Μεταγραφή Ρύθμιση γονιδιακής έκφρασης

Transcript

1 Μεταγραφή Ρύθμιση γονιδιακής έκφρασης RNA πολυμεράση Ριβονουκλεοτίδια DNA mrna

2 Εισαγωγικά: Μεταγραφή mrna DNA RNA πολυμεράση Ευκαρυωτική RNA πολυμεράση Η μεταγραφή αποτελεί το πρώτο βήμα στη γονιδιακή έκφραση και το κυριότερο στάδιο ελέγχου της Η σύνθεση του RNA, είναι η διεργασία της μεταγραφής των πληροφοριών της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA σε πληροφορίες αλληλουχίας RNA. Καταλύεται από ένα μεγάλο ένζυμο που ονομάζεται RNA πολυμέραση Η δομή του ενζύμου είναι πολύ όμοια μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων, αν και υπάρχουν διαφορές στο μήκος και τον αριθμό των υπομονάδων (άρα και στη ρύθμιση της όλης διαδικασίας)

3 Εισαγωγικά: Μεταγραφή Η σύνθεση του RNA πραγματοποιείται σε τέσσερα βήματα: 1) στην πρόσδεση της RNA πολυμεράσης σε μια ειδική περιοχή στην αρχή του γονιδίου που ονομάζεται υποκινητής, 2) έναρξη, 3) την επιμήκυνση και 4) την λήξη και την απομάκρυνση από το DNA. Ένας τυπικός υποκινητής αποτελείται από τρία στοιχεία: τις πρότυπες αλληλουχίες στις θέσεις -35 και -10 και το σημείο έναρξης. Οι αλληλουχίες πριν το σημείο έναρξης της μεταγραφής ονομάζονται ανοδικές (ή αναροïκές), ενώ οι αλληλουχίες μετά το σημείο έναρξης ονομάζονται καθοδικές (ή καταροïκές). Ως μεταγραφική μονάδα ορίζεται ένα τμήμα DNA που εκφράζεται μέσω της παραγωγής ενός μοναδικού μορίου RNA και μπορεί περιλαμβάνει ένα γονίδιο ή μια ομάδα γονιδίων.

4 Τα βασικά χαρακτηριστικά της μεταγραφής Τα ενεργοποιημένα μονομερή υποστρώματα για τη σύνθεση του RNA είναι τα 5 - τριφωσφορικά ριβονουκλεοσίδια ATP, GTP, CTP, UTP. Οι δεσμοί υψηλής ενέργειας αυτών των δομικών λίθων παρέχουν την ενέργεια για την πραγματοποίηση της αντίδρασης. To RNA συντίθεται με κατεύθυνση 5 >3, όπως και το DNA. Η μια αλυσίδα του DNA χρησιμεύει ως εκμαγείο για τη μεταγραφή. Η RNA πολυμεράση διαχωρίζει τις δύο αλυσίδες του DNA σε μια παροδική θηλιά και καθώς το ένζυμο μετακινείται κατά μήκος του γονιδίου, το DNA αποδιατάσσεται στο μπροστινό μέρος της θηλιάς και επαναδιατάσσεται στο πίσω. Στην αντίδραση πολυμερισμού η 3 -OH ομάδα του ενός νουκλεοτιδίου αντιδρά με την 5 - τριφωσφορική ομάδα ενός δεύτερου νουκλεοτιδίου. Έτσι απομακρύνεται ένα πυροφωσφορικό και δημιουργείται ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός. Οι RNA πολυμεράσες, σε αντίθεση με τις DNA πολυμεράσες, δεν χρειάζονται ένα εναρκτήριο μόριο για να αρχίσουν την σύνθεση και επίσης δεν διαθέτουν τη δυνατότητα ελέγχου της πιστότητας του μεταγράφου.

5 Η μεταγραφή στα προκαρυωτικά κύτταρα

6 Υποκινητές προκαρυωτικών γονιδίων Ο υποκινητής χαρακτηρίζεται από την παρουσία βραχειών πρότυπων αλληλουχιών σε ειδικές θέσεις, οι οποίες είναι κρίσιμες για την λειτουργία του. Τα τέσσερα συντηρημένα χαρακτηριστικά ενός βακτηριακού υποκινητή: Α) Η αλληλουχία -35 (5 -T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45-3 ) Ο δείκτης δηλώνει τη συχνότητα εμφάνισης Β) Η αλληλουχία -10 (5 - T 80 A 95T 45 A 60 A 50 T 96-3 ) Γ) Το μήκος της αλληλουχίας που χωρίζει τις -35 και -10, είναι κρίσιμο για τη γεωμετρία της RNA πολυμεράσης Δ) Το σημείο έναρξης είναι συνήθως μια πουρίνη. Υποκινητής Παράγοντας σ Θέση έναρξης RNA πολυμεράση

7 Η βακτηριακή RNA πολυμεράση Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, μια RNA πολυμεράση είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφή όλων των γονιδίων. Για παράδειγμα, η RNA πολυμεράση του βακτηρίου E.coli είναι πολύ μεγάλο ένζυμο (~400Kd) που αποτελείται από επιμέρους υπομονάδες σε στοιχειομετρία α 2 ββ σ.

8 Η RNA πολυμεράση της E. coli Το α 2 ββ ονομάζεται πυρήνας του ενζύμου και έχει το καταλυτικό κέντρο Ο παράγοντας σ εξασφαλίζει τη σταθερή πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στην περιοχή του υποκινητή και αφού βοηθήσει στην έναρξη της μεταγραφής, αποδεσμεύεται, αφήνοντας τον πυρήνα του ενζύμου να δράση.

9 Ο παράγοντας σίγμα Ο παράγοντας σ αλλάζει τις ιδιότητες πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης στο DNA, έτσι ώστε να μειώνεται η συγγένειά της για τυχαίες αλληλουχίες και να αυξάνεται για τους υποκινητές. Στην E. coli έχουν προσδιοριστεί διαφορετικοί παράγοντες σ, καθένας από τους οποίους κάνει την RNA πολυμεράση να αναγνωρίζει μια ομάδα υποκινητών, που προσδιορίζονται από τις αλληλουχίες -35 και -10. Ο γενικός παράγοντας σ 70 ευθύνεται για τη μεταγραφή των περισσότερων γονιδίων κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Οι εναλλακτικοί παράγοντες σ S, σ 32, σ E, σ 54 ενεργοποιούνται στα πλαίσια περιβαλλοντικών αλλαγών. Για παράδειγμα σε κατάσταση θερμικού σοκ επάγεται η παραγωγή του παράγοντα σ 32, που παίζει ρόλο στην μεταγραφή και την έκφραση γονιδίων θερμικού σόκ που εξυπηρετούν συγκεκριμένες μεταβολικές λειτουργίες σε υψηλές θερμοκρασίες.

