ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΟΥ HPV16 Ε7 ΣΕ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑΤΑ. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΥΠΕΡΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΣΤΟΝ ΠΡΟΑΓΩΓΕΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p16

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2008-2009 ΑΡΙΘΜ. 2324 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΟΥ HPV16 Ε7 ΣΕ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑΤΑ. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΥΠΕΡΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΣΤΟΝ ΠΡΟΑΓΩΓΕΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p16 ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Χ. ΚΡΙΚΕΛΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΟΦΙΑ ΚΟΥΙΔΟΥ-ΑΝΔΡΕΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΧΑΪΤΟΓΛΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΟΦΙΑ ΚΟΥΙΔΟΥ-ΑΝΔΡΕΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΧΑΪΤΟΓΛΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΑΓΟΡΑΣΤΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΡΓΥΡΟΠΟΥΛΟΥ-ΠΑΤΑΚΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ, ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Ἡ ἒγκρισις τῆς Διδακτορικῆς Διατριβῆς ὑπό τῆς Ἰατρικῆς Σχολῆς τοῦ Ἀριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δέν ὑποδηλοῖ ἀποδοχήν τῶν γνωμῶν τοῦ συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, ἂρθρ. 202 2 καί ν. 1268/82, ἂρθρ. 50 8) 2

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ 3

4

Στους γονείς μου, Χαρίλαο και Φρειδερίκη 5

6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ 19 1.1 Ο κυτταρικός κύκλος 19 1.2 Απόπτωση 21 1.3 Ογκογονίδια 21 1.4 Ογκοκατασταλτικά γονίδια 22 2. ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ 23 2.1 Μεθυλίωση του DNA 23 2.1.α Μεθυλίωση του DNA και καρκίνος 25 2.1.β Μεθυλίωση του DNA και καρκινογένεση από ιούς 26 2.1.γ Μεθυλίωση του DNA και κάπνισμα 27 3. ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟ ΓΟΝΙΔΙΟ p16 INK4a 28 3.1 Οργάνωση του γονιδίου 28 3.2 Η πρωτεΐνη p16 INK4a 29 3.3 Ρόλος της πρωτεΐνης p16 INK4a στον κυτταρικό κύκλο και ρύθμιση των επιπέδων της 29 3.4 Βιολογικός ρόλος του γονιδίου p16 INK4a - μηχανισμοί απενεργοποίησης 31 3.5 Υπερμεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου p16 INK4a και καρκίνος του πνεύμονα 32 4. ΙΟΙ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ 34 4.1 Κριτήρια ογκογονικότητας 34 4.2 Άμεση και έμμεση επαγωγή της καρκινογένεσης 36 4.3 Παθογένεια της καρκινογένεσης 37 7

4.3.α Γενετική αστάθεια 37 4.3.β Κυτταρική αθανατοποίηση 38 4.3.γ Κακοήθης μετασχηματισμός 39 4.3.δ Ρύθμιση του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος 40 4.3.ε Ανατροπή της ανοσολογικής επιτήρησης 40 4.3.στ Η υπόθεση hit and run 41 4.3.ζ Ιική συνέργεια στην καρκινογένεση 41 5. ΙΟΙ ΗPV ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ 43 5.1 Δομή των ιών HPV 43 5.2 Ταξινόμηση των ιών HPV 44 5.3 Μετάδοση και φυσική ιστορία των ιών HPV 46 5.4 Μεταγραφή των γονιδίων των ιών HPV και μεταγραφικός χάρτης 47 5.5 Οργάνωση του κύκλου ζωής του ιού HPV 48 5.6 Δομή και δράσεις των πρώιμων ογκοπρωτεϊνών HPV16 E6 και E7 53 5.6.α Δομή και δράσεις της πρώιμης ογκοπρωτεΐνης HPV16 Ε6 54 5.6.β Δομή και δράσεις της πρώιμης ογκοπρωτεΐνης HPV16 Ε7 58 5.7 Η σημασία της ενσωμάτωσης των HPV υψηλού κινδύνου για την καρκινογένεση 61 5.8 Όψιμη πρωτεΐνη HPV L1 66 5.9 Όψιμη πρωτεΐνη HPV L2 68 5.10 HPV λοίμωξη και καρκίνος πνεύμονα 69 5.11 Μέθοδοι ανίχνευσης των ιών HPV 75 5.11.α Μέθοδοι ενίσχυσης του στόχου 76 5.11.β Μέθοδοι ενίσχυσης του σήματος 79 5.11.γ Κλινικό δείγμα για την ανίχνευση του ιού HPV 79 5.11.δ Ευαισθησία και ειδικότητα των μεθόδων ανίχνευσης 80 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 6. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 83 6.1 Δειγματοληψία 83 6.2 Επεξεργασία των βρογχικών εκπλυμάτων 83 6.3 Απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων 83 8

6.3.α Απομόνωση του γονιδιωματικού DNA 84 6.3.β Απομόνωση του RNA 84 6.4 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 85 6.5 Φωλιασμένη PCR (nested PCR) 87 6.6 PCR θερμής έναρξης (hot start PCR) 87 6.7 Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR 88 6.8 Ανάλυση με ενζυμα περιορισμού 88 6.9 Πολυμορφισμός μήκους θραύσματος από περιοριστικό ένζυμο (RFLP) 90 6.10 Τυποποίηση των ιών HPV με τη μέθοδο του υβριδισμού 90 6.11 Προσδιορισμός της αλληλουχίας βάσεων στο DNA (DNA sequencing) 94 7. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 95 7.1 Υλικό 95 7.1.α Προέλευση των δειγμάτων 95 7.1.β Συλλογή και αποθήκευση των ιστικών δειγμάτων 97 7.1.γ Επεξεργασία και αποθήκευση των βρογχικών εκπλυμάτων 98 7.1.δ Επεξεργασία και αποθήκευση των τραχηλικών επιχρισμάτων 98 7.2 Μέθοδοι 98 7.2.α Απομόνωση γονιδιωματικού DNA από ιστικά δείγματα 98 7.2.β Απομόνωση γονιδιωματικού DNA από δείγματα βρογχικών εκπλυμάτων 100 7.2.γ Απομόνωση γονιδιωματικού DNA από τραχηλικά επιχρίσματα 101 7.2.δ Ποσοτικός προσδιορισμός και ποιοτικός έλεγχος του DNA που απομονώθηκε 101 7.2.ε Απομόνωση RNA από ιστικά δείγματα 101 7.2.στ Ποσοτικός προσδιορισμός και ποιοτικός έλεγχος του RNA που απομονώθηκε 102 7.2.ζ Παραγωγή μονόκλωνου συμπληρωματικού DNA (cdna) από αγγελιαφόρο RNA (mrna) 102 7.2.η Μελέτη της έκφρασης του ογκογονιδίου HPV16 E7 με τη μέθοδο PCR 103 7.2.θ Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR 103 9

7.2.ι Τυποποίηση των ιών HPV 104 7.2.ι.i Τυποποίηση με τη μέθοδο του υβριδισμού κατά Southern 104 7.2.ι.ii Τυποποίηση των ιών HPV με RFLP 107 7.2.ια Ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA (DNA sequencing) 108 7.3 Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη 108 7.4 Στατιστική ανάλυση 110 8 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 111 8.1 Στόχοι της μελέτης 111 8.2 Ανίχνευση των ιών HPV με τη μέθοδο PCR θερμής έναρξης 111 8.2.α Ανίχνευση του ογκογονιδίου HPV16 Ε7 με φωλιασμένη PCR 112 8.2.α.i Ανάπτυξη των πρωτοκόλλων ανίχνευσης του ιού HPV 112 8.2.α.ii Σχεδιασμός των εκκινητών της φωλιασμένης PCR 115 8.2.α.iii Συνθήκες των αντιδράσεων PCR στα πειραματικά πρωτόκολλα 1-4 117 8.2.α.iv Αποτελέσματα ανίχνευσης του ογκογονιδίου HPV16 E7 119 8.2.α.v Βελτιστοποίηση της αντίδρασης PCR για τον προσδιορισμό του ογκογονιδίου HPV16 E7 122 8.2.α.vi Επιπρόσθετα πειραματικά πρωτόκολλα μεγέθυνσης των ογκογονιδίων HPV16 Ε6 και Ε7 128 8.2.β Ανίχνευση του γονιδίου HPV L1 132 8.2.β.i Συνθήκες της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου HPV L1 132 8.2.β.ii Αποτελέσματα ανίχνευσης του γονιδίου HPV L1 133 8.2.β.iii Ταυτοποίηση του γονιδίου HPV16 L1 με την τεχνική του υβριδισμού στυπώματος κατά Southern 134 8.3 Ανίχνευση της έκφρασης του ογκογονιδίου HPV16 Ε7 136 8.4 Πέψη των προϊόντων ενίσχυσης του ογκογονιδίου HPV16 Ε7 με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού PvuII και AvaII 138 8.5 Επαναληψιμότητα των πειραμάτων μεγέθυνσης με PCR 142 8.6 Αποτελέσματα αλληλούχησης των προϊόντων των πειραματικών πρωτοκόλλων μεγέθυνσης 2 και 4 143 8.7 Συσχέτιση της ανίχνευσης του ογκογονιδίου HPV16 Ε7 με την υπερμεθυλίωση στον προαγωγέα του γονιδίου p16 INK4a 151 10

