειου αλβουμίνης (BSA). Η έκλουση των ιοσωματίων από τα φίλτρα πραγματοποιήθηκε με αργή ανάδευση για 10 min. Αφού συλλέχθηκε το διάλυμα, τοποθετήθηκαν εκ νέου 10ml διαλύματος έκλουσης και ακολούθησε αργή ανάδευση για 10 min. Το φίλτρο τοποθετήθηκε στους 4 ο C, ενώ το συγκεντρωμένο διάλυμα έκλουσης ρυθμίστηκε χρησιμοποιώντας 3Ν HCl σε ph:7. Ακολούθησε περαιτέρω συγκέντρωση του δείγματος με τη μέθοδο καθίζησης με πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG), όπου στο ανωτέρω δείγμα προστέθηκε 10% w/v PEG6000 και NaCl (Sigma, USA) τελικής συγκέντρωσης 0,5Μ. Το μείγμα αναδεύτηκε για 18 h στους 4 ο C και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 1 h στις rpm. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης απορρίφθηκε και το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 2ml θρεπτικού υλικού κυτταροκαλλιεργειών (ΜΜ). 38

53 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΩΝ 2.3. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΩΝ Κυτταροκαλλιέργειες Για την καλλιέργεια και την απομόνωση των ιών χρησιμοποιήθηκαν δυο διαφορετικές κυτταρικές σειρές: Rd (Rhabdomyosarcoma) και Hep-2 (Human epidermoid carcinoma HeLa contaminated). Οι διαδικασίες καλλιέργειας και απομόνωσης ιών πραγματοποιήθηκαν κάτω από άσηπτες συνθήκες, σε ειδικές συσκευές καθέτου νηματικής ροής επιπέδου βιοασφάλειας 2, χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα υλικά (υγρά αντιδραστήρια, γυάλινα και πλαστικά σκεύη). Για την ανάπτυξη των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το μέσο ανάπτυξης (Growth Medium, GM), το οποίο περιείχε υψηλή περιεκτικότητα σε βόειο ορό (10%), επάγοντας τη γρήγορη ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Για τη διατήρηση των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το μέσο διατήρησης (Maintenance Medium, MM), το οποίο περιείχε μια μέση περιεκτικότητα σε ορό (2-5%), διατηρώντας έτσι μια αργή ανάπτυξη των κυττάρων κατά τη διάρκεια του ιικού πολλαπλασιασμού. Οι κυτταρικές σειρές φυλάσσονται στους -80 ο C παρουσία κρυοπροστατευτικού διαλύματος DMSO σε ειδικά φιαλίδια. Κατά τη διαδικασία της απόψυξης τα φιαλίδια μεταφέρθηκαν σε υδατόλουτρο με απεσταγμένο νερό σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα φιαλίδια φυγοκεντρήθηκαν για 3 min στις 8.000rpm, το υπερκείμενο που περιείχε DMSO απορρίφθηκε και τα κύτταρα επαναδιαλύθηκαν σε 2ml GM. Το εναιώρημα τοποθετήθηκε σε πλαστικές φιάλες κυτταροκαλλιεργειών 25cc, προστέθηκαν 5ml GM και η φιάλη τοποθετήθηκε στους 37 ο C για να αναπτυχθούν τα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετάζονταν καθημερινά με παρατήρηση σε ανάστροφο μικροσκόπιο διέλευσης φωτός, για να διαπιστωθεί τόσο η ποιότητά τους όσο και η κάλυψη της επιφάνειας της πλαστικής φιάλης κυτταροκαλλιεργειών. Όταν η κάλυψη των κυττάρων ήταν περίπου στο 90% της επιφάνειας της φιάλης, τότε ακολουθούσε ο αναδιπλασιασμός των κυττάρων, κατά τον οποίο αρχικά απομακρύνονταν το θρεπτικό μέσο, και ακολουθούσαν δυο διαδοχικές πλύσεις με διάλυμα θρυψίνης EDTA με επώαση για 2 min στους 37 ο C για την αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια της φιάλης. Στη συνέχεια τα αποκολλημένα κύτταρα επαναδιαλύονταν σε 21ml μέσου GM με ταυτόχρονη ανάδευση με πιπέτα έτσι ώστε να διαλυθούν τυχόν συσσωματώματα κυττάρων. Τέλος το εναιώρημα των κυττάρων μοιραζόταν σε τρεις πλαστικές φιάλες και τοποθετούταν στους 37 ο C, έως ότου χρειαζόταν εκ νέου αναδιπλασιασμός. 39

54 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΩΝ Διαλύματα: Growth Medium (GM): Για την κυτταρική σειρά RD: Dulbecco s Modified Eagle s Medium (D-MEM) (Biosera, France), 1Μ HEPES (Merck, Germany), 1X Antibiotic Antimycotic (Biosera, France) το οποίο περιέχει πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη και αμφοτερικίνη Β, 1X Non-essential amino acids (Biosera, France) και 10% Fetal Bovine Serum (Biosera, France) Για την κυτταρική σειρά Hep-2: Eagle s Minimum Essential Medium (MEM) (Biosera, France), 1X Antibiotic Antimycotic (Biosera, France) και 10% Fetal Bovine Serum (Biosera, France) Maintenance Medium (MM): Για την κυτταρική σειρά RD: Dulbecco s Modified Eagle s Medium (D-MEM) (Biosera, France), 1Μ HEPES (Merck, Germany), 1X Antibiotic Antimycotic (Biosera, France), 1X Nonessential amino acids (Biosera, France) και 5% Fetal Bovine Serum (Biosera, France) Για την κυτταρική σειρά Hep-2: Eagle s Minimum Essential Medium (MEM) (Biosera, France), 1X Antibiotic Antimycotic (Biosera, France) και 2% Fetal Bovine Serum (Biosera, France) Διάλυμα Θρυψίνης EDTA: Hank s Balanced Salt Solution (Biosera, France) και 1Χ Trypsin EDTA (Biosera, France) Μέτρηση κυττάρων Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε έτσι ώστε να είναι δυνατός ο υπολογισμός του MOI (Multiplicity of Infection) που θα περιγραφεί αναλυτικά παρακάτω. Η μέτρηση αφορούσε τον αριθμό των Rd κυττάρων που περιέχονταν σε πλάκα κυτταροκαλλιεργειών 24 θέσεων. Αρχικά προστέθηκε 1ml εναιωρήματος κυτταροκαλλιέργειας σε θρεπτικό μέσο GM σε κάθε θέση της πλάκας και ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για 24 h για την πλήρη κάλυψη της επιφάνειας από τα Rd κύτταρα. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το θρεπτικό υλικό και προστέθηκαν 0.5ml διαλύματος θρυψίνης EDTA εις διπλούν για την αποκόλληση των κυττάρων. Έπειτα, προστέθηκε 1ml θρεπτικού υλικού D-MEM απουσία ορού με ταυτόχρονη ανάδευση για την διάσπαση τυχόν συσσωμάτων. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν 0.2ml εναιωρήματος κυττάρων και 0.2ml διαλύματος Trypan Blue (0.1% w/v) σε σωλήνα eppendorf (2ml) και αναμείχθηκαν με 40

55 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΩΝ πιπετάρισμα. Χρησιμοποιώντας πιπέτα Pasteur μεταφέρθηκε αρκετή ποσότητα του μίγματος στην εγκοπή του αιμοκυτταρόμετρου Εικόνα : Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer. Οι τέσσερις γωνίες είναι οι θέσεις στις οποίες γίνεται η καταμέτρηση των κυττάρων. Τα κύτταρα που βρίσκονταν σε όλες τις υπόλοιπες θέσεις, καθώς επίσης και πάνω στις γραμμές δεν μετρούνται. Neubauer, έτσι ώστε να καλύπτεται όλη η επιφάνεια του αιμοκυτταρόμετρου, το οποίο στη συνέχεια τοποθετήθηκε στο ανάστροφο μικροσκόπιο για την παρατήρηση και καταγραφή των ζωντανών κυττάρων. Λόγω του διαλύματος Trypan Blue τα νεκρά κύτταρα βάφονται μπλε, οπότε μετρήθηκαν μόνο τα λευκά κύτταρα και μόνο όσα βρίσκονταν στις τέσσερις γωνίες του αιμοκυτταρόμετρου (εικόνα ). Ο υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων ανά ml έγινε με βάση τον παρακάτω τύπο: C = tcn x df x 0.25 x 10 4 tcn: ο συνολικός αριθμός των κυττάρων df: ο συντελεστής αραίωσης του διαλύματος που μελετήθηκε Ενοφθαλμισμός των δειγμάτων σε κυτταροκαλλιέργειες Η μόλυνση των κυττάρων με τα κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα πραγματοποιήθηκε σε πλαστικούς σωλήνες κυτταροκαλλιεργειών (Corning, USA). Αρχικά μεταφέρθηκαν 2ml εναιωρήματος κυττάρων σε θρεπτικό μέσο ΜΜ και οι σωλήνες επωάστηκαν για 24 h στους 37 ο C. Στη συνέχεια, αφού παρατηρήθηκαν οι σωλήνες ως προς την ποιότητα και την ποσότητα των κυττάρων, μεταφέρθηκαν σε διαφορετική συσκευή καθέτου νηματικής ροής επιπέδου βιοασφάλειας 2 για τον ενοφθαλμισμό. 100μl από το κάθε δείγμα τοποθετήθηκαν σε κάθε σωλήνα. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν και δυο σωλήνες ως μάρτυρες, ένας θετικός μάρτυρας στον οποίο τοποθετήθηκαν 100μl Sabin 1 στελέχους γνωστής συγκέντρωσης και ένας αρνητικός μάρτυρας στον οποίο τοποθετήθηκαν 100μl θρεπτικού μέσου ΜΜ. 41

56 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΙΩΝ Οι σωλήνες μετά τη μόλυνση τοποθετήθηκαν σε περιστρεφόμενο κύλινδρο υπό κλίση (5 ο ) στους 37 ο C. Ακολούθησε καθημερινή παρατήρηση των σωλήνων στο ανάστροφο μικροσκόπιο για τον εντοπισμό της ύπαρξης κυτταροπαθογόνου δράσης και τα αποτελέσματα καταγράφονταν. Η παρατήρηση των σωλήνων ολοκληρωνόταν με τον εντοπισμό αλλοίωσης ή νέκρωσης σε μεγάλο ποσοστό στα κύτταρα του αρνητικού μάρτυρα συνήθως 5 με 6 ημέρες μετά την μόλυνση. Για την αύξηση του ιικού τίτλου η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές, όπου μετά το τέλος της πρώτης καλλιέργειας ακολουθούσε νέα μόλυνση κυττάρων χρησιμοποιώντας 100μl από την πρώτη καλλιέργεια και ούτω καθεξής. Το υλικό μετά το τέλος της τελευταίας ανακαλλιέργειας συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -20 ο C για περαιτέρω ανάλυση Σειριακές Αραιώσεις Οι σειριακές αραιώσεις πραγματοποιήθηκαν στα κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα, προκειμένου να διαχωριστούν πιθανά μείγματα ιών. Οι αραιώσεις αυτές κυμάνθηκαν από 10-1 μέχρι της αρχικής συγκέντρωσης. Οι σειριακές αραιώσεις έγιναν σε πλαστικούς σωλήνες των 2ml (eppendorf) με τη χρήση θρεπτικού υλικού ΜM απουσία βόειου ορού. Κατόπιν 100μl της κάθε αραίωσης ενοφθαλμίστηκε σε πλάκες μικροτιτλοποίησης (εικόνα ) οι οποίες περιείχαν κύτταρα ανεπτυγμένα σε θρεπτικό υλικό MM. Ο ενοφθαλμισμός της κάθε αραίωσης έγινε εις διπλούν ώστε να είναι αξιόπιστη Εικόνα : Πλάκα μικροτιτλοποίησης για τις σειριακές αραιώσεις των δειγμάτων. Η κάθε πλάκα χρησιμοποιήθηκε για τον ενοφθαλμισμό 4 δειγμάτων (ΑΒ: το πρώτο δείγμα, CD: το δεύτερο δείγμα, EF: το τρίτο δείγμα, GH: το τέταρτο δείγμα). Οι αριθμοί μέσα στα πηγαδάκια απεικονίζουν τις σειριακές αραιώσεις των κλινικών δειγμάτων ενώ με το γράμμα Μ απεικονίζεται η θέση των μαρτύρων. 42

57 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Οι πλάκες παρέμειναν στους 37 ο C μέχρι την εμφάνιση χαρακτηριστικής κυτταροπαθογόνου δράσης (CPE: cytopathic effect) λαμβάνοντας υπόψη και την κατάσταση των αρνητικών μαρτύρων. Στη συνέχεια το περιεχόμενο των πηγαδιών της πλάκας με τη μεγαλύτερη αραίωση που παρουσίασε CPE ενοφθαλμίστηκε σε πλαστικούς σωλήνες κυτταροκαλλιεργειών που περιείχαν κύτταρα ανεπτυγμένα σε θρεπτικό υλικό MM. Οι πλαστικοί σωλήνες κυτταροκαλλιεργειών παρέμειναν στους 37 ο C μέχρι την εμφάνιση CPE λαμβάνοντας υπόψη και την κατάσταση των αρνητικών μαρτύρων. Τέλος, μετά την παρατήρηση CPE οι πλαστικοί σωλήνες κυτταροκαλλιεργειών διατηρήθηκαν στους -20 ο C μέχρι να ακολουθήσει το επόμενο στάδιο της εκχύλισης του γενετικού υλικού του ιού ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Ο αριθμός των ιικών σωματιδίων που περιέχονται σε 100μl του ιικού δείγματος αποτελεί τον τίτλο του ιού. Ο ιικός τίτλος υπολογίστηκε για τα 10 εμβολιοπροερχόμενα ανασυνδυασμένα δείγματα, καθώς και για τα πρότυπα Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3, CAV 13, CBV6 και Echo 12. Σε πλάκα μικροτιτλοποίησης 96 θέσεων (εικόνα ) προστέθηκαν 100μl κυττάρων (περίπου κύτταρα) ανά θέση και ακολούθησε επώαση για 24 h στους 37 ο C. Στη συνέχεια, για κάθε ιικό δείγμα έγιναν σειριακές υποδεκαπλάσιες αραιώσεις έως την αραίωση Σε κάθε πλάκα μικροτιτλοποίησης υπολογίστηκε ο τίτλος 2 διαφορετικών ιικών στελεχών. Έπειτα, 400μl της 10-1 αραίωσης του πρώτου ιικού στελέχους ενοφθαλμίστηκαν στις θέσεις Β2-Β5 (100μl / θέση), ενώ 400μl της 10-1 αραίωσης του δεύτερου ιικού στελέχους ενοφθαλμίστηκαν στις θέσεις Β6-Β9 (100μl / θέση). Η διαδικασία επαναλήφθηκε μέχρι και τον ενοφθαλμισμό της 10-6 αραίωσης στην πλάκα. Στις στήλες 10 και 11 δεν προστέθηκε ιικό δείγμα καθώς αποτελούν τους αρνητικούς μάρτυρες. Η πλάκα τοποθετήθηκε για επώαση στους 37 ο C και η παρακολούθησή της για εμφάνιση κυτταροπαθογόνου δράσης σε καθημερινή βάση διήρκησε 5 μέρες. Ο τύπος μέσω του οποίου υπολογίστηκε ο ιικός τίτλος είναι: logccid 50 = L-d(S-0.5) CCID: Cell Culture Infective Dose L: η μεγαλύτερη αραίωση όπου εμφανίστηκε πλήρης κυτταροπαθογόνος δράση d: η εκθετική διαφορά μεταξύ των αραιώσεων S: το άθροισμα των θέσεων που παρατηρήθηκε πλήρης κυτταροπαθογόνος δράση. 43

58 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Στις PCR που ακολούθησαν χρησιμοποιήθηκαν φθίνουσες συγκεντρώσεις του κάθε δείγματος με σκοπό να μετρηθεί και η ευαισθησία της κάθε PCR δοκιμασίας. Για το λόγο αυτό έγιναν σειριακές αραιώσεις του κάθε δείγματος (όπως περιγράφηκαν στην ενότητα 2.3.3) έτσι ώστε κάθε δείγμα να υπάρχει σε συγκεντρώσεις των τιμών από 10 5 εως και 1 CCID 50 /0,1ml ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Η μόλυνση των Rd κυττάρων με στελέχη Sabin 1 και CAV13 ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκε με σκοπό τη παραγωγή in vitro ανασυνδυασμένων στελεχών. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε πλαστική πλάκα κυτταροκαλλιεργειών 24 θέσεων στην οποία προστέθηκε αρχικά 1ml εναιωρήματος Rd κυττάρων σε θρεπτικό μέσω ΜΜ και ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για 24 h για την κάλυψη της επιφάνειας από τα κύτταρα. Στη συνέχεια, αφού παρατηρήθηκαν τα κύτταρα ως προς την ποσότητα και την ποιότητα προστέθηκαν τα δύο στελέχη με τον ανάλογο ιικό τίτλο έτσι ώστε να επιτευχθεί ΜΟΙ (Multiplicity of Infection) = 10. Ο τύπος μέσω του οποίου προσδιορίζεται το ΜΟΙ έχει ως εξής: ΜΟΙ= CCID 50 Αριθμός Κυττάρων Μέσω του τύπου αυτού υπολογίστηκε ο επιθυμητός ιικός τίτλος των δύο στελεχών και υπολογίστηκε η ποσότητα που έπρεπε να προστεθεί στην κυτταροκαλλιέργεια. Ταυτόχρονα χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον θέσεις στη πλάκα ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες της μόλυνσης. Στους θετικούς μάρτυρες είχαν προστεθεί Sabin 1 και CAV13 σε διαφορετικές θέσεις με MOI=10 και στους αρνητικούς προστέθηκε μόνο θρεπτικό μέσο απουσία ορού. Μετά την μόλυνση των κυττάρων ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για 1 h και στη συνέχεια το θρεπτικό υλικό απομακρύνθηκε και προστέθηκε 1ml νέου θρεπτικού ΜΜ και η πλάκα τοποθετήθηκε στους 37 ο C για 24 h. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε με σκοπό την απομάκρυνση των ιών που δεν είχαν εισέλθει στα κύτταρα στο χρονικό διάστημα της μιας ώρας. Μετά το πέρας των 24 h τα κύτταρα της πλάκας παρατηρήθηκαν στο ανάστροφο μικροσκόπιο, όπου εντοπίστηκε πλήρης καταστροφή των κυττάρων (4 + CPE) τόσο στους θετικούς μάρτυρες, όσο και στην υπό μελέτη θέση. Στους αρνητικούς μάρτυρες δεν παρατηρήθηκε αλλοίωση των κυττάρων. 44

59 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ RNA Το υλικό (1ml) της μόλυνσης κυττάρων της υπό μελέτης θέσης συλλέχθηκε και τοποθετήθηκε 10 θέσεις (100μl / θέση) μικροπλάκας 96 θέσεων που είχαν τοποθετηθεί κύτταρα Rd σε θρεπτικό ΜΜ. Ακολούθησε επώαση της μικροπλάκας στους 37 ο C για 24 h και το υλικό της κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκε και από τις 10 θέσεις και τοποθετήθηκε στου -20 ο C για περαιτέρω μελέτη. Μέσω της διαδικασίας αυτής δημιουργήθηκαν 10 διαιρέσεις (aliquots) του αρχικού δείγματος που είχε προκύψει έπειτα από την ταυτόχρονη μόλυνση με Sabin 1 και CAV13. Τα 10 aliquots διαιρούν το αρχικό δείγμα και επιτρέπουν την καλύτερη μελέτη των πολλών και διαφορετικών ανασυνδυασμών που μπορεί να προκύψουν, σε σχέση με τη μελέτη ενός δείγματος όπου θα εντοπίζονταν μόνο ο συνηθέστερος ανασυνδυασμός εις βάρος των υπολοίπων πιθανών ανασυνδυασμών ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ RNA Η εκχύλιση του ιικού γενετικού υλικού (RNA) έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του Casas (Casas et al., 1995). Συγκεκριμένα, σε eppendorf των 2ml τοποθετήθηκαν 300μl Lysis Buffer το οποίο αποτελείται από 4M GuSCN, 0,5 % N-lauroyl sacrosine, 1mM dithiotreitol και 25mM sodium citrate. Επίσης προστέθηκαν 10μl γλυκογόνου (100 mg/ml) και τέλος 100μl δείγματος από το υλικό της ενοφθαλμισμένης κυτταροκαλλιέργειας. Ακολούθησε ισχυρή ανάδευση (vortex) του μίγματος και επώαση για 20 min σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προστέθηκαν 400μl ισοπροπανόλης (-20 ο C) και ακολούθησε ξανά vortex του μίγματος και επώαση για 20 min στον πάγο. Μετά την επώαση, ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 min στα 14000rcf και απομάκρυνση του υπερκειμένου. Στο ίζημα που απέμεινε προστέθηκαν 500μl αιθανόλης 70% και στη συνέχεια ακολούθησε vortex για την διαλυτοποίηση του ιζήματος και ξανά φυγοκέντρηση για 10 min στα 14000rcf. Τέλος, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 100μl διπλά απεσταγμένου ύδατος (ddh 2 O). Τα eppendorf παρέμειναν στους -20 ο C μέχρι να ακολουθήσει το επόμενο στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής. Για την εκχύλιση του ιικού RNA από τα δείγμα ΕΝΥ χρησιμοποιήθηκε το QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Germany), όπου 140μl του κάθε δείγματος ΕΝΥ χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή έτσι ώστε να προκύψουν μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της εκχύλισης 60μl διαλύματος εκχύλισης για κάθε ΕΝΥ. 45

60 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ 2.7. ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή επιλέχθηκαν από την υπάρχουσα βιβλιογραφία ή σχεδιάστηκαν ειδικά για την ενίσχυση διαφόρων τμημάτων. Ο σχεδιασμός των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή έγινε μέσω του προγράμματος Primer3 Plus (Rozen & Skaletsky, 2000) και με βάση τα εξής γενικά κριτήρια: Μήκος εκκινητών από 20 έως 22 βάσεις Σημείο τήξης (Tm) από 57 ο C έως 63 ο C Ποσοστό σε GC από 50% έως 60% Από τα ζεύγη εκκινητών που προέκυψαν, επιλέχθηκαν τα ζεύγη εκείνα που εμφάνιζαν τη μικρότερη συμπληρωματικότητα τόσο στα άκρα όσο και σε ολόκληρο το μήκος τους, έτσι ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία διμερών μεταξύ των εκκινητών και δομών φουρκέτας, φαινόμενο που παρεμποδίζει τη διαδικασία της PCR. Όλοι οι εκκινητές που αναλύονται παρακάτω κατασκευάστηκαν από την εταιρία Macrogen (South Korea) Εκκινητές για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών Για την μοριακή ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών επιλέχθηκαν τα ζεύγη εκκινητών που παρουσιάζονται στον πίνακα Οι εκκινητές αυτοί στοχεύουν στην 5 UTR (μια συντηρημένη περιοχή των εντεροϊών) για την ανίχνευση, στην VP1 γενωμική περιοχή για την ταυτοποίηση των εντεροϊών έπειτα από αλληλούχηση του ενισχυμένου τμήματος και στην 2C γενωμική περιοχή για την διάκριση μεταξύ εντεροϊών της ομάδας B και C (EV-Bs, EV-Cs), καθώς το εκκινητικό ζεύγος που επιλέχθηκε ενισχύει την αντίστοιχη αλληλουχία δίνοντας ένα προϊόν συγκεκριμένου μήκους μόνο στην περίπτωση στους EV-Bs. Εκκινητής Αλληλουχία (5 3 ) Πολικότητα Θέση Γενωμική Περιοχή Βιβλιογραφία UG52 CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG Sense UTR (Zoll et al., 1992) UC53 TTGTCACCATAACCAGCCA Antisense UTR (Zoll et al., 1992) ΑΝ89 CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG Sense VP1 (Nix et al., 2006) ΑΝ88 TACTGGACCACCTGGNGGNAYRWACAT Antisense VP1 (Nix et al., 2006) CHR1 CNTCHCARAGTGAYCARGARCARYT Sense C (Kottaridi et al., 2007) CHR2 GTAYACYGGTGGWCCYTGRAAKA Antisense C (Kottaridi et al., 2007) Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών. Η θέση των εκκινητών πάνω στο γονιδίωμα βασίζεται στο πρότυπο στέλεχος Polio 1 Mahoney για τους τέσσερις πρώτους εκκινητές και στο Echo 7 Wallace για τους CHR1 και CHR2. 46

61 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ στελεχών Sabin Για την μοριακή ανίχνευση των ανασυνδυασμών σε εμβολιοπροερχόμενα δείγματα σχεδιάστηκαν οι εκκινητές που παρουσιάζονται στον πίνακα Οι εκκινητές αυτοί σχεδιάστηκαν με ορισμένα επιπλέον κριτήρια σε σχέση με τους τυπικούς εκκινητές μιας PCR. Τα κριτήρια αυτά ήταν τα εξής: Σχεδιάστηκαν ανοδικά και καθοδικά της θέσης ανασυνδυασμού, έτσι ώστε κάθε εκκινητής του ζεύγους να εμφανίζει συμπληρωματικότητα με διαφορετικό ορότυπο των στελεχών Sabin (S1,S2,S3), ανάλογα με τον υπό μελέτη ανασυνδυασμό. Έφεραν τουλάχιστον 2 αταίριαστα ζευγαρώματα (mismatches) μεταξύ του εκκινητή και των υπόλοιπων 2 στελεχών Sabin στα τελευταία 4 νουκλεοτίδια του 3 άκρου του εκκινητή για την αποφυγή των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω κριτήρια σχεδιάστηκαν οι εξής εκκινητές: Εκκινητής Αλληλουχία (5 3 ) Πολικότητα Θέση VP1-S3/S2-S GTACAGCGCCATGACAGTTG Sense c VP1-S3/S2-A TTTCTGGTAGTGGGGTGAGC Antisense b 2A-S1/S3-S GGTACGCTTACACCCCTCTC Sense a 2A-S1/S3-A CCTTGCTATTGAGTCGGTACCT Antisense c 2C-S3/S1-S AGCCTCCACCAACTCCAGTC Sense c 2C-S3/S1-A CCTGGTGTCCAGCAAACAGT Antisense a 2C-S2/S1-S AGTACTCCAGAGACGGAAAGC Sense b 2C-S2/S1-A CCTGGCTGGTGATGTTGACT Antisense a 3C-S2/S1-S TAGCCGGTGTCGTGTACGTT Sense b 3C-S2/S1b-A AGCGCTTTGGCATCCAAG Antisense a 3C-S3/S2-S CCACTCAAATCACCGAGACG Sense c 3C-S3/S2-A TGATCGGGTATCCCACTTCT Antisense b 3D-S1/S2-S TCCACGACAACGTGGCTATT Sense a 3D-S1/S2-A GTTGGCCAGCGTAATGATCC Antisense b 3D-S2/S1-S AAGGAACCAGCAGTCCTTACC Sense b 3D-S2/S1-A GATCGCACCCTACTGCTGAA Antisense a 3D-S2/S1b-S TTGGGGACAGGGTGGATTAT Sense b 3D-S2/S1b-A GCCAAGCTAATAGGCACAGA Antisense a Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών σε Sabin στελέχη. Η θέση των εκκινητών πάνω στο γονιδίωμα βασίζεται στα πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin 1(a), Sabin 2(b) και Sabin 3(c). 47

62 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ Εκκινητές για την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των στελεχών Sabin Για την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των πρότυπων στελεχών Sabin αλλά και των εμβολιοπροερχόμενων στελεχών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed - PCR). Στην τεχνική αυτή χρησιμοποιείται αρχικά ένα εκφυλισμένο ολιγονουκλεοτίδιο μήκους 22 βάσεων το οποίο φέρει τρεις διακριτές περιοχές. Αρχικά μια περιοχή μήκους 10 νουκλεοτιδίων στο 5 άκρο με συγκεκριμένη αλληλουχία ακολουθούμενη από την εκφυλισμένη περιοχή στο μέσο του εκκινητή που αποτελείται από ινοσίνη και 6 νουκλεοτίδια με τυχαίες βάσεις, καταλήγοντας στο 3 άκρο που φέρει 5 νουκλεοτίδια συγκεκριμένης αλληλουχίας. Με τον DOP εκκινητή πραγματοποιείται μια προενίσχυση η οποία ακολουθείται από μια σειρά PCR αντιδράσεων για την ενίσχυση τμημάτων μεγάλου μήκους. Οι εκκινητές αυτοί παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Εκκινητές Αλληλουχία (5 3 ) Πολικότητα Θέση Γενωμική Περιοχή Βιβλιογραφία DOP CCGACTCGAGINNNNNNTGTGG (Nanda et al., 2008) TS1 TACCCTTGTACGCCTGTTTT Sense a 5 -UTR (Kyriakopoulou et al., 2013) SAB222S ATCCGTTACCCGCTTGTGTA Sense a 5 -UTR Παρούσα Διατριβή HEV C-11 CGCTGTCTTTGTAGTAGTTGAT Antisense a VP4 Kyriakopoulou et al., 2013) UG1 TTTGTGTCAGCGTGTTAATG Sense a VP3 (Balanant et al., 1991) SAB2541A3 TGTTGCTTCGGGAGTGAC Antisense c VP1 Παρούσα Διατριβή S 3 26 GCCGTAAGTTGGAGTTTTTCAC Sense c VP1 (Dedepsidis et al., 2006) UC1 GAATTCCATGTCAAATCTAGA Antisense a VP1 (Balanant et al., 1991) SAB5150S ACGAGTCCCCCTCCTGAAT Sense a 3A Παρούσα Διατριβή S TGATGTTCCTCTCTGTTTGAACC Antisense b 3Β (Paximadi et al., 2006) UG16 GTTGGTGGGAACGGTTCACA Sense a 3C (Guillot et al., 2000) SAB6448A CAGTGGGAGGTTGATTCCAT Antisense a 3D Παρούσα Διατριβή HEV C-425 CTCCGAATTAAARRAAAATTTAC Antisense a 3 -UTR (Oberste et al., 2006) Πίνακας : Εκκινητές για την ενίσχυση ολόκληρου γονιδιώματος Sabin στελεχών. Η θέση των εκκινητών πάνω στο γονιδίωμα βασίζεται στα πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin 1(a), Sabin 2(b) και Sabin 3(c) Εκκινητές για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας των εντεροϊών Για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας των εντεροϊών μέσω ανίχνευσης του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου των εντεροϊών σχεδιάστηκαν εκκινητές τόσο για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής (RT), όσο και για την αντίδραση της PCR. Ο 48

