ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΣΙΚΟΓΙΑΝΝΗ Κ. ΓΕΩΡΓΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΣΙΚΟΓΙΑΝΝΗ Κ. ΓΕΩΡΓΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ Ι ΙΟΤΗΤΩΝ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟ ΕΣΜΕΥΣΗΣ ΒΙΟ ΙΑΣΠΩΜΕΝΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ PLGAmPEG ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΤΡΑ

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΣΙΚΟΓΙΑΝΝΗ Κ. ΓΕΩΡΓΙΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ Ι ΙΟΤΗΤΩΝ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟ ΕΣΜΕΥΣΗΣ ΒΙΟ ΙΑΣΠΩΜΕΝΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ PLGAmPEG ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επικ. Καθηγητής Επικ. Καθηγητής Αναπλ. Καθηγητής Κ. Αυγουστάκης Κ. Κλεπετσάνης Κ. Κοντογιάννης 2

3 3 Αφιερώνεται στους γονείς µου

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε κατά τα έτη στο Εργαστήριο Φαρµακευτικής Τεχνολογίας του Τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή Φαρµακευτικής Τεχνολογίας κ. Κωνσταντίνου Αυγουστάκη, τον οποίο θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά για την ουσιαστική του καθοδήγηση, τις γνώσεις που µου µετέδωσε και γιατί χωρίς την πολύτιµη βοήθειά του τόσο κατά την διεξαγωγή των πειραµάτων όσο και κατά την συγγραφή της εργασίας η µελέτη αυτή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τα µέλη της εξεταστικής επιτροπής µου: Τον κ. Παύλο Κλεπετσάνη Επίκουρο Καθηγητή Φυσικοφαρµακευτικής του Τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών για την τεχνική υποστήριξη κατά την διεξαγωγή των πειραµάτων, την πολύτιµη βοήθειά του στον χαρακτηρισµό των προϊόντων καθώς και τις χρήσιµες συµβουλές του. Τον κ. Χρήστο Κοντογιάννη Αναπληρωτή Καθηγητή Ενόργανης Φαρµακευτικής Αναλύσεως του Τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών για τις πολύ εύστοχες παρατηρήσεις του κατά την συγγραφή της παρούσας µελέτης. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερµά τους αγαπητούς συναδέλφους ρ.. Φατούρο, κ. Ν. Στιβακτάκη, κ. Μ. Χρυσανθόπουλο, κ. Σ. Πιπερούδη, κ. Γ. Κοροµηλά, κ. Ε. Γρυπάρη για την φιλία, τη συµπαράστασή τους και τις χρήσιµες συµβουλές τους. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την οικογένειά µου για την ηθική και υλική υποστήριξη που µου παρείχαν καθώς και για την διαρκή ενθάρρυνσή τους χωρίς την οποία δεν θα ήταν δυνατή η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΒΙΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή 1.2 ΒΙΟ ΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΠΟΛΥΜΕΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Μηχανισµοί διάσπασης πολυµερών in vivo Αποδέσµευση του φαρµάκου από βιοδιασπώµενα συστήµατα χορήγησης 1.3 ΒΙΟ ΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΗ ΓΑΛΑΚΤΙΚΟΥ- ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ Πολυ(γαλακτικό γλυκολικό) οξύ Σύνθεση συµπολυµερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA) Χαρακτηριστικά των PLGA συµπολυµερών Εφαρµογές PLGA - Συστήµατα χορήγησης βιοδραστικών ουσιών µε βάση τα PLGA συµπολυµερή Συµπολυµερή πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος µε πολυ(αιθυλενογλυκόλη) Εισαγωγή Σύνθεση συµπολυµερών πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος µε πολυ(αιθυλενογλυκόλη) Χαρακτηριστικά των συµπολυµερών πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος µε πολυ(αιθυλενογλυκόλη) Εφαρµογές PLGA-PEG - Συστήµατα χορήγησης βιοδραστικών ουσιών µε βάση τα PLGA-PEG συµπολυµερή 5

6 1.4 PLA-PEG ΚΑΙ PLGA-PEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΑ ΣΤΗΝ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΒΙΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Μέθοδοι παρασκευής νανοσωµατιδίων Παρασκευή νανοσωµατιδίων µε in situ πολυµερισµό Παρασκευή νανοσωµατιδίων από προσχηµατισµένα πολυµερή ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ PLA-PEG ΚΑΙ PLGA-PEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ οµή Μέγεθος και ζ-δυναµικό Τεχνικές µέτρησης µεγέθους των νανοσωµατιδίων Προσδιορισµός υδροφιλικότητας/υδροφοβικότητας της επιφάνειας των νανοσωµατιδίων Κολλοειδής σταθερότητα των PLA-PEG και PLGA-PEG νανοσωµατιδίων In vitro αποικοδόµηση νανοσωµατιδίων Προσρόφηση πρωτεϊνών και αλληλεπίδραση µε κύτταρα in vitro Φόρτωση και απελευθέρωση φαρµάκων Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΒΙΟΚΑΤΑΝΟΜΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑ 1.5 ΠΙΘΑΝΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αντιµετώπιση µολυσµατικών ασθενειών Αντιµετώπιση καρκίνου Χορήγηση πρωτεϊνών Χορήγηση ολιγονουκλεοτιδίων και γονιδίων 1.6 ΜΕΘΥΛΟΞΑΝΘΙΝΕΣ 1.7 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ 2.2 ΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ 2.3 ΜΕΘΟ ΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 6

7 2.3.1 Σύνθεση και χαρακτηρισµός των συµπολυµερών πολυ(γαλακτικούγλυκολικού) οξέος µε πολυαιθυλενογλυκόλη (PLGAmPEG) Μελέτη προµορφοποίησης µεθυλοξανθινών Μελέτη ανάκτησης των µεθυλοξανθινών έπειτα από λυοφιλοποίηση Παρασκευή νανοσωµατίδιων Παρασκευή νανοσωµατιδίων καφεΐνης Παρασκευή νανοσωµατιδίων θεοφυλλίνης Παρασκευή νανοσωµατιδίων θεοβρωµίνης Χαρακτηρισµός νανοσωµατιδίων Προσδιορισµός µεγέθους νανοσωµατιδίων Προσδιορισµός ζ-δυναµικού νανοσωµατιδίων Προσδιορισµός της φόρτωσης των νανοσωµατιδίων Μελέτη αποδέσµευσης µεθυλοξανθινών από βιοδιασπώµενα PLGAmPEG νανοσωµατίδια. 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΩΝ 3.2 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΜΕΘΥΛΟΞΑΝΘΙΝΩΝ 3.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΩΝ ΕΞΑΧΝΩΣΗΣ ΜΕΘΥΛΟΞΑΝΘΙΝΩΝ 3.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΚΑΙ ΦΟΡΤΙΟΥ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ 3.5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΚΑΙ ΕΝΚΑΨΑΚΙΩΣΗΣ ΜΕΘΥΛΟΞΑΝΘΙΝΩΝ ΣΕ PLGAmPEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΑ Αποτελέσµατα φόρτωσης και ενκαψακίωσης καφεΐνης σε PLGAmPEG νανοσωµατίδια Αποτελέσµατα φόρτωσης και ενκαψακίωσης θεοφυλλίνης σε PLGAmPEG νανοσωµατίδια Αποτελέσµατα φόρτωσης και ενκαψακίωσης θεοβρωµίνης σε PLGAmPEG νανοσωµατίδια Συγκριτικά αποτελέσµατα φόρτωσης και ενκαψακίωσης µεθυλοξανθινών 7

8 3.6 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗΣ ΜΕΘΥΛΟΞΑΝΘΙΝΩΝ ΑΠΟ PLGAmPEG ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙ ΙΑ Απελευθέρωση σε φυσιολογικό ορό ρυθµισµένο µε φωσφορικά (PBS) Απελευθέρωση µεθυλοξανθινών σε πλάσµα 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ 6.1 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: Κατάλογος εικόνων 6.2 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 2: Κατάλογος πινάκων 6.3 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 3: Συντµήσεις 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 8

