چكيده بنيادي مزانشيمي كريستالين زجاجيه كاتاراكت. Downloaded from jssu.ssu.ac.ir at 14:40 IRDT on Tuesday August 21st 2018

Transcript

1 Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences Vol. 19, No. 5, Nov-Dec 2011 Pages: مجله علمي پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهيد صدوقي يزد دوره 19 شماره 5 آذر و دي 1390 صفحه: القاي تمايز سلوله يا بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان به سلوله يا فيبر عدسي * هما محسني كوچصفهاني محمد نبيوني حمداله دلاويز خديجه بهره بر پريسا غيبي نسيم اسلامي 1- دانشيار زيست شناسي تكويني دانشگاه تربيت معلم تهران گروه زيست شناسي 2- استاديار زيست شناسي تكويني دانشگاه تربيت معلم تهران گروه زيست شناسي 3- استاديار آناتومي دانشگاه علوم پزشكي ياسوج دانشكده پزشكي گروه علوم پايه پزشكي دانشجوي كارشناسي ارشد زيست شناسي تكويني دانشگاه تربيت معلم تهران گروه زيست شناسي چكيده تاريخ دريافت: 1390/4/9 تاريخ پذيرش: 1390/7/7 شبه مقدمه: در اين مطالعه اثر تمايزي مايع زجاجيه بر سلولهاي بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان به سلولهاي فيبر عدسي چشم مورد بررسي قرار گرفته است. روش بررسي: در اين كار تجربي سلوله يا مغز استخوان از استخوانهاي ران و درشت ني موشهاي NMRI جدا شد. بنيادي بودن اين سلولها با ماركر oct4 به روش ايمونوسيتوشيمي مورد بررسي قرار گرفت. جهت اثبات مزانشيمي بودن سلولها علاوه بر خاصيت چسبندگي آنها ماركرهاي سطحي CD44 و CD31 با روش فلوسيتومتري بررسي شد. در گروههاي تجربي سلولهاي مزانشيمي با مايع زجاجيه و DMEM همراه با مكملها كشت داده شدند. سپس تواناييآنها جهت تمايز به سلوله يا چشم با سنجش كريستالين α -crystallin به روش ايمونوسيتوشيمي مورد بررسي قرارگرفت. فيبر عدسي نتايج: در كشت اوليه جمعيت سلولي هتروژن بود و سلولها پهن دوكي و چند وجهي بودند. بيان oct4 در سلولها بنيادي بودن سلولها را تاييد كرد. آناليز فلوسايتومتري ماركرهاي سطحي نشان داد كه سلوله يا بنيادي مزانشيمي مغز استخوان ماركر CD44 را به ميزان بالا و ماركرهاي CD31 را به ميزان كم بيان ميكنند. بررسيهاي مورفولوژيكي نشان داد كه اكثر سلولهاي گروههاي تجربي از لحاظ شكل ظاهري نسبت به سلولهاي گروه كنترل كشيدهتر و به صورت موضعي به موازات هم آرايش يافتند. بيان الفا كريستالين در سلوله يا گروههاي تجربي تشكيل سلوله يا شبه فيبر عدسي را تاييد كرد. نتيجهگيري: بر اساس يافتههاي اين مطالعه سلولهاي بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان در اثر عمل القايي مايع زجاجيه ميتوانند به سلولهاي فيبر عدسي چشم تمايز يابند. واژههاي كليدي: سلوله يا بنيادي مزانشيمي كريستالين زجاجيه كاتاراكت * (نويسنده مسي ول) تلفن: نمابر: پست الكترونيكي: kouchesefehani@saba.tmu.ac.ir