63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ εκκινητής της RT, ENTNS1-RT, είναι ένα DNA ολιγομερές μήκους 30 νουκλεοτιδίων με Εικόνα : Δομή του ENTNS1-RT εκκινητή χαρακτηριστική δομή στελέχους θηλιάς (stemloop) στο 5 άκρο και μονόκλωνη μορφή στο 3 άκρο, όπως φαίνεται και στην εικόνα Ως προς την αλληλουχία του, το 3 άκρο το εκκινητή είναι συμπληρωματικό σε συντηρημένη περιοχή της 5 - UTR του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου των εντεροϊών. Το 5 άκρο του εκκινητή στην περιοχή της θηλιάς φέρει μια συγκεκριμένη αλληλουχία η οποία δεν εντοπίζεται στο γονιδίωμα των εντεροϊών και δημιουργεί μια θέση υβριδισμού του sense εκκινητή της PCR που ακολουθεί. Για την αντίδραση της PCR σχεδιάστηκε ένας sense εκκινητής μήκους 18 νουκλεοτιδίων, ENTNS1-F, ο οποίος φέρει την ίδια αλληλουχία με αυτή που εντοπίζεται στην θηλιά του ENTNS1-RT εκκινητή. Ως antisense εκκινητής επιλέχθηκε ο UC53-Flap. Πρόκειται για τον UC53 εκκινητή που περιγράφηκε ανωτέρω και φέρει επιπλέον ΤΑ επαναλήψεις στο 5 άκρο του με σκοπό να αυξάνεται το Tm του και να συμπίπτει όσο το δυνατόν περισσότερο με το Tm του sense εκκινητή. Για τον θετικής πολικότητας RNA κλώνο χρησιμοποιήθηκε ο εκκινητής UC53-Flap ως εκκινητής της RT και το ζεύγος UG52-Flap / UC53-Flap για τις μετέπειτα PCR αντιδράσεις. Το ζεύγος ENV-2 / ENV-1 χρησιμοποιήθηκε κατά τις Nested-PCR αντιδράσεις που ακολούθησαν. Πρόκειται για ένα ζεύγος που τοποθετείται εσωτερικά του αρχικού ζεύγους EntNS1-F / UC53-Flap, αποδίδοντας ένα προϊόν μήκους 148bp. Εκκινητής Αλληλουχία (5 3 ) Θέση Πολικότητα EntNS1-RT TGTGcgttccccgccgtcgcacTTCTGTTT Sense EntNS1-F cgttccccgccgtcgcac - Sense UG52-Flap AATAAATCATAACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG Sense UC53-Flap AATAAATCATAATTGTCACCATAACCAGCCA Antisense ENV-2 CCCCTGAATGCGGCTAATC Sense ENV-1 GATTGTCACCATAAGCAGC Antisense Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου. Η θέση των εκκινητών πάνω στο γονιδίωμα βασίζεται στο πρότυπο εμβολιακό στέλεχος Sabin 1. Με έντονη γραφή προσδιορίζεται η αλληλουχία του εκκινητή που είναι ειδική για τους εντεροϊούς, ενώ με πλάγια γραφή η κοινή αλληλουχία μεταξύ ENTNS1-RT και ENTNS1-F εκκινητών. 49

64 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΚΚΙΝΗΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 Οι τελευταίοι εκκινητές που σχεδιάστηκαν ήταν οι εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV 13 πρότυπων στελεχών. Οι εκκινητές αυτοί, όπως και στην περίπτωση των εκκινητών για την ανίχνευση ανασυνδυασμών στα εμβολιοπροερχόμενα δείγματα, σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να είναι συμπληρωματικοί ανά ζεύγος ο sense σε Sabin 1 αλληλουχία και ο antisense σε CAV 13 αλληλουχία και αντίστροφα. Εκκινητής Αλληλουχία (5 3 ) Θέση Πολικότητα CAV673S GGATTCACTCCATTGAACACA Sense SAB781S CGAGAATTCTAACCGAGCCTA Sense SAB2366S1 CCTCTTTCGACACCCAGAGA Sense CAV2517A GCGTTAGACGCAACTTGTTGTA Antisense CAV2519S TTACAATTGTCCCAGCCAAC Sense SAB2596A CTTGGAGTGTGCTGGTCCAC Antisense SAB3466S GCAAAACGCAGTGAACGTC Sense CAV3521A GATCACGCTCCCACATACTT Antisense CAV3840S CCATGGAACAGGGTATCACTTC Sense SAB3950A GCTTTTCAGTGATGGTACTGG Antisense SAB4113S1 TCACCAAGCAAGGTGACAG Sense CAV4153A CCAAGAATCACCTTGTTTCAA Antisense CAV5020S GGACAAGTACTCCAGGCAGA Sense SAB5207A CCTCCTGGGAGTCAACTGCT Antisense CAV5519A TGCTGGTGGTGGCAGTAGTT Antisense SAB5527S CCACGACAACGTGGCTATTT Sense CAV6637A ACCAACTGCACTACCAGTGAC Antisense SAB6754A1 GATTTTCTCAAGCACCATCTCT Antisense Πίνακας : Εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13. Η θέση των εκκινητών πάνω στο γονιδίωμα βασίζεται στο πρότυπο εμβολιακό στέλεχος Sabin 1 για τους εκκινητές με αρχικά SAB και στο πρότυπο στέλεχος CAV13 για τους εκκινητές με αρχικά CAV Εκκινητές για την Real-Time PCR Οι εκκινητές που επιλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στις Real-Time PCR κατά την μέτρηση του ιικού τίτλου του CAV13 στελέχους, αλλά και κατά τον έλεγχο της ίσης κατανομής των προϊόντων της DOP-PCR παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. 50

65 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Εκκινητές Αλληλουχία (5 3 ) Πολικότητα Θέση Γενωμική Περιοχή Βιβλιογραφία UG52 CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG Sense UTR (Zoll et al., 1992) UC53 TTGTCACCATAACCAGCCA Antisense UTR (Zoll et al., 1992) UG1 TTTGTGTCAGCGTGTTAATG Sense VP3 (Balanant et al., 1991) UC1 GAATTCCATGTCAAATCTAGA Antisense VP1 (Balanant et al., 1991) UG16 GTTGGTGGGAACGGTTCACA Sense C (Guillot et al., 2000) UC12 TCAATTAGTCTGGATTTTCCCTG Antisense D (Guillot et al., 2000) Πίνακας : Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην Real-Time PCR ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Επειδή το γενετικό υλικό των εντεροϊών είναι ένα μονόκλωνο RNA, η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής κατά την οποία από το RNA συντίθεται ένα cdna είναι απαραίτητη προκειμένου να ακολουθήσει PCR για την ενίσχυση της περιοχής του γενώματος που μας ενδιαφέρει. Για όλες τις PCR που ακολούθησαν πραγματοποιήθηκε αντίστροφη μεταγραφή με χρήση τυχαίων εκκινητών. Πρόκειται για μίγμα επτανουκλεοτιδίων με τυχαία αλληλουχία που υβριδίζεται σε πολλές θέσεις πάνω στο γονιδίωμα του ιού παράγωντας έτσι ένα μίγμα από cdnas μετά το πέρας της αντίδρασης που καλύπτει το μεγαλύτερο ποσοστό του ιικού γονιδιώματος. Στην περίπτωση των PCR για την ανίχνευση του αρνητικής και θετικής πολικότητας κλώνου του ιού χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί εκκινητές κατά την αντίστροφη μεταγραφή. Με τη χρήση του ειδικού εκκινητή, χαρακτηριστικά του οποίου αναλύθηκαν ανωτέρω, συντίθεται το cdna μόνο του αρνητικής ή θετικής πολικότητας κλώνου, δίνοντας έτσι την επιθυμητή εξειδίκευση που απαιτείται για την ανίχνευση της ενεργότητας του ιού Αντίστροφη μεταγραφή με χρήση τυχαίων εκκινητών Αρχικά προετοιμάστηκε το πρώτο μίγμα το οποίο περιέχει 100pmol τυχαίους εκκινητές (random primers) d(n7) (Macrogen), 2mM dntps και ddh 2 O μέχρι τα 5μl. Σε eppendorf των 500μl προστέθηκαν 7μl / tube του παραπάνω μίγματος και 5μl RNA (από την εκχύλιση). Ακολούθησε επώαση των eppendorf στους 65 ο C για 5 min σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler για την αποδιάταξη των δευτεροταγών δομών του μονόκλωνου RNA. Μετά την επώαση, τα eppendorf τοποθετήθηκαν αμέσως στον πάγο και προετοιμάστηκε το δεύτερο μίγμα το οποίο περιείχε 1X First strand Buffer, 0.01M 51

66 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Dithiothreitol, 10 Units RNAse out, 100 Units M-MLV (Ιnvitrogen) και ddh 2 O έως τα 8μl. Στη συνέχεια προστέθηκαν 8μl του δεύτερου μίγματος σε κάθε eppendorf και ακολούθησε επώαση διαδοχικά σε τρεις διαφορετικές συνθήκες: 10 min στους 25 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών, 50 min στους 37 ο C για τη σύνθεση του cdna και 15 min στους 70 ο C για την απενεργοποίηση του ενζύμου Αντίστροφη μεταγραφή με χρήση ειδικού εκκινητή Κατά την αντίστροφη μεταγραφή με χρήση ειδικού εκκινητή εφαρμόστηκαν ορισμένες τροποποιήσεις σε σχέση με το παραπάνω πρωτόκολλο σχετικές με τους τυχαίους εκκινητές. Οι τροποποιήσεις αυτές αφορούν τον εκκινητή, το ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε και τις επωάσεις που εφαρμόστηκαν. Έτσι το πρωτόκολλο είχε ως εξής: Αρχικά προετοιμάστηκε το πρώτο μίγμα το οποίο περιείχε 50pmol του εκκινητή ENTNS1-RT ή UG53-Flap, 2mM dntps και ddh 2 O μέχρι τα 5μl. Σε eppendorf των 500μl προστέθηκαν 7μl / tube του παραπάνω μίγματος και 5μl RNA. Ακολούθησε επώαση των eppendorf στους 65 ο C για 5 min σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler για την αποδιάταξη των δευτεροταγών δομών του μονόκλωνου RNA. Μετά την επώαση, τα eppendorf τοποθετήθηκαν στον πάγο και προετοιμάστηκε το δεύτερο μίγμα το οποίο περιείχε 1X First strand Buffer, 0.01M Dithiothreitol, 10 Units RNAse out, 100 Units Superscript II (Ιnvitrogen) και ddh 2 O έως τα 8μl. Στη συνέχεια προστέθηκαν 8μl του δεύτερου μίγματος σε κάθε eppendorf και ακολούθησε επώαση διαδοχικά σε δυο διαφορετικές συνθήκες: 50 min στους 42 ο C για τη σύνθεση του cdna και 15 min στους 70 ο C για την απενεργοποίηση του ενζύμου ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Μέσω της PCR ενισχύεται ένα τμήμα του παραγόμενου cdna που ορίζεται από το εκκινητικό ζεύγος των εκκινητών που επιλέγονται. Έτσι, ανάλογα με τους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε PCR αντίδραση τα τμήματα που ενισχύονταν χρησίμευαν για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών, για την ανίχνευση της ενεργότητας ενός στελέχους και για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin στελεχών αλλά και μεταξύ Sabin CAV13 στελεχών PCR για την ανίχνευση του θετικής πολικότητας RNA κλώνου Χρησιμοποιώντας το cdna που προέκυψε από την RT, με εκκινητή τον ειδικό για τον θετικής πολικότητας RNA κλώνο UG53-Flap, πραγματοποιήθηκε PCR με τη χρήση του 52

67 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) εκκινητικού ζεύγους UG52-Flap / UC53-Flap, ζεύγος το οποίο ενισχύει ένα προϊόν μήκους 450bp. Αρχικά προετοιμάστηκε ένα μίγμα σε μικροσωληνάρια eppendorf (0,2ml) αποτελούμενο από: 1mM dntps (Invitrogen, UK), 1X Kapa Taq Buffer (Kapa Biosystems, USA), 2mM MgCl 2 (Kapa Biosystems, USA), 25pmol από κάθε εκκινητή, 1U Kapa Taq (Kapa Biosystems, USA) και ddh 2 O μέχρι τα 47μl. Στο παραπάνω μίγμα προστέθηκαν 3μl του cdna και τα μικροσωληνάρια τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler στις παρακάτω συνθήκες: 1 κύκλο 2 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna 40 κύκλους -30 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στους 63 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -30 sec στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων από την Taq πολυμεράση 1 κύκλο 2 min στους 72 ο C για την πλήρη σύνθεση των ημιτελών κλώνων PCR για την ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου Χρησιμοποιώντας το cdna που προέκυψε από την RT, με εκκινητή τον ειδικό για τον αρνητικής πολικότητας RNA κλώνο ENTNS1-RT, πραγματοποιήθηκε PCR με τη χρήση του εκκινητικού ζεύγους ENTNS1-F / UC53-Flap, ζεύγος το οποίο ενισχύει ένα προϊόν μήκους 438bp. Αρχικά προετοιμάστηκε ένα μίγμα σε μικροσωληνάρια eppendorf (0,2ml) αποτελούμενο από: 1mM dntps (Invitrogen, UK), 1X Kapa Taq Buffer (Kapa Biosystems, USA), 2mM MgCl 2 (Kapa Biosystems, USA), 25pmol από κάθε εκκινητή, 1U Kapa Taq (Kapa Biosystems, USA) και ddh 2 O μέχρι τα 47μl. Στο παραπάνω μίγμα προστέθηκαν 3μl του cdna και τα μικροσωληνάρια τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler στις παρακάτω συνθήκες: 1 κύκλο 2 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna -30 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στους 55 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών 40 κύκλους -30 sec στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων από την Taq πολυμεράση 1 κύκλο 2 min στους 72 ο C για την πλήρη σύνθεση των ημιτελών κλώνων 53

68 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Nested-PCR για την ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου Η Nested-PCR είναι μία διαδικασία που προσφέρει αυξημένη ευαισθησία σε σχέση με την απλή PCR. Η Nested-PCR είναι ένας συνδυασμός δυο διαδοχικών PCR αντιδράσεων κατά τις οποίες τα προϊόντα της πρώτης PCR χρησιμεύουν ως στόχοι της δεύτερης PCR αντίδρασης. Κατά την δεύτερη PCR χρησιμοποιείται ένα νέο εκκινητικό ζεύγος το οποίο τοποθετείται εσωτερικά του αρχικού εκκινητικού ζεύγους, προσφέροντας έτσι την αυξημένη ειδικότητα της μεθόδου. Βασικό μειονέκτημα της αποτελεί η αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης επιμολύνσεων. Για το λόγο αυτό, η πρώτη PCR εκτελείται στους 20 με 25 κύκλους, ενώ η δεύτερη PCR στους 30 με 35 κύκλους. H παραπάνω διαδικασία εφαρμόστηκε για την ανίχνευση μόνο του κλώνου αρνητικής πολικότητας, καθώς δεν ήταν δυνατός ο εντοπισμός του σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις του ιού. Χρησιμοποιήθηκε το εκκινητικό ζεύγος ENV-2/ENV-1 με αντίστοιχο μέγεθος προϊόντος στις 148bp. Αρχικά προετοιμάστηκε ένα μίγμα το οποίο αποτελούταν από: 1mM dntps, 2mM MgCl 2, 1X Kapa Taq Buffer, 10pmol από τον κάθε εκκινητή, 0.5U Kapa Taq Polymerase και ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 47μl. Τέλος σε κάθε μικροσωληνάριο προστέθηκαν 3μl από το προϊόν της πρώτης PCR. Οι συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιήθηκε η διαδικασία ήταν οι εξής: 1 κύκλο 2 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στους 55 ο C, για τον υβριδισμό των εκκινητών 30 κύκλους -30 sec στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων από την Taq πολυμεράση 1 κύκλο 2 min στους 72 ο C για την επιμήκυνση των ημιτελών κλώνων PCR για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 Για την ανίχνευση των πιθανών ανασυνδυασμών που είχαν προκύψει έπειτα από την ταυτόχρονη μόλυνση των Rd κυττάρων με Sabin1 και CAV13 εφαρμόστηκαν στα 10 aliquots που προέκυψαν εννέα διαφορετικές PCR αντιδράσεις. Το μίγμα της κάθε αντίδρασης περιείχε: 1mM dntps, 1X Kapa Taq Buffer, 2mM MgCl 2, 25pmol από κάθε εκκινητή, 2U Kapa Taq και ddh 2 O μέχρι τα 47μl. Στο μίγμα αυτό 54

69 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) προστέθηκαν 3μl από το cdna και τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε Eppendorf Mastercycler θερμοκυκλοποιητή στις παρακάτω συνθήκες: 1 κύκλο 2 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna 40 κύκλους 1 κύκλο -30 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στις αντίστοιχες θερμοκρασίες που αναγράφονται στον πίνακα για τον υβριδισμό των εκκινητών -2 min στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων από την Taq πολυμεράση 2 min στους 72 ο C για την πλήρη σύνθεση των ημιτελών κλώνων Επειδή το κάθε εκκινητικό ζεύγος παρουσιάζει διαφορετικό Tm είναι αναμενόμενο να εφαρμόζεται διαφορετική θερμοκρασία υβριδισμού για κάθε ζεύγος. Η τελική θερμοκρασία υβριδισμού είναι η θερμοκρασία στην οποία επιτυγχάνεται η μεγαλύτερη δυνατή εξειδίκευση και ευαισθησία της μεθόδου. Δηλαδή, να ενισχύονται τμήματα μόνο από ανασυνδυασμένα στελέχη, χωρίς να ενισχύονται τα πρότυπα που δεν φέρουν ανασυνδυασμούς. Έτσι έπειτα από αρκετές PCR αντιδράσεις για κάθε εκκινητικό ζεύγος προέκυψαν οι παρακάτω θερμοκρασίες υβριδισμού: Ζεύγος εκκινητών CAV673S SAB2596A CAV2519S SAB3950A CAV3840S SAB5207A CAV5020S SAB6754A1 SAB781S CAV2517A SAB2366S1 CAV3521A SAB3466S CAV4153A SAB4113S1 CAV5519A SAB5527S CAV6637A Μήκος Προϊόντος Περιοχή υπό μελέτη 1900bp 5 -UTR VP1 55 ο C 1430bp VP1 2B 53 ο C 1370bp 2B 3A 57 ο C 1730bp 2C 3D 55 ο C 1740 bp VP4 VP1 51 ο C 1155bp VP3 2A 54 ο C 690bp 2A 2C 53 ο C 1400bp 2B 3C 55 ο C 1110bp 3C 3D 63 ο C Θερμοκρασία υβριδισμού Πίνακας : Τα ζεύγη εκκινητών που εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13. Παρουσιάζονται το αναμενόμενο μήκος του προϊόντος ενίσχυσης, η γενωμική περιοχή που ενισχύεται καθώς και η θερμοκρασία υβριδισμού που εφαρμόστηκε για κάθε ζεύγος. 55

70 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ DOP PCR DOP PCR Η DOP-PCR σχεδιάστηκε για να ενισχύει μη ειδικά τον στόχο DNA, χωρίς περιορισμούς σχετικά με την πολυπλοκότητα του DNA ή τα είδη από τα οποία προήλθε. Στηρίζεται στην αρχή της υβριδοποίησης βραχέων αλληλουχιών που είναι ειδικές στο 3 άκρο του εκκινητή DOP, κατά τη διάρκεια των χαμηλών θερμοκρασιών κατά τους αρχικούς κύκλους του πρωτοκόλλου. Δεδομένου ότι αυτές οι βραχείες αλληλουχίες απαντώνται συχνά, η ενίσχυση του DNA στόχου εξελίσσεται σε πολλές θέσεις ταυτόχρονα(telenius et al., 1992). Το πρωτόκολλο της DOP-PCR είναι ένας συνδυασμός δύο διαφορετικών προγραμμάτων κυκλοποίησης. Κατά τη διάρκεια των πρώτων πέντε κύκλων το δείγμα ενισχύεται υπό συνθήκες χαμηλής αυστηρότητας όπου υποβάλλεται σε διάφορες χαμηλές θερμοκρασίες υβριδοποίησης και επιμήκυνσης ώστε να στοχεύσει διάφορες θέσεις πάνω στο γονιδίωμα και στη συνέχεια ακολουθούν 30 με 40 κύκλοι υψηλής αυστηρότητας όπου η θερμοκρασία υβριδοποίησης είναι υψηλότερη αυξάνοντας την εξειδίκευση της ενίσχυσης. Κατά τη διάρκεια των πρώτων πέντε κύκλων, μόνο το 3 άκρο των εκκινητών υβριδοποιείται και ξεκινά την επιμήκυνση από θέσεις που περιέχουν την καλά καθορισμένη ακολουθία των 6bp. Το εκφυλισμένο μέρος των εκκινητών βεβαιώνει ότι όλοι οι πιθανοί συνδυασμοί των 12bp θα αναγνωριστούν και θα επιμηκυνθούν. Έχοντας ως στόχο την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών για την πραγματοποίηση της DOP-PCR, στις οποίες επιτυγχάνεται η μεγαλύτερη δυνατή απόδοση και ευαισθησία της μεθόδου, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές διαφόρων πρωτοκόλλων τροποποιώντας κάθε φορά τις συγκεντρώσεις των dntps, του ρυθμιστικού διαλύματος (buffer) και του εκκινητή DOP. Τελικά οι βέλτιστες συνθήκες για την εκτέλεση της DOP-PCR ήταν οι εξής: Η αντίδραση της DOP-PCR πραγματοποιήθηκε σε μικροσωληνάρια των 0.2ml, με τη χρήση της υψηλής απόδοσης πολυμεράσης ΚΑPA Long της εταιρίας ΚΑΡΑ Biosystems (USA). Αρχικά προετοιμάστηκε μίγμα που περιείχε τα παρακάτω αντιδραστήρια: 0.5mM dntps, 1.25X KAPALong Buffer,2mM MgCl 2, 1,25U KAPA Long Taq, 200pmol DOP εκκινητή και ddh 2 O μέχρι τα 40μl. Στο μίγμα αυτό προστέθηκαν 10μl δείγματος cdna. Κάθε αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50μl. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler, όπου υποβλήθηκαν στις παρακάτω συνθήκες: 56

71 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ DOP PCR 1 ος κύκλος 5 min στους 94 ο C για την αρχική αποδιάταξη του cdna 2 ος κύκλος 3 ος κύκλος 4 ος κύκλος 5 ος κύκλος 6 ος κύκλος 7 ος 41 ος κύκλος -1 min στους 94 ο C για την αποδιάταξη του DNA -5 min στους 25 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -Ramping: 0.1 ο C / s στους 30 ο C -1 min στους 94 ο C για την αποδιάταξη του DNA -4 min στους 30 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -Ramping: 0.1 ο C / s στους 37 ο C -1 min στους 94 ο C για την αποδιάταξη του DNA -3 min στους 37 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -Ramping: 0.1 ο C / s στους 42 ο C -1 min στους 94 ο C για την αποδιάταξη του DNA -2 min στους 42 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -Ramping: 0.1 ο C / s στους 55 ο C -1 min στους 94 ο C για την αποδιάταξη του DNA -1 min στους 55 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -2 min στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων -20 sec στους 94 ο C για την αποδιάταξη του DNA -1 min στους 55 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -1 min (+ 1 sec / κύκλο) στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων 42 ος κύκλος -10 min στους 72 ο C για την πλήρη σύνθεση των ημιτελών κλώνων Όπως αναφέρθηκε η ενίσχυση που πραγματοποιείται με τη μέθοδο της DOP-PCR είναι μη ειδική. Για το λόγο αυτό, είναι απαραίτητο να πραγματοποιηθούν επιπλέον PCR αντιδράσεις για την ενίσχυση των διαφόρων περιοχών του γονιδιώματος των εντεροϊών. Πραγματοποιήθηκαν τέσσερις PCR αντιδράσεις που το μέγεθος των αλληλουχιών που ενισχύθηκαν ήταν μεγαλύτερο από 1kb και 2 PCR που το μέγεθος των αλληλουχιών ήταν μικρότερο σε μέγεθος, για να επιτευχθεί η αλληλοεπικάλυψη μεταξύ των εκκινητών στις διάφορες περιοχές. Η αντίδραση της PCR έγινε σε μικροσωληνάρια των 0.2ml. Αρχικά προετοιμάστηκε ένα μίγμα το οποίο για τις αντιδράσεις με προϊόντα στις 2319bp, 2392bp, 1298bp και 1519bp περιείχε: 1.2mM dntps, 1X Kapa Taq Buffer, 2mM MgCl2, 25pmol από τον κάθε εκκινητή, 1U KAPA Taq και ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 48μl. Τέλος σε κάθε μικροσωληνάριο προστέθηκαν 2μl προϊόντος της DOP-PCR. Στις αντιδράσεις με τελικό προϊόν στις 750bp και 473bp χρησιμοποιήθηκαν: 1mM dntps, 1X Kapa Taq Buffer, 2mM MgCl 2, 10pmol από τον κάθε εκκινητή, 0.5U KAPA Taq και ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 48μl. Τέλος σε κάθε μικροσωληνάριο προστέθηκαν 2μl προϊόντος της DOP-PCR. 57

72 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ MULTIPLEX PCR Κατόπιν τα μικροσωληνάρια φυγοκεντρήθηκαν και τοποθετήθηκαν στον θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler στις συνθήκες που παρουσιάζονται στον πίνακα : Ζεύγη Εκκινητών TS1 HEV C-11 SAB222S SAB2541A3 UG1 UC1 S 3 26 S SAB5150S SAB6448A UG16 HEV C-425 Μήκος Προϊόντος 750bp 2319bp 473bp 2392bp 1298bp 1519bp Συνθήκες PCR Αριθμός Κύκλων Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 3min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 30 sec Θερμοκρασία υβριδοποίησης: 45 ο C για 30 sec 40 κύκλοι Θερμοκρασία επιμήκυνσης: 72 ο C για 50 sec Θερμοκρασία τελικής επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 3min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 30 sec Θερμοκρασία υβριδοποίησης: 42 ο C για 30 sec 50 κύκλοι Θερμοκρασία επιμήκυνσης: 72 ο C για 3min Θερμοκρασία τελικής επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 2min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 30 sec Θερμοκρασία υβριδοποίησης: 43 o C για 30 sec 30 κύκλοι Θερμοκρασία επιμήκυνσης: 72 ο C για 30sec Θερμοκρασία τελικής επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 3min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 30 sec Θερμοκρασία υβριδοποίησης: 45 ο C για 30 sec 50 κύκλοι Θερμοκρασία επιμήκυνσης: 72 ο C για 3 min Θερμοκρασία τελικής επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 3min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 30 sec Θερμοκρασία υβριδοποίησης: 45 ο C για 30 sec 50 κύκλοι Θερμοκρασία επιμήκυνσης: 72 ο C για 1 min 30 sec Θερμοκρασία τελικής επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 3min 1 κύκλος Θερμοκρασία αποδιάταξης: 95 ο C για 30 sec Θερμοκρασία υβριδοποίησης: 42 ο C για 30 sec 50 κύκλοι Θερμοκρασία επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min Θερμοκρασία τελικής επιμήκυνσης: 72 ο C για 2 min 1 κύκλος Πίνακας : Τα ζεύγη εκκινητών που εφαρμόστηκαν για την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των Sabin στελεχών. Παρουσιάζονται το αναμενόμενο μήκος του προϊόντος ενίσχυσης, και οι συνθήκες στις οποίες υποβλήθηκαν τα δείγματα για κάθε εκκινητικό ζεύγος MULTIPLEX PCR Η Multiplex-PCR είναι μια αντίδραση PCR κατά την οποία ενισχύονται ταυτόχρονα περισσότεροι στόχοι πάνω στο γονιδίωμα. Χρησιμοποιούνται από 2 έως 5 εκκινητικά ζεύγη που το καθένα αποδίδει από ένα προϊόν συγκεκριμένου μήκους. Έτσι μειώνεται αρκετά ο 58

73 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ MULTIPLEX PCR χρόνος αλλά και το κόστος που απαιτείται για την εξαγωγή των ίδιων αποτελεσμάτων από απλές PCR. Σημαντικό μειονέκτημα της Multiplex-PCR αποτελεί η πτώση στην ευαισθησία της μεθόδου που παρατηρείται σε σχέση με τις απλές PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται στην Multiplex-PCR πρέπει να καλύπτουν ορισμένες επιπλέον συνθήκες σε σχέση με τους εκκινητές των απλών PCR: Τα προϊόντα σε κάθε αντίδραση να διαφέρουν τουλάχιστον κατά 50bp έτσι ώστε να είναι δυνατός ο διαχωρισμός των προϊόντων κατά την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Τα Tm των εκκινητών να είναι παρόμοια, καθώς θα πρέπει να εφαρμοστεί μια ενιαία θερμοκρασία υβριδισμού. Οι στόχοι των εκκινητών πάνω στο γονιδίωμα να μην βρίσκονται σε γειτονικές γενωμικές περιοχές, ούτε να αλληλεπικαλύπτονται, καθώς υπάρχει η πιθανότητα να προκύπτουν επιπλέον ζώνες Ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών Για την ταυτόχρονη ανίχνευση και ταυτοποίηση εντεροϊών μέσω Multiplex-PCR επιλέχθηκαν τρία ζεύγη εκκινητών από τη βιβλιογραφία. Το ζεύγος UG53 / UC53 το οποίο στοχεύει στην 5 -UTR αποδίδοντας ένα προϊόν μήκους 433bp, το ζεύγος AN89 / AN88 που στοχεύει στην VP1 περιοχή αποδίδοντας ένα προϊόν μήκους 375bp το οποίο στη συνέχεια καθαρίζεται και αλληλουχείται και το ζεύγος CHR1 / CHR2 που στοχεύει στην 2C γενωμική περιοχή αποδίδοντας μόνο στους EV-Bs ένα προϊόν μήκους 800bp. Η κάθε αντίδραση της Multiplex-PCR έγινε σε μικροσωληνάρια των 0.2ml. Ο τελικός όγκος του κάθε μικροσωληναρίου ήταν 25μl και αποτελούνταν από: 1.2mM dntps, 1.65mM MgCl 2, 1.1Χ KAPA2G Buffer A (Kapa Biosystems, USA), 10pmol από το ζεύγος AN89 / AN88, 50pmol από το κάθε ζεύγος UG52 / UC53 και CHR1 / CHR2, 1U KAPA2G Fast Hot Start (Kapa Biosystems, USA), 2μl cdna από κάθε δείγμα και ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 25μl. Κατόπιν τα μικροσωληνάρια τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf - Mastercycler στις εξής συνθήκες: 1 κύκλο 2 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna 50 κύκλους -15 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στους 45 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -20 sec στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων από την Taq πολυμεράση 59

74 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ MULTIPLEX PCR Ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ στελεχών Sabin Στη Multiplex-PCR για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ στελεχών Sabin ομαδοποιήθηκαν 10 ζεύγη εκκινητών σε 4 ομάδες (Groups). Κάθε ζεύγος είχε σχεδιαστεί έτσι ώστε να αποδίδει ένα προϊόν συγκεκριμένου μήκους στην περίπτωση που το υπό μελέτη δείγμα έφερε τον αντίστοιχο ανασυνδυασμό. Έτσι στις Multiplex-PCR αντιδράσεις γινόταν ταυτόχρονη ανίχνευση τριών διαφορετικών τύπων ανασυνδυασμού στα 2 πρώτα group, ενώ τα 2 τελευταία group μπορούσαν να ανιχνεύσουν από δύο διαφορετικούς τύπους ανασυνδυασμού. Στις αντιδράσεις αυτές εφαρμόστηκαν διάφορες συνθήκες, για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών. Οι συνθήκες αυτές αντιστοιχούν στις Multiplex-PCR για τις οποίες ενισχύονται τα τμήματα μεταξύ των εκκινητών στα ανασυνδυασμένα δείγματα, σε όσο το δυνατόν μικρότερη συγκέντρωση (CCID 50 /0.1ml), χωρίς να ενισχύονται τα αντίστοιχα τμήματα στα πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin. Πετυχαίνοντας έτσι τη μεγαλύτερη δυνατή ευαισθησία και εξειδίκευση για κάθε ζεύγος εκκινητών. Επίσης στις αντιδράσεις αυτές ελέγχθηκε και η ικανότητα ταυτόχρονης ανίχνευσης όλων των εξεταζόμενων ανασυνδυασμών για κάθε group. Έτσι δημιουργήθηκαν μίγματα (Mix) για κάθε group τα οποία περιείχαν ίσες ποσότητες ανασυνδυασμένων δειγμάτων. Η κάθε αντίδραση της Multiplex-PCR έγινε σε μικροσωληνάρια των 0.2ml. Ο τελικός όγκος του κάθε μικροσωληναρίου ήταν 25μl και αποτελούνταν από: 1mM dntps, συγκέντρωση MgCl 2 όπως φαίνεται στον πίνακα , 1Χ KAPA2G Buffer A, 12.5pmol από κάθε εκκινητή, 0.5U KAPA2G Fast Hot Start, 2μl cdna από κάθε δείγμα και ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 25μl. Κατόπιν τα μικροσωληνάρια τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf - Mastercycler στις εξής συνθήκες: 1 κύκλο 2 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna -15 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -10 sec στις αντίστοιχες θερμοκρασίες για κάθε δείγμα 50 κύκλους όπως αναφέρονται στον πίνακα για τον υβριδισμό των εκκινητών -10 sec στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων από την Taq πολυμεράση 60

