خلاصه مقدمه مقاله پژوهشي ليزرپزشكي 1390 دورة 8 شمارة 1 صفحات: محمدرضا باغبان اسلامي محمدباقر شيران ليلا روحي پژوهشگاه رويان گروه ژنتيك

Transcript

1 و 1 و 3 مقاله پژوهشي ليزرپزشكي 1390 دورة 8 شمارة 1 صفحات: فراصوت كمتوان تكثير و انديكسهاي رشد سلولهاي بنيادي بالغين 1 داريوش همراهي 2 حميد گورابي محمدرضا باغبان اسلامي 4 محمدباقر شيران 5 ليلا روحي 3 نژاد 1 كارشناسي ارشد فيزيك پزشكي پژوهشگاه رويان 2 پژوهشگاه رويان گروه ژنتيك 3 دكتراي علوم تشريح پژوهشگاه رويان گروه سلولهاي بنيادين بالغين 4 دكتراي فيزيك پزشكي گروه فيزيك پزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران 5 دكتراي زيستشناسيتكوين جانوري دانشگاه آزاد اسلامي واحد شهركرد نويسندة مسي ول: محمدباقر شيران گروه فيزيك و مهندس پزشكي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات درماني تهران تلفن: پست الكترونيك: mshiran@tums.ac.ir خلاصه مقدمه: هدف از اين مطالعه بررسي اثر فراصوت كمتوان بر تكثير و انديكسهاي رشد در سلولهاي بنيادي جداشده از مغز استخوان رت در محيط آزمايشگاهي است. I mw/cm 2 تابانيده شد. مغز روش بررسي: موج فراصوت در مد پيوسته با فركانس 3MHz و با شدت 355= Ave P I/ استخوان از استخوانهاي فمور و تيباي رت گرفته شد و در محيط حاوي سرم جنين گاوي كشت داده شد. سلولهاي خالصشدة پاساژ سوم تحت تابش فراصوت قرار گرفت و در طي دورة هفتروزة كشت تكثير شد و انديكسهاي رشد آنها بهوسيلة محاسبة دوبرابرشدگي جمعيتي (PDN) و نيز رسم منحني رشد مورد بررسي قرار گرفت. هر آزمايش سه بار و براي ده نمونه تكرار شد و ميانگين نتايج بهوسيلة نرم افزار SPSS نسخة 16 مورد ارزيابي قرار گرفت. يافتهها: دادههاي منحني رشد افزايش معنيداري را در گروه فراصوت نسبت به كنترل نشان ميدهد (0/004>p) دادههاي دوبرابر شدگي جمعيتي در گروه فراصوت 5/79±17/39 و در گروه كنترل 14/08±4/69 با 0/005>p بود. سلولهاي مورد استفاده بهراحتي به ردههاي استخواني و چربي تمايز داشتند كه نمايانگر ماهيت بنيادي آنها بود. بحث و نتيجه گيري: دركل پيشنهاد ميشود كه LIUS توانايي بهبود و پيشبرد تكثير و انديكسهاي رشد سلولهاي MSc را درشرايط آزمايشگاهي دارد. واژههاي كليدي: فراصوت كمتوان سلول بنيادي مزانشيمي تكثير انديكسهاي رشد مقدمه نوسانات مكانيكي يكي از فاكتورهاي اساسي در پيشبرد تكثير رشد و تمايز سلولها در پيوند سلولي و بافت بهشمار ميآيند [1]. روشهاي مختلفي براي نيل به اين هدف مورد استفاده قرار گرفتهاند كه ازآن جمله ميتوان به اعمال بار مكانيكي استفاده از لرزانندهها و موج فراصوت كمتوان اشاره نمود ] 2]. امواج فراصوت كمتوان در مهندسي بافت بهعنوان يك عامل مو ثر كاربردي نقش مهمي را ايفاء ميكنند. اين امواج توانايي افزايش بيان ژنهاي خاص وابسته به تكثير توانزيستي و تمايزي سلولهاي مختلف را دارا ميباشند [1 4]. در برخورد با ديگر ميكروارگانيسمها نيز امواج فراصوت قابليت خود را در افزايش تكثير و رشد نشان دادهاند[ 5 ]. از امواج فراصوت بهعنوان كميت فيزيكي غيرتهاجمي در مصارف پزشكي نيز استفاده ميشود [6]. نشان داده شده است كه امواج فراصوت كم توان توانايي ترميم شكستگيهاي استخواني را بهصورت معنيداري افزايش