8.7.α Σε πνευμονικό ιστό 151 8.7.β Σε τραχηλικά επιχρίσματα 152 8.8 Συσχέτιση της ανίχνευσης του ογκογονιδίου HPV16 Ε7 και της μεθυλίωσης του προαγωγέα του p16 INK4a, σε τραχηλικά επιχρίσματα, με το κάπνισμα και λοιπές συσχετίσεις 152 8.9 Δείγματα με ιστολογικές αλλοιώσεις εκτός μη μικροκυτταρικού καρκίνου πνεύμονα 154 9. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 157 10. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 166 11. SUMMARY 170 12. ΓΛΩΣΣΑΡΙ 173 13. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 175 11

12

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος του πνεύμονα έχει προσλάβει τις τελευταίες δεκαετίες διαστάσεις επιδημίας, καθώς 1.35 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται ετησίως. Αποτελεί τη συχνότερη διάγνωση καρκίνου ανάμεσα στους άνδρες στον ανεπτυγμένο κόσμο, ενώ μεταξύ των γυναικών είναι η τέταρτη συχνότερη εντόπιση καρκίνου που διαγιγνώσκεται. Ανησυχητικό είναι το γεγονός ότι η επίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα έχει αυξηθεί κατά 50% περίπου την τελευταία 20ετία, ενώ παρά το ότι μεταξύ των ανδρών εμφανίζεται κάποια τάση σταθεροποίησης, τα ποσοστά αυξάνονται όσον αφορά στο γυναικείο φύλο. Εκτός από την επίπτωση, απειλητικά εμφανίζονται τα στοιχεία σχετικά και με τη θνητότητα από τον καρκίνο του πνεύμονα, καθώς αποτελεί τη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες και τη δεύτερη συχνότερη στις γυναίκες, μετά τον καρκίνο του μαστού. Παρά την πρόοδο που έχει συντελεστεί στην επιβίωση σχετικά με τις διάφορες μορφές καρκίνου, η 5ετής επιβίωση για τον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει δυσμενής, κυμαινόμενη γύρω στο 10%. Η σημαντικότερη αιτία της πτωχής πρόγνωσης είναι το προχωρημένο στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση, ενώ οι υπάρχουσες θεραπείες δεν είναι αρκετά αποτελεσματικές. Ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί το 85% των περιπτώσεων, ενώ το υπόλοιπο 15% αφορά σε μικροκυτταρικό καρκίνο. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το κάπνισμα είναι ο σημαντικότερος παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση καρκίνου του πνεύμονα. Παρόλα αυτά, δεν είναι δυνατό να αποδοθούν όλες οι νέες περιπτώσεις στο κάπνισμα. Υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός ασθενών που δεν έχουν καπνίσει ποτέ, ενώ είναι πιθανό ο αριθμός αυτός να αυξηθεί στο μέλλον. Ως επιπρόσθετοι παράγοντες κινδύνου ενοχοποιούνται η έκθεση σε ραδόνιο, οι υψηλές δόσεις εξωτερικής ακτινοβολίας, χημικά καρκινογόνα όπως ο αμίαντος και η ατμοσφαιρική ρύπανση. Η μεγάλη πρόοδος της μοριακής βιολογίας έχει οδηγήσει στην κατανόηση κάποιων βασικών οδών που οδηγούν στην καρκινογένεση. Μελέτες στον καρκίνο του πνεύμονα ενοχοποιούν μεταλλάξεις του ογκογονιδίου KRAS στο 30% των αδενοκαρκινωμάτων, ενώ σε μικρότερο βαθμό πιστεύεται ότι συμμετέχει η ενίσχυση ή υπερέκφραση των γονιδίων c-myc, της κυκλίνης D1 και του EGFR. Επιπλέον, στην παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα φαίνεται ότι εμπλέκεται και η απενεργοποίηση των 13

ογκοκατασταλτικών γονιδίων p53, p16 και Rb. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μελέτη των επιγενετικών μεταβολών, όπως η μεθυλίωση, που πιστεύεται ότι επηρεάζουν τη λειτουργία των προαναφερθέντων γονιδίων σε βαθμό μεγαλύτερο ακόμη και από τις μεταλλάξεις. Στην προσπάθεια να αναγνωριστούν επιπρόσθετοι παράγοντες που οδηγούν στην καρκινογένεση στον πνεύμονα, ήδη από τα τέλη της δεκαετίας του 1970 αναφέρθηκε η πιθανή εμπλοκή του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (Human Papillomavirus, HPV). Οι ιοί HPV υψηλού κινδύνου είναι καρκινογόνοι και ανευρίσκονται σχεδόν στο 100% των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ο τύπος που ευθύνεται κυρίως είναι ο HPV16, με τα γονίδια Ε6 και Ε7 να παίζουν το βασικό ρόλο στη μετασχηματιστική ικανότητα του ιού. Οι αρχικές αναφορές σχετικά με την καρκινογένεση στον πνεύμονα βασίστηκαν σε παθολογοανατομικές παρατηρήσεις και ενισχύθηκαν στη συνέχεια με την καλύτερη κατανόηση της ογκογόνου δράσης του ιού. Ήδη ο ιός HPV ενοχοποιείται ως σημαντικός παράγοντας κινδύνου για τους καρκίνους κεφαλής και τραχήλου, ενώ σχετικά με τον καρκίνο του πνεύμονα οι αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία είναι αρκετές αλλά παρουσιάζουν αποκλίσεις μεταξύ τους όσον αφορά στο βαθμό με τον οποίο ο ιός HPV είναι παρών και επηρεάζει την καρκινογένεση. Η ανακολουθία των αποτελεσμάτων ανίχνευσης του ιού στον καρκίνο του πνεύμονα θεωρείται ότι οφείλεται πιθανώς σε επιδημιολογικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες, ενώ στις υπάρχουσες μελέτες ακολουθούνται διαφορετικές τεχνικές και προσεγγίσεις ανίχνευσης του ιού που επιτείνουν τη σύγχυση. Τα τελευταία έτη έχουν αναπτυχθεί αποτελεσματικά εμβόλια έναντι του ιού HPV, ενώ πρόσφατα εγκρίθηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) ο μαζικός εμβολιασμός έναντι του ιού σε παγκόσμια κλίμακα, προκειμένου να αντιμετωπιστεί ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας. Το αυξανόμενο ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας σχετικά με την καρκινογόνο δράση του ιού HPV φαίνεται και από την απονομή του βραβείου Nobel Ιατρικής 2009 στον επιστήμονα που ανέδειξε τον ιό HPV ως βασικό παράγοντα κινδύνου στην καρκινογένεση του τραχήλου της μήτρας. Από τα παραπάνω, συμπεραίνεται ότι η μελέτη της συμμετοχής του ιού και σε άλλες μορφές καρκίνου, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα, αποκτά ιδιαίτερη σημασία. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η παρουσία του ιού HPV, και συγκεκριμένα του ογκογονιδίου Ε7, σε επιθηλιακά καρκινώματα του πνεύμονα 14

και να μελετηθεί η παρουσία και ο τρόπος δράσης του ιού συγκριτικά με τον γνωστό τρόπο που δρα ο ιός στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Έγινε προσπάθεια να ερμηνευθούν οι αντικρουόμενες αναφορές που υπάρχουν στη βιβλιογραφία σχετικά με τη συμμετοχή του ιού HPV στην καρκινογένεση του πνεύμονα και να καθοριστεί μια προσέγγιση ανίχνευσης του ιού που θα μπορούσε στη συνέχεια να αξιολογηθεί σε μεγάλες επιδημιολογικές μελέτες. Στους σκοπούς της παρούσας μελέτης περιλαμβάνεται, επίσης, η συσχέτιση της παρουσίας του ογκογονιδίου Ε7 με τη μεθυλίωση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16, το οποίο ευρίσκεται συχνά απενεργοποιημένο στους καρκίνους πνεύμονα και τραχήλου της μήτρας. Αισθάνομαι την υποχρέωση να εκφράσω τη βαθιά ευγνωμοσύνη μου στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Χαΐτογλου, μέλος της τριμελούς επιτροπής, ο οποίος υπήρξε δάσκαλος στη βιολογία από τα πρώτα χρόνια της εκπαίδευσής μου. Ήταν ο πρώτος που με εμπιστεύτηκε και με εισήγαγε στο χώρο του Εργαστηρίου της Βιολογικής Χημείας. Κατά τη διάρκεια των χρόνων που εργάστηκα κοντά του, η παραδειγματική ψυχραιμία του και η πολύχρονη εμπειρία του είχαν καθοριστική σημασία στην ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Αλέξανδρο Λαμπρόπουλο, μέλος της τριμελούς επιτροπής, ο οποίος χάρη στη βαθιά γνώση και εμπειρία σχετικά με τη μοριακή βιολογία και τον ιό HPV ειδικότερα, υπήρξε πολύτιμος αρωγός με τις υποδείξεις και τις διορθώσεις του. Πάντοτε ευγενής και ευχάριστος ήταν πηγή σιγουριάς και αισιοδοξίας. Ιδιαίτερη θέση στην καρδιά μου έχει ο Επίκουρος Καθηγητής κ. Γεώργιος Τζημαγιώργης, μέλος της επταμελούς επιτροπής. Πάντοτε παρών στο χώρο του Εργαστηρίου, δάσκαλος αλλά και φίλος, έκανε τις ατελείωτες ώρες να κυλούν πιο ευχάριστα. Οι συνεχείς υποδείξεις του και η διδασκαλία του με εισήγαγαν στο χώρο της βιολογίας. Η εξαίρετη κατάρτισή του στη μοριακή βιολογία και η οξυδέρκειά του αποτέλεσαν το λόγο που η παρούσα μελέτη ολοκληρώθηκε με επιτυχία. Θα ήθελα από καρδιάς να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια και Διευθύντρια του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, μέλος της επταμελούς επιτροπής, κ. Νόρμα Βαβάτση-Χριστάκη, η οποία μου παρείχε απεριόριστη υλική και ηθική υποστήριξη από την πρώτη στιγμή της παρουσίας μου στο εργαστήριο. Ευχαριστώ, επίσης, τον Καθηγητή κ. Θεόδωρο Αγοραστό, μέλος της επταμελούς επιτροπής, ο οποίος παρείχε κλινικά δείγματα ασθενών από τα ιατρεία που διευθύνει καθώς και την Καθηγήτρια κ. Παρασκευή Αργυροπούλου-Πατάκα, μέλος της επταμελούς επιτροπής. Όλοι ήταν 15