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ένας από τους πιο σηµαντικούς στόχους της φαρµακευτικής θεραπείας είναι η ανάπτυξη φορέων φαρµάκου που θα µεταφέρουν και θα παραδίδουν εκλεκτικά το φάρµακο στις θέσεις φαρµακολογικής δράσης του αλλά και µε έναν ελεγχόµενο ρυθµό χορήγησης κατάλληλα προσαρµοσµένο για την κάθε ασθένεια. Για την ελεγχόµενη χορήγηση και στόχευση βιοδραστικών ουσιών έχουν αναπτυχθεί πολλοί φορείς, όπως πολυµερικά νανοσωµατίδια και λιποσώµατα. Μεταξύ των πολυµερών που έχουν χρησιµοποιηθεί για την παρασκευή νανοσωµατιδιακών φορέων φαρµάκων ιδιαίτερη προσοχή συγκεντρώνουν τα βιοδιασπώµενα και βιοσυµβατά πολυµερή του πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA). Τα νανοσωµατίδια που παρασκευάζονται από τα συµπολυµερή αυτά αποµακρύνονται ταχύτατα από τη συστηµατική κυκλοφορία µετά από ενδοφλέβια χορήγηση, κυρίως µέσω της πρόσληψης τους από το δικτυοενδοθηλιακό σύστηµα. Όταν όµως επικαλυφθούν µε υδρόφιλα, µη ιονικά πολυµερή, όπως η πολυ(αιθυλενογλυκόλη), έχουµε στερεοχηµική σταθεροποίηση των νανοσωµατιδίων και παράταση του χρόνου παραµονής τους στην συστηµατική κυκλοφορία. Στην παρούσα εργασία µελετήθηκε η επίδραση της διαλυτότητας του φαρµάκου στην φόρτωση και αποδέσµευση του από PLGAmPEG νανοσωµατίδια διαφορετικής πολυµερικής σύστασης (αναλογία PLGA/PEG). Ως πρότυπα φάρµακα χρησιµοποιήθηκαν τα µέλη της τάξης των µεθυλοξανθινών καφεΐνη, θεοφυλλίνη και θεοβρωµίνη. Οι µεθυλοξανθίνες αποτελούν ικανοποιητικά πρότυπα ώστε να µπορούν να χρησιµοποιηθούν στην µελέτη της επίδρασης της διαλυτότητας στις ιδιότητες φόρτωσης και απελευθέρωσης φαρµάκων από τα PLGAmPEG νανοσωµατίδια, καθώς είναι µικρά µόρια µε παραπλήσιο µοριακό βάρος και χηµικές ιδιότητες ενώ η διαλυτότητα τους στο νερό είναι σηµαντικά διαφορετική: καφεΐνη (1g/46 ml), θεοφυλλίνη (1 g/120 ml) και θεοβρωµίνη (1 g/2000 ml). Παρασκευάστηκαν έτσι τρεις διαφορετικές συνθέσεις νανοσωµατιδίων µε την µέθοδο του διπλού γαλακτώµατος και χαρακτηρίστηκαν ως προς το µέγεθος και το ζ δυναµικό. Στην συνέχεια 9

10 µελετήθηκαν οι ιδιότητες φόρτωσης των µεθυλοξανθινών καθώς και οι ιδιότητες απελευθέρωσής τους από τα νανοσωµατίδια µέσα σε φυσιολογικό ορό ρυθµισµένο µε φωσφορικά (PBS) και ανθρώπινο πλάσµα in vitro. Το µέσο µέγεθος των νανοσωµατιδίων κυµαίνονταν από 130 έως 200 nm και το ζ δυναµικό από -7 έως -20 mv. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν τα νανοσωµατίδια κατάλληλα για εφαρµογές ελεγχόµενης αποδέσµευσης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των PLGAmPEG νανοσωµατιδίων βρέθηκε να εξαρτάται από την σχετική διαλυτότητα του φαρµάκου στην εξωτερική υδατική φάση και στην οργανική φάση που χρησιµοποιούνται κατά την παρασκευή των νανοσωµατιδίων και όχι απλά από την υδατοδιαλυτότητά τους. Έτσι η φόρτωση των νανοσωµατιδίων ήταν µεγαλύτερη στην περίπτωση της καφεΐνης απ ότι στην θεοβρωµίνη, και αυτής από την φόρτωση στην περίπτωση της θεοφυλλίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των µεθυλοξανθινών σε PLGAmPEG νανοσωµατίδια επηρεάζεται από την αρχική φόρτωση των νανοσωµατιδίων σε φάρµακο (drug input). Για όλα τα φάρµακα που δοκιµάστηκαν, αύξηση της αρχικής ποσότητας του φαρµάκου είχε σαν αποτέλεσµα την αύξηση της φόρτωσης των νανοσωµατιδίων µε φάρµακο. Αντίθετα η επίδραση της αρχικής φόρτωσης στην ενκαψακίωση βρέθηκε να εξαρτάται από την υδατοδιαλυτότητα του φαρµάκου. Έτσι η αύξηση της αρχικής φόρτωσης είχε σαν αποτέλεσµα την ελάττωση της ενκαψακίωσης στην περίπτωση της καφεΐνης, δεν είχε κανένα αποτέλεσµα στην ενκαψακίωση της θεοφυλλίνης ενώ οδήγησε σε µικρή αύξηση της ενκαψακίωσης της θεοβρωµίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των φαρµάκων που δοκιµάστηκαν δεν επηρεάστηκε σηµαντικά από τη σύνθεση του PLGAmPEG συµπολυµερούς από το οποίο παρασκευάστηκαν τα νανοσωµατίδια. Ανεξάρτητα από την πολυµερική σύνθεση των νανοσωµατιδίων, ο ρυθµός απελευθέρωσης των εγκλωβισµένων στα νανοσωµατίδια µεθυλοξανθινών ήταν, τόσο στο PBS όσο και στο ανθρώπινο πλάσµα in vitro, ανάλογος της υδατοδιαλυτότητας του φαρµάκου. Έτσι ο ρυθµός αποδέσµευσης ήταν µεγαλύτερος στην περίπτωση της καφεΐνης απ ότι στην θεοφυλλίνη, και αυτής από την θεοβρωµίνη. 10

11 Με όλες τις πολυµερικές συνθέσεις που δοκιµάστηκαν, ο εγκλωβισµός των µεθυλοξανθινών στα νανοσωµατίδια είχε ως αποτέλεσµα την ελάττωση του ρυθµού αποδέσµευσης των φαρµάκων in vitro, τόσο σε PBS όσο και σε ανθρώπινο πλάσµα. Η ελάττωση του ρυθµού αποδέσµευσης αυξάνονταν µε ελάττωση της υδατοδιαλυτότητας του φαρµάκου. Ο ρυθµός απελευθέρωσης και των τριών µεθυλοξανθινών ήταν µεγαλύτερος στο PBS σε σύγκριση µε το ανθρώπινο πλάσµα. Η απόδειξη της ελεγχόµενης αποδέσµευσης των φαρµάκων από τα νανοσωµατίδια στο ανθρώπινο πλάσµα είναι σηµαντική καθώς καταδεικνύει την καταλληλότητα των PLGAmPEG σωµατιδίων για εφαρµογές ελεγχόµενης χορήγησης φαρµάκων. Πάντως η χρησιµότητα των PLGAmPEG νανοσωµατιδίων σε ελεγχόµενη χορήγηση φαρµάκων φαίνεται να περιορίζεται στις περιπτώσεις των φαρµάκων µε µικρή σχετικά υδατοδιαλυτότητα. 11

12 ABSTRACT The rapid removal of conventional polymeric nanoparticles from the bloodstream limits their potentional in controlled drug delivery and targeting. Surface engineering, however, may lead to nanoparticles capable of evading their uptake from the mononuclear phagocyte system (MPS), which exhibit prolonged residence in blood. Thus, coating the nanoparticle surface with a hydrophilic polymer such as poly(ethylene glycol) (PEG) has been shown to confer long circulation properties to PLGA (poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles. Although the basic physicochemical and biological properties of these nanoparticles have been studied, there is currently a luck of studies dealing in a systematic way with their drug incorporation and release properties. In this work the effect of three different PLGAmPEG copolymer composition on drug loading and release properties, was studied using the members of the methyl-xanthine class of drugs, i.e. caffeine, theophylline, theobromine, as model drugs. This way, the effect of drug solubility on drug loading and release from the nanoparticles can be evaluated in a more scientifically sound way than applying more common practices, such as the study of a drug and its salt. PLGAmPEG copolymers were synthesized from dl-lactide (LE), glycolide (GE) and mpeg(5000) by a melt polymerization process. The synthesized copolymers were identified by the moral ratio of (LE +GE)/mPEG determined by 1 H-NMR. PLGAmPEG nanoparticles loaded with caffeine, theophylline and theobromine were prepared by a double emulsion (w 1 /o/w 2 ) method, where w 1 : aqueous solution of drug, o: a dichloromethane (dcm) solution of the polymer and w 2 : an aqueous solution of sodium cholate (12mM). The size and ζ potential of the nanoparticles, were determined by photon correlation spectroscopy and microelectrophoresis respectively. The size of the nanoparticles ranged approximately from 130 to 200nm depending on the type of PLGAmPEG copolymer used 12

13 and the formulation. All nanoparticle formulations exhibited low negative ζ potential in the range -7 to -20. Drug loading was determined using direct method in which the samples were dissolved in NaOH and the drug in the solution was assayed by a High Performance Liquid Chromatography method (HPLC). The release experiments were performed in phosphate buffered saline and in human plasma in vitro. The nanoparticles were enclosed in a dialysis bag and incubated in PBS (ph=7.4, 37 o C) and in human plasma under mild agitation. At predetermined time intervals, samples were withdrawn and assayed for the drug by HPLC. The drug loading and encapsulation values increased and decreased respectively when the drug/polymer ratio increased, by increasing drug input (initially present drug) while keeping polymer input constant. Due to the relatively high aqueous solubility of the three methylxanthines low nanoparticle loadings were generally obtained. Caffeine, despite its higher aqueous solubility, exhibited a little higher encapsulation and loading than theophylline and theobromine. This may be attributed to the much higher partition coefficient K (dcm/water) of caffeine compared to theophylline and theobromine, which would decrease to a higher extend in the case of caffeine the tendency of the drug to pass from the dcm droplets, formed during the second emulsification step of nanoparticle preparation, to the surrounding aqueous phase. As a result, higher drug retention in the nanoparticles was observed in the case of caffeine. Drug release from the nanoparticles was sustained and depended on the aqueous solubility of the drugs. For instance, the more water-soluble caffeine was released relatively faster than the less water-soluble theophylline and the even less water-soluble theobromine, from all PLGAmPEG compositions both in PBS and in human plasma. Drug release from the nanoparticles did not appear to depend on the composition of the PLGAmPEG copolymer used to prepare the nanopaparticles. Drug release rate in plasma was lower than that in PBS, probably due to the binding of the drug molecules to plasma proteins. Drug encapsulation of methylxanthines in the PLGAmPEG nanoparticles depended on the solubility properties of the drugs. The organic/aqueous phase partition coefficient of the drug may be crucial with regard to the incorporation efficiency of the drug in these nanoparticles. Drug release from the nanoparticles was sustained in both PBS and human plasma, but only for the relatively hydrophobic theobromine in a satisfactory extent. The rate of 13

