ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ» ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Μελέτη της δυνατότητας μείωσης της βιοδιαθεσιμότητας μετάλλων μέσω της σύμπλεξης με οργανικούς υποκαταστάτες φυτικών προϊόντων: η περίπτωση του χαλκού σε προϊόντα καφέ» ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΓΡΗΓΟΡΙΟΥ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2014 1

2

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Μελέτη της δυνατότητας μείωσης της βιοδιαθεσιμότητας μετάλλων μέσω της σύμπλεξης με οργανικούς υποκαταστάτες φυτικών προϊόντων: η περίπτωση του χαλκού σε προϊόντα καφέ» ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΓΡΗΓΟΡΙΟΥ Α.Μ.: 91204 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΝΙΚΟΛΕΛΗΣ, Καθηγητής ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΝΙΚΟΛΕΛΗΣ Καθηγητής Τμήματος Χημείας, ΕΚΠΑ ΜΙΧΑΗΛ ΣΚΟΥΛΛΟΣ Καθηγητής Τμήματος Χημείας, ΕΚΠΑ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΛΟΓΕΡΟΠΟΥΛΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Χαροκοπείου Πανεπιστημίου ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 08/10/2014 3

4

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο καφές, ένα από τα πλέον ευρέως διαδεδομένα ροφήματα ανά τον κόσμο, αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της κουλτούρας πολλών λαών, βοηθάει στη διέγερση του νευρικού συστήματος και χαρίζει πνευματική και σωματική εγρήγορση. Παρουσιάζει σημαντικές ευεργετικές ιδιότητες για την ανθρώπινη υγεία, οι οποίες αποδίδονται στη σημαντική παρουσία βιοδραστικών οργανικών ενώσεων όπως η καφεΐνη, οι πολυφαινόλες -κυρίως χλωρογενικά οξέα- στερόλες, τα διτερπένια καφεόλη και καφεστόλη, το αλκαλοειδές τριγονελλίνη, προϊόντα αντιδράσεων Maillard και αρωματικές ουσίες οι οποίες συμβάλλουν στην αναζωογονητική, αντιφλεγμονώδη, καρδιοπροστατευτική, αντιοξειδωτική κ.α., δράση των ροφημάτων καφέ. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ειδίκευσης είναι η μελέτη της μείωσης της βιοδιαθεσιμότητας των τοξικών μετάλλων στον οργανισμό, μέσω της επίδρασης των ροφημάτων καφέ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε φυσικοχημικός χαρακτηρισμός της οργανικής ύλης που εμπεριέχεται σε ροφήματα καφέ espresso, στιγμιαίου, φίλτρου και Ελληνικού και προσδιορίσθηκαν η δυνατότητα σύμπλεξης ιόντων χαλκού καθώς και η αντιοξειδωτική δράση των ροφημάτων. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων έδειξαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, σε άμεση συσχέτιση με το φαινολικό περιεχόμενο, η οποία σε συνδυασμό με τη συμπλεκτική ικανότητα ιόντων χαλκού που διαπιστώθηκε της οργανικής ύλης, αναδεικνύουν τον καφέ ως ένα εξαιρετικό αντιοξειδωτικό ρόφημα, του οποίου η καθημερινή κατανάλωση, σε φυσιολογικά επίπεδα, μπορεί να μειώσει τη βιοδιαθεσιμότητα των ελεύθερων τοξικών μετάλλων στον ανθρώπινο οργανισμό και συνεπώς τον κίνδυνο εμφάνισης παθογόνων καταστάσεων. ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Ροφήματα καφέ, χαλκός, συμπλεκτική ικανότητα χαλκού, οργανικοί υποκαταστάτες, φαινολικές ενώσεις, αντιοξειδωτική δράση 5

ABSTRACT Coffee, one of the most widespread beverages all over the world, causes stimulation of the nervous system and gives mental and physical alertness, no matter the brewing processing and the way of consumption, which differs among every culture. It has a beneficial role for the human health since it contains significant amounts of bioactive organic compounds. Caffeine, carbohydrates, proteins, lipids, polyphenols mainly chlorogenic acids, the diterpenes cafestol and kahweol, fatty acids, sterols, Maillard reaction products and volatic compounds are some of the chemical components that contribute to the revitalizing, anti-inflammatory, cardioprotective, antioxidant, etc., effects of coffee beverages. The purpose of this thesis is to study whether complex formation, caused by coffee consumption affects metals bioaccessibility in the body. For this reason a physicochemical characterization of organic matter contained in espresso, instant, filter and Greek coffee beverages was undertaken; in addition the copper ions complexing capacity and the antioxidant activity of the above beverages were determined. The results showed a sufficient antioxidant activity, in direct correlation with the phenolic content of the beverages. Furthermore, a significant release of copper organic ligands was observed. Taking those findings under consideration, coffee represents an excellent antioxidant beverage, the daily consumption of which up to normal levels may reduce toxic metals bioaccessibility and subsequently the risk of some pathogenic conditions. KEYWORDS: Coffee beverages, copper, complexing capacity of copper, organic ligands, phenolic compounds, antioxidant activity 6

7

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας Περιβάλλοντος του Τμήματος Χημείας του Ε.Κ.Π.Α. Μέρος των πειραματικών μετρήσεων διεξήχθη στο Εργαστήριο Χημείας- Βιοχημείας και Φυσικοχημείας Τροφίμων του Χαροκοπείου Πανεπιστημίου Αθηνών, κατά το ακαδημαϊκό έτος 2013-2014. Ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Δημήτριο Νικολέλη για την ανάθεση του θέματος της διπλωματικής εργασίας, τον Καθηγητή κ. Μιχαήλ Σκούλλο για τη δυνατότητα που μου έδωσε να παρακολουθήσω το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα σπουδών Χημείας με ειδίκευση Χημεία και Τεχνολογία Περιβάλλοντος και τον Καθηγητή κ. Εμμανουήλ Δασενάκη για την καθοδήγηση που παρείχε καθ όλη τη διάρκεια του Προγράμματος. Στη συνέχεια, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Νικόλαο Καλογερόπουλο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Χαροκοπείου Πανεπιστημίου, για την άριστη συνεργασία, την προθυμία και το χρόνο που μου διέθεσε μα κυρίως για τις σφαιρικές γνώσεις τις οποίες μου μεταλαμπάδευσε. Η τύχη και η τιμή της γνωριμίας και συνεργασίας μου μαζί του δεν μπορούν να αποδοθούν μόνο σε μια παράγραφο. Θερμές ευχαριστίες και στην Επίκουρη Καθηγήτρια του Χαροκοπείου Πανεπιστημίου κ. Ανδριάνα Καλιώρα για τη σύντομη αλλά ιδιαίτερα εποικοδομητική συνεργασία μας. Η πραγματοποίηση και η ολοκλήρωση αυτής της μεταπτυχιακής εργασίας θα ήταν αδύνατη χωρίς τη συμβολή του Δρ. κ.σωτήριου Καραβόλτσου. Τον ευχαριστώ για τον καθολικό σχεδιασμό και την επίβλεψη της πορείας της εργασίας, την υπομονή του και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Η ανεκτίμητη επιστημονική του βοήθεια και η καθοδήγησή του, τόσο στα πρώτα στάδια της διατριβής όσο και σε όλη την διάρκεια της εκπόνησής της συνέβαλλαν τα μέγιστα για το τελικό αποτέλεσμα αυτής, το οποίο δεν θα ήταν το ίδιο χωρίς τη δική του συμβολή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ και στην Δρ. κα. Αικατερίνη Σακελλάρη που η βοήθειά της, ο επαγγελματισμός της, οι παροτρύνσεις της και η φιλική της στάση αποτέλεσαν ισχυρό κίνητρο ώστε να ολοκληρωθεί επιτυχώς η ακαδημαϊκή μου αυτή προσπάθεια. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συναδέλφους και συμφοιτητές μου κ. Γεώργιο Καζαμία, κ. Φώτιο Φωτιάδη και κ. Βασίλειο Καρέλα για αυτά τα δυο όμορφα χρόνια, μα κυρίως τον καλό μου φίλο κ. Κωνσταντίνο Κουκουλάκη για τις συμβουλές του, την αδιάκοπη παρουσία του όποτε τον χρειάστηκα και την ουσιαστική και έμπρακτη βοήθειά του ώστε να ολοκληρώσω με επιτυχία το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα σπουδών. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ ανήκει στους γονείς μου Παύλο και Μαρία για την αστείρευτη και αληθινή αγάπη τους και τη δυνατότητα που μου δίνουν να πραγματοποιώ τα όνειρά μου, αλλά και στον αγαπημένο μου αδελφό Δημήτρη με την ελπίδα ότι σε λίγα χρόνια από τώρα θα γράφει και εκείνος αυτές τις γραμμές στη δική του διπλωματική εργασία. 8

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 5 ABSTRACT... 6 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ... 13 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ... 15 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ... 17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΚΑΦΕΣ, ΕΝΑ ΠΟΛΥΠΛΟΚΟ ΡΟΦΗΜΑ... 24 2.1 Γενικά για τον καφέ... 24 2.2 Η ιστορία του καφέ... 27 2.3 Στάδια παραγωγής και επεξεργασίας καφέ... 29 2.4 Ροφήματα καφέ... 34 2.4.1 Espresso... 35 2.4.2 Καφές φίλτρου... 36 2.4.3 Στιγμιαίος καφές... 37 2.4.4 Ελληνικός καφές... 38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΟΡΓΑΝΙΚΗ ΥΛΗ ΣΕ ΡΟΦΗΜΑΤΑ ΚΑΦΕ... 40 3.1 Χημική σύσταση καφέ... 40 3.2 Καφεΐνη... 42 3.3 Πρωτεΐνες... 43 3.4 Υδατάνθρακες... 43 3.5 Φαινολικές ενώσεις... 44 3.5.1 Φλαβονοεϊδή... 44 3.5.2 Χλωρογενικά οξέα... 45 3.6 Λιπίδια... 46 3.6.1 Τριγλυκερίδια... 47 3.6.2 Τερπένια... 47 3.6.3 Στερόλες... 47 9

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΚΑΦΕ ΣΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΥΓΕΙΑ... 49 4.1 Κατανάλωση καφέ και παθολογικές καταστάσεις... 49 4.1.1 Καρδιαγγειακά νοσήματα... 49 4.1.2 Σακχαρώδης διαβήτης τύπου ΙΙ... 51 4.1.3 Καρκίνος... 52 4.1.4 Νόσος Parkinson... 52 4.1.5 Λοιπές παθολογικές καταστάσεις... 53 4.2 Αντιοξειδωτική δράση ροφημάτων καφέ... 54 4.2.1 Ελεύθερες ρίζες- Οξειδωτικό στρες... 54 4.2.2 Καφές και αντιοξειδωτική δράση... 56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΜΕΤΑΛΛΑ... 60 5.1 Ορισμός και ιδιότητες των μετάλλων... 60 5.2 Ταξινόμηση μετάλλων με βάση το μέγεθος των ενώσεών τους... 60 5.3 Ταξινόμηση μετάλλων με βάση τη χημική τους συγγένεια με διάφορους υποκαταστάτες 61 5.4 Χαλκός... 63 5.4.1 Βιολογική σημασία χαλκού... 64 5.5 Τοξικότητα μετάλλων... 67 5.5.1 Ορισμός και γενικά χαρακτηριστικά... 67 5.5.2 Μηχανισμοί τοξικής δράσης μετάλλων και επίδρασή τους στον οργανισμό... 67 5.5.3 Τοξικότητα του χαλκού... 69 5.5.4 Μηχανισμός τοξικής δράσης του χαλκού- Τοξικοκινητική... 71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΣΥΜΠΛΕΞΗΣ ΜΕΤΑΛΛΩΝ... 73 6.1 Ορισμός ικανότητας σύμπλεξης... 73 6.2 Βολταμμετρικές μέθοδοι... 74 6.2.1 Εισαγωγή- Ορολογία... 74 6.2.2 Βολταμμετρικές τεχνικές... 75 6.2.3 Πολαρογραφία... 77 6.3 Προσδιορισμός της ικανότητας σύμπλεξης ιόντων χαλκού σε ροφήματα καφέ... 82 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 85 10

7.1 Προετοιμασία ροφημάτων καφέ... 85 7.1.1 Espresso... 85 7.1.2 Καφές φίλτρου... 86 7.1.3 Στιγμιαίος καφές... 87 7.1.4 Ελληνικός καφές... 88 7.2 Λυοφιλίωση δειγμάτων... 89 7.3 Μελέτη σύμπλεξης ιόντων χαλκού... 90 7.3.1 Προετοιμασία δειγμάτων καφέ... 90 7.3.2 Προσδιορισμός συμπλεκτικής ικανότητας και σταθεράς σχηματισμού ιόντων Cu. 91 7.4 Προσδιορισμός ολικού χαλκού... 96 7.5 Προσδιορισμός ολικού οργανικού άνθρακα (TOC)... 97 7.6 Προσδιορισμός επιφανειοδραστικών και καταλυτικά ενεργών ουσιών... 97 7.7 Προσδιορισμός του συνολικού φαινολικού περιεχομένου με τη μέθοδο Folin- Ciocalteu. 98 7.8 Αντιοξειδωτικές δοκιμές... 99 7.8.1 Εκτίμηση αντιοξειδωτικής ικανότητας βασιζόμενη στη δέσμευση της 1,1-διφαίνυλο-2- πικρυλο-υδράζυλο ελεύθερης ρίζας (DPPH )... 99 7.8.2 Προσδιορισμός αναγωγικής ικανότητας μέσω αναγωγής του Fe +3 σε Fe +2 (FRAP) 100 7.8.3 Προσδιορισμός χρόνου αντίστασης του ορού του αίματος στην οξείδωση... 101 7.9 Προσδιορισμός απλών πολυφαινολών με αέρια χρωματογραφία/ φασματοσκοπία μάζας (GC-MS)... 102 7.10 Προσδιορισμός λιπαρών οξέων και στερολών... 104 7.10.1 Παρασκευή μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων και τριμεθυλσιλυλαιθέρων των φυτοστερολών... 104 7.10.2 Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με GC/FID... 105 7.10.3 Προσδιορισμός φυτοστερολών με GC/MS... 106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 107 8.1 Οργανικός άνθρακας... 107 8.2 Συμπλεκτική ικανότητα ιόντων χαλκού και σταθερά σχηματισμού συμπλόκων... 108 8.3 Ολικός χαλκός ροφημάτων καφέ... 110 8.4 Επιφανειοδραστικές ουσίες και καταλυτικά ενεργές ουσίες σε ροφήματα καφέ... 111 8.5 Συνολικό φαινολικό περιεχόμενο (μέθοδος Folin- Ciocalteu)... 112 11

8.6 Αντιοξειδωτική δράση... 113 8.7 Απλές πολυφαινόλες... 115 8.8 Λιπαρά οξέα... 119 8.9 Στερόλες... 121 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 123 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ - ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ - ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ... 132 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι... 133 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ... 134 ΑΝΑΦΟΡΕΣ... 135 12

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 2.1: Ποσοστό παγκόσμιας εξαγωγής καφέ κύριων χωρών παραγωγής...25 Σχήμα 2.2: Ετήσια κατανάλωση καφέ σε kg per capita...25 Σχήμα 6.1: Σχέση μεταξύ φαρανταϊκού if και του χωρητικού ρεύματος ic σε ένα πολαρογράφημα συνεχούς ρεύματος, id το ρεύμα διαχύσεως...79 Σχήμα 6.2: Διάγραμμα διαφορικής παλμικής πολαρογραφίας, προσθήκης γνωστής ποσότητας μετάλλου (CMe) για αδρανή φυσικά συστήματα. Η καμπύλη (α)αντιστοιχεί σε μηδενική συγκέντρωση υποκαταστατών (CL=0), η καμπύλη (β) σε μη μηδενική συγκέντρωση υποκαταστατών (CL 0) και το τμήμα (γ) στην προέκταση του παράλληλου με την ευθεία (α) τμήματος της καμπύλης (β). Το σημείο τομής του τμήματος (γ) με τον άξονα x αντιστοιχεί στην τιμή της προσδιοριζόμενης συμπλεκτικής ικανότητας (CC)...83 Σχήμα 6.3: Βολταμμογράφημα οξυνισμένου δείγματος στιγμιαίου καφέ, έπειτα από προσθήκη προτύπου διαλύματος ιόντων χαλκού ώστε η συγκέντρωση του δείγματος σε χαλκό να αντιστοιχεί σε 50μg/L...84 Σχήμα 6.4: Βολταμμογραφήματα που αντιστοιχούν σε διαδοχικές προσθήκες προτύπου διαλύματος ιόντων χαλκού για το δείγμα στιγμιαίου καφέ στο φυσικό ph...84 Σχήμα 7.1: Σχηματική αναπαράσταση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των μετρήσεων που πραγματοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συμπλεκτικής ικανότητας...92 Σχήμα 7.2: Βολταμμογραφήματα που αντιστοιχούν σε διαδοχικές προσθήκες προτύπου διαλύματος ιόντων χαλκού για δείγμα στιγμιαίου καφέ (Ιnstant III) στο φυσικό ph...94 Σχήμα 7.3: Βολταμογράφημα οξυνισμένου και ακτινοβολημένου δείγματος στιγμιαίου καφέ (Instant III) στο οποίο έχει γίνει προσθήκη 50 μg/l Cu...95 Σχήμα 7.4: Καμπύλες τιτλοδότησης δείγματος στιγμιαίου καφέ (Instant III) για ph=2 και ph=8...95 Σχήμα 7.5: Διάγραμμα Ruzic δείγματος στιγμιαίου καφέ (Instant III). Ευθεία καμπύλη του λόγου Μ/(ΜΤ-Μ) (του ελεύθερου ιοντικού χαλκού προς το συμπλεγμένο) ως προς Μ (τον ελεύθερο ιοντικό χαλκό)...96 13

Σχήμα 7.6: Κινητική της οξείδωσης της LDL και υπολογισμός του Lag time (σημείο Β) από μετρήσεις απορρόφησης...102 Σχήμα 8.1: Συγκέντρωση ολικού οργανικού άνθρακα σε ροφήματα καφέ...108 Σχήμα 8.2: Συγκεντρώσεις συμπλεκτικής ικανότητας ιόντων Cu (L T ) σε ροφήματα καφέ...109 Σχήμα 8.3: Τιμές σταθερών σχηματισμού συμπλόκων Cu...110 Σχήμα 8.4: Συγκριτικό διάγραμμα συγκεντρώσεων L T και ολικού χαλκού...111 Σχήμα 8.5: LagTime ροφημάτων καφέ (σε hours)...114 Σχήμα 9.1: Συσχέτιση ολικού φαινολικού περιεχομένου με την ικανότητα δέσμευσης της ρίζας DPPH των ροφημάτων καφέ (CAE= ισοδύναμα καφεϊκού οξέος, ΤΕ= ισοδύναμα Trolox)...123 Σχήμα 9.2: Συσχέτιση ολικού φαινολικού περιεχομένου με την αναγωγική δύναμη των ροφημάτων καφέ (CAE= ισοδύναμα καφεϊκού οξέος, ΑΑΕ= ισοδύναμα ασκορβικού οξέος)...124 Σχήμα 9.3: Συσχέτιση συγκεντρώσεων SAS eq. σε Triton-X-100(T-X-100) σε ροφήματα καφέ. Οι γραμμές αντιστοιχούν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αναφοράς...127 14

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1.1: Ετήσια κατανάλωση καφέ σε kg per capita...20 Εικόνα 2.1: Κύριες χώρες παραγωγής καφέ...24 Εικόνα 2.2: Κατανάλωση καφέ ανά ηλικία...26 Εικόνα 2.3: Coffee Arabica...30 Εικόνα 2.4: Coffee Canephora...30 Εικόνα 2.5: Κόκκοι καφέ κατά τη διαδικασία του καβουρδίσμα...33 Εικόνα 2.6: Καφές espresso...36 Εικόνα 2.7: Καφές φίλτρου...37 Εικόνα 2.8: Κόκκοι στιγμιαίου καφέ...38 Εικόνα 2.9: Σερβίρισμα ελληνικού καφέ...39 Εικόνα 3.1: Το μόριο της καφεΐνης...42 Εικόνα 3.2: Προϊόν αντίδρασης Maillard...44 Εικόνα 3.3: Χλωρογενικό οξύ...45 Εικόνα 3.4: Καφεϊκό οξύ...46 Εικόνα 3.5: Κουμαρικό οξύ...46 Εικόνα 3.6: Το μόριο της καφεστόλης...47 Εικόνα 3.7: Σιτοστερόλη...48 Εικόνα 3.8: Καμπεστερόλη...48 Εικόνα 3.9: Στιγμαστερόλη...48 Εικόνα 5.1: Ταξινόμηση μεταλλικών στοιχείων με βάση τη χημική τους συγγένεια με πιθανούς υποκαταστάτες...62 Εικόνα 5.2: Αυτοφυής χαλκός. Προέλευση ΗΠΑ...63 Εικόνα 5.3: Τροφές πλούσιες σε χαλκό...65 Εικόνα 7.1: Ηλεκτροχημικός αναλυτής ECO-CHEMIE συνδεδεμένος με κυψελίδα μέτρησης τριών ηλεκτροδίων της Metrohm (VA 663)...93 Εικόνα 7.2: Κυψελίδα μέτρησης του ηλεκτροχημικού αναλυτή μαζί με τα ηλεκτρόδια...93 15

Εικόνα 8.1: Χρωματογράφημα SIM απλών πολυφαινολών σε ρόφημα ελληνικού καφέ...117 Εικόνα 8.2: Χρωματογράφημα SCAN συνολικού ρεύματος ιόντων...118 Εικόνα 8.3: Χρωματογράφημα ολικών ιόντων (SCAN) των τριμεθυλσιλυλαιθέρων απλών πολυφαινολών σε ρόφημα ελληνικού καφέ. Κορυφές 1: Χλωρογενικό οξύ (5-Ο-καφφεοϋλκινικό oξύ), 2: 4-Oκαφφεοϋλκινικό οξύ, 3: 3-O-καφφεοϋλκινικό οξύ...118 Εικόνα 8.4: Χρωματογράφημα GC- FID των λιπαρών οξέων σε ρόφημα ελληνικού καφέ...121 Εικόνα 8.5: Χρωματογράφημα GC- MS φυτοστερολών σε ρόφημα ελληνικού καφέ...122 16

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 3.1: Χημική σύσταση ακαβούρδιστων κόκκων καφέ (% επί ξηρού)...40 Πίνακας 5.1: Βασικά χαρακτηριστικά χαλκού...66 Πίνακας 7.1: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Espresso I...85 Πίνακας 7.2: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Espresso II...85 Πίνακας 7.3: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Espresso III...86 Πίνακας 7.4: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Filter I...86 Πίνακας 7.5: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Filter II...86 Πίνακας 7.6: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Filter III....87 Πίνακας 7.7: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Instant I...87 Πίνακας 7.8: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Instant IΙ...87 Πίνακας 7.9: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα δείγματος Instant ΙΙI...88 Πίνακας 7.10: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα ροφημάτων ελληνικού καφέ...89 Πίνακας 7.11: Υγρασία, στερεό υπόλειμμα στο ίζημα(κατακάθι) του ελληνικού καφέ...89 Πίνακας 7.12: Μεθανολικά εκχυλίσματα λυοφιλιοποιημένων δειγμάτων καφέ...90 Πίνακας 7.13: Βάρος κ.ο. δειγμάτων καφέ...90 Πίνακας 7.14: Ζυγίσεις για προσδιορισμό λιπαρών οξέων και φυτοστερολών...105 Πίνακας 8.1: Συγκεντρώσεις (mg/l) στερεού εκχυλίσματος και TOC. Στις παρενθέσεις φαίνονται οι ποσότητες κάθε παραμέτρου ανά μερίδα καφέ (60mL για espresso, φίλτρου και ελληνικό και 50mL για το στιγμιαίο καφέ)...107 Πίνακας 8.2: Συγκεντρώσεις συμπλεκτικής ικανότητας ιόντων Cu (L T )...109 Πίνακας 8.3: Τιμές σταθερών σχηματισμού συμπλόκων Cu(logk)...109 Πίνακας 8.4: Συγκεντρώσεις (μg/l) ολικού χαλκού. Στις παρενθέσεις φαίνονται οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις ανά μερίδα ροφήματος...110 Πίνακας 8.5: Συγκεντρώσεις SAS και CAC mg/l σε ροφήματα καφέ. Στις παρενθέσεις φαίνονται οι συγκεντρώσεις ανά μερίδα καφέ (mg/60ml για espresso, φίλτρου και ελληνικό και mg/50ml για το στιγμιαίο καφέ)...112 17

Πίνακας 8.6: Συνολικό φαινολικό περιεχόμενο των ροφημάτων, εκφρασμένο σε mg ισοδύναμων καφεϊκού οξέος (CAE)...113 Πίνακας 8.7: Ικανότητα των ροφημάτων του καφέ να δεσμεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH, (εκφρασμένη σε mg ισοδύναμων Trolox) και αναγωγική δύναμη αυτών (εκφρασμένη σε mg ισοδύναμων ασκορβικού οξέος ΑΑΕ)...113 Πίνακας 8.8: Χρόνος αντίστασης του ορού του αίματος στην οξείδωση (σε sec.)...114 Πίνακας 8.9: Απλές πολυφαινόλες και τερπενικά οξέα (μg/cup) σε ροφήματα καφέ...115 Πίνακας 8.10: Απλές πολυφαινόλες και τερπενικά οξέα (μg/l) σε ροφήματα καφέ...116 Πίνακας 8.11: Λιπαρά οξέα (% λιπαρών οξέων) στα λιπίδια ροφημάτων καφέ...120 Πίνακας 8.12: Στερόλες και άθροισμα στερολών (μg/cup) σε ροφήματα καφέ...121 Πίνακας 8.13: Στερόλες και άθροισμα στερολών (μg/l) σε ροφήματα καφέ...121 Πίνακας 9.1: Τιμές συγκεντρώσεων παραμέτρων ροφημάτων καφέ...128 Πίνακας 9.2: Κανονικοποιημένες τιμές συγκεντρώσεων παραμέτρων ροφημάτων καφέ...129 Πίνακας 9.3: Συγκριτικός πίνακας συγκέντρωση παραγόντων που μπορούν να συμπλέξουν ιόντα χαλκού, κανονικοποιημένων τιμών αυτών και του λόγου L T / TOC μεταξύ ροφημάτων καφέ και αφεψημάτων βοτάνων...131 18

19

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ένα από τα δημοφιλέστερα ροφήματα σε παγκόσμια κλίμακα είναι ο καφές. Η γεύση, το ιδιαίτερο άρωμα αλλά και η πνευματική και σωματική τόνωση που επιφέρει η κατανάλωσή του, τον καθιστά καθημερινή συνήθεια και αναγκαιότητα για εκατομμύρια ανθρώπους. Υπολογίζεται ότι η διαδικασία παρασκευής του ροφήματος επαναλαμβάνεται παγκοσμίως πάνω από 400 δισεκατομμύρια φορές το χρόνο [1]. Εικόνα 1.1 Ετήσια κατανάλωση καφέ (kg per capita). (Πηγή: International Coffee Organization) Οι περισσότεροι καταναλωτές προτιμούν τον καφέ τους ως ένα μέσο για να αποκτήσουν εγρήγορση το πρωί, να ανακτήσουν ενέργεια κατά τη διάρκεια της ημέρας ή ακόμη και για κοινωνικούς λόγους εστίασης και συνάθροισης. Παρόλα αυτά, η κατανάλωση του καφέ κρύβει αρκετά ακόμη οφέλη για την ανθρώπινη υγεία, χάρη στις άφθονες βιοδραστικές οργανικές ουσίες που 20

διαθέτει. Υδατάνθρακες, πολυσακχαρίτες, μονοσακχαρίτες, πρωτεΐνες, μελανοϊδή, καφεΐνη, λιπίδια, πολυφαινόλες, λιπαρά οξέα, πτητικά έλαια, πεντακυκλικά διτερπένια, τοκοφερόλες και αρωματικές ουσίες είναι μερικές από τις χημικές ουσίες που καθιστούν τον καφέ ένα εξαιρετικό αντιοξειδωτικό ρόφημα, του οποίου η καθημερινή κατανάλωση, σε φυσιολογικά επίπεδα, μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων, διαβήτη καθώς και της νόσου Alzheimer και Parkinson [2]. Παρά το γεγονός ότι οι σπόροι του καφέ προέρχονται από δύο μόνο είδη των δέντρων του καφέ, Coffea arabica και Coffea canephora (Robusta), παρατηρούνται διαφορές στη γεύση, το άρωμα τη και χημική σύσταση μεταξύ των διαφορετικών ροφημάτων καφέ. Η επεξεργασία των κόκκων καφέ, η άλεση, η γήρανση, το καβούρδισμα και η τεχνική παρασκευής έχουν επίδραση επί της χημικής σύνθεσης και των χαρακτηριστικών των ροφημάτων [3]. Στις κοινές μεθόδους παρασκευής ροφημάτων καφέ συγκαταλέγονται η απλή διήθηση, ο βρασμός, η εκχύλιση (καφετιέρα απλή ή espresso), καθώς και άλλοι πολλοί διαφορετικοί τρόποι παρασκευής σε όλο τον κόσμο. Επιπλέον, πολλοί είναι εκείνοι που προσθέτουν στον καφέ τους ζάχαρη, γάλα, κρέμα ή ακόμη και αλκοόλ, με αποτέλεσμα να υπάρχουν πάνω από 60 γνωστά ροφήματα καφέ παγκοσμίως [4]. Η πλειοψηφία αυτών των ροφημάτων έχει, όπως προαναφέρθηκε, υψηλή αντιοξειδωτική δράση, μια ιδιότητα η οποία έγκειται στο γεγονός ότι οι οργανικές ενώσεις μπορούν να μειώσουν τη διαθεσιμότητα των ελεύθερων ριζών [5] και να δεσμεύσουν τα οξειδοαναγωγικά ενεργά μέταλλα όπως Cu, Fe, Cr, Co, Ni, V [6]. Τα μέταλλα αυτά θεωρούνται σημαντικότατη εξωγενής πηγή παραγωγής των Δραστικών Μορφών Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) και των Δραστικών Μορφών Αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS), όταν υπόκεινται σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής στα βιολογικά συστήματα [7]. Εάν στον οργανισμό η συγκέντρωση των ROS και RNS, τα οποία είναι άρρηκτα συνδεδεμένα με το οξειδωτικό στρες, υπερβεί ορισμένα επίπεδα δύναται να προκληθεί καταστροφή των βιολογικών μακρομορίων που σε τελικό στάδιο μπορεί να επιφέρει την παρουσία διαφόρων εκφυλιστικών ασθενειών όπως ο καρκίνος, η αθηροσκλήρωση, οι 21