10 Τα στάδια της μεταγραφής στους προκαρυωτικούς 1) Πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στην περιοχή του υποκινητή και δημιουργία του ανοικτού συμπλόκου Η αντίδραση RNA πολυμεράσης-υποκινητή αρχίζει με το σχηματισμό ενός κλειστού RNAP 70 περιοχή -35. συμπλόκου, όπου το DNA παραμένει δίκλωνο. Η αρχική αναγνώριση γίνεται κυρίως στην Έπειτα το κλειστό σύμπλοκο μετατρέπεται σε -35 TTGACA RNAP TATAAT ανοικτό, όπου η RNA πολυμεράση προσδένεται πιο ισχυρά στον υποκινητή. Κατά τη μετατροπή αυτή, αρχίζοντας από την περιοχή -10 ξετυλίγονται περίπου 17 bp, που εκθέτουν την αλυσίδα του DNA που θα χρησιμοποίηθει ως μήτρα για τη σύνθεση του RNA Η πολυμεράση ξετυλίγει το DNA προκαλώντας αρνητική υπερσυσπείρωσή του που ευνοεί τη μεταγραφή

11 2) Έναρξη της μεταγραφής Με τη δημιουργία του ανοικτού συμπλόκου, η RNAP 70 RNA πολυμεράση είναι πλέον έτοιμη να αρχίσει τη σύνθεση. Το ένζυμο περιέχει δύο θέσεις πρόσδεσης: τη θέση έναρξης και τη θέση επιμήκυνσης. Το αρχικό τριφωσφορικό νουκλεοσίδιο προσδένεται στο ένζυμο, στο ανοικτό σύμπλοκο με τον υποκινητή και σχηματίζει υδρογονικό δεσμό με τη συμπληρωματική βάση του DNA. Η θέση επιμήκυνσης καταλαμβάνεται τότε από το επόμενο τριφωσφορικό νουκλεοσίδιο που επιλέγεται αυστηρά με βάση την ικανότητά του να σχηματίζει υδρογονικό δεσμό με την επόμενη βάση στην αλυσίδα του DNA. Τα δύο ριβονουκλεοτίδια συνδέονται τότε με φωσφοδιεστερικό δεσμό και η πρώτη βάση απομακρύνεται από την θέση έναρξης. Το δινουκλεοτίδιο παραμένει συνδεδεμένο με το DNA με υδρογονικό δεσμό Η RNA πολυμεράση και η αλυσίδα του DNA κινούνται κατά ένα νουκλεοτίδιο τη φορά.

12 3) Επιμήκυνση Επιμήκυνση Κλώνος DNA Ριβονουκλεοτίδια Μετά από την επιτυχή έναρξη, με την προσθήκη μερικών νουκλεοτιδίων, ο παράγοντας σ δεν είναι πλέον απαραίτητος και αποδεσμεύται. Ο παράγοντας σ που απελευθερώνεται, μπορεί να συνδεθεί με άλλα μόρια πυρήνα του ενζύμου και να σχηματίσει μόρια ολοενζύμου. Νεοσυντιθέμενο RNA Κλώνος DNA που χρησιμεύει ως μήτρα Ο μηχανισμός της επιμήκυνσης: Τα εισερχόμενα νουκλεοτίδια συνδέονται με 3-5 φωσφοδιεστερικό δεσμό. Το νεοσυντιθέμενο RNA, απομακρύνεται από το DNA, καθώς η έλικα στο τμήμα που έχει μεταγραφεί, επανασχηματίζεται. Δώδεκα περίπου βάσεις σχηματίζουν υβρίδιο με το DNA στην περιοχή που μεταγράφεται.

13 4) Λήξη της μεταγραφής Στη φάση του τερματισμού της μεταγραφής, ο σχηματισμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών παύει, το υβρίδιο DNA-RNA αποσυνδέεται, η αποδιαταγμένη περιοχή του DNA ξανατυλίγεται και η RNA πολυμεράση ελευθερώνει το DNA. Δύο μηχανισμοί τερματισμού συναντώνται στα προκαρυωτικά κύτταρα: Rho-ανεξάρτητος, απλές αλληλουχίες λήξης Rho-εξαρτώμενος, αλληλουχίες που απαιτούν βοηθητικούς παράγοντες λήξης, όπως ο παράγοντας

14 Rho-ανεξάρτητος μηχανισμός λήξης Οι μεταγραφόμενες περιοχές του DNA περιέχουν σήματα τερματισμού. Η απλούστερη περιοχή τερματισμού είναι μια παλινδρομική περιοχή πλούσια σε ζεύγη GC που ακολουθείται από μια περιοχή πλούσια σε ζεύγη ΑΤ. Έτσι, το μεταγράφημα RNA αυτής της DNA αλληλουχίας είναι αυτοσυμπληρωματικό και σχηματίζει δομή φουρκέτας, με έναν βραχίονα και μια θηλιά. Τα ζεύγη GC, είναι πιο σταθερά από τα ΑΤ λόγω του επιπλέον δεσμού υδρογόνου. Η σταθερή δομή φουρκέτας ακολουθείται από μια αλληλουχία 4 ή περισσοτέρων U, που είναι επίσης σημαντικά για την λήξη.

15 Rho-ανεξάρτητος μηχανισμός λήξης Πώς όμως αυτός ο συνδυασμός της δομής φουρκέταςολιγο(u) τερματίζει τη μεταγραφή; 1) Η RNA πολυμεράση σταματά αμέσως μετά τη σύνθεση του τμήματος RNA, το οποίο αναδιπλώνεται σε δομή φουρκέτας. 2) Η υβριδική έλικα RNA-DNA που παράγεται μετά τη φουρκέτα είναι ασταθής, διότι τα ζεύγη των βάσεων ruda είναι τα ασθενέστερα. Επομένως, η παύση της μεταγραφής που προκαλείται από τη φουρκέτα επιτρέπει στο χαλαρά συνδεδεμένο νεοσυντιθέμενο RNA να αποσυνδεθεί από το εκμαγείο DNA και στη συνέχεια από το ένζυμο. Τέλος, οι αλυσίδες του DNA ξαναενώνονται και η φυσαλίδα μεταγραφής κλείνει.

16 Rho-εξαρτώμενος μηχανισμός λήξης Ο παράγοντας Rho, είναι μια απαραίτητη πρωτεΐνη στην E. coli, που συμμετέχει αποκλειστικά στο στάδιο τερματισμού. Αποτελείται από έξι όμοιες υπομονάδες, κάθε μια από τις οποίες έχει μια επικράτεια πρόσδεσης στο RNA και μια επικράτεια υδρόλυσης ATP RNA πολυμεράση ATP+ H 2 O Παράγοντας ρ ADP+ Pi ppp 5 O παράγοντας ρ αποκτά δραστικότητα από αλληλουχίες που βρίσκονται στο νεοσυντιθέμενο RNA, οι οποίες είναι πλούσιες σε C και φτωχές σε G. Η δραστικότητα ΑΤΡάσης του διαθέτει ο παράγοντας ρ τον βοηθά να «τραβήξει» το νέο RNA, ακολουθώντας RNA πολυμεράση. Όταν η ρ φθάσει την RNA πολυμεράση στη φυσαλίδα μεταγραφής σπάει την υβριδική έλικα RNA-DNA δρώντας όπως μια RNA-DNA ελικάση.