ميدهند [7]. آنچه كه از مطالعة برهمكنش فراصوت با ردههاي سلولي مختلف برميآيد اين است كه امواج توانايي افزايش بيان ژنهاي مختلف نظير پروتي وگليكانها TGFها انواع مختلف كلاژن و... را دارا ميباشند [8-12]. تحقيقات انجام شده در اين زمينه توسط Chapman نشان داده است كه فراصوت توانايي افزايش ورود و خروج يون پتاسيم را به درون سلول دارا ميباشد[ 13 ]. Ryaby و همكاران نشان دادهاند كه فراصوت باعث افزايش ميزان كلسيم در فرآيندهاي رشد و تمايز سلولهاي كشتشدة غضروف و استخوان و نيز افزايش نرخ متابوليسم آنها در محيط كشت ميشود [14-16]. افزايش اين پيامبر ثانويه در سلول باعث افزايش فعاليت آدنيلات سيكلاز و TGF-β و سنتز استي وبلاستها خواهد شد [16]. Wu و همكاران با اثر دادن فراصوت بر سلولهاي غضروف نشان دادند كه موجب افزايش بيان و تنظيم ژن پروتي وگليكان و افزايش نرخ ترميم آن خواهد شد [17]. از طرفي با پيشرفت روز افزون دانش زيستشناسي و پزشكي و كشف سلولهاي بنيادي اتقلابي در مهندسي بافت و طب ترميمي بهوجود آمده است [ و 22]. سلولهاي بنيادي بالغين با توجه به در دسترس بودن قابليت كشت بالا و توان تمايزي مناسب بهعنوان منبع مناسبي در طب ترميمي بهشمار ميروند [21 و 22]. در اين ميان سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان از اهميت ويژهاي برخوردارند زيرا تقريبا در تمام گونهها ٢٩

2 داريوش همراهي و همكاران ٣٠ بهوفور يافت ميشوند و اولين كانديد براي جداسازي و استفاده در پيوند به ويژه بافت استخوان ميباشند [23]. توجه خاص به كوتاه نمودن پروسة كشت در اين سلولها از ديرباز دغدغة محققان بوده است. چنانكه در اين مورد از مواد شيميايي بسياري كمك گرفته شده است [23 24 و 25-33] در اين راستا هدف از انجام اين تحقيق استفاده از فراصوت بهعنوان يك كميت فيزيكي ارزان و در دسترس بهعنوان عامل پيشبرندة رشد و افزايندة تكثير با هدف كاهش مدت زمان دورة كشت ميباشد. روش بررسي كشت و جداسازي سلولهاي مزانشيمي: تعداد 10 سر رت نژاد Wistar با سن تقريبي 8-10 هفته بهوسيلة كلروفرم بيهوش شدند و استخوانهاي فمور و تيبيا جدا گرديد. بافت نرم اطراف آنها پاك شد و داخل محيط DMEM (Dulbecco s USA) Minimum Essential Medium. Gibco. محتوي 15 درصد (Gibco) FBS و 100 واحد بين المللي استرپتومايسين Germany) (Gibco, و 100 واحد بين الملل پنيسيلين Germany) (Gibco, قرار گرفت. مغز استخوان از چهار استخوان دراز تيبيا و فمور بهروش Flashing جدا شد و در داخل يك لولة حاوي 13 ميليليتر محيط DMEM و آنتيبيوتيك قرار گرفت. سلولهاي فوق پس از يكبار سانتريفوژ با دور 1200 در دقيقه و به مدت 5 دقيقه به يك فلاسك 75 سانتيمتر مربع حاوي 12 ميليليتر محيط DMEM محتوي آنتيبيوتيك و 15 درصد FBS منتقل شدند و در شرايط 5 درصد CO2 و دماي 35 درجة سانتيگراد و رطوبت اشباع كشت داده شدند. 48 ساعت پس از آغاز كشت سلولهاي غيرچسبنده با انجام تعويض محيط و شستشو با PBS+ دور ريخته شدند و پس از آن محيط سلولها 2 روز يكبار تعويض شد. 10 روز پس از آغاز كشت درصد كف ظرف پر از سلول شد كه در اين زمان اولين پاساژ سلولي انجام گرفت. سلولها تا سه پاساژ با هدف ترموكوپل نوع T با ضخامت حدود 0/5 ميليمتر استفاده شد. بعد از يافتن