75 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ MULTIPLEX PCR Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Γενωμικές Περιοχές VP1 2C 3A 2A 2C 3D 3C 3D 3C 3D Τύποι Ανα/σμού S3/S2 S2/S1 S2/S1 S1/S3 S3/S1 S2/S1 S3/S2 S1/S2 S2/S1 S2/S1 Εκκινητές VP1-S3/S2-S VP1-S3/S2-A 2C-S2/S1-S 2C-S2/S1-A 2C-S2/S1-S 3C-S2-S1b-A 2A-S1/S3-S 2A-S1/S3-A 2C-S3/S1-S 2C-S3/S1-A 3D-S2/S1-S 3D-S2/S1-A 3C-S3/S2-S 3C-S3/S2-A 3D-S1/S2-S 3D-S1/S2-A 3C-S2/S1-S 3C-S2/S1b-A 3D-S2/S1b-S 3D-S2/S1b-A Προϊόν 203bp 378bp 742bp 204bp 593bp 529bp 327bp 714bp 298bp 495bp Θερμοκρασία Υβριδισμού Συγκέντρωση MgCl 2 61 o C 2.5mM 67 ο C 2mM 65 ο C 2mM 66 ο C 2mM Πίνακας : Τα 4 group των Multiplex-PCR αντιδράσεων. Παρουσιάζονται οι εκκινητές, οι γενωμικές περιοχές, οι τύποι ανασυνδυασμού και τα αντίστοιχα προϊόντα για κάθε group, καθώς επίσης και οι συνθήκες (θερμοκρασία υβριδισμού και συγκέντρωση MgCl 2 ) για κάθε αντίδραση. Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση των τύπων και θέσεων ανασυνδυασμού που ανιχνεύονται σε κάθε Group της Multiplex-PCR. Τα τρίγωνα δείχνουν τη θέση των ανασυνδυασμών και αναγράφουν τον τύπο κάθε ανασυνδυασμού. Τα οριζόντια βέλη αναπαριστούν τη θέση του κάθε εκκινητικού ζεύγους που χρησιμοποιήθηκε. Με έντονη γραμμή αναπαριστώνται τα προϊόντα της PCR και αναγράφεται το αντίστοιχο μήκος σε bp. 61

76 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ REAL-TIME PCR REAL-TIME PCR Η Real-Time PCR αποτελεί μια παραλλαγή της κλασσικής PCR κατά την οποία είναι δυνατή η ποσοτικοποίηση του αρχικού υπό μελέτη δείγματος. Η ποσοτικοποίηση αυτή είναι δυνατή χρησιμοποιώντας μια χρωστική, στην παρούσα διατριβή την SYBR Green, η οποία έχει την ικανότητα να προσδένεται σε δίκλωνο DNA φθορίζοντας σε συγκεκριμένο μήκος κύματος (520nm). Η μέτρηση του φθορισμού σε κάθε κύκλο οδηγεί στην κατασκευή ενός σχεδιαγράμματος (Amplification Plot), μέσω του οποίου υπολογίζεται το Ct (Cycle threshold), ο κύκλος δηλαδή στον οποίο υπερβαίνει την ουδό (threshold) η τιμή φθορισμού. Παράλληλα, χρησιμοποιώντας δείγματα γνωστών συγκεντρώσεων δημιουργείται μια πρότυπη καμπύλη αρχικών αντιγράφων σχετιζόμενα με την τιμή Ct, μέσω της οποίας υπολογίζεται η ποσότητα των αρχικών αντιγράφων του υπό μελέτη δείγματος. Για την μελέτη της εξειδίκευσης της μεθόδου χρησιμοποιείται το Melting Curve Analysis (ή Dissociation Curve) στο οποίο παρουσιάζεται ένα σχεδιάγραμμα μεταβολής φθορισμού σε σχέση με τη θερμοκρασία. Τμήματα ίσου μήκους με ίδια αλληλουχία εμφανίζουν μεταβολή στο φθορισμό στην ίδια θερμοκρασία, λόγω του Tm, ενώ η εμφάνιση μεταβολής φθορισμού σε διαφορετικές θερμοκρασίες υποδηλώνει την ύπαρξη παραπροϊόντων Real-Time PCR για τον υπολογισμό του ιικού τίτλου του στελέχους CAV13 Ο υπολογισμός του ιικού τίτλου γίνεται, όπως αναφέρθηκε ανωτέρω, με βάση τη μέτρηση του CCID 50. Στην περίπτωση των CAV ιών και συγκεκριμένα του στελέχους CAV13 η παραπάνω διαδικασία δεν ήταν δυνατή καθώς το συγκεκριμένο στέλεχος δεν προκαλούσε CPE. Έτσι σχεδιάστηκε μια Real-Time PCR για τον υπολογισμό του ιικού τίτλου του CAV13 με βάση δείγματα γνωστών συγκεντρώσεων του στελέχους Sabin 1. Αρχικά δημιουργήθηκαν σειριακές υποδεκαπλάσιες αραιώσεις του στελέχους Sabin 1 δημιουργώντας δείγματα ιικού τίτλου από 10 5 έως και 1 CCID 50. Τα δείγματα αυτά αφού εκχυλίστηκαν και συντέθηκε το cdna, υποβλήθηκαν παράλληλα με το υπό μελέτη δείγμα CAV13 σε Real-Time PCR χρησιμοποιώντας το εκκινητικό ζεύγος UG52 / UC53. Δημιουργήθηκε ένα μίγμα που περιείχε: 1Χ ROX Low (Kapa Biosystems, USA), 1X KAPA SYBR FAST qpcr MasterMix (Kapa Biosystems, USA), 5pmol από τον κάθε εκκινητή και ddh 2 O μέχρι τα 17μl. Το μίγμα αυτό προστέθηκε σε ειδικά μικροσωληνάρια για Real-Time PCR των 0.2ml και προστέθηκαν 3μl από κάθε δείγμα. Κατόπιν τα μικροσωληνάρια 62

77 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ REAL-TIME PCR τοποθετήθηκαν στον ειδικό για Real-Time PCR θερμοκυκλοποιητή Μx3005p (STRATAGENE, USA) στις παρακάτω συνθήκες: 1 ος κύκλος -1 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna 40 κύκλοι -3 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -30 sec στους 60 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών και την επιμήκυνση των κλώνων 1 ος κύκλος - Ramping 55 o C-95 o C για τη δημιουργία του Melting Curve Analysis Real-Time PCR για τη μελέτη της κατανομής των προϊόντων της DOP-PCR Για να εξεταστεί η ίση κατανομή των τμημάτων που προκύπτουν από την προενίσχυση του γονιδιώματος των εντεροϊών κατά την DOP-PCR πραγματοποιήθηκε Real- Time PCR. Επιλέχθηκαν εκκινητές που υβριδοποιούνται σε 3 διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος (5 -UTR, VP1 και 3D), ώστε να διευκρινιστεί εάν η ποσότητα του αρχικού μορίου στόχου είναι ίση. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε μικροσωληνάρια των 0.2ml, ειδικά για Real- Time PCR. Αρχικά προετοιμάστηκε ένα μίγμα που περιείχε τα εξής: 1Χ ROX Low (Kapa Biosystems, USA), 1X KAPA SYBR FAST qpcr MasterMix (Kapa Biosystems, USA), 5pmol από τον κάθε εκκινητή και ddh 2 O μέχρι τα 17μl. Τέλος σε κάθε μικροσωληνάριο προστέθηκαν 3μl προϊόντος της DOP-PCR. Κατόπιν τα μικροσωληνάρια φυγοκεντρήθηκαν και τοποθετήθηκαν στον ειδικό για Real-Time PCR θερμοκυκλοποιητή Μx3005p (STRATAGENE, USA) στις παρακάτω συνθήκες: 1 ος κύκλος -1 min στους 95 ο C για την αποδιάταξη του cdna 40 κύκλοι -3 sec στους 95 ο C για την αποδιάταξη του DNA -20 sec στους 43 ο C για τον υβριδισμό των εκκινητών -1 sec στους 72 ο C για την επιμήκυνση των κλώνων 1 ος κύκλος - Ramping 55 o C-95 o C για τη δημιουργία του Melting Curve Analysis 63

78 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR Για την ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων χρησιμοποιήθηκε πήκτωμα αγαρόζης με συγκέντρωση που κυμαινόταν από 1.5 έως 2%, ανάλογα με το μήκος των αναμενόμενων προϊόντων της κάθε ηλεκτροφόρησης. Για προϊόντα μήκους μεγαλύτερου των 1000bp χρησιμοποιούνταν η συγκέντρωση 1.5% ενώ για προϊόντα μήκους μικρότερου των 1000bp η συγκέντρωση 2%. Συγκεκριμένα, αντίστοιχη ποσότητα αγαρόζης (0.9gr ή 1.2gr) (Ultra-Pure Gel Agarose, Invitrogen, UK) και 60ml ΤΒΕ (Tris-Boric acid-edta) προστέθηκαν σε κωνική φιάλη των 250 ml. Ακολούθησε θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων για περίπου 1 min, ώστε να λιώσει η αγαρόζη. Όταν το διάλυμα έφτασε σε θερμοκρασία περίπου 40 C προστέθηκε ποσότητα βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr 2 ) τέτοια ώστε η τελική του συγκέντρωση να είναι 1 μg/ml. Το βρωμιούχο αιθίδιο παρεμβάλλεται μεταξύ των ζευγαριών βάσεων του δίκλωνου DNA, φθορίζοντας σε μήκος κύματος 290nm. Στη συνέχεια το διάλυμα τοποθετήθηκε σε ειδική θήκη ηλεκτροφόρησης προκειμένου να πήξει. Μετά τον σχηματισμό της πηκτής αγαρόζης, 10μl PCR προϊόντος αναμιγνύονται με 2μl 10X Gel Loading Buffer (κυανό της βρωμοφαινόλης, σουκρόζη 40%w/v και TBE) και ακολουθεί η προσθήκη των δειγμάτων στις ειδικές θέσεις του πηκτώματος. Για τον προσδιορισμό του μήκους των PCR προϊόντων είναι απαραίτητη η προσθήκη στο πήκτωμα ενός μάρτυρα μοριακού βάρους. Στη συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε ο 100bp DNA Ladder (Invitrogen, UK) για τα προϊόντα μήκος μέχρι 1000bp και ο 1000bp DNA Ladder (Invitrogen, UK) για τα προϊόντα μήκους μεγαλύτερου των 1000bp. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας τάση 120 Volts και ένταση 50 ma για περίπου 1 h. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα αγαρόζης τοποθετήθηκε σε συσκευή υπεριώδους φωτός UV Foto/Phoresis system (Fotodyne, USA) και στη συνέχεια φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας ψηφιακή φωτογραφική μηχανή ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR Για τα προϊόντα της PCR που θα ακολουθούσε αλληλούχηση, το πρώτο βήμα πριν την κλωνοποίησή και αλληλούχησή τους αποτελούσε ο καθαρισμός του προϊόντος από το πήκτωμα αγαρόζης. Συγκεκριμένα, σε νέα ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης φορτώθηκαν τα υπόλοιπα 40μl των προϊόντων της PCR. Οι επιθυμητές ζώνες αποκόπηκαν από το πήκτωμα και τοποθετήθηκαν σε σωλήνες eppendorf των 1.5ml. Ακολούθησε ο καθαρισμός των προϊόντων της PCR με τη βοήθεια του Gel Extraction Kit (Macherey Nagel, 64

79 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και προέκυψαν στο τέλος του καθαρισμού 20μl του καθαρισμένου προϊόντος ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR Τα στάδια της μοριακής κλωνοποίησης των προϊόντων της PCR, είναι τα εξής: η αντίδραση της τοποϊσομεράσης, ο μετασχηματισμός των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων, η επιλογή των κατάλληλων κλώνων μέσω Colony-PCR και τέλος η επιβεβαίωση της ένθεσης του τμήματος DNA με πέψη με ένζυμο περιορισμού EcoRI Αντίδραση τοποϊσομεράσης (TOPO-TA cloning) Με την αντίδραση αυτή γίνεται η σύνδεση του επιθυμητού προϊόντος (ένθεμα) στον φορέα κλωνοποίησης (πλασμίδιο). Ο φορέας κλωνοποίησης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο pcr 2.II- TOPO (Life Technologies, USA), ο οποίος περιέχει μια περιοχή πολυσυνδέτη στην οποία ενσωματώνεται το τμήμα DNA που θέλουμε να κλωνοποιήσουμε. Το μείγμα της αντίδρασης αποτελούταν από 1μl φορέα pcr 2.ΙΙ-TOPO, 1μl διαλύματος αλάτων (Salt solution), 1μl ddh 2 O και 3μl του καθαρισμένου προϊόντος της PCR. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου Μετασχηματισμός των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων Η διαδικασία του μετασχηματισμού ξεκινά με τη μεταφορά 200μl δεκτικών κυττάρων E.Coli στελέχους JM109 σε σωληνάρια eppendorf των 2ml. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 6μl του προϊόντος της αντίδρασης τοποϊσομεράσης και ακολούθησε επώαση των δειγμάτων στον πάγο για 30 min. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ο μετασχηματισμός των δεκτικών κυττάρων μέσω της διαδικασίας heat shock, κατά την οποία τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο, στους 42 ο C για 90 sec και ακολούθως τοποθετήθηκαν ξανά στον πάγο για 2 min. 800μl θρεπτικού υποστρώματος LB Broth (Scharlau, Spain) προστέθηκαν στα προϊόντα του heat shock και ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για 1 h με ανάδευση στις 180 στροφές/min. Έπειτα, έγινε επίστρωση 150μl καλλιέργειας σε τρυβλίο με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB Agar (Scharlau, Spain) εμπλουτισμένο με 100μg/ml αμπικιλλίνη (Calbiochem-Merck, Germany) και 12μl X-Gal (50mg/ml, Promega, USA). Ακολούθησε ολονύχτια επώαση των τρυβλίων στους 37 ο C. Αφού αναπτύχθηκαν οι αποικίες, συλλέχθηκαν 2 λεύκες (ανασυνδυασμένες) αποικίες από κάθε τρυβλίο και 65

80 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR μεταφέρθηκαν σε σωληνάρια eppendorf των 0.2ml που περιέχονταν 15μl ddh 2 O. Από το εναιώρημα αυτό τα 3μl μεταφέρθηκαν σε νέα σωληνάρια eppendorf για την εκτέλεση Colony-PCR που θα αναλυθεί παρακάτω, ενώ τα υπόλοιπα 12μl μεταφέρθηκαν σε σωλήνες των 15ml (Corning, USA) που περιείχαν 2ml LB Broth με 100μg/ml αμπικιλλίνη. Οι θετικές αποικίες που προέκυψαν από την Colony-PCR επωάστηκαν ολονύχτια στους 37 ο C με ανάδευση στις 210 στροφές/min Colony-PCR Μέσω της Colony-PCR, μιας παραλλαγής της κλασσικής PCR έτσι ώστε να είναι δυνατή η απευθείας διεξαγωγή της σε βακτηριακό εναιώρημα, επιτυγχάνεται η επιλογή των κατάλληλων αποικιών έπειτα από την κλωνοποίηση. Ως κατάλληλες ορίζονται οι αποικίες εκείνες που φέρουν το σωστό ένθεμα στο πλασμίδιό τους. Στην Colony-PCR χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή του προϊόντος που μελετάται και εφαρμόστηκαν οι ίδιες συνθήκες αποδιάταξης, υβριδισμού και επιμήκυνσης που εφαρμόστηκαν στην αντίστοιχη PCR. Αρχικά τα 3μl του εναιωρήματος της βακτηριακής αποικίας, που είχαν προστεθεί σε μικροσωληνάρια στο προηγούμενο βήμα, τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Eppendorf Mastercycler και επωάστηκαν στους 95 ο C για 10 min με σκοπό τη λύση των βακτηριακών κυτταρικών τοιχωμάτων και την απελευθέρωση του πλασμιδίου. Στη συνέχεια τα μικροσωληνάρια τοποθετήθηκαν στον πάγο και προστέθηκαν 22μl μίγματος που περιείχε τα παρακάτω: 1mM dntps, 1X Kapa Taq Buffer, 2mM MgCl 2, 12.5pmol από τον κάθε εκκινητή, 1U Kapa Taq και ddh 2 O μέχρι τα 22μl. Τα μικροσωληνάρια τοποθετήθηκαν εκ νέου στον θερμοκυκλοποιητή και εφαρμόστηκαν οι αντίστοιχες συνθήκες με εκείνες που εφαρμόστηκαν κατά την PCR Επιβεβαίωση της ένθεσης του τμήματος DNA με RFLP Αρχικά πραγματοποιήθηκε απομόνωση του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα από τις μετασχηματισμένες βακτηριακές καλλιέργειες με τη χρήση του Nucleospin Plasmid Kit (Macherey Nagel, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπου 2ml της υγρής βακτηριακής καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση 50μl πλασμιδιακού DNA. Έπειτα χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο περιορισμού EcoRI μέσω της τεχνικής RFLP για την επαλήθευση της ενσωμάτωσης του ενθέματος στον πλασμιδιακό φορέα πριν την 66

81 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ αποστολή των δειγμάτων για αλληλούχηση. Ο φορέας κλωνοποίησης φέρει δυο θέσεις αναγνώρισης του ενζύμου EcoRI εκατέρωθεν του σημείου ένθεσης. Έτσι ένα θετικό αποτέλεσμα της RFLP στο πλασμίδιο (δίκλωνο κυκλικό DNA), περιλαμβάνει 2 διαφορετικές ζώνες (ή περισσότερες στην περίπτωση που η θέση αναγνώρισης υπάρχει και στο ένθεμα). Σε μικροσωληνάρια των 500μl τοποθετήθηκαν τα παρακάτω: 2μl πλασμιδιακο DNA, 1X Buffer, 10U EcoRI και ddh 2 O μέχρι τα 20μl. Στη συνέχεια, ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για 1 h. Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 5μl 10X Loading Buffer και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 2%, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δείγματα που ήταν θετικά έπειτα από την διαδικασία της πέψης στάλθηκαν για αλληλούχηση στην εταιρία Macrogen Europe (The Netherlands) ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των δειγμάτων που στάλθηκαν για αλληλούχηση επεξεργάζονται χρησιμοποιώντας ειδικά προγράμματα βιοπληροφορικής με σκοπό την εξαγωγή των επιθυμητών αποτελεσμάτων. Μέσω της επεξεργασίας της αλληλουχίας είναι δυνατή η ταυτοποίηση ενός αγνώστου δείγματος αλλά και η εύρεση ανασυνδυασμών Καθαρισμός και διόρθωση των αλληλουχιών Στην περίπτωση της αλληλούχησης πλασμιδιακού φορέα, η αλληλουχία που προκύπτει περιλαμβάνει, εκτός από την αλληλουχία του ενθέματος και πλασμιδιακές αλληλουχίες, καθώς οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται κατά την αλληλούχηση στοχεύουν σε πλασμιδιακές θέσεις εκατέρωθεν του σημείου ένθεσης. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα επεξεργασίας νουκλεοτιδικών αλληλουχιών GeneRunner ( πραγματοποιήθηκε η αφαίρεση των πλασμιδιακών αλληλουχιών. Επιπλέον, για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν δυο αναγνώσεις κατά την αλληλούχηση, μια για κάθε κλώνο, ιδιαίτερα για τα δείγματα μεγάλου μήκους. Οι δυο αυτές αναγνώσεις, χρησιμοποιώντας το παραπάνω πρόγραμμα, μελετήθηκαν, συγκρίθηκαν και διορθώθηκαν τυχόν λάθη στις αλληλουχίες Ομοπαράθεση των αλληλουχιών Το επόμενο βήμα κατά την επεξεργασία των αλληλουχιών αποτέλεσε η ομοπαράθεση των αλληλουχιών με γνωστές αλληλουχίες κατατεθειμένες στις διεθνείς 67

82 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ τράπεζες δεδομένων. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) του ινστιτούτου NIH (Altschul et al., 1990), έγινε ομοπαράθεση των αλληλουχιών με σκοπό την εύρεση της κοντινότερης σε ομολογία γνωστής αλληλουχίας. Έτσι είναι δυνατή η επαλήθευση των αποτελεσμάτων των προϊόντων της PCR αλλά και η μοριακή ταυτοποίηση των αγνώστων δειγμάτων. Συγκεκριμένα, για την ταυτοποίηση χρησιμοποιείται η VP1 γενωμική περιοχή των εντεροϊών και στην παρούσα διατριβή το προϊόν του εκκινητικού ζεύγους AN89 / AN88. Η κοντινότερη σε ομολογία αλληλουχία που προκύπτει έπειτα το BLAST υποδηλώνει και τον ορότυπο του υπό μελέτη άγνωστου δείγματος Στοίχιση των αλληλουχιών Για τη στοίχιση των αλληλουχιών και τη δημιουργία των απαραίτητων αρχείων στοίχισης για την ανάλυση ανασυνδυασμών που ακολούθησε, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα MEGA7 (Kumar et al., 2016) Ανάλυση ανασυνδυασμών Η ανίχνευση και μελέτη των ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 στελεχών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος ανάλυσης ανασυνδυασμών SimPlot (RaySoft v3.2) (Lole et al., 1999). Το πρόγραμμα αυτό χρησιμοποιεί τη μέθοδο της νουκλεοτιδικής απόστασης δυο ή περισσότερων αλληλουχιών (distance-based method) για την ανίχνευση ανασυνδυασμών στο υπό μελέτη δείγμα. Η στοίχιση της άγνωστης αλληλουχίας μαζί με τις αλληλουχίες αναφοράς εισάγονται στο πρόγραμμα και δημιουργείται ένα γράφημα το οποίο παρουσιάζει την ομοιότητα του υπό μελέτη δείγματος σε σχέση με τα δείγματα αναφοράς κατά μήκος της αλληλουχίας, επιτρέποντας έτσι τον εύκολο προσδιορισμό του ανασυνδυασμού. Για την εμφάνιση της θέσης ανασυνδυασμού χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Recco (Maydt & Lengauer, 2006), το οποίο επίσης χρησιμοποιεί τη μέθοδο της απόστασης και δημιουργεί μια επεξηγηματική απεικόνιση της θέσης ανασυνδυασμού στις στοιχισμένες αλληλουχίες. Μέσω του προγράμματος RNAFold (Gruber et al., 2008) πραγματοποιήθηκε η μελέτη της δευτεροταγούς δομής των μονόκλωνων RNA μορίων, ενώ για την ανίχνευση της ύπαρξης ψευδοκόμβων (pseudoknots) χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ProbKnot (Bellaousov & Mathews, 2010). 68

83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MULTIPLEX-PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. MULTIPLEX-PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Εφαρμογή της μεθόδου σε πρότυπα στελέχη EV-B και EV-C Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν 41 πρότυπα στελέχη για την δημιουργία και την επιλογή των βέλτιστων συνθηκών μιας Multiplex-PCR για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών. Όπως φαίνεται και στον πίνακα όλα τα πρότυπα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ανιχνεύτηκαν μέσω του ζεύγους UG52 / UC53, αποδίδοντας ένα προϊόν ενίσχυσης μήκους 433bp. Μέσω του ζεύγους ΑΝ89 / ΑΝ88 είναι δυνατή η ταυτοποίηση των στελεχών έπειτα από αλληλούχηση του προϊόντος μήκους 375bp. Το προϊόν αυτό επίσης ενισχύθηκε σε όλα τα πρότυπα στελέχη που μελετήθηκαν. Ορότυπος UG52 UC53 AN89 AN88 CHR1 CHR2 Ορότυπος UG52 UC53 AN89 AN88 CHR1 CHR2 433bp 375bp 800bp 433bp 375bp 800bp CAV E CAV E CAV E CAV E CAV E CAV E CAV E CAV E CAV E CBV E CBV E CBV E CBV E CBV E CBV E E E E E E Sabin E Sabin E Sabin E Πίνακας : Τα αποτελέσματα της Multiplex-PCR στα πρότυπα στελέχη για κάθε εκκινητικό ζεύγος. 69

84 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MULTIPLEX-PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Το τελευταίο ζεύγος, CHR1 / CHR2, αποδίδει ένα προϊόν ενίσχυσης μήκους 800bp. Το προϊόν αυτό εντοπίστηκε σε όλα τα πρότυπα στελέχη που ανήκουν στην ομάδα EV-B, δηλαδή όλα τα πρότυπα στελέχη Echo, CBV και το πρότυπο CAV9. Τα υπόλοιπα CAV στελέχη που μελετήθηκαν καθώς επίσης και τα πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin δεν απέδωσαν το προϊόν αυτό, όπως και αναμενόταν, καθώς ανήκουν στην ομάδα EV-C. Εικόνα : Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της Multiplex-PCR. Στις στήλες 1 έως 9: πρότυπα στελέχη Echo1, Echo2, Echo3, CBV1, CBV2, CBV3, CAV1, CAV9 και CAV11 αντίστοιχα. Στις στήλες L έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp Εφαρμογή της μεθόδου σε κλινικά δείγματα Για την επαλήθευση και τον έλεγχο της μεθόδου ως προς την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών χρησιμοποιήθηκαν κλινικά στελέχη διαφόρων οροτύπων όπως παρουσιάστηκαν στον πίνακα και προέρχονταν από τη συλλογή δειγμάτων του εργαστηρίου Μικροβιολογίας Ιολογίας. Και τα τρία ζεύγη εκκινητών απέδωσαν τα αναμενόμενου μήκους προϊόντα σε όλα τα κλινικά στελέχη που εξετάστηκαν, καθώς όλα τα στελέχη άνηκαν στην ομάδα EV-B Επαλήθευση της ειδικότητας της μεθόδου μέσω αλληλούχησης των προϊόντων Για την επαλήθευση της ειδικότητας της μεθόδου επιλέχθηκαν τα προϊόντα της Multiplex-PCR σε 12 από τα 20 κλινικά δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν, τα οποία στη συνέχεια καθαρίστηκαν, κλωνοποιήθηκαν και στάλθηκαν για αλληλούχηση. 70

85 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MULTIPLEX-PCR ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Τα αποτελέσματα της αλληλούχησης επαλήθευσαν την ειδικότητα της μεθόδου, καθώς το προϊόν μήκους 433bp που προήρχετο από το ζεύγος UG52 / UC53 εντοπίστηκε σωστά στην αναμενόμενη θέση στην 5 -UTR. Το προϊόν μήκους 375bp προερχόμενο από το ζεύγος ΑΝ89 / ΑΝ88 τοποθετήθηκε στην VP1 γενωμική περιοχή και επιπροσθέτως μέσω ομοπαράθεσης της αλληλουχίας αυτής έγινε η επιβεβαίωση του οροτύπου των κλινικών δειγμάτων. Το τρίτο προϊόν μήκους 800bp προερχόμενο από το ζεύγος CHR1 / CHR2 τοποθετήθηκε στην 2C γενωμική περιοχή και επιπλέον ομοπαράθεση της αλληλουχίας αυτής μπορούσε να ταυτοποιήσει την ομάδα του στελέχους (EV-B), αλλά όχι τον ορότυπο με μεγάλη ακρίβεια Εφαρμογή της μεθόδου σε άγνωστα περιβαλλοντικά δείγματα Η παρούσα Multiplex-PCR εφαρμόστηκε σε 10 άγνωστα περιβαλλοντικά δείγματα που προέρχονταν από βιολογικούς καθαρισμούς της Περιφέρειας Θεσσαλίας. Τα δείγματα αυτά αρχικά ενοφθαλμίστηκαν στις κυτταρικές σειρές Rd και HEP-2 και αν και ακολούθησαν 10 διαδοχικές ανακαλλιέργειες και στις δύο κυτταρικές σειρές, δεν εντοπίστηκε CPE σε κανένα από τα δείγματα αυτά. Έτσι ακολούθησε στη συνέχεια εφαρμογή της μεθόδου της Multiplex-PCR με σκοπό την ανίχνευση και ταυτοποίηση στελεχών που δεν εμφάνιζαν CPE στις συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα όμως ήταν αρνητικά και στα 10 περιβαλλοντικά δείγματα αποδεικνύοντας την απουσία εντεροϊών από τα παραπάνω δείγματα Εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα ENY Έγινε μια προσπάθεια εφαρμογής της μεθόδου για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των εντεροϊών σε δείγματα ΕΝΥ προερχόμενα από ασθενείς με άσηπτη μηνιγγίτιδα. Όμως, επειδή ο ιικός τίτλος σε δείγματα ΕΝΥ είναι εξαιρετικά μικρός και παράλληλα η Multiplex- PCR εμφανίζει μειωμένη ευαισθησία σε σχέση με τις αντίστοιχες PCR, δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση εντεροϊών μέσω της μεθόδου αυτής. Μέσω απλών PCR ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας το ζεύγος UG52 / UC53 εντεροϊοί σε 30 από 61 δείγματα ΕΝΥ, από τα οποία μόνο τα 12 δείγματα στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν μέσω αλληλούχησης του προϊόντος ΑΝ89 / ΑΝ88. Από τα αποτελέσματα της αλληλούχησης προέκυψε ότι όλα τα στελέχη που απομονώθηκαν ανήκαν στην ομάδα EV-B και συγκεκριμένα στους παρακάτω οροτύπους: 1 στέλεχος CAV 9, ένα στέλεχος Echo 6, δύο στελέχη Echo 9, δύο στελέχη Echo 13, τρία στελέχη Echo 30, δύο στελέχη CBV 3 και ένα στέλεχος CBV 5. 71

86 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DOP-PCR 3.2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DOP-PCR Αρχικά πραγματοποιήθηκε η DOP-PCR για την προενίσχυση, μη ειδικά, ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν 6 διαφορετικές PCR αντιδράσεις στις οποίες χρησιμοποιήθηκε ως στόχος το προϊόν της DOP-PCR. Τα δείγματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα τεχνική ήταν 5 από τα 10 εμβολιοπροερχόμενα κλινικά δείγματα που έφεραν ανασυνδυασμούς (πίνακας ): Κ/2002, EP23, LK3, 738 και 584. Ενδεικτικά στην παρακάτω εικόνα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των προϊόντων της DOP-PCR με το εκκινητικό ζεύγος UG16 / HEV C-425, όπου τα πέντε κλινικά εμβολιοπροερχόμενα δείγματα, καθώς και το Sabin 1 που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας, απέδωσαν το αναμενόμενο προϊόν μήκους 1519bp. Παράλληλα δεν παρατηρήθηκε περίπτωση επιμόλυνσης της αντίδρασης, τόσο κατά την πρώτη όσο και στην δεύτερη PCR, καθώς οι αρνητικοί μάρτυρες δεν απέδωσαν κάποιο προϊόν. L L bp 600bp Στήλη Προϊόν 1 Κ/ EP23 3 LK Sabin 1 ddh 7 2 O (από DOP-PCR) 8 ddh 2 O Εικόνα 3.2.1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της DOP-PCR με το ζεύγος UG16/HEV C-425. Στις στήλες 1 έως 8 έχουν τοποθετηθεί τα αντίστοιχα όπως παρουσιάζονται στον πίνακα δεξιά. Στις στήλες L 1 και L 2 έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp και 1000bp αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα και των 6 PCR αντιδράσεων στα προϊόντα της DOP ήταν θετικά για όλα τα δείγματα, επιτρέποντας έτσι την κάλυψη στο 93,3% του γονιδιώματος με τις 4 PCR αντιδράσεις, και στο 100% προσθέτοντας τα προϊόντα και των άλλων 2 PCR αντιδράσεων, όπως χαρακτηριστικά παρουσιάζεται στο σχεδιάγραμμα της εικόνας που ακολουθεί. 72