17 Aντιβιοτικά ως αναστολείς της μεταγραφής Ριφαμπικίνη Ημισυνθετικό αντιβιοτικό της ομάδας των ριφαμυκινών, που προέρχονται από ένα στέλεχος Streptomyces Είναι εξαιρετικά δραστική εναντίον ενός μεγάλου φάσματος Gram (+) και Gram (-) βακτηρίων. Ο μηχανισμός δράσης της βασίζεται στην πρόσδεσή της στη β υπομονάδα της DNAεξαρτώμενης RNA πολυμεράσης Αναστέλλει την έναρξη της σύνθεσης RNA μέσω της παρεμπόδισης του σχηματισμού του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού στην αλυσίδα του RNA.

18 Aντιβιοτικά ως αναστολείς της μεταγραφής Ακτινομυκίνη D Η ακτινομυκίνη D αναστέλλει την μεταγραφή, με διαφορετικό όμως τρόπο από τη ριφαμπικίνη. Δεσμεύεται ισχυρά και ειδικά στο δίκλωνο ελικοειδές DNΑ, εμποδίζοντας έτσι τη μεταγραφή Επιπλέον, η ικανότητά της να αναστέλλει την ανάπτυξη ταχέως διαιρούμενων κυττάρων την καθιστά έναν αποτελεσματικό θεραπευτικό παράγοντα στην αντιμετώπιση ορισμένων μορφών καρκίνου.

19 Η μεταγραφή στα ευκαρυωτικά κύτταρα

20 Οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες Τα ευκαρυωτικά κύτταρα περιέχουν τρείς διαφορετικές RNA πολυμεράσες που διαφέρουν ως προς τη θέση τους μέσα στον πυρήνα, την ευαισθησία τους σε αναστολείς και τη σύνθεση διαφορετικών τύπων RNA. Eυκαρυωτικές RNA πολυμεράσες Μεταγραφή και σύνθεση του πρόδρομου μορίου τριών rrna RNA Pol I Μεταγραφή των πρόδρομων μορίων mrna (pre-mrna) και μικρών πυρηνικών RNAs που λαμβάνουν μέρος στην ωρίμανση του RNA RNA Pol II Μεταγραφή των μεταφορικών trnas, του 5S rrna RNA Pol III mrna

21 υποκινητές αναγνωρίζονται από πρωτεΐνες διαφορετικές από την ίδια την RNA πολυμεράση. Ευκαρυωτικοί υποκινητές γονιδίων Η δομή των ευκαρυωτικών υποκινητών είναι πιο περίπλοκη. Υπαρξη αλληλουχιών αριστερά από το σημείο έναρξης (upstream sequences), οι οποίες ελέγχουν τον ρυθμό της έναρξης της μεταγραφής Αλληλουχίες μέσα στο ίδιο το γονίδιο που παίζουν ρόλο υποκινητή. Οι υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA pol ΙΙ, έχουν περιοχές ομολογίας: α) Μια αλληλουχία TATAAAT που είναι γνωστή σαν TATA box, bp αριστερά από το σημείο έναρξης, β) Μια αλληλουχία στην περιοχή -75 bp που είναι γνωστή σαν CAAT box, γ) Αρκετά γονίδια περιλαμβάνουν και την τρίτη περιοχή ομολογίας γνωστή ως GC box, δ) Τα γονίδια που δεν έχουν TATA box, διαθέτουν μια περιοχή «εναρκτή» στο σημείο έναρξης με πρώτο νουκλεοτίδιο, αδενίνη Τα πλαίσια ΤΑΤΑ, CAAT και GC καθώς και άλλα στοιχεία με δράση cis στους ευκαρυωτικούς

22 Μεταγραφικοί παράγοντες (Transcription Factors-TFs) Είναι ειδικές πρωτεΐνες που απαιτούνται για την έναρξη της μεταγραφής στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Οι παράγοντες αυτοί, μαζί με την RNA πολυμεράση, συγκροτούν το σύμπλοκο έναρξης Οι TFs, προσδένονται σε ειδικές αλληλουχίες στο DNA και διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: Α) Τους γενικούς παράγοντες που είναι απαραίτητοι για την έναρξη Β) Τους ειδικούς παράγοντες που απαιτούνται, εκτός των γενικών, για τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων (π.χ. γονίδια σφαιρινών) σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων Μεταγραφικός παράγοντας προσδεδεμένος στο DNA

23 Έναρξη της μεταγραφής ο ρόλος των παραγόντων μεταγραφής Για τη συγκρότηση του συμπλόκου έναρξης, η RNA πολυμεράση ΙΙ οδηγείται στη θέση έναρξης της μεταγραφής από ένα σύνολο TFs που είναι γνωστοί ως TFII. Το καθοριστικό γεγονός για την έναρξη είναι η αναγνώριση του πλαισίου ΤΑΤΑ από την πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ (ΤΒΡ), ένα συστατικό του συμπλόκου TFIID. Η δέσμευση της TBP πρωτεΐνης στη μικρή αύλακα του DNA, επάγει αλλαγές στη στερεοδιάταξη του DNA και τελικά δημιουργεί μια κάμψη του μορίου, η οποία είναι κρίσιμη για την εξέλιξη της μεταγραφής πρός τη μια κατεύθυνση

24 Έναρξη της μεταγραφής ο ρόλος των παραγόντων μεταγραφής RNA pol II TF II A TBP ΤAF TATA TF II F TF II B TF II E TF II H DNA Η επιφάνεια της ΤΒΡ πρωτεΐνης παρέχει θέσεις για την πρόσδεση και άλλων παραγόντων με συγκεκριμένη σειρά Πρώτος στρατολογείται ο παράγοντας TFIIΑ και αμέσως μετά ο TFIIΒ Ακολουθεί η πρόσδεση της RNA pol II η οποία προσελκύεται από τον πράγοντα TFIIF με τον οποίο συνδέεται. Ο TFIIF έχει δράση ελικάσης, κι έτσι ανοίγει τους δύο κλώνους Στο σύμπλοκο συνδέονται και οι παράγοντες TFIIE και TFIIH Η καρβοξυτελική δομική περιοχή της RNA pol II φωσφορυλιώνεται (από TFIIH) και έτσι επιτυγχάνεται η έναρξη Στη συνέχεια οι περισσότεροι παράγοντες απελευθερώνονται για να συμμετάσχουν σε ένα άλλο κύκλο έναρξης

25 Διαδικασία επιμήκυνσης Η διαδικασία της επιμήκυνσης είναι παρόμοια με αυτήν των προκαρυωτικών οργανισμών Η μεταγραφή πραγματοποιείται στον πυρήνα των κυττάρων και χωρίζεται τόσο χρονικά όσο και χωρικά από την μετάφραση που γίνεται στο κυτταρόπλασμα, σε αντίθεση με τα βακτηριακά κύτταρα όπου οι δύο αυτές διαδικασίες είναι συζευγμένες. Λήξη της μεταγραφής Η αλληλουχία λήξης είναι η ΑΑΤΑΑΑ ακολουθούμενη από επαναλήψεις GT. Ο τερματισμός της μεταγραφής είναι στενά συνδεδεμένος με τη μετα-μεταγραφική τροποποίηση των μορίων RNA που παράγονται