2 569 دارند اسيد هيالورونيك تمايل بالايي براي جذب آب داشته و هما محسني كوچصفهاني و همكاران مقدمه عدسي يكي از اجزاي چشم است كه ساختاري شفاف و الاستيك دارد و عمل آن تطابق و متمركز كردن نور بر روي شبكيه است( 1 ). تجديد و تكثير سلول هاي عدسي و شبكيه چشم در پستانداران بسيار محدود است و فقط در برخي از دوزيستان وجود دارد( 2 ). در طي دو دهه گذشته تلاشهاي گستردهاي انجام گرديده است تا با شناسايي ژنهاي كليدي در عدسي امكان ترميم و تجديد را در اين سلولها امكانپذير كنند( 3 ). با افزايش سن مشكلات و بيماريهاي چشمي به ويژه پير چشمي و كاتاراكت در جوامع مختلف رو به افزايش است. آب مرواريد(كاتاراكت) كه يكي از شايعترين بيماريهاي چشم ميباشد به علت كدر شدن عدسي چشم اتفاق ميافتد( 4 ) بنابراين امروزه استفاده از سلولهاي بنيادي به عنوان يك راهكار براي ترميم و يا جايگزيني سلولهاي عدسي و شبكيه ضروري به نظر ميرسد. سلولهاي بنيادي سلوله يا تمايز نيافتهاي هستند كه توانايي تبديل و تمايز به انواع مختلف سلولها را دارند( 5 ). مغز استخوان منبع اصلي دو نوع از سلوله يا بنيادي به نام سلوله يا بنيادي خونساز Cell) (HSCs:(Hematopoietic Stem و سلولهاي بنيادي مزانشيمي( MSCs:Mesenchymal Stem (Cell ميباشد( 6 ). سلوله يا بنيادي مزانشيمي را از منابع ديگر مثل بافت چربي پولپ دندان بافت سينوويال بندناف خون محيطي بافت پريوست و ماهيچه اسكلتي جدا كردهاند( 7 8 ). مهمترين منبع سلوله يا بنيادي مزانشيمي در سالهاي اخير مغز استخوان بوده است. سلوله يا بنيادي مزانشيمي به دليل دارا بودن خاصيت خودتجديدي( renewal (self و توان تمايزي به عنوان يك منبع مناسب براي سلول درماني و ژن درماني محسوب ميشود( 9 ). مايع زجاجيه مايعي شفاف است كه از جام بينايي منشاء ميگيرد و فضاي پشت عدسي چشم را پر كرده است و در مسير تمايزي عدسي چشم نقش ويژه دارد. در زجاجيه كندروايتين سولفات هپاران سولفات و اسيدهيالورونيك وجود به اين صورت %99 وزن زجاجيه را آب تشكيل ميدهد و يك حالت ژلهاي به زجاجيه ميدهد( 10 ). مهمترين فاكتورهاي موجود در مايع زجاجيه فاكتورهاي رشد فيبروبلاستي( FGF ) FGF-1 و FGF-2 ميباشد( 11 ). مطالعات تجربي نشان داده است كه اين فاكتورها در محيط كشت باعث القا و تمايز عدسي و بيان ژنهاي كريستالين و طويل شدن و تخصصيابي ساختاري در سلولهاي فيبري ميگردند( 12 ). شواهد نشان ميدهد كه سلولهاي بافت پوششي عدسي تحت القاي FGF در محيط كشت تمايز پيدا كرده و ساختار مولكولي و مورفولوژي فيبرهاي عدسي را كسب كردهاند( 13 ). عمدهترين پروتي ينهاي سلولهاي فيبر عدسي كريستالينها ميباشند( 14 ) كه به دو گروه عمده α و γβ تقسيم ميشوند( 15 ). با توجه به اينكه مايع زجاجيه چشم حاوي فاكتورهاي رشدي ميباشد كه براي نگهداري لنز و ديگر اجزاي چشم موثر ميباشد( 16 ). لذا در اين بررسي اثر القايي مايع زجاجيه چشم گاو بر سلولهاي مزانشيمي موش و تمايز ساختاري آن به فيبرهاي عدسي در محيط كشت مورد بررسي قرار گرفته است. روش بررسي نحوه گرفتن مايع زجاجيه: در اين پژوهش تجربي چشمهاي گاو گرفته شده از كشتارگاه كرج در PBS(Phosphate Buffer Saline) به آزمايشگاه منتقل شد و با آنتيبيوتيك پنيسيلين و استرپتومايسين همراه با PBS استريل گرديد. با فرو كردن سر سرنگ 16g از ناحيه پشتي چشم مايع زجاجيه بيرون كشيده شد و در دستگاه سانتريفيوژ با دور rpm به مدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتيگراد قرار گرفت. مايع رويي فيلتر گرديد و در فريزر 40- درجه سانتيگراد نگهداري شد. جداسازي و كشت سلول هاي مزانشيمي مغز استخوان: موشهاي نژاد NMRI با سن تقريبي 6-4 هفته با روش جابجاي مهرههاي گردني كشته شدند. در شرايط كاملا استريل