14 drug release was affected by the aqueous solubility of the drug and the release medium. It appears that PLGAmPEG nanoparticles can be applied for controlled drug delivery applications only in the case of relatively water-insoluble drugs. 14

15 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15

16 2.1 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΒΙΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Η συµβατική µέθοδος χορήγησης φαρµακευτικών ουσιών περιλαµβάνει την εισαγωγή της ουσίας σε ένα κεντρικό διαµέρισµα 2 (συστηµατική κυκλοφορία του αίµατος), είτε άµεσα (οδός 2), είτε έµµεσα µετά από µια διαδικασία απορρόφησης (οδός 1). Η είσοδος της κάθε ουσίας στο κεντρικό διαµέρισµα ακολουθείται από την κατανοµή της στα άλλα διαµερίσµατα που είναι οι διάφοροι ιστοί ή τα όργανα του σώµατος (Εικ. 1). Όταν το φάρµακο χορηγείται µέσω των συµβατικών αυτών οδών η συγκέντρωση και ο χρόνος διάθεσης του φαρµάκου στη θέση δράσης (στόχος) δεν µπορούν να καθοριστούν ανεξάρτητα. Απλώς επιλέγεται κατάλληλα η δόση ή και η συχνότητα χορήγησης ώστε να επιτευχθούν θεραπευτικά επίπεδα του φαρµάκου στο στόχο για συγκεκριµένη χρονική περίοδο. Ο κλασικός αυτός τρόπος χορήγησης φαρµακευτικών ουσιών εµφανίζει µειονεκτήµατα στα οποία περιλαµβάνονται η επαγωγή παρενεργειών από την δράση του φαρµάκου στους υγιείς ιστούς, και η δυσκολία συµµόρφωσης των ασθενών στην φαρµακευτική αγωγή. Έτσι στις Η.Π.Α, όπου υπάρχουν σχετικές µελέτες υπολογίζεται ότι το 15 % των ασθενών που εισάγονται στα νοσοκοµεία και περίπου θάνατοι ετησίως οφείλονται στις παρενέργειες των φαρµάκων, ενώ το 10 % των εισαγωγών στα νοσοκοµεία οφείλεται στην µη συµµόρφωση των ασθενών στην φαρµακευτική αγωγή (Classen και συνεργάτες, 1997 και Cramer και συνεργάτες, 1994). Η ελεγχόµενη χορήγηση των φαρµακευτικών ουσιών (Εικ. 2) µπορεί να επιτευχθεί είτε µε την διάθεση του φαρµάκου στο κεντρικό διαµέρισµα µε προκαθορισµένο ρυθµό Kd (οδός 1), είτε µε την εφαρµογή της φαρµακοµορφής στην περιοχή του οργάνου στόχου όπου το φάρµακο αποδεσµεύεται µε συγκεκριµένο και προκαθορισµένο ρυθµό Kd (οδός 2) ή τέλος µε την εισαγωγή του φαρµάκου στην συστηµατική κυκλοφορία του αίµατος και την εκλεκτική µεταφορά του στον στόχο (οδός 3). Η εκλεκτική µεταφορά του φαρµάκου µε τη βοήθεια κατάλληλου φορέα στο όργανο / ιστό στόχο (στόχευση του φαρµάκου) επιτυγχάνεται µε τη σύνδεση/εγκλεισµό του φαρµάκου σε κατάλληλο φορέα ( φαρµακοµορφή ) ο οποίος µε τη βοήθεια ενεργητικού ή παθητικού µηχανισµού συσσωρεύεται εκλεκτικά στην περιοχή δράσης του φαρµάκου. 16

17 ΦΑΡΜΑΚΟΜΟΡΦΗ Ο ΟΣ 2 Ο ΟΣ 1 1 ΚEL ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ Κ a ΣΤΟΧΟΣ ΙΣΤΟΣ Α ΙΣΤΟΣ Γ 2 ΙΣΤΟΣ Β Κ EL ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ Εικόνα 1. Συµβατική χορήγηση φαρµακευτικών ουσιών 17

18 ΦΑΡΜΑΚΟΜΟΡΦΗ Ο ΟΣ 2 Ο ΟΣ 3 Ο ΟΣ 1 Κ d ΣΤΟΧΟΣ ΙΣΤΟΣ Α ΙΣΤΟΣ Γ 2 ΙΣΤΟΣ Β Κ 2 ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ Εικόνα 2. Ελεγχόµενη χορήγηση φαρµακευτικών ουσιών. Με την ελεγχόµενη χορήγηση, µε την οποία µπορεί να καθοριστεί ανεξάρτητα και επακριβώς η ποσότητα και ο χρόνος διάθεσης της δραστικής ουσίας στη θέση δράσης αυτής, παρέχεται η δυνατότητα για: 1. Σταθεροποίηση των επιπέδων της δραστικής ουσίας πάνω από τα θεραπευτικά επίπεδα για όσο χρόνο διαρκεί η θεραπεία και µικρότερες διακυµάνσεις της συγκέντρωσης. 2. Ελάττωση των παρενεργειών. 3. Ελάττωση της ποσότητας του φαρµάκου που απαιτείται για τη θεραπεία. 4. Ελάττωση της συχνότητας χορήγησης των δόσεων και πιθανώς και της δυσκολίας χορήγησης, µε αποτέλεσµα και τη βελτίωση της συµµόρφωσης του ασθενούς. 5. Αποτελεσµατική χορήγηση βιοδραστικών ουσιών µε µικρή βιολογική ηµιπερίοδο ζωής, όπως τα πεπτίδια και οι πρωτεΐνες. 18

19 Τα συστήµατα ελεγχόµενης χορήγησης πέρα από το µειονέκτηµα του αυξηµένου κόστους παρασκευής τους σε σύγκριση µε τις συµβατικές φαρµακοµορφές είναι δυνατόν να εµφανίζουν τοξικότητα λόγω των υλικών που χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή αυτών ή λόγω των προϊόντων βιοδιάσπασης αυτών, φέρουν τον κίνδυνο υπέρβασης των τοξικών επιπέδων του φαρµάκου από την (µη αναµενόµενη) απότοµη απελευθέρωση του εγκλεισµένου φαρµάκου (dose dumping effect), ενώ είναι επίσης δυνατή η ενόχληση του ασθενούς από τη φαρµακοµορφή αλλά και από τον τρόπο χορήγησης αυτής. Επιπλέον µε τα συστήµατα παρατεταµένης αποδέσµευσης είναι πιθανή η ανάπτυξη ανοχής από τη συνεχή παρουσία της δραστικής ουσίας στη θέση δράσης, φαινόµενο που έχει παρατηρηθεί για παράδειγµα στην περίπτωση των νιτρωδών (Noak και Born, 1987). Ακόµη µε τα συστήµατα ελεγχόµενης αποδέσµευσης χορηγούµενα από το στόµα είναι δυνατόν να έχουµε ελάττωση της βιοδιαθεσιµότητας του φαρµάκου, όπως στην περίπτωση συστηµάτων ελεγχόµενης αποδέσµευσης της προπανολόλης και της θεοφυλλίνης (Gundert Remy και Hildebrandt, 1984, και McAinsh και συνεργάτες, 1978). Τα συστήµατα ελεγχόµενης χορήγησης µπορούν να καταταχθούν ανάλογα µε την πολυπλοκότητα που παρουσιάζουν στην τεχνολογία τους σε τέσσερις κατηγορίες, (Εικ. 3 ) (Chien, 1992): 1. Συστήµατα προκαθορισµένου ρυθµού αποδέσµευσης (Εικ. 3,Α) Πρόκειται για συστήµατα των οποίων ο ρυθµός αποδέσµευσης του φαρµάκου καθορίζεται από την κατασκευή του συστήµατος. Ο έλεγχος αυτός επιτυγχάνεται µε την εισαγωγή στο σύστηµα φραγµού (barrier) µέσω του οποίου ελέγχεται ο ρυθµός διάχυσης των µορίων του φαρµάκου από το σύστηµα στο περιβάλλον υγρό. Ο φραγµός αυτός περιλαµβάνει δύο τύπους. Τα λεγόµενα συστήµατα µεµβράνης (membrane ή reservoir systems), στα οποία ο φραγµός είναι µια πολυµερική µεµβράνη που περιβάλλει το σύστηµα, και τα συστήµατα τύπου µήτρας (matrix systems) όπου το φάρµακο βρίσκεται διαλυµένο ή διεσπαρµένο εντός πολυµερικής ή κηρώδους µήτρας. Οι δύο αυτές µορφές συστηµάτων ελεγχόµενης αποδέσµευσης είναι οι απλούστερες µορφές που µπορούµε να συναντήσουµε και πολλά συστήµατα αυτού του τύπου χρησιµοποιούνται σήµερα στη θεραπευτική. 19