26 Μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις του RNA Τα RNAs τωv ευκαρυωτικώv κυττάρων, που παράγονται με τη διαδικασία της μεταγραφής, υφίσταvται τρoπoπoιήσεις για vα καταστoύv ικαvά vα εκτελέσoυv τo βιoλoγικό τoυς ρόλo Συγκεκριμέvα, τo συvτιθέμενο πρωτoγεvές RNA υφίσταται περαιτέρω μεταμεταγραφικές μεταβoλές, γνωστές ως ωρίμαvση Η ωρίμανση είvαι διαφoρετική μεταξύ των τύπων RNA και θα αναλυθούν παρακάτω

27 Μετα-μεταγραφική ωρίμανση του αγγελιαφόρου RNA (mrna) To ευκαρυωτικό μετάγραφο mrna, τροποποιείται μέσα στον πυρήνα των κυττάρων κατά τη διάρκεια ή λίγο μετά το πέρας της μεταγραφής Οι τροποιήσεις που υφίστανται, περιλαμβάνουν την τροποποίηση των 5 και 3 άκρων και την εκτομή των εσωνίων και συρραφή των εξωνίων Το mrna εξάγεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, μόνο όταν έχουν ολοκληρωθεί όλες οι απαραίτητες τροποποιήσεις

28 Τροποποίηση των άκρων του mrna Τροποποίηση του 5 άκρου του mrna H τροποποίηση του 5 άκρου είναι γνωστή ως κάλυψη (capping). Το κάλυμμα συμβάλλει στη σταθερότητα των μορίων mrna, προστατεύοντας τα από τη δράση φωσφατασών ή νουκλεασών. Επιπλέον, ενισχύει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης του mrna.

29 Τροποποίηση του 5 άκρου- Προσθήκη καλύματος G Η 2 Ο A T C G 3 HO ppp + p pp 3...OH 3 HO m 7 G ppp 3 PPi mn 6 A OH To τριφωσφορικό άκρο της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας τροποποιείται αμέσως μετά τη μεταγραφή. Αρχικά απελευθερώνεται μια φωσφορική ομάδα με υδρόλυση. Το διφωσφορικό 5 -άκρο προσβάλλει το α-άτομο του φωσφόρου μιας GTP. Το νέο αυτό κατάλοιπο έχει τον αντίστροφο προσανατολισμό από τα άλλα νουκλεοτίδια και συνδέεται με 5-5 τριφωσφορικό δεσμό. Η δομή αυτή ονομάζεται καλύπτρα και αποτελεί υπόστρωμα για αντιδράσεις μεθυλίωσης. Η πρώτη μεθυλίωση καταλύεται από το ένζυμο 7-μεθυλοτρανσφεράση της γουανίνης και περιλαμβάνει την προσθήκη μιας μεθυλομάδας στη θέση 7 της ακραίας γουανίνης (καλύπτρα 0) Η μεθυλίωση της αρχικής ακραίας βάσης από την 2 -Ο μεθυλοτρανσφεράση δημιουργεί την καλύπτρα 1. Η μεθυλίωση της δεύτερης αδενίνης στη θέση Ν 6 συναντάται στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς

30 Τροποποίηση του 3 άκρου- Προσθήκη poly (A) ουράς RNA 5 AAUAAA (11-20bp) C ενδονουκλεάση A UUGUGUGUUG 3 ΑΤP 5 AAUAAA (11-20bp) C Πολύ (Α) πολυμεράση A ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 3 Η πολυ (Α) ουρά αυξάνει τη σταθερότητα του mrna. Δεν κωδικοποιείται από το DNA, αλλά προστίθεται μετά τη μεταγραφή. Μια ειδική μια ειδική ενδονουκλεάση, αναγνωρίζει την αλληλουχία AAUAAA και διασπά το mrna καθοδικά αυτής. Στη συνέχεια η πολύ (Α) πολυμεράση προσθέτει περίπου 250 κατάλοιπα αδενυλικών στο 3 άκρο του μεταγράφου

31 Μάτισμα mrna- Εκτομή εσωνίων και συρραφή εξωνίων (mrna splicing) Η αλληλουχία ενός εσωνίου αρχίζει με GU και λήγει με AG. Οι δύο αυτές αλληλουχίες δηλώνουν τη θέση ματίσματος. Μια εσωτερική αδενίνη που βρίσκεται νουκλεοτίδια πριν από το 3 άκρο του εσωνίου αποτελεί το σημείο διακλάδωσης Το μάτισμα πραγματοποιείται σε δύο αντιδράσεις τρανσεστεροποίησης. Η 1 η αντίδραση η 2 -ΟΗ ομάδα της αδενίνης στη θέση διακλάδωσης σχηματίζει φωσφοροδιεστερικό δεσμό με τη φωσφορική ομάδα του 5 -άκρου του εσωνίου, δημιουργώντας μια ελεύθερη 3 -ΟΗ στο 3 -άκρο του εξωνίου 1 Η 2 η αντίδραση συνδέει την ελεύθερη 3 -ΟΗ του εξωνίου 1με την 5 -φωσφορική ομάδα του εξωνίου 2. Εξώνιο 1 GU Εσώνιο A AG Εξώνιο 2 Θέση διακλάδωσης

32 Μάτισμα mrna- Εκτομή εσωνίων και συρραφή εξωνίων Εξώνιο 1 GU Εσώνιο A AG Εξώνιο 2 Αναγνώριση της θέσης ματίσματος 5 από το snrnp U1 U1 U1, U2 Θέση διακλάδωσης U2 Στη συνέχεια, U2 δεσμεύεται στη θέση διακλάδωσης Εξώνιο 1 GU Εσώνιο A AG Εξώνιο 2 5 GU U5 A U4 U6 AG 3 Έπειτα το προσυναρμολογημένο σύμπλοκο U4-U5-U6 συνδέεται με το σύμπλοκο U1, U2 και πρόδρομο μόριο mrna και έτσι τελικά σχηματίζεται το πλήρες σωμάτιο ματίσματος Εσώνιο Εξώνιο 1 Εξώνιο 2 Ανακατατάξεις του RNA στο σωμάτιο ματίσματος, ευθυγραμμίζουν τα 2 εξώνια για να ολοκληρωθεί η αντίδραση

33 Εναλλακτική συρραφή Το εναλλακτικό μάτισμα είναι ένας αρκετά διαδεδομένος μηχανισμός για τη δημιουργία πρωτεϊνικής ποικιλομορφίας. Συνιστά τη διαφορική συμμετοχή εξωνίων σε ένα ώριμο RNA Το εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να ρυθμίζεται για να παράγει διαφορετικές μορφές μιας πρωτεΐνης για ειδικούς ιστούς ή στάδια της ανάπτυξης Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 P Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 1 Exon 2 Exon 4

34 Μετα-μεταγραφική ωρίμανση του μεταφορικού RNA (trna) 5 1 Α A C C Α 3 3 A A C A A U G G C U A A U A C U A U C UAC 4 A A C A U A G y U Η ωρίμανση του trna περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1) Διάσπαση της αλληλουχίας οδηγού του 5 -άκρου 2) Αντικατάσταση της 3 -τελικής αλληλουχίας από την αλληλουχία CCA που είναι απαραίτητη για τη δέσμευση των αμινοξέων 3) Μάτισμα για την αφαίρεση του εσωνίου 4) Τροποποίηση μερικών βάσεων