ιδιαίτερα ενθαρρυντικοί και οι υποδείξεις τους ήταν πολύτιμες στα τελικά στάδια της συγγραφής. Ευχαριστώ θερμά τον Διευθυντή της Θωρακοχειρουργικής Κλινικής του Θεαγενείου Αντικαρκινικού Νοσοκομείου κ. Χρήστο Τσιλίκα, τον Διευθυντή της Πνευμονολογικής Κλινικής κ. Γεώργιο Σαρίκο και τον Αναπληρωτή Διευθυντή κ. Ιακώβ Άντζελ για τη συνεργασία και την παροχή κλινικών δειγμάτων και δεδομένων των ασθενών τους. Ιδιαίτερη ευγνωμοσύνη αισθάνομαι για τη συνάδελφο κ. Ελισάβετ Γεωργίου, η οποία με αγκάλιασε από την πρώτη στιγμή που έγινα μέλος της ομάδας του Εργαστηρίου. Υπήρξε φίλη και δασκάλα μαζί, πολύτιμος συνεργάτης και ανεκτίμητος αρωγός. Με την αξιοθαύμαστη υπομονή της με καθοδήγησε τα πρώτα χρόνια και με τις ευρείες γνώσεις της και το πάθος της για έρευνα αποτέλεσε για εμένα το καλύτερο πρότυπο. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής της σχετικά με τη μεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου p16 στον καρκίνο του πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή για τη διερεύνηση συσχέτισης με την παρουσία του ογκογονιδίου Ε7. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στη βιολόγο κ. Θεοδώρα Κατωπόδη, οι συμβουλές της οποίας στη σύνταξη του τελικού κειμένου υπήρξαν καθοριστικές. Στην άριστη και οικογενειακή ατμόσφαιρα του Εργαστηρίου συμβάλλει και η παρουσία των μεταπτυχιακών φοιτητών και υποψηφίων διδακτόρων που εργάζονται εκεί. Η Αικατερίνη Φράγκου, ο Κωνσταντίνος Φαιδωνίδης, η Άντρεα Ιωάννου και ο Χρήστος Καραγεωργόπουλος είναι λίγα μόνο από τα πρόσωπα που με βοήθησαν ουσιαστικά αλλά και ηθικά στην εκπόνηση της διατριβής. Τους ευχαριστώ όλους από καρδιάς. Τέλος, όσον αφορά στην Καθηγήτρια κ. Σοφία Κουίδου-Ανδρέου, επιβλέπουσα της διδακτορικής διατριβής, είναι ιδιαίτερα δύσκολο να εκφράσω το μέγεθος της ευγνωμοσύνης και του θαυμασμού μου προς αυτήν. Η προσωπικότητά της και η καλλιέργεια του πνεύματός της, παράλληλα με την άριστη γνώση της μοριακής βιολογίας και την εξαίρετη αντίληψή της έκαναν δυνατή την ολοκλήρωση της διατριβής. Παρά το γεγονός ότι προέκυψαν συχνά δυσκολίες και αδιέξοδα, η δασκάλα μου ήταν πάντοτε παρούσα παρέχοντάς μου ανεκτίμητη βοήθεια. Αισθάνομαι μεγάλη τιμή που μαθήτευσα κοντά της και ιδιαίτερα τυχερός που είχα την ευκαιρία να ζήσω τόσο καιρό δίπλα της. 16

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18

1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Ο καρκίνος μπορεί να ορισθεί ως μια γενετική ασθένεια που προέρχεται από γενετική βλάβη, η οποία προκαλεί διαταραχή της έκφρασης γονιδίων σημαντικών για την ομαλή αύξηση του κυττάρου (1). Ο καρκίνος είναι η τελική κατάληξη μιας σειράς μεταβολών που οδηγούν σε απώλεια των μηχανισμών ελέγχου της διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού και της χωροταξίας των κυττάρων. Οι μεταβολές που χαρακτηρίζουν τα καρκινικά κύτταρα συνοψίζονται ως εξής: αυτοδυναμία σε αυξητικά σήματα, αντίσταση σε σήματα ανασταλτικά της αύξησης, διαφυγή από μηχανισμούς απόπτωσης, απεριόριστο δυναμικό πολλαπλασιασμού, ικανότητα για αγγειογένεση ικανότητα για διείσδυση και μετάσταση. Η καρκινογένεση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία, η οποία ξεκινά με την έκθεση σε μεταλλαξιγόνους παράγοντες (χημικά καρκινογόνα, ακτινοβολία, ογκογόνοι ιοί) που έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία κυττάρων με πλεονέκτημα πολλαπλασιασμού και επιβίωσης. Η εξέλιξη προς τον κακοήθη φαινότυπο συμβαίνει όταν επιδράσουν επιπρόσθετα αυξητικοί παράγοντες και προκληθούν γενετικέςεπιγενετικές μεταβολές (ενεργοποίηση ογκογονιδίων, απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων) (2,3). Τα γονίδια που επηρεάζονται κατά την καρκινογένεση είναι αυτά που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (κυτταρικό κύκλο) και τον κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) και διακρίνονται σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. 1.1 Ο κυτταρικός κύκλος Ο κυτταρικός κύκλος είναι μια σειρά γεγονότων, ένα σύνθετο κύκλωμα που περιέχει θετικούς και αρνητικούς ρυθμιστές που σκοπό έχουν τον ακριβή διπλασιασμό του γενετικού υλικού και την ισότιμη διαίρεση του κυττάρου σε δύο κύτταρα-απογόνους (4). Ο κυτταρικός κύκλος διακρίνεται σε τέσσερις φάσεις: α. τη φάση S (synthesis) κατά την οποία γίνεται διπλασιασμός του γενετικού υλικού β. τη φάση Μ (mitosis) κατά την οποία λαμβάνει χώρα η κυτταρική διαίρεση 19

γ. τη φάση G 1 που προηγείται της φάσης S, και τέλος δ. τη φάση G 2 που προηγείται της μίτωσης. Η φάση ηρεμίας G 0 είναι μια φάση άλλοτε άλλης διάρκειας κατά την οποία τα κύτταρα δε διαιρούνται και βρίσκονται σε αδράνεια (Εικόνα 1). Αδράνεια Τελική διαφοροποίηση Απόπτωση Κυτταρική ανάπτυξη Σημείο περιορισμού, R Μίτωση Αντιγραφή DNA Σημείο ελέγχου G 2 Εικόνα 1. Κυτταρικός κύκλος. Υπάρχουν δύο σημεία ελέγχου που καθορίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου καθώς εκεί λαμβάνεται η απόφαση για την εξέλιξή του: α. το σημείο περιορισμού, R (restriction) στη φάση G 1 όπου λαμβάνεται η απόφαση για την είσοδο στη φάση S (5) β. το τέλος της φάσης G 2 όπου λαμβάνεται η απόφαση για είσοδο στη μίτωση. Σημαντικό ρόλο για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου παίζει μια ομάδα πρωτεϊνών, οι οποίες είναι γνωστές ως κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclindependent kinases, cdks). Προκειμένου να ενεργοποιηθούν, σχεδόν όλες απαιτούν τη σύνδεση με πρωτεΐνες που ονομάζονται κυκλίνες. Επομένως, μια ενεργός κυκλινοεξαρτώμενη κινάση είναι ένα ετεροδιμερές ένζυμο αποτελούμενο από μια ρυθμιστική υπομονάδα (κυκλίνη) και μια καταλυτική υπομονάδα (κινάση) (6). Όπως φαίνεται στην εικόνα 1, κάθε κυκλίνη μαζί με τις αντίστοιχες κινάσες δραστηριοποιούνται σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου (7). Η περαιτέρω ρύθμιση της δραστικότητας των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών μπορεί να γίνει αφενός μεν με φωσφορυλίωση αφετέρου δε με τη δράση των 20