νευροεκφυλιστικές νόσοι, ο διαβήτης και οι καρδιαγγειακές παθήσεις [8]. Κατά συνέπεια, η δέσμευση των ενεργών μετάλλων είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρησή τους σε μια σταθερή οξειδωτική κατάσταση, προκειμένου αυτά να μην είναι σε θέση να συμμετέχουν σε βιολογικές διαδικασίες που θα μπορούσαν να έχουν ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες. Η ικανότητα των ροφημάτων καφέ να αναστέλλουν τη διαδικασία της οξείδωσης είναι, ως επί το πλείστον, συνδεδεμένη με την παρουσία πολυφαινολών, χλωρογενικού οξέος, φερουλικού, καφεϊκού και κουμαρικού οξέος τα οποία περιέχονται σε αυτά [9]. Επιπλέον, η καφεΐνη, οι φαινυλαλανίνες και ορισμένες πτητικές ενώσεις, όπως πυρόλες και φουράνια, φαίνεται να ενισχύουν την αντιοξειδωτική ικανότητα των ροφημάτων καφέ. Στον καβουρδισμένο καφέ συντίθενται, ως προϊόντα αντιδράσεων Maillard, οι μελανοϊδίνες (καστανές χρωστικές ουσίες), που θεωρούνται πρόσθετο αντιοξειδωτικό [10]. Η επιστημονική κοινότητα έχει επανειλημμένως ασχοληθεί με την επίδραση που έχει το καβούρδισμα στην αντιοξειδωτική ικανότητα του καφέ. Μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει μια σχέση μεταξύ της αντιοξειδωτικής δράσης και της μεθόδου καβουρδίσματος που χρησιμοποιείται, της θερμοκρασία φρύξης και του χρόνου [11]. Πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι η ταυτόχρονη κατανάλωση τροφίμων πλούσιων σε φυτοχημικές ενώσεις, όπως καφές ή βότανα μαζί, με ψάρια και θαλασσινά μπορεί να μειώσει τη βιοδιαθεσιμότητα των τοξικών μετάλλων που δύνανται να περιέχουν τα τελευταία [12]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο καφές είναι εμπλουτισμένος με βιοδραστικές οργανικές ενώσεις που θα μπορούσαν να δεσμεύσουν τα τοξικά μέταλλα, ταυτόχρονη κατανάλωση τροφίμων με ένα φλιτζάνι καφέ, θα μπορούσε πράγματι να μειώσει το ποσοστό των βιοδιαθέσιμων ανεπιθύμητων μετάλλων στον ανθρώπινο οργανισμό. Παρόλα αυτά, η κατανάλωση καφέ παραμένει ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα. Πολλοί είναι εκείνοι που αντιτίθενται στην κατανάλωσή του, υποστηρίζοντας πως η καφεΐνη που εμπεριέχουν τα ροφήματα καφέ όχι μόνο είναι εθιστική, αλλά συνδέεται έμμεσα με την εμφάνιση παθογόνων καταστάσεων όπως αυξημένη αρτηριακή πίεση, διαβήτη, καρδιακές αρρυθμίες κ.α [13]. Σύμφωνα με την Επιστημονική Επιτροπή Τροφίμων της Ευρωπαϊκής Ένωσης, στοιχεία 22

βασιζόμενα σε ανθρώπινες μελέτες, οι οποίες αφορούν άτομα υγιή, που υποβάλλονται σε έντονη άσκηση και με προδιάθεση για καρδιακή αρρυθμία, δεν έχουν δείξει τυχόν κινδύνους από πρόσληψη καφεΐνης σε φυσιολογικά επίπεδα [14]. Δεδομένης της εξαιρετικής απήχησης που έχει ο καφές, παρά τις όποιες επιστημονικές ή μη ενστάσεις, οι επιδράσεις του στον οργανισμό και η πιθανή θετική συνεισφορά του αποτελούν καίριο αντικείμενο επιστημονικής μελέτης. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της συμπλεκτικής ικανότητας ιόντων χαλκού σε ροφήματα καφέ. Μελετήθηκαν δείγματα από τέσσερα είδη καφέ: espresso, καφές φίλτρου, στιγμιαίος και ελληνικός. Προσδιορίστηκε η συμπλεκτική ικανότητα των ιόντων Cu (L T ), η σταθερά σχηματισμού των συμπλόκων του μετάλλου (logk app ) με τη μέθοδο της Διαφορικής Παλμικής Ανοδικής Αναδιαλυτικής Βολταμμετρίας (Differential Pulse Anodic Stripping Voltammentry, DPASV), ο ολικός περιεχόμενος χαλκός με τη μέθοδο της φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης και ο ολικός οργανικός άνθρακας (Τotal Οrganic Carbon, TOC) με τη μέθοδο της καταλυτικής οξείδωσης σε υψηλή θερμοκρασία. Οι επιφανειοδραστικές ουσίες (Surface Active Substances, SAS) και οι ενεργές καταλυτικές ουσίες (Catalytically Active Compounds, CAC) προσδιορίσθηκαν με Βολταμετρία Εκλεκτικής Φάσης Εναλλασσόμενου Ρεύματος (PSACV), ενώ διεξήχθησαν και αντιοξειδωτικές δοκιμές. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μερικός χαρακτηρισμός του οργανικού υλικού που περιέχεται στα ροφήματα, με χρήση της αναλυτικής τεχνικής Αέριας Χρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μάζας (GC- MS). Τέλος, εξετάστηκε η πιθανή συσχέτιση των πολυφαινολών και της αντιοξειδωτικής ικανότητας με τη συμπλοκοποίηση του χαλκού. 23

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΚΑΦΕΣ, ΕΝΑ ΠΟΛΥΠΛΟΚΟ ΡΟΦΗΜΑ 2.1 Γενικά για τον καφέ Στις μέρες μας ο καφές είναι το δεύτερο πιο εμπορεύσιμο προϊόν στη παγκόσμια αγορά μετά το πετρέλαιο, χάρη στην αναζωογονητική του δράση, το φίνο άρωμα και τη γεύση του. Η παγκόσμια παραγωγή καφέ έχει αυξηθεί από 86 εκατομμύρια σάκους το 1980 σε 112 εκατομμύρια σάκους το 2000. Παρόλα αυτά παρατηρούνται μεγάλες ετήσιες διακυμάνσεις οφειλόμενες κυρίως στην ηγέτιδα παραγωγό Βραζιλία. Η βραζιλιάνικη σοδειά καφέ μπορεί να ποικίλλει από το 19 έως το 33% της ετήσιας παγκόσμιας παραγωγής γεγονός που οφείλεται σε επαναλαμβανόμενους παγετούς, βροχοπτώσεις, ξηρασίες κτλ. Καφές παράγεται σε περίπου 60 χώρες, συμπεριλαμβανομένων και των µελών Παγκοσμίου Οργανισμού Καφέ (Εικόνα 2.1) [15]. Εικόνα 2.1 Κύριες χώρες παραγωγής καφέ. (Πηγή: International Coffee Organization) Στο Σχήμα 2.1 εμφανίζονται τα ποσοστά εξαγωγής καφέ για το έτος 2012, των κύριων χωρών παραγωγής. Στη σύγχρονη εποχή, ο καφές έχει γίνει τόσο δημοφιλής, κατέχοντας τη δεύτερη θέση στην κατανάλωση ροφημάτων μετά το νερό [16]. Είναι θέμα γεύσεως ή ακόμη καλύτερα της συνολικής επίδρασής 24

του στις αισθήσεις µας. Η κατανάλωση του καφέ είναι ευρέως διαδεδομένη σε όλο τον κόσμο, ειδικά στην Ευρώπη, τις Ηνωμένες Πολιτείες, τη Βραζιλία και την Ιαπωνία, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 2.2. Σχήμα 2.1 Ποσοστό παγκόσμιας εξαγωγής καφέ κύριων χωρών παραγωγής. (Πηγή: International Coffee Organization) Σχήμα 2.2 Ετήσια κατανάλωση καφέ σε kg-per capita. (Πηγή: International Coffee Organization) 25

Ενδιαφέρον παρουσιάζουν και οι ηλικίες κατανάλωσης ροφημάτων καφέ. Όπως φαίνεται από την εικόνα 2.2, η αύξηση της ηλικίας συνοδεύεται από αύξηση της ημερήσιας κατανάλωσης καφέ. Εικόνα 2.2 Κατανάλωση καφέ ανά ηλικία. (Πηγή: http://www.statisticbrain.com/) Το δέντρο του καφέ, ένας αειθαλής ξυλώδης θάμνος, ανήκει στην οικογένεια Rubiaceae του γένους Coffea. Αν και έχουν αναγνωρισθεί πάνω από 80 είδη καφεόδεντρου σε όλο τον κόσμο μόνο δύο ποικιλίες είναι οικονομικά εκμεταλλεύσιμες, η Coffee Arabica και η Coffee canephora (Robusta). Η ποικιλία arabica είναι η αρχαιότερη από τις δύο. Πιστεύεται ότι προέρχεται από την Αιθιοπία αλλά, όπως δηλώνει και η ονομασία της, καλλιεργήθηκε για πρώτη φορά στην Αραβική Χερσόνησο. Το 78% της παγκόσμιας παραγωγής καφέ είναι της ποικιλίας arabica. Ευδοκιμεί καλύτερα σε μεγάλα υψόμετρα, διαθέτει μια πολύ ραφιναρισμένη γεύση σε σύγκριση με τα υπόλοιπα είδη καφέ και περιέχει 1% καφεΐνη. Η ποικιλία arabica στις μέρες μας παράγεται κυρίως σε χώρες της Κεντρικής και Νότιας Αμερικής και είναι γνωστή για την έντονη αρωματική γεύση που δίνει στον καφέ. Από 26

υψηλής ποιότητας ποικιλία arabica παρασκευάζονται οι διάφοροι τύποι ελαφρύ καφέ [17]. Η ποικιλία robusta είναι ανθεκτικότερη στις ασθένειες, λόγω της σχεδόν διπλάσιας ποσότητας καφεΐνης που περιέχει (η καφεΐνη μπορεί να παραλύσει και να σκοτώσει ορισμένα από τα έντομα που απειλούν το καφεόδεντρο). Είναι ένα «εύρωστο» είδος με υψηλή παραγωγή ανά φυτό. Ευδοκιμεί σε χαμηλότερα υψόμετρα και διαθέτει μια πιο δριμεία, σκληρή γεύση. Η ποικιλία robusta, που αποτελεί το υπόλοιπο 22% της παγκόσμιας παραγωγής, έχει τη δυνατότητα να προσαρμόζεται στα θερμά-υγρά κλίματα, στα οποία η arabica δεν ευδοκιμεί. Παρά την περισσότερο ουδέτερη γεύση της σε σχέση με την arabica, η ποικιλία robusta έχει αυξημένη δημοτικότητα, ιδιαίτερα στη μορφή του διαλυτού καφέ [18]. 2.2 Η ιστορία του καφέ Η παγκόσμια εξάπλωση της καλλιέργειας και κατανάλωσης του καφέ ξεκίνησε στη χερσόνησο της βορειοανατολικής Αφρικής, όπου, σύμφωνα με το μύθο, τα δέντρα του καφέ εντοπίζονταν στην περιοχή του Βασιλείου της Κάφφα, επαρχίας της Αιθιοπίας. Το όνομα του καφέ προέρχεται από την αραβική λέξη qahwa που είναι παραφθορά τμήματος της αρχικής αραβικής ονομασίας του καφέ, qahwat albūnn, κρασί του κόκκου, που αναφέρεται στο γεγονός ότι ο καφές χρησιμοποιείται σαν υποκατάστατο του κρασιού, καθώς το Κοράνι απαγορεύει το αλκοόλ. Έχει καταγραφεί ότι ο καρπός του φυτού καταναλωνόταν από τους σκλάβους που μεταφέρονταν από το σημερινό Σουδάν στην Υεμένη και την Αραβία, μέσω του τότε σημαντικού λιμανιού, Mόκα. Είναι βέβαιο πως ο καφές καλλιεργείτο στην Υεμένη από τον 15 ο αιώνα και πιθανότατα πολύ νωρίτερα. Οι Άραβες σε μια προσπάθεια να αποτρέψουν την καλλιέργειά του και σε άλλες χώρες, απαγόρευσαν την εξαγωγή γόνιμων κόκκων καφέ εκτός συνόρων. Ο περιορισμός αυτός έλαβε τέλος το 1616 από τους Ολλανδούς, οι οποίοι επιστρέφοντας στην Ολλανδία 27

μετέφεραν μαζί τους καφεόδεντρα προκειμένου να καλλιεργηθούν μέσα σε θερμοκήπια [19]. Τα πρώτα καφεποτεία (kaveh kanes) άνοιξαν στη Μέκκα και γρήγορα εξαπλώθηκαν σε όλο τον αραβικό κόσμο, ευδοκιμώντας ως χώροι συνάθροισης, τέλεσης χοροεσπερίδων, διεξαγωγής εμπορικών συμφωνιών αλλά και ως «καταφύγια» πολιτικών συζητήσεων. Μέχρι τα τέλη του 1600 οι Ολλανδοί καλλιεργούσαν καφέ στο Malabar της Ινδίας και την Ινδονησία. Μέσα σε λίγα χρόνια οι ολλανδικές αποικίες είχαν γίνει οι κύριοι προμηθευτές του καφέ στην Ευρώπη, τον οποίο εισήγαν το 1615 οι Βενετοί έμποροι. Αν και αρχικά ο καφές χρησιμοποιείτο από τους Ευρωπαίους για ιατροφαρμακευτικούς λόγους, το 1683 άνοιξε στη Βενετία το πρώτο καφεποτείο ακολουθούμενο από το διασημότερο Caffe Florian στην πλατεία του Αγίου Μάρκου το 1720, το οποίο λειτουργεί μέχρι και σήμερα. Η εξάπλωση του καφεόδεντρου στην Κεντρική και Νότια Αμερική έγινε και πάλι από τους Ολλανδούς, καθιστώντας τις χώρες αυτές ως κυρίαρχες πηγές συγκομιδής έως και σήμερα. Το 1730 οι Βρετανοί εισήγαγαν τον καφέ στην Τζαμάικα, όπου πλέον παράγεται το διασημότερο και ακριβότερο είδος καφέ στα Γαλάζια Όρη (Blue Mountains). Περί τις αρχές του 1830 η Βραζιλία ήταν ο μεγαλύτερος παραγωγός καφέ στον κόσμο με παραγωγή πάνω 600.000 σάκους ετησίως, ακολουθούμενη από την Κούβα, την Ιάβα και την Αϊτή, η καθεμία με ετήσια παραγωγή από 350 έως 450.000 σάκους. Η παγκόσμια παραγωγή ανήλθε σε περίπου 2.5 εκατ. σάκους ετησίως [20]. Η διάνοιξη της Διώρυγας του Παναμά το 1914 έδωσε τεράστια ώθηση στην εξαγωγή του καφέ από την Κολομβία και σηματοδότησε μια νέα εποχή στην εμπορία του προϊόντος. Έως το 1905 η Κολομβία εξήγαγε 500.000 σάκους καφέ ετησίως, ενώ από το 1915 και έπειτα τα νούμερα διπλασιάστηκαν, φέρνοντας τον συγκεκριμένο καφέ πρώτο στις προτιμήσεις των Αμερικανών και Ευρωπαίων καταναλωτών. Από εκείνο το σημείο και έπειτα η Κολομβία και η Βραζιλία κυριαρχούν στον παγκόσμιο χάρτη παραγωγής καφέ, με παραγωγή εκατομμυρίων σάκων κάθε χρόνο. 28

Παρά τις πολιτικές, κοινωνικές και οικονομικές αναταραχές του 20ού αιώνα η ζήτηση του καφέ παρουσίασε μια συνεχόμενη αύξηση. Η κατανάλωση στις ΗΠΑ συνέχισε να αυξάνεται φθάνοντας στο αποκορύφωμά της το 1946, όταν η ετήσια κατανάλωση ανά κάτοικο ήταν 19.8 κιλά. Η επιπρόσθετη αύξηση της παραγωγής σε όλες τις περιοχές καλλιέργειας του καφεόδεντρου ήταν αναγκαία. Μετά τη λήξη του Δευτέρου Παγκοσμίου Πολέμου ακόμη περισσότερα κράτη ξεκίνησαν να καλλιεργούν και να παράγουν καφέ, βασίζοντας μεγάλο κομμάτι της οικονομίας τους σε αυτή τη δραστηριότητα [21]. Η σημασία του καφέ για την παγκόσμια οικονομία είναι ιδιαιτέρως μεγάλη. Είναι ένα από τα πολυτιμότερα πρωτογενή προϊόντα του παγκόσμιου εμπορίου και η καλλιέργεια, η επεξεργασία, η εμπορία, η μεταφορά και η προώθησή του προσφέρουν απασχόληση σε εκατομμύρια ανθρώπους σε όλο τον κόσμο. Ο καφές είναι ζωτικής σημασίας για τις οικονομίες και τις πολιτικές διαφόρων αναπτυσσόμενων χωρών, κάτι που μαρτυρά η υψηλή αξία της μετοχής του στο Χρηματιστήριο. 2.3 Στάδια παραγωγής και επεξεργασίας καφέ Συγκομιδή Η συγκομιδή των καρπών με τον πλέον σωστό τρόπο είναι σημαντική για την ποιότητα της σοδειάς. Οι καρποί του καφέ μαζεύονται μόλις ωριμάσουν. Η διαδικασία αυτή μπορεί να μην είναι τόσο εύκολη γιατί ακόμα και στο ίδιο καφεόδεντρο οι καρποί ωριμάζουν σε διαφορετική χρονική στιγμή. Είναι πιθανόν στο ίδιο κλαδί να υπάρχουν ώριμοι καρποί και καρποί που δεν έχουν ωριμάσει. Είναι σημαντικό οι ώριμοι να ξεχωρίζονται, αλλιώς η ποιότητα βλάπτεται. Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι συγκομιδής των καρπών του καφεόδενδρου, οι πλέον συνηθισμένες εκ των οποίων είναι η συλλογή χειρωνακτικά και το τίναγμα με ειδικά μηχανήματα. Η συγκομιδή χειρωνακτικά χρησιμοποιείται κυρίως για την παραγωγή εξαιρετικών ποικιλιών καφέ [22]. 29

Όπως προαναφέρθηκε, μόνο δύο ποικιλίες είναι οικονομικά εκμεταλλεύσιμες, η Coffeα Arabica και η Coffeα canephora (Robusta), οι οποίες φαίνονται στις παρακάτω εικόνες: Εικόνα 2.3 Coffeα Arabica Εικόνα 2.4 Coffeα canephora.(robusta). (Πηγή: http://www.zmescience.com) Στη συνέχεια οι καρποί θα πρέπει να υποβληθούν σε προσεκτική επεξεργασία. Πρέπει να διαχωριστούν οι βαθμοί ωρίμανσης και να απομακρυνθούν οι καρποί που φέρουν ατέλειες. Επεξεργασία κόκκων Υγρή επεξεργασία: Η μέθοδος αυτή απαιτεί μεγάλη προσοχή και ως εκ τούτου παρέχει καλύτερη ποιότητα κόκκων καφέ. Οι καρποί πλένονται και κοσκινίζονται ώστε να απομακρυνθούν τυχόν ρύποι. Στη συνέχεια, συμπιέζονται μηχανικά, ώστε να βγει η σάρκα. Οι κόκκοι του καφέ αποξηραίνονται αμέσως και η σάρκα του καρπού που έχει παραμείνει προσδίδει περισσότερη γλυκύτητα. Τα υπολείμματα της σάρκας απομακρύνονται με μηχανικό καθαρισμό των κόκκων, πριν ο ακατέργαστος καφές χάσει την υπόλοιπη υγρή σύστασή του, που είναι προσκολλημένη στην κιτρινωπή μεμβράνη, κατά το ψήσιμο ζύμωσης. Η ζύμωση δεν πρέπει να διαρκέσει πάνω από 36 ώρες. Η διαδικασία αυτή προσδίδει στον καφέ έντονη φρουτώδη γεύση και περισσότερη οξύτητα. Τέλος, ο καφές πλένεται ξανά και αποξηραίνεται στον ήλιο ή μηχανικά. Η διαδικασία αυτή κρατάει περίπου για άλλες δέκα ημέρες. Για να είναι έτοιμοι οι κόκκοι για περαιτέρω επεξεργασία, το επίπεδο υγρασίας τους δεν πρέπει να ξεπερνάει το 11-12%. Η διαδικασία αυτή είναι πολύ σημαντική για τη διατήρηση της γεύσης του καφέ. Ο υγρός καθαρισμός λόγω 30

της χρήσης νερού, ενέργειας και εξοπλισμού είναι σαφώς πιο δαπανηρός [23]. Ξηρή επεξεργασία: Πριν ξεκινήσει η ξηρή επεξεργασία γίνεται καθαρισμός των κόκκων από εξωτερικούς ρύπους. Ο καθαρισμός αυτός γίνεται με τη χρήση αέρα υπό υψηλή πίεση, μετά οι κόκκοι απαλλάσσονται από τη σκόνη και στο τέλος πλένονται. Μόλις απομακρυνθούν τα κλαδιά, τα φύλλα, οι πέτρες κλπ. οι κόκκοι αποξηραίνονται. Επίσης, κατά το πλύσιμο των κόκκων οι πιο ώριμοι καρποί βγαίνουν στην επιφάνεια και έτσι αποχωρίζονται ευκολότερα. Στη συνέχεια, οι καρποί αποξηραίνονται για δύο εβδομάδες περίπου στον ήλιο, ενώ αναταράσσονται μερικές φορές την ημέρα. Η διαδικασία αυτή κρατάει 2 έως 3 εβδομάδες. Τη νύχτα και όταν βρέχει οι κόκκοι καλύπτονται ώστε να προστατευθούν από την υγρασία. Σε πιο ξηρές περιοχές οι κόκκοι μπορεί να μην πλένονται, αλλά κατευθείαν να αρχίσουν να υποβληθούν σε ξήρανση. Κατόπιν, οι κόκκοι περνάνε από ειδική συσκευή αποξήρανσης ώστε τα επίπεδα υγρασίας τους να πέσουν σε 11-12%. Όταν οι κόκκοι είναι ήδη ξηροί αρχίζει η διαδικασία απομάκρυνσης της σάρκας. Ο εξοπλισμός είναι παρόμοιος με εκείνον που χρησιμοποιείται στην υγρή επεξεργασία καθαρισμού. Μετά από αυτές οι διαδικασίες οι κόκκοι καφέ ξεχωρίζονται ανάλογα με το βάρος και τα μεγέθη τους. Τέλος πακετάρονται σε τυποποιημένες σακούλες [24]. Άλλες προαιρετικές διαδικασίες που μπορούν να ακολουθηθούν είναι η ταξινόμηση με βάση το μέγεθος, η παλαίωση των κόκκων, η αποθήκευση καθώς και η αποκαφεΐνοποίση, με πιο συνηθισμένη μέθοδο εκείνη της χρήσης θερμού νερού για τη διάνοιξη των πόρων και τη διόγκωση των κόκκων του καφέ. Η απομάκρυνση της καφεΐνης γίνεται με οργανικούς διαλύτες, που είναι αρκετά εκλεκτικοί, όπως μεθυλενοχλωρίδιο ή οξικός αιθυλεστέρας [25]. Καβούρδισμα Οι χλωροί καρποί έχουν μια γήινη, φυτική μυρωδιά και γι αυτό πρέπει να υποβληθούν σε θερμική επεξεργασία η οποία ονομάζεται καβούρδισμα, που θα αναδείξει το πραγματικό άρωμά τους. Το καβούρδισμα, σε ένα εύρος 31

θερμοκρασιών μεταξύ 200 250 C, προκαλεί έντονες αλλαγές. Ο όγκος των σπόρων αυξάνεται (50 80%) και αλλάζει η δομή και το χρώμα τους. Το πράσινο χρώμα αντικαθίσταται από το καφέ, παρατηρείται μια απώλεια βάρους της τάξεως του 13 20% και μια σταδιακή αύξηση στην εμφάνιση του χαρακτηριστικού αρώματος των καβουρδισμένων σπόρων. Ταυτόχρονα, το ειδικό βάρος πέφτει από 1.126 1.272 g/cm 3 στο 0.570 0.694 g/cm 3. Έτσι, οι καβουρδισμένοι σπόροι επιπλέουν στο νερό ενώ οι χλωροί βυθίζονται. Οι σκληροί και άθραυστοι σπόροι γίνονται εύθραυστοι και μαλακοί μετά το καβούρδισμα [26]. Τέσσερις κύριες φάσεις διακρίνονται κατά τη διάρκεια του καβουρδίσματος. Το στέγνωμα, η ωρίμανση, η αποσύνθεση και τέλος το πλήρες καβούρδισμα. Οι αρχικές αλλαγές λαμβάνουν μέρος περίπου στους 50 C όταν η πρωτεΐνη στα κύτταρα των ιστών μετουσιώνεται και το νερό εξατμίζεται. Το μαύρισμα εμφανίζεται πάνω από τους 100 C, κατά τη διάρκεια της πυρόλυσης των οργανικών συστατικών και συνοδεύεται από διόγκωση και μια αρχική ξηρή απόσταξη. Περίπου στους 150 C λαμβάνει χώρα έκλυση των πτητικών συστατικών (νερό, CO 2, CO) η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια αύξηση στον όγκο του σπόρου. Η φάση της αποσύνθεσης, η οποία αρχίζει στους 180 200 C, είναι χαρακτηριστική γιατί οι σπόροι αναγκάζονται να ανοίξουν στην εγκοπή τους, ενώ ταυτόχρονα εκλύεται γαλαζωπός καπνός και απελευθερώνεται το άρωμα του καφέ. Τελικώς, έχοντας πραγματοποιήσει άριστη καραμελοποίηση, η φάση του πλήρους καβουρδίσματος έχει επιτευχθεί, με την περιεχόμενη υγρασία των σπόρων να πέφτει στο τελικό επίπεδο της τάξεως του 1.5 3.5%. Η διαδικασία του καβουρδίσματος χαρακτηρίζεται από το μετασχηματισμό των αρχικών χημικών ενώσεων σε νέες. Η συνεχής λειτουργία της διαδικασίας καβουρδίσματος απαιτεί ικανότητα και εμπειρία για την παραλαβή ομοιόμορφου χρώματος και άριστου αρώματος, αλλά και για να ελαχιστοποιηθεί η φθορά λόγω υπερβολικού καβουρδίσματος, καψαλίσματος ή καψίματος. Κατά τη διάρκεια του καβουρδίσματος, η θερμότητα μεταφέρεται με την επαφή των σπόρων πάνω στα τοιχώματα της συσκευής καβουρδίσματος, ή με ζεστό αέρα ή με εύφλεκτα αέρια. Φυγόκεντροι καβουρδιστές (περιστρεφόμενα επίπεδα ταψιά), περιστρεφόμενοι κυλινδρικοί καβουρδιστές, καβουρδιστές ρευστού στρώματος (90% μεταφορά 32

θερμότητας) και άλλα, χρησιμοποιούνται είτε συνεχόμενα, είτε διακεκομμένα. Σε μια καινούργια διαδικασία που ονομάζεται διαδικασία σύντομου καβουρδίσματος (short-time roasting process) απαιτείται χρόνος 2 5min και η φάση της προθέρμανσης μειώνεται σημαντικά από την καλύτερη μεταφορά θερμότητας. Η εξάτμιση του νερού προχωρά με την έκλυση ατμού, προκαλώντας έτσι μεγαλύτερη αύξηση στον όγκο του σπόρου από τις συμβατικές διαδικασίες καβουρδίσματος. Συνεπώς η πυκνότητα στη θεμελιώδη κατάσταση του καφέ που καβουρντίστηκε με αυτή τη διαδικασία είναι 15 25% χαμηλότερη. Η διαδικασία του καβουρδίσματος ελέγχεται ηλεκτρονικά ή με τη δοκιμή καβουρντισμένων σπόρων. Το τελικό προϊόν περνάει γρήγορα σε κόσκινα για να ψυχθεί ή ψεκάζεται με νερό με σκοπό να αποφευχθεί το υπερβολικό καβούρδισμα, ή το κάψιμο και η απώλεια αρώματος. Κατά τη διάρκεια του καβουρδίσματος, δημιουργούνται ατμοί και κυτταρικά υπολείμματα (κόκκοι σπερμοδέρματος), που απομακρύνονται είτε με αναρρόφηση με τη βοήθεια κενού είτε σε μεγαλύτερες μονάδες, με αποτέφρωση. Ο βαθμός του επιθυμητού καβουρδίσματος διαφέρει από χώρα σε χώρα. Στις Η.Π.Α. και στην Κεντρική Ευρώπη οι σπόροι καβουρδίζονται μέχρι ενός ελαφρού χρώματος (200 220 C, 3 10 min, με παρατηρούμενη απώλεια βάρους 14 17%) και στη Γαλλία, Ιταλία και χώρες των Βαλκανίων, σε ένα σκούρο χρώμα (230 C, με παρατηρούμενη απώλεια βάρους 20%) [27]. Εικόνα 2.5 Κόκκοι καφέ κατά τη διαδικασία του καβουρδίσματος. (Πηγή: http://www.strictlycoffee.co.za/) 33

Άλεση και συσκευασία Μετά το καβούρδισμα και την αποκαφεϊνοποίηση, εφόσον γίνει, οι κόκκοι του καφέ ψύχονται και αλέθονται σε αλεστικές μηχανές. Εφόσον ο καφές προορίζεται για μεγάλη χρονική διάρκεια συντήρησης είναι πολύ ευαίσθητος στο οξυγόνο. Για το λόγο αυτό, το υλικό συσκευασίας θα πρέπει να έχει χαμηλή διαπερατότητα σε οξυγόνο και το οξυγόνο μέσα στη συσκευασία θα πρέπει να διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα. Αυτός είναι και ο λόγος που χρησιμοποιούνται ευρύτατα θερμοσφραγιζόμενα σακουλάκια με εσωτερική επικάλυψη στρώματος αλουμινίου. Ο εμπορικά διαθέσιμος καφές αποτελείται από μίγμα 4-8 διαφορετικών ποικιλιών, οι οποίες λόγω των διαφορετικών φυσικών ιδιοτήτων τους, καβουρδίζονται ξεχωριστά [28]. 2.4 Ροφήματα καφέ Ο τύπος των σχετικών ροφημάτων καφέ και ο τρόπος κατανάλωσής τους είναι συνδεδεμένοι με τις κοινωνικές συνήθειες και τον πολιτισμό κάθε χώρας. Η ποικιλία των τεχνικών που έχουν αναπτυχθεί για την παρασκευή του ως ρόφημα είναι ευρύτατη. Το ρόφημα του καφέ παίρνει την ονομασία του ανάλογα με την τεχνική «ψησίματος» (brewing) και όχι από τον τόπο στον οποίο καλλιεργείται. Κριτήρια για την επιλογή μιας μεθόδου «ψησίματος» αποτελούν η γεύση, η οικονομία και οι πολιτιστικές συνήθειες [29]. Προτού «ψηθούν», οι κόκκοι του καφέ αλέθονται, μια διαδικασία η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί και σε οικιακό επίπεδο, αν και στην πλειονότητά τους οι προς πώληση συσκευασμένοι καφέδες είναι ήδη αλεσμένοι. Οι περισσότερες τεχνικές παρασκευής καφέ περιλαμβάνουν την ανάμειξη των αλεσμένων κόκκων καφέ με ζεστό νερό για ορισμένο χρόνο, προκειμένου να αναδυθεί το άρωμά του. Το υπερκείμενο υγρό μπορεί να καταναλωθεί, αφού φιλτραριστεί. Ακολουθεί η προσθήκη ζάχαρης, γάλακτος, μπαχαρικών και αλκοόλ κατά βούληση. Η τεχνική που θα χρησιμοποιηθεί εξαρτάται σε κάποιο βαθμό από τον βαθμό καβουρδίσματος των κόκκων του καφέ, καθώς το αποτέλεσμα μπορεί να διαφέρει στην οξύτητα, την καθαρότητα και τη γεύση του ροφήματος. Οι ελαφρώς καβουρδισμένοι κόκκοι καφέ χρησιμοποιούνται 34