3 570 القاي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي... anti oct4 رقيق شده در 0/2 BSA/PBST درصد اضافه شد و استخوانهاي ران و درشت ني جدا و داخل محيط DMEM قرار داده شد و سپس به زير هود منتقل گرديد. دو سر استخوان با يك قيچي كاملا استريل بريده شده و مغز استخوان از داخل كانال استخوان با استفاده از سرنگ حاوي محيط DMEM و عمل Flushing خارج شد. مغز استخوان در فالكون 15 ميليليتري ريخته و سانتريفيوژ شد تا پلت سلولي تشكيل شود. سپس محيط رويي تخليه شده و سلولها در 2 ميلي ليتر محيط تازه معلق شدند. محيط مورد استفاده Dubleco s Modified Eagles Medium )DMEM Fetal Bovine Serum; حاوي )FBS %15 (Gibco; Germany Gibco, و 100 واحد بينالمللي پنيسيلين( (Gibco, Germany Gibco, و 100 واحد بينالمللي استرپتومايسين( (Germany (Germany بود. سلوله یا حاصل در فلاسك 25 سانتي متري كشت داده شدند. محيط سلولها هر 3 روز يكبار به مدت دو هفته تعويض شد. سلوله يا مزانشيمي بر اساس خاصيت چسبندگي خود به كف فلاسك ميچسبند اما سلوله يا خونساز با تعويض محيط كشت حذف ميشدند. بعد از يك هفته پاساژ اول انجام شد به اين ترتيب كه سلولها با استفاده از trypsin-edta از كف فلاسك جدا شده و پس از سانتريفيوژ با لام ني وبار شمارش شدند درصد سلوله يا زنده به وسيله رنگ آميزي تريپان بلو تعيين شد. ضمن انجام پاساژهاي دوم و سوم سلوله يا پاساژ سوم در مرحله بعدي تحقيق استفاده گرديدند. بنيادي و مزانشيمي بودن اين سلولها با ماركرهاي CD44 Oct4 و CD31 با روشهاي ايمونوسيتوشيمي و فلوسايتومتري مورد بررسي قرار گرفت. ارزيابي ايمونوسيتوشيمي با نشانگر :Oct4 به منظور انجام ارزيابي ايمونوسيتوشيمي سلوله يا مزانشيمي به مدت 15 دقيقه با پارافرمالدي يد 4 درصد در دماي اتاق تثبيت شدند. سپس با PBS شتشو داده و از بافر بلاك كننده حاوي 100-X Triton جهت نفوذپذيري سلولها براي ورود آنتيبادي استفاده شد. سپس Goat serum اضافه شد و پس از خارج كردن Goat serum آنتيبادي اوليه سلولها در اين محلول به مدت 45 دقيقه در انكوباتور 37 درجه سانتي گراد انكوبه شدند. نمونهها 2 بار با 0/1 PBS/Tween درصد شتشو داده شدند. آنتيبادي ثانويه رقيق شده در 0/2 BSA/PBST درصد متصل FITC به مدت 30 دقيقه به( isothiocyanate (Fluorescein در دماي اتاق اضافه شد. در نهايت به سلولها رنگ Hoechst اضافه شد تا هستهها رنگ بگيرند. در طول آزمايش از ميكروسكوپ معكوس فلورسانس جهت ارزيابي سلولها استفاده شد. بررسي بيان ماركرهاي سطحي به روش فلوسيتومتري: سلولها را بعد از تريپسينه و سانتريفيوژكردن در اپندورف ريخته و