20 2. Συστήµατα ενεργοποιούµενης αποδέσµευσης (activation modulated systems ) (Εικ.3,Β) Στα συστήµατα αυτά µέσω παρέµβασης κάποιας φυσικής, χηµικής ή βιοχηµικής διεργασίας ή ακόµα και µε την παροχή κάποιας εξωτερικώς προερχόµενης ενέργειας επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση της αποδέσµευσης του φαρµάκου. Στους φυσικούς τρόπους ενεργοποίησης τέτοιων συστηµάτων περιλαµβάνονται µεταξύ άλλων η οσµωτική πίεση, η οποία βρίσκει εφαρµογή στα γνωστά συστήµατα σταθερού ρυθµού αποδέσµευσης τύπου ωσµωτικής αντλίας (Alza Corporation) (Theeuwes, 1983), η εφαρµογή ηλεκτροµαγνητικού πεδίου για την επιτάχυνση της αποδέσµευσης από συστήµατα στα οποία έχουν εγκλεισθεί µαγνητικά σωµατίδια (Hsieh και Langer, 1983), η εφαρµογή ασθενούς ηλεκτρικού πεδίου (ιοντοφόρηση) σε διαδερµικά συστήµατα µε σκοπό την διευκόλυνση διόδου των φαρµάκων µέσω του δέρµατος (Bertolucci, 1982) και η ενυδάτωση υδρόφιλης πολυµερικής µήτρας που προκαλεί διόγκωση επιτρέποντας την αποδέσµευση του φαρµάκου µε ρυθµό χρήσιµο θεραπευτικά (Peppas, 1987). Στους χηµικούς τρόπους ενεργοποίησης της αποδέσµευσης περιλαµβάνονται η υδρόλυση, η οποία προκαλεί την σταδιακή in vivo διάσπαση του φραγµού (µήτρας ή µεµβράνης) ο οποίος περιορίζει την αποδέσµευση του φαρµάκου (Heller,1984), καθώς επίσης και η ph-εξαρτώµενη υδρόλυση, η οποία οδηγεί στην εκλεκτική διάλυση του φραγµού όταν βρίσκεται σε περιβάλλον µε συγκεκριµένο ph και η οποία βρίσκει ευρεία εφαρµογή στην παρασκευή εντεροδιαλυτών µορφών (Chien, 1983). 3. Συστήµατα στα οποία η αποδέσµευση ελέγχεται από µηχανισµό ανάδρασης (feed back regulated systems) (Εικ. 3,Γ) Η αποδέσµευση της δραστικής ουσίας από τα συστήµατα αυτά επάγεται από την ενεργοποίηση ενός βιοχηµικού παράγοντα in vivo. Ο ρυθµός αποδέσµευσης εξαρτάται από την συγκέντρωση του βιοχηµικού παράγοντα µέσω µηχανισµού ανάδρασης. Η πιο εξελιγµένη µορφή τέτοιων συστηµάτων ελεγχόµενης είναι τα συστήµατα αυτορυθµιζόµενης αποδέσµευσης (self-regulated systems), τα οποία βρίσκονται ακόµη σε πειραµατικό στάδιο. Σε ένα τέτοιο σύστηµα (Jeong και συνεργάτες, 1984) σύµπλοκα γλυκοσυλιωµένης ινσουλίνης µε κονκαναβαλλίνη Α (glycosylated insulin concanavalin A complex), περιβάλλονται από ηµιπερατή πολυµερική µεµβράνη. Η γλυκόζη του αίµατος εισέρχεται 20

21 στο σύστηµα µέσω της ηµιπερατής µεµβράνης και εκτοπίζει την γλυκοσυλιωµένη ινσουλίνη από το σύµπλοκο µε την κονκαναβαλλίνη Α, ενεργοποιώντας την αποδέσµευση της γλυκοσυλιωµένης ινσουλίνης από το σύστηµα. Η απελευθέρωση της ινσουλίνης προκαλεί πτώση και επαναφορά των επιπέδων της γλυκόζης στο αίµα σε φυσιολογικά επίπεδα. Η πτώση των επιπέδων της γλυκόζης προκαλεί µε τη σειρά της ελάττωση της ποσότητας ινσουλίνης που αποδεσµεύεται από το σύστηµα (Εικ.4). Εικόνα 3. Κατηγορίες συστηµάτων ελεγχόµενης χορήγησης βιοδραστικών ουσιών 21

22 Εικόνα 4. Αυτορυθµιζόµενο σύστηµα χορήγησης ινσουλίνης 4. Συστήµατα στόχευσης (drug targeting systems) (Εικ. 3, ) Τα συστήµατα αυτά επιχειρούν την εκλεκτική αποστολή της δραστικής ουσίας στην θέση δράση αυτής. Η εκλεκτική αποστολή στα κύτταρα στόχο έχει ως αποτέλεσµα την βελτίωση του θεραπευτικού δείκτη του φαρµάκου και είναι ιδιαίτερα σηµαντική σε ισχυρά φάρµακα µε αυξηµένη τοξικότητα, όπως είναι τα αντικαρκινικά φάρµακα. Το ιδανικό σύστηµα στόχευσης κατά τον Ringsdorf (1978) περιλαµβάνει τα εξής: µία µη - ανοσογονική βιοδιασπώµενη πολυµερική αλυσίδα στην οποία έχει προσδεθεί µια κατευθυντήρια οµάδα (targeting moiety), η οποία θα οδηγήσει το σύστηµα στον στόχο και ένας διαλυτοποιητής (solubiliser) αν χρειάζεται, για την διάλυση του συστήµατος στα βιολογικά υγρά (π.χ. αίµα). Τα µόρια του φαρµάκου συνδέονται στο σύστηµα µέσω ενός βραχίονα (spacer) ο οποίος φέρει χηµικούς δεσµούς που µπορούν να διασπασθούν µόνο από ένζυµα που βρίσκονται στην περιοχή του κυττάρου στόχου, ελευθερώνοντας το φάρµακο (Εικ.5). Το παραπάνω σύστηµα παραµένει εν πολλοίς ακόµη θεωρητική σύλληψη. Παρ όλα αυτά τα τελευταία χρόνια έχει επιτευχθεί σηµαντική πρόοδος στο σχεδιασµό συστηµάτων στόχευσης, η οποία βασίζεται στην καλύτερη κατανόηση του βιολογικού συστήµατος αλλά και στην τεράστια ανάπτυξη που έχει συντελεσθεί στους τοµείς της µοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας, µε αποτέλεσµα αρκετά τέτοια συστήµατα να 22

23 βρίσκονται σήµερα στο στάδιο των κλινικών δοκιµών. Για την ανάπτυξη αυτών των συστηµάτων γίνεται εκµετάλλευση τόσο των φυσιολογικών όσο και των παθοφυσιολογικών ιδιαιτεροτήτων του στόχου (κυρίως σε κυτταρικό επίπεδο). Η εκλεκτική συσσώρευση του συστήµατος στον στόχο συµβαίνει παθητικά (passive targeting) ή ενεργητικά (active targeting). ραστικές ουσίες µικρού µοριακού βάρους, όπως είναι τα αντικαρκινικά φάρµακα, µπορούν να διαπεράσουν εύκολα τις κυτταρικές µεµβράνες των περισσοτέρων ιστών, οπότε το φάρµακο κατανέµεται ταχέως σε όλο το σώµα και όχι εκλεκτικά στον πάσχοντα ιστό. Εάν λοιπόν το φάρµακο προσδεθεί µε κάποιο τρόπο σε µεγαλοµοριακή ουσία όπως για παράδειγµα ένα βιοσυµβατό πολυµερές και οι δεσµοί αυτοί είναι αρκετά σταθεροί ώστε να επιτρέπουν την παρατεταµένη κυκλοφορία του φαρµάκου στο αίµα, η είσοδος του συµπλέγµατος στα κύτταρα λόγω του µεγάλου µοριακού βάρους µπορεί να γίνει µόνο µε ενδοκύττωση. Οι καρκινικοί όγκοι εµφανίζουν περισσότερο διαπερατά τριχοειδή αγγεία σε σχέση µε τους φυσιολογικούς ιστούς οπότε το σύµπλεγµα φορέα φαρµάκου, το οποίο εµφανίζει ιδιότητες µακράς παραµονής στην γενική κυκλοφορία, µπορεί να εξέλθει από τα αγγεία µόνο στην περιοχή του όγκου και συσσωρεύεται σε αυτούς. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η παθητική στόχευση. Η ενεργητική στόχευση µπορεί να γίνει µε τη σύνδεση του συµπλέγµατος φορέαφαρµάκου µε ένα µόριο που ονοµάζεται κατευθυντήρια οµάδα (targeting moiety) και αναγνωρίζεται από συγκεκριµένους υποδοχείς των κυττάρων στόχων. Η οµάδα αυτή µπορεί να είναι κάποιο αντίσωµα, υδατάνθρακας, πεπτίδιο ή ολιγονουκλεοτίδιο. Την µεγαλύτερη δυσκολία αυτής της προσέγγισης για την χορήγηση φαρµάκων αποτελεί η εύρεση µη ανοσογονικών και εξαιρετικά εξειδικευµένων κατευθυντήριων οµάδων. Παρ όλα αυτά τα τελευταία χρόνια έχει επιτευχθεί κάποια πρόοδος. Έτσι, έχει επιτευχθεί η ικανοποιητική στόχευση του ηπατικού παρεγχύµατος από το σύµπλεγµα συµπολυµερούς HPMA και φαρµάκου προσδένοντας σ αυτό γαλακτόζη η οποία αναγνωρίζεται από τον υποδοχέα της ασιαλογλυκοπρωτεΐνης που βρίσκεται στα ηπατοκύτταρα (Dunkan και συνεργάτες 1996). Επίσης, η πρόσδεση του fab τµήµατος µονοκλωνικού αντισώµατος έναντι του HER2/new σε στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα λιποσώµατα στα οποία είχε εγκλωβιστεί η αντικαρκινική ουσία δοξορουµπικίνη (doxorubicin), οδήγησε σε αποτελεσµατικότερη παρεµπόδιση της in vivo ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων µαστού που υπερεκφράζουν την HER2/new σε σύγκριση µε τα λιποσώµατα που δεν φέρουν το αντίσωµα (Park και συνεργάτες, 1996, Kiprotin και συνεργάτες, 1997). 23