αναστολέων των cdks. Οι αναστολείς αυτοί διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: στην οικογένεια των αναστολέων Cip/Kip (πρωτεΐνες p21, p27, p57), οι οποίοι είναι γενικοί αναστολείς των cdks (8) και στην οικογένεια των πρωτεϊνών INK4 (πρωτεΐνες p15, p16, p18, p19), οι οποίοι είναι ειδικοί αναστολείς των cdks4/6 και του συμπλέγματός τους με την κυκλίνη D (9,10). 1.2 Απόπτωση Απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι η προαγωγή του κυτταρικού θανάτου μέσω προκαθορισμένων μοριακών μηχανισμών που διαθέτει το κύτταρο. Η απόπτωση είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη και ομοιόσταση των πολυκύτταρων οργανισμών (11). Κυρίαρχο ρόλο στον έλεγχο της απόπτωσης παίζει η οικογένεια των πρωτεϊνών bcl-2 (12). Οι πρωτεΐνες αυτές λειτουργούν ανασταλτικά στην απόπτωση και αποτελούν μια ομάδα πρωτο-ογκογονιδίων γνωστής ως αντι-αποπτωτικά γονίδια (13). Κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης κατέχει, επίσης, η πρωτεΐνη ΤΡ53 που ενεργοποιείται σε περίπτωση μη επιδιορθώσιμης βλάβης του DNA (14). Η δράση της ΤΡ53 προάγει την απόπτωση μέσω αύξησης της έκφρασης του γονιδίου Βax ταυτόχρονα με την ελάττωση της έκφρασης της bcl-2 (15). Στην καρκινογένεση, παρατηρείται απώλεια της ικανότητας των κυττάρων για απόπτωση ταυτόχρονα με την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και την αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (16). 1.3 Ογκογονίδια Τα ογκογονίδια μπορεί να είναι είτε μεταλλαγμένες μορφές φυσιολογικών γονιδίων του κυττάρου που ονομάζονται πρωτο-ογκογονίδια (17) είτε γονίδια ογκογόνων ιών με ικανότητα μεταμόρφωσης του κυττάρου ξενιστή (18). Τα γονίδια αυτά συμμετέχουν σε οδούς που ρυθμίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική διαίρεση και διαφοροποίηση (19). Αρκεί η ενεργοποίηση μόνο του ενός από τα δύο αλλήλια ενός πρωτο-ογκογονιδίου ώστε αυτό να μετατραπεί σε ογκογονίδιο και να επηρεάσει το φαινότυπο του κυττάρου. Η ενεργοποίηση των πρωτο-ογκογονιδίων μπορεί να γίνει με (20): 21

α. σημειακές μεταλλάξεις, οι οποίες οδηγούν σε μεταβολές της δομής και των ιδιοτήτων των αντίστοιχων πρωτεϊνών (πχ ογκογονίδιο Ras) β. υπερέκφραση του γονιδίου, λόγω χρωμοσωμικής μετατόπισής του δίπλα στον προαγωγέα ενός συχνά εκφραζόμενου γονιδίου (πχ χρωμόσωμα Philadelphia, Ph1) γ. γονιδιακή ενίσχυση, δηλαδή ενσωμάτωση πολλαπλών αντιγράφων του γονιδίου και συνεπώς αυξημένη έκφρασή του (πχ ογκογονίδιο c-myc) 1.4 Ογκοκατασταλτικά γονίδια Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την κυτταρική αύξηση και τον πολλαπλασιασμό και η απώλεια της λειτουργίας τους μπορεί να οδηγήσει στον κακοήθη φαινότυπο. Οι πιο γνωστοί εκπρόσωποι είναι τα γονίδια p53 και Rb που βρίσκονται απενεργοποιημένα (λόγω μετάλλαξης ή απενεργοποίησης της πρωτεΐνης που κωδικοποιούν) στις περισσότερες περιπτώσεις καρκίνου. Οι φυσιολογικές λειτουργίες των ογκοκατασταλτικών γονιδίων περιλαμβάνουν την αναστολή του κυτταρικού κύκλου, την πρόοδο της απόπτωσης και τη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος, μέσω διαφύλαξης της πιστότητας της αντιγραφής του DNA και της απρόσκοπτης επιδιόρθωσής του (21-26). Σύμφωνα με την υπόθεση του Knudson (27), τα ογκοκατασταλτικά γονίδια εμφανίζουν υπολειπόμενη ογκογενετική δράση και επομένως, αντίθετα με τα ογκογονίδια που δρουν ως επικρατή, απαιτείται μετάλλαξη ή έλλειψη και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου προκειμένου να κατασταλεί η φυσιολογική δράση τους. 22

2. ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Είναι γνωστό ότι οι μεταλλάξεις, είτε είναι κληρονομούμενες μέσω των γεννητικών κυττάρων είτε (συχνότερα) προκύπτουν κατά τη διάρκεια της ζωής στα σωματικά κύτταρα, μπορούν να οδηγήσουν σε καρκίνο. Αυτές οι μεταλλάξεις μπορούν να μεταβάλλουν τη λειτουργία γονιδίων, όπως πχ να ενισχύσουν τη λειτουργία ογκογονιδίων ή να προκαλέσουν απώλεια της λειτουργίας ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Επί μακρόν υπήρχε το ερώτημα εάν η έναρξη και η εξέλιξη του καρκίνου οφειλόταν μόνο στις μεταλλάξεις ή και σε «επιγενετικές» μεταβολές που δεν σχετίζονται με αλλαγές στην πρωτοταγή αλληλουχία των βάσεων στο DNA. Ο όρος «επιγενετική» αναφέρεται σε μια κληρονομούμενη (στα σωματικά κύτταρα) μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης που δεν οφείλεται σε αλλαγή της αλληλουχίας των βάσεων του DNA (28). Δύο βασικοί μηχανισμοί που προκαλούν επιγενετικές μεταβολές είναι η μεθυλίωση του DNA και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών (29). Διαταραχή στην ισορροπία των επιγενετικών μηχανισμών μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στη δομή της χρωματίνης και στη μεταγραφική δραστηριότητα. Οι επιγενετικές μεταβολές μπορούν να γεφυρώσουν με τον καλύτερο τρόπο την έκθεση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες και το γενετικό υπόστρωμα στη διαδικασία της καρκινογένεσης (30). 2.1 Μεθυλίωση του DNA Στα ανθρώπινα κύτταρα η μεγάλη πλειοψηφία των γονιδίων είναι απενεργοποιημένα, καθώς τα περισσότερα γονίδια είναι απαραίτητα σε ορισμένα μόνο κύτταρα και εκφράζονται μόνο σε αυτά. Η μεθυλίωση διατηρεί το μεγάλο τμήμα του μη κωδικοποιού DNA σε αδρανή μεταγραφικά κατάσταση. Είναι γνωστό ότι η συχνότητα των CpG δινουκλεοτιδίων είναι πολύ μικρότερη (4-5 φορές) από την αναμενόμενη, με βάση τη συχνότητα των βάσεων κυτοσίνης (C) και γουανίνης (G) στο DNA. Από τα υπάρχοντα CpG δινουκλεοτίδια περίπου 60-90% είναι μεθυλιωμένα και αυτή η υψηλή συχνότητα παρέχει μια πιθανή αιτιολόγηση της ελαττωμένης συχνότητας CpG: οι κυτοσίνες του DNA υπόκεινται σε αυτόματη υδρολυτική απαμίνωση προς ουρακίλη (U), μια βάση που αναγνωρίζεται από τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA, απομακρύνεται και αντικαθίσταται. 23

Αντίθετα, όταν η 5 -μεθυλοκυτοσίνη υφίσταται την ίδια απαμίνωση, η βάση που προκύπτει δεν είναι ουρακίλη αλλά θυμίνη (Τ), μια βάση που είναι μέρος της φυσιολογικής δομής του DNA και διαφεύγει από τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς (Εικόνα 2) (31). Έτσι η χαμηλή συχνότητα των CpG δινουκλεοτιδίων πιθανώς αντανακλά τη σταδιακή τους απώλεια μέσω αυτής της διαδικασίας C T χημικής μετάπτωσης (transition), που αποτελεί το συχνότερο πολυμορφισμό στον ανθρώπινο πληθυσμό και από τις συχνότερες μεταλλάξεις στον καρκίνο (32,33). Τα περισσότερα από τα CpG δινουκλεοτίδια που έχουν διατηρηθεί είναι διασκορπισμένα στο γονιδίωμα, κάποια όμως βρίσκονται σε πολύ υψηλή συγκέντρωση σε περιοχές που ονομάζονται «CpG νησίδες» (CpG islands). Πρόκειται για περιοχές του γονιδιώματος μήκους 500-2000 ζευγών βάσεων (base pairs, bp) και αντιστοιχούν στις περιοχές των προαγωγέων των περισσοτέρων από τα μισά γονιδίων (η πλειοψηφία των CpG νησίδων σχετίζεται με γονίδια που αφορούν στη διατήρηση της κυτταρικής οργάνωσης, house-keeping genes). Στις περιοχές αυτές η συχνότητα CpG είναι παρόμοια με την αναμενόμενη με βάση τη συχνότητα των C+G βάσεων και ο λόγος CpG/GpC είναι περίπου 60%. Αυτό σημαίνει ότι στις περιοχές αυτές τα CpG δεν υπέστησαν την απώλεια που συνέβη στο υπόλοιπο γονιδίωμα, κάτι που οφείλεται στο γεγονός ότι τα CpG δινουκλεοτίδια στις περιοχές αυτές δεν είναι μεθυλιωμένα, σε αντίθεση με εκείνα που βρίσκονται διασκορπισμένα στο γονιδίωμα (34). κυτοσίνη ουρακίλη απαμίνωση απαμίνωση 5- μεθυλοκυτοσίνη θυμίνη Εικόνα 2. Απαμίνωση της κυτοσίνης σε ουρακίλη και της 5 -μεθυλοκυτοσίνης σε θυμίνη. 24