35 Μετα-μεταγραφική ωρίμανση του ριβοσωμικού RNA (rrna) Η σύνθεση των rrna γίνεται στον πυρηνίσκο Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, τα γονίδια των rrna είναι επαναλαμβανόμενα. Η επαναλαμβανόμενη μονάδα μεταγραφής αποτελείται από τα 18S, 5.8S και 28S rrna και χωρίζεται από την επόμενη μονάδα μεταγραφής από μια συνδετική περιοχή που δεν μεταγράφεται. Η ωρίμανση των rrna, περιλαμβάνει την απομάκρυνση αλληλουχιών τόσο από τα άκρα όσο και από εσωτερικές περιοχές του προϊόντος μεταγραφής. Τα γονίδια των rrna συνήθως δεν περιέχουν εσώνια. Σε μερικούς κατώτερους ευκαρυωτικούς όπου συναντώνται εσώνια, η εκτομή τους γίνεται με αυτομάτισμα χωρίς τη συμμετοχή άλλων πρωτεϊνών.

36 Τι είναι γονίδιο; Τμήμα του DNA που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μιας πρωτεΐνης ή/και ενός μορίου RNA (mrna, trna, rrna, snrna, ncrnas όπως τα mirna κ.ά).

37 AGAG TATCTGCAGAGCATTCTTCTGTTCAGAAGATCTCAGTAGCTG AGGGTGTGTCTGCGAAGCCTGGTGCTTTCTAAATGAGCAAGCAAGCATCT TTGTATACTGCAGAGGGTTTGGGGATCCCTCAGCCTGTAGTCAGCAGATG TTGATTAAGCTTCTGATATGTGACAGTCACTGTTGTAGGTAGCATGTGCT TCCCCGGGAGGTGCTGGAGAGCAGTTCCAGGGCCAGGAACTGGGGCTGAG CTTATTGAGTATTGGTGAAAGAGGCTGGGATGTAATAGACTATCAGGGTT GGGTGTGTCTTAGGAAGTTAGGAATTAGGTGGAGCTGGGAGGCTGAATAT GGAGGCTTGGCATGGTTTGAAAATCTATATGGGATCTAGAACAGGACCAG GGCCTTGTCTTTGCAGGCATGCTGTGGGGGAAGCGAGGAGACAGATGTAG GGGAAACCTGGGCGTTAAGGGCTAATAGTGTCATTCCTCTTCATCCGTAT TGAGCACTTGAGGTGCTCTAAATGTGTGGCAGAAGTCAGGCTTTGAGTAT TCACAGCCATTCTCTGAGATAGATGCTCCTATTTCGTGCATTTACAATTA AGCATACTGAGTTGTGGGTTAGGGATTTTGAAGCTTTCTAGGAATTTTGA GATTGGATATTGTCTTATGAGTAGCAGATTTGACAGTCATGGGGAAGCTT ACAGCTGAAATATTCATATTTTTCTGAAGCCCTAATCAAGACATCCACCT GTTTGATGGATGATCTTTCAACTGCCTGACTGGGGAATCATATCAAAGAA TTTCCATGACATTGCAAAGGCTTTGTGCAGATGGCGATAGGTAAATGCCT CCTGTGAAGTTTTCCTTCGGCATGTCTTTCTGAAGTTTAGCGTTTTCATT TTAAAAATGGCATACTGGTTTTGCAGATCACTCAATGAAGTTTCCAACTT AGGTGTATAAATACAATTTGGGGGTGGTCCTCACCATCGAGGACAGTTGA TGCTCTAGGAAGCCGTGTGGTGTTTAAGGCATGGTGTTGAATATTGCCCA GCACATTGGCCTTGGGAAAGGTGGGTTTATAGGACTGTGGAACACACCCT TTGAAATCACAGTGCAGCACACACAAAAAACCTTGGTGTTGGCTTTGCCT CTTAGGAGGCCAGGGAATGAGGTCTTGAAGTTTGGATAGGTTGTTGGGGA AGCTGCGGGAATTGAGGAGTGAGATGTTAAAAGCGGAGGCCAGGGAGGCC TCCCTTTGACATAAGAGGCACCTGAGACCCAGAAAAAAGGAAGAGAATTG CTCCTAGTCCCTGGGGTGTCTGTGCTGGGTCCAGCGCCCACCCAAGCACA GGGTGAAGTGGGAGAAGGTGGAGGAGAGGAGGGGTGCCAGAGGGGATGCT GAGGGAGATAGTGTGGGGCCTTGAGGTCTTCATGTCTATCCTCTACTTCC ATCCTTTCTCCCGGGACCTCCACTCCAAACTCTCCCCCCTGGACCCCCAG GTGACCATGGAGGAAGAAGATGAGTCTCGAGGGAAGACAGAGGAGTCGGG GGAGGATCGGGGCGATGGTCCGCCAGACAGAGACCCCACGCTTTCTCCTT CTGCCTTTATCCTGGTGAGGCTGCTGGGCTCCTGGCACTGAGGGATGGAG GAGCTGGGCATCCACACTCCAGGGGCCTGACTCCAGGGCCTGAGGCAGGG GCGCTGGACTCTTGGCTCCCTTGAAGCACTTGAGTCTAGCTGTCAGTGTC TGGGATGTCTGTCTCCCAAGGGGCAGAGGTTGCAAAGCATCTGCCTGGGT CCTCTGACGCTTGGTTCTTCCCCCCTTCCCCAGCGAGCCATCCAGCAGGC TGTGGGAAGCTCCCTGCAGGGGGACCTGCCCAATGATAAAGGTATGGCGG CTTCCGGTTCCTTTTAGCCCCTGCCCCCTCTCTGCATTCTTTATCCTAAT GTCATTCATACAAGCTTTTCTGAAGCCTCCTGGGTGCCACCCTTGTGCTG GCATGGGGAGCCAAAAATGGGCAGACACCCTGTAGCTGCCTTGGAAGGGC