87 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DOP-PCR Εικόνα 3.2.2: Σχηματική αναπαράσταση των προϊόντων της DOP-PCR. Με έντονη σήμανση παρουσιάζονται τα προϊόντα των τεσσάρων PCR που καλύπτουν το 93.3% του γονιδιώματος, ενός με διακεκομμένη οι υπόλοιπες δύο PCR που ολοκληρώνουν την κάλυψη Αλληλούχηση των προϊόντων της DOP-PCR Τα προϊόντα που προέκυψαν από τις διάφορες PCR καθαρίστηκαν και στάλθηκαν για αλληλούχηση στην εταιρεία Macrogen Europe (The Netherlands), έτσι ώστε να διαπιστωθεί η εξειδίκευσης της τεχνικής. Μετά την απόκτηση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε επεξεργασία των αλληλουχιών και με ομοπαράθεση μελετήθηκαν ως προς την ομοιότητα τους με τις αλληλουχίες των αντίστοιχων στελεχών εντεροϊών που έχουν ήδη κατατεθεί στη γονιδιακή τράπεζα GenBank, με τη βοήθεια του BLAST. Όλες οι αλληλουχίες αντιστοιχούσαν στο κάθε στέλεχος από το οποίο προέρχονταν, καθώς και στις αναμενόμενες περιοχές του γονιδιώματος που πραγματοποιήθηκε η ενίσχυση. Αυτά τα αποτελέσματα επαλήθευσαν την εξειδίκευση της τεχνικής. Ενδεικτικά παρουσιάζεται το αποτέλεσμα της ομοπαράθεσης μέσω του BLAST για το δείγμα EP23 με το ζεύγος UG16/HEV C-425 και προϊόν 1519bp: Περιγραφή Human poliovirus 1 strain Sabin isolate EP23 polyprotein gene, partial cds Max score Total score Cover e-value Ident Accession % % AY Πίνακας : Αποτέλεσμα ομοπαράθεσης με BLAST για το δείγμα EP Real-Time PCR για την μελέτη της κατανομής των προϊόντων της DOP-PCR Πραγματοποιήθηκε Real-Time PCR για να διαπιστωθεί η ίση κατανομή των τμημάτων που προκύπτουν από την προενίσχυση στις περιοχές του γονιδιώματος. Ως Ct (Cycle Threshold) ορίζεται ο κύκλος στον οποίο θετικοποιείται η τιμή του φθορισμού. Κατά συνέπεια η αρχική ποσότητα του μορίου στόχου σχετίζεται με το Ct. Ίσες ποσότητες 73

88 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ DOP-PCR αρχικού μορίου στόχου αναμένεται να δώσουν ίδιες τιμές Ct. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη Real-Time στις τρείς γενωμικές περιοχές (5 UTR, VP1, 3D) ήταν τα παρακάτω: Εκκινητές Προϊόν Ct UG52 / UC UG1 / UC UG16 / UC Πίνακας : Αποτέλεσμα της Real-Time PCR στα προϊόντα της DOP-PCR. Παρατηρείται μια διαφορά στο Ct, διαφορά που ήταν αναμενόμενη και οφείλεται στη χρήση της SYBR Green, καθώς τα προϊόντα της Real-Time έχουν διαφορετικό μήκος, κάτι που σημαίνει πως το μεγαλύτερο προϊόν θα συσσωρεύει περισσότερη ποσότητα SYBR Green με αποτέλεσμα να φθορίζει περισσότερο σε σχέση με τα μικρότερα τμήματα. Έτσι, αναμένεται η διαφορά στο Ct να είναι αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους του προϊόντος. Οι αναμενόμενες τιμές Ct προκύπτουν πολλαπλασιάζοντας το λόγο των προϊόντων με το Ct του μεγαλύτερου προϊόντος. Για τη ζώνη των 433bp προκύπτει μία αναμενόμενη τιμή Ct: 596 x16=1,37 x 16=22, Ενώ για τη ζώνη των 473bp προκύπτει: 596 x16=1,26 x 16=20, Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται όλα τα παραπάνω και επιπλέον εμφανίζεται η ποσοστιαία διαφορά μεταξύ αναμενόμενης και παρατηρούμενης τιμή Ct, η οποία και στα δύο προϊόντα (423bp, 473bp) είναι κάτω του 10% και υποδεικνύει ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά. PCR Product (bp) Παρατηρούμενο Ct Αναμενόμενο Ct Διαφορά ,02 9,1% ,16 4,3% Πίνακας : Ποσοστιαία διαφορά μεταξύ παρατηρούμενου και αναμενόμενου Ct σε σχέση με το μέγεθος του προϊόντος. 74

89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MULTIPLEX-PCR ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ SABIN ΣΤΕΛΕΧΗ 3.3. MULTIPLEX-PCR ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ SABIN ΣΤΕΛΕΧΗ Δέκα εμβολιοπροερχόμενα ανασυνδυασμένα δείγματα που είχαν ταυτοποιηθεί σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου Ιολογίας Μικροβιολογίας χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα Multiplex-PCR για την ανίχνευση ανασυνδυασμών από τη VP1 έως και την 3D γενωμική περιοχή. Παράλληλα μελετήθηκε και η ευαισθησία της μεθόδου χρησιμοποιώντας υποδεκαπλάσιες αραιώσεις των δειγμάτων που κυμαίνονταν από 10 5 έως και 1 CCID 50. Επίσης, ελέγχθηκε και η ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει περισσότερους του ενός ανασυνδυασμούς ταυτόχρονα σε ένα δείγμα, χρησιμοποιώντας μίγματα των δειγμάτων σε κάθε Group. Τα αποτελέσματα των τεσσάρων Multiplex-PCR αντιδράσεων παραθέτονται αναλυτικά παρακάτω και συγκεντρωτικά στον πίνακα Και στα 4 Group της Multiplex-PCR ανιχνεύτηκαν και επαληθεύτηκαν όλοι οι ανασυνδυασμοί των υπό μελέτη δειγμάτων. Παράλληλα και στα 4 Group ανιχνεύτηκαν με επιτυχία ταυτόχρονα οι ανασυνδυασμοί στα δείγματα που περιείχαν μίγματα των υπό μελέτη δειγμάτων. Ως προς την ευαισθησία της μεθόδου παρουσιάστηκε μια μεταβολή μεταξύ των τεσσάρων Group. Στα πρώτα τρία Group ήταν δυνατή η ανίχνευση ανασυνδυασμών σε δείγματα συγκέντρωσης μέχρι και 10 CCID 50 /0.1ml, ενώ στο τέταρτο Group ήταν δυνατή η ανίχνευση ανασυνδυασμών σε δείγματα συγκέντρωσης μέχρι και 10 3 CCID 50 /0.1ml. Σε όλα τα Group τα πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin, που χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, καθώς δεν φέρουν ανασυνδυασμούς, δεν απέδωσαν κανένα προϊόν. L bp 300bp 200bp Εικόνα 3.3.1: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της Multiplex-PCR για το Group 1. Στις στήλες 1 έως 3: Τα εμβολιοπροερχόμενα δείγματα K/2002, LK3 και EP9 αντίστοιχα. Στις στήλες 4 έως 7 έχουν τοποθετηθεί Mix και των 3 δειγμάτων σε συγκεντρώσεις 10 5, 10 3, 10 και 1 CCID 50 αντίστοιχα. Στις στήλες 8 έως 11 οι αρνητικοί μάρτυρες Sabin 1, Sabin2, Sabin 3 και ddh 2 O αντίστοιχα. Στη στήλη L έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp. 75

90 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Γενωμικές Περιοχές VP1 2C 3A 2A 2C 3D 3C 3D 3C 3D Τύποι Ανα/σμού S3/S2 S2/S1 S2/S1 S1/S3 S3/S1 S2/S1 S3/S2 S1/S2 S2/S1 S2/S1 Εκκινητές Προϊόν ΔΕΙΓΜΑ VP1-S3/S2-S VP1-S3/S2-A 2C-S2/S1-S 2C-S2/S1-A 2C-S2/S1-S 3C-S2-S1b-A 2A-S1/S3-S 2A-S1/S3-A 2C-S3/S1-S 2C-S3/S1-A 3D-S2/S1-S 3D-S2/S1-A 3C-S3/S2-S 3C-S3/S2-A 3D-S1/S2-S 3D-S1/S2-A 3C-S2/S1-S 3C-S2/S1b-A 3D-S2/S1b-S 3D-S2/S1b-A CCID 50 /0.1ml S1 S2 S3 203bp K/ bp LK bp EP bp bp EP bp IF bp bp I bp ID bp Πίνακας 3.3.1: Συγκεντρωτικά αποτελέσματα των 4 Multiplex-PCR αντιδράσεων. Παρουσιάζονται οι θέσεις και οι τύποι ανασυνδυασμού, τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση και το αποτέλεσμα της κάθε Multiplex-PCR. Με (+) σημειώνονται τα δείγματα τα οποία παρουσίασαν το αναμενόμενο προϊόν, ενώ με (-) σημειώνεται η απουσία του αναμενόμενου προϊόντος ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Η μέθοδος της ανίχνευσης του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου των εντεροϊών για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητάς τους αρχικά εφαρμόστηκε πάνω στο πρότυπο εμβολιακό στέλεχος Sabin 1 και στη συνέχεια δοκιμάστηκε στα πρότυπα στελέχη CAV που ανήκουν στην ομάδα EV-C. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε μια δοκιμή της κινητικής της ανίχνευσης των αρνητικής και θετικής πολικότητας RNA κλώνων, για τον εντοπισμό της ελάχιστης χρονικής διάρκειας που απαιτείται από τη στιγμή της μόλυνσης μέχρι και την ανίχνευση του εκάστοτε κλώνου σε σχέση με τη συγκέντρωση του ιού. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την παραπάνω μέθοδο παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες: 76

91 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Χρόνος μετά τη μόλυνση 3h 6h 9h 12h 24h 48h 72h Αρνητικός κλώνος Θετικός κλώνος Πίνακας 3.4.1: Κινητική ανίχνευσης κλώνου αρνητικής και θετικής πολικότητας ιικού τίτλου 10 5 CCID 50. Χρόνος μετά τη μόλυνση 3h 6h 9h 12h 24h 48h 72h S N S N S N S N S N S N S N Αρνητικός κλώνος Χρόνος μετά τη μόλυνση 3h 6h 9h 12h 24h 48h 72h Θετικός κλώνος Πίνακας 3.4.2: Κινητική ανίχνευσης κλώνου αρνητικής και θετικής πολικότητας ιικού τίτλου 1 CCID 50. Με S παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των απλών PCR, ενώ με N τα αποτελέσματα των Nested-PCR. Χρόνος μετά τη μόλυνση 3h 6h 9h 12h 24h 48h 72h S N S N S N S N S N S N S N Αρνητικός κλώνος Χρόνος μετά τη μόλυνση 3h 6h 9h 12h 24h 48h 72h Θετικός κλώνος Πίνακας 3.4.3: Κινητική ανίχνευσης κλώνου αρνητικής και θετικής πολικότητας ιικού τίτλου 10-2 CCID 50. Με S παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των απλών PCR, ενώ με N τα αποτελέσματα των Nested-PCR. Όπως φαίνεται από τους παραπάνω πίνακες, η ανίχνευση του κλώνου αρνητικής πολικότητας μπορεί να πραγματοποιηθεί πολύ σύντομα, ακόμα και 3 ώρες μετά την μόλυνση της κυτταροκαλλιέργειας. Στην υψηλότερη συγκέντρωση του ιού 10 5 CCID 50, η ανίχνευση του αρνητικού κλώνου γίνεται εφικτή μέσω απλής PCR 3 ώρες μετά τη μόλυνση. Στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις του ιού, η κατάσταση διαφοροποιείται καθώς η ανίχνευση του κλώνου αρνητικής πολικότητας επιτυγχάνεται μόνο μέσω της Nested-PCR έπειτα από 6 ώρες. Ενδεικτικά, στις παρακάτω εικόνες απεικονίζονται αποτελέσματα, όσον αφορά την ανίχνευση του αρνητικού και θετικού κλώνου στις διάφορες συγκεντρώσεις του στελέχους Sabin 1: 77

92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ 446bp 100bp L Στήλη Προϊόν h A h B h A h B h A h B h A h B 9 ddh 2 O Εικόνα 3.4.1: Ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου σε Sabin CCID 50. Στις στήλες 1 έως 9 έχουν τοποθετηθεί τα αντίστοιχα προϊόντα της PCR, εις διπλούν (Α,Β) για τις απομονώσεις στις 3, 6, 9 και 12 h μετά τη μόλυνση αντίστοιχα. Στη στήλη L έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp. L bp 100bp Στήλη Προϊόν h A h B h A h B h A h B h A h B 9 ddh 2 O Εικόνα 3.4.2: Ανίχνευση του θετικής πολικότητας RNA κλώνου σε Sabin CCID 50. Στις στήλες 1 έως 9 έχουν τοποθετηθεί τα αντίστοιχα προϊόντα της PCR, όπως αναφέρονται στον πίνακα δεξιά. Στη στήλη L έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp. 78

93 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ L bp Στήλη Προϊόν 1 1 6h A 2 1 6h B 3 1 9h A 4 1 9h B h A h B 7 ddh 2 O Εικόνα 3.4.3: Ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου σε Sabin 1 1CCID 50 έπειτα από Nested-PCR. Στις στήλες 1 έως 7 έχουν τοποθετηθεί τα αντίστοιχα προϊόντα της PCR, από τις απομονώσεις στις 6, 9 και 12 h μετά τη μόλυνση από τα κύτταρα. Στη στήλη L έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp. Παράλληλα με τις μοριακές τεχνικές, πραγματοποιήθηκε και μελέτη της κυτταροκαλλιέργειας για τον έλεγχο των αποτελεσμάτων. Πιο συγκεκριμένα, μετά την μόλυνση των Rd κυττάρων με το συγκεκριμένο στέλεχος, η πλάκα κυτταροκαλλιέργειας παρατηρούνταν καθημερινά για την εμφάνιση CPE. Όπως ήταν αναμενόμενο, υπήρχαν διαφορές ως προς την CPE για κάθε μία από τις διαφορετικές συγκεντρώσεις του ιού. Στην μεγαλύτερη συγκέντρωση του στελέχους 10 5 CCID 50, παρατηρήθηκε πλήρης καταστροφή της κυτταροκαλλιέργειας (4 + CPE), 24 h μετά την μόλυνσή της. Αντίθετα, στη συγκέντρωση του 1 CCID 50, περίπου το 25% (1 + CPE) της καλλιέργειας εμφάνιζε CPE μετά από 2 ημέρες, ενώ η μικρότερη συγκέντρωση (10-2 CCID 50 ) εμφάνισε 2 + CPE 3 ημέρες μετά τη μόλυνση Ανίχνευση της ειδικότητας του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου Τα αποτελέσματα αυτά μέσω της stem loop RT-PCR ελέγχθηκαν ως προς την ειδικότητα των εκάστοτε προϊόντων τους. Για το λόγο αυτό ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε σε δύο επίπεδα. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν τέσσερις ξεχωριστές PCR. Στην πρώτη έγινε προσπάθεια να ανιχνευτεί ο αρνητικός κλώνος μέσω του εκκινητικού ζεύγους ΕntNS1-F / UC53-Flap κατευθείαν από το υλικό εκχύλισης και χωρίς την χρήση του ειδικού εκκινητή EntNS1-RT κατά διαδικασία της RT. 79

94 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Η δεύτερη PCR ακολούθησε την φυσιολογική διαδικασία κατά την οποία πραγματοποιήθηκε RT με τον ειδικό εκκινητή και στη συνέχεια PCR με το ζεύγος εκκινητών που προαναφέρθηκε. Όπως ήταν αναμενόμενο η ενίσχυση του τμήματος έγινε μόνο στη δεύτερη περίπτωση, όπου και παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ζώνη κατά την ηλεκτροφόρηση. Ομοίως και για τα προϊόντα του θετικής πολικότητας κλώνου, αρχικά πραγματοποιήθηκε RT απουσία του εκκινητή UC53-Flap και στη συνέχεια PCR με το ζεύγος UG52-Flap / UC53-Flap. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε RT παρουσία του UC53-Flap και στη συνέχεια PCR με το ίδιο ζεύγος. Όπως ήταν αναμενόμενο και σε αυτή την περίπτωση η ενίσχυση του τμήματος παρατηρήθηκε μόνο στη δεύτερη περίπτωση, παρουσία δηλαδή του UC53-Flap εκκινητή κατά την RT. Εκκινητής RT Ζεύγος εκκινητών (PCR) Αποτέλεσμα PCR Απουσία ENTNS1-RT EntNS1-F/UC53-Flap - EntNS1-RT EntNS1-F/UC53-Flap + Απουσία UC53-Flap UG52-Flap/UC53-Flap - UC53-Flap UG52-Flap/UC53-Flap + Πίνακας : Έλεγχος της ειδικότητας στο επίπεδο της RT. Θετικό αποτέλεσμα στην PCR παρατηρείται μόνο με τη χρήση του EntNS1-RT. Κατά το δεύτερο έλεγχο για τον κλώνο αρνητικής πολικότητας, πραγματοποιήθηκαν τέσσερις PCR αντιδράσεις. Στις δύο πρώτες, μετά την ολοκλήρωση της RT με τον EntNS1-RT, χρησιμοποιήθηκε το εκκινητικό ζεύγος UG52-Flap/UC53-Flap (ειδικό για ανίχνευση θετικού κλώνου) και το εκκινητικό ζεύγος EntNS1-F/UC53-Flap (ειδικό για ανίχνευση αρνητικού κλώνου). Στην περίπτωση αυτή, ενίσχυση προϊόντος παρατηρήθηκε μόνο στην δεύτερη PCR. Ενώ στις δύο τελευταίες, μετά την ολοκλήρωση της RT με τον UC53-Flap, χρησιμοποιήθηκαν εκ νέου τα δύο εκκινητικά ζεύγη. Μόνο με τη χρήση του ειδικού για τον θετικής πολικότητας ζεύγους UG52-Flap/UC53-Flap παρατηρήθηκε ενίσχυση του προϊόντος. Εκκινητής RT Ζεύγος εκκινητών (PCR) Αποτέλεσμα PCR EntNS1-RT UG52-Flap/UC53-Flap - EntNS1-RT EntNS1-F/UC53-Flap + UC53-Flap EntNS1-F/UC53-Flap - UC53-Flap UG52-Flap/UC53-Flap + Πίνακας : Έλεγχος της ειδικότητας στο επίπεδο της PCR για τον θετικής και αρνητικής πολικότητας κλώνο. Θετικό αποτέλεσμα στην PCR παρατηρείται μόνο με τη χρήση του ζεύγους EntNS1-F/UC53-Flap κατά την ανίχνευση του αρνητικού κλώνου, ενώ για τον θετικής μόνο με το ζεύγος UG52-Flap/UC53-Flap. 80

95 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ CAV Ανίχνευση ενεργότητας των προτύπων στελεχών Coxsackie A Στις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν κατά την απομόνωση και καλλιέργεια των διάφορων εντεροϊών διαπιστώθηκε πως τα πρότυπα στελέχη CAV δεν εμφάνιζαν την χαρακτηριστική εικόνα του CPE. Έτσι για την επιλογή των ενεργών στελεχών CAV που χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια κατά τη μελέτη των ανασυνδυασμών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ειδικής Stem-Loop RT-PCR. Δείγματα προτύπων στελεχών CAV που ανήκουν στην ομάδα EV-C απομονώθηκαν στις 12 και 24 h μετά τη μόλυνση σε κυτταρική σειρά και υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε RT με τον εκκινητή ENTNS1-RT. Κατόπιν τα προϊόντα της RT υποβλήθηκαν σε PCR με εκκινητές το ζεύγος ENTNS1-F / UC53-Flap. Από τα τέσσερα στελέχη, μόνο το CAV13 απέδωσε το αναμενόμενο προϊόν στις 446bp και στις δύο απομονώσεις. Επιπλέον τα δείγματα αυτά υποβλήθηκαν σε Nested-PCR, σε περίπτωση που ο ιικός τίτλος ήταν μικρός. Τα αποτελέσματα της Nested-PCR ήταν τα ίδια σε σχέση με την αρχική PCR, καθώς μόνο το στέλεχος CAV13 απέδωσε το αναμενόμενο προϊόν στις 158bp, τόσο στις 12 h όσο και στις 24 h μετά τη μόλυνση. 158bp L Στήλη Προϊόν 1 CAV11 12h 2 CAV13 12h 3 CAV15 12h 4 CAV17 12h 5 Rd 6 CAV11 24h 7 CAV13 24h 8 CAV15 24h 9 CAV17 24h 10 Rd 11 ddh 2 O Εικόνα : Ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου στα πρότυπα στελέχη CAV. Στις στήλες 1 έως 11 έχουν τοποθετηθεί τα αντίστοιχα προϊόντα της Nested-PCR, όπως παρουσιάζονται στον πίνακα δεξιά. Στη στήλη L έχει τοποθετηθεί μάρτυρας μοριακού βάρους 100bp ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ CAV13 Λόγω της ιδιαιτερότητας του πρότυπου στελέχους CAV13 που δεν εμφάνιζε CPE στις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, δεν ήταν δυνατή η μέτρηση του ιικού τίτλου του στελέχους μέσω κυτταροκαλλιεργειών και υπολογισμού του CCID 50, όπως συνέβη με τα υπόλοιπα στελέχη. 81

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΙΙΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ CAV13 Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε η Real-Time PCR και το εκκινητικό ζεύγος UG52 / UC53, όπου το αγνώστου ιικού τίτλου στέλεχος CAV13 συγκρίθηκε με γνωστές συγκεντρώσεις του στελέχους Sabin 1. Σειριακές αραιώσεις του στελέχους Sabin 1 με ιικό τίτλο 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 και 1 CCID 50 παρουσίασαν με βάση το Amplification Plot και το Dissociation Curve μια καλή γραμμικότητα και εξειδίκευση αντίστοιχα. Η συγκέντρωση του 1 CCID 50 χρησιμοποιήθηκε εις τριπλούν, καθώς προσεγγίζει το όριο ανίχνευσης της τεχνικής. Εικόνα 3.5.1: Αποτελέσματα της Real-Time PCR για τις γνωστές συγκεντρώσεις του στελέχους Sabin1. Αριστερά παρουσιάζεται το Amplification Plot και δεξιά το Dissociation Curve. Έτσι με βάση τα αποτελέσματα της παραπάνω Real-Time κατασκευάστηκε η πρότυπη καμπύλη Αρχικής Συγκέντρωσης Ct Initial Quantity (CCID50) Εικόνα 3.5.2: Πρότυπη καμπύλη δειγμάτων Sabin 1 γνωστών αρχικών συγκεντρώσεων. Παράλληλα με τις γνωστές συγκεντρώσεις του ιού υποβλήθηκαν στην ίδια Real- Time PCR σειριακές αραιώσεις του στελέχους CAV13. Το Amplification Plot καθώς και το Dissociation Curve των δειγμάτων αυτών παρουσιάζονται παρακάτω: 82

97 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Εικόνα 3.5.3: Αποτελέσματα της Real-Time PCR για τις άγνωστες συγκεντρώσεις του στελέχους CAV13. Αριστερά παρουσιάζεται το Amplification Plot και δεξιά το Dissociation Curve. Από τα παραπάνω αποτελέσματα και τις τιμές Ct που αντιστοιχούσαν σε κάθε αραίωση του δείγματος CAV13 υπολογίστηκε η συγκέντρωση του αρχικού δείγματος με βάση την πρότυπη καμπύλη της εικόνας σε 10 6,7 CCID ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Όπως περιγράφηκε ανωτέρω, για τη μελέτη των in vitro ανασυνδυασμών μεταξύ των πρότυπων στελεχών Sabin 1 και CAV13 αρχικά έγινε ταυτόχρονη μόλυνση κυττάρων με MOI = 10 για τη δημιουργία των συνθηκών υπερμόλυνσης. Στη συνέχεια το υλικό της κυτταροκαλλιέργειας διαιρέθηκε σε 10 aliquots έτσι ώστε να διευρυνθεί η μελέτη των θέσεων ανασυνδυασμού σε σχέση με τη μελέτη ενός δείγματος. Ακολούθησε εκχύλιση του ιικού RNA και κατόπιν RT με τυχαίους εκκινητές για τη σύνθεση του cdna. Έπειτα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε εννέα PCR αντιδράσεις με ειδικούς εκκινητές για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 στελεχών. Τα προϊόντα των PCR αντιδράσεων που ήταν θετικά καθαρίστηκαν, κλωνοποιήθηκαν και στάλθηκαν για αλληλούχηση. Εν τέλει ακολούθησε η επεξεργασία των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών για την ανάλυση των ανασυνδυασμών PCR αντιδράσεις για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13 Τα 10 aliquots (Rec 1 έως Rec 10) που προέκυψαν από την ταυτόχρονη μόλυνση Rd κυττάρων με πρότυπα στελέχη Sabin 1 και CAV13 υποβλήθηκαν στις 9 PCR αντιδράσεις που περιγράφηκαν στο κεφάλαιο Από τις εννέα αντιδράσεις μόνο στις 3 προέκυψαν θετικά προϊόντα. Στις υπόλοιπες PCR είτε δεν παράγονταν κανένα προϊόν, είτε η 83

98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 εξειδίκευση ήταν χαμηλή με αποτέλεσμα να παράγονται προϊόντα και στους αρνητικούς μάρτυρες Sabin 1 και CAV13 που δεν έφεραν ανασυνδυασμούς. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα και των 9 PCR αντιδράσεων για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13. Δείγματα Ζεύγος εκκινητών Μήκος Προϊόντος Περιοχή υπό μελέτη Rec 1 Rec 2 Rec 3 Rec 4 Rec 5 Rec 6 Rec 7 Rec 8 Rec 9 Rec 10 Sabin 1 CAV CAV673S SAB2596A CAV2519S SAB3950A CAV3840S SAB5207A CAV5020S SAB6754A1 SAB781S CAV2517A SAB2366S1 CAV3521A SAB3466S CAV4153A SAB4113S1 CAV5519A SAB5527S CAV6637A 1900bp 5 -UTR VP bp VP1 2B bp 2B 3A bp 2C 3D bp VP4 VP bp VP3 2A bp 2A 2C bp 2B 3C bp 3C 3D Πίνακας : Αποτελέσματα των 9 PCR αντιδράσεων για την ανίχνευση ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13. Παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των 10 aliquots για κάθε εκκινητικό ζεύγος που χρησιμοποιήθηκε. Με σκίαση υποδεικνύονται οι 3 θετικές PCR αντιδράσεις. Με (+) εμφανίζονται τα δείγματα που απέδωσαν το αναμενόμενου μήκους προϊόν, ενώ με (-) η απουσία το προϊόντος αυτού. Τα πρότυπα στελέχη Sabin 1 και CAV13 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες των αντιδράσεων, καθώς δεν φέρουν ανασυνδυασμούς. Στην εικόνα που ακολουθεί, παρουσιάζονται ενδεικτικά τα αποτελέσματα της πρώτης PCR με το εκκινητικό ζεύγος CAV673S / SAB2596A, έπειτα από ηλεκτροφόρηση των προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 1%. Σε αυτή την PCR όλα τα δείγματα, εκτός των Rec 2, Rec 3 και Rec 4, απέδωσαν το αναμενόμενο προϊόν μήκους 1900bp. 84

99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV bp L L 2 Στήλη Προϊόν 1 Rec 1 2 Rec 2 3 Rec 3 4 Rec 4 5 Rec 5 6 Rec 6 7 Rec 7 8 Rec 8 9 Rec 9 10 Rec 10 Εικόνα : Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πρώτης PCR. Στις στήλες 1 έως 10 έχουν τοποθετηθεί τα αντίστοιχα προϊόντα της PCR με το εκκινητικό ζεύγος CAV673S / SAB2596A, όπως παρουσιάζονται στον πίνακα δεξιά. Στις στήλες L 1 και L 2 έχουν τοποθετηθεί μάρτυρες μοριακού βάρους 1000bp και 100bp αντίστοιχα Επεξεργασία των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών Τα προϊόντα των τριών θετικών PCR αντιδράσεων καθαρίστηκαν, κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακούς φορείς και τα πλασμίδια που προέκυψαν στάλθηκαν για αλληλούχηση. Κάθε πλασμίδιο αλληλουχήθηκε εις διπλούν έτσι ώστε να υπάρχει πλήρης κάλυψη του ενθέματος. Με βάση τις 2 αλληλουχίες που προέκυψαν διορθώθηκαν όποια λάθη εντοπίστηκαν κατά την αλληλούχηση και δημιουργήθηκε η αντίστοιχη αλληλουχία για κάθε θετικό προϊόν της προηγούμενης PCR. Οι αλληλουχίες αυτές στη συνέχεια συγκρίθηκαν με βάση την ομολογία τους με γνωστές κατατεθειμένες αλληλουχίες μέσω του BLAST. Από τα αποτελέσματα του BLAST προέκυψε ότι τα προϊόντα του ζεύγους CAV673S / SAB2596A αποτελούσαν μη ειδικά προϊόντα, καθώς είχε ενισχυθεί περιοχή του κυτταρικού γονιδιώματος προερχόμενη από τα Rd κύτταρα. Επιπλέον το ζεύγος SAB5527S / CAV6637A απέδωσε προϊόντα που εμφάνιζαν 100% ομολογία με το πρότυπο στέλεχος Sabin 1 και δεν έφεραν κάποιο γεγονός ανασυνδυασμού. Οι μόνες ειδικές αλληλουχίες που εμφάνιζαν μεταβολές σε σχέση με τα πρότυπα στελέχη ήταν οι αλληλουχίες που προέρχονταν από το ζεύγος SAB3466S / CAV4153A. Οι αλληλουχίες αυτές στοιχήθηκαν μέσω του προγράμματος MEGA7 με τις αντίστοιχες αλληλουχίες των προτύπων στελεχών Sabin 1 και CAV 13 και στα αποτελέσματα της στοίχισης ακολούθησε η ανάλυση των ανασυνδυασμών. 85

100 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV Ανάλυση των ανασυνδυασμών Για κάθε ένα από τα προϊόντα της PCR με εκκινητές το ζεύγος SAB3466S / CAV4153A, δημιουργήθηκε με βάση τη στοίχιση των αλληλουχιών ένα σχεδιάγραμμα SimPlot στο οποίο απεικονίζεται το γεγονός ανασυνδυασμού του κάθε δείγματος. Επιπλέον δημιουργήθηκε με τη χρήση του προγράμματος Recco απεικόνιση του τμήματος της θέσης ανασυνδυασμού, αλλά και γύρω από αυτή, με βάση την ομολογία της εκάστοτε υπό μελέτης αλληλουχίας και των αλληλουχιών αναφοράς Sabin 1 και CAV13. Στα Simplot σχεδιαγράμματα παρουσιάζεται η ποσοστιαία ομοιότητα της υπό μελέτης αλληλουχίας σε σχέση με της αλληλουχίες αναφοράς των προτύπων στελεχών Sabin 1 και CAV13 κατά μήκος της αλληλουχίας. Στη θέση ανασυνδυασμού παρατηρείται μια απότομη πτώση στην ομοιότητα με το αρχικό στέλεχος (Sabin 1) και παράλληλα αυξάνεται η ομοιότητα με το δεύτερο στέλεχος αναφοράς (CAV13). Σε κάθε σχεδιάγραμμα εντοπίζεται και αναγράφεται επιπλέον και το σημείο ανασυνδυασμού. Στις απεικονίσεις Recco παρουσιάζεται η περιοχή ανασυνδυασμού κάθε δείγματος και η μεταβολή της ομοιότητας της αλληλουχίας σε επίπεδο νουκλεοτιδίων. Για το δείγμα Rec 1: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec 1 86