2.1.α Μεθυλίωση του DNA και καρκίνος Δύο ειδών διαταραχές της μεθυλίωσης έχουν αναγνωριστεί στα καρκινικά κύτταρα: απομεθυλίωση και υπερμεθυλίωση. Ενώ αρχικά πιστευόταν ότι οι μεταβολές της μεθυλίωσης στον καρκίνο αφορούσαν μόνο γενικευμένη απομεθυλίωση του γονιδιώματος που θα μπορούσε να οδηγήσει σε μαζική υπερέκφραση ογκογονιδίων (35), τώρα είναι αποδεκτό ότι η απομεθυλίωση αφορά μόνο στα CpG δινουκλεοτίδια που είναι διασκορπισμένα στο γονιδίωμα και όχι σε αυτά που βρίσκονται σε CpG νησίδες (36). Δύο πιθανές συνέπειες της απομεθυλίωσης του γονιδιώματος είναι: α) η απώλεια του ελέγχου της μεταγραφής σε φυσιολογικά «σιωπηρές» περιοχές, που θα μπορούσε να οδηγήσει σε έκφραση ιικών και άλλων φυσιολογικά απενεργοποιημένων γονιδίων και β) η περικεντρομεριδιακή αστάθεια, καθώς οι περιοχές του κεντρομεριδίου χρειάζονται αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης για τη σωστή λειτουργία τους (37). Η δεύτερη μεταβολή της μεθυλίωσης του DNA που παρατηρείται στον καρκίνο είναι η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων σε περιοχές προαγωγέων γονιδίων, σχετίζεται με καταστολή της μεταγραφής και αποτελεί, μαζί με τις μεταλλάξεις, έναν μηχανισμό για την αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων (38). Στο τροποποιημένο μοντέλο του Knudson (39), η διαταραχή της λειτουργίας ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου απαιτεί την απώλεια της λειτουργίας και των δύο αλληλίων του γονιδίου. Η απώλεια της λειτουργίας του ενός αλληλίου μπορεί να οφείλεται σε κληρονομούμενες ή σωματικές μεταλλάξεις στην κωδικοποιούσα περιοχή του γονιδίου. Το δεύτερο συμβάν (hit) συνήθως οφείλεται σε απώλεια της περιοχής του χρωμοσώματος που περιέχει το άλλο αλλήλιο (απώλεια της ετεροζυγωτίας). Η υπερμεθυλίωση του προαγωγέα ενός γονιδίου μπορεί να έχει το ίδιο αποτέλεσμα με μια μετάλλαξη στην κωδικοποιούσα περιοχή του (πρώτο συμβάν) (40). Ενώ οι σημειακές μεταλλάξεις σπάνια μπορούν να αποτελέσουν αιτία για την απώλεια της λειτουργίας και των δύο αλληλίων, η υπερμεθυλίωση των προαγωγέων και των δύο αντιγράφων ενός γονιδίου δεν είναι σπάνια σε σποραδικό καρκίνο. Ο πιθανός μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η υπερμεθυλίωση των προαγωγέων στον καρκίνο είναι ο εξής: στο μεταμορφωμένο κύτταρο κάποιες CpG νησίδες ογκοκατασταλτικών γονιδίων θα εμφανίσουν υπερμεθυλίωση (38,41). Αυτό πιθανότατα είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία, σε αντίθεση με την εμφάνιση μιας μετάλλαξης σε ένα γονίδιο. Χρειάζονται αλλεπάλληλες ώσεις διαταραγμένης 25

μεθυλίωσης για να προκύψει τόσο έντονη υπερμεθυλίωση, αρκετή για να προκαλέσει μεταγραφική απενεργοποίηση του αντίστοιχου γονιδίου. Η μεταγραφική απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων λόγω της υπερμεθυλίωσης των προαγωγέων τους είναι συχνό φαινόμενο στον καρκίνο, πιθανώς συχνότερο των μεταλλάξεων. Ο συνεχώς αυξανόμενος κατάλογος γονιδίων που εμφανίζουν υπερμεθυλίωση των προαγωγέων τους περιλαμβάνει γονίδια που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο (p16 INK4a, p15 INK4b, Rb, p14 ARF ) (42-47), στην επιδιόρθωση του DNA (BRCA1, hmlh1, MGMT) (48-54), στο μεταβολισμό των καρκινογόνων (GSTP1) (55,56), στην κυτταρική συγκόλληση (CDH1, CDH13) (57-60) και στην απόπτωση (DAPK, TMS1) (61-64). Φαίνεται, μάλιστα, ότι υπάρχει ένα προφίλ υπερμεθυλίωσης CpG νησίδων ανάλογα με το είδος του όγκου. Επιπλέον, κάποια νεοπλάσματα παρουσιάζουν πολύ εντονότερη μεθυλίωση (οισοφάγου, στομάχου, εντέρου) σε σχέση με άλλα που εμφανίζουν σημαντικά ασθενέστερη μεθυλίωση (ωοθηκών). Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι τα νεοπλάσματα με το μεγαλύτερο βαθμό μεθυλίωσης είναι αυτά με τη μεγαλύτερη έκθεση σε καρκινογόνες ουσίες (65). 2.1.β Μεθυλίωση του DNA και καρκινογένεση από ιούς Η λοίμωξη από DNA ιούς και ρετροϊούς που μπορούν να προκαλέσουν εισαγωγή ιικού DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή, συχνά ενεργοποιεί ως μηχανισμό άμυνας τη μεθυλίωση του ιικού γενετικού υλικού. Η μεθυλίωση του ιικού DNA έχει σκοπό την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων του ιού και καταλύεται από τις μεθυλοτρανσφεράσες του κυττάρου ξενιστή. Η περαιτέρω συγκέντρωση πρωτεϊνών που συνδέονται στο μεθυλιωμένο DNA καθώς και της αποακετυλάσης των ιστονών οδηγούν σε πυκνή δομή χρωματίνης και απενεργοποίηση των γονιδίων του ιού (66). Ωστόσο, οι ιοί έχουν συχνά την ικανότητα να ξεπερνούν αυτό το εμπόδιο και να χρησιμοποιούν τη μεθυλίωση προς όφελός τους (67). Για παράδειγμα, μεθυλίωση συγκεκριμένων προαγωγέων γονιδίων του ιού Epstein-Barr (EBV) σηματοδοτεί τη λανθάνουσα φάση της λοίμωξης που είναι απαραίτητη για τη χρόνια λοίμωξη και την ογκογόνο δράση του ιού (68). Από την άλλη, η έκφραση της πρωτεΐνης LMP1 του ιού σχετίζεται με υπερμεθυλίωση σημαντικών γονιδίων όπως της Ε-καντερίνης (Ecadherin) (69). Παρομοίως, σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα από τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV) ανιχνεύεται υπερμεθυλίωση των γονιδίων p16 INK4a (70,71) και 26

GSTP1 (72). Πιθανώς, αυτή η ανώμαλη μεθυλίωση να οφείλεται στην ενεργοποίηση της μεθυλοτρανσφεράσης μετά την εισαγωγή του ιικού γονιδιώματος. Ένας ακόμη ιός που πιθανότατα χρησιμοποιεί τη μεθυλίωση προς όφελός του είναι ο ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων (human papillomavirus, HPV). Αν και έχει βρεθεί υπερμεθυλίωση των ογκογονιδίων του ιού σε αρχικά στάδια αλλοιώσεων στον τράχηλο της μήτρας, φαίνεται πως η καρκινική μεταμόρφωση σχετίζεται με απομεθυλίωση των γονιδίων αυτών και αδρανοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16 του ξενιστή μέσω υπερμεθυλίωσης του προαγωγέα του (73,74). Ανάλογο φαινόμενο έχει ανιχνευθεί και στον καρκίνο του πνεύμονα (75). 2.1.γ Μεθυλίωση του DNA και κάπνισμα Η υπερμεθυλίωση του DNA έχει συσχετισθεί και με το κάπνισμα σε νεοπλάσματα, σε προκαρκινωματώδεις καταστάσεις και σε φυσιολογικούς ιστούς (76-82). Η παρουσία μεθυλίωσης σε νεοπλάσματα που σχετίζονται με το κάπνισμα (πχ της στοματικής κοιλότητας και του πνεύμονα) έχει επιβεβαιωθεί και με μελέτες υβριδισμού με τη χρήση αντισώματος έναντι της 5 -μεθυλοκυτοσίνης (83,84). Η αιτιολογική συσχέτιση μεθυλίωσης και καπνίσματος αποδείχθηκε σε μελέτη στην οποία προκλήθηκε γενικευμένη μεθυλίωση με την ενδοδερμική χορήγηση καρκινογόνων του καπνού σε πειραματόζωα (85). 27

3. ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟ ΓΟΝΙΔΙΟ p16 INK4a Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p16 INK4a είναι ένα γονίδιο που παίζει ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G 1. Είναι επίσης γνωστό ως MTS-1 (major tumor suppressor-1), INK4a (inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a) και CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A). Το γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μοριακού βάρους 15.8kd (kilo-dalton) αποτελούμενη από 156 αμινοξέα. Η πρωτεΐνη αυτή είναι μέλος μιας ομάδας που αποτελείται από τις πρωτεΐνες p16 INK4a, p15 INK4b, p18 INK4c και p19 INK4d. Ο ρόλος τους είναι να συνδέονται με την κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 4 ή 6 (cdk4/6) και έτσι, αναστέλλοντας τη δράση της κυκλίνης D, να σταματούν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. 3.1 Οργάνωση του γονιδίου Το γονίδιο p16 INK4a βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 9, στη θέση 21 (9p21). Αποτελείται από τρία εξόνια με μέγεθος 125, 307 και 12 ζεύγη βάσεων (Εικόνα 3) (42). Ένα επιπλέον εξόνιο, το 1β, που βρίσκεται σε απόσταση περίπου 15 kb (kilobases) από το εξόνιο 1, συνδέεται με τα εξόνια 2 και 3 δημιουργώντας ένα εναλλακτικό μετάγραφο (Εικόνα 3) (86). Η μετάφραση αυτού του μεταγράφου οδηγεί στην πρωτεΐνη p19 ARF, με μοριακό βάρος 13.8 kd. Τα δύο μετάγραφα έχουν κοινά τα εξόνια 2 και 3, αλλά επειδή το πλαίσιο ανάγνωσης έχει διαφορετικό σημείο έναρξης στο καθένα, η αλληλουχία των αμινοξέων είναι τελείως διαφορετική στις δύο πρωτεΐνες (26,86,87). Η έκφραση κάθε γονιδίου ρυθμίζεται από τον δικό του προαγωγέα. 28

p16 INK4a p19 ARF Εικόνα 3. Δομή του γονιδίου p16 και τα μετάγραφα p16 INK4a και p19 ARF. Με βέλη απεικονίζονται οι αντίστοιχοι προαγωγείς. 3.2 Η πρωτεΐνη p16 INK4a Η οικογένεια των πρωτεϊνών INK4 αποτελείται από τέσσερα μέλη (p16 INK4a, p15 INK4b, p18 INK4c και p19 INK4d ) που χαρακτηρίζονται από την παρουσία τεσσάρων ή πέντε μοτίβων αγκυρίνης (ankyrin) (88). Οι επαναλήψεις της αγκυρίνης είναι γενικά παρούσες σε πρωτεΐνες που η δράση τους περιλαμβάνει αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών. Στην πρωτεΐνη p16 INK4a μια θέση στην τρίτη ομάδα αγκυρίνης φαίνεται πως είναι η περιοχή με την οποία συνδέεται στην κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 4 (cdk4) και οδηγεί στην αναστολή της. Όσον αφορά στην ίδια την κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 4 (cdk4), η θέση πάνω στην οποία συνδέεται η p16 INK4a επικαλύπτεται με τη θέση σύνδεσης της πρωτεΐνης p27 KIP1. Η θέση σύνδεσης της κυκλίνης D πάνω στην cdk4 δεν αλληλεπικαλύπτεται με θέση σύνδεσης της p16 INK4a, αλληλοεπηρεάζονται ωστόσο στην τριτοταγή δομή. Πιθανώς η p16 INK4a αναστέλλει τη cdk4 σταθεροποιώντας μια καταλυτικά αδρανή τριτοταγή δομή με μικρότερη συγγένεια προς την κυκλίνη D (87). 3.3 Ρόλος της πρωτεΐνης p16 INK4a στον κυτταρικό κύκλο και ρύθμιση των επιπέδων της Η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος prb και οι σχετιζόμενες με αυτήν πρωτεΐνες p107 και p130 συνδέονται και αναστέλλουν αρκετούς μεταγραφικούς 29

παράγοντες που απαιτούνται για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου στη φάση G 1 απαιτεί φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών αυτών ώστε να απελευθερωθούν οι μεταγραφικοί παράγοντες που ελέγχονται από τις πρωτεΐνες αυτές. Η δράση του συμπλέγματος cdk4/6-κυκλίνη D είναι καθοριστικής σημασίας για τη φωσφορυλίωση της prb (η οποία αποτελεί και τη μόνη λειτουργία του) και επομένως για τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών κυττάρων. Η σύνδεση της πρωτεΐνης p16 INK4a με την cdk4/6 αλλάζει τη διαμόρφωση της κινάσης εμποδίζοντας τη σύνδεση της κυκλίνης και τη δημιουργία του καταλυτικά ενεργού ενζύμου. Αυτό οδηγεί σε αναστολή της φωσφορυλίωσης της prb, οπότε παρεμποδίζεται η απελευθέρωση του μεταγραφικού παράγοντα E2F από την πρωτεΐνη prb και η είσοδός του στον πυρήνα. Οι λειτουργικές συσχετίσεις αυτών των πρωτεϊνών είναι γνωστές ως το μονοπάτι p16 INK4a /cdk4/κυκλίνηd1/rb (Εικόνα 4) (89), το οποίο έχει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. G 1 S αναστολή αύξησης prb E2F prb PO PO PO κυκλίνη D κυκλίνη D E2F είσοδος στον πυρήνα και μεταγραφή γονιδίων απαραίτητων για τον κυτταρικό κύκλο cdk4 cdk4 p16 κυκλίνη D προαγωγή του κυτταρικού κύκλου προς τη φάση S cdk4 p16 διακοπή του κυτταρικού κύκλου Εικόνα 4. Ο ρόλος της πρωτεΐνης p16 INK4a στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Σύνδεση της πρωτεΐνης p16 INK4a με την cdk4 προκαλεί αναστολή της cdk4 και, κατά συνέπεια, αναστολή της φωσφορυλίωσης της prb και της απελευθέρωσης του μεταγραφικού παράγοντα E2F. 30

Τα επίπεδα της πρωτεΐνης p16 INK4a στο κύτταρο ρυθμίζονται στο στάδιο της μεταγραφής. Το mrna είναι εξαιρετικά σταθερό (χρόνος ημίσειας ζωής > 24 ώρες) και ο χρόνος ημίσειας ζωής της πρωτεΐνης είναι 8-18 ώρες. Συσσώρευση του mrna και της πρωτεΐνης p16 INK4a έχει ανιχνευθεί σε λίγες καταστάσεις: γήρανση του κυττάρου, ενεργοποίηση του ογκογονιδίου ras, απενεργοποίηση του Rb (87) και παρουσία του ιού HPV (90). Σε κύτταρα με αδρανοποιημένο Rb, τα επίπεδα του mrna και της πρωτεΐνης p16 INK4a είναι αυξημένα. Κάτι τέτοιο επιβεβαιώνεται σε νεοπλάσματα με απενεργοποιημένο Rb τα οποία παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση p16 INK4a, σε αντίθεση με νεοπλάσματα θετικά για το Rb. Η αδρανοποίηση του p16 INK4a σε κύτταρα με λειτουργική πρωτεΐνη Rb επιτρέπουν τη συνεχή φωσφορυλίωσή της, από την οποία εξαρτάται ο καρκινικός φαινότυπός τους (26). Με παρόμοιο τρόπο, κύτταρα με απενεργοποιημένο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 μπορούν, επίσης, να εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του p16 INK4a. 3.4 Βιολογικός ρόλος του γονιδίου p16 INK4a - μηχανισμοί απενεργοποίησης Φαίνεται πως ο ρόλος του γονιδίου p16 INK4a είναι σημαντικός όχι μόνο στη διαδικασία της γήρανσης του κυττάρου, αλλά και ως ένα σημαντικό σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Τα επίπεδά του σταδιακά αυξάνονται ως απάντηση σε μικρές βλάβες του DNA και συνεχή μιτογόνα ερεθίσματα ή σήματα πολλαπλασιασμού από ογκογονίδια. Επιτρέπει, έτσι, με τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου την επιδιόρθωση των βλαβών ή, σε περίπτωση σημαντικής βλάβης, την είσοδο σε αποπτωτικά μονοπάτια. Σε αντίθεση, όμως, με το γονίδιο p53 που απαντά σε μεγάλη βλάβη του DNA, το p16 INK4 ενεργοποιείται σε αθροιστικά αποτελέσματα μικρών βλαβών. Κάτι τέτοιο συμφωνεί και με τα επιδημιολογικά δεδομένα αδρανοποίησής του σε νεοπλάσματα με μακρά έκθεση σε καρκινογόνα (πνεύμονα, οισοφάγου, ουροδόχου κύστης) (42). Η αδρανοποίηση του p16 INK4a γίνεται με τρεις μηχανισμούς: ομόζυγη απαλοιφή, μετάλλαξη και μεθυλίωση του προαγωγέα του. Με μικροδορυφορική ανάλυση βρέθηκε ότι ένα μεγάλο εύρος νεοπλασμάτων παρουσιάζουν μικρές (<200 kb) απαλοιφές και στα δύο αλλήλια (91). Απαλοιφές στην περιοχή του γονιδίου συχνά συνοδεύονται από αδρανοποίηση και δύο άλλων 31