38 CCTAGCAGTATCTGCAGAGCATTCTTCTGTTCAGAAGATCTCAGTAGCTG AGGGTGTGTCTGCGAAGCCTGGTGCTTTCTAAATGAGCAAGCAAGCATCT TTGTATACTGCAGAGGGTTTGGGGATCCCTCAGCCTGTAGTCAGCAGATG TTGATTAAGCTTCTGATATGTGACAGTCACTGTTGTAGGTAGCATGTGCT TCCCCGGGAGGTGCTGGAGAGCAGTTCCAGGGCCAGGAACTGGGGCTGAG CTTATTGAGTATTGGTGAAAGAGGCTGGGATGTAATAGACTATCAGGGTT GGGTGTGTCTTAGGAAGTTAGGAATTAGGTGGAGCTGGGAGGCTGAATAT GGAGGCTTGGCATGGTTTGAAAATCTATATGGGATCTAGAACAGGACCAG GGCCTTGTCTTTGCAGGCATGCTGTGGGGGAAGCGAGGAGACAGATGTAG GGGAAACCTGGGCGTTAAGGGCTAATAGTGTCATTCCTCTTCATCCGTAT TGAGCACTTGAGGTGCTCTAAATGTGTGGCAGAAGTCAGGCTTTGAGTAT TCACAGCCATTCTCTGAGATAGATGCTCCTATTTCGTGCATTTACAATTA AGCATACTGAGTTGTGGGTTAGGGATTTTGAAGCTTTCTAGGAATTTTGA GATTGGATATTGTCTTATGAGTAGCAGATTTGACAGTCATGGGGAAGCTT ACAGCTGAAATATTCATATTTTTCTGAAGCCCTAATCAAGACATCCACCT GTTTGATGGATGATCTTTCAACTGCCTGACTGGGGAATCATATCAAAGAA TTTCCATGACATTGCAAAGGCTTTGTGCAGATGGCGATAGGTAAATGCCT CCTGTGAAGTTTTCCTTCGGCATGTCTTTCTGAAGTTTAGCGTTTTCATT TTAAAAATGGCATACTGGTTTTGCAGATCACTCAATGAAGTTTCCAACTT AGGTGTATAAATACAATTTGGGGGTGGTCCTCACCATCGAGGACAGTTGA TGCTCTAGGAAGCCGTGTGGTGTTTAAGGCATGGTGTTGAATATTGCCCA GCACATTGGCCTTGGGAAAGGTGGGTTTATAGGACTGTGGAACACACCCT TTGAAATCACAGTGCAGCACACACAAAAAACCTTGGTGTTGGCTTTGCCT CTTAGGAGGCCAGGGAATGAGGTCTTGAAGTTTGGATAGGTTGTTGGGGA AGCTGCGGGAATTGAGGAGTGAGATGTTAAAAGCGGAGGCCAGGGAGGCC TCCCTTTGACATAAGAGGCACCTGAGACCCAGAAAAAAGGAAGAGAATTG CTCCTAGTCCCTGGGGTGTCTGTGCTGGGTCCAGCGCCCACCCAAGCACA GGGTGAAGTGGGAGAAGGTGGAGGAGAGGAGGGGTGCCAGAGGGGATGCT GAGGGAGATAGTGTGGGGCCTTGAGGTCTTCATGTCTATCCTCTACTTCC ATCCTTTCTCCCGGGACCTCCACTCCAAACTCTCCCCCCTGGACCCCCAG GTGACCATGGAGGAAGAAGATGAGTCTCGAGGGAAGACAGAGGAGTCGGG GGAGGATCGGGGCGATGGTCCGCCAGACAGAGACCCCACGCTTTCTCCTT CTGCCTTTATCCTGGTGAGGCTGCTGGGCTCCTGGCACTGAGGGATGGAG GAGCTGGGCATCCACACTCCAGGGGCCTGACTCCAGGGCCTGAGGCAGGG GCGCTGGACTCTTGGCTCCCTTGAAGCACTTGAGTCTAGCTGTCAGTGTC TGGGATGTCTGTCTCCCAAGGGGCAGAGGTTGCAAAGCATCTGCCTGGGT CCTCTGACGCTTGGTTCTTCCCCCCTTCCCCAGCGAGCCATCCAGCAGGC TGTGGGAAGCTCCCTGCAGGGGGACCTGCCCAATGATAAAGGTATGGCGG CTTCCGGTTCCTTTTAGCCCCTGCCCCCTCTCTGCATTCTTTATCCTAAT GTCATTCATACAAGCTTTTCTGAAGCCTCCTGGGTGCCACCCTTGTGCTG GCATGGGGAGCCAAAAATGGGCAGACACCCTGTAGCTGCCTTGGAAGGGC GTCCTCCCCTTTTCATCCCATGGCCATCCCCCTTGGAACAGGCACAGCTC CCCTGGATTGAGTCTTTGCTCTGTACCCAGCCTGTGCCATGTCCTCCATG TGTGTCGCTGTAGTACTGCCCATAGGTGCTGTCCCCGTTTTACAAATGAG CCACAAAGGTGGCCAGGCACGGTGGCTCATGCCTGTAATTCCAACACTTC GCAAGGCCGAGGCGGGTGAATCGCTTGAGCCCAGGAGTTCAAGATCAGCT TGGGCAACATAGTGAGACCTAGTCGCCACAAAAAGTACAAGAATTAGCCA GGCGTGGGGGTGGCACATCTAGTCCCAGCTATTCAGGAGGCTGAGGTGGG AAGATCGCTTTAGCCCAGGAGACCAGGGGTACAGTGAGCAGTGATTGTGC CACTGCACTCCAGCCTGCATGACAATGAGAGACCCTGTCTCAAAAACAAA GAAACAAAAAAGGAGCCACAAAAAGGTTTGGCTGAGCATCCCCAGGGGTC AGAGACAGGGAGTGGCAGACCAGGCTTCTGATACAAATGGGCTCAAGGTC AGTCCCCACCCCCACTCCCCAGTGCCCCTCACCCCTAGCCACCCCCTCCA TCCCCTGGGTGACCAGAGCAGTACTGTAAAAACCTAAACTGAGTCCTCCC CGCTCCCGCGGTGAAAAGCCCTGTGCAGTTTTCTACAGCCCCGCCTCTAG AGTCTGATTCAAAACCAGCTGCAATTTCTTGGCCAATGCCTGTCTTCTCA TCAGACTGAACTTTGTGAGGGCAGGCGACACACATGTCCTGGTCCCGGCC AGGCCTGGAGCAGCCCAGGGTTCGGCCTGGAGGAGATGTTCAGTGACATG CAGAGGCCCAGGCCTGGCCTTTGGTCCCGGGCACCTGCAGCAGAGGGCGC ATGGGACAGACCCTCAGCAGGACTTCCAGCCTGAGAGCAGCTGGACGGCC AGAGAGGTTAGGCTGGCAGCAGAGGCGAGTGGAGGTGGAGGTTCCGCAGG TACTCACTGGCCCTTGCTGTGTCTTCCCCCGCTGTCGCCACCCCACCAGT ATCTGAAGAAGCTGCACACGCAGGAGCGGGCGGTGGAGGAGGTGAAGCTG GCCATCAAGCCATACTATCAGAAGAAGGACATCACCAAGGAGGAGTACAA GGACATCCTGAGGAAGGCCGTCCACAAGGTGGGCACCCGGAGAGAGGGGC AGACACAGGCCGGGGAGAGAACGAGCTGGAGGGACAGATGTGTGCAGACA GATGGACGCGGATGGGAGACGGGGAGGAGGTCAGTCTGGGAGGTGAGGAG GGTGACAGGATTTTCTCAAGGCCACCTGGGCCTGTTCCGCTGGCCCTGGG GCACCCATCGTCTAGGGGGACAGAGGGACTTTGGCCTGGTTATTGGGGAA GCTCCTCCTACCGCAGTTCCAAGCTGCGCCCAACAGTCCTGGGTGGATGG GGCCCCGGGAGCCTGGTGGTGACTCCAACTGTCCCCGGCCCCCCAGATCT GCCACAGCAAAAGTGGGGAAATCAACCCAGTGAAGGTGAGCAACCTGGTG CGGGCCTACGTCCAGCGCTACCGCTACTTCCGCAAGCACGGTCGCAAGCC AGGGGACCCCCCAGGGCCCCCACGGCCGCCCAAGGAGCCAGGGCCCCCAG ACAAGGGTGGCCCGGGCCTGCCCCTGCCCCCTCTCTGAGAGCCCTGGCCA GCTCTTCGCCCCTCACCTCTTTGAAACTCTGGACGTATTTATGGCTCCAC CTCCCCACCTCCCTCCCCCGTCAGTGGGATGACTGGGGGAGGGTTGCTGC AGGGAAGAGGAGAGCCCCCTGCCCTGCCCTGCCCCGTGTCCACCTCCCTT GCCCCCAAGCCTGTCCCCAGTGCCCCTCCCTTCTGTTTGTGCCCCTCTCC CCAATTTCATTAAAGATTTCATGAAACATTACCCCTGAGCCCCATGGTTC TAACCCTTTGTTTTCGGAGACAAATTTGCCAGAGGGTTGGGGAGGGACCC CCAGGAGGCTGAGGATGGGAGACAGAGACCAGACTGTGACTTGGGGCAGC

