ΙΪΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & Γενετικά Τροποποιημένα Κύτταρα

Transcript

1 ΙΪΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & Γενετικά Τροποποιημένα Κύτταρα

2 ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΙΩΝ 1. Οι ιοί είναι μικροοργανισμοί που προκαλούν ασθένειες σε ένα οργανισμό, μετά από μόλυνση των κυττάρων του 2. Είναι παρασιτικοί οργανισμοί και δεν αυτο-αναπαράγονται * Συγκεκριμμένα, δεν διαθέτουν μηχανισμούς αντιγραφής, μεταγραφής & μετάφρασης αλλά χρησιμοποιούν εκείνους του ξενιστή-μολυσμένου κυττάρου για την αναπαραγωγή τους

3 ΒΑΣΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΙΩΝ *Οι ρετροϊοί ενσωματώνονται μόνιμα στο γένωμα

4 Ι- Ο κύκλος αναπαραγωγής ζωής των ιών Το παράδειγμα του βακτηριοφάγου *Η ιϊκή αναπαραγωγή απαιτεί: α. το ιϊκό γένωμα και β. τις ιϊκές πρωτεϊνες

5 ΙΙ- Ο κύκλος ζωής των ιών Το παράδειγμα του ιού της γρίπης-α Γένωμα ιού: ssrna (-) (-) (-) (+) 1. Πολλοί ιοί μολύνουν τον πυρήνα του κυττάρου-ξενιστη 2. Χρησιμοποιούν τους κυτταρικούς μηχανισμούς αντιγραφής & μετάφρασης

6 Η ΔΙΠΛΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΙΪΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ-1/2 1. Ορισμένοι ιοί μολύνουν ένα κύτταρο και το γενετικό τους υλικό «επιπλέει» στο κυτταρόπλασμα του ξενιστή χωρίς να ενσωματώνεται στο γένωμα 2. Όμως μία ιϊκή ενσωμάτωση στο γένωμα μπορεί να οδηγήσει σε: A. κυτταρικό θάνατο λόγω συνεχών ενσωματώσεων & παραγωγής σωματιδίων (π.χ: η μόλυνση HIV) ή/και B. ποικίλες ασθένειες μέσω ιϊκής ενθετικής μεταλλαξιγένεσης ΙΪΚΗ ΕΝΘΕΤΙΚΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ: είναι η προκαλούμενη μετάλλαξη από την ένθεση επιπρόσθετων ιϊκών βάσεων DNA στο γονιδίωμα του κυττάρου

7 A. Ο ιός HIV & κυτταρικός θάνατος LTR: μακρές τελικές ακολουθίες Α. Δομική μορφολογία 1. αντίστροφη µεταγραφάση 2. ιντεγκράση 3. πρωτεάση Β. Βασικά ρετροϊικά γονίδια Gag: ενδοκαψιδιακές πρωτεϊνες Pol: αντίστροφη μεταγραφάση, ιντεγκράση & πρωτεάση Env: πρωτεϊνες κάψας

8 Η ρετροϊική μόλυνση HIV προκαλεί κυτταρικό θάνατο + *Ο ιός HIV μολύνει ανθρώπινα: CD4 Τ-βοηθητικά λεμφοκύτταρα CD4: (Cluster of Differentiation 4) γλυκοπρωτεϊνη στην επιφάνεια των Τ-βοηθητικών λεµφοκυττάρων Video-1: η μόλυνση, αναπαραγωγή και η στόχευση θεραπείας του HIV

9 B. Η Ρετροϊική ενθετική ή εισαγωγική μεταλλαξιγένεση No effect ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ 1. Μακράν ενός γονιδίου: >>1Mb 2. Ενσωμάτωση πλησίον γονιδίου 3. Ενσωμάτωση πλησίον υποκινητή ή καταστολέα ενός γονιδίου 4. Ενσωμάτωση μέσα σε γονίδιο *Ενσωμάτωση σε ανενεργές περιοχές του γονιδώματος Enhancer= επαυξηντής Promoter= υποκινητής Η ενσωμάτωση ρετροϊών στο γένωμα του ξενιστή μπορεί να προκαλέσει: 1. μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης, 2. κυτταρικό θάνατο και 3. μεταλλαξιγένεση ή/και ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ

10 Η ΔΙΠΛΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΙΪΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ-2/2 Με δεδομένο ότι οι ιοί «μεταφέρουν» στο κύτταρο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ίαση ασθενειών? Και πώς?