συνήθως για την παρασκευή καφέ φίλτρου, ενώ κόκκοι με εντονότερο καβούρδισμα προτιμώνται για ροφήματα espresso [30]. Στην Ευρώπη τη μεγαλύτερη κατά κεφαλήν κατανάλωση καφέ έχουν οι σκανδιναβικές χώρες, όπου καταναλώνεται κυρίως ελαφρά καβουρδισμένος και υγρά επεξεργασμένος καφές Arabica. Παρουσία της ποικιλίας καφέ Robusta στο χαρμάνι και εντονότερος βαθμός καβουρδίσματος συναντάται περισσότερο στις νοτιοδυτικές χώρες. Μέτρια καβουρδισμένος στη Γερμανία, τις Κάτω Χώρες και την Αυστρία, πολύ σκούρος στη Γαλλία, την Ισπανία και την Πορτογαλία και ακόμη πιο σκούρος στην Ιταλία. Οι πιο διαδεδομένες τεχνικές παρασκευής περιλαμβάνουν μεθόδους αφέψησης (βραστός, Ελληνικός ή Τούρκικος), μεθόδους έγχυσης (Φίλτρου και Napoletana) και τις αυθεντικές Ιταλικές μεθόδους πίεσης (Moca και Espresso) [31]. 2.4.1 Espresso Ο καφές espresso είναι ένα συμπυκνωμένο ρόφημα που παράγεται μέσω της διοχέτευσης μικρής ποσότητας νερού, θερμοκρασίας περίπου 86-95 C, υπό πίεση σε υψηλής ποιότητας σκούρους, αλεσμένους σε σκόνη κόκκους καφέ, με τη βοήθεια μιας μηχανής espresso. Το νερό αρωματίζεται από τον καφέ, χωρίς να βράζει με αυτόν. Η υφή του espresso είναι πιο παχύρευστη σε σύγκριση με τους καφέδες που παρασκευάζονται με άλλες μεθόδους, χάρη στην υψηλότερη συγκέντρωση των διαλυμένων αιωρούμενων στερεών σωματιδίων και την crema (ο αφρός με κρεμώδη υφή που σχηματίζει ως αποτέλεσμα της πίεσης). Ως αποτέλεσμα της υψηλής πίεσης που ασκείται, οι γεύσεις και οι χημικές ενώσεις σε ένα τυπικό φλιτζάνι καφέ espresso είναι πολύ συμπυκνωμένες [32]. Ο espresso αποτελεί τη βάση για άλλα ροφήματα, όπως latte, cappuccino, macchiato, moca ή americano. Έχει περισσότερη ποσότητα καφεΐνης ανά μονάδα όγκου σε σχέση με τα περισσότερα ροφήματα, αλλά το συνηθισμένο μέγεθος μερίδας σερβιρίσματος είναι μικρότερο, περί τα 60 ml, το οποίο διαθέτει από70 έως 80 mg καφεΐνης. 35

Οι παράγοντες που καθορίζουν την ποιότητα του ροφήματος είναι η ποιότητα των κόκκων του καφέ που χρησιμοποιείται, η θερμοκρασία του νερού, η πίεση που ασκείται, ο χρόνος διήθησης και η θερμοκρασία σερβιρίσματος [33]. Εικόνα 2.6 Καφές espresso. (Πηγή: http://en.wikipedia.org/wiki/file:linea_doubleespresso) 2.4.2 Καφές φίλτρου Το φιλτράρισμα του καφέ είναι μια μέθοδος που περιλαμβάνει διοχέτευση του νερού σε καβουρδισμένους, αλεσμένους κόκκους καφέ που έχουν τοποθετηθεί σε ένα χάρτινο φίλτρο, δημιουργώντας έτσι το ρόφημα που ονομάζεται καφές φίλτρου. Συγκεκριμένα, το νερό διαρρέει μέσα από τον αλεσμένο καφέ, απορροφώντας έλαια και αποστάγματά του, και στη συνέχεια περνά μέσα από τον πυθμένα του φίλτρου και περισυλλέγεσαι σε γυάλινο δοχείο. Το κατακάθι από τον χρησιμοποιούμενο καφέ κατακρατείται στο φίλτρο. Το νερό πρέπει να έχει θερμοκρασία 93-96 C. Η συνήθης αναλογία νερού- καφέ είναι 450 ml νερού σε 28g αλεσμένου καφέ. Η διαδικασία μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους, ακόμη και χειροκίνητα, αν και χρησιμοποιούνται ευρέως οι ηλεκτρικές καφετιέρες. Τα χάρτινα φίλτρα είναι ως επί το πλείστον μιας χρήσης και απορρίπτονται μαζί με τον χρησιμοποιούμενο καφέ, χωρίς να αποκλείεται η χρήση μόνιμων φίλτρων κατασκευασμένων από λεπτά διάτρητα μεταλλικά φύλλα. Το φιλτράρισμα με διηθητικό χαρτί παράγει καθαρό και ελαφρύ σώμα καφέ. Ο παραγόμενος άνευ 36

ιζημάτων καφές παρουσιάζει έλλειψη σε ορισμένα έλαια και άλλες οργανικές ουσίες, λόγω του ότι αυτές έχουν κατακρατηθεί στο φίλτρο. Η ποσότητα της καφεΐνης που εμπεριέχει ένα φλιτζάνι καφέ φίλτρου- μέγεθος μερίδας σερβιρίσματος 125 ml- κυμαίνεται από 60 έως 100 mg, ανάλογα με την ποιότητα του χρησιμοποιούμενου καφέ [34]. Εικόνα 2.7 Καφές φίλτρου. (Πηγή: http://www.brian-coffee-spot.com/) 2.4.3 Στιγμιαίος καφές O στιγμιαίος καφές σε σκόνη, είναι το προϊόν του καφέ το οποίο με λίγο ζεστό νερό διαλύεται τέλεια απελευθερώνοντας όλο το άρωμα που περικλείει. Μέσω διαφόρων βιομηχανικών διαδικασιών ο καφές αφυδατώνεται σε μορφή σκόνης ή κόκκων. Η παρασκευή του στιγμιαίου καφέ γίνεται με δύο τρόπους, είτε με κτύπημα πρώτα ελάχιστου νερού με το μίγμα καφέ και ζάχαρης είτε με την ειδική συσκευή παραγωγής στιγμιαίου καφέ διά ατμού. Στη συνέχεια προσθέτουμε την επιθυμητή ποσότητα νερού. Το πλεονέκτημα του στιγμιαίου καφέ είναι η μεγάλη ταχύτητα παρασκευής του καθώς και η μεγάλη χρονικά διάρκεια ζωής του. Επίσης, ο μειωμένος όγκος και το μικρότερο βάρος του προϊόντος κατά τη μεταφορά σε σχέση με τον ακατέργαστο καφέ (ολόκληροι κόκκοι καφέ ή κομμένοι) διευκολύνει σημαντικά τη διάδοσή του. Ο στιγμιαίος καφές πωλείται σε σκόνη ή κόκκους αεροστεγώς συσκευασμένος σε γυάλινα βαζάκια, μεταλλικά κουτιά ή φακελάκια, με τις οδηγίες παρασκευής συνήθως τυπωμένες στη συσκευασία. Η σκόνη ή οι 37

κόκκοι προτιμήθηκαν από τους παραγωγούς και τους καταναλωτές για την ευκολία με την οποία διαλύονται στο ζεστό νερό και για το έλεγχο που επιτυγχάνεται στην ποσότητα που θα χρησιμοποιηθεί. Στις αρχές της δεκαετίας του 1980 ο στιγμιαίος καφές εμφανίστηκε και με ποικιλία διαφόρων γεύσεων (περίπου 100 σε όλο τον κόσμο) ανάλογα με τις προτιμήσεις των κατοίκων κάθε χώρας, οι οποίες δημιουργούνται με την ανάμειξη διαφόρων ποικιλιών καφέ και κατόπιν καβουρδίσματος σε διαφορετικούς χρόνους. Από το στιγμιαίο καφέ παρασκευάζεται, στον ελλαδικό κυρίως χώρο, ο δημοφιλέστατος φραπέ. Σε ορισμένες χώρες, όπως η Πορτογαλία, η Ισπανία, η Ινδία παρασκευάζουν το στιγμιαίο καφέ αντικαθιστώντας το νερό με ζεστό γάλα. Ένα φλιτζάνι ροφήματος στιγμιαίου καφέ, περί τα 150 ml, περιέχει από 50 έως 60 mg καφεΐνης [35]. Εικόνα 2.8 Κόκκοι στιγμιαίου καφέ. (Πηγή: http://www.bluetokaicoffee.com/) 2.4.4 Ελληνικός καφές Ο Ελληνικός καφές (γνωστός σε χώρες της δυτικής Ευρώπης ως «Τούρκικος Καφές») είναι είδος καφέ που παρασκευάζεται με ψήσιμο, σε μπρίκι, αλεσμένων σε λεπτή σκόνη καβουρδισμένων κόκκων καφέ και ο οποίος πίνεται περισσότερο από κάθε άλλο είδος καφέ σε πολλές περιοχές της ανατολικής Μεσογείου, της Μέσης Ανατολής, των Βαλκανίων και της Βόρειας Αφρικής. Βασικό εργαλείο της παρασκευής του ελληνικού καφέ είναι το λεγόμενο «μπρίκι», μέσα στο οποίο πρέπει να βράσει (σχεδόν) το μίγμα του νερού (75 ml) με τον καφέ και τη ζάχαρη, που αναδεύεται αρχικά. Επίσης χαρακτηριστικό είναι και το καϊμάκι, ένας πηχτός αφρός που δημιουργείται κατά το βρασμό του καφέ. Η παρασκευή του ελληνικού καφέ 38

θεωρείται επιτυχημένη, όταν το καϊμάκι διατηρείται κατά το σερβίρισμά του. Σερβίρεται σε μικρό φλιτζάνι [36]. Για τον ελληνικό καφέ προτιμάται έντονος βαθμός καβουρδίσματος, που συνηθίζεται κυρίως στην Τουρκία, ωστόσο και ένα μέτριο καβούρδισμα μπορεί να οδηγήσει σε δυνατό άρωμα και γεύση. Η κοκκομετρία του είναι μικρότερη από αυτή του espresso. Μετά το καβούρδισμα γίνεται μίξη ποικιλιών καφέ σε κατάλληλη αναλογία για να δημιουργηθεί το επιθυμητό χαρμάνι. Η καφεΐνη που εμπεριέχεται σε ένα ρόφημα των 50 ml κυμαίνεται μεταξύ 50 και 60 mg. Στην Ελλάδα διαδόθηκε κατά τη διάρκεια της Οθωμανικής περιόδου. Σύμφωνα με την παράδοση οι πρώτοι που παρασκεύασαν τέτοιου είδους καφέ ήταν οι Βεδουίνοι της Μέσης Ανατολής οι οποίοι έβαζαν την χύτρα του καφέ πάνω στην άμμο που κάλυπτε την στάχτη και τα κάρβουνα για να τα κρατήσει ζωντανά. Γι' αυτό υπάρχει και η παράδοση να ψήνεται ο καφές πάνω σε άμμο (στη χόβολη) στα παραδοσιακά καφενεία [37]. Εικόνα 2.9 Σερβίρισμα ελληνικού καφέ. (Πηγή: http://www.turkishcoffeeworld.org/) 39

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΟΡΓΑΝΙΚΗ ΥΛΗ ΣΕ ΡΟΦΗΜΑΤΑ ΚΑΦΕ 3.1 Χημική σύσταση καφέ Από τη χημική ανάλυση του καφέ έχουν προκύψει τουλάχιστον χίλιες ενώσεις µε ποικιλία δράσεων. Η χημική σύσταση των ακαβούρδιστων κόκκων καφέ διαφέρει από αυτή των καβουρδισμένων και εξαρτάται από την ποικιλία, την προέλευση και το κλίμα [38]. Πίνακας 3.1 Χημική σύσταση ακαβούρδιστων κόκκων καφέ (% επί ξηρού). ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΕΥΡΟΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ % Υδατοδιαλυτά συστατικά 29.0-36.2 Υγρασία 5.0-12.1 Πρωτεΐνες 8.7-12.2 Λιπίδια 8.3-17.0 Πηγή: (Belitz & Grosch, 1999) Οι κύριες κατηγορίες χημικών συστατικών που ανιχνεύονται στον πράσινο (ακαβούρδιστο) καφέ είναι τα αλκαλοειδή όπως η τριγονελλίνη, τα χλωρογενικά οξέα, διάφοροι υδατάνθρακες, σάκχαρα όπως η σακχαρόζη, λιπίδια και πρωτεΐνες. Όπως όμως αναφέρθηκε, η σύσταση των κόκκων αλλάζει ριζικά κατά τη διάρκεια του καβουρδίσματος, καθώς δημιουργούνται διάφορες ουσίες που είναι υπεύθυνες για το άρωμα του καφέ. Το καβούρδισµα οδηγεί σε απώλεια βάρους του ξηρού υλικού. Αυτή οφείλεται κυρίως στη διαφυγή αερίου διοξειδίου του άνθρακα, νερού και πτητικών προϊόντων κατά τη διαδικασία της πυρόλυσης. Μέρος των πολυσακχαριτών, 40

των σακχάρων, των αµινοξέων και των λιπαρών οξέων είναι πιθανό να αποικοδομηθούν. Το καβούρδισµα επίσης προωθεί τις αντιδράσεις καραµελοποίησης και την παραγωγή προϊόντων συμπύκνωσης [39]. Τα συστατικά που απαντώνται στα ροφήματα καφέ περιλαμβάνουν υδατάνθρακες, συμπεριλαμβανομένων των πολυσακχαριτών, δισακχαρίτες (σακχαρόζη) και μονοσακχαρίτες (γλυκόζη, γαλακτόζη, αραβινόζη, φρουκτόζη, μανόζη, μαννιτόλη, ξυλόζη και ριβόζη), μελανοεϊδή ως προϊόντα αντιδράσεων Maillard, λιπίδια όπως τριγλυκερίδια, στερόλες (στιγμαστερόλη, σιτοστερόλη), λιπαρά οξέα (λινολεΐκό, λινολενικό, ελαΐκό, παλμιτικό, στεατικό, λιγνοκερικό και βηχενικό), πεντακυκλικά διτερπένια (μεθυλοκαφεστόλη, καφεστόλη, καχεόλη), διτερπενικές αλκόολες, διτερπενικούς και τριτερπενικούς εστέρες και κεραμίδιο. Τοκοφερόλες (α, β, γ) είναι επίσης παρούσες μαζί με τοκοτριενόλες. Η σύνθεση του καφέ περιλαμβάνει επίσης ελεύθερα αμινοξέα, κυρίως ασπαραγίνη, γλουταμικό οξύ, αλανίνη, ασπαρτικό οξύ και λυσίνη καθώς και αρκετά είδη ξανθινών όπως καφεΐνη, θεοβρωμίνη και θεοφυλλίνη. Ακόμη, πτητικά αλειφατικά οξέα και μη πτητικά οξέα, τριγονελλίνη και νικοτινικό οξύ. Κόκκοι καφέ περιέχουν επίσης ποικιλία από διαφορετικά ιχνοστοιχεία, όπως κάλιο, μαγνήσιο, ασβέστιο, φωσφόρο, θείο, μόλυβδο, χρώμιο, ψευδάργυρο, χαλκό, νικέλιο και σίδηρο [40]. Σημαντικότατη κατηγορία ενώσεων με υψηλές συγκεντρώσεις στα ροφήματα καφέ είναι αυτή των φαινολικών ενώσεων, όπως χλωρογενικά οξέα, καφεϊκό οξύ, φερουλικό και p-κουμαρικό οξύ, καφεοϋλοκινικό και δικαφεοϋλοκινικό συζευγμένα με τυροσίνη, τρυπτοφάνη ή φαινυλαλανίνη. Παρούσες είναι και οι προανθοκυανιδίνες, ενώ οι κατεχίνες είναι απούσες [41]. Τα πτητικά συστατικά του καφέ συμβάλλουν στο άρωμα ενώ τα µη πτητικά συστατικά (όπως η καφεΐνη, οι πολυσακχαρίτες και τα χλωρογενικά οξέα) συμβάλλουν στη γεύση του καφέ καθώς είναι υπεύθυνα για τη στιφάδα και την πικρότητά του [42]. 41

3.2 Καφεΐνη H καφεΐνη είναι ένα λευκό, πικρό, κρυσταλλοειδές αλκαλοειδές της ξανθίνης µε διεγερτική δράση. Όπως τα περισσότερα αλκαλοειδή, έτσι και η καφεΐνη έχει ως βασικό σκελετό έναν πουρινικό δακτύλιο. Εντοπίζεται στα φύλλα και τους σπόρους πολλών φυτών, όπου και δρα ως φυσικό φυτοφάρμακο κατά των εντόμων. Η περιεκτικότητα της καφεΐνης στους ακαβούρδιστους κόκκους καφέ της ποικιλίας Arabica είναι 0.8-2.5% ενώ στην ποικιλία Robusta το ποσοστό μπορεί να φτάσει μέχρι και 4%. Κατά τη διαδικασία του καβουρδίσματος το ποσοστό αυτό μειώνεται ελάχιστα. Έτσι το ποσοστό καφεΐνης στην ποικιλία Arabica μειώνεται στο 1.2% και στην ποικιλία Robusta στο 2% [43]. Η συγκέντρωση της καφεΐνης σε ένα ρόφημα καφέ εξαρτάται τόσο από τη μέθοδο παρασκευής όσο και από τον τύπο του καφέ. Μερικοί από τους παράγοντες που επιδρούν στη συγκέντρωσή της είναι ο χρόνος παρασκευής, η θερμοκρασία, το άλεσμα και ο τύπος του καφέ. Παρόλα αυτά, η συγκέντρωση της καφεΐνης μπορεί να διαφοροποιείται ακόμη και στο ίδιο το φυτό. Γενικά, ένα φλιτζάνι καφέ espresso περιέχει γύρω στα 80mg καφεΐνης ενώ ένα φλιτζάνι καφέ φίλτρου 60 125 mg. Αν και το µόριο της καφεΐνης παραμένει σταθερό ακόμα και σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες, έχει παρατηρηθεί ότι ο σκούρος καφές περιέχει χαμηλότερα ποσοστά καφεΐνης, καθώς κατά τη διάρκεια του «ψησίματος» ένα μικρό ποσοστό καφεΐνης χάνεται. Η καφεΐνη προσδίδει µία πικρή γεύση στον καβουρδισµένο καφέ, ωστόσο συμβάλλει στην πικρότητα και τη στιφάδα του τελικού προϊόντος σε ποσοστό μόλις 10% [44]. Εικόνα 3.1 Το μόριο της καφεΐνης. (Πηγή: http://www.triradar.com/) 42

Στον άνθρωπο η καφεΐνη διεγείρει το κεντρικό νευρικό σύστημα, ενώ αποτρέπει προσωρινά την υπνηλία και επιφέρει εγρήγορση. Στον οργανισμό δρα ανταγωνιστικά στους υποδοχείς της αδενοσίνης µε συνέπεια να αυξάνει τη σωματική διέγερση, να διεγείρει το κεντρικό νευρικό σύστημα και τον καρδιακό µυ, να αυξάνει τις γαστρικές εκκρίσεις και τη διούρηση [45]. 3.3 Πρωτεΐνες Οι πρωτεΐνες στον κόκκο του καφέ ανευρίσκονται τόσο ελεύθερες όσο και δεσμευμένες στον πυρήνα του κόκκου, ενώ η συγκέντρωσή τους ποικίλει από 10 13%. Το γλουταµινικό οξύ αποτελεί το 19 % του συνόλου των πρωτεϊνών και το ασπαρτικό οξύ το 10 %. Το ποσοστό των περιεχόμενων πρωτεϊνών είναι υψηλότερο στους ώριμους κόκκους του καφέ σε σχέση µε τους πιο άγουρους. Κατά το καβούρδισµα οι πρωτεΐνες υδρολύονται προς σχηματισμό ελεύθερων αμινοξέων. Η συγκέντρωση του γλουταµινικού οξέος και του ασπαρτικού παραμένει σταθερή, ενώ η περιεχόμενη κυστεΐνη και αργινίνη καταστρέφονται εντελώς κατά το καβούρδισµα. Ακατάλληλες συνθήκες αποθήκευσης δύνανται να αυξήσουν τα επίπεδα των πρωτεϊνών και να υποβαθμίσουν σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα του καφέ. Κατά τη διάρκεια του «ψησίματος» του καφέ, οι πρωτεΐνες ενώνονται µε τα σάκχαρα, μέσω αντιδράσεων Maillard [46]. 3.4 Υδατάνθρακες Η κατηγορία αυτή είναι πολύ σημαντική για τη διαμόρφωση των αρωματικών συστατικών του καφέ µέσω της καραµελοποίησης των μικρού µοριακού βάρους σακχάρων και µέσω της αντίδρασης Maillard. Από τις αντιδράσεις Maillard σχηματίζονται τόσο µελανοϊδίνες, που ευθύνονται για το χρώμα του καφέ, όσο και αρωματικές ενώσεις όπως πυριδίνες που είναι υπεύθυνες για το χαρακτηριστικό άρωµα του καφέ. Οι µελανοϊδίνες που ανιχνεύονται στον καφέ, περιέχουν φαινολικά τµήµατα και για αυτό το λόγο συμβάλλουν στις αντιοξειδωτικές ιδιότητες του ροφήματος. Τέλος, η πικρή γεύση του καφέ οφείλεται κατά κύριο λόγο στα προϊόντα της αντίδρασης Maillard [47]. 43

Εικόνα 3.2 Προϊόν αντίδρασης Maillard. (Πηγή: http://pubs.rsc.org/) 3.5 Φαινολικές ενώσεις Οι φαινολικές ενώσεις ανήκουν στα φυσικά αντιοξειδωτικά του καφέ και αποτελούν μια πολύ μεγάλη τάξη ενώσεων. Η δομή των φαινολικών ενώσεων ποικίλει και έτσι μπορούμε να συναντήσουμε απλές φαινολικές ενώσεις όπως φαινολικά οξέα με έναν ανθρακικό σκελετό 6 ατόμων άνθρακα, μέχρι σύνθετες φαινολικές ενώσεις αποτελούμενες από πολυμερισμένα μόρια όπως οι ταννίνες. Οι φαινολικές ενώσεις είναι παράγωγα του βενζολίου με ένα ή περισσότερα υδροξύλια στο φαινολικό δακτύλιο και ανάλογα με τη δομή του ανθρακικού σκελετού κατατάσσονται στα φαινολικά οξέα, στα φλαβονοειδή, στα στιλβένια και τις λιγνάσες [48]. Οι πολυφαινόλες είναι δευτερογενείς μεταβολίτες των φυτών, που χρησιμοποιούνται στο αμυντικό τους σύστημα ενάντια στους δύσκολους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Η κύρια χημική διαδικασία στην οποία εμπλέκονται οι πολυφαινόλες είναι η σάρωση των δραστικών μορφών οξυγόνου, ενώ οι φαινολικές ενώσεις των φυτών μπορούν επίσης να δράσουν σαν φυσικά αντιοξειδωτικά προκαλώντας χηλίωση σε μεταλλικά ιόντα. Αναφέρονται επίσης ως κύρια συστατικά των εκκριμάτων ρίζας ως απόκριση στην ανεπάρκεια σιδήρου. Οι πιο άφθονες πολυφαινόλες στον καφέ είναι τα χλωρογενικά οξέα, το καφεϊκό, το φερουλικό, το p- κουμαρικό και οι προανθοκυανιδίνες [49]. 3.5.1 Φλαβονοεϊδή Τα φλαβονοειδή αποτελούν τη μεγαλύτερη τάξη των φαινολικών ενώσεων. Η τάξη των φλαβονοειδών αποτελείται από τις παρακάτω οικογένειες: 44

φλαβόνες, ισοφλαβόνες, φλαβονόλες, φλαβανόλες, φλαβανόνες, ανθοκυανίνες και προανθοκυανιδίνες. Όλες οι οικογένειες των φλαβονοειδών προέρχονται από μια κοινή βιοσυνθετική πορεία. Επιπλέον μετατροπές γίνονται σε διάφορα στάδια με αποτέλεσμα μεταβολές στην έκταση της υδροξυλίωσης, της μεθυλίωσης, το διμερισμό και τη γλυκοζυλίωση [50]. Στις φλαβονόλες ανήκει και η κερκετίνη που είναι η κυριότερη φλαβονόλη στη διατροφή μας και βρίσκεται και στον καφέ, όπως και η μυρικετίνη. Τα φλαβονοειδή μπορεί να είναι μονομερή, διμερή ή ολιγομερή. Οι πολυμερείς ενώσεις ονομάζονται ταννίνες και ανάλογα με τη δομή τους διαχωρίζονται σε συμπυκνωμένες και υδρολυόμενες ταννίνες. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες είναι πολυμερή των φλαβανοειδών, ενώ οι υδρολυόμενες περιέχουν συνήθως γαλλικό οξύ εστεροποιημένο με υδατάνθρακα [51]. 3.5.2 Χλωρογενικά οξέα Τα χλωρογενικά οξέα αποτελούν τις κύριες φαινολικές ουσίες που υπάρχουν στον κόκκο του καφέ και περιλαμβάνουν διάφορες ομάδες ενώσεων. Τα χλωρογενικά οξέα είναι εστέρες του κινικού οξέος µε διάφορα υδροξυκιναμωµικά οξέα, όπως καφεϊκό, φερουλικό και p-κουµαρικό οξύ. Στον καφέ εµφανίζονται ως µονο- και δι-εστέρες. Τα χλωρογενικά οξέα υδρολύονται σε ένα µόριο καφεϊκού και ένα µόριο κινικού οξέος. Η ολική σύσταση σε χλωρογενικά οξέα μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το είδος, την καλλιέργεια, το βαθμό ωρίμανσης, τις συνθήκες ανάπτυξης του φυτού του καφέ καθώς και το κλίμα. Γενικά, οι τιμές των ολικών χλωρογενικών οξέων στους κόκκους καφέ που αναφέρονται στην βιβλιογραφία κυμαίνονται από 41-79 mg/g κόκκων στον Coffea arabica, και από 61-113 mg/g κόκκων στον Coffea canephora [52]. Εικόνα 3.3 Χλωρογενικό οξύ. 45

Εικόνα 3.4 Καφεϊκό οξύ. Εικόνα 3.5 κουμαρικό οξύ. (Πηγή: http://www.sigmaaldrich.com/) Το χλωρογενικό οξύ και τα παράγωγά του, καφεϊκό οξύ, φερουλικό και p- κουμαρικό οξύ αναγνωρίζονται για τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες και πιθανότατα συμβάλλουν στην προστασία έναντι των καρδιαγγειακών νοσημάτων. Επιπρόσθετα, έχει βρεθεί ότι, το χλωρογενικό οξύ μπορεί να ρυθμίσει τη γλυκαιμία καθυστερώντας µεν την απορρόφηση της γλυκόζης από το ήπαρ, αυξάνοντας δε την έκκριση του ανορεξιογόνου πεπτιδίου GLP 1, που αυξάνει την ευαισθησία των β παγκρεατικών κυττάρων στη γλυκόζη [53]. 3.6 Λιπίδια Τα λιπίδια στον πράσινο καφέ καταλαμβάνουν ποσοστό περίπου 15% στην ποικιλία Arabica και 10% στην ποικιλία Robusta. Το έλαιο του καφέ απαρτίζεται κυρίως από τριγλυκερίδια σε ποσοστό 75.2%, διτερπένια σε ποσοστό 18.5% και στερόλες σε ποσοστό 2.2%. Κατά το καβούρδισµα το ποσοστό των τριγλυκεριδίων και των στερολών δε μεταβάλλεται, ενώ τα επίπεδα των trans λιπαρών οξέων μειώνονται. Η ποσότητα του λινελαϊκού οξέος μειώνεται µε την αύξηση της θερμοκρασίας καβουρδίσµατος και το 20% των τοκοφερολών καταστρέφεται [54]. Τα περισσότερα από τα λιπίδια βρίσκονται στο ενδοσπέρμιο των πράσινων κόκκων καφέ ενώ μόνο μια μικρή ποσότητα, οι κηροί του καφέ, βρίσκεται στην εξωτερική στοιβάδα του καρπού. Το λίπος του καφέ αποτελείται κυρίως από τριακυλογλυκερόλες με λιπαρά οξέα σε αναλογίες παρόμοιες με εκείνες που βρίσκονται στα κοινά βρώσιμα φυτικά έλαια. Το ασαπωνοποίητο κλάσμα είναι πλούσιο σε διτερπένια που ανήκουν στα καουράνια, κυρίως καφεστόλη, καβεόλη και 16-ο- μεθυλοκαφεστόλη, η οποία χρησιμεύει ως αξιόπιστος δείκτης για την παρουσία καφέ Robusta σε μείγματα καφέ [55]. 46

3.6.1 Τριγλυκερίδια Στο έλαιο του καφέ το 75% των λιπών είναι τριγλυκερίδια. Τα κυριότερα είναι: οι εστέρες λινελαϊκού οξέος (30-46% των οξέων), του παλµιτικού (25-35%), του ελαϊκού (8.8-17.2%) και του στεατικού (6.4-10.9%). Το ποσοστό των ελεύθερων λιπαρών οξέων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό του αρώματος του καφέ κατά το καβούρδισµα. Λόγω της θερμικής οξείδωσής τους διασπώνται σε μικρότερα µόρια, όπως για παράδειγμα αλδεΰδες και συμβάλλουν στο σχηματισμό ετεροκυκλικών πτητικών συστατικών [56]. 3.6.2 Τερπένια Τα διτερπένια αποτελούν το 20% των λιπιδίων του καφέ. Η καφεστόλη είναι το σημαντικότερο από αυτά στον καφέ Robusta και η καχεόλη στον καφέ Arabica. Στο έλαιο του καφέ τα διτερπένια εµφανίζονται ως εστέρες των κορεσµένων λιπαρών οξέων, αντιπροσωπεύοντας το 18% των λιπιδίων [57]. Εικόνα 3.6 Το μόριο της καφεστόλης. (Πηγή: http://www.sigmaaldrich.com/) 3.6.3 Στερόλες Οι στερόλες υπάρχουν στον καφέ είτε σε ελεύθερη μορφή (40% των στερολών) είτε σε εστεροποιηµένη μορφή (60%) και αποτελούν το 2.2% των συνολικών λιπιδίων. Οι πιο σημαντικές είναι η σιτοστερόλη (45.4-51.6% των συνολικών στερολών), η στιγµαστερόλη (21.9-23.1%) και η καµπεστερόλη (15.8-16.9%) [58]. 47

Εικόνα 3.7 Σιτοστερόλη. Εικόνα 3.8 Καμπεστερόλη. Εικόνα 3.9 Στιγμαστερόλη. (Πηγή: http://www.sigmaaldrich.com/) 48