24 Εικόνα 5. Ιδανικό σύστηµα ελεγχόµενης αποδέσµευσης και στόχευσης φαρµακευτικών ουσιών, σύµφωνα µε τον Ringsdorf (1978). 1.2 ΒΙΟ ΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΠΟΛΥΜΕΡΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ Εισαγωγή Η εφαρµογή βιοδιασπώµενων συστηµάτων ελεγχόµενης χορήγησης βιοδραστικών ουσιών, καθιστά περιττή την χειρουργική επέµβαση για την αποµάκρυνση των κενών φορέων µετά την αποδέσµευση του φαρµάκου. Επιπλέον, στην περίπτωση που οι ιδιότητες του συστήµατος επιτρέπουν τον έλεγχο του ρυθµού βιοδιάσπασης, είναι δυνατός ο έλεγχος (επιλογή) της κινητικής της αποδέσµευσης του φαρµάκου µε κατάλληλη ρύθµιση του ρυθµού βιοδιάσπασης. Για την παρασκευή βιοδιασπώµενων συστηµάτων χορήγησης φαρµάκων χρησιµοποιούνται πολυµερικά υλικά τα οποία υφίστανται την αποικοδοµητική 24

25 δράση του βιολογικού µέσου η οποία οδηγεί στην µεταβολή των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων του συστήµατος ή και στην πλήρη µετατροπή του σε διαλυτά προϊόντα που αποµακρύνονται από την θέση εφαρµογής του συστήµατος. Για την περιγραφή της in vivo αποικοδόµησης των βιοδιασπώµενων φορέων χρησιµοποιούνται τρεις κυρίως όροι: βιοδιάσπαση, (biodegradation), βιοδιάβρωση (bioerosion) και βιοαπορρόφηση (bioabsorption). Ο τελευταίος όρος χρησιµοποιείται κυρίως στην ιατρική για να περιγράψει την απορρόφηση εµφυτευµάτων από το σώµα. Ένα τέτοιο παράδειγµα αποτελεί η εξαφάνιση από την περιοχή εφαρµογής τους των βιοαπορροφούµενων ιατρικών ραµµάτων όταν εισαχθούν στο ανθρώπινο σώµα. Οι όροι βιοδιάσπαση και βιοδιάβρωση χρησιµοποιήθηκαν από τους Graham και Wood (1982) και από τον Heler (1985) για την περιγραφή πολυµερών που υφίστανται διάσπαση in vivo και εξαφανίζονται εντελώς από το σηµείο εµφύτευσής τους. O όρος βιοδιάσπαση όµως χρησιµοποιήθηκε κυρίως για την περιγραφή φαινοµένων υδρολυτικής, ενζυµικής ή βακτηριακής διάσπασης του πολυµερούς in vivo η οποία δεν καταλήγει απαραίτητα σε µεταβολή της φυσικής του κατάστασης (Holland και συνεργάτες, 1986). Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν τον όρο βιοδιάβρωση για τις περιπτώσεις καταστροφής του πολυµερούς µετά από in vivo φυσικές ή χηµικές διαδικασίες πολλές φορές µη πλήρως διευκρινισµένες. Σύµφωνα µε άλλους ερευνητές ο όρος βιοδιάσπαση (biodegradation) πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο όταν στη διάσπαση του πολυµερούς συµµετέχει ενεργά και το βιολογικό σύστηµα, όπως για παράδειγµα στην περίπτωση της συµµετοχής ενζύµων του οργανισµού στην διάσπαση του πολυµερούς. Στις άλλες περιπτώσεις θα πρέπει να χρησιµοποιείται απλά ο όρος διάσπαση (degradation) (Williams,1982) Μηχανισµοί διάσπασης πολυµερών in vivo Οι τρεις βασικοί µηχανισµοί διάσπασης των πολυµερών φαίνονται στην Εικ.6 (I, II και III). Στην περίπτωση των πολυµερών που φέρουν σταυρωτούς οµοιοπολικούς δεσµούς (cross links) η διάσπαση προς διαλυτές πολυµερικές αλυσίδες επέρχεται µετά από υδρόλυση των ασταθών δεσµών οι οποίοι µπορούν να είναι (τύπος IA) ή να µην είναι (τύπος IB) οι σταυρωτοί δεσµοί. Στην περίπτωση που τα πολυµερή φέρουν οµάδες που 25

26 µπορούν να υδρολυθούν, ιονιστούν ή πρωτονιωθούν in vivo, η µετατροπή των αρχικά αδιάλυτων πολυµερικών αλυσίδων σε διαλυτές µπορεί να βασίζεται στις µεταβολές αυτές (τύπος II). Ο τρίτος µηχανισµός βιοδιάσπασης περιλαµβάνει την υδρόλυση ευαίσθητων δεσµών των πολυµερικών αλυσίδων οδηγώντας σταδιακά στην αποικοδόµηση του πολυµερούς σε διαλυτά προϊόντα µικρού µοριακού βάρους (τύπος III, Εικ. 6). Οι τύποι διάσπασης I και II αφορούν πολυµερή αρχικώς αδιάλυτα στα βιολογικά υγρά (π.χ. υγρά γαστρεντερικού σωλήνα, αίµα) ενώ ο τύπος III αφορά τόσο τα πολυµερή που διαλύονται από τα βιολογικά υγρά όσο και αυτά που δεν διαλύονται και παραµένουν στην στερεή κατάσταση µέχρι τη διάσπασή τους προς διαλυτά στα βιολογικά υγρά προϊόντα. Στην πράξη, η βιοδιάσπαση ενός πολυµερούς µπορεί να είναι περισσότερο πολύπλοκη περιλαµβάνοντας συνδυασµό των παραπάνω µηχανισµών. Εικόνα 6. Μηχανισµοί διάσπασης πολυµερών in vivo. 26

27 Αποδέσµευση του φαρµάκου από βιοδιασπώµενα συστήµατα χορήγησης Η αποδέσµευση της δραστικής ουσίας από τα βιοδιασπώµενα συστήµατα χορήγησης επιτυγχάνεται µε έκλουση της ουσίας από το υγρό διάλυσης µετά την διάσπαση του πολυµερούς, µε διάχυση της ουσίας διαµέσου του πολυµερούς ή µε συνδυασµό των δύο παραπάνω µηχανισµών. Ο αργός ρυθµός αποδέσµευσης εξαρτάται κυρίως από τη διάχυση της ουσίας στην πολυµερική µήτρα. Στην περίπτωση που ο ρυθµός διάσπασης του πολυµερούς είναι αργός, τότε η κινητική της αποδέσµευσης περιγράφεται από το πρότυπο Higuchi (1963): M t = M 1 2 Kt Εξίσωση 1 όπου Mt / M είναι το ποσοστό του φαρµάκου που αποδεσµεύεται σε χρόνο t και K η σταθερά που εξαρτάται από τις φυσικοχηµικές ιδιότητες του πολυµερούς και του φαρµάκου καθώς και από την κατασκευή του συστήµατος. Στην αντίθετη περίπτωση κατά την οποία η διάσπαση του πολυµερούς εξελίσσεται µε µεγαλύτερο ρυθµό από τη διάχυση της ουσίας, τότε η κινητική αποδέσµευσης καθορίζεται από τη διάσπαση του πολυµερούς. Η διάσπαση του πολυµερούς µπορεί να συµβαίνει σε όλη τη µάζα του (οµοιογενής διάσπαση), διαδικασία που οδηγεί στην κατάρρευση της δοµής του πολυµερούς. Στην περίπτωση που το πολυµερές είναι υδρόφοβο αλλά υδρολύεται προς υδρόφιλα προϊόντα η διάσπαση περιορίζεται στη επιφάνεια του συστήµατος (ετερογενής διάσπαση). Πολυµερή που υφίστανται οµοιογενή διάσπαση αποτελούν πολύπλοκα συστήµατα όσον αφορά την κατανόησή τους. Πράγµατι, η διάσπαση προκαλεί µεταβολή της κατάστασης του πολυµερούς µε τον χρόνο η οποία δεν µπορεί να περιγραφεί εύκολα και ο ρυθµός αποδέσµευσης του φαρµάκου από τέτοια συστήµατα δεν είναι ούτε σταθερός ούτε προβλέψιµος. Σε συστήµατα στα οποία το πολυµερές υφίσταται ετερογενή διάσπαση µπορεί να επιτευχθεί κινητική µηδενικής τάξεως (σταθερός ρυθµός αποδέσµευσης) εάν η αποδέσµευση του φαρµάκου λόγω διάχυσης είναι ελάχιστη και η επιφάνεια του συστήµατος που εκτίθεται στο περιβάλλον υγρό παραµένει σταθερή όσο χρόνο διαρκεί η αποδέσµευση. Στην περίπτωση ετερογενούς διάσπασης ο ρυθµός αποδέσµευσης του φαρµάκου µπορεί να περιγραφεί από την παρακάτω εξίσωση (Hophenberg, 1976): 27