11 Ο Μηχανισμός & η Σημασία της 1. Το γένωμα του ρετροϊού (ssrna) μετατρέπεται σε DNA (cdna) & στο γένωμα του ξενιστή 2. Ο ενσωματωμένος ρετροϊός μπορεί να εκφράζεται συνεχώς 3. Η ενσωμάτωσή του τον καθιστά μεταφοράς γονιδίων

12 Παραγωγή ρετροϊικών φορέων για ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ * Τα κύτταρα πακεταρίσματος είναι απαραίτητα για την αποφυγή παραγωγής ρετροϊών αγρίου τύπου απάλλειψη (gag, pol & env) α. Κατασκευή ανασυνδυασμένου ρετροϊού/ θεραπευτικού γονιδίου (Video-2 rec. DNA) Κύτταρα πακεταρίσματος ρετροϊών β. Παραγωγή σωματιδίων ανασυνδυασμένου ρετροϊού γ. Συλλογή σωματιδίων για κυττάρων ή οργανισμού

13 ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΧΡΗΣΗΣ ΡΕΤΡΟΪΙΚΩΝ ΦΟΡΕΩΝ 1. Η αυθαίρετη ενσωμάτωση σε τυχαίες θέσεις στο γένωμα 2. Η ενσωμάτωση σε απαραίτητο γονίδιο του ξενιστή θα διαταράξει την λειτουργία του, λόγω μεταλλαξιγένεσης 3. Εάν το γονίδιο ρυθμίζει την κυτταρική διαίρεση, η ενσωμάτωση πιθανόν να οδηγήσει σε ανεξέλεκτο πολλαπλασιασμό/καρκινογένεση. *Σήμερα, η ερευνητική προσπάθεια εστιάζεται στην κατευθυνόμενη ενσωμάτωση σε «ανενεργές» περιοχές του γενώματος.

14 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΡΕΤΡΟΪΙΚΩΝ ΦΟΡΕΩΝ ΣΤΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Η Γονιδιακή θεραπεία βασίζεται σε τεχνικές Μοριακής Βιολογίας και αποσκοπεί στην αποκατάσταση ενός παθολογικού φαινότυπου μέσω αλλαγής του γενετικού υλικού του Αδρά: μπορεί να επιτευχθεί με: - απάλλειψη (Knock out) του «παθολογικού γονιδίου» - εισαγωγή του «υγιούς γονιδίου» σε κύτταρα όπου δεν λειτουργεί - εισαγωγή γονιδίου στο γένωμα που «καταπολεμά» την ασθένεια Με δεδομένο ότι ένα γονίδιο δεν μπορεί να εισαχθεί στο ανθρώπινο κύτταρο, η χρήση ρετροϊικών φορέων καθίσταται πολύ χρήσιμη

15 1. ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ: γαμετικά & σωματικά κύτταρα Στα ΓΑΜΕΤΙΚΑ 1. γονιδιακή μεταφορά γίνεται σ όλα τα κύτταρα του νέου οργανισμού 2. εξασφαλίζεται η μόνιμη θεραπεία των επόμενων γενεών 3. επιτυγχάνεται η εξάλλειψη ασθένειας σ ένα πληθυσμό * αφύσικος τρόπος θεραπείας & απρόβλεπτων μεταλλάξεων Στα ΣΩΜΑΤΙΚΑ 1. είναι μεν συντηρητική αλλά πιο ασφαλής (λίγα κύτταρα του οργανισμού) 2. περιορίζεται σε συγκεκριμμένο ασθενή δεν μεταφέρεται σε επόμενες γενεές 3. Τα κύτταρα-στόχοι πεθαίνοντας απαιτούν την επανάληψη της θεραπείας