Maximum) LAM (Last Axial شدت و زمان مناسب براي آزمايش بر مبناي ثابت بودن دماي درون ظرف كشت در ناحية LAM و در پليت 12 چاهكي بهدست آمد (كمتر از 1 درجة سانتيگراد افزايش دما مجاز بود). علت استفاده از ظرف كشت 12 چاهكي انطباق آن با ابعاد ميدان فراصوت بود. براي اطمينان از صحت آزمايش دما در دو طرف درون و بيرون چاهك و نيز در 2 ميليمتري كف آن در محيط آب براي شدت انتخاب شده mw.cm-2) 355) بهدست آمد[ 9 ]. رسم منحني رشد Curve) :(Growth سلولهاي تقريبا خالص از پاساژ دوم با تخلية محيط رويي دوبار بهوسيلة محلول PBS شسته شدند و سپس تحت اثر آنزيم تريپسين از كف ظرف جدا شدند. پس از شمارش سلولي توسط لام ني وبار تعداد سلول در هر چاهك از ظرف كشت 12 چاهكي محتوي محيط كشت 15 درصد DMEM +FCS كشت داده شدند و در شرايط دماي 37 درجة سانتيگراد و 5 درصد CO2 و رطوبت 80 درصد در انكوباتور نگهداري شدند. به سلولها مدت 24 ساعت فرصت داده شد تا به كف ظرف كشت خود بچسبند. براي هر نمونه نمونة روزكنترل نيز لحاظ شد و نمونة مورد آزمايش تحت تابش امواج فراصوت قرار گرفت. محيط سلولها هر دو روز يكبار تا پايان آزمايش در هر دو گروه كنترل و شاهد تعويض شد و محيط تازه در اختيار سلولها قرار گرفت. در اتمام هر روز و بهمدت 7 روز پيدرپي سلولها مجددا تريپسينه شدند و بهوسيلة لام ني وبار شمارش ميشدند. دوبرابر شدگي جمعيتي و دوبرابر شدگي جمعيتي كل (Population Doubling and Total Population Doubling Number): دوبرابر شدگي جمعيتي كميتي است كه نشاندهندة تعداد دفعات دوبرابر شدن يك سلول در يك دورة كشت ميباشد [35]. براي بهدست آوردن مقدار آن با استفاده از دادههاي يك دورة كشت محدود و دانستن تعداد اوليه و تعداد سلولها در انتهاي دوره با فرمول رياضي: PD = Ln N N بهدست ميآيد. كه در آن N0 تعداد اولية سلولها در ابتداي دورة كشت و N تعداد شمارش شدة سلولها در هر روز شمارش كشت خواهد بود. دوبرابر شدگي جمعيتي كل با استفاده از فرمول فوق و تنها با جايگذاري N بهعنوان تعداد كل نهايي سلولها بهدست خواهد آمد. بررسي ماهيت بنيادي مزانشيمي سلولها: سلولهاي پاساژ سوم براي بررسي ماهيت بنيادي مزانشيمي به دو ردة استخوان و چربي در محيطهاي القاء تمايزي به مدت 21 روز تمايز داده شدند. رنگآميزي آليزارين رد و تكنيك RT-PCR براي ژنهاي آلكالين فسفاتاز استي وكلسين و استي وپونتين براي بررسي تمايز به رسيدن به جمعيتي تقريبا خالص از rmscs پيش برده شدند و از سلولهاي پاساژ سوم براي انجام طرح استفاده شد. تابش فراصوت: دستگاه فراصوت مدل Germany) (Phyaction,190i با فركانس 3MHz براي كاهش و حذف پديدة حفرهسازي انتخاب شد[ 6 ]. كاليبراسيون منبع فراصوت با استفاده از روش فشار تابشي انجام شد. در اين روش با استفاده از يك ترازوي با دقت بالا (حدود 0/001 گرم) فشار تابشي موج فراصوت اندازهگيري گرديد. ناحية دورترين فاصلة محوري با استفاده از كاغذ و رنگ بهدست آمد و از شكل بهدست آمده براي ميدان فراصوت براي محاسبة بيشترين شدت (PeakIntensity) استفاده شد [33]. براي يافتن منطقة دقيق آن از