28 M M t = K ot 1 a Co n 1 Εξίσωση 2 όπου ο λόγος Mt / M αποτελεί το ποσοστό του φαρµάκου που ελευθερώνεται σε χρόνο t, K o είναι η σταθερά ρυθµού διάσπασης του πολυµερούς και C α ο είναι το αρχικό ποσό του φαρµάκου στο σύστηµα. Τα n και α είναι σταθερές που εξαρτώνται από τη γεωµετρία του συστήµατος. Για παράδειγµα στην περίπτωση πλακιδίου, n=1 και το α ισούται µε το µισό πάχος του πλακιδίου, για τον κύλινδρο n=2 και το α ισούται µε την ακτίνα του, ενώ για σφαίρα n=3 και το α ισούται πάλι µε την ακτίνα του. Σύµφωνα και µε την παραπάνω εξίσωση σταθερό ρυθµό αποδέσµευσης έχουµε µόνο στην περίπτωση που το σύστηµα έχει τη µορφή πλακιδίου, ενώ για τα άλλα συστήµατα ο ρυθµός αποδέσµευσης της δραστικής ουσίας µειώνεται µε το χρόνο. Τα πλέον µελετηµένα πολυµερή που υφίστανται διάσπαση τύπου IA είναι τα συµπολυµερή βινυλ-πυρολιδόνης ή ακρυλαµιδίου µε N,N -µεθυλενοδισακρυλαµιδίο, όµως ο ρυθµός διάσπασής τους είναι εξαιρετικά αργός. Τα συµπολυµερή ακρυλαµιδίου µε Ν,Ν - µεθυλενοδισακρυλαµιδίο έχουν µελετηθεί για την χορήγηση της προσταγλαδίνης F2α και αιθυνυλοοιστραδιόλης σε µύες µε τη µορφή υποδερµικών εµφυτευµάτων (Davis και Chang, 1972, Davis και συνεργάτες, 1972). Τα αποτελέσµατα ήταν αυτά που περιµένουµε για την αποδέσµευση δραστικών ουσιών µικρού µοριακού βάρους από υλικό το οποίο διογκώνεται µε το νερό αλλά ουσιαστικά δεν συµβαίνει σηµαντική διάβρωσή του κατά τη διάρκεια χρήσης του συστήµατος. Εποµένως η προσταγλαδίνη F2α, που είναι ελάχιστα διαλυτή στο νερό, απελευθερώνεται µέσα σε 24 h, ενώ η αιθυνυλοοιστραδιόλη που είναι λιγότερο διαλυτή στο νερό αποδεσµεύεται µε αργότερο ρυθµό, και στις δύο περιπτώσεις όµως ακολουθείται κινητική αποδέσµευσης πρώτης τάξεως. Ένα παράδειγµα συστήµατος που διασπάται µε τύπου IB διάσπαση είναι µικροσωµατίδια παρασκευασµένα από δεξτράνη που έχει αλληλεπιδράσει µε ακρυλικό οξύ, γλυκιδικό εστέρα και Ν,Ν - µεθυλενοδισακρυλαµίδιο (Edman P., και συνεργάτες, 1980). Τα τεµαχίδια αυτά ήταν σταθερά σε ph από 2 µέχρι 7 και ο ρυθµός υδρόλυσής τους αυξανόταν µε αύξηση του ph. Μακροµόρια όπως καρβονική ανυδράση, ανθρώπινη αλβουµίνη ορού, ανοσοσφαιρίνη και καταλάση ενσωµατώθηκαν στα σωµατίδια χωρίς να παρατηρηθεί απώλεια της δραστικότητάς τους. Η αποδέσµευση αυτών των ουσιών βρέθηκε να καθορίζεται από τη διάχυση. 28

29 Έχουν αναπτυχθεί δύο τάξεις συστηµάτων που χρησιµοποιούν διάσπαση τύπου II ή συνδυασµό διάσπασης τύπου II και III για την ελεγχόµενη αποδέσµευση δραστικών ουσιών. Στη µία τάξη η ουσία διασπείρεται µέσα στην πολυµερική µήτρα και ελευθερώνεται όταν λαµβάνει χώρα η διαλυτοποίησή της. Σε αυτή περιλαµβάνονται συστήµατα που φέρουν εντερική επικάλυψη. Αυτά τα συστήµατα σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να είναι αδιάλυτα σε κάποιο συγκεκριµένο ph, συνήθως του στοµάχου, αλλά διαλύονται µε την αλλαγή του ph, για παράδειγµα στον εντερικό αυλό. Συνήθως τα πολυµερή αυτά χρησιµεύουν ως προστατευτικά των δισκίων και όχι για την ελεγχόµενη αποδέσµευση ουσιών. Όµως είναι δυνατόν µε τη χρήση διαφόρων µιγµάτων και επικαλύψεων, τα οποία έχουν διαφορετικό ρυθµό διάσπασης, να επιτευχθεί παρατεταµένη αποδέσµευση των δραστικών ουσιών (Robinson, 1976). Η διάλυση αυτών των πολυµερών µπορεί να γίνει µε τρεις κυρίως τρόπους: (α) διάλυση µε υδρόλυση πλευρικών αλυσίδων π.χ. συµπολυµερή αλκυλ-βινυλεστέρων µε ανυδρίτη του µηλεϊνικού οξέος, (β) διάλυση µε ιονισµό καρβοξυλικών οµάδων, π.χ. στην περίπτωση της οξικής φθαλικής κυτταρίνης, (γ) διάλυση µε πρωτονίωση αµινοµάδων, π.χ. Ν,Ν διαιθυλαµινοοξική κυτταρίνη (cellulose acetate N,N diethylaminoacetate). Στη δεύτερη τάξη η δραστική ουσία συνδέεται οµοιοπολικά µε την πολυµερική αλυσίδα και η ουσία αποδεσµεύεται στο περιβάλλον όταν ο δεσµός αυτός διασπαστεί. Υπάρχουν και σε αυτή την κατηγορία δύο πολυµερικά συστήµατα, στο ένα η δραστική ουσία είναι υδατοδιαλυτή και το πολυµερές παίζει το ρόλο φορέα και στο άλλο η δραστική ουσία είναι αδιάλυτη και το πολυµερές δρα ως δεξαµενή από την οποία αποδεσµεύεται σταδιακά. Τέλος ο τύπος διάσπασης III περιλαµβάνει πολυµερή στα οποία η πολυµερική τους αλυσίδα µπορεί να διασπαστεί υδρολυτικά. Το πολυ(γαλακτικό) οξύ ήταν ένα από τα πρώτα πολυµερή που χρησιµοποιήθηκαν µε τη µορφή βιοδιασπώµενων εµφυτευµάτων, και σήµερα πολυµερή βασισµένα στο γαλακτικό, γλυκολικό οξύ και τα συµπολυµερή τους χρησιµοποιούνται ευρύτατα στην ανάπτυξη φαρµακευτικών συστηµάτων. 29

30 1.6 ΒΙΟ ΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΗ ΓΑΛΑΚΤΙΚΟΥ- ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ Πολυ(γαλακτικό γλυκολικό) οξύ Το γλυκολικό και το γαλακτικό οξύ είναι τα κοινά ονόµατα των δύο πρώτων α- υδροξυκαρβοξυλικών οξέων, δηλαδή του α-υδροξυοξικού και του α-υδροξυπροπιονικού οξέος αντίστοιχα. OH CH 2 COOH OH CH COOH CH 3 ΓΛΥΚΟΛΙΚΟ ΟΞΥ ΓΑΛΑΚΤΙΚΟ ΟΞΥ Το γαλακτικό οξύ περιέχει ένα ασύµµετρο άτοµο άνθρακα και εποµένως έχει δύο οπτικά ισοµερή : COOH HO - C - H COOH H C - OH CH 3 CH 3 L (+) D (-) Κυκλικά διµερή του γαλακτικού και γλυκολικού οξέος συντίθενται µε αφυδάτωση των µονοµερών και ονοµάζονται γαλακτίδιο (lactide, LE) και γλυκολίδιο (glycolide, GE). Η κυκλοποίηση γίνεται στην αέρια φάση (Wise και συνεργάτες,1979). Τα κυκλικά διµερή είναι λευκά υγροσκοπικά υλικά τα οποία υδρολύονται παρουσία υγρασίας. Το γαλακτίδιο περιέχει ασύµµετρο άτοµο άνθρακα και διαθέτει τέσσερις διαστερεοϊσοµερείς µορφές, τις L και D που είναι οπτικοί αντίποδες (L (-) και D (+) γαλακτίδιο αντίστοιχα), τη µεσοµορφή DL και το ρακεµικό µίγµα των L (-) και D (+). Το σηµείο τήξεως του ρακεµικού µίγµατος είναι υψηλότερο από αυτό των συστατικών του (Chabot και συνεργάτες, 1983). 30