γονιδίων, του p15 και του p19 ARF, κάτι που μπορεί να σημαίνει μεγαλύτερο πλεονέκτημα πολλαπλασιασμού σε σχέση με αδρανοποίηση ενός μόνο γονιδίου (92). Σε αντίθεση με άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια, οι σημειακές μεταλλάξεις δεν αποτελούν συχνή αιτία απενεργοποίησης του γονιδίου p16 INK4a, καθώς η συχνότητά τους έρχεται τρίτη μετά τις ομόζυγες απαλοιφές και τη μεθυλίωση (42). Παρότι αρχικά προτάθηκε ότι μπορεί σιωπηλές ή παρανοηματικές μεταλλάξεις του p16 INK4a να επηρεάζουν δραστικά το πλαίσιο ανάγνωσης του p19 ARF, φαίνεται ότι αυτό δεν ισχύει, καθώς μεταλλάξεις στο εξόνιο 2 δεν επηρεάζουν τη λειτουργία του p19 ARF (93). Η υπερμεθυλίωση του p16 INK4a στην περιοχή του προαγωγέα του είναι μια πολύ συχνή αιτία απενεργοποίησης της έκφρασης του γονιδίου σε μεγάλο αριθμό νεοπλασμάτων. Ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός μελετών αναφέρουν την ανίχνευση της υπερμεθυλίωσης του γονιδίου p16 INK4a σε νεοπλάσματα του στομάχου (94), του παγκρέατος (95), του παχέος εντέρου (96), της υπόφυσης (97), σε αιματολογικά νεοπλάσματα (98,99) και σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (100-102). 3.5 Υπερμεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου p16 INK4a και καρκίνος του πνεύμονα Την τελευταία δεκαετία ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός αναφορών συσχετίζουν τον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα με απενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου p16 INK4a, η οποία οφείλεται σε σημαντικό ποσοστό σε επιγενετική αδρανοποίηση λόγω μεθυλίωσης του προαγωγέα του. Η μεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου μπορεί να αφορά και στα δύο αλλήλια ή μόνο στο ένα, σε συνδυασμό με ετερόζυγη απαλοιφή του άλλου (103). Παράλληλα, διαπιστώνεται ότι η μεθυλίωση του p16 INK4a είναι συχνό φαινόμενο σε πρωτοπαθείς όγκους καρκίνου του πνεύμονα ποντικών (104). Σε ανθρώπινους όγκους καρκίνου του πνεύμονα η διερεύνηση διαταραχών στο μονοπάτι p16 INK4a /cdk4/κυκλίνηd1/rb δείχνει συχνή απενεργοποίηση του γονιδίου p16 INK4a και η έκφρασή του παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με την έκφραση του Rb (105,106). Επιπλέον, επιβεβαιώνεται και σε δείγματα πρωτοπαθούς 32

καρκίνου του πνεύμονα από ανθρώπους η συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης του γονιδίου και αναστολής της έκφρασής του (107,108). Η συχνότητα ανίχνευσης της μεθυλίωσης του γονιδίου p16 INK4a σε δείγματα ιστού καρκίνου του πνεύμονα παρουσιάζει μεγάλη διακύμανση στις διάφορες μελέτες, ποικίλλοντας από 17% (109) έως 92% σε γυναίκες από την Κίνα (110,111). Ωστόσο, στις περισσότερες μελέτες η συχνότητα ποικίλλει από 40-70% (111-115). Σε μικρό αριθμό μελετών (116-120) διερευνάται, επίσης, η παρουσία μεθυλίωσης σε μη καρκινικό ιστό πνεύμονα από τους ίδιους ασθενείς, που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια της επέμβασης. Η παρουσία της μεθυλίωσης σε θέσεις μακροσκοπικά ή μικροσκοπικά υγιούς ιστού πιθανώς αντανακλά την ύπαρξη ενός μεγάλου πεδίου πρώιμων μεταβολών υπερμεθυλίωσης ή/και την κλωνική επέκταση κυττάρων με ανώμαλη μεθυλίωση (118). Η συχνότητα ανίχνευσης της μεθυλίωσης του γονιδίου p16 INK4a σε κυτταρολογικό υλικό (βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, δείγμα με βουρτσάκι και πτύελα) ασθενών παρουσιάζει, επίσης, μεγάλη διακύμανση (116,121-123) και εξαρτάται από την ευαισθησία της μεθόδου που χρησιμοποιείται και από τη συχνότητα της μεθυλίωσης στα αντίστοιχα δείγματα ιστού από τους ασθενείς. Η συχνότητα ανίχνευσης της μεθυλίωσης στο κυτταρολογικό υλικό σε άλλες περιπτώσεις φαίνεται να εμφανίζει συσχέτιση με το κάπνισμα και τη βαρύτητά του (80,81,114,116) ενώ σε άλλες όχι (113,122,123). 33

4. ΙΟΙ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Διάφοροι ιοί θεωρείται ότι ενέχονται στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Είναι ενδιαφέρον ότι μερικά από τα χαρακτηριστικά που απαντώνται στα καρκινικά κύτταρα (αέναος πολλαπλασιασμός, ανθεκτικότητα στην απόπτωση, ελαττωμένη ευαισθησία στα αντι-αυξητικά μηνύματα) είναι απαραίτητα για την αποτελεσματική αντιγραφή και πολλαπλασιασμό των ιών. Κάποιοι ιοί καταφέρνουν να παρέχουν αυτά τα χαρακτηριστικά στα κύτταρα που επιμολύνουν. Καθώς, μάλιστα, τα χαρακτηριστικά αυτά επηρεάζουν την κυτταρική σταθερότητα και την ιστική ομοιόσταση, η λοίμωξη από αυτούς τους ογκογόνους ιούς προκαλεί την ανάπτυξη του καρκινικού φαινοτύπου ή έστω επιταχύνει την εμφάνισή του. Μέχρι σήμερα, ως ογκογόνοι έχουν χαρακτηριστεί οι ιοί της ηπατίτιδας Β (HBV), ο Epstein-Barr (EBV), ο ερπητοϊός του σαρκώματος Kaposi (KSHV) και ο ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) (124). 4.1 Kριτήρια ογκογονικότητας Ένα πλήθος μεθόδων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της παρουσίας ιών σε καρκινικούς ιστούς, με κυριότερη την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR). Η ευαισθησία της μεθόδου αυτής επιτρέπει την ανίχνευση ακόμη και ελάχιστων ποσοτήτων DNA ή RNA των λοιμογόνων παραγόντων. Σε πολλές περιπτώσεις καρκίνου που οφείλονται στην παρουσία ιών, η παρουσία ιικών αντιγράφων είναι πολύ μικρή, συνήθως λιγότερο από ένα αντίγραφο DNA ανά 10 καρκινικά κύτταρα. Σε αυτές τις περιπτώσεις είναι σκόπιμη η χρησιμοποίηση φωλιασμένης PCR (nested PCR) καθώς παρουσιάζει ακόμη μεγαλύτερη ευαισθησία. Υπάρχουν, βέβαια, τύποι καρκίνου όπως το καρκίνωμα ρινοφάρυγγα, το σάρκωμα Kaposi και το καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας όπου υπάρχει έντονη παρουσία των ογκογόνων ιών (EBV, KSHV και HPV, αντίστοιχα) με παρουσία πολλών ιικών αντιγράφων σε κάθε καρκινικό κύτταρο. Μάλιστα, το ιικό DNA βρίσκεται σε κλωνική μορφή, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία του ιού στο κύτταρο από νωρίς στη διαδικασία του καρκινικού μετασχηματισμού. Η αιτιολογική συσχέτιση της παρουσίας των ιών με την καρκινογένεση έχει αποδειχθεί με διάφορους τρόπους, αλλά το ερώτημα που παραμένει αδιευκρίνιστο είναι αν αρκεί από μονή της η έντονη παρουσία ενός ιού 34