با PBS شستشو و سپس به مدت 10 دقيقه با دور سانتريفيوژ شدند. آنتيباديهاي اوليه CD rpm كونژوگه با PE (فيكواريترين) و CD31 كونژوگه با FITC (فلورسنس ايزوتيوسيانات) اضافه شد و به مدت 30 دقيقه در يخچال قرار گرفت و براي كنترل منفي از آنتي باديهاي PE-IgG2a, FITC- IgG2b استفاده شد. در مرحله بعد سلولها پس از شستشو با PBS به مدت 10 دقيقه با دور 2000rpm سانتريفيوژ شدند. سپس به سلولها بافر فيكس كننده فرمالين 1 درصد اضافه شد و با دستگاه فلوسيتومتري (FACS) آناليز شدند. تيمار سلولهاي جدا شده با مايع زجاجيه: پس از آخرين پاساژ سلولها بعد از شمارش سلولي تعدادي سلول در پليت 24 خانهاي كشت داده شدند و پس از چسبيدن سلولها به كف ظرف گروههاي تجربي با دوزهاي %15 %20 %50 %25 از مايع زجاجيه تيمار شدند و گروه كنترل بدون تيمار با مايع زجاجيه و صرفا با DMEM و %15 FBS و آنتيبيوتيكها كشت داده شدند. اين خانهها به مدت 14 و 21 روز تحت تيمار و كشت قرار گرفتند. رنگآميزي سلولها با ماركر كريستالين: در انتهاي روزهاي 14 و 21 طبق روش ايمونوسيتوشيمي ذكر شده در بالا نمونههاي تجربي و نمونههاي كنترل با آنتيبادي

4 571 هما محسني كوچصفهاني و همكاران اوليه كريستالين alpha A+ alpha B crystalline antibody و (ab28163) رنگآميزي شدند. نتايج آنتيبادي ثانويه( anti-rabbit-igg-fitc(af8035 مورفولوژي سلولهاي كشت داده شده: در كشت اوليه سلولهاي گرفته شده از مغز استخوان موشهاي NMRI به شكل گروههاي سلولي ناهمگن و ديده هتروژن شدند(تصوير 1,A). در روز هفتم سلولها با مورفولوژي متفاوت نظير پهن دوكي و چند وجهي مشاهده شدند(تصوير,B). 1 در پ سا اژهاي بعدي تعداد سلوله يا دوكي شكل بيشتر شد به طوري كه در پاساژ سوم اكثريت سلولها دوكي شكل بودند. در ادامه پاساژهاي بعدي سلولهاي بنيادي مزانشيمي بصورت خالص در آمده بودند و سلولهاي مزانشيمي از لحاظ مورفولوژيكي بيشتر شبيه به سلولهاي فيبروبلاست(دوكي شكل) بودند. ايمونوسيتوشيمي سلول هاي بنيادي مغز استخوان: بنيادي بودن Oct4 سلولهاي كشت شده با استفاده از آنتيبادي و به روش ايمونوسيتوشيمي سنجش شد. سلولهاي مزانشيمي كشت شده با آنتيبادي Oct4 ايمونوپوزيتيو بودند كه بيانگر بنيادي و چند توان بودن اين سلولها است(تصويرA 2 ). هسته سلولهاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان كه با رنگآميزي Hoechst آبي ديده ميشوند(تصويرB 2 ). تصوير 1 : كشت سلولهاي مغز استخوان گرفته شده از موش در روز اول كشت سلولهاي مزانشيمي و غيرمزانشيمي به شكل ناهمگن ديده شدند( A ). در روز هفتم سلولهاي مزانشيمي بيشتر به صورت دوكي شكل مشاهده شدند( B ). (ميكروسكوپ فاز كنتراست معكوس با بزرگ نمايي 400 برابر). تصوير 2 : A- بيان Oct4 در اين سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان با روش ايمونوسيتوشيمي بنيادي بودن اين سلولها را نشان داد(فلش). B هسته سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان كه با رنگ آميزيHoechst آبي ديده ميشود(ميكروسكوپ فاز كنتراست معكوس با بزرگ نمايي 200 برابر).