3 فصلنامة ليزر پزشكي دورة 8 شمارة 1 فراصوت كم توان تكثير و انديكسهاي... Primers of Osteogenic genes Primers of adipogenic genes Housekeeping gene Osteopontin Osteocalcin Alkaline phosphatase PPAR-alpha PPARgamma2 C/EBP-alpha GAPDH 5 -GATTATAGTGACACAGAC bp 5 -AGCAGGAATACTAACTGC GTCCCACACAGCAACTCG bp 5 -CCAAAGCTGAAGCTGCCG CGGACCCTGCCTTACCAACTCATTTGTG CC CGCACGCGATGCAACACCACTCAGG bp 5 -CCCTGCCTTCCCTGTGAACTGAC bp 5 -GGGACTCATCTGTACTGGTGGGG-3 5 -GGTGAAACTCTGGGAGATCCC bp 5 -CTCCATCTCTGCCACGGGCT-3 5 -ACGTGGAGACGCAGCAGAA bp 5 -AGGCGGTCATTGTCACTGG-3 5'-TCGGTGTGAACGGATTTG-3' 5'ACTCCACGACATACTCAGCAC-3' 612 bp جدول 1: توالي پرايمرهاي مورد استفاده در طرح Cells Number(*10^3) Days US Control استخوان و رنگ آميزي اويل رد و تكنيك RT-PCR براي ژنهاي PPAR-α, PPAR-γ, C/EBP-α براي بررسي تمايز به چربي استفاده شد [35]. توالي پرايمرهاي مورد استفاده در طرح در جدول 1 آمده است. آزمون آماري و حجم نمونه: تعداد 10 نمونه در سلول در اين تحقيق مورد استفاده قرار گرفت و هر نمونه داراي سه تكرار بود. درنهايت ميانگين دادهها با استفاده از آزمون آماري t-test مورد بررسي و آناليز قرار گرفت. نرمافزار مورد استفاده SPSS نسخة 16 بود. نتايج منحني رشد: اختلاف معنيداري ميان ميزان رشد سلولها در دو گروه فراصوت و كنترل وجود دارد (0/005 p). در اين پاساژ سلولهاي گروه فراصوت داراي فاز lag تقريبا مشابهي بودند. فاز log در گروه فراصوت با شيب تندتري نسبت به گروه كنترل نشان داده شد و تقريبا از روز ششم به فاز platue رسيد اين درصورتي بود كه در گروه كنترل فاز log از شيب كمتري برخوردار بود و نيز ديرتر به فاز platue رسيد (شكل 1 ). دوبرابر شدگي جمعيتي: و مقدار PD كل در نمونة فراصوت 5/79 ± 17/3924 و براي نمونة كنترل مقدار آن برابر 14/07819±4/69 بود (0/004 p) (شكل 3). بررسي ماهيت تمايزي سلولهاي بنيادي: رنگ آميزي Oil-Red براي نمايش تمايز به چربي و رنگآميزي شكل 1 : منحني رشد سلولهاي بنيادي تحت تا ثير فراصوت در دورة 7 روزة كشت (I=355mW/cm 2, Frequency=3MHz) Alizarin-Red براي بررسي تمايز به استخوان مو يد ماهيت بنيادي سلولهاي مورد استفاده در طرح بود (شكل الف و ب 4 ). نتايج RT-PCR مكمل قطعيت تمايز به دو ردة استخوان و چربي بود (شكل 5 ). مقدار PD براي نمونة كنترل 5/63±0/006 و براي نمونة فراصوت 6/71 ± 0/16 اختلاف آنها نيز معنيدار بود (0/005 p) (شكل 2 ). ٣١

4 ب: داريوش همراهي و همكاران 9 Population Doubling No US Co Days شكل 2 : دوبرابر شدگي جمعيتي سلولهاي بنيادي تحت تا ثير فراصوت در دورة 7 روزة كشت (I=355mW/cm2, Frequency=3MHz) شكل 5 : الف) نتايج RT-PCR نمايانگر تمايز به استخوان شكل 3: دوبرابر شدگي جمعيتي كل سلولهاي بنيادي تحت تا ثير فراصوت در دورة 7 روزة كشت (I=355mW/cm2, Frequency=3MHz) =*P<0.004 شكل 5 ( نتايج RT-PCR نمايانگر تمايز به چربي بحث و نتيجه گيري استفاده از امواج فراصوت در شرايط آزمايشگاهي و تحقيقات در مورد شكستگيها برروي مدلهاي حيواني مختلف نشاندهندة اثرهاي برانگيزشي انرژي اين امواج بر فعاليتهاي درون سلولي آزاد شدن سايتوكانها و افزايش سرعت بهبود در شكستگيها ميباشد[ 36 و 37]. فراصوت كمتوان با افزايش مقدار كلسيم درونسلولي اثر مستقيم خود را بر فرآيندهاي فيزيولوژيك