ώστε να οδηγήσει σε συμπεράσματα συσχέτισης με την καρκινογένεση και αν υπάρχει κάποιο όριο ιικών αντιγράφων (π.χ. <1 ανά 10 καρκινικά κύτταρα) που θα μπορούσε να αποκλείσει τη συμμετοχή στην παθογένεια αυτή. Από νωρίς (125) αναγνωρίστηκε η δυσκολία που παρουσιάζει η προσπάθεια να αποδειχθεί η αιτιολογική συσχέτιση ιών και καρκίνου, λόγω των παρακάτω γεγονότων: Ο μακρύς χρόνος επώασης μεταξύ της αρχικής λοίμωξης με τον θεωρούμενο ογκογόνο ιό και της επαγωγής του καρκίνου. Η συχνή και απανταχού παρουσία των περισσοτέρων από τους υποψήφιους ιούς και απεναντίας η σπανιότητα των καρκίνων με τους οποίους συσχετίζονται. Η αρχική λοίμωξη με τον υποψήφιο ιό είναι συνήθως υποκλινική έτσι ώστε είναι αδύνατο να καθοριστεί επακριβώς το χρονικό διάστημα παρουσίας του ιού. Η ανάγκη παρουσίας επιπρόσθετων παραγόντων στους περισσότερους καρκίνους σχετιζόμενους με ιούς. Η αιτιολογία του καρκίνου μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τη γεωγραφική εντόπιση και την ηλικία. Διαφορετικά στελέχη ιών έχουν διαφορετικό ογκογόνο δυναμικό. Ο παράγοντας άνθρωπος-ξενιστής παίζει σημαντικό ρόλο στην επιρρέπεια στον καρκίνο, ιδίως η ηλικία κατά την λοίμωξη, τα γενετικά χαρακτηριστικά του και η κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος. Ο καρκίνος είναι μια πολύπλοκη και πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει αλλαγές στο ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή, δράσεις διαφόρων ογκογονιδίων, ποικίλες χρωμοσωμικές αναδιατάξεις και ένα μεγάλο φάσμα άλλων συμβάντων σε μοριακό επίπεδο. Ένας ιός μπορεί να επηρεάσει οποιοδήποτε στάδιο της διαδικασίας αυτής. Η αδυναμία να αναπαραχθούν πολλοί ανθρώπινοι καρκίνοι σε πειραματόζωα μετά από μόλυνση με τους υποψήφιους ιούς. Η εμφάνιση καρκίνου με συγκεκριμένα ιστολογικά χαρακτηριστικά μπορεί να προκληθεί από μια μεγάλη ποικιλία παραγόντων διαφορετικών μεταξύ τους, όπως ιοί, τοξίνες, χημικά ή μεταλλαγμένα γονίδια. 35

Έγινε, επίσης, προσπάθεια να καθοριστούν συγκεκριμένα κριτήρια από επιδημιολογική και ιολογική σκοπιά, τα οποία θα πρέπει να πληρούνται ώστε να χαρακτηριστεί ένας ιός ως ογκογόνος (125). Τα επιδημιολογικά κριτήρια είναι τα ακόλουθα: Η γεωγραφική κατανομή της λοίμωξης από τον ιό πρέπει να είναι ίδια με αυτήν της επίπτωσης του καρκίνου για τον οποίο ενοχοποιείται. Η παρουσία ιικών δεικτών (τίτλος αντισωμάτων ή επίπεδα αντιγόνων του ιού) πρέπει να είναι υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο συγκριτικά με υγιείς μάρτυρες. Η παρουσία των ιικών δεικτών πρέπει να προηγείται της εμφάνισης του καρκίνου και οι ασθενείς με υψηλότερους ιικούς δείκτες πρέπει να χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη επίπτωση καρκίνου. Προφύλαξη από τη λοίμωξη (εμβολιασμός) ή αποτελεσματικός έλεγχος αυτής πρέπει να ελαττώσει την επίπτωση του καρκίνου. Τα ιολογικά κριτήρια έχουν ως εξής: Ο ιός πρέπει να προκαλεί τον καρκινικό μετασχηματισμό ανθρώπινων κυττάρων in vitro. Το ιικό γενετικό υλικό ή DNA πρέπει να ανιχνεύεται στα καρκινικά κύτταρα και όχι στα φυσιολογικά. Ο ιός πρέπει να είναι ικανός να προκαλεί όγκο όταν μεταδοθεί σε πειραματόζωα και η αδρανοποίηση του ιού πριν από τη μετάδοση πρέπει να προφυλάσσει από την καρκινογένεση. 4.2 Άμεση και έμμεση επαγωγή της καρκινογένεσης Οι λοιμογόνοι παράγοντες μπορούν να δράσουν ως καρκινογόνα είτε άμεσα είτε έμμεσα. Ως άμεσο καρκινογόνο μπορεί να θεωρηθεί ένας λοιμογόνος παράγοντας όταν (126): Υπάρχει συχνή παρουσία ολόκληρου του γονιδιώματος ή μέρος αυτού στα καρκινικά κύτταρα. 36

Μεταφορά του νουκλεϊκού οξέος του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες ή πειραματόζωα προκαλεί αθανατοποίηση των κυττάρων ή δημιουργία όγκου, αντίστοιχα. Απομάκρυνση του νουκλεϊκού οξέος του ιού από τα μολυσμένα κύτταρα ή αναστολή της λειτουργίας του προκαλεί αναστροφή της αθανατοποίησης ή του καρκινικού φαινοτύπου. Επιδημιολογικές και προοπτικές μελέτες έχουν καταδείξει τον συγκεκριμένο λοιμογόνο παράγοντα ως βασικό παράγοντα κινδύνου για τον αντίστοιχο τύπο καρκίνου. Η έμμεση επαγωγή της καρκινογένεσης είναι ακόμη πιο σύνθετη διαδικασία και καθίσταται δυσκολότερο να εκτιμηθεί. Ως έμμεσο καρκινογόνο θα μπορούσε να θεωρηθεί ένας λοιμογόνος παράγοντας, όταν (126): Κλινικές παρατηρήσεις, in vitro μελέτες καθώς και μελέτες σε πειραματόζωα καταδεικνύουν τον συγκεκριμένο παράγοντα ως συντελούντα στην καρκινογένεση. Επιδημιολογικές μελέτες ενοχοποιούν τον ιό ως παράγοντα κινδύνου. Εμβολιασμός ή επιτυχής θεραπεία του ιού παρέχουν σημαντική προστασία έναντι καρκίνων στων οποίων την παθογένεια θεωρείται ότι συμμετέχει ο ιός. 4.3 Παθογένεια της καρκινογένεσης Υπάρχουν πολλοί μηχανισμοί με τους οποίους οι ιοί μπορούν να προκαλέσουν την καρκινική εξαλλαγή. 4.3.α Γενετική αστάθεια Η γενετική αστάθεια είναι ένα από τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων, είτε στο επίπεδο των χρωμοσωμάτων είτε στο γονιδιακό επίπεδο. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες, γνωστές ως ανευπλοειδία, έχουν αναγνωριστεί από καιρό στα καρκινικά κύτταρα με τη βοήθεια της μικροσκοπίας και των τεχνικών καρυοτυπικής ανάλυσης. Από την άλλη, η μελέτη των κληρονομούμενων συνδρόμων οδήγησε στη γνώση ότι η απορρύθμιση της λειτουργίας των γονιδίων που επιδιορθώνουν το DNA οδηγεί σε μεταλλάξεις ολόκληρου του γονιδιώματος. Μεγάλο 37

ερωτηματικό παραμένει εάν το πρωταρχικό φαινόμενο είναι οι γονιδιακές μεταλλάξεις ή η ανευπλοειδία, καθώς και οι δύο μηχανισμοί παίζουν ποικίλο ρόλο σε διαφορετικούς καρκίνους. Τελευταία, η μελέτη της ανευπλοειδίας απασχολεί περισσότερο την επιστημονική έρευνα, καθώς νέα δεδομένα υποστηρίζουν ότι ίσως αυτή να είναι το πιο πρώιμο γεγονός στην καρκινογένεση, είτε πρόκειται για κληρονομούμενους είτε για σποραδικούς καρκίνους (127). Η διαταραχή στο μηχανισμό της μιτωτικής ατράκτου είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία ανωμαλίας στα χρωμοσώματα, επιτρέποντας να επισυμβούν περαιτέρω μεταλλάξεις σε κρίσιμα γονίδια. Επίσης, η γενετική αστάθεια προάγει την ανάπτυξη του όγκου παρέχοντας κυτταρική ετερογένεια, η οποία επιτρέπει σε κακοήθεις κλώνους να αποκτούν συγκριτικό πλεονέκτημα επιβίωσης. Κύτταρα τραχήλου της μήτρας με προκαρκινικές αλλοιώσεις επιμολυσμένα με τον ιό HPV εμφανίζουν συχνά ανώμαλο αριθμό μιτώσεων (128). Η ογκοπρωτεΐνη E7 των ιών HPV υψηλού κινδύνου συμβάλλει στη γονιδιωματική αστάθεια προκαλώντας βλάβες στο διπλασιασμό των κεντροσωματίων. Επιπρόσθετα, κατά την εξαλλαγή από σοβαρή δυσπλασία σε διηθητικό καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας, κύτταρα προσβεβλημένα από ιούς HPV υψηλού κινδύνου εμφάνισαν επαναλαμβανόμενη ενίσχυση 3q (129). Τέλος, οι ιοί DNA μπορούν να προκαλέσουν γενετική αστάθεια με μηχανισμούς διαφορετικούς από την ανευπλοειδία. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη HPV E6 προκαλεί καταστολή του ενζύμου MGMT, το οποίο συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA και προλαμβάνει μεταλλάξεις πολλών σημαντικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένου του p53 (130). 4.3.β Κυτταρική αθανατοποίηση Κύριο χαρακτηριστικό των περισσότερων καρκίνων είναι η διατήρηση του μήκους των τελομερών, μέσω της de novo έκφραση της τελομεράσης, ενός ενζυμικού συμπλέγματος που αποτελείται από τρία κύρια συστατικά: ένα RNA πρότυπο επαναλήψεων των τελομερών (TTAGGG), την πρωτεΐνη που σχετίζεται με την τελομεράση (htep-1) και μια καταλυτική υποομάδα με δραστικότητα αντίστροφης μεταγραφάσης (htert). Μελέτες που έγιναν σε νεοπλάσματα του τραχήλου της μήτρας, κατέδειξαν βράχυνση των τελομερών στην προκαρκινική τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία 38