39 Μη κωδικά μόρια RNA (ncrnas) Τα μη κωδικά μόρια RNA αποτελούν μη-μεταφραζόμενα σε πρωτεΐνες μετάγραφα RNA τα οποία μπορούν να κατηγοριοποιηθούν, ανάλογα με το μέγεθός τους, σε: short ncrnas (<200nt) and long ncrnas (>200nt).

40 Μη κωδικά μόρια RNA (ncrnas) Περισσότερο από το 80% του ανθρώπινου DNA είναι μεταγραφικά ενεργό Ωστόσο, λιγότερο από το 3% κωδικοποιεί πρωτεΐνες Kentaro Inamura. Cells (2017)

41 Μικρά μη κωδικά μόρια RNA Μικρά πυρηνικά RNA (snrna): RNU 7SK small nuclear RNA Small ILF3/NF90-associated RNA 7SL μικρά κυτταροπλασματικά μόρια RNA (scrna) micrornas (mirnas) Piwi-interacting RNA (pirna) Ριβοσωμικά RNA (rrna): 5S rrna 5.8S rrna Μεταφορικά μόρια RNA (trna) Ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωματίδια (Vault RNA; vtrna) Y RNA Θραύσματα RNA με λειτουργικό ρόλο

42 ΜicroRNAs (mirnas) Ενδογενή, μικρά, μη-κωδικά, ρυθμιστικά μόρια RNA. Παράγονται μέσω μιας σχετικά πολύπλοκης βιοσυνθετικής πορείας που περιλαμβάνει αρκετά στάδια ωρίμανσης. Ρυθμίζουν, σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, την έκφραση πολυάριθμων γονιδίων που εμπλέκονται σε σημαντικές κυτταρικές διεργασίες από την κυτταρική διαφοροποίηση μέχρι την απόπτωση. Μηχανισμοί Ρύθμισης 1. Αποικοδόμηση του mrna στόχου 2. Αναστολή της μετάφρασης του mrna στόχου Ένα mirna μπορεί να ρυθμίζει της έκφραση πολλών γονιδίων και ένα γονίδιο μπορεί να ρυθμίζεται από πολλλαπλά mirnas.

43 ΜicroRNAs (mirnas) Miyoshi K et al, Mol Genet Genomics. 2010;284:

44 Άλλες κατηγορίες μικρών μη κωδικών μορίων RNA Μικρά Πυρηνισκικά RNA (snorna): RNU (RNU3P1, RNU3P2, RNU3P3, RNU3P4, RNU86, RNU105A, RNU105B, RNU105C) Small nucleolar RNA, A/B box (SNORA) Small nucleolar RNA, C/D box (SNORD) Small Cajal body-specific RNA (scarna) Μη κωδικά μόρια RNA, τα οποία σχετίζονται με θέσεις έναρξης της μεταγραφής (Transcription Start Site; TSS) γονιδίων: Μικρά RNA μόρια που σχετίζονται με τους υποκινητές γονιδίων (PASRs) TSS-σχετιζόμενα RNAs (TSSa-RNAs), Μετάγραφα ανοδικά του υποκινητή (PROMPTs)

45 Μικρά πυρηνισκικά RNA (snorna) Τα μικρά πυρηνισκικά RNA (snοrna), συχνά αναφερόμενα ως οδηγοί RNA, είναι μια ομάδα μικρών μορίων RNA τα οποία έχουν σαν κύριο ρόλο να καθοδηγούν χημικές τροποποιήσεις άλλων μορίων RNA, συμπεριλαμβανομέων των rrna, trnas και snrna, Υπάρχουν δυο κύριες υποομάδες snorna: Τα snorna με C/D box σχετίζονται με τη μεθυλίωση του RNA Τα snorna με H/ACA box σχετίζονται με την ψευδοουριδυλίωση του RNA

46 Small Cajal body-specific RNA (scarna) Τα μικρά RNA που παράγονται ειδικά από τα σωμάτια Cajal (scarna) αποτελούν μια ομάδα snorna που εντοπίζονται ειδικά στο σωμάτιο Cajal, ένα πυρηνικό οργανίδιο που εμπλέκεται στη βιογένεση των μικρών πυρηνικών ριβονουκλεοπρωτεϊνών (snrnps). Καθοδηγούν την τροποποίηση (μεθυλίωση και ψευδοουριδυλίωση) των RNA U1, U2, U4, U5 και U12 που απαρτίζουν το spliceosome και που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II. Τα περισσότερα scarna δεν διακρίνονται δομικά και λειτουργικά από τα snorna, καθώς καθοδηγούν την τροποποίηση των rrna στον πυρηνίσκο.

47 Θραύσματα RNA με λειτουργικό ρόλο Πολλά μικρά μη κωδικά RNA κόβονται με πολύ συγκεκριμένο τρόπο, δημιουργώντας έτσι πολύ σταθερά, λειτουργικά θραύσματα RNA, με μήκος παρόμοιο με αυτό των mirnas αλλά με εν μέρει διαφορετικές λειτουργίες: trna fragments (trf) trna halves / trna-derived, stress-induced RNA (tirna) processed snornas (psnorna) / snorna-derived RNA (sdrna) rrna fragments

48 Θραύσματα trna (trf / tirna / trna halves) trf: Μερικά από τα θραύσματα αυτά προέρχονται από πρόδρομα μόρια trna, ενώ άλλα προέρχονται από ώριμα κυτταροπλασματικά trna. Μερικά trf έχουν διαρκή παρουσία σε όλα τα κύτταρα, ενώ άλλα δημιουργούνται μόνο σε κύτταρα που εκτίθενται σε συνθήκες στρες. Τα επίπεδά τους ποικίλουν μεταξύ διαφόρων κυτταρικών τύπων και ιστών. Δεν εμφανίζουν συσχέτιση γενικώς με τα επίπεδα των trna από τα οποία προέρχονται. Παρά το γεγονός ότι τα θραύσματα trna παρουσιάζουν ετερογένεια όσον αφορά το μέγεθός τους (10 45 νουκλεοτίδια), δεν είναι προϊόντα τυχαίου κοψίματος των trna ή αποικοδόμησής τους, διότι τα άκρα τους είναι συγκεκριμένα. Τα ώριμα trna και τα pre-trna μπορούν να κοπούν σε διαφορετικές θέσεις και να δημιουργήσουν έτσι διάφορα λειτουργικά θραύσματα.