سلول خواهد گذاشت كه اثر ويژة افزايش كلسيم درون سلولي راهاندازي مسيرهاي سيگنالي بيان ژنهاي تكثيري است [ و 39]. در اين تحقيق با توجه به حذف اثر حرارتي LIUS سعي بر بررسي اثر خالص موج فراصوت بر سلولها بوده است. اين اثر را به نام micro streaming گويند [ و 41]. اين اثر باتوجه به توانايي انتقال انرژي بهوسيلة LIUS در محيط شكل 4 : الف) تمايز Osteogenic و رنگآميزي Alizarin-Red شكل 4 ب: ( تمايز Adipogenic و رنگآميزي Oil-Red ٣٢

5 فصلنامة ليزر پزشكي دورة 8 شمارة 1 فراصوت كم توان تكثير و انديكسهاي... بيولوژي و in vitro و ايجاد تغيير در ساختارهاي فضايي مولكولهاي حياتي افزايش ميزان كلسيم درونسلولي افزايش مقدار درونبرد و برونريز يونهاي ديگر در نهايت باعث افزايش توان تكثير و انديكسهاي رشد در سلولهاي بنيادي شده است. در مطالعات قبلي LIUS با شرايط مشابه نشان داده است كه توانايي برانگيزش مسيرهاي تمايزي به استخوان را در شرايط محيط كشت بدون حضور مواد شيميايي دارا ميباشد [9]. بهنظر ميرسد با استفاده از LIUS در پروسة كشت و مهندسي بافت استخوان ميتوان علاوه بر كوتاه نمودن دورة كشت به سلولهاي داراي ژنهاي بيانشده در مقياس mrna و افزايش بهره در مهندسي بافت استخوان دست يافت. پيشنهادها در مهندسي بافت استخوان معضل توان زيستي سلولهاي پيوند شده در محل همواره باعث القاي آپپتوز و كاهش بهرهوري پيوند شده است. بهنظر ميرسد در صورت بررسي اثر LIUS بر توان زيستي MSCs بتوان به نتايجي دست يافت كه شايد افزايشدهندة ميزان بهرهوري از پيوند باشد. References 1. Takeuchi R. Low-intensity pulsed ultrasound activates the phosphatidylinositol 3 kinase/akt pathway and stimulates the growth of chondrocytes in three-dimensional cultures: a basic science study. Arthritis Research & Therapy 2008; Meng QQ. Enhanced antitumor effects of lowfrequency ultrasound combined with adriamycin on human leukemia multidrug resistance cell line K562/A02. Chinese Journal of Cance 2008; 27(11): Tsai WC. Ultrasound stimulation of types I and III collagen expression of tendon cell and upregulation of transforming growth factor beta. J Orthop Res 2006; 24(6): Iwashina T. Low-intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation and proteoglycan production in rabbit intervertebral disc cells cultured in alginate. Biomaterials 2006; 27(3): Pitt WG, Ross SA. Ultrasound increases the rate of bacterial cell growth. Biotechnol Prog 2003; 19(3): Wells PNT, Biomedical Ultrasonics. Academic Press Harle J, Olsen FM, Salih V. Effects of ultrasound on transforming growth factor-b genes in bone cells. European Cells and Materials 2005; 10: Ding Y. Effect of low-intensity pulsed ultrasound on bone formation during mandible distraction osteogenesis in a canine model--a preliminary study. J Oral Maxillofac Surg 2009; 67(11): Hamrahi D, Shiran MB, Bagheban Eslaminegad MR, Gourabi H, Rohi L. Effect of low- Intensity Ultrasound on Osteogenic Differentiation of