101 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV Rec 1 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 1 Για το δείγμα Rec 2: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 2 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 2 87

102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 3: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 3 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 3 88

103 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 4: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 4 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 4 89

104 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 5: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 5 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 5 90

105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 6: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 6 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 6 91

106 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 7: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 7 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 7 92

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 8: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 8 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 8 93

108 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 9: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 9 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 9 94

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για το δείγμα Rec 10: 2A 2B Εικόνα : SimPlot ανάλυση του δείγματος Rec Rec 10 Sabin 1 CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της περιοχής ανασυνδυασμού του δείγματος Rec 10 95

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Συγκεντρωτικά από τα παραπάνω αποτελέσματα προέκυψαν 7 διαφορετικοί τύποι ανασυνδυασμού. Ένας τύπος ανασυνδυασμού εμφανίστηκε σε τρία διαφορετικά aliquots ενώ ακόμη ένας σε 2 διαφορετικά. Όλοι οι ανασυνδυασμοί που ανιχνεύτηκαν εντοπίζονται στις περιοχές 2A και 2Β, με μια μικρή υπεροχή υπέρ της 2Β περιοχής όπου εντοπίστηκαν 4 από τους 7 τύπους ανασυνδυασμού σε σχέση με τη 2Α όπου εντοπίστηκαν 3. Στον παρακάτω πίνακα συγκεντρώνονται όλα τα παραπάνω αποτελέσματα των αναλύσεων των ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13. Τύπος Ανασυνδυασμού Γενωμική Περιοχή Σημείο Ανασυνδυασμού Περιοχή Ανασυνδυασμού Αριθμός Εμφανίσεων S1/CAV13 2A 3761nt 3757nt 3764nt 1 S1/CAV13 2A 3777nt 3774nt 3781nt 1 S1/CAV13 2A 3820nt 3811nt 3830nt 2 S1/CAV13 2B 3899nt 3894nt 3904nt 3 S1/CAV13 2B 3980nt 3978nt 3981nt 1 S1/CAV13 2B 4003nt 4002nt 4003nt 1 S1/CAV13 2B 4008nt 4006nt 4010nt 1 Πίνακας : Συγκεντρωτικός πίνακας των ανασυνδυασμών μεταξύ Sabin 1 και CAV13. Παρουσιάζονται η γενωμική περιοχή, το σημείο και η περιοχή ανασυνδυασμού, καθώς επίσης και ο αριθμός εμφανίσεων του κάθε τύπου ανασυνδυασμού στα υπό μελέτη δείγματα Ανάλυση της δευτεροταγούς δομής των RNA μορίων στις περιοχές των ανασυνδυασμών Όπως αναφέρθηκε και στην παράγραφο 1.5.2, αν και τα γεγονότα ανασυνδυασμού είναι αρκετά συχνά στους εντεροϊούς, δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητός ο μηχανισμός βάσει του οποίου γίνεται η μετάβαση του αντιγραφικού συμπλόκου από τον ένα κλώνο στον άλλο. Όμως, ένας βασικός παράγοντας, που πιθανολογείται ότι διευκολύνει τον τερματισμό της RNA σύνθεσης και της συνέχισής της σε ένα άλλο μόριο, είναι η ύπαρξη δευτεροταγών δομών στην περιοχή του ανασυνδυασμού. Επιπλέον αναφέρθηκε στην ίδια παράγραφο πως ο ανασυνδυασμός συμβαίνει κατά τη σύνθεση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου. Οπότε, με βάση τον παραπάνω ισχυρισμό, στην παρούσα διατριβή οι ανασυνδυασμοί δημιουργήθηκαν όταν, κατά τη σύνθεση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου του CAV13 στελέχους, το αντιγραφικό σύμπλοκο μεταπήδησε στον Sabin 1 κλώνο, συναντώντας μια δευτεροταγή δομή που εμπόδιζε την ολοκλήρωση της αντιγραφής. 96

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα βιοπληροφορικής RNAFold, σχεδιάστηκε η δευτεροταγής δομή τόσο ολόκληρου του RNA μορίου του στελέχους CAV13, όσο και της γενωμικής περιοχής 2Α-2Β στην οποία εντοπίστηκαν οι ανασυνδυασμοί της παρούσας διατριβής, με βάση την ελάχιστη ελεύθερη ενέργεια του μορίου (MFE). Και στις 2 περιπτώσεις στις περιοχές των ανασυνδυασμών εντοπίστηκαν δευτεροταγείς δομές οι οποίες πιθανόν να ευθύνονται για την εμφάνιση των ανασυνδυασμών. Εικόνα : Απεικόνιση της δευτεροταγούς δομής της 2A γενωμικής περιοχής. Στην πάνω απεικόνιση εμφανίζεται το μοντέλο της 2Α περιοχής για το στέλεχος CAV13, ενώ κάτω εμφανίζονται οι αντίστοιχες απεικονίσεις αριστερά για το στέλεχος Sabin 1 και δεξιά για το ανασυνδυασμένο στέλεχος. Με βέλη υποδεικνύονται τα σημεία των ανασυνδυασμών που ανιχνεύτηκαν στη 2Α περιοχή, στην παρούσα διατριβή. 97

112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Εικόνα : Απεικόνιση της δευτεροταγούς δομής της 2Β γενωμικής περιοχής. Στην πάνω απεικόνιση εμφανίζεται το μοντέλο της 2Β περιοχής για το στέλεχος CAV13, ενώ κάτω εμφανίζονται οι αντίστοιχες απεικονίσεις αριστερά για το στέλεχος Sabin 1 και δεξιά για το ανασυνδυασμένο στέλεχος. Με βέλη υποδεικνύονται τα σημεία των ανασυνδυασμών που ανιχνεύτηκαν στη 2Β περιοχή, στην παρούσα διατριβή. 98

113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Από τις δυο παραπάνω εικόνες παρατηρείται η πιθανή ύπαρξη συγκεκριμένων δευτεροταγών δομών στις περιοχές των ανασυνδυασμών που εντοπίστηκαν στην παρούσα διατριβή. Ιδιαίτερα στη δεύτερη εικόνα, όπου αναπαρίστανται οι πιθανές δευτεροταγές δομές της 2Β γενωμικής περιοχής, παρατηρείται μια εντονότερη και πολυπλοκότερη διαμόρφωση σε σχέση με τη διαμόρφωση της 2Α περιοχής, στο πρότυπο στέλεχος CAV13. Επιπλέον μια ακόμη δευτεροταγής δομή που πιθανολογείται ότι διευκολύνει την εμφάνιση γεγονότων ανασυνδυασμού, είναι οι ψευδοκόμβοι (pseudoknots). Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα βιοπληροφορικής ProbKnot, έγινε μια προσπάθεια ανίχνευσης της ύπαρξης τέτοιων δομών στις περιοχές ανασυνδυασμού. Λόγω περιορισμού του προγράμματος ανιχνεύτηκε η ύπαρξη ψευδοκόμβων μόνο για μια περιοχή 500nt του στελέχους CAV13, από τη θέση 3600nt έως τη θέση 4100nt, στην οποία εμπεριέχονται όμως όλοι οι ανασυνδυασμοί που ανιχνεύτηκαν ανωτέρω. Εικόνα : Απεικόνιση της ανίχνευσης πιθανών ψευδοκόμβων. Πάνω παρουσιάζονται οι πιθανοί ψευδοκόμβοι που μπορούν να δημιουργηθούν και οι αντίστοιχες πιθανότητες της περιοχής 3600nt 4100nt του στελέχους CAV13 και κάτω η αντίστοιχη απεικόνιση για τα στελέχη Sabin1 αριστερά και το ανασυνδυασμένο στέλεχος δεξιά. 99

114 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Από το παραπάνω σχεδιάγραμμα και με βάση το υπόμνημα, προκύπτει ότι στη συγκεκριμένη περιοχή που εξετάστηκε, οι πιο πιθανές θέσεις για τη δημιουργία ψευδομόμβων είναι οι κυκλωμένες περιοχές και αντιστοιχούν στις περιοχές nt και nt. Περιοχές οι οποίες τοποθετούνται πολύ κοντά στις θέσεις ανασυνδυασμού που εντοπίστηκαν στην παρούσα διατριβή. 100

115 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Οι εντεροϊοί είναι γένος ιών που ανήκουν στην οικογένεια Picornaviridae. Το γονιδίωμά τους αποτελείται από ένα μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας (+ssrna), το οποίο κωδικοποιεί για μια πολυπρωτεΐνη, η οποία στη συνέχεια τεμαχίζεται δίνοντας της δομικές πρωτεΐνες του καψιδίου και τις λειτουργικές πρωτεΐνες. Κυριότερο μέλος των εντεροϊών αποτελεί ο πολιοϊός, με τους ιούς Coxsackie A και B και τους Echo ιούς να αποτελούν εξίσου σημαντικά μέλη του γένους αυτού (Racaniello, 2013). Τα κλινικά συμπτώματα της μόλυνσης με εντεροϊούς μπορούν να κυμαίνονται από ασυμπτωματικές μολύνσεις, μέχρι και την εμφάνιση άσηπτης μηνιγγίτιδας αλλά και οξείας χαλαρής παράλυσης πολιομυελίτιδα. Γίνεται έτσι αντιληπτό ότι έχει ιδιαίτερη σημασία η ανίχνευσης τη κυκλοφορίας των διαφόρων στελεχών των εντεροϊών σε ένα πληθυσμό. Η διάγνωση της μόλυνσης με εντεροϊούς και ο χαρακτηρισμός τους μπορεί να είναι πολύπλοκη διαδικασία. Η δυσκολία οφείλεται στο γεγονός ότι οι εντεροϊοί μπορούν να βρίσκονται στο αναπνευστικό και γαστρεντερικό σύστημα τόσο υγιών όσο και ασθενών ατόμων. Λόγω της ομοιότητας των συμπτωμάτων που προκαλούνται από διαφορετικούς τύπους εντεροϊών, είναι απαραίτητη όχι μόνο η διάγνωσή τους αλλά και η ταυτοποίησή τους (Palacios & Oberste, 2005). Για την ταυτοποίηση και τυποποίηση των εντεροϊών έχουν χρησιμοποιηθεί τεχνικές όπως η οροεξουδετέρωση, η RFLP και η ενίσχυση συγκεκριμένων γενωμικών περιοχών του γονιδιώματος των εντεροϊών με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Η κλασσική μέθοδος ανίχνευσης και ταυτοποίησης των εντεροϊών είναι η απομόνωσή τους από κυτταροκαλλιέργειες, που προϋποθέτει τουλάχιστον τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές και συνεχόμενες ανακαλλιέργειες μέχρι την εμφάνιση της χαρακτηριστικής εικόνας της κυτταροπαθογόνου δράσης (CPE) των ιών στα κύτταρα. Κατόπιν η ταυτοποίηση του οροτύπου για κάθε στέλεχος διεξάγεται μέσω οροεξουδετέρωσης χρησιμοποιώντας έναν αριθμό ειδικών αντισωμάτων (WHO, 2004). Η συγκεκριμένη προσέγγιση παρουσίασε αρκετά μειονεκτήματα, όπως στην περίπτωση ορισμένων CAV ιών που δεν εμφανίζουν CPE και κατά συνέπια δεν μπορούν να χαρακτηριστούν μέσω της οροεξουδετέρωσης (Terletskaia-Ladwig et al., 2008). Σύγχρονες μοριακές τεχνικές, με βάση την RΤ-PCR και την Real-Time PCR, αποτελούν χρήσιμα εργαλεία στη διάγνωση των λοιμώξεων των εντεροϊών 101

116 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ και στην ταυτοποίηση και τυποποίηση των εντεροϊών (Benschop et al., 2010; Bolanaki et al., 2008; Caro et al., 2001; Kottaridi et al., 2005; Siafakas et al., 2004). Το πρώτο κομμάτι της παρούσας διατριβής αφορούσε την ανάπτυξη μιας Multiplex- PCR αντίδρασης για την ανίχνευση και ταυτοποίηση εντεροϊών. Τρία εκκινητικά ζεύγη που στοχεύουν στην 5 -UTR, VP1 και 2C γενωμική περιοχή απέδωσαν τρία αμπλικόνια που παρείχαν επαρκή πληροφορία για την ανίχνευση και την ταυτοποίηση πρότυπων αλλά και κλινικών δειγμάτων εντεροϊών. Η 5 -UTR γενωμική περιοχή αποτελεί την πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ των εντεροϊών επειδή παίζει σημαντικό ρόλο στην μετάφραση και στην αντιγραφή του θετικής πολικότητας κλώνου RNA των εντεροϊών (Zoll et al., 1992). Το ζεύγος UG52 / UC53 χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλές τεχνικές PCR για την ανίχνευση των εντεροϊών καθώς, ενισχύει ένα προϊόν μήκους 433bp, καθιστώντας δυνατή την ανίχνευση όλων των εντεροϊών με τη χρήση ενός ζεύγους εκκινητών (Georgopoulou et al., 2000; Kottaridi et al., 2005; Zoll et al., 1992). Το δεύτερο εκκινητικό ζεύγος που χρησιμοποιήθηκε στην τεχνική αυτή ήταν το εκφυλισμένο ζεύγος ΑΝ89 / ΑΝ88 το οποίο ενισχύει τμήμα της VP1 γενωμικής περιοχής μήκους 375bp. Η χρήση εκφυλισμένων εκκινητών παρέχει τη δυνατότητα να αποδίδουν το συγκεκριμένο προϊόν όλοι οι διάφοροι ορότυποι των εντεροϊών στοχεύοντας μια αρκετά ευμετάβλητη γενωμική περιοχή, όπως είναι η VP1 (Nix et al., 2006).Η περιοχή αύτη υπόκειται σε εξελικτική πίεση, αφού η πρωτεΐνη VP1 βρίσκεται στο εξωτερικό του καψιδίου και φέρει τα κύρια αντιγονικά σημεία του ιού και για αυτό το λόγο εμφανίζει υψηλό ρυθμό μεταλλάξεων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι αλληλούχηση της VP1 γενωμικής περιοχής, ή τμήμα αυτής, είναι η πιο ακριβής προσέγγιση για την μοριακή ταυτοποίηση των εντεροϊών (Benschop et al., 2010; Oberste et al., 2000; Oberste et al., 2003). Το τελευταίο ζεύγος εκκινητικών μορίων που χρησιμοποιήθηκε στην Multiplex-PCR είναι το ζεύγος CHR1 / CHR2. Το εκφυλισμένο αυτό ζεύγος ενισχύει ένα τμήμα της 2C γενωμικής περιοχής μήκους 800bp. Οι εκκινητές αυτοί σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία των EV-B έτσι ώστε να παρέχει ένα αμπλικόνιο χρήσιμο για την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και την μελέτης γεγονότων ανασυνδυασμού (Kottaridi et al., 2007). Έτσι, η παρουσία του συγκεκριμένου προϊόντος υποδεικνύει την ύπαρξη ενός εντεροϊού που ανήκει στην ομάδα EV-B, ενώ η απουσία του προϊόντος, παράλληλα με την 102

117 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ παρουσία των υπόλοιπων 2 προϊόντων της παρούσας τεχνικής, την ύπαρξη ενός εντεροϊού που ανήκει στην ομάδα EV-A ή EV-C. Τα αποτελέσματα της Multiplex-PCR στα πρότυπα στελέχη, έδειξαν την ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει και να ταυτοποιεί όλους τους ορότυπους που εξετάστηκαν. Σε όλα τα πρότυπα στελέχη ενισχύθηκαν και τα δυο προϊόντα μήκους 433bp και 375bp προερχόμενα από τα ζεύγη UG52 / UC53 και AN89 / AN88 αντίστοιχα. Επιπλέον, 30 από τα 41 πρότυπα στελέχη απέδωσαν το προϊόν μήκους 800bp που προέρχεται από το ζεύγος CHR1 / CHR2. Όλα τα στελέχη που ήταν θετικά στο προϊόν αυτό ανήκαν στην ομάδα EV-B, ενώ τα υπόλοιπα 11 στελέχη που ήταν αρνητικά ανήκαν στην ομάδα EV-C. Για να διαπιστωθεί περαιτέρω η ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει και να ταυτοποιεί εντεροϊούς, χρησιμοποιήθηκαν 20 κλινικά δείγματα τα οποία είχαν ταυτοποιηθεί σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου και ανήκαν στην ομάδα EV-B. Τα αποτελέσματα απέδειξαν την ικανότητα της μεθόδου, καθώς σε όλα τα δείγματα ενισχύθηκαν και τα 3 αναμενόμενα προϊόντα. Η αλληλούχηση του προϊόντος των εκκινητών AN89 / AN88 επιβεβαίωσε σωστά και με ακρίβεια τον ορότυπο των κλινικών δειγμάτων, αποδεικνύοντας πως η αλληλούχηση ολόκληρης, ή τμήματος, της VP1 γενωμικής περιοχής είναι η πιο ακριβής μέθοδος για την μοριακή ταυτοποίηση των εντεροϊών (Benschop et al., 2010; Oberste et al., 2000; Oberste et al., 2003). Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η μείωση της ευαισθησίας που παρατηρείται σε σχέση με τις αντίστοιχες απλές PCR. Η μείωση αυτή, αν και είναι της τάξης των 10CCID 50, είναι σημαντική ιδιαίτερα στα δείγματα όπου ο ιικός τίτλος είναι ιδιαίτερα μικρός. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν τα δείγματα ΕΝΥ. Στην παρούσα διατριβή δεν ήταν δυνατή η ανίχνευσή εντεροϊών στα δείγματα αυτά μέσω της Multiplex-PCR, ενώ χρησιμοποιώντας απλές PCR ανιχνεύτηκαν εντεροϊοί στα 30 από τα 61 συνολικά δείγματα ENY. Οπότε, γίνεται αντιληπτό ότι σε δείγματα όπου ο ιικός τίτλος είναι ιδιαίτερα μικρός παρουσιάζεται μια αδυναμία της μεθόδου να ανιχνεύσει και να ταυτοποιήσει με επιτυχία εντεροϊούς στα δείγματα αυτά. Μελλοντική προσέγγιση για την αύξηση της ευαισθησίας της μεθόδου θα μπορούσε να αποτελέσει ο σχεδιασμός μιας Multiplex Real-Time PCR, μέσω της οποίας να αντισταθμίζεται η απώλεια της ευαισθησίας λόγω Multiplex με το κέρδος της ευαισθησίας λόγω Real-Time. 103

118 ΣΥΖΗΤΗΣΗ DOP-PCR 4.2. DOP-PCR Αν και η ταυτοποίηση των εντεροϊών μέσω ολόκληρης, ή τμήματος, της VP1 γενωμικής παρέχει αρκετή πληροφορία για τη σωστή ταυτοποίηση του ιού, δεν είναι όμως αρκετή για τις επιδημιολογικές μελέτες και για τις μελέτες γεγονότων ανασυνδυασμού. Για τις μελέτες αυτές κρίνεται απαραίτητη η αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη στρατηγική για την υψηλής απόδοσης αλληλούχηση των RNA ιών, περιλαμβάνει το σχεδιασμό αλληλεπικαλυπτόμενων αμπλικονίων, τα οποία εκτείνονται σε ολόκληρο το γονιδίωμα του ιού, ακολουθούμενα από τη στοχευμένη ενίσχυση γενωμικών περιοχών περίπου 1000bp, μετά από αντίστροφη μεταγραφή σε πλάκες 96 θέσεων. Παρόλο που αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για RNA όσο και για DNA ιούς, καθώς και σε περιπτώσεις μικρής ποσότητας ιικών νουκλεϊκών οξέων, δεν είναι χρήσιμη για την απόκτηση γενωμικών πληροφοριών από ιούς για τους οποίους υπάρχουν λίγες ή καθόλου διαθέσιμες πληροφορίες των αλληλουχιών τους ή για ιούς οι οποίοι έχουν αποκλίνει σημαντικά από στελέχη με δημοσιευμένες αλληλουχίες (Djikeng & Spiro, 2009). Η διαδικασία της αλληλούχησης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) έχει καταστεί μία πολύ ισχυρή προσέγγιση στο πεδίο των μολυσματικών ασθενειών και έχει επιφέρει την επανάσταση στις μελέτες της μοριακής ιολογίας. Η NGS έχει εφαρμοστεί εκτενώς σε ευρύ φάσμα ανίχνευσης, για την παρακολούθηση της εξάπλωσης των παθογόνων παγκοσμίως (Chan et al., 2012), σε επιδημιολογικές μελέτες παγκοσμίως, για την ανάλυση της ποικιλομορφίας ιικών κοινοτήτων σε μεταγενωμικές αναλύσεις (Sibley et al., 2012), καθώς και για την ανίχνευση άγνωστων παθογόνων και την ανακάλυψη νέων ιών (Barzon et al., 2011). Στο δεύτερο κομμάτι της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε μία προσπάθεια ανάπτυξης μίας γρήγορης και εύκολης ενίσχυσης ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών. Το γονιδίωμα καλύπτεται με λίγες μόνο αντιδράσεις ενίσχυσης και τα τμήματα, στη συνέχεια μπορούν να αλληλουχηθούν. Η τεχνική αυτή είναι ανεξάρτητη προηγούμενης αλληλούχησης, καθώς δεν απαιτείται γνώση της αλληλουχίας του γονιδιώματος των στελεχών και μπορεί να ενισχύσει γονιδιώματα εντεροϊών εξαιρετικά χαμηλών αντιγράφων (Dupinay et al., 2012). Το πρώτο βήμα περιελάμβανε τη δημιουργία ενός πρωτοκόλλου προενίσχυσης του γονιδιώματος των εντεροϊών. Βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για τη χρήση της DOP-PCR κατά την οποία πραγματοποιείται μία μη ειδική προενίσχυση 104

119 ΣΥΖΗΤΗΣΗ DOP-PCR ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών. Αυτό είναι δυνατό, χάρη στη χρήση ενός μόνο εκφυλισμένου εκκινητή 22 νουκλεοτιδίων, ο οποίος περιέχει μία καλά καθορισμένη αλληλουχία στο 3 άκρο, ακολουθούμενη από 6 εκφυλισμένα νουκλεοτίδια. Το 5 άκρο του εκκινητή περιέχει μια σπάνια θέση περιορισμού ενδονουκλεάσης (Telenius et al., 1992). Η αλληλουχία του εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε ήταν η εξής 5 - CCGACTCGAGINNNNNNTGTGG-3. Κατά την DOP-PCR πραγματοποιήθηκαν πέντε πρώτοι κύκλοι, όπου το δείγμα ενισχύθηκε υπό συνθήκες χαμηλής αυστηρότητας καθώς υποβάλλεται σε χαμηλές θερμοκρασίες υβριδοποίησης και επιμήκυνσης ώστε να στοχεύσει διάφορες θέσεις πάνω στο γονιδίωμα. Έπειτα, ακολούθησαν 35 κύκλοι υψηλής αυστηρότητας, όπου η θερμοκρασία υβριδοποίησης ήταν υψηλότερη, αυξάνοντας την εξειδίκευση της ενίσχυσης. Κατά τη διάρκεια των πρώτων πέντε κύκλων, μόνο το 3 άκρο των εκκινητών υβριδοποιείται και ξεκινά την επιμήκυνση από θέσεις που περιέχουν την καλά καθορισμένη ακολουθία των 6 νουκλεοτιδίων. Το εκφυλισμένο μέρος των εκκινητών βεβαιώνει ότι όλοι οι πιθανοί συνδυασμοί των 12 νουκλεοτιδίων θα υβριδιστούν και θα επιμηκυνθούν. Η τεχνική αρχικά χρησιμοποιήθηκε και δοκιμάστηκε στα πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin 1,2 και 3, ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες ενίσχυσης χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο υψηλής πιστότητας, σε σχέση με τις απλές PCR. Στη συνέχεια, η τεχνική δοκιμάστηκε σε κλινικά δείγματα. Πρόκειται για τα εμβολιοπροερχόμενα δείγματα Κ/2002, EP23, LK3, 738 και 584. Τα προϊόντα της DOP-PCR υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε συμπληρωματικές PCR με ζεύγη εκκινητών που δημιουργούσαν αλληλεπικαλυπτόμενα αμπλικόνια, με στόχο την ειδική ενίσχυση των διαφόρων περιοχών του γονιδιώματος των εντεροϊών ώστε να σταλούν για αλληλούχηση. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος TS1 / HEV C-11. Οι εκκινητές αυτοί στοχεύουν στην 5 -UTR περιοχή του γονιδιώματος. Ο TS1 είναι ένας ειδικός εκκινητής για όλους τους εντεροϊούς (universal), ενώ ο HEV C-11 είναι ειδικός μόνο για τους EV-Cs. Αυτό το ζεύγος χρησιμοποιήθηκε για να καλύψει το κενό ενίσχυσης που υπήρχε στις πρώτες 200 βάσεις του γονιδιώματος και ενίσχυσε με επιτυχία το αναμενόμενο προϊόν σε όλα τα δείγματα. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών SAB222S / SAB541A3 το οποίο ενισχύει μια περιοχή 2319bp από την 5 -UTR έως την VP1 γενωμική περιοχή. Οι εκκινητές αυτοί δεν είναι universal και σχεδιάστηκαν στην παρούσα μελέτη έτσι ώστε να υβριδίζονται σε Sabin αλληλουχίες. Το αναμενόμενο προϊόν προέκυψε σε όλα τα δείγματα με 105

120 ΣΥΖΗΤΗΣΗ DOP-PCR διαφορετική όμως ένταση σε κάθε δείγμα έπειτα από την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η μεταβολή αυτή της έντασης πιθανότητα σχετίζεται με την συμπληρωματικότητα των εκκινητών στα δείγματα, ιδιαίτερα του antisense εκκινητή που τοποθετείται στην ευμετάβλητη VP1 γενωμική περιοχή. Το ζεύγος UG1 / UC1 που χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια, ενισχύει μία μικρή περιοχή 473 βάσεων από τη VP3 έως τη VP1 περιοχή προκειμένου να καλύψει το κενό ανάμεσα στο προηγούμενο και επόμενο ζεύγος εκκινητών. Οι εκκινητές αυτοί είναι universal και το αναμενόμενο προϊόν των 473bp προέκυψε σε όλα τα δείγματα. Το μεγαλύτερο προϊόν που ενισχύθηκε ήταν μήκους 2392bp και προέκυψε από το ζεύγος εκκινητών S 3 26 / S Οι εκκινητές αυτοί ενισχύουν ένα προϊόν που τοποθετείται από την VP1 έως την 3Β γενωμική περιοχή. Δεν αποτελούν Universal εκκινητές και είχαν σχεδιασθεί σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου. Ο εκκινητής S 3 26 είναι ειδικός για Sabin 3 στελέχη και ο S για Sabin 2, στις περιοχές που υβριδοποιούνται. Ωστόσο, ο S παρουσιάζει ικανοποιητική ομολογία και με το Sabin 1 στέλεχος στην περιοχή υβριδισμού με αποτέλεσμα να ενισχύεται το αντίστοιχο προϊόν και στα Sabin 1 στελέχη. Το γεγονός αυτό, αιτιολογεί την ύπαρξη προϊόντος στο δείγμα ΙΚ, το οποίο αν και στην περιοχή υβριδοποίησης του συγκεκριμένου εκκινητή είναι Sabin 1, αποδίδει κανονικά το προϊόν μήκους 2392bp. Έτσι, μετά την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων, προκύπτει προϊόν στο αναμενόμενο ύψος σε όλα τα δείγματα σε αυτήν την περιοχή. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ενίσχυση από την 3Α έως την 3D περιοχή του γονιδιώματος των στελεχών από το ζεύγος εκκινητών SAB5150S / SAB6448Α, το οποίο επίσης αν και δεν είναι Universal, είναι ειδικό για όλα τα στελέχη Sabin και σχεδιάστηκε στη παρούσα μελέτη. Το αναμενόμενο προϊόν μήκους 1298bp προέκυψε σε όλα τα δείγματα. Η τελευταία ενίσχυση πραγματοποιήθηκε από το ζεύγος εκκινητών UG16 / HΕV C- 425, από την 3C έως την 3 -UTR περιοχή των στελεχών. Ο UG16 είναι ειδικός για όλους τους εντεροϊούς, ενώ ο HEV C-425 είναι ειδικός για τους EV-Cs. Η ενίσχυση που πραγματοποιήθηκε απέδωσε ένα προϊόν μήκους 1519bp και προέκυψε σε όλα τα στελέχη. Η ύπαρξη των παραπροϊόντων και του νεφώματος (smear) στα αποτελέσματα της κάθε PCR, οφείλεται στην προενίσχυση του γονιδιώματος από την DOP-PCR και δεν επηρεάζουν το ειδικό προϊόν και τα αποτελέσματα γενικότερα. Επιπλέον, η διαφορετική ένταση των προϊόντων είναι πιθανό να οφείλεται σε διαφορετική συμπληρωματικότητα των εκκινητών με το εκάστοτε δείγμα και δε συνδέεται με την αποτελεσματικότητα της μεθόδου. Η αλληλούχηση των προϊόντων από κάθε PCR επιβεβαίωσε την εγκυρότητα της 106

121 ΣΥΖΗΤΗΣΗ DOP-PCR τεχνικής, καθώς ακόμη και σε δείγματα που οι ζώνες στο πήκτωμα ήταν αρκετά αχνές, η αλληλούχηση ήταν επιτυχής. Τέλος πραγματοποιήθηκε Real-Time PCR για να εξεταστεί η ίση κατανομή των τμημάτων που προκύπτουν από την προενίσχυση του γονιδιώματος των εντεροϊών κατά την DOP-PCR. Ο έλεγχος έγινε σε τρείς περιοχές του γονιδιώματος (5 -UTR, VP1 και 3D) με τα ζεύγη εκκινητών (UG52 / UC53, UG1 / UC1 και UG16 / UC12, αντίστοιχα). Αν και παρατηρήθηκαν διαφορετικές τιμές Ct, συνυπολογίζοντας το διαφορετικό μήκος των τριών προϊόντων, παρατηρήθηκε ότι οι διαφορετικές τιμές Ct ήταν αναμενόμενες. Κατά συνέπεια δεν εντοπίστηκε διαφορά στην κατανομή των προϊόντων της DOP-PCR, καθώς η διαφορά που παρατηρήθηκε (4,3-6%) ήταν μικρότερη του 10%. Συνοψίζοντας, αναπτύχθηκε μία τεχνική με την οποία έγινε δυνατή η ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών με σχεδόν μόνο 4 PCR αντιδράσεις. Με τις 4 αντιδράσεις επιτυγχάνεται κάλυψη περίπου του 93,3% του γονιδιώματος των εντεροϊών, ενώ χρησιμοποιώντας και τις υπόλοιπες 2 PCR αντιδράσεις με τα μικρότερα προϊόντα επιτυγχάνεται η πλήρης κάλυψη του γονιδιώματος. Η μεγαλύτερη ενίσχυση που επιτεύχθηκε ήταν μήκους 2392bp, κάτι που είναι αδύνατο να πραγματοποιηθεί με μία απλή PCR, χρησιμοποιώντας απλή Taq πολυμεράση, καθώς η ικανότητα επιμήκυνσης ενός τέτοιου ενζύμου κυμαίνεται περίπου στις 1500bp. Επιπλέον όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε εγκαταστάσεις με απλό εξοπλισμό, χαμηλότερου κόστους σε σχέση με τον εξοπλισμό που απαιτείται στην περίπτωση της NGS, καθιστώντας έτσι την τεχνική ως ένα χρήσιμο εργαλείο σε εργαστήρια που δεν διαθέτουν υπερσύγχρονα μηχανήματα. Όλες οι αντιδράσεις, με εξαίρεση την αρχική DOP, έγιναν με τη χρήση απλής Taq πολυμεράσης, μειώνοντας επιπλέον το κόστος της τεχνικής, ως προς τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για την πραγματοποίησή της. Τα δείγματα της παρούσας εργασίας είχαν απομονωθεί ύστερα από καλλιέργεια σε κυτταρικές σειρές. Συνεπώς, μελλοντική προσέγγιση αποτελεί ο έλεγχος της τεχνικής σε περιβαλλοντικά και κλινικά δείγματα χωρίς τη μεσολάβηση κυτταροκαλλιεργειών, έτσι ώστε να μπορεί να χαρακτηριστεί ως μία καθολική τεχνική για την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος των εντεροϊών. Η αλληλούχηση χρησιμοποιείται ευρύτατα τόσο σε επιδημιολογικές μελέτες, όσο και ως διαγνωστικό εργαλείο. Η ύπαρξη μίας γρήγορης, εύκολης και οικονομικής τεχνικής, που είναι ικανή να ενισχύσει πολύ μικρές ποσότητες ιικών αντιγράφων είναι πολύ χρήσιμη 107