5 572 القاي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي... بررسي بيان ماركرهاي سطحي به روش فلوسيتومتري: جهت اثبات ماهيت مزانشيمي بودن اين سلولها علاوه بر خاصيت چسبدگي آنها به ظرف كشت يكي ديگر از راههاي شناسايي آنها استفاده از ماركر سطحي ميباشد كه بعد از چند بار پاساژدادن و جداشدن سلولهاي بنيادي مزانشيمي از ساير سلولها به روش فلوسيتومتري بررسي شد كه ماركر CD44 به ميزان بالايي و ماركر CD31 به ميزان كمي بيان شد(شكل 3). شكل 3 : بررسي نتايج فلوسيتومتري سلولهاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان با ماركرهاي سطحي CD44 و :CD31 سلولهاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان 91/85 درصد ماركر CD44 و 2/35 ماركر CD31 را بيان كردند. تاثير مايع زجاجيه بر سلولهاي بنيادي مزانشيمي: سلولهاي بنيادي مزانشيمي در گروههاي تجربي كه با مايع زجاجيه تيمار شده بودند از نظر شكل ظاهري نسبت به سلولهاي گروه كنترل(بدون مايع زجاجيه) كشيدهتر و به صورت موضعي به موازات هم آرايش يافته بودند(تصوير 4 ). بعلاوه تعداد هستكها در داخل هسته زياد شده بود كه نشان دهنده فعاليت پروتي ينسازي در اين سلولها بود. در روز چهاردهم مورفولوژي سلولهاي گروه تجربي دوكيتر و ساختاري مشابه رشتههاي فيبري كسب كرده بودند كه با مورفولوژي سلولهاي پوششي فيبر عدسي مشابه بودند(تصوير 4 ). به علاوه پروتي ين آلفا كريستالين در سلولهاي گروههاي تجربي بيان شد(تصوير 5 ). در اين تحقيق از مايع زجاجيه چشم گاو براي القاي تمايز سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان موش به سلولهاي فيبر عدسي استفاده شد. بررسيهاي مورفولوژيكي نشان داد كه تنها در دوزهاي %25 و %50 از مايع زجاجيه ميتوان تغييرات قابل مقايسهاي را نسبت به گروههاي كنترل مشاهده كرد. تغييرات مورفولوژيكي مشاهده شده در اين تحقيق عبارتند از كشيدگي

6 573 هما محسني كوچصفهاني و همكاران زياد سلولها به موازات هم قرارگيري آنها افزايش تعداد مورفولوژيكي بيانگر شروع تمايز اين سلولها به سمت هستكها و از دست دادن هسته سلولي كه همه اين نتايج ساختارهاي شبه فيبر عدسي ميباشد. تصوير 4 : سلوله يا بنيادي مزانشيمي پس از 14 روز تيمار. در گروه كنترل( A ) بدون مجاورت با مايع زجاجيه به شكل گرد ديده شدند. در حاليكه درگروه تجربي( B ) بصورت دوكي و موازي هم قرار گرفتهاند(ميكروسكوپ فاز كنتراست معكوس با بزرگ نمايي 400 برابر). تصوير 5 : بيان آلفا كريستالين در سلوله يا تيمار شده با مايع زجاجيه(ميكروسكوپ فاز كنتراست معكوس با بزرگ نمايي 200 برابر) بحث در اين تحقيق مغز استخوان به سلوله يا اين منظور سلوله يا توانايي تمايز سلوله يا بنيادي مزانشيمي فيبر عدسي چشم بررسي گرديد. به مزانشيمي از مغز استخوان موش جدا شد و به مدت 14 و 21 روز با مايع زجاجيه چشم گاو تيمار شد. سلوله يا بنيادي مزانشيمي براي اولين بار توسط Friednstin و Petrakova از مغز استخوان رت به دست آمد( 17 ). جداسازي و خلوص سلولهاي بنيادي مزانشيمي موش به علت تعداد كم سلولهاي مزانشيمي در مغز استخوان و رشد ناخواسته سلولهاي غيرمزانشيمي به مراتب مشكلتر از ديگر گونههاي جانوري است اين جداسازي بر اساس خاصيت چسبندگي سلوله يا به ظروف كشت صورت گرفت چون سلوله يا مزانشيمي هماتوپويتيي ك توانايي چسبيدن به ظرف كشت را ندارند. در حقيقت اين روش جداسازي تا به امروز به عنوان روش استاندارد براي جدا كردن سلولهاي بنيادي مزانشيمي از مغز استخوان شناخته شده و استفاده ميشود. با اين مكانيسم كه بسيار ساده و كم هزينه كوتاهترين در ميباشد خاصيت از ميتوان ممكن زمان چسبندگي سلولهاي بنيادي مزانشيمي و تعويض مداوم محيط كشت در آغازين ساعات كشت سلولهاي مغز استخوان موش