31 Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά διαστερεοϊσοµερών γαλακτιδίου Ισοµερή L-Γαλακτίδιο D-Γαλακτίδιο DL-Γαλακτίδιο Μέσο-Γαλακτίδιο µσηµείο τήξης( o C) Το γλυκολίδιο (µε σηµείο τήξης 82 ο C) υπάρχει σε δύο ισοµερείς κρυσταλλικές µορφές α και β. Ο α κρύσταλλος είναι θερµοδυναµικά σταθερότερος εάν η κρυσταλοποίηση γίνει πάνω από τους 42 ο C, ενώ η β-µορφή ευνοείται όταν η κρυσταλοποίηση γίνει κάτω από αυτή τη θερµοκρασία. Η α µορφή επειδή είναι και η σταθερότερη προτιµάται για τη σύνθεση πολυµερών υψηλού µοριακού βάρους, όµως σε θερµοκρασία περιβάλλοντος µετατρέπεται αργά στο β-ισοµερές (Frazza και Schmitt, 1971) Σύνθεση συµπολυµερών πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA) Χαµηλού µοριακού βάρους πολυ(γαλακτικό) οξύ, πολυ(γλυκολικό) οξύ και πολυ(γαλακτικό γλυκολικό) οξύ µπορούν να παρασκευαστούν µε απευθείας εστεροποίηση του γαλακτικού οξέος, του γλυκολικού οξέος ή µίγµατος αυτών αντίστοιχα (Filachione E.M. και Fischer C.H., 1944). H-(O-CO-CH 2 -O-CO-CH 2 )x-(o-co-ch(ch 3 )-O-CO-CH(CH 3 ))y-oh Εικόνα 7. Χηµικός τύπος του συµπολυµερούς γαλακτικού- γλυκολικού οξέος (PLGA) Αντίθετα για τη σύνθεση πολυµερών µεγάλου µοριακού βάρους τα µονοµερή που πρέπει να χρησιµοποιηθούν είναι οι κυκλικοί διεστέρες του γαλακτικού και του γλυκολικού οξέος, δηλαδή το γαλακτίδιο (lactide) και γλυκολίδιο (glycolide) αντίστοιχα. Η αντίδραση πολυµερισµού µπορεί να λάβει χώρα µε την παρουσία µονοµερών είτε σε τήγµα (melt polymerization), είτε σε διάλυµα (solution polymerization). Ο πολυµερισµός σε διάλυµα 31

32 γίνεται µε τη διάλυση των µονοµερών σε κατάλληλο οργανικό διαλύτη, όπως χλωροφόρµιο, τολουόλιο ή διοξάνιο, όµως για την παρασκευή πολυµερών µεγάλου µοριακού βάρους απαιτούνται µεγάλοι χρόνοι πολυµερισµού και γι αυτό δεν προτιµάται. Ο πολυµερισµός τήγµατος των µονοµερών γίνεται υπό κενό ή σε ατµόσφαιρα αζώτου σε υψηλή θερµοκρασία που κυµαίνεται από 130 έως 220 ο C. Το µεγάλο µοριακό βάρος των προϊόντων της αντίδρασης εξασφαλίζεται από την υψηλή καθαρότητα, την χαµηλή οξύτητα των µονοµερών και την απουσία υγρασίας υγρασίας στο περιβάλλον που λαµβάνει χώρα η αντίδραση (Lowe, 1954). Η απόδοση της αντίδρασης αλλά και το µοριακό βάρος των προϊόντων της αντίδρασης επηρεάζονται τόσο από τη συγκέντρωση όσο και από το είδος του καταλύτη, καθώς και το χρόνο και τη θερµοκρασία πολυµερισµού (Avgoustakis και Nixon, 1991). Καταλύτες που µπορούν να χρησιµοποιηθούν και να δώσουν συµπολυµερή µεγάλου µοριακού βάρους είναι τα οξέα κατά Lewis, όπως το χλωριούχο αργίλιο, ο διχλωριούχος ψευδάργυρος και το τριφθοριούχο αντιµόνιο, και οι οργανοµεταλλικές ενώσεις, όπως ο 2 (2 αίθυλ- εξανοϊκός) κασσίτερος (Tsuruta και συνεργάτες, 1964, Gilding και Reede, 1979). Ο 2 (2-αιθυλ-εξανοϊκός) κασσίτερος, Sn(oct) 2 είναι ο συχνότερα χρησιµοποιούµενος καταλύτης αφ ενός διότι συµβάλλει στη λήψη προϊόντων υψηλού µοριακού βάρους µε µεγάλη απόδοση και αφ ετέρου διότι η χρήση του σε φαρµακευτικά προϊόντα θεωρείται ασφαλής καθώς έχει επιτραπεί η χρήση του ως σταθεροποιητής τροφίµων από την ιοίκηση Τροφίµων και Φαρµάκων (FDA) των ΗΠΑ. Παρουσία του 2-(2-αιθυλεξανοϊκού)κασσίτερου η αντίδραση πολυµερισµού φαίνεται να προχωράει σύµφωνα µε το µηχανισµό που δίνεται στην εικόνα 8. 32

33 Εικόνα 8. Πιθανός µηχανισµός πολυµερισµού πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος µε καταλύτη 2-(2-αιθυλ-εξανοϊκό) κασσίτερο (RCOOSnCOR) Χαρακτηριστικά των PLGA συµπολυµερών Τα PLGA συµπολυµερή εµφανίζουν µεγάλο εύρος ιδιοτήτων ανάλογα µε την σύστασή τους, δηλαδή την αναλογία γαλακτικού-γλυκολικού οξέος στο µόριό τους, την στερεοχηµεία του γαλακτικού οξέος και το µοριακό βάρος, γεγονός που µαζί µε την αποδεδειγµένη βιοσυµβατότητα και την ικανότητα βιοδιάσπασής τους ερµηνεύει την µεγάλη χρήση που βρίσκουν τα πολυµερή αυτά σε ποικιλία βιοϊατρικών εφαρµογών. α) ιαλυτότητα Τα συµπολυµερή πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος είναι διαλυτά στους συνήθεις οργανικούς διαλύτες. Αυτή η ιδιότητά τους διευκολύνει τη διαµόρφωσή τους σε µορφές χορήγησης φαρµάκων. Συγκεκριµένα το πολυ(dl-γαλακτικό) και το πολυ(γαλακτικόγλυκολικό) οξύ µε ποσοστό µονάδων γλυκολικού οξέος λιγότερο από 50 %, είναι διαλυτά 33

34 στην ακετόνη, οξικό αιθυλεστέρα, τετραϋδροφουράνιο, διοξάνιο, βενζόλιο και σε αλογονωµένους υδρογονάνθρακες (χλωροφόρµιο, µεθυλενοχλωρίδιο). Το πολυ(l-γαλακτικό) οξύ είναι διαλυτό σε χλωριωµένους υδρογονάνθρακες σε θερµοκρασία περιβάλλοντος ενώ η διάλυσή του στο βενζόλιο απαιτεί θέρµανση (Kulkarni και συνεργάτες, 1971, Schindler και Harper, 1979, Deasy και συνεργάτες, 1989). Τέλος το πολυ(γλυκολικό) οξύ και τα συµπολυµερή του µε πολυ(γαλακτικό) οξύ που είναι πλούσια σε µονάδες γλυκολικού οξέος είναι υλικά δυσδιάλυτα στους κοινούς οργανικούς διαλύτες. Έτσι, ο χειρισµός αυτών των πολυµερών απαιτεί ειδικούς διαλύτες, όπως η εξαφθοροϊσοπροπανόλη (HFIP) (Gilding και Reed,1979). Οι παράµετροι διαλυτότητας δ συγκεκριµένων βιοδιασπώµενων πολυµερών καθορίσθηκαν από τον Seimann (1985). Οι τιµές δ για το πολυ(l-γαλακτικό), πολυ(dlγαλακτικό) και το συµπολυµερές τους µε αναλογία 58 : 42 (LE : GE%mol) ήταν παρόµοιες και κυµαίνονταν από 16.4 έως 16.8 x 10 3 (JM 3 ) αντικατοπτρίζοντας τον υδρόφοβο χαρακτήρα αυτών των πολυµερών. β) Κρυσταλλικότητα Η σύσταση των συµπολυµερών καθώς και το είδος των εναντιοµερών µονάδων του γαλακτικού οξέος στο πολυµερές καθορίζει την θερµοκρασία υαλώδους µετάβασης (Tg), το σηµείο τήξεως (Tm) και την κρυσταλλικότητά τους (Gilding και Reed, 1979, Vert και συνεργάτες, 1981). Η κρυσταλλικότητα του πολυ(γλυκολικού) οξέος είναι %, ενώ του πολυ(γαλακτικού) οξέος είναι 37 %. Τα πολυ(dl - γαλακτικό) και πολυ(γαλακτικό- γλυκολικό) οξύ µε περιεκτικότητα σε µονάδες γλυκολικού από 0-70 % είναι άµορφα. γ) Μοριακό βάρος των συµπολυµερών Τα µόρια ενός πολυµερικού υλικού δεν έχουν όλα την ίδια µάζα. Ένα πολυµερές µπορεί να αποτελείται από αλυσίδες διαφόρων µεγεθών µε αποτέλεσµα η πειραµατική µέτρηση του µοριακού βάρους να αντιπροσωπεύει στην πραγµατικότητα µία µέση τιµή που ονοµάζεται µέσο µοριακό βάρος (Billmeyer, 1984). Ανάλογα µε την ιδιότητα στην οποία βασίζεται η µέθοδος µέτρησης λαµβάνονται διάφορες τιµές µοριακού βάρους. Έτσι, εάν η µέτρηση του µοριακού βάρους βασίζεται σε µεγέθη που εξαρτώνται κυρίως από τον 34