122 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΟΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ τόσο για την κατάταξη νέων στελεχών που μπορεί να προκύπτουν μέσω εξέλιξης όσο και για την ταυτοποίηση των μηχανισμών εξέλιξής τους ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΟΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Το OPV ήταν το εμβόλιο που χρησιμοποιήθηκε εκτενέστατα από το 1964, συντελώντας στην δραστική μείωση των κρουσμάτων πολιομυελίτιδας από περιπτώσεις σε 125 ενδημικές χώρες το 1988 σε μόλις 42 περιπτώσεις σε τέσσερις χώρες (Πακιστάν, Αφγανιστάν, Λάος και Νιγηρία) το 2016 (Jorba et al., 2016). Παρόλα αυτά η εμφάνιση των VDPV άλλαξε τελείως την αντίληψη γύρω από το OPV, καθώς η εμφάνιση αυτή εθεωρείτο ως αμελητέος κίνδυνος καθώς προκαλούσε σπάνιες και μεμονωμένες περιπτώσεις VAPP. Η απομόνωση ιικών στελεχών με αυξημένη νευρομολυσματικότητα απετέλεσε ένα μεγάλο πρόβλημα για την ασφάλεια του OPV (Equestre et al., 1991; Gnanashanmugam et al., 2007; Otelea et al., 1993). Κατά τον πολλαπλασιασμό των εμβολιακών στελεχών στον ανθρώπινο εντερικό σωλήνα, μεταλλάξεις σε καθοριστές του εξασθενημένου φαινοτύπου τους και γεγονότα ανασυνδυασμού μεταξύ των τριών στελεχών Sabin του εμβολίου OPV μπορούν να συντελέσουν στην απώλεια του εξασθενημένου φαινοτύπου των στελεχών OPV και την απόκτηση ιδιοτήτων χαρακτηριστικών των πολιοϊών αγρίου τύπου (Cherkasova et al., 2005; Furione et al., 1993; Georgescu et al., 1997). Η τρισθενής φύση του OPV και η κατανομή των μεταλλάξεων εξασθένισης σε ολόκληρο το γονιδίωμα των εμβολιακών στελεχών Sabin, ευνοούν τον δια-οροτυπικό ανασυνδυασμό που οδηγεί σε νέα ιικά στελέχη με αυξημένη αρμοστικότητα. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, τα συνήθη σημεία ανασυνδυασμού βρίσκονται στη μέση ή στο 3 μέσο της 2C γενωμικής περιοχής για ανασυνδυασμούς τύπου S3/Sx και στην μέση ή στο 3 μέσο της 3D γενωμικής περιοχής για ανασυνδυασμούς τύπου S2/Sx (Blomqvist et al., 2003; Boot et al., 2004; Cuervo et al., 2001; Georgescu et al., 1995; Georgopoulou & Markoulatos, 2001; Karakasiliotis et al., 2004; Karakasiliotis et al., 2005; Kew et al., 2002; Liu et al., 2003; Paximadi et al., 2006). Ωστόσο, έχουν επίσης χαρακτηριστεί παράγωγα του OPV που έχουν σπάνιους τύπους ανασυνδυασμού και βρίσκονται σε μη δομικές γενωμικές περιοχές διαφορετικές των 2C και 3D (Cuervo et al., 2001; Georgescu et al., 1994; Paximadi et al., 2006; Pliaka et al., 2010). Εκτός από τις μη δομικές γενωμικές περιοχές, ανασυνδυασμοί έχουν εντοπιστεί και στις δομικές περιοχές. Συγκεκριμένα έχουν αναφερθεί περιπτώσεις εμφάνισης 108

123 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΟΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ανασυνδυασμού στη VP1 γενωμική περιοχή (Blomqvist et al., 2003; Blomqvist et al., 2010; Dedepsidis et al., 2008; Martín et al., 2002). Ο ανασυνδυασμός αυτός έχει ως αποτέλεσμα ένα ανασυνδυασμένο στέλεχος με διατυπικό καψίδιο που εμφανίζει αυξημένη αρμοστικότητα. Επίσης, παρόλο που ο συγκεκριμένος ανασυνδυασμός αποτελεί ένα σπάνιο γεγονός, έχει προταθεί η πιθανότητα ύπαρξης ενός «θερμού σημείου» (hotspot) για τη συγκεκριμένη θέση. Αυτό το σημείο εντοπίζεται στο 3 άκρο της VP1 γενωμικής περιοχής και ευνοεί τον ανασυνδυασμό τύπου S3/S2 (Dedepsidis et al., 2008). Μια Multiplex-PCR μέθοδος που είχε αναπτυχθεί προηγουμένως από τους Kilpatrick et al χρησίμευε στην ταυτοποίηση ανασυνδυασμένων στελεχών Sabin. Η μέθοδος αυτή στοχεύει στο 5 μέσο της 2C γενωμικής περιοχής και σε ευμετάβλητες περιοχές κοντά στο μέσο της 3D γενωμικής περιοχής και των τριών στελεχών Sabin. Ωστόσο, η τεχνική αυτή παραλείπει αρκετούς τύπους ανασυνδυασμού καθώς στοχεύει μόνο σε μια μικρή περιοχή του ιικού γενώματος (Kilpatrick et al., 2004). Μια ακόμη RT-PCR για την ανίχνευση των κύριων τύπων ανασυνδυασμού S3/Sx και S2/Sx στην 2C και 3D γενωμική περιοχή αντίστοιχα. Η προσέγγιση αυτή εστίαζε μόνο σε αυτές τις 2 γενωμικές περιοχές και, αν και ανίχνευε ένα μεγάλο αριθμό ανασυνδυασμένων VDPVs, δεν μπορούσε να ανιχνεύσει και να ταυτοποιήσει λιγότερο συχνούς τύπους ανασυνδυασμού που εντοπίζονταν στις υπόλοιπες γενωμικές περιοχές (Pliaka et al., 2010). Κατά το τρίτο μέρος της παρούσας διατριβής, σχεδιάστηκαν τέσσερις Multiplex-PCR αντιδράσεις που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση σπάνιων τύπων ανασυνδυασμού που βρίσκονται στις VP1, 2A, 2C, 3A, 3C και 3D γενωμικές περιοχές των παραγώγων του OPV. Δέκα ανασυνδυασμένα παράγωγα του OPV που είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί με αλληλούχηση επιλέχθηκαν με σκοπό να αναλυθεί η ακρίβεια της προτεινόμενης Multiplex-PCR μεθόδου. Πέντε από αυτά (742, LK3, 738, 584 και I34) βρέθηκαν να φέρουν διπλούς ανασυνδυασμούς ή και πολλαπλούς ενώ πέντε από αυτά (Κ/2002, EP9,EP23, ID και IF) έφεραν μόνο μια θέση ανασυνδυασμού. Πιο συγκεκριμένα μέσω του Group 1 καθίσταται δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση τριών τύπων ανασυνδυασμού. Οι ανασυνδυασμοί αυτοί είναι τύπου S3/S1 στο 3 άκρο της VP1 γενωμικής περιοχής, S2/S1 στο 3 άκρο της 2C γενωμικής περιοχής και S2/S1 στο 3 άκρο της 3Α γενωμικής περιοχής. Ο πρώτος τύπος ανασυνδυασμού (S3/S1 VP1) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους VP1-S3/S2-S, VP1-S3/S2-A ενισχύοντας ένα προϊόν μήκους 203bp από το νουκλεοτίδιο (nt) 3157 στο 3367nt. Ο δεύτερος τύπος ανασυνδυασμού (S2/S1 2C) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 2C-S2/S1-S, 2C- 109

124 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΣΕ ΕΜΒΟΛΙΟΠΟΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ S2/S1-A ενισχύοντας ένα προϊόν μεγέθους 378bp από το 4880nt στο 5258nt. Ο τρίτος τύπος ανασυνδυασμού (S2/S1 3Α) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 2C-S2/S1-S, 3C- S2/S1b-A ενισχύοντας ένα προϊόν μεγέθους 742bp από το 4880nt στο 5623nt. Σε αυτό το Group λόγω της χρήσης ενός κοινού εκκινητή για δυο τύπους ανασυνδυασμού (2C-S2/S1-S) αναμένουμε την εμφάνιση δύο προϊόντων 378bp και 742bp στην περίπτωση που ο ανασυνδυασμός εντοπίζεται στην 2C περιοχή, ενώ αναμένουμε μόνο την εμφάνιση του προϊόντος των 742bp στην περίπτωση που ο ανασυνδυασμός εντοπίζεται στην 3Α περιοχή. Στο Group 2 γίνεται δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση, επίσης, τριών τύπων ανασυνδυασμού. Οι ανασυνδυασμοί αυτοί είναι S1/S3 στο 5 άκρο της 2Α γενωμικής περιοχής, S3/S1 στο 3 άκρο της 2C γενωμικής περιοχής και S2/S1 στο μέσο της 3D γενωμικής περιοχής. Ο πρώτος τύπος ανασυνδυασμού (S1/S3 2A) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 2A-S1/S3-S, 2A-S1/S3-A ενισχύοντας ένα προϊόν μήκους 204bp από το 3344nt στο 3538nt. Ο δεύτερος τύπος ανασυνδυασμού (S3/S1 2C) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 2C-S3/S1-S, 2C-S3/S1-A ενισχύοντας ένα προϊόν μεγέθους 593bp από το 4771nt στο 5372nt. Ο τρίτος τύπος ανασυνδυασμού (S2/S1 3D) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 3D-S2/S1-S, 3D-S2/S1-A ενισχύοντας ένα προϊόν μεγέθους 529bp από το 6097nt στο 6607nt. Στο Group 3 γίνεται δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση δύο τύπων ανασυνδυασμού. Οι ανασυνδυασμοί αυτοί είναι S3/S2 στο 3 άκρο της 2C γενωμικής περιοχής και S1/S2 στο 5 άκρο της 3D γενωμικής περιοχής. Ο πρώτος τύπος ανασυνδυασμού (S3/S2 2C) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 2C-S3/S2-S, 2C- S3/S2-A ενισχύοντας ένα προϊόν μήκους 327bp από το 5700nt στο 6034nt. Ο δεύτερος τύπος ανασυνδυασμού (S1/S2 3D) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 3D-S1/S2- S, 3D-S1/S2-A ενισχύοντας ένα προϊόν μεγέθους 714bp από το 5526nt στο 6238nt. Στο Group 4 γίνεται δυνατή η ανίχνευση και ταυτοποίηση, επίσης, δυο τύπων ανασυνδυασμού. Οι ανασυνδυασμοί αυτοί είναι S2/S1 στο 5 άκρο της 3C γενωμικής περιοχής και S2/S1 στο 3 ακραίο όριο της 3D γενωμικής περιοχής. Ο πρώτος τύπος ανασυνδυασμού (S2/S1 3C) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 3C-S2/S1-S, 3C- S2/S1b-A ενισχύοντας ένα προϊόν μήκους 298bp από το 5324nt στο 5623nt. Ο δεύτερος τύπος ανασυνδυασμού (S2/S1 3D) ταυτοποιείται μέσω του εκκινητικού ζεύγους 3D- S2/S1b-S, 3D-S2/S1b-A ενισχύοντας ένα προϊόν μεγέθους 495bp από το 6758nt στο 7253nt. Ως προς την ευαισθησία της μεθόδου παρατηρούμε πως στα 3 πρώτα Group η μικρότερη δυνατή συγκέντρωση του ιού που μπορεί να ανιχνευτεί κυμαίνεται από 10 έως 1 110

125 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ CCID 50 /0.1ml, ενώ στο 4 ο Group η ευαισθησία της μεθόδου εμφανίζει μια πτώση, καθώς ανιχνεύονται ανασυνδυασμοί σε δείγματα με ιικό τίτλο 10 3 CCID 50. Η πτώση αυτή της ευαισθησίας που παρατηρείται οφείλεται στο σχεδιασμό των εκκινητών, καθώς δεν ήταν δυνατή η ύπαρξη 2 mismatch στα 4 τελευταία νουκλεοτίδια όπως περιγράφηκε. Ως αποτέλεσμα, η θερμοκρασία υβριδισμού ανέβηκε στους 66 ο C για να καλυφθεί η ειδικότητα, χάνοντας έτσι στην ευαισθησία της μεθόδου. Επιπλέον, οι αρνητικοί μάρτυρες σε κάθε αντίδραση (πρότυπα εμβολιακά στελέχη Sabin 1, 2 και 3) είχαν ιικό φορτίο της τάξης των 10 5 CCID 50 /0.1ml. Η συγκέντρωση αυτή των πρότυπων δειγμάτων μεταφράζεται ως ένας πολύ καλός δείκτης της εξειδίκευσης κάθε αντίδρασης, καθώς οι αρνητικοί μάρτυρες είτε σε ίσες συγκεντρώσεις, είτε σε μεγαλύτερες σε σχέση με τα ανασυνδυασμένα δείγματα δεν αποδίδουν κανένα από τα προβλεπόμενα προϊόντα, που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένους τύπους ανασυνδυασμού. Εν κατακλείδι, οι τέσσερις Multiplex-PCR αντιδράσεις που περιγράφηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση σπάνιων τύπων ανασυνδυασμού που εντοπίζονται από τη VP1 έως και τη 3D γενωμική περιοχή των παραγώγων του OPV. Η εφαρμογή αυτών των Multiplex-PCR αντιδράσεων θα επιτρέψει την γρήγορη ταυτοποίηση των θέσεων ανασυνδυασμού που βρίσκονται από τη VP1 έως και τη 3D γενωμική περιοχή των παραγώγων του OPV, η οποία μπορεί εύκολα να εφαρμοστεί σε εργαστήρια που δεν έχουν την ευκολία χρήσης τεχνικών αλληλούχησης ως πρώτη μέθοδο για την γρήγορη ανίχνευση και χαρακτηρισμό των ανασυνδυασμένων ιικών στελεχών ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ Η αντιγραφή των εντεροϊών αποτελεί ένα κρίσιμο σημείο του κύκλου ζωής και της μολυσματικότητας τους. Η παρουσία του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου είναι ενδεικτική της αντιγραφικής ενεργότητας του εντεροϊού, καθώς μέσω του μορίου αυτού δημιουργούνται οι νέοι θετικής πολικότητας RNA κλώνοι που θα αποτελέσουν τα νέα ιικά γενώματα (Racaniello, 2013). Η βασική προσέγγιση για την ανίχνευση της ενεργότητας των εντεροϊών προϋποθέτει την ανάπτυξη των ιών σε ειδικές κυτταρικές σειρές, με τον εντοπισμό της να γίνεται μέσω της εμφάνισης του CPE. Η προσέγγιση αυτή όμως δεν προσφέρει την απαιτούμενη ευαισθησία και εξειδίκευση που απαιτείται, καθώς παρατηρούνται διαφορές στην εμφάνιση του CPE μεταξύ των κυτταρικών σειρών (Rodriguez et al., 2008). Επιπλέον, δεν είναι δυνατή η ανάπτυξη όλων των εντεροϊών στις υπάρχουσες κυτταρικές σειρές 111

126 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ (Leland & Ginocchio, 2007), ενώ ορισμένοι εντεροϊοί, με χαρακτηριστικό παράδειγμα ορισμένα στελέχη CAV, αν και ενεργοί δεν εμφανίζουν την χαρακτηριστική εικόνα του CPE κάνοντας ακόμα πιο δύσκολη την ανίχνευση της μολυσματικότητάς τους (S. H. Lee et al., 2005). Μέθοδοι υβριδισμού καθώς και μοριακές τεχνικές όπως η direct PCR, είχαν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για τον έλεγχο της αντιγραφικής ενεργότητας εντεροϊών. Το βασικό μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι η αδυναμία διάκρισης μεταξύ αντιγραφικά ενεργών και μη-αντιγραφικά ενεργών στελεχών στο εκάστοτε δείγμα (Richards, 1999), η οποία μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα (Timofeeva & Skrypina, 2001). Εναλλακτικές τεχνικές ανίχνευσης των αντιγραφικά ενεργών RNA ιών και κατά συνέπεια και των εντεροϊών, χρησιμοποιούσαν χιμαιρικούς-σημασμένους εκκινητές για την RT και ειδικούς εκκινητές που στόχευαν στη σημασμένη περιοχή κατά την PCR που ακολουθούσε. Όμως, και σε αυτή την περίπτωση η ειδικότητα της μεθόδου παρέμενε ένα σημαντικό πρόβλημα, καθώς ανιχνεύτηκε λανθασμένος υβριδισμός του εκκινητή της RT στον συμπληρωματικό κλώνο (Bessaud et al., 2008; Jiang et al., 2004; Komurian-Pradel et al., 2004; Timofeeva & Skrypina, 2001). Στο τέταρτο μέρος της παρούσας διατριβής σχεδιάστηκε μία ειδική Stem-Loop RT- PCR με σκοπό τη γρήγορη και ειδική ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου των εντεροϊών. Πιο συγκεκριμένα, σχεδιάστηκε ένας ειδικός εκκινητής (EntNS1-RT) που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διαδικασία της RT και έφερε τρεις διακριτές περιοχές. Μία ειδική ιική αλληλουχία στο 3 άκρο, μία stem-loop δομή κοντά στο 5 άκρο και μια χαρακτηριστική μη-ιική αλληλουχία στη θηλιά του 5 άκρου. Ο σχεδιασμός των εκκινητών βασίστηκε σε προηγούμενες μελέτες που απέδειξαν τη σημαντική αύξηση της ειδικότητας και ευαισθησίας λόγω θερμοδυναμικής σταθερότητας με τη χρήση stem-loop εκκινητών σε σχέση με τους γραμμικούς (Anwar et al., 2006; Riccelli et al., 2001). Επιπλέον, σχεδιάστηκε ένας δεύτερος εκκινητής (EntNS1-F) που χρησιμοποιήθηκε κατά την επακόλουθη διαδικασία της PCR και διέθετε την ίδια νουκλεοτιδική αλληλουχία με την αλληλουχία της θηλιάς του 5 άκρου του stem-loop εκκινητή της RT. Αυτός ο σχεδιασμός επέτρεψε τον υβριδισμό του ενός εκ των δύο εκκινητών της PCR στον εκκινητή της RT και όχι στο γονιδίωμα του ιού, καθιστώντας την διαδικασία εξαιρετικά ειδική. Η ανίχνευση του κλώνου αρνητικής πολικότητας πραγματοποιήθηκε με επιτυχία σε δείγματα του στελέχους Sabin 1 με υψηλό ιικό τίτλο (10 5 CCID 50 ), αλλά και χαμηλότερο (1 και 10-2 CCID 50 ). Η ανίχνευση αυτή πραγματοποιήθηκε 3 ώρες, για δείγματα ιικού τίτλου 10 5 CCID 50, και 6 ώρες, για τα δείγματα χαμηλού τίτλου, μετά την μόλυνση σε 112

127 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 κυτταροκαλλιέργεια Rd, ενώ το CPE εμφανίστηκε 24 ώρες μετά την μόλυνση για τον υψηλό ιικό τίτλο 10 5 CCID 50, 2 ημέρες μετά τη μόλυνση για τον ιικό τίτλο 1 CCID 50 και 3 ημέρες μετά τη μόλυνση για τον ιικό τίτλο 10-2 CCID 50. Τα αποτελέσματα αυτά καθιστούν την συγκεκριμένη stem-loop RT-PCR μία μη-χρονοβόρα, ευαίσθητη και με αξιόπιστα αποτελέσματα τεχνική. Η μελέτη της εξειδίκευσης της μεθόδου απέδειξε ότι η ενίσχυση ήταν ειδική ως προς το αρνητικής πολικότητας RNA μόριο, καθώς το αναμενόμενο προϊόν ενισχύονταν μόνο όταν η σύνθεση του cdna είχε γίνει με τη χρήση του εκκινητή EntNS1-RT και μόνο όταν χρησιμοποιούταν κατά την PCR το ζεύγος EntNS1-F / UC53-Flap. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση του αντιγραφόμενου κλώνου σε στελέχη εντεροϊών, τα οποία δεν εμφανίζουν κυτταροπαθογόνο δράση σε γνωστές κυτταρικές σειρές. Πρόκειται για τα πρότυπα στελέχη CAV11, CAV13, CAV15 και CAV17. Μέσω της τεχνικής αυτής έγινε επιτυχημένη διάκριση μεταξύ του αντιγραφικά ενεργού στελέχους CAV13 και των υπολοίπων που ήταν ανενεργά. Αν και η παρούσα τεχνική εφαρμόστηκε μόνο σε Sabin 1 και ορισμένα CAV στελέχη, μπορεί να θεωρηθεί ως κατάλληλη για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας πολλών ακόμα εντεροϊών, δεδομένης της υψηλής συντήρησης που παρουσιάζει το τμήμα της 5 -UTR μεταξύ των ιών που ανήκουν στο γένος των εντεροϊών, τμήμα στο οποίο στοχεύει ο ειδικός εκκινητής της RT ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως τα οφέλη της παγκόσμιας κοινότητας από τη χρήση του OPV εμβολίου ήταν τεράστια. Παράλληλα όμως, μια συνεχιζόμενη χρήση του εμβολίου αυτού, εκτός από τους κινδύνους που επιφέρει η VAPP, μπορεί να επιφέρει μια έξαρση εμβολιοπροερχόμενων πολιοϊών (VDPVs). Οι VDPVs προέρχονται από το OPV, αλλά διαφέρουν από τα στελέχη του OPV και τα στελέχη που απομονώνονται από άτομα έπειτα από εμβολιασμό με OPV, έχοντας περισσότερες του 1% νουκλεοτιδικές αλλαγές στην κωδική περιοχή της VP1 (Kew et al., 2005). Τέτοια στελέχη ευθύνονται για εξάρσεις πολιομυελίτιδας στην νήσο Ισπανιόλα (Kew et al., 2002), στις Φιλιππίνες (Shimizu et al., 2004), στην Αίγυπτο (Yang et al., 2003), στη Μαδαγασκάρη (Rousset et al., 2003) και στη Νιγηρία (Adu et al., 2007). Ανάλυση των αλληλουχιών σε αρχικά αλλά και μεταγενέστερα δείγματα cvdpv αποκάλυψε ότι η 5 -UTR, η μη-δομική αλλά και η 3 UTR προέρχονταν από 113

128 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 ιό της ομάδας C, επιβεβαιώνοντας το γεγονός ότι στελέχη του OPV και EV-Cs έχουν συχνές γενετικές ανταλλαγές (Yang et al., 2003). Μελετώντας τα γενετικά χαρακτηριστικά των ανασυνδυασμένων γενωμάτων των cvdpvs, ανακαλύφθηκε ότι όλα τα γενώματα είχαν διατηρήσει τουλάχιστον ολόκληρη την περιοχή που κωδικοποιεί για τις καψιδιακές πρωτεΐνες από τα αντίστοιχα εμβολιακά στελέχη και μερικό ή όλο το υπόλοιπο γονιδίωμα, ιδιαίτερα η περιοχή των μη-δομικών πρωτεϊνών, προέρχεται από EV-Cs (Joffret et al., 2012; Kew et al., 2002; Rakoto- Andrianarivelo et al., 2007; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2008; Yang et al., 2003). Τα περισσότερα από αυτά έδειχναν το 3 -μέσο των γενωμάτων τους να προέρχεται από μη- Sabin αλληλουχίες με τις θέσεις ανασυνδυασμού να εντοπίζονται στις πρωτεΐνες 2Α ή 2Β (Kew et al., 2002; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2007; Shimizu et al., 2004; Yang et al., 2003). Ωστόσο, οι θέσεις ανασυνδυασμού μπορούσαν να βρίσκονται σε διαφορετικό σημείο της Ρ2 ή Ρ3 περιοχής (Joffret et al., 2012; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2008). Επιπροσθέτως, πολλά VDPVs τύπου 2 εμφάνιζαν ένα μεγάλο μέρος της 5 -UTR να προέρχεται από μη-sabin EV-Cs. Στην περίπτωση αυτή, μερικά από τα δείγματα αυτά διατηρούσαν μόνο την κωδικοποιούσα περιοχή του καψιδίου από τα αρχικά OPV στελέχη. Πιο πολύπλοκες γενωμικές δομές βρέθηκαν στη Μαδαγασκάρη κατά την έξαρση των VDPVs που παρατηρήθηκε το cvdpvs τύπου 2 εμφάνιζαν ένα μωσαϊκό τετραμερές ανασυνδυασμένο γονιδίωμα που αποτελούταν από μη-sabin αλληλουχίες στην 5 -UTR και στις Ρ2, Ρ3 περιοχές, καψιδιακές αλληλουχίες του Sabin 2 και Sabin 3 στο 3 άκρο του γενώματος (Rakoto-Andrianarivelo et al., 2008). Η ανακάλυψη ότι μερικά ανασυνδυασμένα cvdpv γενώματα είχαν διατηρήσει μόνο τις κωδικοποιούσες περιοχές του καψιδίου από τα αρχικά Sabin στελέχη (Georgescu et al., 1995; Guillot et al., 2000; Joffret et al., 2012; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2008; Yang et al., 2003), απέδειξε ότι όλα τα υπόλοιπα μέρη του γονιδιώματος μπορούν να μοιράζονται μεταξύ άλλων EV-Cs. Το καψίδιο των εντεροϊών, που σπανίως υπόκειται σε ανασυνδυασμό (Simmonds, 2006), φαίνεται ως η κύρια ιική δομή που καθορίζει τον τύπο του ιού. Στο τελευταίο κομμάτι της παρούσας διατριβής έγινε μια προσπάθεια για τη δημιουργία ανασυνδυασμένων στελεχών μεταξύ Sabin 1 και εντεροϊών της ομάδας C. Με σκοπό να μελετηθούν οι θέσεις και οι τύποι ανασυνδυασμού που συμβαίνουν σε in vitro στελέχη. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν όλα τα στελέχη της ομάδας C του εργαστηρίου. Από τα στελέχη αυτά επιλέχθηκε μόνο το πρότυπο στέλεχος CAV13, το οποίο, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ήταν το μόνο μεταξύ των υπολοίπων στελεχών CAV της ομάδας C που εμφάνιζε αντιγραφική ενεργότητα. 114

129 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Για την μέτρηση του ιικού τίτλου του στελέχους CAV13 χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της Real-Time PCR. Η κλασσική μέθοδος μέτρησης του ιικού τίτλου μέσω κυτταροκαλλιεργειών και υπολογισμού βάσει του τύπου Karber, δεν ήταν δυνατή, καθώς όπως έχει παρατηρηθεί ορισμένα στελέχη CAV αδυνατούν να εμφανίσουν τη χαρακτηριστική εικόνα CPE έπειτα από μόλυνση στις χρησιμοποιούμενες κυτταρικές σειρές (S. H. Lee et al., 2005). Έπειτα ακολούθησε μόλυνση κυττάρων Rd ταυτόχρονα με τα στελέχη Sabin 1 και CAV13 χρησιμοποιώντας τον αντίστοιχο ιικό τίτλο έτσι ώστε να επιτευχθεί MOI = 10. Με τον υψηλό συντελεστή μόλυνσης επιτυγχάνεται η συνθήκη της υπερμόλυνσης των κυττάρων, η οποία είναι απαραίτητη για την δημιουργία ανασυνδυασμών. Η αρχική μόλυνση πραγματοποιήθηκε σε πλάκα κυτταροκαλλιεργειών 24 θέσεων όπου είχαν προστεθεί αρχικά κύτταρα Rd. Δύο ώρες μετά τη μόλυνση το υπερκείμενο σε κάθε θέση της πλάκας αφαιρέθηκε και προστέθηκε εκ νέου θρεπτικό κυτταροκαλλιέργειας άνευ ορού. Το βήμα αυτό πραγματοποιήθηκε με σκοπό την απομάκρυνση των ιικών σωματιδίων που δεν είχαν εισέρθει στα κύτταρα. Τα ανασυνδυασμένα γενώματα που προκύπτουν ανά κύκλο αντιγραφής αποτελούν το 10-20% (Duggal et al., 1997). Αν στο υλικό παρέμεναν και τα ιοσωμάτια που δεν είχαν εισέλθει στα κύτταρα, τότε το ποσοστό αυτό θα μειωνόταν σημαντικά, δυσκολεύοντας έτσι αρκετά τη διάκριση μεταξύ ανασυνδυασμένων και προτύπων στελεχών. Το υλικό της κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση και χρησιμοποιήθηκε για την μόλυνση 10 διαφορετικών θέσεων σε πλάκα κυτταροκαλλιεργειών 96 θέσεων όπου είχαν προστεθεί κύτταρα Rd, δημιουργώντας έτσι 10 διαιρέσεις (aliquots) της αρχικής μόλυνσης. Μέσω της δημιουργίας των aliquots επεκτείνεται η μελέτη σε περισσότερα δείγματα και δίνεται η δυνατότητα ανίχνευσης, εφ όσον έχουν συμβεί, περισσότερων γεγονότων ανασυνδυασμού. Στην περίπτωση που η μελέτη γινόταν χωρίς το ενδιάμεσο βήμα των aliquots, θα ανιχνεύονταν μόνο ο επικρατέστερος ανασυνδυασμός, περιορίζοντας έτσι τα αποτελέσματα της μελέτης. Η ανίχνευση των ανασυνδυασμών πραγματοποιήθηκε με μια σειρά από PCR αντιδράσεις. Για τις αντιδράσεις αυτές είχαν σχεδιαστεί 18 εκκινητικά μόρια. Οι εννέα εκκινητές με βάση το σχεδιασμό τους μπορούσαν να υβριδιστούν με πλήρη ταύτιση (complete match) πάνω στο γονιδίωμα του Sabin 1 στελέχους, παρουσιάζοντας όμως παράλληλα τουλάχιστον 2 αταίριαστα ζεύγη (mismatch) στα 4 νουκλεοτίδια του 3 άκρου τους πάνω στο γονιδίωμα του CAV13 στελέχους. Οι υπόλοιποι εννέα εκκινητές παρουσίαζαν την αντίστροφη εικόνα, έχοντας πλήρη ταύτιση με το CAV13 στέλεχος και 115