7 574 القاي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي... براي تخليص سلولهاي دوكي بنيادي مزانشيمي استفاده كرد( 18 ). در اين تحقيق براي اثبات بنيادي بودن سلولها بيان Oct4 و براي مزانشيمي بودن سلولها از خاصيت چسبندگي آنها و ماركرهاي CD44 و CD31 استفاده شد. Eslaminejad و همكاران در سال 2007 ماركرهاي سطحي CD11b CD45 CD34 CD44 CD135 و Thy1.2 را در سلوله يا بنيادي مزانشيمي مغز استخوان موش بررسي كردند كه نتايج اين بررسي نشان داد كه ماركر CD44 در حد بسيار بالايي( 90 درصد) و ساير ماركرها به ميزان كم در اين سلولها بيان شدند( 19 ). در اين مطالعه بيان برخي ماركرهاي سطحي نظير CD44 و CD31 در سلوله يا بنيادي مزانشيمي مغز استخوان به روش فلوسيتومتري مورد بررسي قرار گرفت كه نتايج اين تحقيق نشان داد كه ماركر CD44 در سلوله يا كه داشته در حالي بنيادي مزانشيمي بيان بالايي( 91/85 ) ماركر CD31 بيان كمي( 2/35 ) داشت. در سال 2000 Eleanor و همكاران بر روي رشد و تمايز آنها اين سلولهاي اپيتليومي عدسي انسان مطالعه كردند. سلولهاي اپيتليومي را جدا كرده و به مدت 15 روز در محيط در نهايت مشاهده كردند كه كشت دادند. FGF-2 داراي مورفولوژي آنها تغيير يافته و اجسام لنتوي يدي( Lentoid ) (مجموعه دستجات چند سلولي گرد و داراي خاصيت انكساربالا) ظاهر شدند. آنها براي اثبات ادعاي خود در مورد تمايز اين سلولها به عدسي چشم از ماركر آلفا كريستالينها با در تحقيق حاضر استفاده كردند( 20 ). RT-PCR روش سلولهاي بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان كه به مدت 14 و 21 روز تحت القاي مايع زجاجيه چشم قرار داشتند از نظر بيان آلفا كريستالين مورد بررسي قرار گرفتند كه پاسخ مثبت اين سلولها بيانگر تمايز آنها به سمت ايجاد سلوله يا فيبر عدسي و بيان ژنهاي خاص عدسي ميباشد. O`Connor و همكارانش در سال 2007 دو بافت اپيتليومي از دو عدسي مجزا را بر روي هم در محيط كشت مخلوط با زجاجيه گاوي(به نسبت 1:1) كشت دادند كه در اين شرايط اين سلولها بعد از 30 روز كشت شكل كروي پيدا كرده شفاف شده و قادر به متمركز كردن نور شدهاند. در نتيجه مايع زجاجيه گاوي فاكتورهاي مناسب براي تمايز به سمت سلولهاي عدسي را داراست( 21 ). به Maleki و همكاران در سال 2009 نشان دادند كه سلوله يا بنيادي مزانشيمي بند ناف مي توانند تحت القاي مايع زجاجيه سلوله يا فيبر عدسي تمايز يابند( 22 ). نتيجه مطالعه ما همانند مطالعه Maleki و همكاران نشان داد تحت القاي فاكتورهاي رشد موجود در مايع زجاجيه چشم سلوله يا بنيادي مزانشيمي مشتق از مغز استخوان ميتوانند به ساختاري مشابه به فيبر عدسي تمايز يابند كه در هر دو تحقيق ماركرتمايزي آلفا كريستالين بيان شدند. نتيجهگيري در كل از يافتههاي اين تحقيق ميتوان نتيجه گرفت كه بر اساس تغييرات مورفولوژيكي و بيان ماركرهاي خاص عدسي سلوله يا بنيادي مزانشيمي مشتق شده از مغز استخوان در اثر تيمار با زجاجيه به سلوله يا شبه فيبر عدسي تمايز مييابند. سپاسگزاري از همكاري آقاي دكتر امير آتشي مدير گروه سلولي شركت بن ياخته و همچنين مساعدت نمودن دانشگاه علوم پزشكي ايران جهت انجام آناليز فلوسايتومتري صميمانه سپاسگزاري مينماييم. منابع: 1- Tholozan F, Quinlan RA. Lens cells: more than meets the eye. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2007; 39(10):