35 αριθµό των µορίων του πολυµερούς που υπάρχουν στο δείγµα, όπως για παράδειγµα η ωσµωτική πίεση, προσδιορίζεται το κατά αριθµό µέσο µοριακό βάρος (number-average molecular weight) ή M n : M ΣM N t t n = Εξίσωση 3 N t Όπου Ν t είναι ο αριθµός των µορίων που έχουν µοριακό βάρος Μ i. Στις µεθόδους προσδιορισµού του µοριακού βάρους στις οποίες το µετρούµενο µέγεθος επηρεάζεται από την µάζα του µορίου (π.χ. µέθοδοι που βασίζονται στη µέτρηση της διάθλασης του φωτός από διάλυµα του πολυµερούς), υπολογίζεται το κατά βάρος µέσο µοριακό βάρος, M w. M w ΣM i N = ΣM N t 2 i t Εξίσωση 4 Από τις παραπάνω εξισώσεις είναι προφανές ότι το M w είναι πάντοτε µεγαλύτερο από το M n. Ο λόγος M w / M n ονοµάζεται δείκτης πολυδιασποράς (polydispersity index, PI) και αποτελεί µέτρο του εύρους της κατανοµής του µοριακού βάρους (MWD) ενός πολυµερούς και µπορεί να προσδιορισθεί µε χρωµατογραφία διαπέρασης πηκτής (GPC). Ένα µέτρο του µεγέθους ή της έκτασης γενικά στο χώρο των πολυµερικών µορίων είναι το ιξώδες των διαλυµάτων τους. Επίσης στα γραµµικά πολυµερή σχετίζεται εµπειρικά µε το µοριακό βάρος, µέσω της εξίσωσης Mark-Houwink: [] K( MB) a n = Εξίσωση 5 Στην παραπάνω εξίσωση το [n] αποτελεί το εγγενές ιξώδες (intrinsic viscosity) του πολυµερούς, Κ και α είναι χαρακτηριστικές σταθερές του συστήµατος πολυµερούς - διαλύτη για συγκεκριµένη θερµοκρασία. Σε πολλά συστήµατα το α κυµαίνεται µεταξύ 0.6 και 0.8. Τυπικές τιµές της σταθεράς Κ είναι µεταξύ 0.5 x 10-4 και 5 x 10-4 (Billmeyer F.W., 1984). Το εγγενές ιξώδες µπορεί να υπολογιστεί κατά προσέγγιση από την εξίσωση των Solomon Ciuta (1962): 35

36 1 = [ ]2 Εξίσωση 6 1 [] n 2( ln ) C n sp n rel όπου C είναι η συγκέντρωση του διαλύµατος του πολυµερούς, και n sp, n rel το ειδικό και το σχετικό ιξώδες του διαλύµατος αντίστοιχα. Οι µετρήσεις του εγγενούς ιξώδους οδηγούν στην παρακάτω έκφραση του µέσου µοριακού βάρους του πολυµερούς µε βάση το ιξώδες: M u ΣM t N = ΣM N t 1+ a t t Εξίσωση 7 Έχει βρεθεί ότι σε πολλές περιπτώσεις πολυµερών το M u είναι 10 µε 20 % χαµηλότερο από το M w. Έτσι αν η κατανοµή του µοριακού βάρους είναι γνωστή µπορούµε να υπολογίσουµε από την παρακάτω εξίσωση την σταθερά K: a [ n ] = KM u Εξίσωση 8 Μία λιγότερο ακριβής εξίσωση η οποία µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη συσχέτιση του κατά βάρους µέσου µοριακού βάρους M w µε το εγγενές ιξώδες [n], και στην οποία βασίζεται ο προσδιορισµός του µοριακού βάρους των πολυµερών µε ιξωδοµετρία, είναι η εξής: a [ n ] = KM w Εξίσωση 9 δ) Μηχανικές ιδιότητες Η διαδικασία πολυµερισµού, η στερεοχηµεία του παραγόµενου πολυµερούς, η σύστασή του και το µοριακό του βάρος καθορίζουν τη µηχανική αντοχή των συµπολυµερών πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος. Τα µη κρυσταλλικά πολυ(dl-γαλακτικό) και πολυ(dlγαλακτικό-γλυκολικό) οξέα είναι λιγότερο ανθεκτικά από τα ηµικρυσταλλικά πολυ(lγαλακτικό) και πολυ(γλυκολικό) οξέα (Gilding και Reed, 1979, Vert και συνεργάτες, 1981). Οι Rak και συνεργάτες (1985) βρήκαν µια γραµµική σχέση µεταξύ του µοριακού βάρους, του συντελεστή ελαστικότητας του Young (E) και της ενέργειας που απαιτείται για τη θραύση υµενίων (films) πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος. Επίσης ανέφεραν ότι η αντοχή σε εφελκυσµό (tensile strength) των υµενίων αυξάνεται µε αύξηση του µοριακού βάρους. 36

37 Αύξηση των µονάδων d στο µόριο του dl -PLA που χρησιµοποιείται για την παρασκευή εµφυτευµάτων προκαλεί ελάττωση της µηχανικής αντοχής του (Vert και συνεργάτες, 1981). Η δύναµη τάσης που εφαρµόζονταν κυµαίνονταν από τα 64 MPa για το πολυ(l-γαλακτικό) έως τα 42 MPa για το πολυ(dl- γαλακτικό). Επίσης βρέθηκε ότι οι µήτρες πολυ(l- γαλακτικού) ενισχυµένες µε ίνες πολυ(γλυκολικού) έχουν την απαραίτητη αντοχή για να µπορέσουν να χρησιµοποιηθούν ως βοηθήµατα στην οστεοσύνθεση (Vert και συνεργάτες, 1981). ε) Βιοδιάσπαση του πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος Τα in vivo προϊόντα διάσπασης των συµπολυµερών πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος είναι το γαλακτικό και το γλυκολικό οξύ, τα οποία αποµακρύνονται από το σώµα µέσω του κύκλου του Krebs. Ο ρυθµός βιοδιάσπασής τους είναι παρόµοιος στους διάφορους ιστούς του σώµατος (Kulkarni και συνεργάτες, 1966, Brady και συνεργάτες, 1973, Miller και συνεργάτες, 1977). Ο χρόνος που απαιτείται για την βιοδιάσπασή τους ποικίλλει ανάλογα µε την σύσταση και το µοριακό βάρος των πολυµερών από 1 µήνα έως 2 χρόνια (Miller και συνεργάτες, 1977). Η βιοδιάσπαση των συµπολυµερών αυτών γίνεται σε δύο στάδια (Pitt και συνεργάτες, 1981, Pitt και Gu, 1987). Το πρώτο στάδιο προχωρά µε µη ειδική υδρόλυση των εστερικών δεσµών και µάλιστα το στάδιο αυτό φαίνεται να αυτοκαταλύεται από τις ελεύθερες καρβοξυλικές οµάδες που αποκαλύπτονται µε τη λύση των δεσµών. Η κινητική που ακολουθείται σε αυτό το στάδιο είναι πρώτης τάξης. Η υδρόλυση των εστερικών δεσµών του πολυµερούς συµβαίνει µε παρόµοιο µηχανισµό in vitro και in vivo, γεγονός το οποίο υποδεικνύει ότι δεν υπάρχει στη διαδικασία αυτή ανάµειξη ενζύµων. Το δεύτερο στάδιο της βιοδιάσπασης χαρακτηρίζεται από την έναρξη απώλειας µάζας από το πολυµερές και από την αύξηση του ρυθµού υδρόλυσης. Ούτε σε αυτό το στάδιο έχει αποδειχθεί ανάµειξη ενζύµων. Πάντως έχει δειχθεί ότι σε in vitro πειράµατα η παρουσία κάποιων ενζύµων επιταχύνει τη διάσπασή τους (Williams, 1981, Williams και Mort, 1977). Ο χρόνος που απαιτείται για την βιοδιάσπαση των PLGA συµπολυµερών αυξάνει µε αύξηση του µοριακού τους βάρους (Chawla και Chang, 1986, Ogawa και συνεργάτες, 37