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΚΑΦΕ ΣΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΥΓΕΙΑ Η σύγχρονη έρευνα έχει αποδείξει ότι η κατανάλωση καφέ συνδέεται άμεσα µε την ανθρώπινη συμπεριφορά, τη λειτουργία του εγκεφάλου, καθώς επίσης και τη μεταβολική δραστηριότητα. Η καφεΐνη, παρουσιάζει ευεργετικές επιδράσεις στη συμπεριφορά, όταν η κατανάλωση καφέ γίνεται µε μέτρο. Έχει αποδειχθεί πως αυξάνει την εγρήγορση και βοηθά στη μείωση της κόπωσης, βελτιώνοντας έτσι την απόδοση σε καθήκοντα που απαιτούν επαγρύπνηση, σε έργα που απαιτούν παρατεταμένη απόκριση και στη διάθεση [59]. Επιπλέον ο καφές, όπως προκύπτει από ερευνητικά αποτελέσματα, συνδέεται ως ένα βαθμό µε την πρόληψη διάφορων μορφών καρκίνου και εκφυλιστικών ασθενειών, όπως η νόσος Parkinson και η νόσος Alzheimer. Συμβάλει επίσης στην προστασία του πεπτικού συστήματος, στην καταπολέμηση φλεγμονών και μειώνει τον κίνδυνο ηπατικής κύρωσης [60]. Η κατανάλωση καφέ φαίνεται να επιδρά στο μεταβολισμό της ζάχαρης, μειώνοντας τον κίνδυνο εμφάνισης διαβήτη. Επίσης συντελεί στη μείωση των πιθανοτήτων εμφάνισης πέτρας στα νεφρά και στη χολή [61]. Εν αντιθέσει, η αυξημένη κατανάλωση καφέ μπορεί να επιφέρει αρνητικές συνέπειες στην υγεία του ανθρώπου, συμβάλλοντας στην εμφάνιση ασθενειών όπως υπερλιπιδαιµίες, ρευματοειδή αρθρίτιδα, νεοπλασίες κ.α. [62]. 4.1 Κατανάλωση καφέ και παθολογικές καταστάσεις 4.1.1 Καρδιαγγειακά νοσήματα Το κυριότερο σημείο αντιπαράθεσης των ερευνητών είναι η συσχέτιση καφέ και στεφανιαίας νόσου (Coronary Heart Disease, CHD). Αν και η τάση επιβάλλει θετική συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης κατανάλωσης καφέ και του κινδύνου ανάπτυξης CHD, ενώ γίνεται λόγος για αρρυθμίες και έντονη αγγειοδιαστολή των στεφανιαίων αρτηριών, η πλειονότητα των μελετών και ειδικότερα των προοπτικών κάνουν λόγο για την προστατευτική δράση του 49

καφέ έναντι του κινδύνου νοσηρότητας και θνησιμότητας από CHD [63]. Στο διάστημα 1984 έως 1993 διεξήχθη στη Σκωτία µια µη παρεμβατική προοπτική μελέτη, η Scottish Heart Health Study Lifestyle, µε αντικείμενο την κατανάλωση τσαγιού και καφέ ως προδιαθεσικών παραγόντων για στεφανιαία νόσο. Συγκεκριμένα, η κατανάλωση καφέ φάνηκε να έχει µια ήπια ευεργετική επίδραση στη νοσηρότητα και θνησιμότητα της νόσου, η οποία και αυξανόταν σταδιακά, ανάλογα με την αυξανόμενη δόση του καφέ. Σε αντίθεση, η αυξημένη κατανάλωση τσαγιού έδειξε το αντίθετο [64]. Στο ίδιο μήκος κύματος κυμαίνονται κι άλλες μελέτες, που είτε δεν εντοπίζουν θετική συσχέτιση μεταξύ κατανάλωσης καφέ και CHD, είτε καταλήγουν στο ίδιο συμπέρασμα ότι ο καφές μειώνει τον κίνδυνο θνησιμότητας από στεφανιαία νόσο και καρδιαγγειακά νοσήματα ακόμα και σε µη ινσουλινοεξαρτώµενους διαβητικούς [65]. Τα σημαντικότερα, ωστόσο, δεδομένα προκύπτουν από µια άλλη μελέτη, στα αποτελέσματα της οποίας φάνηκε ότι η κατανάλωση καφέ δεν αυξάνει το μακροπρόθεσμο κίνδυνο για CHD ενώ η μέτρια κατανάλωση 3 4 φλιτζάνια καφέ ανά 24 ώρες οδηγεί σε μείωση του κινδύνου εμφάνισης CHD για τις γυναίκες [66]. Παράλληλα, έχει διερευνηθεί ο προσδιορισμός του καφέ ως παράγοντα κινδύνου για ορισμένους δείκτες, όπως η ολική χοληστερόλη, η αρτηριακή πίεση κα., που επάγουν καρδιαγγειακά νοσήματα. Αναφορικά µε την επίδραση της κατανάλωσης καφέ σε βιοχημικούς δείκτες όπως η ολική χοληστερίνη, η LDL(Low Density Lipoprotein) και HDL(High Density Lipoprotein) λιποπρωτεΐνη, τα αποτελέσματα των διαφόρων μελετών εστιάζουν στη μέθοδο παρασκευής και τις ανθυγιεινές συνήθειες, που ακολουθούν την υψηλή κατανάλωση καφέ, όπως το κάπνισμα και η καθιστική ζωή. Εν γένει, οι μεγαλύτερες συσχετίσεις μεταξύ καφέ και χοληστερόλης έχουν εντοπισθεί σε χώρες όπου καταναλώνεται άφιλτρος καφές. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις οι εθελοντές αναφέρουν και υψηλότερη πρόσληψη διαιτητικού κορεσμένου λίπους, που σχετίζεται άρρηκτα µε την ανύψωση της χοληστερόλης. Επίσης, μεγάλο ρόλο έχει η ποσότητα καφέ που καταναλώνεται. Έχει βρεθεί ότι η κατανάλωση 5 φλιτζανιών καφέ και άνω δύναται να αυξήσει την ολική χοληστερόλη και την LDL λιποπρωτεΐνη [67]. Η υπόθεση για την επίδραση του άφιλτρου καφέ στο λιπιδαιµικό προφίλ αφορά 50

στο γεγονός ότι τα περισσότερα λιποειδή (κυρίως η καφεστόλη) καταλήγουν στο τελικό ρόφημα αφού δεν υπάρχει κατάλληλο φίλτρο για να τα συγκρατήσει. Η αναλογία της χοληστερόλης στη μορφή των λιποπρωτεϊνών HDL, η οποία ονομάζεται πολλές φορές «καλή χοληστερόλη», προς εκείνη των LDL μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί η ευπάθεια στην ανάπτυξη της καρδιακής νόσου. Για ένα υγιές άτομο, η αναλογία LDL/HDL είναι 3.5 [68]. Η αλληλεπίδραση καφέ και αρτηριακής πίεσης οφείλεται κυρίως στην καφεΐνη αλλά και σε άλλα συστατικά όπως οι πολυφαινολικές ενώσεις και το κάλιο. Μελέτες έχουν δείξει ότι κατανάλωση καφέ πάνω από 4 φλιτζάνια ανά 24 ώρες δύναται να προστατεύσει από υπέρταση κυρίως γυναίκες. Από την άλλη, κλινικές δοκιμές μικρής διάρκειας έχουν δείξει ότι η κατανάλωση περισσότερων από 5 φλιτζάνια καφέ ημερησίως αυξάνει την αρτηριακή πίεση σε σύγκριση µε περιπτώσεις ατόμων που δεν καταναλώνουν καθόλου καφέ. Συμπερασματικά, τα περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι η τακτική, μέτρια κατανάλωση καφέ δεν αυξάνει τον κίνδυνο υπέρτασης [69]. 4.1.2 Σακχαρώδης διαβήτης τύπου ΙΙ Η σχέση καφέ και σακχαρώδους διαβήτη τύπου ΙΙ έχει μελετηθεί διεξοδικά στην προσπάθεια διερεύνησης του συσχετισμού της κατανάλωσης καφέ µε τον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου. Ιδιαίτερης προσοχής χρίζει το γεγονός ότι η ευεργετική επίδραση του καφέ δεν οφείλεται στην καφεΐνη, η οποία εξάλλου μειώνει την ινσουλινοευαισθησία, αφού ανάλογες μελέτες για ντεκαφεϊνέ ροφήματα και τσάι είχαν παρόμοια αποτελέσματα. Μολονότι η καφεΐνη επιβαρύνει την ανοχή της γλυκόζης και την ινσουλινοευαισθήσια, καθώς διεγείρει την έκκριση κορτιζόλης και επινεφρίνης στο πλάσμα, είναι λιγοστές οι επιδημιολογικές μελέτες που συσχετίζουν θετικά την κατανάλωση καφέ µε ινσουλινοαντίσταση [70]. Μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε χώρες όπως η Σουηδία, η Φιλανδία, η Ολλανδία, οι Η.Π.Α. και αλλού, έδειξαν ότι η δοσοεξαρτώµενη κατανάλωση καφέ μειώνει τον κίνδυνο εμφάνισης σακχαρώδους διαβήτη ΙΙ. Συγκεκριμένα, ανέφεραν ότι κάθε επιπλέον φλιτζάνι καφέ ανά ημέρα μείωνε το σχετικό κίνδυνο του σακχαρώδους διαβήτη κατά 7% και τα άτομα που κατανάλωναν 3 4 φλιτζάνια καφέ την ημέρα είχαν 25% 51

μικρότερο κίνδυνο από αυτούς που κατανάλωναν κάτω από 2 φλιτζάνια καφέ την ημέρα [71]. 4.1.3 Καρκίνος Η σχέση του καφέ µε διάφορες μορφές καρκίνου έχει μελετηθεί εκτενώς. Μεταξύ άλλων, έχει ερευνηθεί η αλληλεπίδραση καφέ και καρκίνου του ήπατος ευρήματα έχουν δείξει ότι 2 φλιτζάνια καφέ την ημέρα μπορούν να προστατεύσουν από ηπατικές βλάβες και να μειώσουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του ήπατος [72]. Έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί επίσης, για τυχόν θετική συσχέτιση καφέ και καρκίνου του στομάχου, χωρίς όμως αυτό να αποδεικνύεται. Μια ακόμη μελέτη αναφορικά µε τη σχέση καφέ και καρκίνου του ήπατος ήταν επίσης ενθαρρυντική. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η υψηλή κατανάλωση καφέ μειώνει τον κίνδυνο εμφάνισης ηπατικού καρκίνου σε σύγκριση µε περιπτώσεις ατόμων που έκαναν μέτρια προς χαμηλή κατανάλωση καφέ, καθώς επίσης και ότι η κατανάλωση 1 φλιτζανιού καφέ επιπλέον την ημέρα μειώνει το σχετικό κίνδυνο κατά 4% [73]. Από παρόμοιες αναλύσεις έχει προκύψει ότι η κατανάλωση καφέ δεν επιδρά στην εμφάνιση καρκίνων του παχέος εντέρου και των ωοθηκών, χωρίς ωστόσο να έχει προστατευτική δράση [74]. 4.1.4 Νόσος Parkinson Επιδημιολογικές μελέτες έχουν συσχετίσει αρνητικά την κατανάλωση καφέ µε την εμφάνιση της νόσου Parkinson, ενώ έχει προκύψει και επιβεβαίωση της προστατευτικής δράσης του καφέ έναντι της συγκεκριμένης ασθένειας. Συγκεκριμένα, έχει προκύψει ότι τα άτομα που δεν κατανάλωναν καφέ είχαν 3 4 φορές μεγαλύτερη πιθανότητα να εμφανίσουν τη νόσο στα επόμενα 25 30 έτη της ζωής τους σε σύγκριση µε τα άτομα που κατανάλωναν 4 φλιτζάνια καφέ/ 24 h, ενώ ακόμη και τα άτομα που κατανάλωναν έστω 1 φλιτζάνι καφέ την ημέρα είχαν 50% μικρότερο κίνδυνο να εμφανίσουν τη νόσο σε σχέση µε αυτούς που δεν κατανάλωναν καφέ στην επόμενη δεκαετία της ζωής τους. Ο εν δυνάμει προστατευτικός μηχανισμός φαίνεται ότι σχετίζεται µε την καφεΐνη [75]. Η νόσος του Parkinson χαρακτηρίζεται από αναστολή της αναγέννησης των ντοπαµινεργικών νευρώνων στην περιοχή του μεσεγκεφάλου. Μελέτες σε 52

πειραματόζωα έχουν δείξει ότι η καφεΐνη προστατεύει τους νευρώνες αυτούς από την τοξικότητα. Ειδικότερα, η καφεΐνη δρα ως ανταγωνιστής των Α 1 και Α 2Α υπότυπων του υποδοχέα της αδενοσίνης. Η έκφραση των Α 2Α υποδοχέων αναστέλλεται στο ραβδωτό σώμα του εγκεφάλου, ενώ στη νόσο του Parkinson οι υποδοχείς αυτοί αναστέλλουν την αναγέννηση των ντοπαµινεργικών υποδοχέων [76]. 4.1.5 Λοιπές παθολογικές καταστάσεις Η αλληλεπίδραση κατανάλωσης καφέ και μείωσης της ψυχοπνευµατικής υγείας (όπως σε περιπτώσεις γεροντικής άνοιας και κατάθλιψης) σε μεσήλικες και ηλικιωμένους έχει μελετηθεί ποικιλοτρόπως. Έχει ερευνηθεί τόσο η ενδεχόμενη επιβαρυντική επίδραση όσο και η ενδεχόμενη προστατευτική δράση του καφέ. Από τα αποτελέσματα της πλειονότητας των μελετών, που έχουν εξετάσει τον καφέ ως προδιαθεσικό παράγοντα για την εμφάνιση της γεροντικής άνοιας, δεν έχει προκύψει θετική συσχέτιση [77]. Εν αντιθέσει, υπάρχουν ενδείξεις ότι η αυξημένη κατανάλωση καφέ κατά την ενήλικη ζωή μπορεί είτε να βελτιώσει τη γνωστική ικανότητα των γυναικών ηλικίας 80 ετών και άνω είτε να μειώσει το σχετικό κίνδυνο εμφάνισης γεροντικής άνοιας κατά 65 70% και το σχετικό κίνδυνο εμφάνισης της νόσου Alzheimer κατά 62 64%, ειδικά σε ηλικιωμένα άτομα που κατανάλωναν 3 5 φλιτζάνια καφέ κατά τη μεσήλικη ζωή τους. Οι πιθανοί μηχανισμοί σχετίζονται τόσο µε τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες του καφέ όσο και µε το μηχανισμό που προστατεύει από σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ, αφού έχει ότι ο διαβήτης αυξάνει τον κίνδυνο γεροντικής άνοιας [78]. Η κύρια αντιοξειδωτική δράση του καφέ οφείλεται στις πολυφαινολικές του ενώσεις, κυρίως στο χλωρογενικό οξύ. Σε μελέτη που πραγματοποιήθηκε στο φινλαδικό πληθυσμό αναφορικά με την προστατευτική δράση του καφέ ως προς την εμφάνιση κατάθλιψης, βρέθηκε ότι κατανάλωση καφέ περί τα 825 ml/ 24 h δύναται να μειώσει το σχετικό κίνδυνο κατά 28% σε σύγκριση µε τη μη κατανάλωση καφέ [79]. Επιπλέον, οι μεγαλύτερες ποσότητες καφέ συνοδεύονταν και από άστατη διατροφή και εν γένει ανθυγιεινό τρόπο ζωής. Μολονότι ο μηχανισμός δράσης παραμένει άγνωστος και χρίζει περαιτέρω έρευνας, πιθανολογείται ότι το χλωρογενικό οξύ και οι αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές του διαδραματίζουν κάποιο ρόλο, 53

καθώς είναι γνωστό ότι η καταθλιπτική διαταραχή χαρακτηρίζεται και από μικρού βαθμού φλεγμονώδεις διαδικασίες [80]. 4.2 Αντιοξειδωτική δράση ροφημάτων καφέ 4.2.1 Ελεύθερες ρίζες- Οξειδωτικό στρες Ως οξειδωτικό στρες χαρακτηρίζεται η ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και δραστικών μεταβολιτών, που ονομάζονται οξειδωτικοί παράγοντες ή δραστικές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) και της αδρανοποίησης/απομάκρυνσής τους από προστατευτικούς μηχανισμούς, που ονομάζονται αντιοξειδωτικοί. Η ανισορροπία αυτή οδηγεί στην καταστροφή σημαντικών βιομορίων και κυττάρων μεταβάλλοντας έτσι την ομοιόσταση του οργανισμού με αποτέλεσμα την ανάπτυξη ασθενειών. Οι ROS παράγονται κατά τον φυσικό κυτταρικό μεταβολισμό και διαδραματίζουν ζωτικό ρόλο στη διέγερση σηματοδοτικών οδών σε φυτικά και ζωικά κύτταρα, ως απάντηση σε αλλαγές στις ενδο- και εξω- κυτταρικές συνθήκες [81]. Οι περισσότερες από τις ROS παράγονται στα κύτταρα μέσω της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας, όπου τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται στον τελικό τους αποδέκτη, το μοριακό οξυγόνο, μέσω αναπνευστικών συγκροτημάτων που βρίσκονται στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Κατά τη διάρκεια ενδογενών μεταβολικών αντιδράσεων, τα αερόβια κύτταρα παράγουν ROS (O - 2, H 2 O 2, OH ) ως φυσιολογικά προϊόντα της βιολογικής αναγωγής του μοριακού οξυγόνου, σε ποσοστό 1-5% του ολικού οξυγόνου. Σε συνθήκες υποξίας από τη μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα μπορούν επίσης να παραχθούν οξείδια του αζώτου (NO), τα οποία προκαλούν την παραγωγή δραστικών ενώσεων αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS) [82]. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, οι ελεύθερες ρίζες οι ROS και RNS προκαλούν οξείδωση, δηλαδή αύξηση του θετικού φορτίου ενός στοιχείου ως αποτέλεσμα αποβολής ηλεκτρονίων σε μόρια γειτονικών κυττάρων, με συνέπεια να προκαλούνται σοβαρές βλάβες ή ακόμα και θάνατος αυτών των κυττάρων. Το οξειδωτικό στρες προκαλεί οξειδωτικές αλλαγές στα βιολογικά μακρομόρια, όπως υδατάνθρακες, λιπίδια, πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα 54

(DNA/RNA) και διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη γήρανση και στις εκφυλιστικές ασθένειες. Με σκοπό να αντιμετωπίσει την περίσσεια των ελευθέρων ριζών που παράγονται λόγω του οξειδωτικού στρες, το ανθρώπινο σώμα έχει δημιουργήσει έναν εξειδικευμένο μηχανισμό για τη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής του ομοιόστασης. Αυτός ο ενδογενής μηχανισμός περιλαμβάνει δέσμευση ή σταθεροποίηση των ROS, παρεμπόδιση του σχηματισμού τους, δημιουργία χηλικών συμπλόκων καθώς και ενζυμική και μη ενζυμική αντιοξειδωτική άμυνα μέσω συστατικών που παράγονται στο σώμα (υπεροξειδική δισμουτάση, καταλάση, ουρικό οξύ, πρωτεΐνες του πλάσματος). Πηγή προέλευσης των τοξικών και δραστικών ελευθέρων ριζών στον οργανισμό δεν αποτελεί μόνο το μιτοχονδριακό σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων του αερόβιου μεταβολισμού, αλλά και ένα σύνολο άλλων ενδογενών και εξωγενών παραγόντων. Η ενζυμική δράση οξειδασών, οι φλεγμονές, ο μεταβολισμός του κυτοχρώματος P450, τα υπεροξειδιοσώματα, η αυτοοξείδωση ορισμένων υποστρωμάτων αποτελούν τους ενδογενείς παράγοντες, ενώ η υπεριώδης ακτινοβολία, οι ακτίνες Χ, οι ακτίνες γ, η υψηλή θερμιδική δίαιτα, η ρύπανση της ατμόσφαιρας και το κάπνισμα τους εξωγενείς [83]. Μεταλλικά ιόντα όπως τα ιόντα Fe (II), Cu, Cr (III), Cr (V) και Cr (IV), Co (II), Ni(II) και V(IV), παράγουν ενδοκυτταρικά δραστικές ελεύθερες ρίζες αν και η δραστικότητά τους διαφέρει. Οι αντιδράσεις τύπου Fenton είναι ένας από τους επικρατέστερους μηχανισμούς που πραγματοποιούνται. Ένα μεταλλικό ιόν αντιδρά με το H 2 O 2 προς παραγωγή της ιδιαίτερα τοξικής ρίζας υδροξυλίου: metal n+ + H 2 O 2 metal n+1 + OH - + OH Ένας άλλος κοινός μηχανισμός παραγωγής ROS είναι οι αντιδράσεις Haber- Weiss, κατά τις οποίες το Ο 2 συμμετέχει στην παραγωγή ριζών OH και στην αναγωγή του Fe(III) οδηγώντας στις αντιδράσεις Fenton. 55

metaln +1 + Ο 2 metal n+ + Ο 2 metal n+ + H 2 O 2 metal n+1 + OH - + OH Ο 2 + H 2 O 2 Ο 2 + OH - + OH Οι αντιδράσεις Haber-Weiss περιλαμβάνουν μεταλλικά ιόντα όπως τα ιόντα Cr (III), Cr (IV), Cr (V) και Cr (VI), V (IV), Co (I) και Co (II). Ο μηχανισμός Haber-Weiss είναι πιθανό να επικρατεί έναντι του μηχανισμού Fenton στους ζωντανούς οργανισμούς, λόγω της παραγωγής ROS από τη λειτουργία των μακροφάγων κατά τη διεργασία της φαγοκύττωσης. Εκτός από τις αντιδράσεις Fenton και Haber-Weiss, ορισμένα μεταλλικά ιόντα μπορούν να παράγουν κυτταρικές ελεύθερες ρίζες, μέσω ενός άμεσου μηχανισμού με κυτταρικά μόρια. Η αντίδραση του Cr (VI) με την κυστεΐνη ή την πενικιλλαμίνη παράγει σουλφυδριλικές ρίζες, οι οποίες εν συνεχεία αντιδρούν με άλλα μόρια προς παραγωγή Ο 2 : GS + RSH RSSR + H + RSSR + O 2 RSSR + Ο 2 Η διερεύνηση της αντιοξειδωτικής δράσης που επιδεικνύουν διάφορες ενώσεις αλλά και της δυνατότητας δέσμευσης των ελεύθερων μετάλλων από τις οργανικές ουσίες που περιέχουν τα ροφήματα καφέ, αποτελούν αντικείμενο πολλών μελετών, που στοχεύουν στην ακριβή κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους δρουν οι ουσίες αυτές [84]. 4.2.2 Καφές και αντιοξειδωτική δράση Στον καφέ υπάρχουν φυσικά αντιοξειδωτικά που περιλαμβάνουν κυρίως φαινολικές ενώσεις. Τα χλωρογενικά οξέα αποτελούν τις κύριες φαινολικές ουσίες που υπάρχουν στον κόκκο του καφέ και περιλαμβάνουν διάφορες ομάδες ενώσεων. Τα συγγενικά ισομερή του χλωρογενικού οξέος 56

σχηματίζονται από εστεροποίηση ενός μορίου κινικού οξέος και ενός έως τριών μορίων συγκεκριμένων οξέων όπως το trans-υδροξυ-κιναμμωμικό οξύ, το καφεϊκό οξύ, το φερρουλικό οξύ και το κουμαρικό οξύ, τα οποία είναι τα πιο κοινά στον καφέ [85]. Όσον αφορά στις πολυφαινόλες, η αντιοξειδωτική τους δράση οφείλεται στην ικανότητά τους: να δεσμεύουν ελεύθερες ρίζες να είναι δότες ατόμων υδρογόνου ή ηλεκτρονίων να δημιουργούν χηλικά σύμπλοκα με μεταλλικά κατιόντα να αναστέλλουν τη δράση οξειδωτικών ενζύμων (οξειδάση της ξανθίνης, πρωτεϊνική κινάση C, κυκλοοξυγονάση, λιποοξυγονάση, NADH οξειδάση) να επάγουν τη δράση ενδογενών αντιοξειδωτικών ενζύμων. Συγκεκριμένα, ορισμένες πολυφαινόλες επάγουν ένζυμα της φάσης ΙΙ του μεταβολισμού, όπως την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, με αποτέλεσμα την αύξηση της απέκκρισης οξειδωτικών παραγόντων από τον οργανισμό, ή άλλα αντιοξειδωτικά ένζυμα, όπως η μεταλλοθειονίνη ή το κυτόχρωμα P450 να προστατεύουν εξωγενή αντιοξειδωτικά, όπως τις βιταμίνες E και C, το β-καροτένιο, το λυκοπένιο κ.α [86]. Τα φαινολικά οξέα λειτουργούν ως ουσίες που τερματίζουν τις αντιδράσεις των ελευθέρων ριζών και σαν συμπλοκοποιητές μεταλλικών ιόντων είναι ικανά να καταλύουν την υπεροξειδάση των λιπιδίων. Τα φαινολικά αντιοξειδωτικά (PPH) εμπλέκονται στην οξείδωση των λιπιδίων και άλλων μορίων με το να δίνουν ταχύτατα ένα άτομο υδρογόνου σε ελεύθερες ρίζες (ROO, RO ) όπως φαίνεται στις παρακάτω αντιδράσεις: ROO + PPH ROOH + PP RO + PPH ROH + PP 57

Επιπλέον, τα ενδιάμεσα της φαινόξυ-ρίζας είναι σχετικά σταθερά και συνεπώς δεν μπορεί εύκολα να ξεκινήσει μια νέα αλυσιδωτή αντίδραση. Τα ενδιάμεσα της φαινόξυ-ρίζας δρουν επίσης ως ουσίες που τερματίζουν τον πολλαπλασιασμό των ριζών αντιδρώντας με άλλες ελεύθερες ρίζες: ROO + PP ROOPP RO + PP ROPP [87] Ωστόσο κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες (υψηλή συγκέντρωση φαινολικών αντιοξειδωτικών, υψηλό ph, παρουσία σιδήρου) τα φαινολικά αντιοξειδωτικά μπορούν να εκκινήσουν μια πορεία αυτοξείδωσης και να συμπεριφερθούν ως προοξειδωτικά. Η ικανότητα των πολυφαινολών ως αντιοξειδωτικών ενώσεων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη χημική τους δομή. Για τα φαινολικά οξέα συγκεκριμένα, η αντιοξειδωτική τους ικανότητα εξαρτάται από τον αριθμό και τη θέση των υδροξυλικών ομάδων σε σχέση με τη δραστική καρβοξυλική ομάδα. Μόνο-ύδροξυ υποκαταστημένα βενζοϊκά οξέα με την υδροξυλική ομάδα (-OH) σε όρθο- ή πάρα- θέση σε σχέση με την καρβοξυλική ομάδα (- COOH) δεν παρουσιάζουν αντιοξειδωτική δραστικότητα κάτι που δεν συμβαίνει όταν ο υποκαταστάτης είναι σε μέτα- θέση. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των φαινολικών οξέων αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο βαθμός υδροξυλίωσης (γαλλικό οξύ, 3-OH). Αντίθετα όταν οι υδροξυλικές ομάδες στις θέσεις 3- και 5- αντικατασταθούν με μεθοξυλικές ομάδες η ικανότητά τους αυτή μειώνεται [88]. Τα φλαβονοειδή του καφέ είναι μεταξύ των πιο ισχυρών φυσικών αντιοξειδωτικών επειδή έχουν ένα ή περισσότερα από τα παρακάτω δομικά στοιχεία τα οποία εμπλέκονται στην αντιοξειδωτική δράση. Μία ο- διαφαινολική ομάδα σε δακτύλιο, η οποία προσφέρει υψηλή σταθερότητα στο σχηματισμό ριζών και συμμετέχει στον εκτοπισμό των ηλεκτρονίων. Ένα 2-3 διπλό δεσμό σε συζυγία με την 4- οξο δράση σε δακτύλιο, υπεύθυνο για τον εκτοπισμό ηλεκτρονίων από το Β δακτύλιο και 58

Υδροξυλάσες μαζί με την 4- οξο δράση για μέγιστη δυνατότητα δέσμευσης των ριζών [89]. Στον καφέ εκτός από τα φυσικά αντιοξειδωτικά που αντιπροσωπεύονται κυρίως από φαινολικές ενώσεις, ανιχνεύονται και άλλα αντιοξειδωτικά όπως τα μελανοειδή, που είναι ενώσεις καφέ χρώματος. Τα μελανοειδή τα οποία βρίσκονται στο διαλυτό μέρος του καβουρδισμένου καφέ αποτελούν προϊόντα της αντίδρασης Maillard μεταξύ πρωτεϊνών και υδατανθράκων και επηρεάζουν το χρώμα και το άρωμα του καφέ [90]. Τα μελανοειδή είναι ένα από τα κύρια συστατικά του ροφήματος του καφέ και είναι υπεύθυνα για την ισχυρή αντιοξειδωτική ικανότητα και την ικανότητα δέσμευσης μετάλλων που έχει το ρόφημα του καφέ. Ο μηχανισμός της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας οφείλεται κυρίως σε αντιδράσεις εξουδετέρωσης των ελευθέρων ριζών [91]. Ένα άλλο κύριο συστατικό του καφέ, η καφεΐνη, έχει αντιοξειδωτική ικανότητα και προστατευτική επίδραση στους ιστούς. Αντίθετα με το χλωρογενικό οξύ, η καφεΐνη απορροφάται ταχύτατα και αποτελεσματικά από τον ανθρώπινο οργανισμό και στη συνέχεια μεταβολίζεται στο ήπαρ, παράγοντας διμέθυλξανθίνες και μεθυλουρικό οξύ τα οποία θεωρούνται αντιοξειδωτικά. Άλλα αντιοξειδωτικά του καφέ θεωρούνται και οι τοκοφερόλες (α, β, γ) μαζί με τις τοκοτριενόλες [92]. 59

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΜΕΤΑΛΛΑ 5.1 Ορισμός και ιδιότητες των μετάλλων Τα χημικά στοιχεία διακρίνονται σε μέταλλα (περίπου 70 τον αριθμό) και σε αμέταλλα (περίπου 30). Αυτή η διάκριση βασίζεται στη διαφοροποίηση των στοιχείων ως προς τις χημικές και φυσικές τους ιδιότητες. Έτσι, μέταλλο λέγεται κάθε υλικό, που λαμβάνεται από τα διάφορα μεταλλεύματα με τη χρήση διαφόρων μεταλλουργικών μεθόδων, σχηματίζει μεταλλικό δεσμό και κατά κανόνα εμφανίζει τις παρακάτω ιδιότητες [93]: Βρίσκεται σε στερεά κατάσταση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, εκτός από τον υδράργυρο που είναι υγρός έχει χαρακτηριστική μεταλλική λάμψη παρουσιάζει αργυρό χρωματισμό, εκτός από το χαλκό (ερυθρός) και το χρυσό (κίτρινος) έχει σχετικά υψηλή πυκνότητα έχει σχετικά υψηλό σημείο τήξεως εμφανίζει υψηλή θερμική αγωγιμότητα και υψηλή ηλεκτρική αγωγιμότητα διαθέτει πλαστικότητα, δηλαδή είναι δυνατόν να μορφοποιηθεί εν ψυχρώ. Τα μέταλλα είναι ελατά και όλκιμα. έχει κρυσταλλική δομή [94] Η ταξινόμηση των μετάλλων μπορεί να γίνει λαμβάνοντας υπόψη διάφορους παράγοντες όπως το μέγεθος των μορφών τους και τη χημική συγγένεια τους με διάφορους υποκαταστάτες [95]. 5.2 Ταξινόμηση μετάλλων με βάση το μέγεθος των ενώσεών τους Μέταλλα σε αιωρούμενη, σωματιδιακή φάση Στην κατηγορία αυτή ανήκουν μέταλλα με μέγεθος ενώσεων μεγαλύτερο από 0,45 μm. Τα μέταλλα αυτά μπορεί να έχουν είτε ανόργανη προέλευση ή 60