8 575 هما محسني كوچصفهاني و همكاران 2- Tsonis PA, Rio-Tsonis KD. Lens and retina regeneration: transdifferentiation, stem cells and clinical applications. Experimental Eye Research 2004; 78(2): Bosco L, Venturini G, Willems D. In vitro lens transdifferentiation of Xenopus laevis outer cornea induced by fibroblast growth factor (FGF). Development 1997; 124(2): Rai DV, Koli KS. Effects of cataract formation on electrical properties of goat eye lens. Pol J med phy Eng 2006; 12(1): Behfar A, Yamada S, Crespo-Diaz R, Nesbitt JJ, Rowe LA, Perez-Terzic C, et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Am Coll Cardiol 2010; 56 (9): Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284(5411): Baghaban Eslaminejad MR, Taghiya L. Mesenchymal stem cell purification from the articular cartilage cell culture. Iranian J Basic Med Sci 2007; 10(3): Alexanian AR. Neural stem cells induce bone- marrow-derived mesenchymal stem cells to generate neural stemlike cells via juxtacrine and paracrine interactions. Exp Cell Res 2005; 310(2): Baksh D, Song L. Tuan RS: adult mesenchymal stem cells. characterization, differentiation and application in cell therapy. Mol Med 2004; 8(3): Oyser CW. The human eye:stricture andfunction. Sinauer Associates; 1999.p Majima K. Presence of growth factor in human vitreous. Ophthalmologica 1997; 211(4): McAvoy JW. Beta- and gamma-crystallin synthesis in rat lens epithelium explanted with neural retinal. Differentiation 1980; 17(2): Zhao H, Rossant J, Ornitz DM, Beebe DC, Robinson ML. Different FGFR genes play an essential but redundant role in postinduction lens development. Invest Ophthalmol Visual Sci 2003; 44(5): Bloemendal H, de Jong W, Jaenicke R, Lubsen, NH, Slingsby C, Tardieu A. Ageing and vision: structure, stability and function of lens crystallines. Prog Biophys Mol Biol 2004; 86 (3): Horwitz JA. Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89 (21): Beebe DC, Latker CH, Jebens HA, Johnson MC, Feagans DE, Feinberg RN. Transport and steady-state concentration of plasma proteins in the vitreous humor of the chicken embryo: implications for the mechanism of eye growth during early development. Dev Biol 1986; 114 (2): Friedenstein AJ, Piatetzky Shapiro II, Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol. Exp. Morph 1966; 16(3): Kemp KC, Hows J, Donaldson C. Bone marrow-derived mesenchymal sem cells. Leuk lymphoma 2005;

9 576 القاي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي... 46(11): Eslaminejad MB, Nadri S, Hossini RH. Expression of Thy 1.2 surface antigen increases significantly during the murine mesenchymal stem cells cultivation period. Dev Growth Differ 2007; 49(4): Blakely EA, Bjornstad KA, Chang PY, McNamara MP, Chang E, Aragon G, et al. Growth and differentiation of human lens epithelial cells in vitro on matrix. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41 (12): Oconnor MD, McAcavoy JW. In vitro generation of function lens-like structures with relevance To agerelated nuclear cataract. Invest ophthalmol Vis Sci 2007;48 (3): Maleki M, Parivar K, Nabiyouni M, Yaghmaei P, Naji M. Induction of alpha-crystallins expression in umbilical cord mesenchymal stem cells. Iranian J Ophthalmology 2010; 22(2):