16 ΑΝΑΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ: ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (µία εναλλακτική µέθοδος: σε χειρουργική επέµβαση & σε φάρµακα) Στόχος της Αναγεννητικής Ιατρικής είναι η επιδιόρθωση, αντικατάσταση αναγέννηση ιστών & οργάνων που δυσλειτουργούν ή Παραδείγματα: σακχαρώδης διαβήτης, οστεοαρθρίτιδα, εκφυλιστικές νόσοι καρδιάς και νευρικού συστήματος και αποκατάσταση τραυματικών βλαβών Βασίζεται στη διαφοροποίηση των ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ: 1. από Εµβρυϊκά βλαστικά 2. από Σωµατικά βλαστικά Μεγάλο εύρος διαφοροποίησης (πολυ-δύναµα) Μικρό εύρος διαφοροποίησης (ολιγο-δύναµα)

17 Α. Τα εμβρυϊκά πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ES cells) Πολυδύναμα κύτταρα Τα κανονικά εμβρυικά βλαστικά κύτταρα προέρχονται από την εσωτερική στοιβάδα της βλαστοκύστης και παράγουν ΟΠΟΙΟΔΗΠΟΤΕ ΙΣΤΟ

18 Β. Τα επαναπρογραμματισμένα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ips: induced Pluripotent Stem cells) Το πρόβλημα του επαναπρογραμματισμού: Εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ips βλαστικά κύτταρα Διαφοροποίηση Σωματικά κύτταρα (2006-Δρ. Sinya Yamanaka) * Η παραγωγή κυττάρων ips από τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα αποτελεί την βάση της Αναγεννητικής Ιατρικής

19 Η ιδέα παραγωγής κυττάρων ips προήλθε από την κλωνοποίηση της Dolly-1996 Ζυγωτό Φυσιολογική ανάπτυξη εμβρύου μέσω γονιμοποίησης Παραγωγή εμβρύου/ κλώνου χωρίς γονιμοποίηση Παραγωγή κλωνοποιημένου ζώου σε θετή μητέρα (Black face) Αυτό απέδειξε ότι ο πυρήνας ενός διαφοροποιημένου σωματικού κυττάρου μπορεί να ΕΠΑΝΑ-ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΘΕΙ, παράγοντας Βλαστικά κύτταρα

20 Ο ρετροϊικός φορέας γονιδίων: Klf4, Oct3/4, Sox2 & c-myc (Video-3 Yamanaka) (2006-Δρ. Sinya Yamanaka, Πανεπιστήμιο Kyoto, Ιαπωνία) Η έκφραση της ομάδας γονιδίων: Klf4, Oct3/4, Sox2 & c-myc είναι ικανή & αναγκαία για παραγωγή επαναπρογραματισμένων πολυδύναμων κυττάρων

21 Μεταγραφικά Ρυθµιζόµενο Δίκτυο στο Εµβρυονικό Βλαστικό Κύτταρο 1/2

22 Μεταγραφικά Ρυθµιζόµενο Δίκτυο στο Εµβρυονικό Βλαστικό Κύτταρο 2/2

23 Στάδια γένεσης κυττάρων ips εξατομικευμένης θεραπείας (Video-4) (Video-5) (Video-6) 1. Απομονωμένα κύτταρα συγκεκριμμένου ασθενούς (π.χ: δέρματος) 2. Μόλυνση κυττάρων με τον ιό/ ρετροϊικό φορέα plendg-kosm [Χρησιμοποιείται Λεντιϊός (ρετροϊός) που μολύνει και μη-πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα] 3. Απομόνωση/έλεγχος κυττάρων με ιδιότητες ips 4. Καλλιέργεια κυττάρων ips & απομόνωση διαφοροποιημένων κυττάρων ενδιαφέροντος

24 Τέλος