οργανική. Η σωματιδιακή ύλη μπορεί να περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις μετάλλων κυρίως χαλκού και σιδήρου. Τα μέταλλα αυτά σχηματίζουν διάφορα σύμπλοκα και ένυδρα υδροξείδια με τα σωματίδια ή προσροφώνται στην επιφάνειά τους. Μέταλλα σε διαλυτή φάση Κολλοειδή μέταλλα: Στα κολλοειδή ανήκουν οι μορφές των μετάλλων με μέγεθος από 1 nm έως 0.2-1 μm. Πρόκειται για μία σημαντική κατηγορία, αφού τα κολλοειδή συμμετέχουν στο βιογεωχημικό κύκλο των μετάλλων και του άνθρακα. Λόγω της μεγάλης τους επιφάνειας, τα κολλοειδή παρουσιάζουν αυξημένη προσροφητική ικανότητα και με αυτόν τον τρόπο ρυθμίζουν την κατανομή των στοιχείων μεταξύ διαλυτής και σωματιδιακής φάσης. Τα κολλοειδή αποτελούνται κυρίως από μεγάλα οργανικά μόρια και συγκριτικά με τα αιωρούμενα σωματίδια διαθέτουν πολύ περισσότερες θέσεις σύμπλεξης ανά μονάδα μάζας. «Αληθώς» διαλυτά μέταλλα: Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι μορφές των μετάλλων με μέγεθος μικρότερο από 1 nm. Ο διαχωρισμός τους από τα κολλοειδή γίνεται με διάφορες μεθόδους. Κυρίως χρησιμοποιείται η τεχνική της υπερδιήθησης και της διαπήδησης, ενώ σπανιότερα χρησιμοποιείται η χρωματογραφία [96]. 5.3 Ταξινόμηση μετάλλων με βάση τη χημική τους συγγένεια με διάφορους υποκαταστάτες Μεταλλικά ιόντα τύπου Α («σκληρά» ιόντα) Τα μέταλλα αυτού του τύπου σχηματίζουν πιο σταθερά σύμπλοκα με υποκατατάτες που περιέχουν τα «σκληρά» άτομα- δότες Ν, Ο και Ρ σε σχέση με εκείνους που περιέχουν τα «μαλακά» άτομα P, S και Ο. Εμφανίζονται ως υψηλά θετικά φορτισμένα ιόντα και έχουν μικρές ακτίνες. Η χημική τους συγγένεια με άτομα δότες διαφόρων υποκαταστατών ακολουθεί τη σειρά: F> O> P > N ~ Cl > Br > I > S. 61

Μεταλλικά ιόντα τύπου Β («μαλακά» ιόντα) Τα «μαλακά» ιόντα συνήθως έχουν ένα μεγάλο αριθμό ηλεκτρονίων στην εξωτερική τους στοιβάδα και κατά συνέπεια, σχηματίζουν κυρίως ομοιοπολικούς δεσμούς. Η χημική τους συγγένεια με άτομα δότες διαφόρων υποκαταστατών εμφανίζει αντίστροφη σειρά συγκριτικά με τα «σκληρά» ιόντα: F < O < P < N ~ Cl < Br < I < S. Όλα τα ιόντα αυτού του τύπου, με εξαίρεση ορισμένα όπως ο χαλκός και ο ψευδάργυρος, έχουν σημαντικούς βιολογικούς ρόλους και έτσι οι οργανισμοί πρέπει να έχουν μηχανισμούς ώστε να τα διατηρούν σε ασφαλή επίπεδα. Μεταλλικά ιόντα ενδιάμεσου τύπου Τα μέταλλα αυτής της κατηγορίας εμφανίζουν συμπεριφορά ενδιάμεση των τύπων Α και Β. Πολλά από αυτά είναι απαραίτητα στους οργανισμούς σε μικροποσότητες, αφού παίρνουν μέρος σε διάφορες βιοχημικές διεργασίες. Σε υψηλές όμως συγκεντρώσεις μπορεί να εμφανίσουν τοξικότητα [97]. Εικόνα 5.1 Ταξινόμηση των μεταλλικών στοιχείων με βάση τη χημική τους συγγένεια με πιθανούς υποκαταστάτες. 62

5.4 Χαλκός Το χημικό στοιχείο Χαλκός (Cuprum) είναι μέταλλο με ατομικό αριθμό 29 και ατομικό βάρος 63,546. Έχει θερμοκρασία τήξης 1084.6 C και θερμοκρασία βρασμού 2567 C. Το σύμβολό του είναι Cu. Έχει κοκκινωπό χρώμα και είναι όλκιμος και ελατός [98]. Λόγω της ιδιότητάς του όταν είναι τηγμένος να απορροφά ατμοσφαιρικό αέρα, τον οποίο αποβάλλει ψυχόμενος, δεν μπορούν να κατασκευασθούν χυτά αντικείμενα από χαλκό. Δεν εμφανίζει σχιστότητα, ενώ έχει ανώμαλη θραύση. Είναι τελείως αδιαφανής, ακόμη και σε λεπτά ελάσματα. Δεν εμφανίζει μαγνητικές ιδιότητες. Σε επαφή με άλλα μέταλλα εμφανίζει διαφορά δυναμικού (φαινόμενο Galvani). Ανήκει στην ομάδα της 1ης κύριας σειράς των στοιχείων μετάπτωσης [99]. Εικόνα 5.2 Αυτοφυής χαλκός. Προέλευση ΗΠΑ. (Πηγή: http://en.wikipedia.org/wiki/copper) Σύμφωνα με τους αρχαιολόγους ο χαλκός είναι το πρώτο από τα μέταλλα που χρησιμοποίησε ο άνθρωπος για την κατασκευή σκευών, εργαλείων και όπλων. Εκτιμάται ότι ο χαλκός έγινε γνωστός περίπου το 9.000 π.χ., πιθανόν επειδή απαντάται ως αυτοφυής και δεν απαιτεί μεταλλουργική διαδικασία για την παρασκευή του σε καθαρή μορφή. H χρήση καθαρού χαλκού ήταν γνωστή στη Μικρά Ασία από το 6.500 π.χ. ενώ από τα μέσα της 4ης χιλιετίας άρχισε να αναπτύσσεται η μεταλλουργία που προκάλεσε και την αστικοποίηση της Μεσοποταμίας. Περί το 3.000 π.χ. η χρήση χαλκού ήταν πλήρως διαδεδομένη στην Εγγύς Ανατολή. Η χρήση του ορείχαλκου ήταν 63

ευρύτερα διαδεδομένη στη 2η χιλιετία μέχρι την 1η όπου ακολούθησε η ευρύτερη χρήση του σιδήρου [100]. Ανευρίσκεται αυτοφυής στη Φύση, ωστόσο σήμερα τα κοιτάσματα αυτοφυούς χαλκού είναι είτε περιορισμένα είτε μη οικονομικά εκμεταλλεύσιμα, όπως το αποκαλούμενο "Desseminated Copper Ore" στην Μοντάνα και άλλες Πολιτείες των ΗΠΑ. Κυριότερα ορυκτά του χαλκού είναι ο Χαλκοπυρίτης (Cu 2 S), ο χαλκοσίνης, o βορνίτης, ο κυπρίτης, ο μαλαχίτης και ο αζουρίτης (τα δύο τελευταία είναι ημιπολύτιμοι λίθοι). Στα κράματά του ανήκει ο ορείχαλκος και ο μπρούντζος, που χρησιμοποιούνται σε ποικίλες κατασκευές, όπως εργαλεία, όπλα, αμαγάλματα, διακοσμητικά σκεύη, όργανα μέτρησης και μουσικά όργανα. Ο χαλκός εμφανίζει δύο αριθμούς οξείδωσης (+1 και +2). Δεν είναι ιδιαίτερα δραστικό μέταλλο γι' αυτό και δεν αντιδρά εύκολα με άλλα στοιχεία ούτε χρησιμοποιείται ευρέως ως αναγωγικό. Στον ατμοσφαιρικό αέρα καλύπτεται αρχικά από οξείδιό του, το οποίο, με το διοξείδιο του άνθρακα μετατρέπεται σε ανθρακικό χαλκό, προσδίδοντας του πρασινωπό χρώμα. Αντιδρά με οξυγόνο, θείο και αλογόνα προς τις αντίστοιχες ενώσεις. Δεν προσβάλλεται από αραιά οξέα ούτε από πυκνό θειικό οξύ, αλλά από το νιτρικό οξύ (HNO 3 ) [101]. 5.4.1 Βιολογική σημασία χαλκού Ο χαλκός είναι απαραίτητο ιχνοστοιχείο, τόσο στα ζώα όσο και στα φυτά. Ανευρίσκεται σε ποικιλία ενζύμων, όπως την υπεροξειδάση του κυτοχρώματος C και την υπεροξυ-δισμουτάση. Ορισμένα μαλάκια και αρθρόποδα έχουν ως μεταφορική ουσία των αναπνευστικών αερίων την αιμοκυανίνη (αντί της αιμοσφαιρίνης), η οποία περιέχει χαλκό. Στα ανώτερα ζώα έχει διαπιστωθεί ότι η παρουσία χαλκού διευκολύνει την απορρόφηση σιδήρου από τον οργανισμό. H υπερβολική απόθεση χαλκού στους ιστούς προκαλεί τη νόσο του Wilson, ενώ χρόνια έλλειψη χαλκού προκαλεί δυσλειτουργία στη σύνθεση ντοπαμίνης, με συνέπεια την εμφάνιση κατάθλιψης, στη σύνθεση μελανίνης από τα δερματικά κύτταρα καθώς και δυσλειτουργίες στο μεταβολισμό των λιπών και των τριγλυκεριδίων [102]. O 64

χαλκός μεταπίπτει στον ανθρώπινο ή ζωικό οργανισμό μεταξύ των μορφών του μονοσθενούς χαλκού (Cu +1 ) και στην πλειοψηφία του δισθενούς χαλκού (Cu +2 ). Ο χαλκός έχει τη δυνατότητα να παίρνει και να δίνει εύκολα ηλεκτρόνια και αυτό εξηγεί και το σημαντικό ρόλο του στις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις και τη δέσμευση των ελεύθερων ριζών. Ανευρίσκεται στο κρέας, στα καρύδια, τα οστρακόδερμα, τα λαχανικά και στους σπόρους (άλευρα ολικής άλεσης) [103]. Εικόνα 5.3 Τροφές πλούσιες σε χαλκό. (Πηγή: http://en.wikipedia.org/wiki/copper) Παγκοσμίως παράγονται περίπου 15.6 εκατ. τόνοι το χρόνο. Οι κυριότερες χώρες παραγωγοί είναι η Χιλή, το Περού, οι ΗΠΑ, η Κίνα, η Αυστραλία, η Ρωσία και ο Καναδάς [104]. 65

Τα βασικά χαρακτηριστικά του χαλκού παρατίθενται στον Πίνακα 5.1 που ακολουθεί. Πίνακας 5.1 Βασικά χαρακτηριστικά χαλκού Χημικό σύμβολο Cu Ατομικός αριθμός 29 Χημική ομάδα Στοιχείο μετάπτωσης Πυκνότητα 8.96 g cm -3 Χρώμα Κοκκινωπό Σημείο τήξης 1084.62 C Σημείο βρασμού 2562 C Θερμότητα εξάτμισης 300.4 kj mol -1 Θερμότητα τήξης 13.26 kj mol -1 Μοριακή θερμοχωρητικότητα Ηλεκτρική αγωγιμότητα Θερμική αγωγιμότητα 24.440 J mol - -1 1 K 16.78 nω m -1 401 W m -1 K (Πηγή: http://en.wikipedia.org/wiki/copper) 66

5.5 Τοξικότητα μετάλλων 5.5.1 Ορισμός και γενικά χαρακτηριστικά Τοξικότητα είναι η ικανότητα μιας ουσίας -εν προκειμένω των μετάλλων- να επηρεάζει τις ζωτικές λειτουργίες ενός βιολογικού συστήματος ή ενός ζωντανού οργανισμού. Με βάση το ρόλο τους στους ζωντανούς οργανισμούς τα διάφορα στοιχεία ταξινομούνται στα: Στοιχεία βιοχημικώς χρήσιμα. H, B, C, N, O, F, Na, Mg, Si, P, S, Cl, K, Ca, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Br, I Στοιχεία με πιθανή βιοχημική σημασία. Al, Ti, As, Sn, Pb, Cd. Στοιχεία πιθανώς μη βιοχημικώς χρήσιμα. He, Li, Be, Ne, Ar, Sc, Cr, Ga, Ge, Se, Kr, Rb, Sr, Y, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Bi, Po, At, R, Fr, Ac, Th, Pa, U. Αρκετά μέταλλα θεωρούνται απαραίτητα στους ζώντες οργανισμούς λόγω του οξειδοαναγωγικού ρόλου που διαδραματίζουν σε πολλές ενζυμικές πρωτεΐνες ή/και συμμετοχής τους ως δομικών συστατικών ή ρυθμιστών της όσμωσης ηλεκτρολυτών. Άλλα είναι αναγκαία σε μεγάλες ποσότητες, όπως π.χ. το νάτριο και το ασβέστιο, ενώ άλλα είναι απαραίτητα σε μικρότερες ποσότητες, π.χ. σίδηρος, χαλκός και ψευδάργυρος, διότι σε αυξημένες συγκεντρώσεις ασκούν τοξική επίδραση στους οργανισμούς. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν και τα πολύ τοξικά μέταλλα, όπως ο υδράργυρος, ο μόλυβδος, το κάδμιο, το χρώμιο κ.α. που είναι επιβλαβή για τον άνθρωπο και σχεδόν για όλους τους οργανισμούς, ακόμη και όταν βρίσκονται σε ίχνη της τάξης του εκατομμυριοστού του γραμμαρίου [105]. 5.5.2 Μηχανισμοί τοξικής δράσης μετάλλων και επίδρασή τους στον οργανισμό Η τοξική δράση των μετάλλων στους οργανισμούς οφείλεται στην, Απενεργοποίηση των απαραίτητων βιολογικών λειτουργικών ομάδων των βιομορίων Αντικατάσταση των απαραίτητων ιχνοστοιχείων στα βιομόρια από άλλα 67

Τροποποίηση της ενεργού διαμόρφωσης των βιομορίων Βιοχημικά, ο κυριότερος μηχανισμός της τοξικής δράσης τους οφείλεται στην ισχυρή συγγένεια των μεταλλοκατιόντων με το θείο. Έτσι, οι σουλφυδρυλικές ομάδες -SH, οι οποίες συχνά εμφανίζονται στα ένζυμα, που ελέγχουν την ταχύτητα των κρίσιμων μεταβολικών αντιδράσεων στο ανθρώπινο σώμα, ενώνονται εύκολα με τα κατιόντα των βαρέων μετάλλων που προσλήφθηκαν με την τροφή ή με μόρια που περιέχουν μέταλλα. Συνεπακόλουθα, ο δεσμός μετάλλου- θείου που προκύπτει επηρεάζει το ένζυμο και τη λειτουργία του, με αποτέλεσμα ο ανθρώπινος οργανισμός να προσβάλλεται μερικές φορές θανατηφόρα. Ακόμη, υπάρχουν ενδείξεις ότι ορισμένα μέταλλα, ικανά να συμμετέχουν σε οξειδοαναγωγικούς κύκλους (πχ. Cu, Fe) στο εσωτερικό των κυττάρων, είναι δυνατό να προκαλέσουν τοξική επίδραση, όχι μόνο μέσω τυχαίας σύνδεσής τους, αλλά επιπλέον μέσω της παραγωγής ελευθέρων ριζών ενεργού οξυγόνου και υπεροξειδικών ριζών φτάνοντας μέχρι και στην παρεμβολή του μετάλλου σε διαδικασίες μεταγραφής του DNA και την πρόκληση γενετικών ανωμαλιών [106]. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την τοξικότητα των ιχνοστοιχείων στους οργανισμούς είναι: Η χημική μορφή του μετάλλου Η παρουσία άλλων μετάλλων Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη φυσιολογία των οργανισμών και πιθανώς τη μορφή του μετάλλου (θερμοκρασία, ph, διαλυμένο οξυγόνο, φως, αλατότητα) Το είδος του οργανισμού Η φυσιολογική κατάσταση και φάση εξέλιξης του οργανισμού (στάδιο ανάπτυξης, ηλικία, μέγεθος) Η φυσική κατάσταση του οργανισμού Όσον αφορά στην τοξική τους επίδραση, ορισμένα βαρέα μέταλλα προκαλούν ισχυρή τοξική επίδραση στον οργανισμό, μέσω πρόσληψης επιμολυσμένης τροφής και ιδιαίτερα νερού, ακόμη και μέσω της εισπνοής. 68

Άμεσα συμπτώματα είναι η τάση για εμετό, διάρροια, καρδιακή ανωμαλία, δερματικές παθήσεις, ενώ πολλά είναι θανατηφόρα σε μεγαλύτερες δόσεις. Συγκεκριμένα, εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος και δρουν με ποικίλους τρόπους, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Δύναται να αντικαταστήσουν το ασβέστιο στον ερειστικό ιστό ή στις νευρωνικές συνάψεις, λόγω του παρόμοιου μεγέθους και φορτίου τους και έτσι είναι πιθανή η επιβράδυνση της παιδικής ανάπτυξης, καθώς και η εμφάνιση μαθησιακών δυσκολιών. Προκαλούν νευροτοξικότητα, νεφροτοξικότητα και υπέρταση, ενώ με την εισπνοή συσσωρεύονται στους πνεύμονες. Ο μεθυλιωμένος υδράργυρος εισέρχεται μέσω της διατροφής στον ανθρώπινο οργανισμό, κυρίως μέσω της κατανάλωσης λιπαρών ψαριών και προκαλεί χρόνια ή οξεία δηλητηρίαση ή και θάνατο. Επειδή ο υδράργυρος είναι λιποδιαλυτός, τείνει να συσσωρευτεί στον εγκέφαλο με συνέπεια νεφρίτιδα, κατάρρευση του κυκλοφορικού, νευρικές βλάβες και τερατογενέσεις. Οι ενώσεις του καδμίου θεωρούνται υπεύθυνες για αναπνευστικές δυσλειτουργίες και καρκινογενέσεις, ενώ μέταλλα όπως το κοβάλτιο και ο ψευδάργυρος που σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις είναι απαραίτητα ιχνοστοιχεία, σε υψηλότερα επίπεδα γίνονται τοξικά. Επιπλέον, το αργίλιο είναι υπεύθυνο για νευροτοξικές βλάβες και ίσως σε κάποιο βαθμό για τη νόσο Alzheimer, όταν συσσωρεύεται στον εγκέφαλο, ενώ το εξασθενές χρώμιο προκαλεί συμπτώματα χρόνιας δηλητηρίασης που είναι συνήθως αντιστρεπτά και περιλαμβάνουν αναπνευστικές και δερματικές βλάβες καθώς και καρκινογένεση έπειτα από χρόνια έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις του. Αποθηκεύεται κυρίως στα νεφρά και τη σπλήνα, με ίχνη ποσοτήτων του να ανιχνεύονται και στην καρδιά, τους πνεύμονες, το πάγκρεας και τον εγκέφαλο [107]. 5.5.3 Τοξικότητα του χαλκού Ο χαλκός και τα ιόντα του είναι σημαντικά για τα βιολογικά συστήματα, καθώς είναι απαραίτητα ως θρεπτικά συστατικά. Το εύρος συγκέντρωσης όμως εντός του οποίου η επίδρασή του στις μεταβολικές διεργασίες των οργανισμών είναι η βέλτιστη είναι ιδιαίτερα στενό. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις είναι απαραίτητος για τους έμβιους οργανισμούς και κυρίως για τη βλάστηση και δρα ως 69

συστατικό διαφόρων ενζύμων και ως καταλύτης οξειδοαναγωγής σε μια ποικιλία μεταβολικών οδών. Σε υψηλές συγκεντρώσεις εντούτοις ο χαλκός αναστέλλει την ανάπτυξη και παρεμβαίνει σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως η φωτοσύνθεση, η αναπνοή, η δραστηριότητα των ενζύμων, η σύνθεση των χρωστικών και των πρωτεϊνών και ο διαχωρισμός των κυττάρων. Η ευρεία εφαρμογή του χαλκού και των αλάτων του στη βιομηχανία και τη γεωργία, καθώς και η υψηλή τοξικότητά του σε υψηλότερο εύρος συγκεντρώσεων τον καθιστούν δυνητικά τοξικό ιχνοστοιχείο [108]. Η ωφέλιμη πρόσληψη του χαλκού εκτιμήθηκε στα 0.7 mg/ημέρα για τους άνδρες και 0.8mg/ημέρα για τις γυναίκες όπως αυτή θεσπίστηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας το 1996, με συνιστώμενα διαιτητικά επιτρεπτά όρια τα 0.9 mg/ημέρα για τους ενήλικες γενικά [109]. Ο χαλκός είναι μέταλλο ιδιαίτερου ενδιαφέροντος καθώς οι συγκεντρώσεις των ιόντων του, μέσα στο εύρος, το οποίο είναι κοινό για τα φυσικά ύδατα, μπορεί να είναι τοξικές για το φυτοπλαγκτόν και τους οργανισμούς (π.χ. σε περιπτώσεις νερών ανάβλυσης). Πολλοί φυσικοί οργανικοί υποκαταστάτες στο έδαφος, το νερό και τα ιζήματα μπορούν να συμπλέξουν το χαλκό και να επηρεάσουν τη δραστικότητά του, την παραμονή και την κινητικότητά του στο έδαφος και το νερό. Τα ιόντα του χαλκού που συνδέονται με το χουμικό υλικό συγκαταλέγονται μεταξύ των σημαντικότερων μορφών στα γλυκά και εκβολικά ύδατα. Στο θαλασσινό νερό ο ανταγωνισμός για αντιδράσεις με άλλα μέταλλα και υποκαταστάτες μειώνουν τη συμπλεκτική αντίδραση του χαλκού με το χουμικό υλικό. Ποσοστό μεγαλύτερο από 99.9% του χαλκού είναι συμπλοκοποιημένο με υποκαταστάτες στις υγρές κατακρημνίσεις [110]. Μεταξύ των διαφόρων δισθενών μετάλλων ή μετάλλων μεταπτώσεως ο χαλκός σχηματίζει ιδιαίτερα σταθερά οργανικά σύμπλοκα. Οι αντιδράσεις συμπλοκοποίησης επηρεάζουν τη βιοδιαθεσιμότητα των ιόντων χαλκού, καθώς και τις αντιδράσεις προσρόφησής του σε σωματιδιακό υλικό. Η βιοδιαθεσιμότητα του χαλκού είναι πιθανό να ελέγχεται επίσης από την κινητική διαχωρισμού των μεταλλικών συμπλόκων. Οι συμπλεγμένες μορφές του χαλκού με υδροξύλιο (Cu(OH) + και Cu(OH) 2(aq) και ανόργανους υποκαταστάτες (CuHCO + 2-3, CuCO 3, Cu(CO 3 ) 2 και CuCl -(n-2) n ) εμφανίζουν 70

τοξικότητα. Τα μεταλλικά σύμπλοκα με λιπόφιλους οργανικούς υποκαταστάτες είναι ικανά να διαπεράσουν τις κυτταρικές μεμβράνες, με αποτέλεσμα την τοξική δράση τους. Ο διαχωρισμός του χαλκού μεταξύ διαλυτών και σωματιδιακών μορφών προκύπτει από τον ανταγωνισμό μεταξύ των διαλυμένων υποκαταστατών και των θέσεων σύμπλεξης στα σωματίδια [111]. 5.5.4 Μηχανισμός τοξικής δράσης του χαλκού- Τοξικοκινητική Ο χαλκός και οι ενώσεις του εισέρχονται στον οργανισμό κυρίως μέσω του γαστρεντερικού σωλήνα και ειδικότερα του δωδεκαδακτύλου με μηχανισμό ενεργού μεταφοράς, σε μικρότερο βαθμό μέσω στομάχου και σπανιότερα μέσω του αναπνευστικού βλεννογόνου και του δέρματος σε ποσότητες που ακόμη δεν έχουν διευκρινισθεί [112]. Ο βαθμός απορρόφησης του χαλκού στο γαστρεντερικό σύστημα εξαρτάται κατά ένα μεγάλο μέρος από τη χημική κατάσταση καθώς και από την παρουσία άλλων ενώσεων ή στοιχείων όπως ο ψευδάργυρος, ο σίδηρος κτλ. Συγκεκριμένα, το 30-50% του προσλαμβανόμενου χαλκού που απορροφάται είναι συνήθως στη δισθενή του μορφή (Cu 2+ ) και λιγότερο στη μονοσθενή (Cu + ). Στον ορό του αίματος ο χαλκός όταν απορροφηθεί από το έντερο, μεταφέρεται συνδεδεμένος με την αλβουμίνη και στη συνέχεια όταν ο χαλκός απελευθερώνεται από το ήπαρ μεταφέρεται στους ιστούς με τη σερουλοπλασμίνη σε ποσοστό 95% [113]. Η σερουλοπλασμίνη είναι α 2 σφαιρίνη μεγάλου μοριακού βάρους που δεσμεύεται στενά και μεταφέρει 6-8 άτομα δισθενούς χαλκού. Συντίθεται και ρυθμίζεται η συγκέντρωσή της από το ήπαρ χωρίς να αποκλείονται και άλλοι ιστοί στο σώμα που να μπορούν να τη συνθέσουν [114]. Οι Freedman et al. (1989) υποστηρίζουν ότι σύμφωνα με ένα μοντέλο κυτταρικού μεταβολισμού του χαλκού στο ήπαρ, το συγκεκριμένο μέταλλο συμπλοκοποιείται πρώτα με την ανηγμένη γλουταθειονίνη (GSH- reduced gloutathionine) αμέσως αφότου μπει στο κύτταρο και ύστερα μεταφέρεται για να συμπλοκοποιηθεί με τη μεταλλοθειονίνη. Αυτό συμβαίνει γιατί εφόσον εισέλθει ο χαλκός στο κύτταρο απαιτούνται αρκετές ώρες για να φτάσει σε ικανοποιητικά επίπεδα η συγκέντρωση της μεταλλοθειονίνης ώστε να 71

ανασταλεί η τοξικότητα του. Η μεταλλοθειονίνη είναι μια δεσμευτική πρωτεΐνη χαμηλού μοριακού βάρους, πλούσια σε κυστεΐνη, η οποία αποθηκεύει προσωρινά τον κυτταροπλασματικό χαλκό. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου η μεταλλοθειονίνη συσσωρεύει και μεταφέρει το χαλκό σε άλλες πρωτεΐνες και ένζυμα, όπως η σερουλοπλασμίνη και η υπεροξειδική δισμουτάση, δεν έχει ακόμη διευκρινισθεί πλήρως [115]. 72

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΣΥΜΠΛΕΞΗΣ ΜΕΤΑΛΛΩΝ 6.1 Ορισμός ικανότητας σύμπλεξης Η συμπλεκτική ικανότητα μετάλλου (CCMe) ενός δείγματος είναι η ικανότητά του να συμπλέκει ορισμένη ποσότητα ενός μετάλλου. Η συμπλεκτική ικανότητα ως προς ένα μέταλλο ουσιαστικά αποτελεί μέτρο της ποσότητας των υποκαταστατών του στο δείγμα. Η συμπλεκτική ικανότητα ενός δείγματος ως προς τα μεταλλικά ιόντα, ορίζεται ως τα προστιθέμενα moles του μετάλλου που έχουν συμπλεχθεί ανά λίτρο δείγματος. Ο προσδιορισμός της συμπλεκτικής ικανότητας μπορεί να επηρεαστεί από το βαθμό ευκινησίας του συστήματος. Έτσι, ευκίνητο θεωρείται ένα σύστημα όταν ο χρόνος επίτευξης της θερμοδυναμικής ισορροπίας της διάστασης των συμπλόκων του μετάλλου (MeL) είναι ικανοποιητικά μεγαλύτερος από τον χρόνο απόκρισης της χρησιμοποιούμενης αναλυτικής τεχνικής. Στην περίπτωση που τα μεταλλικά σύμπλοκα δεν διίστανται κατά τη μέτρηση, τότε το σύστημα χαρακτηρίζεται ως αδρανές. Για να επιτευχθεί πλήρης ευκινησία χρειάζονται μεγάλοι χρόνοι ανάλυσης. Τα μεταλλικά σύμπλοκα είναι είτε ανόργανα είτε οργανικά και μπορούν να διαχωριστούν περαιτέρω σε ευκίνητα και μη ευκίνητα (αδρανή), ανάλογα με τις σταθερές αστάθειας/ σχηματισμού τους. Τα σύμπλοκα μπορούν να αλλάξουν σημαντικά τη φυσική, χημική και βιολογική συμπεριφορά των μετάλλων, ενώ μειώνουν την τοξικότητά τους στους οργανισμούς [116]. 73

6.2 Βολταμμετρικές μέθοδοι 6.2.1 Εισαγωγή- Ορολογία Σύμφωνα με τον Henze (2001), «πολαρογραφία» και γενικότερα «βολταμμετρία» ονομάζονται οι αναλυτικές μέθοδοι που βασίζονται στις μετρήσεις ρεύματος-δυναμικού σε ηλεκτροχημικές κυψελίδες. Το αναλυτικό σήμα είναι το ρεύμα (συνήθως φαρανταϊκό ρεύμα), το οποίο ρέει μέσα στην κυψελίδα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης του αναλύτη στο μικρής επιφάνειας ηλεκτρόδιο εργασίας. Ο αναλύτης μπορεί να είναι κατιόν, ανιόν ή μόριο [117]. Η μέθοδος αυτή δημιουργήθηκε από τον Jaroslav Heyrovsky, ο οποίος εισήγαγε το σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου ως το ηλεκτρόδιο εργασίας. Το ηλεκτρόδιο αυτό αποτελείται από γυάλινο τριχοειδές παχέως τοιχώματος, από το οποίο ο υδράργυρος στάζει μέσα στο διάλυμα του δείγματος υπό την πίεση μιας στήλης υδραργύρου. Οι όροι «πολαρογραφία» και «βολταμμετρία» χρησιμοποιούνται συχνά με την αντίστροφη έννοια ή δίχως ακρίβεια. Σύμφωνα με τους κανόνες της IUPAC, o όρος «πολαρογραφία» χρησιμοποιείται όταν η καμπύλη ρεύματος-δυναμικού καταγράφεται με τη χρήση υγρού ηλεκτροδίου εργασίας, του οποίου η επιφάνεια μπορεί να ανανεώνεται περιοδικά ή συνεχώς (πχ. με τη μορφή σταγόνων). Αυτό περιλαμβάνει το κλασικό σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου (Dropping Mercury Electrode DME) και το στατικό σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου (Static Mercury Drop Electrode SMDE), που αναπτύχθηκε στη συνέχεια. Ο όρος «βολταμμετρία» χαρακτηρίζει το σύνολο των μεθόδων στις οποίες οι μετρήσεις ρεύματος δυναμικού πραγματοποιούνται σε στατικά και σταθερά ηλεκτρόδια εργασίας (ανεξαρτήτως του υλικού τους). Αυτά περιλαμβάνουν το σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου, το ηλεκτρόδιο λεπτού φιλμ υδραργύρου, τα υαλώδη ηλεκτρόδια άνθρακα και τα ηλεκτρόδια πάστας άνθρακα. Τα ηλεκτρόδια εργασίας ευγενών μετάλλων (πχ. χρυσού ή λευκόχρυσου) χρησιμοποιούνται λιγότερο συχνά. Στην πολαρογραφία ως ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιμοποιείται αποκλειστικά το σταγονικό ηλεκτρόδιο υδραργύρου (HDME) [118]. 74