Rat Bone- Marrow Mesenchymal Stem Cell: An in vitro study. Lasers in Medicine 2008; 5(2): Kobayashi Y. Low- intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation, proteoglycan synthesis and expression of growth factor related genes in human nucleus pulposus cell line. European Cells and Materials 2009; 17: Chan CW. Dose-dependent effect of low-intensity pulsed ultrasound on callus formation during rapid distraction osteogenesis. J Orthop Res 2006; 24(11): Eberson CP. Effect of low-intensity ultrasound stimulation on consolidation of the regenerate zone in a rat model of distraction osteogenesis. J Pediatr Orthop 2003; 23(1): Chapman IV MN, Tucker S. Ultrasound-induced changes in rates of influx and efflux of potassium ions in rat thymocytes in vitro. Ultrasound Med Biol 1980; 6: Ryaby JT BE, Bendo JA, Dalton PF, Tannenbaum S, Pilla AA. Low intensity pulsed ultrasound increases calcium incorporation in both differentiating cartilage and bone cell cultures. Trans Orthop Res Soc 1989; RyabyJT MJ, Pilla AA, Duarte-Alves P. Lowintensity pulsed ultrasound modulates adenylate cyclase activity and transforming growth factor beta synthesis. Brighton CT, Pollack SR, editors Electromagnetics in medicine and biology. San Francisco: San Francisco Press 1991; RyabyJT MJ, Duarte-Alves P. Low intensity pulsed ultrasound affects adenylate cyclase activity and TGF-b synthesis in osteoblastic cells. Trans Orthop Res Soc 1992; WuCC LD, Bolander ME, Bronk J, Kinnick R, Greenleaf JF. Exposure to low intensity ultrasound stimulates aggrecan gene expression by cultured chondrocytes. Trans Orthop Res Soc 1996; 21: 622. ٣٣

6 داريوش همراهي و همكاران 18. Bruedigam C. Basic techniques in human mesenchymal stem cell cultures: differentiation into osteogenic and adipogenic lineages, genetic perturbations, and phenotypic analyses. Curr Protoc Stem Cell Biol 2011; 1: Catelas I. Human mesenchymal stem cell proliferation and osteogenic differentiation in fibrin gels in vitro. Tissue Eng 2006; 12(8): Minguell JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal Stem Cells. Society for Experimental Biology and Medicine 2001; / : Wang S. Stem-cell-activated organ following ultrasound exposure: better transplant option for organ transplantation. Med Hypotheses 2010; 74(1): Fickert S. Human mesenchymal stem cell proliferation and osteogenic differentiation during long-term ex vivo cultivation is not age dependent. J Bone Miner Metab 2011; 29(2): Thibault RA. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells on pregenerated extracellular matrix scaffolds in the absence of osteogenic cell culture supplements. Tissue Eng Part A 2010; 16(2): Zhang P. Effects of naringin on the proliferation and osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cell. Eur J Pharmacol, 2009; 607(1-3): Gong Z. Influence of culture medium on smooth muscle cell differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A 2009; 15(2): McClure SR. The effect of variable waveform low-intensity pulsed ultrasound in a fourth metacarpal osteotomy gap model in horses. Ultrasound Med Biol 2010; 36(8): Narita Y. Effects of transforming growth factorbeta 1 and ascorbic acid on differentiation of human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells into smooth muscle cell lineage. Cell Tissue Res 2008; 333(3): Qian Z, Stoodley P, Pitt WG. Effect of lowintensity ultrasound upon biofilm structure from confocal scanning laser microscopy observation. Biomaterials 1996; 17(20): Saito M. Effect of low- and high-intensity pulsed ultrasound on collagen post-translational modifications in MC3T3-E1 osteoblasts. Calcif Tissue Int 2004; 75(5): Jaiswal RK. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 2000; 275(13): Hildebrandt C, Buth H, Thielecke H. Influence of cell culture media conditions on the osteogenic differentiation of cord blood-derived mesenchymal stem cells. Ann Anat 2009; 191(1): Costa-Pinto AR. Adhesion, proliferation, and osteogenic differentiation of a mouse mesenchymal stem cell line (BMC9) seeded on novel melt-based chitosan/polyester 3D porous scaffolds. Tissue Eng Part a 2008; 14(6): MQK, SM B, WD J. Effect of wave diffraction on the measurement of ultrasonic power output using the radiation force method with a plane reflecting target angled at 45. Meas Sci Technol 1992; 3: Gordanove. Stem Cell Culture Method Mac Grow Hill Press Eslaminejad NS, Hosseini RH. Expression of the 1.2 surface antigen increases significantly during the murine mesenchymal stem cells cultivation period. Dev Growth Differ 2007; 49: Malizos KN. Low-intensity pulsed ultrasound for bone healing: An overview. Injury, Int. J. Care Injured 2006; 37: S Zhou S. Molecular Mechanisms of Low Intensity Pulsed Ultrasound in Human Skin Fibroblasts. The journal of biological chemistry 2004; 279(52): Yang KH, Wang SJ. Exposure to low-intensity ultrasound increases aggrecan gene expression in a rat femur fracture model. J Orthop Res 1996; 14: Chapman IMN, Tucker S. Ultrasound-induced changes in the rates of influx and efflux of potassium ions in rat thymocytes in vitro. Ultrasound Med Biol 1980; 6: Ryaby JT, Bendo JA. Low intensity pulsed ultrasound increases calcium incorporation in both differentiating cartilage and bone cell cultures. Trans Orthop Res Soc 1989; 14: Deyne PGD, Kirsch-Volders M. In Vitro Effects of Therapeutic Ultrasound on the Nucleus of Human Fibroblasts. Physical Therapy 1995; 75(7): ٣٤