49 SncRNAs ως νέοι και πολλά υποσχόμενοι βιοδείκτες καρκίνου Δύο κύριοι λόγοι για την αύξηση ερευνητικού ενδιαφέροντος για την μελέτη του δυναμικού των ncrnas ως πιθανοί βιοδείκτες καρκίνου: 1. Μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό λειτουργικό ρόλο στην ανάπτυξη του και την εξέλιξη του καρκίνου. 2. Είναι σταθερά και ανιχνεύσιμα σε ιστούς (συμπεριλαμβανομένου και παραφινο-ποιημένων δειγμάτων), ορό/ πλάσμα, ούρα, σάλιο κ.λ.π καθιστώντας τα ιδανικούς υποψηφίους ως βιοδείκτες καρκίνου. Πολλές μελέτες εξετάζουν το προφίλ έκφρασης των SncRNA και την σχέση τους με την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο, την υποτροπή, ή τη μετάσταση. Διάφορες κλινικές μελέτες που εξετάζουν τα mirnas ως βιοδείκτες καρκίνου βρίσκονται σε εξέλιξη : π.χ. Καρκίνωμα νεφρού (NCT ), οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (NCT ), κλινική μελέτη φάσης ΙΙ για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NCT ) κ.α.

50 Μεγάλα μη κωδικά μόρια RNA (LncRNAs) Κλασικά Long - non coding RNAs (lncrna, lnrnas): για παράδειγμα HOTAIR, XIST, MALAT1 Long intergenic non-coding RNA (lincrna) Ribosomal RNA (rrna): 18S rrna 28S rrna Μιτοχονδριακό 12S RNA Μιτοχονδριακό 16S RNA RMRPs, RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease RPPH1, Ribonuclease P RNA component H1 TERC, Telomerase RNA component

51 lncrnas στη Μοριακή Ογκολογία Επαγωγή της νεοπλασματικής εξαλλαγής μέσω της δυσλειτουργίας ουσιωδών βιολογικών διεργασιών : Μεταγραφική και Επιγενετική ρύθμιση Απόπτωση Επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή (epithelial to mesenchymal transition -EMT) Ρόλος-κλειδί στην αιτιοπαθογένεια της νόσου, δρώντας ως : Ογκογόνα μόρια (HOTAIR, ANRIL, MALAT1, HULC e.t.c.) Ογκοκατασταλτικά μόρια (LincRNA-p21, GAS5, MEG3 e.t.c.) Τα μόρια αυτά θεωρούνται ιδανικά για την χρήση τους ως βιοδείκτες καρκίνου: (i) Εμπλέκονται σε διάφορα στάδια της δημιουργίας και της εξέλιξης του καρκίνου και τα επίπεδα έκφρασής τους μεταβάλλονται σε ασθενείς με τη νόσο. (ii) Σχετικά μεγάλη σταθερότητα σε ιστολογικά δείγματα και διάφορα βιολογικά υγρά. (iii) Μπορούν να προσδιοριστούν με σχετικά χαμηλού κόστους μεθοδολογίες.

52 lncrnas ως μοριακοί βιοδείκτες καρκίνου Διάγνωση: 1. Καρκινικό προστατικό αντιγόνο PCA3. Μέτρηση του mrna του γονιδίου στα ούρα και υπολογισμός του PCA3 score (Εγκεκριμένο από τον FDA, 2012) 2. Ανίχνευση της έκφρασης του UCA1 (Urothelial Carcinoma-Associated 1) σε ίζημα ούρων. Πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως Πρόγνωση: 1. HOTAIR: Ισχυρός δυσμενής προγνωστικός δείκτης όσον αφορά την ελευθέρα νόσου και την ολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του μαστού. 2. MALAT1: Υπερέκφραση σε μεταστατικούς όγκους μη-μικροκυτταρικού καρκινώματος του πνεύμονα αλλά και ανεξάρτητος βιοδείκτης δυσμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς με όγκους αρχικού σταδίου. Πρόβλεψη της ανταπόκρισης των ασθενών στην θεραπεία: 1. XIST: συσχέτιση με την ανταπόκριση στη θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο ωοθήκης. 2. Η έκφραση του MALAT1 στο οστεοσάρκωμα, σχετίζεται με φτωχή ανταπόκριση στη θεραπεία.

53 lncrnas ως θεραπευτικοί στόχοι ή ρυθμιστές Στόχοι για την ανάπτυξη νέων θεραπειών : Κατασκευή του φορέα DNA BC-819 (DTA-Η19), που φέρει το γονίδιο της τοξίνης της διφθερίτιδας Α (DTA) υπό τον έλεγχο μεταγραφικών ρυθμιστικών αλληλουχιών του lncrna Η19. Το πλασμίδιο BC-819 εκμεταλλεύεται την ιστοειδική έκφραση του Η19 και λειτουργεί ως «δούρειος ίππος» για να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα μέσω της έκφρασης της DTA. Η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα του BC-819 φορέα αξιολογείται σε τρέχουσας κλινικές δοκιμές και, μέχρι στιγμής, έχουν ολοκληρωθεί μελέτες φάσης Ι / ΙΙ στον καρκίνο του παγκρέατος και της ουροδόχου κύστης. Ως ρυθμιστές: Η sirna-επαγόμενη επιλεκτική αποσιώπηση ορισμένων γονιδίων των lncrna, μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ευαισθησίας των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (π.χ. αποσιώπηση του HOTAIR σε καρκινικά κύτταρα ήπατος οδηγεί σε αύξηση της ευαισθησίας τους, στη σισπλατίνη και τη δοξορουβικίνη). Στόχευση ορισμένων αλληλεπίδρασων mirna-lncrna αποτελεί μια νέα θεραπευτική στρατηγική.

54 Μηχανισμοί δράσης των lncrnas Rodrıguez et.al. Brief. Functional Genomics (2015) A. Επιγενετική αποσιώπηση με τη στρατολόγηση συμπλεγμάτων αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης (π.χ. PCR2). B. Ρύθμιση σταθερότητας mrnas μέσω αλληλεπίδρασης lncrnas και των Staufen πρωτεϊνών (STAU). C. Ρύθμιση μεταγραφής μέσω πρόσδεσης σε μεταγραφικούς παράγοντες, η οποία οδηγεί στην καταστολή της ικανότητάς τους να προσδένονται σε υποκινητές. D. Ρύθμιση (επαγωγή ή καταστολή) της μετάφρασης των mrnas. E. Έλεγχος του εναλλακτικού ματίσματος μέσω ρύθμισης της φωσφορυλίωσης των SR παραγόντων συρραφής F. Δρουν ως ενδογενή μόρια RNA-ανταγωνιστές μέσω της πρόσδεσής τους σε micrornasστόχους.