6.2.2 Βολταμμετρικές τεχνικές Οι βολταμμετρικές τεχνικές (ή πληρέστερα βολταμπερομετρικές) συνιστούν μια ομάδα ηλεκτροχημικών τεχνικών αναλύσεως, στις οποίες η αναλυτική πληροφορία προκύπτει από διαγράμματα i-e, όπου i είναι το ρεύμα που διαρρέει το ηλεκτρολυτικό στοιχείο και Ε το δυναμικό του ηλεκτροδίου εργασίας. Οι επιμέρους βολταμμετρικές τεχνικές διαφέρουν μεταξύ τους κυρίως ως προς τον τρόπο με τον οποίο μεταβάλλεται το δυναμικό με το χρόνο και ως προς τον τύπο του χρησιμοποιούμενου ηλεκτροδίου εργασίας. Γενικά, οι μετρήσεις στις βολταμμετρικές τεχνικές γίνονται σε συνθήκες που ευνοούν την πόλωση του ηλεκτροδίου εργασίας σε ευρείες περιοχές δυναμικού του έτσι ώστε, όταν διέρχεται ηλεκτρικό ρεύμα, η τιμή του να μπορεί να συσχετισθεί άμεσα με τη συγκέντρωση των ηλεκτρενεργών χημικών σωματιδίων, τα οποία συμμετέχοντας σε μια ηλεκτροδιακή ημιαντίδραση δρουν ως αποπολωτές. Συνθήκες που ευνοούν την πόλωση του ηλεκτροδίου εργασίας και ως εκ τούτου χρησιμοποιούνται μόνες ή σε συνδυασμό στις επιμέρους βολταμμετρικές τεχνικές είναι: Ηλεκτρόδιο εργασίας με μικρή επιφάνεια. Η χρησιμοποίηση ηλεκτροδίου εργασίας με πολύ μικρή επιφάνεια (μικροηλεκτρόδιο) σε σχέση με την επιφάνεια του άλλου ηλεκτροδίου του ηλεκτρολυτικού στοιχείου (αντιηλεκτροδίου ή βοηθητικού ηλεκτροδίου) εξασφαλίζει α) ταχύτατη πόλωση συγκεντρώσεως στην περιοχή του διαλύματος που το περιβάλλει, β) τιμές ρεύματος οι οποίες εξαρτώνται αποκλειστικά από τις φαρανταϊκές διαδικασίες που πραγματοποιούνται σε αυτό και όχι στο αντιηλεκτρόδιο ή βοηθητικό ηλεκτρόδιο (καθίσταται το καθοριστικό του ρεύματος ηλεκτρόδιο) και γ) πολύ μικρά ρεύματα (μερικές δεκάδες μα ή μικρότερα), γεγονός που επιτρέπει να θεωρηθούν οι μετρήσεις ως μη καταστροφικές του δείγματος, αφού μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα της ηλεκτρενεργού ουσίας του ηλεκτρολυτικού διαλύματος υφίσταται οξείδωση ή αναγωγή κατά τη διάρκεια κάθε μέτρησης. 75

Ακινησία διαλύματος. Το διάλυμα στην ηλεκτρολυτική κυψελίδα διατηρείται ακίνητο (δεν αναδεύεται), γεγονός που σε συνδυασμό με τη μικρή επιφάνεια του ηλεκτροδίου εργασίας επιταχύνει την πόλωση συγκεντρώσεως. Υλικό ηλεκτροδίου εργασίας. Ως υλικό των ηλεκτροδίων εργασίας χρησιμοποιούνται κατά το δυνατόν χημικώς αδρανή υλικά όπως ευγενή μέταλλα, υδράργυρος και διάφορες αγώγιμες μορφές άνθρακα (υαλώδης άνθρακας ή γραφίτης), γεγονός που επεκτείνει την περιοχή πολώσεως σε αρκετά οξειδωτικά δυναμικά. Η χρησιμοποίηση υδραργύρου επεκτείνει την περιοχή πολώσεως και σε αρκετά αναγωγικά δυναμικά, ακόμη και σε όξινα διαλύματα, δεδομένου ότι η αποπόλωση υδραργυρικών ηλεκτροδίων με αναγωγή του ύδατος ή των υδρογονοκατιόντων προϋποθέτει μεγάλο καθοδικό υπερδυναμικό (πόλωση ενεργοποιήσεως). Το ηλεκτρολυτικό στοιχείο στο οποίο ισχύουν μία ή περισσότερες από τις παραπάνω συνθήκες και χρησιμοποιείται σε μια βολταμμετρική τεχνική αναλύσεως θα ονομάζεται στο εξής βολταμμετρικό στοιχείο ή βολταμμετρική κυψελίδα (voltammetric cell). Σχεδόν στο σύνολό τους οι βολταμμετρικές τεχνικές χαρακτηρίζονται γενικά από χαμηλά όρια ανιχνεύσεως (τυπικά 10-8 10-10 Μ, ανάλογα με τη συγκεκριμένη τεχνική) και ικανοποιητική εκλεκτικότητα. Διακρίνονται από τις άλλες ηλεκτροχημικές τεχνικές ως προς το ότι πολλές από αυτές επιτρέπουν την ποιοτική ταυτοποίηση, όπως και τον ταυτόχρονο προσδιορισμό περισσότερων του ενός ηλεκτρενεργών συστατικών. Εκτός από τις καθαρά αναλυτικές εφαρμογές οι βολταμμετρικές τεχνικές χρησιμοποιούνται ευρύτατα σε ηλεκτροχημικές και γενικότερα φυσικοχημικές μελέτες, όπως π.χ. στη διευκρίνιση μηχανισμών ηλεκτροδιακών αντιδράσεων, σε μελέτες χημικών ισορροπιών (προσδιορισμός συντάξεως και σταθερών σχηματισμού συμπλόκων), σε κινητικές μελέτες και καταλύσεις αντιδράσεων και στην παρακολούθηση βραχύβιων ηλεκτρενεργών σωματιδίων. Η συνηθέστερη βολταμμετρική τεχνική αναλύσεως είναι η πολαρογραφία, η οποία ορίζεται ως «βολταμμετρία σταγονικού ηλεκτροδίου υδραργύρου», 76

αφού το τελευταίο χρησιμοποιείται αποκλειστικά και μόνο στην πολαρογραφία ως ηλεκτρόδιο εργασίας [119]. 6.2.3 Πολαρογραφία Η πολαρογραφία επινοήθηκε από τον Heyrovsky το 1922, ο οποίος για το επίτευγμά του αυτό τιμήθηκε το 1959 με το βραβείο Νόμπελ. Έκτοτε αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ευρέως στη χημική ανάλυση. Με την πολαρογραφία είναι δυνατή η ταυτοποίηση και ο προσδιορισμός ανόργανων και οργανικών ουσιών, που μπορούν να αναχθούν ή να οξειδωθούν ηλεκτροχημικά. Κατά την πολαρογραφική ανάλυση διάλυμα του δείγματος φέρεται σε ειδικό ηλεκτρολυτικό δοχείο (κυψελίδα) και υφίσταται ηλεκτρόλυση μεταξύ δύο ηλεκτροδίων, ενός μικροηλεκτροδίου (του σταγονικού ηλεκτροδίου υδραργύρου-hmde), που πολώνεται εύκολα και δρα ως κάθοδος (εξού και η ονομασία της τεχνικής) κι ενός ευμεγέθους μη πολώσιμου ηλεκτροδίου αναφοράς, συνήθως κορεσμένου ηλεκτροδίου καλομέλανας (ΚΗΚ) (αντιθέτως μπορεί να χρησιμοποιηθεί μεγάλη επιφάνεια υδραργύρου), που αποτελεί την άνοδο. Το HMDE αποτελεί το ηλεκτρόδιο εργασίας του ηλεκτρολυτικού στοιχείου και για μεγαλύτερη ακρίβεια χρησιμοποιείται και ένα βοηθητικό ηλεκτρόδιο, συνήθως λευκόχρυσου, από το οποίο διέρχεται το ρεύμα, σχεδόν κατά αποκλειστικότητα, ενώ το ρεύμα που διέρχεται από το ηλεκτρόδιο αναφοράς του ΚΗΚ είναι αμελητέο. Η ηλεκτρόλυση γίνεται παρουσία περίσσειας φέροντος ηλεκτρολύτη, σε απόλυτα ήρεμο διάλυμα (χωρίς ανάδευση), ώστε η μεταφορά των ηλεκτρενεργών ουσιών από την κύρια μάζα του διαλύματος στην επιφάνεια του HMDE να γίνεται πρακτικά μόνο με διάχυση. Μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων εφαρμόζεται συνεχώς μεταβαλλόμενη τάση Ε, κατά κανόνα ισοταχώς (συνήθως προς αρνητικότερες τιμές από +0.1 έως -1.9 V ως προς το ΚΗΚ) και καταγράφεται η ένταση του ρεύματος i (καθοδικό ρεύμα). Στην αρχή της ηλεκτρόλυσης παρατηρείται ένα πολύ ασθενές ρεύμα, το βασικό ρεύμα, που οφείλεται σε ίχνη ηλεκτρενεργών προσμίξεων του φέροντος ηλεκτρολύτη και σε χωρητική φόρτιση του HMDE. Όταν η τάση Ε 77

γίνει ίση με το δυναμικό αποσυνθέσεως της ηλεκτρενεργού ουσίας Α του διαλύματος, παρατηρείται γρήγορη αύξηση της εντάσεως του ρεύματος που συνεχίζεται μέχρι μια οριακή τιμή i 1 (ρεύμα κόρου ή ύψος κύματος), η οποία αντιστοιχεί στην αναγωγή ή οξείδωση όλων των μορίων ή ιόντων της ουσίας Α, που βρίσκονται πολύ κοντά στο ηλεκτρόδιο εργασίας HMDE (είναι αδύνατον να αυξηθεί περισσότερο ο ρυθμός προσελεύσεως νέων μορίων ή ιόντων της ουσίας Α στο HMDE αποκλειστικά και μόνο με διάχυση). Επειδή στην προκειμένη περίπτωση το ρεύμα κόρου οφείλεται πρακτικά στη διάχυση, η διαφορά i-i r ονομάζεται ρεύμα διαχύσεως i d. Η απότομη μεταβολή της εντάσεως i του ρεύματος καλείται πολαρογραφικό κύμα ή βαθμίδα, ενώ η καμπύλη εντάσεως-τάσεως αποτελεί το πολαρογράφημα, το οποίο λαμβάνεται αυτόματα από τον πολαρογράφο. Στην περίπτωση του μείγματος ηλεκτρενεργών ουσιών με σαφή διαφορά στο δυναμικό αποσυνθέσεως, λαμβάνονται διαδοχικά πολαρογραφικά κύματα [120]. Οι μεταβολές αυτές της εντάσης του ρεύματος εξαρτώνται από την τιμή της εφαρμοζόμενης τάσεως και από τη φύση και τη συγκέντρωση των ηλεκτρενεργών ουσιών, για αυτό και είναι δυνατή η ταυτοποίηση και ο προσδιορισμός των ουσιών αυτών από το διάγραμμα i d -Ε ως εξής: το δυναμικό που αντιστοιχεί στο σημείο της καμπύλης «έντασης-τάσης» στο οποίο i= i d /2 καλείται δυναμικό μισού κύματος ή δυναμικό ημικύματος Ε1/2, αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά για κάθε ηλεκτρενεργό ουσία υπό καθορισμένες συνθήκες και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίησή της. Το ρεύμα διαχύσεως i d είναι συνήθως ανάλογο της συγκεντρώσεως C (i d = k*ci, k: σταθερά αναλογίας) της ηλεκτρενεργού ουσίας στο διάλυμα και χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της. Στην απλούστερη περίπτωση η αρχή μέτρησης της πολαρογραφίας βασίζεται στην καταγραφή του ρεύματος που ρέει μέσω του DME ως ηλεκτροδίου εργασίας κατά τη διάρκεια μιας γραμμικής (άμεσης) αλλαγής της τάσης (κλασική άμεση πολαρογραφία ρεύματος). Το ηλεκτρόδιο καταμέτρησης είναι συνήθως ηλεκτρόδιο καλομέλανος ή χλωριούχου αργύρου, το οποίο αποτελεί και το ηλεκτρόδιο αναφοράς. [121] 78

Το ρεύμα που ρέει διαμέσου του ηλεκτροδίου εργασίας αποτελείται από δύο συνιστώσες: το φαρανταϊκό ρεύμα i f, το οποίο βασίζεται στην αναγωγή ή οξείδωση του αναλύτη και το χωρητικό ρεύμα i c, το οποίο προκαλείται μέσω της φόρτισης και αποφόρτισης της ηλεκτροχημικής διπλής στοιβάδας στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου εργασίας. Στους περισσότερους πολαρογραφικούς προσδιορισμούς το i f παρέχει το σήμα μέτρησης (χρήσιμο σήμα) και το i c την ανεπιθύμητη παρεμβολή. Στην πράξη το i c μπορεί να φθάσει μέχρι και την τιμή 10-7 Α, εμπίπτοντας στο εύρος του ρεύματος i d που προκύπτει για το διάλυμα ενός αναλύτη συγκέντρωσης 10-5 mol/l. Στην περίπτωση που i c = i f, τότε το χρήσιμο σήμα δεν μπορεί να διαχωριστεί από την ανεπιθύμητη παρεμβολή, δηλαδή το όριο ανίχνευσης για άμεσους πολαρογραφικούς προσδιορισμούς περιορίζεται από τη σχέση ανάμεσα στο χρήσιμο σήμα και στην παρεμβολή (επίσης γνωστή ως «αναλογία σήματος θορύβου»). Σχήμα 6.1 Σχέση μεταξύ φαρανταϊκού i f και του χωρητικού ρεύματος i c σε ένα πολαρογράφημα συνεχούς ρεύματος, i d το ρεύμα διαχύσεως (Πηγή: Henze 2003) Το ρεύμα διάχυσης i d είναι η μέγιστη τιμή του i f, η οποία λαμβάνεται όταν όλα τα μόρια του αναλύτη που έχουν μεταφερθεί στην επιφάνεια της σταγόνας υδραργύρου μέσω διάχυσης έχουν τροποποιηθεί πχ. αναχθεί ή οξειδωθεί (αντίδραση μεταφοράς φορτίου). Η σχέση μεταξύ του ρεύματος διάχυσης και της συγκέντρωσης του αναλύτη περιγράφεται από την εξίσωση Ilkovic: I d = 0,607 n D 1/2 m 2/3 t 1/6 C a όπου n ο αριθμός των ηλεκτρονίων που ανταλλάσσονται στην αντίδραση μεταφοράς φορτίου, D ο συντελεστής διάχυσης του αναλύτη, m ο ρυθμός 79

ροής του υδραργύρου, t d ο χρόνος ροής της σταγόνας υδραργύρου και C a η συγκέντρωση του αναλύτη. Ο πολαρογραφικός προσδιορισμός με μεγαλύτερη ευαισθησία είναι δυνατός μόνο εάν η αναλογία i f /i c μπορεί να βελτιωθεί με άλλες τεχνικές μέτρησης (πχ. αυξάνοντας το i f ή μειώνοντας το i c ). Για τη μερική εξάλειψη του χωρητικού ρεύματος δημιουργήθηκαν η πολαρογραφία συνεχούς ρεύματος (Direct Current-DC) και οι παλμικές μέθοδοι. Για την αύξηση του φαρανταϊκού ρεύματος δημιουργήθηκε η αναδιαλυτική βολταμμετρία, στην οποία ο αναλύτης συσσωρεύεται ηλεκτρολυτικά σε ένα σταθερό ηλεκτρόδιο εργασίας, πριν το βολταμμετρικό προσδιορισμό. Επίσης, η απόδοση των πολαρογραφικών και βολταμμετρικών μεθόδων έχει βελτιωθεί με τη χρήση του στατικού σταγονικού ηλεκτροδίου υδραργύρου (SMDE) και με την καταγραφή των πολαρογραφημάτων στα ψηφιακά όργανα μέσω γραμμικής σάρωσης [122]. Όργανα πολαρογραφίας Η διάταξη που απαιτείται για τις βολταμμετρικές μετρήσεις αποτελείται από τρία κύρια μέρη: Σύστημα μέτρησης (measuring stand) Σύστημα διασύνδεσης (interface) με μικροεπεξεργαστή Ηλεκτρονικό υπολογιστή Όσον αφορά το σύστημα της μέτρησης αυτό περιλαμβάνει: Ποτενσιοστάτη (ηλεκτρονική μονάδα με την οποία μπορεί να ελεγχθεί και να ρυθμιστεί επακριβώς η τιμή του ηλεκτροδίου εργασίας ως προς το δυναμικό ηλεκτροδίου αναφοράς τόσο για την προεπιλεγμένη διαμόρφωση του δυναμικού [τετραγωνικού κύματος, κανονική πολαρογραφία και πολαρογραφία διαφορικών παλμών] όσο και για πολαρογραφία εναλλασσόμενου ρεύματος) Ενισχυτή μέτρησης ρεύματος για τη μέτρηση καταγραφή της έντασης του ρεύματος Αναλογικοψηφιακό μετατροπέα 80

Ψηφιακοαναλογικό μετατροπέα Ρυθμιστές βαλβίδων αερίων Κυψελίδα μέτρησης τριών ηλεκτροδίων με αναδευτήρα. Εκτός από τα ηλεκτρόδια εργασίας και αναφοράς, η κυψελίδα μέτρησης περιλαμβάνει επίσης βοηθητικό ηλεκτρόδιο, η προσθήκη του οποίου προκαλεί μείωση στη ροή του ρεύματος μεταξύ του ηλεκτροδίου αναφοράς και του ηλεκτροδίου εργασίας. Ως εκ τούτου η ροή του ρεύματος λαμβάνει χώρα ανάμεσα στο ηλεκτρόδιο εργασίας και στο βοηθητικό, έτσι ώστε το ηλεκτρόδιο αναφοράς να λειτουργεί αποκλειστικά ως σημείο αναφοράς για τον καθορισμό του δυναμικού στο ηλεκτρόδιο εργασίας. Ως ηλεκτρόδιο αναφοράς συνήθως χρησιμοποιούνται τα ηλεκτρόδια Ag/AgCl, εκτός από το ηλεκτρόδιο καλομέλανος που χρησιμοποιείτο παλαιότερα. Όσον αφορά το απαιτούμενο σύστημα διασυνδέσεως (interface), εκεί πραγματοποιείται η επιλογή των πειραματικών συνθηκών (είδος μέτρησης, εύρος δυναμικού, χρόνοι απαέρωσης και ανάδευσης, γνωστή προσθήκη), οι οποίες από εκεί μεταφέρονται στο λειτουργικό σύστημα ελέγχου και υπολογισμών, όπου παράγονται τα αποτελέσματα. Οι σημαντικότεροι τύποι ηλεκτροδίων εργασίας είναι τα ηλεκτρόδια υδραργύρου ελεγχόμενα μέσω βαλβίδας, τα οποία αποτελούνται από λεπτά τριχοειδή με εσωτερική διάμετρο περίπου 50 μm συνδεδεμένα με δεξαμενή υδραργύρου. Η ροή του Hg ελέγχεται μέσω βαλβίδας, η οποία ανοίγει για μικρό χρονικό διάστημα (20-200 ms) και κλείνει ξανά γρήγορα προκειμένου να σχηματιστεί μια μεμονωμένη σταγόνα Hg με σταθερή επιφάνεια 0.1-0.6 mm 2 ή κατόπιν επανάληψης μια σειρά σταγόνων Hg. Το σταγονικό ηλεκτρόδιο Hg με σταθερό μέγεθος σταγόνας Hg πλεονεκτεί έναντι εκείνου του οποίου η επιφάνεια αυξάνεται όσο η σταγόνα πέφτει, καθώς το ρεύμα καταγράφεται κατά τη μέτρηση πάντοτε σε σταθερή επιφάνεια ηλεκτροδίου, ώστε να επιτευχθεί μεγαλύτερη ευαισθησία [123]. 81

Εφαρμογές πολαρογραφίας Η πολαρογραφία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό μεγάλου αριθμού ανόργανων και οργανικών ουσιών, μοριακών ή ιονικών, οι οποίες ανάγονται ή οξειδώνονται στο σταγονικό ηλεκτρόδιο Hg σε δυναμικά μεταξύ + 0.3V και - 2.8V ως προς ηλεκτρόδιο καλομέλανα. Η περιοχή των προσδιοριζόμενων συγκεντρώσεων μπορεί να εκτείνεται μέχρι και 10-8 M για τη διαφορική παλμική πολαρογραφία ή 10-10 Μ για την αναδιαλυτική βολταμμετρία. Κυριότερες εφαρμογές της πολαρογραφίας στην ποσοτική ανάλυση είναι οι εξής: 1.Προσδιορισμός μεταλλοϊόντων, μέσω κατάλληλης επιλογής φέροντος ηλεκτρολύτη, ph και συμπλεκτικών μέσων. Μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί και ανάλυση μίγματος μεταλλοϊόντων όταν τα δυναμικά ημικύματος διαφέρουν επαρκώς μεταξύ τους ώστε να εμφανίζεται διακριτό κύμα για κάθε ένα εξ αυτών και να δύναται να μετρηθεί το αντίστοιχο ρεύμα διάχυσης 2.Προσδιορισμός ανόργανων ανιόντων 3.Προσδιορισμός ουδέτερων μορίων π.χ. διαλυμένου οξυγόνου σε υδατικά διαλύματα, οξειδίων αζώτου και θείου, H 2 O 2 κλπ 4.Προσδιορισμός οργανικών ουσιών και χαρακτηριστικών ομάδων και παρακολούθηση της κινητικής πολλών οργανικών αντιδράσεων [124]. 6.3 Προσδιορισμός της ικανότητας σύμπλεξης ιόντων χαλκού σε ροφήματα καφέ Η συμπλεκτική ικανότητα αναφέρεται κυρίως στο χαλκό λόγω της μεγάλης του εκλεκτικότητας για τους οργανικούς υποκαταστάτες. Αποτελεί μέταλλο με ιδιαίτερα μεγάλη βιολογική σημασία για τους οργανισμούς και σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα τα οποία επηρεάζουν έντονα τη βιοδιαθεσιμότητά του [125]. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της συμπλεκτικής ικανότητας ως προς ιόντα χαλκού, η οποία χρησιμοποιήθηκε και στην παρούσα εργασία είναι η Διαφορική Παλμική Ανοδική Αναδιαλυτική 82

Βολταμμετρία (DPASV) με τη χρήση σταγονικού ηλεκτροδίου υδραργύρου. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη και ακριβής και αποκλείει κάθε επηρεασμό των αποτελεσμάτων από κινητικούς παράγοντες [126]. Ο προσδιορισμός συμπλεκτικής ικανότητας μετάλλου (MeCC) σε αδρανή συστήματα βασίζεται σε διαγράμματα (Σχημα 6.2) που αναπαριστούν τη μετρούμενη ένταση του ηλεκτρικού ρεύματος (i) συναρτήσει της συγκέντρωσης (προσθήκη γνωστής ποσότητας) του μετάλλου (C Me ) και τα οποία εξαρτώνται από την ισχύ της σύμπλεξης. Σε ευκίνητα συστήματα τα διαγράμματα αυτά εξαρτώνται επίσης από το συντελεστή διάχυσης των οργανικών υποκαταστατών. Βάσει των συγκεκριμένων διαγραμμάτων (σχήμα 6.2) η συμπλεκτική ικανότητα προσδιορίζεται (α) σε αδρανή συστήματα από την προέκταση του ευθύγραμμου τμήματος της καμπύλης β στον άξονα των τετμημένων (ευθεία γ) και (β) σε ευκίνητα συστήματα από τον εντοπισμό του σημείου όπου καταγράφεται αλλαγή στην κλίση της καμπύλης (έχει επέλθει κορεσμός των υποκαταστατών). Το σημείο αυτό σε αρκετές περιπτώσεις είναι δύσκολο να εντοπιστεί με ακρίβεια και για αυτό θα πρέπει να αποφεύγεται ο προσδιορισμός της συμπλεκτικής ικανότητας σε ευκίνητα συστήματα [127]. Σχήμα 6.2 Διάγραμμα διαφορικής παλμικής πολαρογραφίας, προσθήκης γνωστής ποσότητας μετάλλου (C Me ) για αδρανή φυσικά συστήματα. Η καμπύλη (α) αντιστοιχεί σε μηδενική συγκέντρωση υποκαταστατών (C L =0), η καμπύλη (β) σε μη μηδενική συγκέντρωση υποκαταστατών (C L 0) και το τμήμα (γ) στην προέκταση του παράλληλου με την ευθεία (α) τμήματος της καμπύλης (β). Το σημείο τομής του τμήματος (γ) με τον άξονα x αντιστοιχεί στην τιμή της προσδιοριζόμενης συμπλεκτικής ικανότητας (CC). (Πηγή: Davison 1978) 83

Στο σχήμα 6.3 δίνεται ένα παράδειγμα βολταμμογραφήματος το οποίο αντιστοιχεί σε οξυνισμένο δείγμα στιγμιαίου καφέ έπειτα από την προσθήκη πρότυπου διαλύματος ιόντων χαλκού ώστε η συγκέντρωση του δείγματος σε χαλκό να αντιστοιχεί σε 50 μg/l. Σχήμα 6.3 Βολταμμογράφημα οξυνισμένου δείγματος στιγμιαίου καφέ, έπειτα από προσθήκη προτύπου διαλύματος ιόντων χαλκού ώστε η συγκέντρωση του δείγματος σε χαλκό να αντιστοιχεί σε 50μg/L. Στο σχήμα 6.4 δίνονται τα βολταμμογραφήματα που λαμβάνονται για το δείγμα που ελήφθη από το στιγμιαίο καφέ στο φυσικό ph, έπειτα από προσθήκες πρότυπου διαλύματος ιόντων χαλκού ώστε η συγκέντρωση του δείγματος σε χαλκό να αντιστοιχεί σε 20, 30, 40, 50 και 70 μg/l. Σχήμα 6.4 Βολταμμογραφήματα που αντιστοιχούν σε διαδοχικές προσθήκες προτύπου διαλύματος ιόντων χαλκού για το δείγμα στιγμιαίου καφέ στο φυσικό ph. 84

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 7.1 Προετοιμασία ροφημάτων καφέ 7.1.1 Espresso Παρασκευάζονται δεκαπέντε ροφήματα καφέ espresso, που ανά 5 θα ενοποιηθούν προς 3 δείγματα (Espresso I, Espresso II, Espresso III) με τη βοήθεια καφετιέρας espresso, πιέσεως 15bar. Θεωρούμε ως serving size τα 60 ml και χρησιμοποιούμε 14 g καφέ (διπλή δόση) και νερό βρύσης. Επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία για όλα τα δείγματα. Πίνακας 7.1 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Espresso I Αρ. Όγκος Στερεό % Απόδοση % Υγρασία Δείγματος (ml) εκχύλισμα (g) σε στερεό 1 60 2.77 19.79 95.38 2 60 2.95 21.07 95.08 3 60 2.72 19.43 95.47 4 60 2.73 19.50 95.45 5 60 2.80 20.00 95.33 Ολικό (Espresso I) 13.97 Μ.Ο: 95.34 Πίνακας 7.2 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Espresso II Αρ. Όγκος Στερεό % Απόδοση % Υγρασία Δείγματος (ml) εκχύλισμα (g) σε στερεό 6 60 2.55 18.21 95.75 7 60 2.73 19.50 95.45 8 60 2.59 18.50 95.68 9 60 2.64 18.86 95.60 10 60 2.73 19.50 95.45 Ολικό (Espresso II) 13.24 M.O: 95.58 85

Πίνακας 7.3 Υγρασία, στερεό υπόλειμμα εκχύλισμα Espresso III Αρ. Δείγματος Στερεό εκχύλισμα (g) % Aπόδοση σε στερεό % Υγρασία Όγκος (ml) 11 60 2.80 20.00 95.33 12 60 2.68 19.14 95.53 13 60 2.62 18.71 95.63 14 60 2.62 18.71 95.63 15 60 2.70 19.29 95.50 Ολικό (Espresso IIΙ) 13.42 Μ.Ο: 95.52 Η ποικιλία του καφέ espresso που χρησιμοποιήθηκε ήταν 100% Arabica. 7.1.2 Καφές φίλτρου Παρασκευάζονται δεκαπέντε ροφήματα καφέ φίλτρου, που ανά 5 θα ενοποιηθούν προς 3 δείγματα (Filter I, Filter II, Filter III) με τη βοήθεια καφετιέρας. Για το Filter I διαλύουμε μία κουταλιά Γαλλικού καφέ, δηλαδή 6.686 g σε 300 ml νερού (περίπου 2.2 g/ 100 ml) και έπειτα ακολουθείται η ίδια διαδικασία για όλα τα δείγματα. Αρ. Δείγματος Πίνακας 7.4 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Filter I Όγκος (ml) Στερεό εκχύλισμα (g) % Απόδοση σε στερεό % Υγρασία 1 60 0.41 30.66 99.16 2 60 0.41 30.66 99.16 3 60 0.40 29.91 99.16 4 60 0.41 30.66 99.15 5 60 0.41 30.66 99.16 Ολικό (Filter I) 2.04 Μ.Ο: 99.15 Αρ. Δείγματος Πίνακας 7.5 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Filter II Όγκος (ml) Στερεό εκχύλισμα (g) % Απόδοση σε στερεό % Υγρασία 6 60 0.41 30.66 99.2 7 60 0.38 28.41 99.18 8 60 0.41 30.66 99.18 9 60 0.41 30.66 99.32 10 60 0.41 30.66 99.19 Ολικό (Filter II) 2.02 Μ.Ο: 99.21 86

Αρ. Δείγματος Πίνακας 7.6 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Filter III Όγκος (ml) Στερεό εκχύλισμα (g) % Απόδοση σε στερεό % Υγρασία 11 60 0.39 29.16 99.17 12 60 0.36 26.92 99.24 13 60 0.42 31.40 99.15 14 60 0.43 32.15 99.14 15 60 0.40 29.91 99.13 Ολικό (Filter III) 2.00 Μ.Ο: 99.17 Η ποικιλία του καφέ φίλτρου που χρησιμοποιήθηκε ήταν 100% Arabica. 7.1.3 Στιγμιαίος καφές Παρασκευάζονται δεκαπέντε ροφήματα στιγμιαίου καφέ, που ανά 5 θα ενοποιηθούν προς 3 δείγματα (Instant I, Instant II, Instant III). Για το Instant I διαλύεται μία κουταλιά στιγμιαίου καφέ, δηλαδή 3.0008 g, σε 250 ml νερού (περίπου 1.2 g/ 100 ml)και έπειτα ακολουθείται η ίδια διαδικασία για όλα τα δείγματα. Αρ. Δείγματος Πίνακας 7.7 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Instant I Όγκος (ml) Στερεό εκχύλισμα (g) % Απόδοση σε στερεό % Υγρασία 1 50 0.50 83.33 98.99 2 50 0.54 90 97.85 3 50 0.56 93.33 97.80 4 50 0.55 91.66 97.85 5 50 0.57 95 97.75 Ολικό (Instant I) 2.72 Μ.Ο: 98.05 Αρ. Δείγματος Πίνακας 7.8 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Instant II Όγκος (ml) Στερεό εκχύλισμα (g) % Απόδοση σε στερεό % Υγρασία 6 50 0.52 86.66 98.98 7 50 0.59 98.33 97.66 8 50 0.58 96.66 97.68 9 50 0.59 98.33 97.65 10 50 0.59 98.33 97.25 Ολικό (Instant II) 2.89 Μ.Ο: 97.84 87