130 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 αταίριαστα ζεύγη με το Sabin 1 στέλεχος. Κάθε ζεύγος εκκινητών είχε έναν εκκινητή με πλήρη ταύτιση στο Sabin 1 και έναν με πλήρη ταύτιση στο CAV13. Έτσι, στις PCR αντιδράσεις που ακολούθησαν ενισχύονται μόνο τμήματα που φέρουν ανασυνδυασμούς, χωρίς να ενισχύονται οι πρότυπες αλληλουχίες. Επιπλέον, στο σύνολό τους οι εκκινητές αυτοί προσφέρουν κάλυψη στο μεγαλύτερο μέρος του γονιδιώματος, από την 5 -UTR έως και την 3D γενωμική περιοχή. Από τις 9 PCR αντιδράσεις που πραγματοποιήθηκαν μόνο το εκκινητικό ζεύγος SAB3466S / CAV4153A απέδωσε ένα προϊόν αναμενόμενου μήκους (690bp) του οποίου η αλληλουχία ήταν ανασυνδυασμένη. Στα υπόλοιπα ζεύγη δεν ήταν δυνατή η ενίσχυση των αντίστοιχων προϊόντων. Μια εξήγηση της εικόνας αυτής είναι ότι στα υπό μελέτη δείγματα δεν υπήρχαν ανασυνδυασμοί μεταξύ των περιοχών όπου στόχευαν οι εκκινητές αυτοί. Επιπλέον, οι συνθήκες της PCR για κάθε εκκινητικό ζεύγος προσαρμόζονταν έτσι ώστε να επιτυγχάνεται μεγάλη εξειδίκευση. Χρησιμοποιώντας τα πρότυπα στελέχη Sabin 1 και CAV13 ως αρνητικούς μάρτυρες, οι συνθήκες προσαρμόζονταν αρχικά έτσι ώστε να μην εμφανίζονται προϊόντα στους αρνητικούς μάρτυρες. Όπως περιγράφηκε και στον αντίστοιχο πίνακα (πίνακας ), σε δύο περιπτώσεις όπου η θερμοκρασία υβριδισμού είναι αυξημένη (57 ο C και 63 ο C), γεγονός που συνεπάγεται σε μειωμένη ευαισθησία, είναι πιθανό να υπάρχει ο αντίστοιχος ανασυνδυασμός σε μικρό βαθμό αλλά να μην μπορεί να ανιχνευτεί λόγω μειωμένης ευαισθησίας. Μια τρίτη πιθανή εξήγηση της απουσίας προϊόντων με τη χρήση των υπόλοιπων ζευγών είναι και η εμφάνιση πιθανών μεταλλάξεων. Ο ρυθμός συσσώρευσης μεταλλάξεων στους εντεροϊούς είναι αρκετά αυξημένος (Wimmer et al., 1993), με αποτέλεσμα να διαφέρουν σε ένα ποσοστό οι κατατεθειμένες αλληλουχίες των πρότυπων στελεχών με τα υπό μελέτη δείγματα. Οπότε εάν μια μετάλλαξη εντοπίζεται κοντά στο 3 άκρο των εκκινητών είναι πιθανό να αποτρέπει την ενίσχυση του αναμενόμενου τμήματος. Έπειτα από αλληλούχηση και επεξεργασία της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που προερχόταν από το προϊόν του ζεύγους SAB3466S / CAV4153A και στα 10 aliquots, ανιχνεύτηκαν 7 διαφορετικοί τύποι ανασυνδυασμού. Τρεις τύποι ανασυνδυασμού εντοπίστηκαν στη 2A γενωμική περιοχή μεταξύ των νουκλεοτιδίων και 4 τύποι ανασυνδυασμού στη 2Β γενωμική περιοχή μεταξύ των νουκλεοτιδίων , γεγονός που επιβεβαιώνει την υψηλή συχνότητα εμφάνισης ετεροτυπικών ανασυνδυασμών στη μηδομική περιοχή των εντεροϊών της ομάδας C και συγκεκριμένα στις γενωμικές περιοχές 2Α ή 2Β (Kew et al., 2002; Rakoto-Andrianarivelo et al., 2007; Shimizu et al., 2004; Yang et al., 2003). 116

131 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SABIN 1 ΚΑΙ CAV13 Από αυτούς τους 7 διαφορετικούς τύπους ανασυνδυασμού, ο ανασυνδυασμός της 2Β γενωμικής περιοχής με θέση 3894nt 3904nt και σημείο ανασυνδυασμού το νουκλεοτίδιο 3899 εμφανίστηκε 3 φορές στα 10 εξεταζόμενα aliquots, καθιστώντας τον ως τον ανασυνδυασμό με την πιο συχνή εμφάνιση μεταξύ των υπολοίπων. Επιπλέον, ο ανασυνδυασμός της 2Α γενωμικής περιοχής με θέση 3811nt 3830nt και σημείο ανασυνδυασμού το νουκλεοτίδιο 3820 εμφανίστηκε 2 φορές στα 10 aliquots. Αν και ο αντιγραφικός μηχανισμός (ή μηχανισμός αλλαγής μήτρας), που θεωρείται ο επικρατέστερος για τα γεγονότα ανασυνδυασμού στους εντεροϊούς (Agol, 1997), δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός, έχει αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες ο ιδιαίτερος ρόλος των δευτεροταγών δομών του RNA μορίου (Dedepsidis et al., 2010). Επίσης, o ανασυνδυασμός συμβαίνει κατά την σύνθεση των αρνητικής πολικότητας RNA κλώνων για δύο κυρίως λόγους. Η συχνότητα του ανασυνδυασμού εξαρτάται σημαντικά από την διαθεσιμότητα των RNA μορίων που δρουν ως δέκτες και οι θετικής πολικότητας RNA κλώνοι σε σύγκριση με τους αρνητικής είναι πολύ περισσότεροι στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων. Επιπλέον, οι αρνητικής πολικότητας RNA κλώνοι βρίσκονται μέσα στο κύτταρο σε δίκλωνη μορφή (replicative intermediate) και σε αυτή τη μορφή δεν είναι διαθέσιμοι να συμμετέχουν σε γεγονότα ανασυνδυασμών (Racaniello, 2013). Με βάση τα παραπάνω έγινε μια προσπάθεια ανίχνευσης πιθανών δευτεροταγών δομών που να δικαιολογούν τους ανασυνδυασμούς που ανιχνεύτηκαν στην παρούσα διατριβή. Μέσω ειδικών προγραμμάτων βιοπληροφορικής σχεδιάστηκαν οι πιθανές δευτεροταγές δομές των 2Α και 2Β γενωμικών περιοχών με βάση το μοντέλο της ελάχιστης ελεύθερης ενέργειας. Τα αποτελέσματα των προγραμμάτων αυτών έδειξαν μια υψηλή πιθανότητας ύπαρξης δευτεροταγών δομών και στις δύο γενωμικές περιοχές, αλλά και υψηλή πιθανότητα ύπαρξης ψευδοκόμβων (pseudoknots) στην περιοχή γύρω από τους ανασυνδυασμούς που ανιχνεύτηκαν. Συνοψίζοντας, στο τελευταίο κομμάτι της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η θέση και ο τύπος ανασυνδυασμού που προκύπτει in vitro, έπειτα από ταυτόχρονη μόλυνση με πρότυπα Sabin 1 και CAV13 στελέχη. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν επαληθεύουν ως τις συχνότερες θέσεις του ετεροτυπικού ανασυνδυασμού τις γενωμικές περιοχές 2Α και 2Β και επιπλέον ενισχύουν την πεποίθηση περί ύπαρξης συσχέτισης μεταξύ των θέσεων ανασυνδυασμού και των δευτεροταγών RNA δομών πέριξ των θέσεων αυτών. 117

132 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Adams, M. J., Lefkowitz, E. J., King, A. M. Q., Harrach, B., Harrison, R. L., Knowles, N. J., et al. (2016). Ratification vote on taxonomic proposals to the International Committee on Taxonomy of Viruses (2016). Arch Virol, 161(10), Adu, F., Iber, J., Bukbuk, D., Gumede, N., Yang, S.-J., Jorba, J., et al. (2007). Isolation of recombinant type 2 vaccine-derived poliovirus (VDPV) from a Nigerian child. Virus Res, 127(1), Agol, V. I. (1997). Recombination and other genomic rearrangements in Picornaviruses. Seminars in Virology, 8, Agol, V. I. (2002). Picornavirus Genome: an Overview Molecular Biology of Picornavirus: American Society of Microbiology. Alexander, L. N., Seward, J. F., Santibanez, T. A., Pallansch, M. A., Kew, O. M., Prevots, D. R., et al. (2004). Vaccine policy changes and epidemiology of poliomyelitis in the United States. JAMA, 292(14), Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215(3), Ambros, V., & Baltimore, D. (1980). Purification and properties of a HeLa cell enzyme able to remove the 5'-terminal protein from poliovirus RNA. J Biol Chem, 255(14), Ambros, V., Pettersson, R. F., & Baltimore, D. (1978). An enzymatic activity in uninfected cells that cleaves the linkage between poliovirion RNA and the 5 terminal protein. Cell, 15(4), Anonymous. (1999). Performance of acute flaccid paralysis (AFP) surveillance and incidence of poliomyelitis, (as of 25 November 1999). Wkly Epidemiol Rec, 74(49), Anwar, A., August, J. T., & Too, H. P. (2006). A stem-loop-mediated reverse transcription real-time PCR for the selective detection and quantification of the replicative strand of an RNA virus. Anal Biochem, 352(1), Aycock, W. L. (1928). The Significance of the Age Distribution of Poliomyelitis. Evidence of Transmission through Contact. Am J Hyg, 8, Baicus, A., Persu, A., Dinu, S., Joffret, M. L., Delpeyroux, F., & Oprisan, G. (2011). The frequency and biodiversity of poliovirus and non-polio enterovirus strains isolated from healthy children living in a limited area in Romania. Arch Virol, 156(4), Balanant, J., Guillot, S., Candrea, A., Delpeyroux, F., & Crainic, R. (1991). The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment length polymorphism assay. Virology, 184(2), Barzon, L., Lavezzo, E., Militello, V., Toppo, S., & Palu, G. (2011). Applications of nextgeneration sequencing technologies to diagnostic virology. Int J Mol Sci, 12(11),

133 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Bellaousov, S., & Mathews, D. H. (2010). ProbKnot: Fast prediction of RNA secondary structure including pseudoknots. Rna, 16(10), Belnap, D. M., McDermott, B. M., Jr., Filman, D. J., Cheng, N., Trus, B. L., Zuccola, H. J., et al. (2000). Three-dimensional structure of poliovirus receptor bound to poliovirus. Proc Natl Acad Sci USA, 97(1), Benschop, K., Minnaar, R., Koen, G., van Eijk, H., Dijkman, K., Westerhuis, B., et al. (2010). Detection of human enterovirus and human parechovirus (HPeV) genotypes from clinical stool samples: polymerase chain reaction and direct molecular typing, culture characteristics, and serotyping. Diagn Microbiol Infect Dis, 68(2), Bessaud, M., Autret, A., Jegouic, S., Balanant, J., Joffret, M. L., & Delpeyroux, F. (2008). Development of a Taqman RT-PCR assay for the detection and quantification of negatively stranded RNA of human enteroviruses: evidence for false-priming and improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods, 153(2), Bienz, K., Egger, D., & Pasamontes, L. (1987). Association of polioviral proteins of the P2 genomic region with the viral replication complex and virus-induced membrane synthesis as visualized by electron microscopic immunocytochemistry and autoradiography. Virology, 160(1), Blomqvist, S., Bruu, A. L., Stenvik, M., & Hovi, T. (2003). Characterization of a recombinant type 3/type 2 poliovirus isolated from a healthy vaccinee and containing a chimeric capsid protein VP1. J Gen Virol, 84(Pt 3), Blomqvist, S., Savolainen-Kopra, C., Paananen, A., El Bassioni, L., El Maamoon Nasr, E. M., Firstova, L., et al. (2010). Recurrent isolation of poliovirus 3 strains with chimeric capsid protein Vp1 suggests a recombination hot-spot site in Vp1. Virus Res, 151(2), Blondel, B., Duncan, G., Couderc, T., Delpeyroux, F., Pavio, N., & Colbere-Garapin, F. (1998). Molecular aspects of poliovirus biology with a special focus on the interactions with nerve cells. J Neurovirol, 4(1), Bodian, D. (1955). Emerging concept of poliomyelitis infection. Science, 122(3159), Bodian, D., Morgan, I. M., & Howe, H. A. (1949). Differentiation of types of poliomyelitis viruses; the grouping of 14 strains into three basic immunological types. Am J Hyg, 49(2), Bolanaki, E., Kottaridi, C., Dedepsidis, E., Kyriakopoulou, Z., Pliaka, V., Pratti, A., et al. (2008). Direct extraction and molecular characterization of enteroviruses genomes from human faecal samples. Mol Cell Probes, 22(3), Boot, H. J., Schepp, R. M., van Nunen, F. J., & Kimman, T. G. (2004). Rapid RT-PCR amplification of full-length poliovirus genomes allows rapid discrimination between wildtype and recombinant vaccine-derived polioviruses. J Virol Methods, 116(1), Brown, D. M., Cornell, C. T., Tran, G. P., Nguyen, J. H. C., & Semler, B. L. (2005). An Authentic 3 Noncoding Region Is Necessary for Efficient Poliovirus Replication. J Virol, 79(18),

134 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Burnet, F. M. (1945). Poliomyelitis in the light of recent experimental work. Health Bull (Melb)(81-82), Caro, V., Guillot, S., Delpeyroux, F., & Crainic, R. (2001). Molecular strategy for 'serotyping' of human enteroviruses. J Gen Virol, 82(Pt 1), Carter, J., & Saunders, V. (2013). Viorology: Principles and Applications (2nd ed.). West Sussex, England: John Wiley & Sons Ltd. Casas, I., Powell, L., Klapper, P. E., & Cleator, G. M. (1995). New method for the extraction of viral RNA and DNA from cerebrospinal fluid for use in the polymerase chain reaction assay. J Virol Methods, 53(1), Caspar, D. L., & Klug, A. (1962). Physical principles in the construction of regular viruses. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 27, CDC. (2005). Progress toward interruption of wild poliovirus transmission--worldwide, January 2004-March MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 54(16), Chan, J. Z., Pallen, M. J., Oppenheim, B., & Constantinidou, C. (2012). Genome sequencing in clinical microbiology. Nat Biotechnol, 30(11), Cherkasova, E. A., Korotkova, E. A., Yakovenko, M. L., Ivanova, O. E., Eremeeva, T. P., Chumakov, K. M., et al. (2002). Long-Term Circulation of Vaccine-Derived Poliovirus That Causes Paralytic Disease. J Virol, 76(13), Cherkasova, E. A., Yakovenko, M. L., Rezapkin, G. V., Korotkova, E. A., Ivanova, O. E., Eremeeva, T. P., et al. (2005). Spread of vaccine-derived poliovirus from a paralytic case in an immunodeficient child: an insight into the natural evolution of oral polio vaccine. J Virol, 79(2), Cho, M. W., Teterina, N., Egger, D., Bienz, K., & Ehrenfeld, E. (1994). Membrane rearrangement and vesicle induction by recombinant poliovirus 2C and 2BC in human cells. Virology, 202(1), Chow, M., Newman, J. F., Filman, D., Hogle, J. M., Rowlands, D. J., & Brown, F. (1987). Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. Nature, 327(6122), Colston, E., & Racaniello, V. R. (1994). Soluble receptor-resistant poliovirus mutants identify surface and internal capsid residues that control interaction with the cell receptor. Embo j, 13(24), Colston, E., & Racaniello, V. R. (1995). Poliovirus variants selected on mutant receptorexpressing cells identify capsid residues that expand receptor recognition. J Virol, 69(8), Combelas, N., Holmblat, B., Joffret, M. L., Colbere-Garapin, F., & Delpeyroux, F. (2011). Recombination between poliovirus and coxsackie A viruses of species C: a model of viral genetic plasticity and emergence. Viruses, 3(8),

135 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Combiescu, M., Guillot, S., Persu, A., Baicus, A., Pitigoi, D., Balanant, J., et al. (2007). Circulation of a type 1 recombinant vaccine-derived poliovirus strain in a limited area in Romania. Arch Virol, 152(4), Cuervo, N. S., Guillot, S., Romanenkova, N., Combiescu, M., Aubert-Combiescu, A., Seghier, M., et al. (2001). Genomic features of intertypic recombinant sabin poliovirus strains excreted by primary vaccinees. J Virol, 75(13), Dales, S., Eggers, H. J., Tamm, I., & Palade, G. E. (1965). Electron microscopic study of the formation of poliovirus. Virology, 26(3), De Jesus, N. H. (2007). Epidemics to eradication: the modern history of poliomyelitis. Virology Journal, 4(1), 70. de Quadros, C. A., Andrus, J. K., Olive, J. M., Guerra de Macedo, C., & Henderson, D. A. (1992). Polio eradication from the Western Hemisphere. Annu Rev Public Health, 13, Dedepsidis, E., Karakasiliotis, I., Paximadi, E., Kyriakopoulou, Z., Komiotis, D., & Markoulatos, P. (2006). Detection of unusual mutation within the VP1 region of different re-isolates of poliovirus Sabin vaccine. Virus Genes, 33(2), Dedepsidis, E., Kyriakopoulou, Z., Pliaka, V., & Markoulatos, P. (2010). Correlation between recombination junctions and RNA secondary structure elements in poliovirus Sabin strains. Virus Genes, 41(2), Dedepsidis, E., Pliaka, V., Kyriakopoulou, Z., Brakoulias, C., Levidiotou-Stefanou, S., Pratti, A., et al. (2008). Complete genomic characterization of an intertypic Sabin 3/Sabin 2 capsid recombinant. FEMS Immunol Med Microbiol, 52(3), Djikeng, A., & Spiro, D. (2009). Advancing full length genome sequencing for human RNA viral pathogens. Future Virol, 4(1), Domingo, E., & Holland, J. J. (1997). RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol, 51, Dowdle, W. R., De Gourville, E., Kew, O. M., Pallansch, M. A., & Wood, D. J. (2003). Polio eradication: the OPV paradox. Rev Med Virol, 13(5), Duggal, R., Cuconati, A., Gromeier, M., & Wimmer, E. (1997). Genetic recombination of poliovirus in a cell-free system. Proc Natl Acad Sci USA, 94(25), Duggal, R., & Wimmer, E. (1999). Genetic recombination of poliovirus in vitro and in vivo: temperature-dependent alteration of crossover sites. Virology, 258(1), Dupinay, T., Nguyen, A., Croze, S., Barbet, F., Rey, C., Mavingui, P., et al. (2012). Nextgeneration sequencing of ultra-low copy samples: from clinical FFPE samples to single-cell sequencing. Curr topics in virol, 10. Echeverri, A. C., & Dasgupta, A. (1995). Amino Terminal Regions of Poliovirus 2C Protein Mediate Membrane Binding. Virology, 208(2),

136 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Egger, D., Teterina, N., Ehrenfeld, E., & Bienz, K. (2000). Formation of the Poliovirus Replication Complex Requires Coupled Viral Translation, Vesicle Production, and Viral RNA Synthesis. J Virol, 74(14), Enders, J. F., Weller, T. H., & Robbins, F. C. (1949). Cultivation of the Lansing Strain of Poliomyelitis Virus in Cultures of Various Human Embryonic Tissues. Science, 109(2822), Equestre, M., Genovese, D., Cavalieri, F., Fiore, L., Santoro, R., & Perez Bercoff, R. (1991). Identification of a consistent pattern of mutations in neurovirulent variants derived from the sabin vaccine strain of poliovirus type 2. J Virol, 65(5), Figlerowicz, M., Alejska, M., Kurzynska-Kokorniak, A., & Figlerowicz, M. (2003). Genetic variability: the key problem in the prevention and therapy of RNA-based virus infections. Med Res Rev, 23(4), Filman, D. J., Syed, R., Chow, M., Macadam, A. J., Minor, P. D., & Hogle, J. M. (1989). Structural factors that control conformational transitions and serotype specificity in type 3 poliovirus. Embo j, 8(5), Flanegan, J. B., Petterson, R. F., Ambros, V., Hewlett, N. J., & Baltimore, D. (1977). Covalent linkage of a protein to a defined nucleotide sequence at the 5'-terminus of virion and replicative intermediate RNAs of poliovirus. Proc Natl Acad Sci USA, 74(3), Fricks, C. E., & Hogle, J. M. (1990). Cell-induced conformational change in poliovirus: externalization of the amino terminus of VP1 is responsible for liposome binding. J Virol, 64(5), Friedrich, F. (1996). Genomic modifications in Sabin vaccine strains isolated from vaccination-associated cases, healthy contacts and healthy vaccinees. Acta Virol, 40(3), Furione, M., Guillot, S., Otelea, D., Balanant, J., Candrea, A., & Crainic, R. (1993). Polioviruses with natural recombinant genomes isolated from vaccine-associated paralytic poliomyelitis. Virology, 196(1), Gamarnik, A. V., & Andino, R. (1998). Switch from translation to RNA replication in a positive-stranded RNA virus. Genes Dev, 12(15), Georgescu, M. M., Balanant, J., Macadam, A., Otelea, D., Combiescu, M., Combiescu, A. A., et al. (1997). Evolution of the Sabin type 1 poliovirus in humans: characterization of strains isolated from patients with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J Virol, 71(10), Georgescu, M. M., Delpeyroux, F., & Crainic, R. (1995). Tripartite genome organization of a natural type 2 vaccine/nonvaccine recombinant poliovirus. J Gen Virol, 76 ( Pt 9), Georgescu, M. M., Delpeyroux, F., Tardy-Panit, M., Balanant, J., Combiescu, M., Combiescu, A. A., et al. (1994). High diversity of poliovirus strains isolated from the central nervous system from patients with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J Virol, 68(12),

137 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Georgopoulou, A., & Markoulatos, P. (2001). Sabin type 2 polioviruses with intertypic vaccine/vaccine recombinant genomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 20(11), Georgopoulou, A., Markoulatos, P., Spyrou, N., & Vamvakopoulos, N. C. (2000). Improved genotyping vaccine and wild-type poliovirus strains by restriction fragment length polymorphism analysis: clinical diagnostic implications. J Clin Microbiol, 38(12), Gnanashanmugam, D., Falkovitz-Halpern, M. S., Dodge, A., Fang, M., Wong, L. J., Esparza, M., et al. (2007). Shedding and Reversion of Oral Polio Vaccine Type 3 in Mexican Vaccinees: Comparison of Mutant Analysis by PCR and Enzyme Cleavage to a Real-Time PCR Assay. J Clin Microbiol, 45(8), Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., & Hofacker, I. L. (2008). The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Res, 36(Web Server issue), W Guillot, S., Caro, V., Cuervo, N., Korotkova, E., Combiescu, M., Persu, A., et al. (2000). Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J Virol, 74(18), Harber, J., Bernhardt, G., Lu, H. H., Sgro, J. Y., & Wimmer, E. (1995). Canyon rim residues, including antigenic determinants, modulate serotype-specific binding of polioviruses to mutants of the poliovirus receptor. Virology, 214(2), Harrison, S. L. (2013). Principles of Virus Structure. In B. N. Fields, D. M. Knipe & P. M. Howley (Eds.), Fields virology (pp ). Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincot Williams & Wilkins. Hogle, J. M., Chow, M., & Filman, D. J. (1985). Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science, 229(4720), Ida-Hosonuma, M., Sasaki, Y., Toyoda, H., Nomoto, A., Gotoh, O., Yonekawa, H., et al. (2003). Host range of poliovirus is restricted to simians because of a rapid sequence change of the poliovirus receptor gene during evolution. Arch Virol, 148(1), Jacobson, S. J., Konings, D. A., & Sarnow, P. (1993). Biochemical and genetic evidence for a pseudoknot structure at the 3' terminus of the poliovirus RNA genome and its role in viral RNA amplification. J Virol, 67(6), Jiang, Y. J., Liao, G. Y., Zhao, W., Sun, M. B., Qian, Y., Bian, C. X., et al. (2004). Detection of infectious hepatitis A virus by integrated cell culture/strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Appl Microbiol, 97(5), Joffret, M.-L., Jégouic, S., Bessaud, M., Balanant, J., Tran, C., Caro, V., et al. (2012). Common and Diverse Features of Cocirculating Type 2 and 3 Recombinant Vaccine-Derived Polioviruses Isolated From Patients With Poliomyelitis and Healthy Children. J Infect Dis, 205(9), Johnson, R. T. (1998). Viral infections of the nervous system (2nd ed.). Philadelphia: Lippincott-Raven. 123

138 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Jorba, J., Diop, O. M., Iber, J., Sutter, R. W., Wassilak, S. G., & Burns, C. C. (2016). Update on Vaccine-Derived Polioviruses - Worldwide, January 2015-May MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 65(30), Karakasiliotis, I., Markoulatos, P., & Katsorchis, T. (2004). Site analysis of recombinant and mutant poliovirus isolates of Sabin origin from patients and from vaccinees. Mol Cell Probes, 18(2), Karakasiliotis, I., Paximadi, E., & Markoulatos, P. (2005). Evolution of a rare vaccine-derived multirecombinant poliovirus. J Gen Virol, 86(11), Kew, O. M., Morris-Glasgow, V., Landaverde, M., Burns, C., Shaw, J., Garib, Z., et al. (2002). Outbreak of poliomyelitis in Hispaniola associated with circulating type 1 vaccine-derived poliovirus. Science, 296(5566), Kew, O. M., Sutter, R. W., de Gourville, E. M., Dowdle, W. R., & Pallansch, M. A. (2005). Vaccine-derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication. Annu Rev Microbiol, 59, Kilpatrick, D. R., Ching, K., Iber, J., Campagnoli, R., Freeman, C. J., Mishrik, N., et al. (2004). Multiplex PCR Method for Identifying Recombinant Vaccine-Related Polioviruses. J Clin Microbiol, 42(9), King, A. M. (1988). Preferred sites of recombination in poliovirus RNA: an analysis of 40 intertypic cross-over sequences. Nucleic Acids Res, 16(24), Kitamura, N., Semler, B. L., Rothberg, P. G., Larsen, G. R., Adler, C. J., Dorner, A. J., et al. (1981). Primary structure, gene organization and polypeptide expression of poliovirus RNA. Nature, 291(5816), Knowles, N. J., Hovi, T., Hyypia, T., King, A. M. Q., Lindberg, A. M., Pallansch, M. A., et al. (2012). Family - Picornaviridae. In A. M. Q. King, M. J. Adams, E. B. Carstens & E. J. Lefkowitz (Eds.), Virus Taxonomy (pp ). San Diego: Elsevier. Koike, S., Taya, C., Kurata, T., Abe, S., Ise, I., Yonekawa, H., et al. (1991). Transgenic mice susceptible to poliovirus. Proc Natl Acad Sci USA, 88(3), Komurian-Pradel, F., Perret, M., Deiman, B., Sodoyer, M., Lotteau, V., Paranhos-Baccala, G., et al. (2004). Strand specific quantitative real-time PCR to study replication of hepatitis C virus genome. J Virol Methods, 116(1), Kottaridi, C., Bolanaki, E., Kyriakopoulou, Z., Dedepsidis, E., Pratti, A., & Markoulatos, P. (2007). Possible recombination and gene adaptation exchanges among clinical echovirus strains: crossing the temporal and topological barriers. Diagn Microbiol Infect Dis, 58(4), Kottaridi, C., Bolanaki, E., Siafakas, N., & Markoulatos, P. (2005). Evaluation of seroneutralization and molecular diagnostic methods for echovirus identification. Diagn Microbiol Infect Dis, 53(2), Kumar, S., Stecher, G., & Tamura, K. (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol Biol Evol, 33(7),

139 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Kyriakopoulou, Z., Kottaridi, C., Dedepsidis, E., Bolanaki, E., Levidiotou-Stefanou, S., & Markoulatos, P. (2006). Molecular characterization of wild-type polioviruses isolated in Greece during the 1996 outbreak in Albania. J Clin Microbiol, 44(3), Kyriakopoulou, Z., Tsolis, K., Pliaka, V., Tsakogiannis, D., Ruether, I. G., Gartzonika, C., et al. (2013). Combined 5' UTR RFLP analysis and VP1 sequencing for epidemic investigation of enteroviruses. Arch Virol, 158(1), Lee, S. H., Lee, C., Lee, K. W., Cho, H. B., & Kim, S. J. (2005). The simultaneous detection of both enteroviruses and adenoviruses in environmental water samples including tap water with an integrated cell culture-multiplex-nested PCR procedure. J Appl Microbiol, 98(5), Lee, Y. F., Nomoto, A., Detjen, B. M., & Wimmer, E. (1977). A protein covalently linked to poliovirus genome RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 74(1), Leland, D. S., & Ginocchio, C. C. (2007). Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clin Microbiol Rev, 20(1), Lentz, K. N., Smith, A. D., Geisler, S. C., Cox, S., Buontempo, P., Skelton, A., et al. (1997). Structure of poliovirus type 2 Lansing complexed with antiviral agent SCH48973: comparison of the structural and biological properties of three poliovirus serotypes. Structure, 5(7), Liao, S., & Racaniello, V. (1997). Allele-specific adaptation of poliovirus VP1 B-C loop variants to mutant cell receptors. J Virol, 71(12), Lipskaya, G. Y., Muzychenko, A. R., Kutitova, O. K., Maslova, S. V., Equestre, M., Drozdov, S. G., et al. (1991). Frequent isolation of intertypic poliovirus recombinants with serotype 2 specificity from vaccine-associated polio cases. J Med Virol, 35(4), Liu, H. M., Zheng, D. P., Zhang, L. B., Oberste, M. S., Kew, O. M., & Pallansch, M. A. (2003). Serial recombination during circulation of type 1 wild-vaccine recombinant polioviruses in China. J Virol, 77(20), Liu, H. M., Zheng, D. P., Zhang, L. B., Oberste, M. S., Pallansch, M. A., & Kew, O. M. (2000). Molecular evolution of a type 1 wild-vaccine poliovirus recombinant during widespread circulation in China. J Virol, 74(23), Lole, K. S., Bollinger, R. C., Paranjape, R. S., Gadkari, D., Kulkarni, S. S., Novak, N. G., et al. (1999). Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C- infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination. J Virol, 73(1), Lukashev, A. N. (2005). Role of recombination in evolution of enteroviruses. Rev Med Virol, 15(3), Lukashev, A. N., Lashkevich, V. A., Ivanova, O. E., Koroleva, G. A., Hinkkanen, A. E., & Ilonen, J. (2003). Recombination in Circulating Enteroviruses. J Virol, 77(19), Macadam, A. J., Pollard, S. R., Ferguson, G., Skuce, R., Wood, D., Almond, J. W., et al. (1993). Genetic Basis of Attenuation of the Sabin Type 2 Vaccine Strain of Poliovirus in Primates. Virology, 192(1),