10 577 هما محسني كوچصفهاني و همكاران Differentiation Induction of the Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow to Lens Fiber-Like Cells Mohseni Kouchesfahani H(PhD) *1, Nabiuni M(PhD) 2, Delaviz H(PhD) 3, Bahrebar Kh(MSc) 4, Gheibi P(MSc) 5, Eslami N(MSc) 6 1,2,4-6 Department of Biology, Tarbiat Moallem University, Tehran, Iran 3 Department of Basic Medical Sciences, Yasuj University of Medical Sciences, Yasuj, Iran Received: 10 Jul 2011 Accepted: 23 Sep 2011 Abstract Introduction: In this study the effect of vitreous humor on the mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow to lens fiber-like cells was investigated. Methods: In this experimental study bone marrow cells were collected by flushing femurs and tibias in NMRI mice. Immunocytochemistry by Oct4 antibody was used to confirm that the cells are stem cells. The mesenchymal character of these cells was proven by their adherence and by such flocytometery markers as CD44, CD31. In experimental groups, MSCs were cultured with DMEM and bovine vitreous body for induction. The supplemented medium was changed every two days. The expression of α crystalline, as the marker of lens differentiation, was detected by immunocytochemistry. Results: During the primary culture, the cell population was heterogeneous where varying morphologies such as flat, spindle-shaped, and polygonal were observed. In the subsequent passages, the number of the spindle-shaped cells appeared to increase, so that in passage 3 the majority of the cells seemed morphologically to be spindle-shaped. Immunocytochemistery study confirmed the presence of stem cells using Oct4 antibody. The flowcytometric analysis of surface markers revealed that mesenchymal bone marrow stem cells express CD44 and CD31 to a low level. Morphological studies showed that most cells in experimental groups were locally longer and more aligned in parallel compared to control group cells. α crystalline expression proved the formation of lens fiber-like cells. Conclusion: According to the findings of this study, it can be concluded that MSCs derived from mouse bone marrow differentiate into lens fiber like cells by treating them with vitreous humor. Keyword: Mesenchymal Stem Cells, Vitreous Body, Immunohistochemistry; Cataract This paper should be cited as: Mohseni Kouchesfahani H, Nabiuni M, Delaviz H, Bahrebar Kh, Gheibi P, Eslami N. Differentiation induction of the mesenchymal stem cells derived from bone marrow to lens fiber-like cells. J Shahid Sadoughi Univ Med Sci; 19(5): *Corresponding author: Tel: , Fax: , kouchesefehani@saba.tmu.ac.ir