Πίνακας 7.9 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα δείγματος Instant III Αρ. Δείγματος Όγκος (ml) Στερεό εκχύλισμα (g) % Απόδοση σε στερεό % Υγρασία 11 50 0.47 78.33 99.05 12 50 0.51 85 97.97 13 50 0.51 85 97.97 14 50 0.52 86.66 97.94 15 50 0.51 85 97.98 Ολικό (Instant III) 2.53 Μ.Ο: 98.18 7.1.4 Ελληνικός καφές Παρασκευάζονται διπλοί καφέδες με δύο κουταλάκια καφέ (4.358 gr το ένα) και 140 ml νερό, δηλαδή η συγκέντρωση του καφέ είναι περίπου 6.2 g/100 ml. Μετά το βράσιμο κάθε διπλού καφέ, το ρόφημα χωρίζεται σε δύο ποτήρια ζέσεως των 100 ml, όπου στο ένα εισάγεται ο ελληνικός καφές γρήγορης κατανάλωσης και στο άλλο ελληνικός καφές αργής κατανάλωσης. Καφές «γρήγορης κατανάλωσης» (Γρήγορο/Fast): Καφές που πίνεται σχετικά βιαστικά. Κάθε πέντε λεπτά λαμβάνεται μία δόση (γουλιά) από κάθε ποτήρι έως ότου τελειώσει το υγρό και μείνει μόνο το κατακάθι. Συνολικά, 6 δόσεις-γουλιές. Καφές «αργής κατανάλωσης» (Αργό/Slow): Καφές που πίνεται σχετικά αργά. Κάθε δέκα λεπτά λαμβάνεται μία δόση (γουλιά) από κάθε ποτήρι έως ότου τελειώσει το υγρό και μείνει μόνο το κατακάθι. Συνολικά 6 δόσεις-γουλιές. Για κάθε δείγμα παρασκευάστηκαν τρεις διπλοί καφέδες, δηλαδή δύο καφέδες ανά βράσιμο. Τέλος συλλέχθηκαν, για κάθε δείγμα, σε ένα ποτήρι ζέσεως τα υγρά από τρία βρασίματα και σε ένα άλλο τα κατακάθια τους. Παρασκευάστηκαν τρία δείγματα «γρήγορα» και τρία «αργά». Δηλαδή συνολικά δεκαοχτώ καφέδες. Κάθε δείγμα χωρίστηκε σε έξι αποστειρωμένα ποτήρια με βιδωτό πώμα των 100 ml. 88

Πίνακας 7.10 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα ροφημάτων ελληνικού καφέ Αρ. Δείγματος Υγρό (g) Στερεό εκχύλισμα (g) % Υγρασία Greek Fast I 330 7.37 97.77 Greek Fast II 322 6.55 97.97 Greek Fast III 325 6.87 97.89 Greek Slow I 315 6.70 97.87 Greek Slow II 332 6.80 97.95 Greek Slow III 335 6.70 98 Πίνακας 7.11 Υγρασία, στερεό εκχύλισμα στο ίζημα(κατακάθι) του ελληνικού καφέ Αρ. Δείγματος Υγρό (g) Στερεό εκχύλισμα (g) % Υγρασία Greek Fast I 85.79 17.38 79.74 Greek Fast II 91.2 17.99 80.27 Greek Fast III 89.61 17.75 80.19 Greek Slow I 93.59 18.37 80.37 Greek Slow II 93.51 22 76.47 Greek Slow III 78.8 17.74 77.49 Ο ελληνικός καφές που χρησιμοποιήθηκε ήταν χαρμάνι των ποικιλιών Arabica και Robusta. 7.2 Λυοφιλίωση δειγμάτων Τα δείγματα φυλάχθηκαν στην κατάψυξη στους -80 ο C για 72 h, ώστε να μην αυξηθεί σημαντικά η θερμοκρασία τους κατά τη μεταφορά τους για λυοφιλίωση και δεν επιτευχθεί σωστή εξάχνωση. Έπειτα σφραγίστηκαν με Parafilm το οποίο τρυπήθηκε σε διάφορα σημεία, για να είναι δυνατή η εξάχνωση του νερού από τα δείγματα (λυοφιλίωση) και τέλος μεταφέρθηκαν στον λυοφιλιωτή (HetoLyolab 3000, Heto-Holten, Allerod, Denmark). Μετά από διάστημα 4 ημερών, αφού είχε ολοκληρωθεί η διαδικασία της λυοφιλίωσης, τα δείγματα είχαν πλέον την μορφή πούδρας. Τα ξηρά στερεά εκχυλίσματα καφέ των υποδειγμάτων κάθε δείγματος ενοποιήθηκαν, οπότε προέκυψαν συνολικά 15 ομογενοποιημένα δείγματα στερεών εκχυλισμάτων ροφημάτων καφέ, τα οποία και φυλάχθηκαν στην κατάψυξη στους -20 ο C. 89

Επιπρόσθετα, παρασκευάσθηκαν μεθανολικά εκχυλίσματα των στερεών εκχυλισμάτων, τα οποία και φυλάχθηκαν στους -20 ο C [128]. Πίνακας 7.12 Μεθανολικά εκχυλίσματα λυοφιλιοποιημένων δειγμάτων καφέ. Δείγμα mg δείγματος/ 1mL MeOH Espresso I 5.4 Espresso II 5.2 Espresso III 5 Filter I 5 Filter II 5 Filter III 5.1 Instant I 5.3 Instant II 5.3 Instant III 5 Greek Fast I 5.2 Greek Fast II 5.2 Greek Fast III 5.2 Greek Slow I 5.3 Greek Slow II 5.3 Greek Slow III 5.3 7.3 Μελέτη σύμπλεξης ιόντων χαλκού 7.3.1 Προετοιμασία δειγμάτων καφέ Ζυγίζονται δείγματα αφυδατωμένων ροφημάτων καφέ, με εύρος βάρους ανά δείγμα 5-12 mg, σε αναλυτικό ζυγό και ακολούθως διαλυτοποιούνται με διςαπιονισμένο νερό φέρονται σε ογκομετρικές φιάλες των 100 και 50 ml. Πίνακας 7.13 Βάρος κ.ο. δειγμάτων καφέ Δείγμα mg δείγματος/ 100mL Η 2 Ο Espresso I 11.2 Espresso II 11.5 Espresso III 10.5 Filter I 4.9 Filter II 5.3 Filter III 4.9 Instant I 5.1 Instant II 5 Instant III 6.5 Greek Fast I 7.2 Greek Fast II 6.9 Greek Fast III 6.3 Greek Slow I 6.1 Greek Slow II 7.3 Greek Slow III 6.5 90

7.3.2 Προσδιορισμός συμπλεκτικής ικανότητας και σταθεράς σχηματισμού ιόντων Cu Η πορεία προσδιορισμού συμπλεκτικής ικανότητας και σταθεράς σχηματισμού ιόντων χαλκού φαίνεται στο σχήμα 7.1. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για τους προσδιορισμούς της συμπλεκτικής ικανότητας και της σταθεράς σχηματισμού τοποθετήθηκαν στο ψυγείο μέχρι την ανάλυσή τους, εντός σύντομου χρονικού διαστήματος. Για την παρασκευή των οξυνισμένων δειγμάτων (ph=2) που ακτινοβολήθηκαν από λυχνία UV, για 48 h, λαμβάνονται 50 ml από κάθε δείγμα τα οποία εισάγονται σε φιαλίδια TEFLON και ακολούθως προστίθενται 50 μl πυκνού HCl στο καθένα. Μέσω της ακτινοβόλησης οξυνισμένου δείγματος επιτυγχάνεται η πλήρης διάσπαση των εν δυνάμει υποκαταστατών των ιόντων χαλκού και ως αποτέλεσμα μέσω της τιτλοδότησης του συγκεκριμένου δείγματος είναι δυνατός ο προσδιορισμός της ευαισθησίας / απόκρισης του ηλεκτροχημικού αναλυτή στις διαδοχικές προσθήκες γνωστής ποσότητας ιόντων χαλκού. Η αναλυτική μέθοδος που εφαρμόστηκε είναι η Διαφορική Παλμική Ανοδική Αναδιαλυτική Βολταμμετρία (DPASV, Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry). Η τεχνική αυτή θεωρείται ως η πλέον κατάλληλη για τη μέτρηση της συμπλεκτικής ικανότητας των ιόντων χαλκού. Ο προσδιορισμός της συμπλεκτικής ικανότητας πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη γνωστών ποσοτήτων πρότυπου διαλύματος ιόντων χαλκού σε δείγμα, τόσο σε φυσικό ph (~8.0) όσο και σε ph=2. Για τις μετρήσεις στον ηλεκτροχημικό αναλυτή τόσο σε φυσικό ph όσο και σε ph=2 κάθε φορά προστίθετο στην κυψελίδα μέτρησης ποσότητα δείγματος ίση με 25 ml και 5 σταγόνες ηλεκτρολύτη. 91

Σχήμα 7.1: Σχηματική αναπαράσταση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των μετρήσεων που πραγματοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συμπλεκτικής ικανότητας. 92

Για την ακτινοβόληση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε λυχνία UV ισχύος 750 W (Philips). Οι ηλεκτροχημικές μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με τον ηλεκτροχημικό αναλυτή ECO-CHEMIE συνδεδεμένο με κυψελίδα μέτρησης τριών ηλεκτροδίων της Metrohm (VA 663) (Εικόνες 7.1 και 7.2). Εικόνα 7.1: Ηλεκτροχημικός αναλυτής ECO-CHEMIE συνδεδεμένος με μέτρησης τριών ηλεκτροδίων της Metrohm (VA 663). κυψελίδα Εικόνα 7.2: Κυψελίδα μέτρησης του ηλεκτροχημικού αναλυτή μαζί με τα ηλεκτρόδια. 93

Οι πειραματικές συνθήκες που εφαρμόστηκαν στον ηλεκτροχημικό αναλυτή είναι οι ακόλουθες (Plavsic et al. 1982): Χρόνος απαέρωσης με άζωτο (Ν 2 ): 5 λεπτά (για τα πρώτα 25 ml δείγματος) και 30 δευτερόλεπτα για κάθε επόμενη προσθήκη πρότυπου διαλύματος χαλκού. Πίεση μέσου απαέρωσης: 1.2 bar Χρόνος απόθεσης: 120 s Χρόνος εξισορρόπησης πριν από τη μέτρηση: 30 s Δυναμικό απόθεσης: -0.6 V Χρόνος διαμόρφωσης: 0.04 s Διάστημα χρόνου:0.31 s Πλάτος διαμόρφωσης: 25 mv Βήμα δυναμικού: 5 mv Στο σχήμα 7.2 παριστάνονται χαρακτηριστικά βολταμμογραφήματα που αντιστοιχούν σε διαδοχικές προσθήκες προτύπου δ/τος ιόντων Cu, ενώ στο σχήμα 7.3 ένα χαρακτηριστικό βολταμμογράφημα οξυνισμένου και ακτινοβολημένου δείγματος έπειτα από προσθήκη ιόντων Cu. Σχήμα 7.2: Βολταμμογραφήματα που αντιστοιχούν σε διαδοχικές προσθήκες προτύπου διαλύματος ιόντων χαλκού για δείγμα στιγμιαίου καφέ (Ιnstant III) στο φυσικό ph. 94

Σχήμα 7.3: Βολταμογράφημα οξυνισμένου και ακτινοβολημένου δείγματος στιγμιαίου καφέ (Instant III) στο οποίο έχει γίνει προσθήκη 50 μg/l Cu. Για κάθε δείγμα που αναλύθηκε ελήφθησαν οι καμπύλες τιτλοδότησης της συγκέντρωσης του προστιθέμενου χαλκού (Cu added) (μg/l) (άξονας χ) συναρτήσει της έντασης του ρεύματος (i/a) (άξονας ψ) για τα δείγματα σε φυσικό ph και ph=2 (σχήμα 7.4). Σχήμα 7.4: Καμπύλες τιτλοδότησης δείγματος στιγμιαίου καφέ (Instant III) για ph=2 και ph=8. Οι απόλυτες τιμές της συμπλεκτικής ικανότητας και της αντίστοιχης σταθεράς σχηματισμού των συμπλόκων χαλκού των δειγμάτων που αναλύονται υπολογίζονται με εφαρμογή του διαγράμματος Ruzic (Ruzic, 1982). Αναλυτικά, αρχικά λαμβάνεται η ευθεία καμπύλη του λόγου Μ/(Μ Τ -Μ) (άξονας 95

ψ) ως προς Μ (άξονας χ), (σχήμα 7.5), όπου Μ είναι το ελεύθερο μεταλλικό ιόν και Μ Τ -Μ είναι το συμπλεγμένο μέταλλο (όπου Μ Τ είναι η συνολική ποσότητα του μετάλλου) (Ruzic 1982, Van de Berg 1982). H σταθερά σχηματισμού (Κ app ) προσδιορίζεται από την τεταγμένη επί την αρχή της ευθείας (τεταγμένη=1/κ app CCCu), ενώ από την κλίση της ευθείας (κλίση=1/cccu) προσδιορίζεται η συμπλεκτική ικανότητα των ιόντων χαλκού. Σχήμα 7.5: Διάγραμμα Ruzic δείγματος στιγμιαίου καφέ (Instant III). Ευθεία καμπύλη του λόγου Μ/(Μ Τ -Μ) (του ελεύθερου ιοντικού χαλκού προς το συμπλεγμένο) ως προς Μ (τον ελεύθερο ιοντικό χαλκό). 7.4 Προσδιορισμός ολικού χαλκού Για τον προσδιορισμό του ολικού χαλκού πραγματοποιήθηκε χώνευση με τη χρήση π. HNO 3 ορισμένης ποσότητας αφυδατωμένου ροφήματος καφέ (περίπου 100 μg) σε θερμοκρασία 120 ºC για 12 ώρες. Χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλα δοχεία από Teflon τα οποία προηγουμένως είχαν παλαιωθεί. Ο προσδιορισμός του χαλκού πραγματοποιήθηκε με φασματομετρία ατομικής απορρόφησης με φούρνο γραφίτη και διόρθωση υποβάθρου σήματος με εφαρμογή του φαινομένου Zeeman (Varian, SpectrAA 640Z). 96

7.5 Προσδιορισμός ολικού οργανικού άνθρακα (TOC) Για τον προσδιορισμό του ολικού οργανικού άνθρακα εφαρμόστηκε η μέθοδος της καταλυτικής οξείδωσης σε υψηλή θερμοκρασία (HTCO, High Temperature Catalytic Oxidation) και χρησιμοποιήθηκε ο αναλυτής διαλυτού οργανικού άνθρακα TOC-5000A της Shimadzu (Sugimura and Suzuki 1988). Τα δείγματα οξυνίστηκαν με HCl 2 M σε ph<2 και στη συνέχεια διαβιβάστηκε σε αυτά υπερκάθαρο οξυγόνο για περίπου 12 λεπτά ώστε να απομακρυνθεί πλήρως ο ανόργανος άνθρακας ως CO 2. Έπειτα, τα δείγματα διαβιβάζονται σε καταλύτη πληρωμένο με Pt-Al 2 O 3 στους 680 o C. Με αυτή τη διαδικασία, ο οργανικός άνθρακας οξειδώνεται πλήρως και το διοξείδιο του άνθρακα που παράγεται μετράται σε ανιχνευτή IR [129]. 7.6 Προσδιορισμός επιφανειοδραστικών και καταλυτικά ενεργών ουσιών Προσδιορίσθηκε για πρώτη φορά η συγκέντρωση των επιφανειοδραστικών ουσιών (SAS) και των καταλυτικά ενεργών ενώσεων (CAC), σε ph 8.2 και 5.1, σε ροφήματα καφέ. Ο προσδιορισμός πραγματοποιείται σε αυτές τις τιμές pη, δεδομένου ότι η εγγύτητα των σταθερών διάστασης του ρυθμιστικού διαλύματος και του καταλύτη αποτελεί προϋπόθεση για την εμφάνιση του καταλυτικού μηχανισμού. Επίσης, η καταλυτική δράση των διαφόρων ουσιών σχετίζεται με την παρουσία ατόμων S, Ν, Ο και Ρ στα οργανικά μόρια. Σε pη 8.2 ανιχνεύονται οι οργανικές αζωτούχες ενώσεις, μιας και στην πλειοψηφία τους οι σταθερές διάστασής τους βρίσκονται σε αυτή την τιμή ph. Εν αντιθέσει, σε pη 5.1 το θειικό άλας και οι καρβοξυλικές ομάδες των οργανικών μορίων θεωρούνται ότι διίστανται, προκαλώντας την καταλυτική δραστικότητα των ιόντων Η. Για τον προσδιορισμό των SAS παρασκευάσθηκαν υδατικά διαλύματα αφυδατωμένων ροφημάτων καφέ συγκεντρώσεως 10 mg/l. Για τον προσδιορισμό των CAC παρασκευάσθηκαν διαλύματα αφυδατωμένων ροφημάτων καφέ αναδιαλυμένα σε NaCl (0.55M) τελικής συγκεντρώσεως 10 mg/l (με προσθήκη όξινου ρυθμιστικού διαλύματος για μετρήσεις σε ph 5.1 και τη χρήση θαλασσινού νερού απαλλαγμένο από οργανικές ενώσεις για τις 97

μετρήσεις σε ph 8.2). Τα δείγματα μετρήθηκαν αμέσως μετά την παρασκευή τους. Η ηλεκτροχημική μέτρηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του οργάνου μautolab type III (Eco-Chemie, Ολλανδία), το οποίο είναι συνδεδεμένο με κυψελίδα τριών ηλεκτροδίων, από τα οποία ως ηλεκτρόδιο εργασίας θεωρείται αυτό του υδραργύρου (SMDE) και ως ηλεκτρόδιο αναφοράς το Ag AgCl (3 Μ KCl) [130]. 7.7 Προσδιορισμός του συνολικού φαινολικού περιεχομένου με τη μέθοδο Folin- Ciocalteu Η μέθοδος βασίζεται σε οξειδοαναγωγική αντίδραση με την οποία προσδιορίζεται το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο χωρίς διάκριση μεταξύ μονομερών, διμερών και πολυμερών φαινολικών συστατικών. Το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu είναι διάλυμα σύνθετων πολυμερών ιόντων που σχηματίζονται από φωσφομολυβδαινικά και φωσφοβολφραμικά ετεροπολυμερή οξέα. Οξειδώνει τα φαινολικά ιόντα με ταυτόχρονη αναγωγή των ετεροπολυμερών οξέων σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση, της οποίας δεν είναι γνωστή η στοιχειομετρία: P 2 W 18 O -7 62 H 4 P 2 W 18 O -8 62, H 6 P 2 Mo 18 O -6-7 62 H 6 P 2 Mo 18 O 62 Το προϊόν είναι σύμπλοκο μολυβδαινίου-βολφραμίου (Mo-W) χαρακτηριστικής μπλε χρώσης που απορροφά στο ορατό (750 nm). Η αλκαλικότητα ρυθμίζεται με κορεσμένο διάλυμα Na 2 CO 3 (20% w/v) που αφενός δε διαταράσσει την σταθερότητα του F-C και του προϊόντος της αντίδρασης, αφετέρου αποτελεί προϋπόθεση παρουσίας των φαινολικών ιόντων. Αναλυτική Πορεία Σε ένα φιαλίδιο eppedorf τοποθετούνται 790 μl απιονισμένου νερού και έπειτα 10 μl δείγματος αφυδατωμένου ροφήματος, αναδιαλυμένου σε μεθανόλη, συγκέντρωσης 5 mg/ml ή καθαρής μεθανόλης για την παρασκευή του τυφλού δείγματος. Στη συνέχεια, προστίθενται 50 μl αντιδραστηρίου F-C. Ακολουθεί ανάδευση, ενώ μετά το πέρας 1min προστίθενται επίσης 150μL κορεσμένου διαλύματος Na 2 CO 3 (20% w/v). Το μίγμα ανακινείται εκ νέου και 98

φυλάσσεται σε σκοτεινό μέρος, για 120 min, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το προϊόν της αντίδρασης φωτομετρείται στα 750nm, με τη βοήθεια φασματοφωτομέτρου διπλής δέσμης, ως προς το λευκό δείγμα, ενώ κατασκευάζεται και πρότυπη καμπύλη αναφοράς με καφεϊκό οξύ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε mg ισοδύναμα καφεϊκού οξέος. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς Παρασκευάζονται διαλύματα καφεϊκού οξέος συγκεντρώσεων 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800 mg/l. Ακολουθείται η διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό διαγράμματος ψ=f(x),όπου x η ποσότητα του καφεϊκού οξέος (CA) σε mg/l και ψ η απορρόφηση στα 750 nm. 7.8 Αντιοξειδωτικές δοκιμές 7.8.1 Εκτίμηση αντιοξειδωτικής ικανότητας βασιζόμενη στη δέσμευση της 1,1-διφαίνυλο-2-πικρυλο-υδράζυλο ελεύθερης ρίζας (DPPH ) Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα των αντιοξειδωτικών ουσιών να δεσμεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH. Η δέσμευση αυτής της σταθερής ελεύθερης ρίζας έχει ως αποτέλεσμα το διάλυμα να αποχρωματίζεται. Η ελάττωση της απορρόφησης μετράται στα 515 nm, με τη βοήθεια φασματοφωτομέτρου διπλής δέσμης. Αναλυτική Πορεία Σε φιαλίδια eppendorf προστίθενται 25 μl δείγματος αφυδατωμένου ροφήματος, αναδιαλυμένου σε μεθανόλη, συγκέντρωσης 1mg/mL ή μεθανόλης για το λευκό προσδιορισμό και 975 μl DPPH [Διάλυμα DPPH σε MeOH (3,9 mg σε 100 ml)]. Ακολουθεί ανάδευση και αφήνονται σε σκοτεινό μέρος για 30min. Η απορρόφηση μετράται σε t=0 min και t=30 min στα 515 nm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα Trolox (ανάλογο της βιταμίνης E) μέσω της πρότυπης καμπύλης. 99

Κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς Παρασκευάζονται διαλύματα Trolox συγκεντρώσεων 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,4, 1,6 mm. Ακολουθείται η διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό διαγράμματος ψ=f(x),όπου x η ποσότητα του Trolox σε mm και ψ η %ΔΑ515, όπου: %ΔΑ 515 = [(Α 0 515 Α 30 515) / Α 0 515] x100 7.8.2 Προσδιορισμός αναγωγικής ικανότητας μέσω αναγωγής του Fe +3 σε Fe +2 (FRAP) Η δοκιμή FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) μετρά την αντιοξειδωτική δράση όλων των συστατικών του διαλύματος της αντίδρασης που μπορούν να δράσουν αναγωγικά, μετρώντας την αναγωγική τους δύναμη. Η δοκιμή FRAP βασίζεται στη δυνατότητα των συστατικών του δείγματος να ανάγουν το σύμπλοκο TPTZ-Fe(III) σε έγχρωμο (μπλε) σύμπλοκο TPTZ-Fe(II). Αναλυτική Πορεία Σε ένα φιαλίδιο eppendorf αναμιγνύονται 50 μl διαλύματος αφυδατωμένου ροφήματος αναδιαλυμένου σε μεθανόλη συγκεντρώσεως 1 mg/ml, με 50 μl FeCl3 (3 mm σε 5 mm HCl) ή 50 μl απιονισμένο νερό για τη παρασκευή του λευκού δείγματος. Ακολουθεί καλή ανάδευση και το μίγμα αφήνεται να αντιδράσει για 30 min σε υδατόλουτρο στους 37 o C. Στη συνέχεια, προστίθενται 900 μl διαλύματος TPTZ (2,4,6-τριπυριδυλο-s-τριαζίνη, 1mM σε 0,05 Μ HCl) και ακολουθεί ανάδευση. Ο Fe +2 που έχει προκύψει δημιουργεί έγχρωμο (μπλε) σύμπλοκο με το TPTZ. Το δείγμα παραμένει για 10 min στο σκοτάδι και ακολουθεί μέτρηση της απορρόφησης στα 620nm, με τη βοήθεια φασματοφωτομέτρου διπλής δέσμης. Παράλληλα κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς βιταμίνης C (η βιταμίνη C ανάγει το Fe +3 σε Fe +2 ) και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα ασκορβικού οξέος. 100

Κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς Παρασκευάζονται διαλύματα ασκορβικού οξέος συγκεντρώσεων 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 mm. Ακολουθείται η διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό διαγράμματος ψ=f(x),όπου x η ποσότητα του ασκορβικού οξέος σε mm και ψ η απορρόφηση στα 620 nm. 7.8.3 Προσδιορισμός χρόνου αντίστασης του ορού του αίματος στην οξείδωση Ο ρόλος των λιποπρωτεϊνών LDL (Low Density Lipoprotein) είναι να μεταφέρουν τη χοληστερόλη στους περιφερειακούς ιστούς και να ρυθμίζουν τη de novo σύνθεσή της στους ιστούς αυτούς [131]. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε βασίζεται στην οξείδωση της LDL, που θεωρείται το πρώτο στάδιο του μηχανισμού που οδηγεί στο σχηματισμό αθηρωματικής πλάκας και εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως τη διατροφή, τον τρόπο ζωής κ.λπ. Κατά την οξείδωση της LDL παράγονται λιποειδικά υπεροξείδια,η κινητική της παραγωγής των οποίων καταγράφεται με φωτομέτρηση στα 245 nm με φωτόμετρο ELISA. Η καθυστέρηση έναρξης της οξείδωσης (χρόνος επαγωγής) σε δείγμα ελέγχου (control) και στο υπό αξιολόγηση εκχύλισμα εκφράζεται ως χρόνος αντίστασης του ορού στην οξείδωση (LagTime). Εάν κάποιο εκχύλισμα προκαλέσει αύξηση του χρόνου αντίστασης του ορού σε σχέση με αυτόν του control, αυτό αποτελεί ένδειξη ότι το τρόφιμο από το οποίο προέρχεται θα εμφανίζει αντιαθηρογόνο δράση στο σώμα μας. Αναλυτική Πορεία Παρασκευάζεται διάλυμα CuSO4 3 ml συγκεντρώσεως 200 μμ, το οποίο και θα χρησιμοποιηθεί ως οξειδωτικό μέσο. Για το μίγμα CuSO4 και PBS λαμβάνονται 21 ml διαλύματος PBS (διάλυμα 9 g NaCl, 0.9076 g Na2HPO4 2H2O, 0.2408 g NaH2PO4 2H2O σε 1000 ml H2O) στο οποίο προστίθενται 2 ml CuSO4. Δείγμα αίματος 20 ml φυγοκεντρείται και παραλαμβάνεται ο ορός. Στη συνέχεια παρασκευάζεται το διάλυμα ορού με προσθήκη 170 μl ορού και 1830 μl ρυθμιστικού διαλύματος PBS. Σε κάθε πηγαδάκι του well plate flat bottom τοποθετούνται 20 μl αραιωμένου ορού και 101

στη συνέχεια 1 μl μεθανολικού εκχυλίσματος αφυδατωμένων ροφημάτων καφέ συγκεντρώσεως 0.01μL/L. Ως δείγμα ελέγχου (control) χρησιμοποιείται 1 μl μεθανόλης. Η αντίδραση ξεκινά με την προσθήκη 230 μl μίγματος CuSO4 και PBS. Γίνεται μέτρηση της απορρόφησης στα 245 nm για 5 h ανά 2 min σε φωτόμετρο ELISA. Ο υπολογισμός του Lag time (Σχήμα 7.6) γίνεται από το λογισμικό του φωτομέτρου. Σχήμα 7.6: Κινητική της οξείδωσης της LDL και υπολογισμός του Lag time (σημείο Β) από μετρήσεις απορρόφησης. 7.9 Προσδιορισμός απλών πολυφαινολών με αέρια χρωματογραφία/ φασματοσκοπία μάζας (GC-MS) Οι απλές πολυφαινόλες προσδιορίσθηκαν με αέρια χρωματογραφία φασματοσκοπία μάζας των τριμεθυλσιλυλαιθέρων τους. Ο αέριος χρωματογράφος που χρησιμοποιήθηκε είναι ένα σύστημα της Agilent (Wallbronn, Germany) HP series 6890 N εφoδιασμένος με ανιχνευτή HP 5973 MS (ΕΙ, ηλεκτρονιακού ιονισμού 70 ev), εισαγωγέα split- splitless και αυτόματο δειγματολήπτη HP 7683. Για την ανάλυση 1 μl σιλυλιωμένου δείγματος εισάγεται στον εισαγωγέα θερμοκρασίας 220 ο C με λόγο σχάσης (split ratio) δείγματος προς φέρον αέριο 1:10. Η γραμμή μεταφοράς του δείγματος στον ανιχνευτή μάζας τέθηκε στους 280 ο C. H στήλη που χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό ήταν HP-5MS (Agilent) 30 m x 0.2mm x 0.25μm και το φέρον αέριο ήταν Ηe υψηλής καθαρότητας, με ροή 0,7 ml/min. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα που χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό ήταν: αρχική θερμοκρασία 70 ο C επί 5min, άνοδος θερμοκρασίας στους 130 102

ο C με ρυθμό 15 ο C/min, άνοδος στους 160 ο C με ρυθμό 4 ο C/min παραμονή επί 15min και τελικά άνοδος στους 300 ο C όπου παραμένει επί 15 min. Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη μέθοδο SIM Mode. Στη μέθοδο αυτή, που χρησιμοποιήθηκε για προσδιορισμό 27 απλών πολυφαινολών, γίνεται καταγραφή επιλεγμένων ιόντων-θραυσμάτων (selective ion monitoring SIM- GC/MS) χαρακτηριστικών των προς προσδιορισμό συστατικών, τα οποία έχουν βρεθεί από μέτρηση σιλυλιωμένων παραγώγων προτύπων ουσιών. Ο ποιοτικός προσδιορισμός (ανίχνευση) των συστατικών βασίζεται στην παρουσία στο χρωματογράφημα τριών χαρακτηριστικών για κάθε συστατικό ιόντων, σε χρόνο κατακράτησης (RT) 0.05 min του αναμενόμενου χρόνου κατακράτησης των συστατικών στα πρότυπα διαλύματα. O ποσοτικός προσδιορισμός βασίζεται σε ένα από τα τρία ιόντα που ορίζεται ως ιόν στόχος (target ion), ενώ επιβεβαιώνεται από τους λόγους της έντασης απόκρισης των άλλων 2 ιόντων (qualifier ions) προς την ένταση απόκρισης του ιόντος στόχου στο δείγμα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός έγινε με τη μέθοδο εσωτερικού προτύπου. Ως τέτοιο επελέγη η 3-(4-υδροξυ-φαινυλο)-1-προπανόλη. Μια σειρά προτύπων διαλυμάτων μιγμάτων των συστατικών που προσδιορίζονται οδήγησε στην κατασκευή καμπυλών αναφοράς για κάθε συστατικό σε περιοχή συγκεντρώσεων από 80 3500 ng/ml. Οι καμπύλες αναφοράς ήταν γραμμικές με συντελεστές γραμμικής συσχέτισης R 2 > 0.996 για όλες τις ουσίες που προσδιορίσθηκαν. Επιπρόσθετα ελήφθησαν χρωματογραφήματα του συνόλου των ιόντων των συστατικών των δειγμάτων (μέθοδος SCAN που καταγράφει το συνολικό ρεύμα ιόντων (TIC total ion current), με σκοπό την ανίχνευση και άλλων χλωρογενικών οξέων. Παρασκευή δειγμάτων Σε φιαλίδια GC (GC vials) προστίθενται 100 μl από κάθε μεθανολικό εκχύλισμα των αφυδατωμένων ροφημάτων, καθώς και 50 μl εσωτερικού προτύπου (3-(4-υδροξυφαινυλο)-1-προπανόλη). Ακολουθεί συμπύκνωση σε φυγοκεντρικό εξατμιστήρα κενού (Speed Vac) μέχρι ξηρού. Μετά την εξάτμιση 103