140 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Martín, J., Samoilovich, E., Dunn, G., Lackenby, A., Feldman, E., Heath, A., et al. (2002). Isolation of an Intertypic Poliovirus Capsid Recombinant from a Child with Vaccine- Associated Paralytic Poliomyelitis. J Virol, 76(21), Maydt, J., & Lengauer, T. (2006). Recco: recombination analysis using cost optimization. Bioinformatics, 22(9), McGoldrick, A., Macadam, A. J., Dunn, G., Rowe, A., Burlison, J., Minor, P. D., et al. (1995). Role of mutations G-480 and C-6203 in the attenuation phenotype of Sabin type 1 poliovirus. J Virol, 69(12), Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., & Racaniello, V. R. (1989). Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell, 56(5), Minor, P. D. (1999). Poliovirus vaccination: current understanding of poliovirus interactions in humans and implications for the eradication of poliomyelitis. Expert Rev Mol Med, 1999, Moscufo, N., Yafal, A. G., Rogove, A., Hogle, J., & Chow, M. (1993). A mutation in VP4 defines a new step in the late stages of cell entry by poliovirus. J Virol, 67(8), Mueller, J. E., Bessaud, M., Huang, Q. S., Martinez, L. C., Barril, P. A., Morel, V., et al. (2009). Environmental poliovirus surveillance during oral poliovirus vaccine and inactivated poliovirus vaccine use in Cordoba Province, Argentina. Appl Environ Microbiol, 75(5), Mueller, S., Wimmer, E., & Cello, J. (2005). Poliovirus and poliomyelitis: a tale of guts, brains, and an accidental event. Virus Res, 111(2), Nanda, S., Jayan, G., Voulgaropoulou, F., Sierra-Honigmann, A. M., Uhlenhaut, C., McWatters, B. J., et al. (2008). Universal virus detection by degenerate-oligonucleotide primed polymerase chain reaction of purified viral nucleic acids. J Virol Methods, 152(1-2), Nix, W. A., Oberste, M. S., & Pallansch, M. A. (2006). Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens. J Clin Microbiol, 44(8), Nomoto, A., Detjen, B., Pozzatti, R., & Wimmer, E. (1977). The location of the polio genome protein in viral RNAs and its implication for RNA synthesis. Nature, 268(5617), Nomoto, A., Kitamura, N., Golini, F., & Wimmer, E. (1977). The 5'-terminal structures of poliovirion RNA and poliovirus mrna differ only in the genome-linked protein VPg. Proc Natl Acad Sci USA, 74(12), Novak, J. E., & Kirkegaard, K. (1991). Improved method for detecting poliovirus negative strands used to demonstrate specificity of positive-strand encapsidation and the ratio of positive to negative strands in infected cells. J Virol, 65(6), Oberste, M. S., Maher, K., Flemister, M. R., Marchetti, G., Kilpatrick, D. R., & Pallansch, M. A. (2000). Comparison of classic and molecular approaches for the identification of untypeable enteroviruses. J Clin Microbiol, 38(3),

141 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Oberste, M. S., Maher, K., Williams, A. J., Dybdahl-Sissoko, N., Brown, B. A., Gookin, M. S., et al. (2006). Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses. J Gen Virol, 87(Pt 1), Oberste, M. S., Nix, W. A., Maher, K., & Pallansch, M. A. (2003). Improved molecular identification of enteroviruses by RT-PCR and amplicon sequencing. J Clin Virol, 26(3), Otelea, D., Guillot, S., Furione, M., Combiescu, A. A., Balanant, J., Candrea, A., et al. (1993). Genomic modifications in naturally occurring neurovirulent revertants of Sabin 1 polioviruses. Dev Biol Stand, 78, Palacios, G., & Oberste, M. S. (2005). Enteroviruses as agents of emerging infectious diseases. J Neurovirol, 11(5), Pallansch, M., Oberste, S., & Whitton, L. (2013). Enteroviruses: Polioviruses, Coxsackieviruses, Echoviruses, and Newer Enteroviruses. In B. N. Fields, D. M. Knipe & P. M. Howley (Eds.), Fields virology (6th ed., pp ). Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. Paul, A. V., Rieder, E., Kim, D. W., van Boom, J. H., & Wimmer, E. (2000). Identification of an RNA hairpin in poliovirus RNA that serves as the primary template in the in vitro uridylylation of VPg. J Virol, 74(22), Paul, J. R. (1971). A history of poliomyelitis: New Haven & London: Yale Univ, Press. Paximadi, E., Karakasiliotis, I., Mamuris, Z., Stathopoulos, C., Krikelis, V., & Markoulatos, P. (2006). Genomic analysis of recombinant sabin clinical isolates. Virus Genes, 32(2), Paximadi, E., Karakasiliotis, I., Papaventsis, D., Papageorgiou, G., & Markoulatos, P. (2008). Recombinant Sabin environmental isolates in Greece and Cyprus. J Appl Microbiol, 104(4), Pettersson, R. F., Ambros, V., & Baltimore, D. (1978). Identification of a protein linked to nascent poliovirus RNA and to the polyuridylic acid of negative-strand RNA. J Virol, 27(2), Pettersson, R. F., Flanegan, J. B., Rose, J. K., & Baltimore, D. (1977). 5[prime]-Terminal nucleotide sequences of polio virus polyribosomal RNA and virion RNA are identical. Nature, 268(5617), Pfister, T., Mirzayan, C., & Wimmer, E. (1999). POLIOVIRUSES (PICORNAVIRIDAE) Molecular Biology A2 - Granoff, Allan. In R. G. Webster (Ed.), Encyclopedia of Virology (Second Edition) (pp ). Oxford: Elsevier. Pliaka, V., Dedepsidis, E., Kyriakopoulou, Z., Mpirli, K., Tsakogiannis, D., Pratti, A., et al. (2010). A new RT-PCR assay for the identification of the predominant recombination types in 2C and 3D genomic regions of vaccine-derived poliovirus strains. Mol Cell Probes, 24(3),

142 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Racaniello, V. R. (2013). Picornaviridae: The viruses and their replication. In B. N. Fields, D. M. Knipe & P. M. Howley (Eds.), Fields virology (6th ed., pp ). Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. Racaniello, V. R., & Baltimore, D. (1981a). Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science, 214(4523), Racaniello, V. R., & Baltimore, D. (1981b). Molecular cloning of poliovirus cdna and determination of the complete nucleotide sequence of the viral genome. Proc Natl Acad Sci USA, 78(8), Rakoto-Andrianarivelo, M., Guillot, S., Iber, J., Balanant, J., Blondel, B., Riquet, F., et al. (2007). Co-circulation and evolution of polioviruses and species C enteroviruses in a district of Madagascar. PLoS Pathog, 3(12), e191. Rakoto-Andrianarivelo, M., Gumede, N., Jegouic, S., Balanant, J., Andriamamonjy, S. N., Rabemanantsoa, S., et al. (2008). Reemergence of recombinant vaccine-derived poliovirus outbreak in Madagascar. J Infect Dis, 197(10), Ren, R. B., Costantini, F., Gorgacz, E. J., Lee, J. J., & Racaniello, V. R. (1990). Transgenic mice expressing a human poliovirus receptor: a new model for poliomyelitis. Cell, 63(2), Riccelli, P. V., Merante, F., Leung, K. T., Bortolin, S., Zastawny, R. L., Janeczko, R., et al. (2001). Hybridization of single-stranded DNA targets to immobilized complementary DNA probes: comparison of hairpin versus linear capture probes. Nucleic Acids Res, 29(4), Richards, G. P. (1999). Limitations of molecular biological techniques for assessing the virological safety of foods. J Food Prot, 62(6), Rieder, E., Paul, A. V., Kim, D. W., van Boom, J. H., & Wimmer, E. (2000). Genetic and Biochemical Studies of Poliovirus cis-acting Replication Element cre in Relation to VPg Uridylylation. J Virol, 74(22), Rodriguez, R. A., Gundy, P. M., & Gerba, C. P. (2008). Comparison of BGM and PLC/PRC/5 cell lines for total culturable viral assay of treated sewage. Appl Environ Microbiol, 74(9), Rossmann, M. G. (1989). The canyon hypothesis. Hiding the host cell receptor attachment site on a viral surface from immune surveillance. J Biol Chem, 264(25), Rousset, D., Rakoto-Andrianarivelo, M., Razafindratsimandresy, R., Randriamanalina, B., Guillot, S., Balanant, J., et al. (2003). Recombinant Vaccine Derived Poliovirus in Madagascar. Emerg Infect Dis, 9(7), Rozen, S., & Skaletsky, H. (2000). Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol, 132, Rueckert, R. R., Dunker, A. K., & Stoltzfus, C. M. (1969). The structure of mouse-elberfeld virus: a model. Proc Natl Acad Sci USA, 62(3),

143 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Schlegel, A., Giddings, T. H., Ladinsky, M. S., & Kirkegaard, K. (1996). Cellular origin and ultrastructure of membranes induced during poliovirus infection. J Virol, 70(10), Shimizu, H., Thorley, B., Paladin, F. J., Brussen, K. A., Stambos, V., Yuen, L., et al. (2004). Circulation of Type 1 Vaccine-Derived Poliovirus in the Philippines in J Virol, 78(24), Siafakas, N., Markoulatos, P., & Levidiotou-Stefanou, S. (2004). Molecular identification of enteroviruses responsible for an outbreak of aseptic meningitis; implications in clinical practice and epidemiology. Mol Cell Probes, 18(6), Sibley, C. D., Peirano, G., & Church, D. L. (2012). Molecular methods for pathogen and microbial community detection and characterization: current and potential application in diagnostic microbiology. Infect Genet Evol, 12(3), Simmonds, P. (2006). Recombination and selection in the evolution of picornaviruses and other Mammalian positive-stranded RNA viruses. J Virol, 80(22), Simmonds, P., & Welch, J. (2006). Frequency and dynamics of recombination within different species of human enteroviruses. J Virol, 80(1), Spector, D. H., & Baltimore, D. (1974). Requirement of 3 -Terminal Poly(adenylic acid) for the Infectivity of Poliovirus RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 71(8), Stanway, G., Hughes, P. J., Mountford, R. C., Reeve, P., Minor, P. D., Schild, G. C., et al. (1984). Comparison of the complete nucleotide sequences of the genomes of the neurovirulent poliovirus P3/Leon/37 and its attenuated Sabin vaccine derivative P3/Leon 12a1b. Proc Natl Acad Sci U S A, 81(5), Summers, D. F., & Maizel, J. V., Jr. (1968). Evidence for large precursor proteins in poliovirus synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 59(3), Tapparel, C., Junier, T., Gerlach, D., Van-Belle, S., Turin, L., Cordey, S., et al. (2009). New respiratory enterovirus and recombinant rhinoviruses among circulating picornaviruses. Emerg Infect Dis, 15(5), Telenius, H., Carter, N. P., Bebb, C. E., Nordenskjold, M., Ponder, B. A., & Tunnacliffe, A. (1992). Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, 13(3), Terletskaia-Ladwig, E., Meier, S., Hahn, R., Leinmuller, M., Schneider, F., & Enders, M. (2008). A convenient rapid culture assay for the detection of enteroviruses in clinical samples: comparison with conventional cell culture and RT-PCR. J Med Microbiol, 57(Pt 8), Timofeeva, A. V., & Skrypina, N. A. (2001). Background activity of reverse transcriptases. Biotechniques, 30(1), 22-24, 26, 28. Todd, S., Towner, J. S., Brown, D. M., & Semler, B. L. (1997). Replication-competent picornaviruses with complete genomic RNA 3' noncoding region deletions. J Virol, 71(11),

144 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Trask, J. D., Vignec, A. J., & Paul, J. R. (1938). Poliomyelitis virus in human stools. JAMA, 111(1), Tucker, S. P., Thornton, C. L., Wimmer, E., & Compans, R. W. (1993). Vectorial release of poliovirus from polarized human intestinal epithelial cells. J Virol, 67(7), WHO. (2004). Polio Laboratory Manual (4th ed.). Geneva, Switzerland: World Health Organization. Wimmer, E., Hellen, C. U., & Cao, X. (1993). Genetics of poliovirus. Annu Rev Genet, 27, Yang, C. F., Naguib, T., Yang, S. J., Nasr, E., Jorba, J., Ahmed, N., et al. (2003). Circulation of Endemic Type 2 Vaccine-Derived Poliovirus in Egypt from 1983 to J Virol, 77(15), Yin, J., Paul, A. V., Wimmer, E., & Rieder, E. (2003). Functional dissection of a poliovirus cisacting replication element [PV-cre(2C)]: analysis of single- and dual-cre viral genomes and proteins that bind specifically to PV-cre RNA. J Virol, 77(9), Yogo, Y., Teng, M.-h., & Wimmer, E. (1974). Poly(U) in poliovirus minus RNA is 5 -terminal. Biochem Biophys Res Commun, 61(4), Yogo, Y., & Wimmer, E. (1972). Polyadenylic acid at the 3'-terminus of poliovirus RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 69(7), Zhang, Y., Zhu, S., Yan, D., Liu, G., Bai, R., Wang, D., et al. (2010). Natural type 3/type 2 intertypic vaccine-related poliovirus recombinants with the first crossover sites within the VP1 capsid coding region. PLoS One, 5(12), e Zoll, G. J., Melchers, W. J., Kopecka, H., Jambroes, G., van der Poel, H. J., & Galama, J. M. (1992). General primer-mediated polymerase chain reaction for detection of enteroviruses: application for diagnostic routine and persistent infections. J Clin Microbiol, 30(1),

145 ABSTRACT 6. ABSTRACT Enteroviruses belong to Picornaviridae family. Their genome is composed of a positive sense single-strand RNA of 7.500bp in length and is surrounded by an icosahedral capsid. Enteroviruses that infect humans are classified into four species: EV-A, EV-B, EV-C and EV-D. Polioviruses, the most significant member of EV-C species, are the causal agents of paralytic poliomyelitis and exist as three distinct serotypes (PV1, PV2 and PV3). Since the 1960s, poliomyelitis has been effectively controlled by the use of two vaccines containing all three serotypes of PV, the inactivated poliovirus vaccine (IPV) and the live attenuated oral poliovirus vaccine (OPV). Despite the success of OPV in polio eradication program, it has shown a significant disadvantage: the emergence of vaccine associated paralytic poliomyelitis (VAPP) and the circulation of vaccine derived polioviruses (VDPVs). VAPP is a result of accumulated mutations and/or recombination events placed at the genome of attenuated vaccine Sabin strains. The aim of the present thesis was to design and develop different methods in order to study the in vitro production mechanism of recombinant strains of polioviruses and EV-Cs. During the first part of the thesis a Multiplex-PCR method was designed and developed in order to detect and characterize enteroviruses. The results of this method on prototype and clinical strains proved the ability of the method to stand as a useful tool for fast and accurate detection and characterization of enteroviruses. At the second part of the thesis, a whole genome sequencing technique, using only four PCR reactions, was designed and developed, using a special primer (DOP), through which a preamplification of entire genome is performed. During the third part of the thesis, a Multiplex-PCR reaction was designed in order to detect recombination events located from VP1 to 3D genomic region of vaccine derived polioviruses. The results of the Multiplex-PCR proved the ability of the method to detect and identify rare and common recombination types by using only four Multiplex-PCR reactions. At the fourth part of the thesis a specific Stem-Loop RT-PCR method was designed to detect the replicative activity of enteroviruses through detection of the replicative negative strand RNA strand. This method was originally applied on Sabin 1 prototype strain, where the replicative activity was correctly detected at high and low virus titres, quite early before the appearance of CPE. Moreover, this method was also used to distinguish between replicative active and inactive CAV prototype strains, that didn t yield CPE in cell cultures. 131

146 ABSTRACT At the final part of the thesis, the study of recombination events derived from simultaneous Rd cell culture infection using Sabin 1 and CAV13 prototype strains was conducted. Probable secondary RNA structure models were also designed using specific bioinformatics software. The results of this study proved the increased incidence of heterotypic recombination events in 2A or 2B genomic regions and showed that a correlation between recombination sites and secondary RNA structure may be established. 132

147 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 7. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 133

148 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 134

149 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 135

150 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 136

151 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 137

152 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 138

153 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 139

154 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 140

155 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 141

156 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 142

157 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 143

158 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 144

159 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 145

160 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 146

161 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 147

162 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 148

163 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 149

164 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Multiplex RT-PCR assay for the detection and characterization of Coxsackie A, Coxsackie B and Echoviruses. Tilemachos G. Dimitriou 1, Georgios Moschonas 1, Zaharoula Kyriakopoulou 1, Antonis Fikatas 1, Constantina Gartzonika 2, Stamatina Leveidiotou-Stefanou 2, Panayotis Markoulatos 1 1 University of Thessaly, School of Health Sciences, Department of Biochemistry & Biotechnology, Microbiology-Virology Laboratory, Larissa, Greece 2 University of Ioannina, Medical School, Department of Microbiology, Ioannina, Greece Running Title: Multiplex RT-PCR for CAV, CBV and Echoviruses Corresponding Author: Professor P. Markoulatos University of Thessaly, School of Health Sciences, Department of Biochemistry & Biotechnology Ploutonos 26 & Aiolou Larissa, Greece. Tel.: , Fax: markoulatos@bio.uth.gr 150

165 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Abstract Background: Echoviruses, Coxsackie A and Coxsackie B viruses are members of the Enterovirus genus and have been associated with aseptic meningitis cases in many countries. The purpose of this study was to develop a Multiplex RT-PCR assay that could detect and characterize enteroviruses. The use of modern molecular approaches override barriers that occur during the standard method for the detection and identification of enteroviruses which requires virus isolation from cell cultures, followed by neutralization with a panel of specific antibodies. Methods: In this assay three primer pairs targeting at 5 -UTR, VP1 and 2C genomic regions were used. In order to investigate the ability of the assay to detect and characterize enteroviruses, thirty eight Coxsackie A, Coxsackie B and Echoviruses reference strains were selected. The assay was designed on reference strains and validated using 20 previously characterized clinical isolates that belonged to Enterovirus B species. Results: The results revealed the aptitude of this assay to effectively detect all tested viruses by the presence of the amplicon located at 5 UTR, while sequencing of the amplicon located at VP1 genomic region accurately characterized the serotype of the investigated clinical isolate. Finally the third amplicon located at 2C genomic region characterized and classified the investigated sample into Enterovirus B species. Conclusion: The Multiplex RT-PCR assay was able to correctly detect and characterize Coxsackie A, Coxsackie B and Echoviruses. Keywords Enteroviruses, Multiplex RT-PCR, molecular detection, genotyping Introduction Coxsackie A, Coxsackie B and Echoviruses, belong to genus Enterovirus of the Picornaviridae family. The genome of this family consists of a 7,5 kb single-stranded positive-sense RNA genome surrounded by a non-enveloped icosahedral protein capsid. The RNA genome consists of a long 5 untranslated region (5 -UTR) which is followed by a single, large open reading frame (ORF) that encodes for a single polyprotein and a 3 -UTR that ends to a poly(a) tail. The polyprotein contains three segments. P1 segment includes the structural viral capsid proteins: VP4, VP2, VP3 and VP1, whereas the P2 and P3 segments contain the non-structural proteins (2A pro, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C pro and 3D pol ) that are involved in polyprotein s autocatalytic processing and viral RNA replication [1]. Based 151

166 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ on phylogenetic analyses and according to ICTV, Coxsackie A viruses are distributed into three Enterovirus species: Enterovirus A, Enterovirus B and Enterovirus C. Coxsackie B viruses and Echoviruses are classified into Enterovirus B species [1]. Enteroviruses (EVs), although their infections may often remain mild or asymptomatic [1], have been associated with a wide variety of clinical manifestations ranging from hemorrhagic conjunctivitis, aseptic meningo-encephalitis to acute flaccid paralysis [2]. EVs have a seasonal distribution that can vary between the different types and can co-circulate depending on the year and the place [3]. Echoviruses, as well as Coxsackie A and B viruses are the causal agents of many aseptic meningitis outbreaks observed in many countries and clinical strains have been isolated and further investigated from sewages, stools, nasopharyngeal and throat swabs or CSF samples [4-6]. The typical assay for the detection of enteroviruses is virus isolation in cell cultures followed by seroneutralization with type-specific antibodies to determine the serotype. This assay is not so much specific and sensitive while is time-consuming, expensive and labor intensive. At present, the most commonly used assay for the detection of enteroviruses is PCR, offering rapidness and reliability. Targeting and amplifying the 5 -UTR genomic region, the most conserved genomic region among all enterovirus serotypes, was proved to be a useful tool for the molecular detection of all different enterovirus serotypes in clinical isolates [7-11]. However, the 5 -UTR genomic region is not discriminative enough and therefore is inadequate for typing [11-14]. The most accurate genomic region that offers serotype/genotype correlation was found to be VP1, as the capsid protein that encodes carries the main antigenic sites [15-17]. Sequencing part of the VP1 region was successfully used for the molecular identification of enteroviruses and epidemiological studies [17-20]. Other typing methods may also include sequencing of capsid genes VP4 and/or VP2, but these regions were found to be less discriminatory in order to define the different genotypes [17,22]. In this study, a Multiplex RT-PCR assay was developed in order to detect and characterize Echoviruses, Coxsackie A and B viruses. Three primer pairs targeting at three different genomic sites 5 UTR, VP1 and 2C were selected for this assay. The assay was initially designed on prototype strains and then tested on both prototypes and clinical enteroviruses isolates. The results revealed the aptitude of this assay to effectively detect all tested viruses by the presence of the amplicon located at 5 UTR, while sequencing of the amplicon located at VP1 genomic region 152

167 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ accurately characterized the serotype of the investigated clinical isolate. Finally the third amplicon located at 2C genomic region characterized and classified the investigated sample into Enterovirus B species. Material and Methods Reference and clinical strains In the present study, 38 reference (Table 1) and 20 clinical (Table 2) isolates were used. Reference strains have been obtained from Pasteur Institute of Paris (IPP, Epidemiologie Moleculaire des Enterovirus, Institute Pasteur, Paris) and the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA). The clinical isolates used in this study were previously characterized by seroneutralization assay and by partial sequencing of the VP1 genomic region [12, 22]. Serotype, registration code, year and place of isolation as well as clinical manifestations of each clinical strain are shown in Table 2. Thirty out of thirty eight reference strains and all clinical isolates belonged to EV-B species, whereas 8 reference strains (CAV1, CAV11, CAV13, CAV17, CAV18, CAV20, CAV21 and CAV24) belonged to EV-C species. Table 1 Enteroviruses reference strains and accession numbers used in sequence analysis. Serotype Strain Accession Number Serotype Strain Accession Number CAV1 Tompkins AF E5 Noyce AF CAV9 Griggs D00627 E7 Wallace AY CAV11 Belgium 1 AF E9 Barty X92886 CAV13 Flores AF E12 Travis X79047 CAV17 G-12 AF E13 Del Carmen AY CAV18 G-13 AF E14 Tow AY CAV20 IH-35 AF E15 Ch AY CAV21 Coe D00538 E16 Harrington AY CAV24 EH 24/70 D90457 E17 CHHE-29 AY CBV1 Japan M16560 E20 JV-1 AY CBV2 Ohio-1 AF E21 Farina AY CBV3 Nancy M88483 E24 decamp AY CBV4 JVB X05690 E25 JV-4 AY CBV5 Faulkner AF E26 Coronel AY CBV6 Schmitt AF E27 Bacon AY E1 Farouk AF E29 JV-10 AY E2 Cornelis AY E30 Bastianni AF E3 Morrisey AY E31 Caldwell AY E4 Pesacek AY E33 Toluca-3 AY

168 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Table 2 Clinical isolates that were tested in the present study. Underlined samples were used in molecular cloning of Multiplex RT-PCR products Serotype Registration Place of origin Clinical manifestations Year of isolation CAV9 65/89/1 Cantacuzino Institute, Romania Transient spinal paralyisis 1989 CAV9 113/73/2 Cantacuzino Institute, Romania Persistent spinal paralysis 1973 CAV9 611/80/1 Cantacuzino Institute, Romania Transient spinal paralysis 1980 CAV9 A9/He2 Environment/Cyprus CAV9 A9/He5 Environment/Cyprus CBV1 98/74/2 Cantacuzino Institute, Romania Transient spinal paralyisis 1974 CBV1 99/74/1 Cantacuzino Institute, Romania Transient spinal paralyisis 1974 CBV2 118/95/2 Cantacuzino Institute, Romania Unknown 1995 CBV3 77/78/13 Cantacuzino Institute, Romania Meningoencephalitis 1978 CBV4 69/86/1 Cantacuzino Institute, Romania Gastrointestinal disorder 1986 CBV4 169/75/1 Cantacuzino Institute, Romania Gastrointestinal disorder 1975 CBV5 14/70/1 Cantacuzino Institute, Romania Meningitis 1970 CBV5 254/77/1 Cantacuzino Institute, Romania Facial paralysis 1977 CBV5 7/73/19 Cantacuzino Institute, Romania Conjuctivitis 1973 CBV6 86/73/1 Cantacuzino Institute, Romania Transient spinal paralyisis 1973 E 5 156/98/1 Cantacuzino Institute, Romania Unknown 1998 E 6 Tsikan Greece Aseptic meningitis 2001 E 13 Das Greece Aseptic meningitis 2001 E Greece Influenza-like symptoms 1980 E 30 Kar Greece Aseptic meningitis 2001 Primers The alignment of 38 prototype sequences that were used in this study (Table 1) was made by MEGA version 6.0 software [24] and was performed in order to identify conserved sequences in three different genomic regions (5 UTR, VP1 and 2C). According to the results of the alignment, three primer pairs were selected. Information about their sequence, position and targeting genomic region is given in Table 3. Table 3 Name, polarity, position and targeting genomic region of each primer pair used Primer Genomic Sequence (5 3 ) Polarity Position Name Region References UG52 CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG Sense UTR [25] UC53 TTGTCACCATAACCAGCCA Antisense UTR [25] ΑΝ89 CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG Sense VP1 [26] ΑΝ88 TACTGGACCACCTGGNGGNAYRWACAT Antisense VP1 [26] CHR1 CNTCHCARAGTGAYCARGARCARYT Sense C [27] CHR2 GTAYACYGGTGGWCCYTGRAAKA Antisense C [27] 154

169 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Virus titration and serial dilutions Three reference strains, Coxsackie A9, Coxsackie B6 and Echovirus 12, were selected in order to determine the sensitivity of each primer pair. The virus titre of each strain was determined in TCID 50 /0,1ml according to WHO instructions [28] and serial dilutions were performed in order to achieve virus titres of 10 5, 10 3, 10 and 1 TCID 50 /0.1ml by tenfold dilutions of infected RD cells. Extraction of viral RNA Hundred (100) μl of frozen and thawed viral stocks were subjected to viral RNA extraction according to the guanidine thiocyanate extraction protocol by Casas et al [29]. The pellet was dried and dissolved in 100μl of sterile double-distilled water, DNase RNase free (DEMO S.A, Athens, Greece). Reverse Transcription Reverse transcription was performed at a Techne (TC-512) thermal cycler. In brief, a first reaction mixture consisting of: 5 pmol of random d(n7) primers (Macrogen, South Korea), 2mM of dntps and RNase-free distilled water up to a volume of 7μl was prepared. Seven microliter of the first reaction mixture with 5μl of the extracted viral RNA were incubated for 5min at 65 C. A second reaction mixture consisting of: 1X of 5X first strand buffer, 0,01 mm of DTT, 10 units of ribonuclease inhibitor, 100 units of M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, Life Technologies Paisley, UK) and RNasefree distilled water up to a volume of 8μl was added to each sample and incubated for: 10min at 25 C, 50min at 37 C and 15min at 70 C. Multiplex-PCR assay The mixture for each Multiplex-PCR reaction consisted of: 2μl of cdna, 10 pmol of AN89/AN88 primer pair, 50pmol of each primer pair UG52/UC53 and CHR1/CHR2, 1,1X KAPA2G Buffer A, 1,2mM dntps, 1,65mM MgCl 2, 1 unit KAPA2G Fast HotStart polymerase (KAPA Biosystems, Boston, Massachusetts, United States) and double distilled H 2 O up to a final volume of 25μl. All Multiplex-PCR reactions were performed in a Techne (TC-512) thermal cycler for 40 cycles. The initial denaturation step was carried out at 95 ο C for 2min. Multiplex-PCR conditions for each cycle were: denaturation at 95 o C for 15s, annealing at 45 o C for 30s, and extension at 72 o C for 20s. Analysis of PCR products was performed through agarose gel electrophoresis (2% agarose, 1μg/ml ethidium bromide in Tris boric acid EDTA buffer) using as a molecular weight marker the 100bp DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK). 155

170 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Molecular Cloning of Multiplex-PCR products and Sequence Processing The three Multiplex RT-PCR products derived from 12 different clinical isolates were selected in order to evaluate the ability of the assay to correctly detect and identify different Coxsackie A and B viruses and Echoviruses. The isolates used for the evaluation of the Multiplex PCR assay are the underlined samples in Table 2. These products were extracted from agarose gel using Nucleospin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany) according to manufacturer s instructions. Three microliters (3μl) of each product were cloned into pcrii-topo vector (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) and 6μl of the cloning reaction were transformed into JM109 competent cells according to manufacturer s instructions. Three white colonies of each amplicon were picked up and cultured overnight in LB medium containing 50μg/ml ampicillin. Plasmid DNA was purified using NucleoSpin Plasmid Kit (Macherey- Nagel, Düren, Germany) and 20μl of plasmid DNA were sequenced by Macrogen (Macrogen Europe, Amsterdam, The Netherlands). The sequences were processed and aligned using nucleotide blast online tool ( BLAST, NIH). Results Detection of prototype strains In the present study 38 reference strains were used in order to assess the ability of the Multiplex RT-PCR assay to detect and characterize different enteroviruses. As shown in Table 4, all reference strains were amplified with the primer pair UG52/UC53 targeting the 5 -UTR genomic region and yielded a PCR product of 433 bp. Similarly, the second primer pair AN89/AN88 amplified all reference strains yielding a PCR product of 375 bp located at VP1 genomic region. In contrast the amplification product of 800 bp that was obtained with primer pair CHR1/CHR2 was generated by 30 out of 38 references strains. All 30 strains that yielded the 800 bp PCR product belonged to Enterovirus B species, whereas the 8 strains that did not yield the 800 bp PCR product belonged to Enterovirus C species. As an example, the results after agarose gel electrophoresis of nine reference strains by Multiplex RT-PCR are shown in Figure

171 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Table 4 Results of the Multiplex RT-PCR assay on reference strains for each primer pair Reference Primers UG52/UC53 AN89/AN88 CHR1/CHR2 strains PCR Product 433 bp 375 bp 800 bp Serotype CAV CAV CAV CAV CAV CAV CAV CAV CAV CBV CBV CBV CBV CBV CBV E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E

172 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Figure 1. Agarose gel electrophoresis of Multiplex RT-PCR products. Lanes 1-9 reference strains Echo1, Echo2, Echo3, CBV1, CBV2, CBV3, CAV1, CAV9 and CAV11 respectively. All strains yielded the expected three amplicons: 375bp, 433bp and 800bp, but not strains CAV1 and CAV11 on lanes 7 and 9, which yielded as was expected only two amplicons: 375bp and 433bp. Lanes L a 100bp DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK) Detection of clinical strains The ability of the Multiplex RT-PCR assay to detect and characterize not only the reference strains, but also clinical samples was tested using 20 previously characterized clinical isolates that belonged to EV- B species. Primer pairs UG52/UC53, AN89/AN88 and CHR1/CHR2 yielded the three expected amplicons correctly in all the clinical isolates tested. Sequencing Results Sequencing of the three different Multiplex-PCR products that derived from 12 different clinical strains confirmed the ability of the assay to detect and characterize Echoviruses, Coxsackie A and B viruses. Specifically the 433bp amplicon obtained by primer pair UG52/UC53 was located correctly at 5 UTR. The sequence of this amplicon could discriminate the species of each isolate but was unable to correctly validate the serotype of the examined isolate. The second product that was amplified by primer pair AN89/AN88 yielding a 375bp PCR product was correctly located at VP1 genomic region. Moreover, the sequence of this PCR product confirmed the serotype of all the previously characterized clinical isolates that were investigated in the present study. The sequencing results of the third primer pair obtained with the CHR1/CHR2 primer pair yielded a PCR product of 800bp that was located at 2C genomic region and confirmed that, the sequence of this PCR product could discriminate the examined clinical isolates only until the level of species. 158