του διαλύτη πραγματοποιείται παραγωγοποίηση των δειγμάτων με προσθήκη 250 μl σιλυλιωτικού αντιδραστηρίου BSTFA (Bis(trimethylsily) trifluoroacetamide) και θέρμανση σε υδατόλουτρο στους 70 ο C για 20 λεπτά. Φύλαξη σε βαθιά ψύξη (-20 C) για προσδιορισμό απλών πολυφαινολών με GC- MS. 7.10 Προσδιορισμός λιπαρών οξέων και στερολών Αφυδατωμένα ροφήματα καφέ (0.2 g) ζυγίστηκαν με ακρίβεια σε σωλήνες με βιδωτό πώμα καλυμμένο εσωτερικά με Teflon, και εκχυλίσθηκαν με εξάνιο (3 5 ml). Μετά την παραλαβή και εξάτμιση του διαλύτη, έγινε σαπωνοποίηση των λιπαρών οξέων με προσθήκη υδροξειδίου του καλίου σε μεθανόλη (2 ml, 0.5 M) και θέρμανση στους 95 C επί 20 min. 7.10.1 Παρασκευή μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων και τριμεθυλσιλυλαιθέρων των φυτοστερολών Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν οι μεθυλεστέρες των λιπαρών οξέων με προσθήκη 1,5 ml BF 3 /MeOH και θέρμανση στους 95 C επί 3 min. Ακολούθησε προσθήκη 4 ml κορεσμένου διαλύματος χλωριούχου νατρίου και 2 ml εξανίου, ισχυρή ανάδευση και φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 5 min. Η υπερκείμενη οργανική στοιβάδα παραλήφθηκε και διαμοιράσθηκε σε δύο φιαλίδια αεριοχρωματογραφίας. Το πρώτο φιαλίδιο (300 μl από την υπερκείμενη οργανική στοιβάδα) σφραγίσθηκε και αποθηκεύθηκε σε βαθιά ψύξη ( 20 C), έως ότου αναλυθεί για τον προσδιορισμό των λιπαρών οξέων με GC. Στο δεύτερο φιαλίδιο (1300 μl από την υπερκέιμενη οργανική στοιβάδα) προστέθηκε 200 μl εσωτερικού προτύπου 5-α-χολεστάνιο και αφού εξατμίσθηκαν οι διαλύτες σε Speed Vac, τα φιαλίδια σφραγίστηκαν και τα δείγματα σιλυλιώθηκαν με BSTFA στους 70 C επί 20 min. Τα σιλυλιωμένα δείγματα φυλάχθηκαν σε βαθιά ψύξη ( 20 C), μέχρι να προσδιορισθούν οι φυτοστερόλες τους με GC/MS. 104

Πίνακας 7.14 Ζυγίσεις για προσδιορισμό λιπαρών οξέων και φυτοστερολών Δείγμα Υγρασία (%) 7.10.2 Προσδιορισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με GC/FID Βάρος δείγματος (g) Για τον προσδιορισμό χρησιμοποιήθηκε αεριοχρωματογράφος HP6890 της Agilent (Hewlett Packard) εφοδιασμένος με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (Flame Ionization Detector, FID), ανιχνευτή μάζας MS 6890 (Mass Selective Detector, MSD) και αυτόματο δειγματολήπτη HP 7673. Λιπίδια (g) Λιπαρά (% dw) Λιπαρά (mg/l fw) Espresso I 95.34 0.2003 0.0074 3.69 1719.5 Espresso II 95.58 0.1998 0.0067 3.35 1480.7 Espresso III 95.52 0.2007 0.0074 3.68 1648.6 Filter I 99.15 0.2010 0.0015 0.74 62.9 Filter II 99.21 0.1997 0.0022 1.10 86.9 Filter III 99.17 0.1999 0.0022 1.10 91.3 Instant I 98.05 0.2001 0.0020 0.99 193.1 Instant II 97.85 0.2000 0.0015 0.75 161.3 Instant III 98.18 0.1999 0.0017 0.85 154.7 Greek Fast I 97.77 0.2007 0.0136 6.77 1509.7 Greek Fast II 97.97 0.2007 0.0130 6.47 1313.4 Greek Fast III 97.85 0.2002 0.0138 6.89 1481.4 Greek Slow I 97.97 0.1999 0.0141 7.05 1431.2 Greek Slow II 97.95 0.2007 0.0154 7.67 1572.4 Greek Slow III 98 0.1998 0.0149 7.45 1490 Ο διαχωρισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων έγινε σε τριχοειδή στήλη BPX70 (SGE, Melbourne, Australia) (50% ΡΗ phenylmethylpolysiloxane), μήκους 60m, εσωτερικής διαμέτρου 0.25 mm και πάχους εσωτερικής επικάλυψης 0.25μm. Χρησιμοποιήθηκε ήλιο ως φέρον αέριο με ροή 0.8 ml/min ενώ η θερμοκρασία του εισαγωγέα του δείγματος και του ανιχνευτή ήταν 230 και 290 C αντίστοιχα. Για την ανάλυση γινόταν εισαγωγή -με ένεση- 1 μl δείγματος στο χρωματογράφο με διαχωρισμό ροής (split mode) δείγματος προς φέρον αέριο 1:20. Έτσι τελικά το 1/20 του 1 μl εισαγόταν στην στήλη. Η θερμοκρασία του φούρνου του χρωματογράφου ακολούθησε το πρόγραμμα: αρχική θερμοκρασία 130 C, αύξηση με ρυθμό 3 C/min έως τους 250 C όπου και παρέμεινε σταθερή επί 15 min. Για την ταυτοποίηση των κορυφών, οι χρόνοι κατακράτησης των λιπαρών οξέων καταγράφηκαν αρχικά με ανάλυση πολυπροτύπου 37 μεθυλεστέρων 105

λιπαρών οξέων της Sigma (Sigma L9405, St Louis, MO, USA) με χρήση του ανιχνευτή μάζας και με τη βοήθεια των βιβλιοθηκών (NIST και WILEY) του ανιχνευτή μάζας. Στη συνέχεια έγινε χρήση του ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και τα πρότυπα παρεμβάλλονταν σε τακτά διαστήματα, ώστε αφ ενός μεν να καταγράφονται τυχόν μικρές μεταβολές στους χρόνους κατακράτησης των συστατικών και αφ ετέρου για υπολογισμό των συντελεστών απόκρισης (response factors, RF) των διαφόρων λιπαρών οξέων, ώστε να διορθώνονται τα εμβαδά των αντιστοίχων χρωματογραφικών κορυφών. Τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν ως % του συνόλου των λιπαρών οξέων. 7.10.3 Προσδιορισμός φυτοστερολών με GC/MS Ο αέριος χρωματογράφος χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα σύστημα της Agilent (Wallbronn, Germany) HP series 6890 N εφoδιασμένος με ανιχνευτή HP 5973 MS (ΕΙ, ηλεκτρονιακού ιονισμού 70 ev), εισαγωγέα split-splitless και αυτόματο δειγματολήπτη HP 7683. Για την ανάλυση 1 μl σιλυλιωμένου δείγματος εισάγεται στον αεριοχρωματογράφο (splitless mode). H στήλη που χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό ήταν HP-5MS (Agilent) 30 m x 0.2 mm x 0.25 μm και το φέρον αέριο ήταν Ηe υψηλής καθαρότητας, με ροή 1 ml/min. Η θερμοκρασία του εισαγωγέα και της γραμμής μεταφοράς του δείγματος στον ανιχνευτή μάζας ρυθμίσθηκαν στους 250 C και 300 C αντίστοιχα. H θερμοκρασία φούρνου ήταν αρχικά 210 C, αυξήθηκε στους 300 C με ρυθμό 5.5 C /min και παρέμεινε στους 300 C επί 15 min. Η ταυτοποίηση των φυτοστερολών έγινε βάσει των χρόνων κατακράτησης, και με τη χρήση των ηλεκτρονικών βιβλιοθηκών φασμάτων μάζας Wiley και NIST 2005, των φασμάτων μάζας προτύπων ουσιών και βιβλιογραφικών δεδομένων. Η ποσοτικοποίηση έγινε με χρήση 5-α-χολεστανίου ως εσωτερικού προτύπου και καμπύλες αναφοράς που κατασκευάσθηκαν με πρότυπα διαλύματα β- σιτοστερόλης που περιείχαν την ίδια ποσότητα εσωτερικού προτύπου με τα προς ανάλυση δείγματα. Η ποσοτικοποίηση της καμπεστερόλης, στιγμαστερόλης και Δ7-αβεναστερόλης βασίσθηκε στην καμπύλη αναφοράς της β-σιτοστερόλης. 106

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8.1 Οργανικός άνθρακας Οι συγκεντρώσεις του ολικού οργανικού άνθρακα στα δείγματα που ελήφθησαν από τα ροφήματα καφέ παρουσιάζονται στον πίνακα 8.1. Οι εν λόγω συγκεντρώσεις εμφανίζουν διακύμανση από 1.9 έως 14.9 g/l. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις οργανικού άνθρακα προσδιορίστηκαν σε δείγματα που προέρχονται από ρόφημα καφέ espresso (μέση συγκέντρωση 12653.7 mg/l), ακολουθούμενες από τον ελληνικό καφέ «αργής» και «γρήγορης» κατανάλωσης (μέση συγκέντρωση 6559.0 mg/l και 6250.9 mg/l αντίστοιχα) και το στιγμιαίο καφέ (μέση συγκέντρωση 2906.9 mg/l). Οι μικρότερες συγκεντρώσεις οργανικού άνθρακα προσδιορίστηκαν στα δείγματα που ελήφθησαν από τον καφέ φίλτρου (μέση συγκέντρωση 2018.2 mg/l). Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις οργανικού άνθρακα ανά μερίδα καφέ - 60 ml δηλαδή για τον espresso, τον καφέ φίλτρου και τον ελληνικό καφέ «γρήγορης» και «αργής» κατανάλωσης, και 50 ml για το στιγμιαίο καφέ - προσδορίστηκαν για τον καφέ espresso 759.2 mg/cup, 121.1 mg/cup για τον καφέ φίλτρου, 145.3 mg/cup για το στιγμιαίο καφέ, 375.1 mg/cup για τον ελληνικό «γρήγορης» κατανάλωσης και 393.5 mg/cup για τον ελληνικό καφέ «αργής» κατανάλωσης. Πίνακας 8.1 Συγκεντρώσεις (mg/l) στερεού εκχυλίσματος και TOC. Στις παρενθέσεις φαίνονται οι ποσότητες κάθε παραμέτρου ανά μερίδα καφέ (60 ml για espresso, φίλτρου και ελληνικό και 50 ml για το στιγμιαίο καφέ). Δείγμα Στερεό εκχύλισμα TOC Espresso 45.1 (2.7) 12653.7 ± 1944.5 (759.2 ± 116.7 ) Filter 6.7 (0.4) 2018.2 ± 129.7 (121.1 ± 7.8) Instant 10.8 (0.5) 2906.9 ± 428.5 (145.3 ± 21.4) Greek fast 23.0 (1.3) 6250.9 ± 72.6 (375.1 ± 4.4) Greek slow 22.6 (1.3) 6559 ± 711.0 (393.5 ± 42.7) 107

Σχήμα 8.1 Συγκέντρωση ολικού οργανικού άνθρακα σε ροφήματα καφέ. 8.2 Συμπλεκτική ικανότητα ιόντων χαλκού και σταθερά σχηματισμού συμπλόκων Οι συγκεντρώσεις της L Τ παρουσιάζουν σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών καφέ που μελετήθηκαν με διακύμανση από 69.0 μm έως 429.6 μμ. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις συμπλεκτικής ικανότητας ως προς ιόντα χαλκού προσδιορίστηκαν σε ροφήματα ελληνικού καφέ «γρήγορης» κατανάλωσης και espresso (μέση συγκέντρωση 363.9 μμ και 361 μm αντίστοιχα). Ακολουθούν οι συγκεντρώσεις που ελήφθησαν για τα δείγματα από ελληνικό καφέ «αργής» κατανάλωσης (μέση συγκέντρωση 234.2 μm) καθώς και εκείνες που ελήφθησαν για το στιγμιαίο καφέ (μέση συγκέντρωση 167.4 μm). Οι μικρότερες τιμές συμπλεκτικής ικανότητας προσδιορίστηκαν για τα δείγματα που ελήφθησαν από τον καφέ φίλτρου (μέση συγκέντρωση 74.6 μm) (Πίνακας 8.2). Οι αντίστοιχες συμπλεκτικές συγκεντρώσεις ανά μερίδα καφέ (50 ml για το στιγμιαίο καφέ και 60 ml για τους υπόλοιπους) είναι 21.7 μmol/cup για τον espresso, 4.5 μmol/cup για τον καφέ φίλτρου, 8.4 μmol/cup για το στιγμιαίο, ενώ για τον ελληνικό είναι 21.8 μmol/cup και 14.1 μmol/cup για τον καφέ «γρήγορης» και «αργής» κατανάλωσης αντίστοιχα. 108

Πίνακας 8.2 Συγκεντρώσεις συμπλεκτικής ικανότητας ιόντων Cu (L T ) Δείγμα LT (μm) LT (μmol)/cup Espresso 361 ± 61.8 21.7 ± 3.7 Filter 74.6 ± 5.4 4.5 ± 0.3 Instant 167.4 ± 18.3 8.4 ± 0.9 Greek fast 363.9 ± 8.7 21.8 ± 0.5 Greek slow 234.2 ± 30.0 14.1 ± 1.8 Σχήμα 8.2 Συγκεντρώσεις συμπλεκτικής ικανότητας ιόντων Cu (L T ) σε ροφήματα καφέ. Όσον αφορά στη σταθερά σχηματισμού των συμπλόκων χαλκού (logk), οι τιμές της εμφάνισαν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δειγμάτων των ροφημάτων καφέ, κυμαινόμενες από 6.4 έως 9.2. Η μέγιστη τιμή της σταθεράς σχηματισμού προσδιορίστηκε στα ροφήματα ελληνικού καφέ «αργής» κατανάλωσης (μέση τιμή 8.9). Ο ελληνικός καφές «γρήγορης» κατανάλωσης και ο καφές φίλτρου εμφανίζουν σταθερά σχηματισμού συμπλόκων με παρόμοια διακύμανση τιμών (μέση τιμή 7.9 και στις δύο είδη καφέ). Ακολουθεί ο στιγμιαίος καφές (μέση τιμή 7.2) ενώ οι χαμηλότερες τιμές της σταθεράς σχηματισμού ελήφθησαν από τα ροφήματα καφέ espresso (μέση τιμή 6.6) (Πίνακας 8.3). Πίνακας 8.3 Τιμές σταθερών σχηματισμού συμπλόκων Cu (logk) Δείγμα logk Espresso 6.6 ± 0.2 Filter 7.9 ± 0.1 Instant 7.2 ± 0.1 Greek fast 7.9 ± 0.2 Greek slow 8.9 ± 0.3 109

Σχήμα 8.3 Τιμές σταθερών σχηματισμού συμπλόκων Cu. 8.3 Ολικός χαλκός ροφημάτων καφέ Οι συγκεντρώσεις ολικού χαλκού διέφεραν μεταξύ των διαφόρων ροφημάτων, με τον ελληνικό καφέ «αργής» κατανάλωσης να παρουσιάζει τις υψηλότερες συγκεντρώσεις (μέση συγκέντρωση 107 μg/l). Ακολουθεί ο ελληνικός καφές «γρήγορης» κατανάλωσης (μέση συγκέντρωση 97.0 μg/l) και στη συνέχεια ο espresso (μέση συγκέντρωση 47.5 μg/l). Τόσο ο καφές φίλτρου, όσο και ο στιγμιαίος παρουσίασαν τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις ολικού χαλκού (μέση συγκέντρωση 16.9 μg/l και 12.3 μg/l αντίστοιχα) (Πίνακας 8.4). Πίνακας 8.4 Συγκεντρώσεις ολικού χαλκού. Στις παρενθέσεις φαίνονται οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις ανά μερίδα ροφήματος. Δείγμα TCu (μμ) TCu (μg/l) Espresso 0.8 ± 0.1 47.5 ± 5.7 (2.9 ± 0.3) Filter 0.3 ± 0.1 16.9 ± 8.9 (1.0 ± 0.5) Instant 0.2 ± 0.1 12.3 ± 5.1 (0.6 ± 0.3) Greek fast 0.8 ± 0.6 97.0 ± 11.3 (5.8 ± 0.7) Greek slow 1.6 ± 0.2 107 ± 14.7 (6.4 ± 0.9) Το γεγονός ότι σε κανένα από τα ροφήματα καφέ οι συγκεντρώσεις του ολικού χαλκού δεν υπερβαίνουν αυτές τις L Τ αποδεικνύει πως ο χαλκός που εμπεριέχεται στα ροφήματα καφέ είναι πλήρως συμπλεγμένος. Ακολουθεί το συγκριτικό διάγραμμα συγκεντρώσεων L Τ και ολικού χαλκού (Σχήμα 8.4). 110

Σχήμα 8.4 Συγκριτικό διάγραμμα συγκεντρώσεων L T και ολικού Cu. 8.4 Επιφανειοδραστικές ουσίες και καταλυτικά ενεργές ουσίες σε ροφήματα καφέ Οι συγκεντρώσεις των επιφανειοδραστικών ουσιών (SAS) παρουσιάζουν διαφοροποιήσεις μεταξύ των διαφορετικών ροφημάτων καφέ, με τον espresso να παρουσιάζει τη μέγιστη μέση συγκέντρωση (1354 mg/l eq. T-X-100). Ακολουθούν οι δύο τύποι ελληνικού καφέ, «γρήγορης» και «αργής» κατανάλωσης (με μέσες συγκεντρώσεις 662 mg/l eq. T-X-100 και 667 mg/l eq. T-X-100 αντίστοιχα), ο στιγμιαίος καφές (μέση συγκέντρωση 298 mg/l eq. T-X-100), ενώ τις μικρότερες τιμές συγκεντρώσεων παρουσίασε ο καφές φίλτρου (206 mg/l eq. T-X-100). Στην πλειοψηφία των δειγμάτων υπήρχε παρουσία ενεργών καταλυτικών ενώσεων (CAC) σε ph 5.1, με τον καφέ φίλτρου να παρουσιάζει τη μέγιστη τιμή συγκεντρώσεων (194300 mg/l eq. xanthan), ακολουθούμενος από τον καφέ espresso (μέση συγκέντρωση 182325 mg/l eq. xanthan) ενώ οι συγκεντρώσεις στον ελληνικό καφέ ήταν αρκετά χαμηλότερες (944668 και 56580 mg/l eq. xanthan για τον ελληνικό καφέ «αργής» και «γρήγορης» κατανάλωσης αντίστοιχα). Τις μικρότερες όμως τιμές συγκεντρώσεων παρουσίασε ο στιγμιαίος καφές (6718 mg/l eq. xanthan). Σε ph 8.2 οι μέσες συγκεντρώσεις των ενεργών καταλυτικών ουσιών είναι σαφώς μικρότερες, σε σύγκριση με αυτές σε ph 5.1. Τις υψηλότερες 111

συγκεντρώσεις CAC σε ph 8.2 διαθέτει ο καφές espresso (45 mg/l eq. HSA). Ακολουθεί ο ελληνικός καφές «αργής» κατανάλωσης (34 mg/l eq. HSA), ο στιγμιαίος καφές (28 mg/l eq. HSA), ο ελληνικός καφές «γρήγορης» κατανάλωσης (9 mg/l eq. HSA ) με μεγάλη απόκλιση από τις τιμές συγκεντρώσεων του ελληνικού «αργής» κατανάλωσης και τελευταίος ο καφές φίλτρου (7 mg/l eq. HSA). Τα αποτελέσματα των SAS και CAC παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 8.5). Πίνακας 8.5 Συγκεντρώσεις SAS και CAC (mg/l) σε ροφήματα καφέ. Στις παρενθέσεις φαίνονται οι συγκεντρώσεις ανά μερίδα καφέ (mg/60ml για espresso, φίλτρου και ελληνικό και mg/50ml για το στιγμιαίο καφέ). Δείγμα SAS eq. T-X-100 CAC ph 8.2 eq. HSA CAC ph 5.1 eq. xanthan Espresso 1354 (81.2) 45 (2.7) 182325 (10940) Filter 206 (12.3) 7 (0.4) 194300 (11658) Instant 298 (14.9) 28 (1.4) 6718 (336) Greek fast 662 (39.7) 9 (0.5) 56580 (3395) Greek slow 667 (40) 34 (2.0) 94468 (5668) 8.5 Συνολικό φαινολικό περιεχόμενο (μέθοδος Folin- Ciocalteu) Το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο που περιέχει μια κούπα ροφήματος καφέ κυμαίνεται από 31.9 έως 359.3 mg CAE. Το ρόφημα με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση πολυφαινολών βρέθηκε να είναι ο espresso (μέση συγκέντρωση 317.1 mg CAE/ cup), ακολουθούμενος από τον ελληνικό καφέ (μέση συγκέντρωση 154.4 και 152.1 mg CAE/ cup για τον ελληνικό καφέ «αργής» και «γρήγορης» κατανάλωσης αντίστοιχα). Σχετικά χαμηλή βρέθηκε η συγκέντρωση των πολυφαινολών στον καφέ φίλτρου (μέση συγκέντρωση 42.1 mg CAE/ cup), ενώ παρόμοιες περίπου συγκεντρώσεις παρουσίασε και ο στιγμιαίος καφές (35.7 mg CAE/ cup) (Πίνακας 8.6). 112

Πίνακας 8.6 Συνολικό φαινολικό περιεχόμενο των ροφημάτων, εκφρασμένο σε mg ισοδύναμων καφεϊκού οξέος(cae). Δείγμα mg CAE/cup mg CAE/L Espresso 317.1 ± 39.2 5285.0 ± 654.1 Filter 42.1 ± 3.8 702.2 ± 63.5 Instant 35.7 ± 3.3 714.8 ± 67.1 Greek fast 152.1 ± 3.6 2536.4 ± 60.7 Greek slow 154.4 ± 6.1 2574.1 ± 102.4 8.6 Αντιοξειδωτική δράση Εξετάσθηκε η ικανότητα των ροφημάτων καφέ να δρουν ως φυσικά αντιοξειδωτικά, μελετώντας την ικανότητα δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH και αναγωγής του Fe 3+ σε Fe 2+. Αναφορικά με την κατάταξη των ροφημάτων, σε σχέση με την αντιοξειδωτική τους δράση, είναι παρόμοια και στις δυο τεχνικές προσδιορισμού της. Συγκεκριμένα, ο καφές espresso παρουσιάζει τη μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση (μέση συγκέντρωση eq. Trolox και eq. Ascorbic acid 111.9 mg/cup και 23.9 mg/cup αντίστοιχα). Ακολουθεί ο ελληνικός καφές «γρήγορης» κατανάλωσης και με μικρή διαφορά ο «αργής» κατανάλωσης (52.1 mg/cup eq. Trolox και 0.7 mg/cup eq. Ascorbic acid για τον fast και 48 mg/cup eq. Trolox και 0.2 mg/cup eq. Ascorbic acid για τον slow), ενώ ο καφές φίλτρου και ο στιγμιαίος παρουσιάζουν τη μικρότερη αντιοξειδωτική δράση, τόσο ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH όσο και ως προς την αναγωγική τους δύναμη (13.5 mg/cup eq. Trolox και 0.2 mg/cup eq. Ascorbic acid για τον καφέ φίλτρου και 13.1 mg/cup eq. Trolox και 0.1 cup eq. Ascorbic acid για τον slow). Τα αποτελέσματα παρατίθενται στον Πίνακα 8.7. Πίνακας 8.7 Ικανότητα των ροφημάτων του καφέ να δεσμεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH, (εκφρασμένη σε mg ισοδύναμων Trolox (ΤΕ)) και αναγωγική δύναμη αυτών (εκφρασμένη σε mg ισοδύναμων ασκορβικού οξέος ΑΑΕ). Δείγμα mg TE/cup mg TE/L mg AAE/cup mg AAE/L Espresso 111.9 ± 17 1865.2 ± 284 1.4 ± 0.1 23.9 ± 3.1 Filter 13.5 ± 2.7 225.4 ± 45.9 0.2 ± 0.0 3.2 ± 0.1 Instant 13.1 ± 0.9 263.5 ± 19.7 0.1 ± 0.0 3.3 ± 0.2 Greek fast 52.1 ± 3.9 868.6 ± 65.9 0.7 ± 0.0 12.6 ± 1.0 Greek slow 48 ± 1.4 800.1 ± 23.3 0.2 ± 0.0 4.3 ± 0.3 113

Όσον αφορά στον προσδιορισμό του χρόνο αντίστασης του ορού του αίματος στην οξείδωση, τα ροφήματα καφέ έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Τον υψηλότερο χρόνο αντίσταστης στην οξείδωση παρουσίασε ο ορός που εμπεριείχε ελληνικό καφέ «γρήγορης» κατανάλωσης (3741.7 sec.). Ακολουθήσε εκείνος με τον ελληνικό καφέ «αργής» κατανάλωσης (3538.5 sec.) και με μικρή διαφορά ο ορός με τον espresso (3325.5 sec.). Ο καφές φίλτρου και ο στιγμιαίος καφές φάνηκε πως καθυστερούν την οξείδωση του ορού λιγότερο από τα υπόλοιπα ροφήματα (2884.8 και 22203.8 sec. αντιστοίχως). Πίνακας 8.8 Χρόνος αντίστασης του ορού του αίματος στην οξείδωση (σε sec.) Δείγμα LagTime Espresso 3325.5 ± 295.2 Filter 2884.8 ± 361.2 Instant 2203.8 ± 507.8 Greek fast 3741.7 ± 256.3 Greek slow 3538.5 ± 260.7 Σχήμα 8.5 LagTime ροφημάτων καφέ (σε hours) 114

8.7 Απλές πολυφαινόλες Προσδιορίσθηκαν οι απλές πολυφαινόλες που περιέχονται σε ροφήματα καφέ. Σε όλα τα ροφήματα το χλωρογενικό οξύ ήταν κυρίαρχο υπερβαίνοντας το 99% των συνολικών πολυφαινολών. Ακόμη, υψηλότερη συγκέντρωση σε σύγκριση με τις υπόλοιπες πολυφαινόλες έχει και το καφεϊκό οξύ χωρίς ωστόσο να πλησιάζει τις πολύ υψηλές τιμές του χλωρογενικού οξέος. Πίνακας 8.9 Απλές πολυφαινόλες και τερπενικά οξέα (μg/cup) σε ροφήματα καφέ Espresso Filter Instant Greek fast Greek slow Βανιλλίνη 17.4 ± 6.3 4.7 ± 0.7 3.6 ± 0.3 6.7 ± 0.3 6.5 ± 0.6 Κινναμωμικό οξύ 39.6 ± 11.6 5.6 ± 1.8 5.0 ± 2.2 11.8 ± 5.3 12.2 ± 3.8 Τυροσόλη 1.4 ± 0.4 0.4 ± 0.2 0.5 ± 0.1 0.7 ± 0.3 0.5 ± 0.1 p-oh- Βενζοϊκό oξύ 61.8 ± 14.8 8.7 ± 3.0 7.8 ± 2.0 16.9 ± 8.9 13.7 ± 2.3 p-oh- φαινυλοξικό οξύ - - - - - Ομοβαννιλική αλκοόλη - - - - - Φλωρετικό οξύ - - - - - Βαννιλικό οξύ 37.8 ± 10.9 4.4 ± 0.2 2.8 ± 0.5 7.6 ± 2.8 5.6 ± 0.3 Ομοβαννιλικό οξύ - - - - - o-κουμαρικό οξύ - - - - - Πρωτοκατεχικό οξύ 42.3 ± 18.8 3.8 ± 2.2 4.5 ± 0.8 8.9 ± 3.8 7.1 ± 1.5 3,4 δι- OHφαινυλοξικό οξύ - - - - - Συριγκικό οξύ 8.9 ± 3.3 0.6 ± 0.1 3.8 ± 2.0 7.9 ± 11.0 3.0 ± 1.3 p- Κουμαρικό οξύ 31.3 ± 8.2 3.2 ± 1.3 13.8 ± 3.2 15.8 ± 18.1 5.4 ± 2.2 Γαλλικό οξύ - - - - - Φερουλικό οξύ 81.2 ± 28.4 9.5 ± 4.4 20.0 ± 10.0 43.0 ± 53.1 16.6 ± 5.6 Καφφεϊκό οξύ 202.7 ± 64.2 37.3 ± 15.5 30.2 ± 7.3 143.3 ± 59.2 131.8 ± 39.7 Σιναπικό οξύ 3.5 ± 0.3 1.0 ± 1.2 0.8 ± 0.5 3.1 ± 2.8 1.8 ± 0.6 Ρεσβερατρόλη - - - - - Χρυσίνη 68.1 ± 53.9 10.8 ± 9.9 7.6 ± 3.6 21.3 ± 9.4 31.0 ± 14.9 Επικατεχίνη - - - - - Ναριγκενίνη 40.5 ± 4.1 9.1 ± 10.2 11.6 ± 7.4 42.8 ± 64.05 10.2 ± 4.5 Κατεχίνη - - - - - Γενιστεΐνη - - - - - Καμπφερόλη 1.4 ± 0.0 0.5 ± 0.5 1.3 ± 0.9 4.1 ± 6.3 1.0 ± 0.6 Χλωρογενικό οξύ 110851.3 ± 8652.5 ± 927.8 ± 101881.0 ± 90142.5 ± 29209.8 1132.8 254.9 28909.5 2623.3 Κερκετίνη 65.2 ± 0.8 12.4 ± 1.3 12.7 ± 4.9 36.6 ± 13.2 27.4 ± 1.7 Μυρισετίνη - - - - - Ολεανολικό οξύ 31.5 ± 42.3 1.3 ± 1.8 4.0 ± 2.8 31.3 ± 49.8 13.3 ± 13.6 Ουρσολικό οξύ 32.3 ± 32.3-7.8 ± 7.2 31.7 ± 54.8 13.3 ± 8.4 Πίνακας 8.9 Απλές πολυφαινόλες και τερπενικά οξέα (μg/l) σε ροφήματα καφέ 115

Πίνακας 8.10 Απλές πολυφαινόλες και τερπενικά οξέα (μg/l) σε ροφήματα καφέ Espresso Filter Instant Greek fast Greek slow Βανιλλίνη 289.3 ± 105.6 78.0 ± 11.0 71.5 ± 6.9 111.2 ± 5.6 108.6 ± 10.2 Κινναμωμικό οξύ 659.6 ± 193.2 93.7 ± 30.1 99.3 ± 44.9 196.0 ± 88.4 203.3 ± 63.1 Τυροσόλη 24.1 ± 7.4 6.9 ± 4.2 9.7 ± 2.9 10.8 ± 5.1 7.7 ± 1.2 p-oh- Βενζοϊκό oξύ 1030 ± 245.8 144.6 ± 50.6 155.1 ± 39.1 281.9 ± 147.8 227.6 ± 38.4 p-oh- φαινυλοξικό - - - - - οξύ Ομοβαννιλική - - - - - αλκοόλη Φλωρετικό οξύ - - - - - Βαννιλικό οξύ 629.9 ± 181.6 73.4 ± 3.1 55.4 ± 9.8 127.2 ± 47.0 92.8 ± 4.2 Ομοβαννιλικό οξύ - - - - - o-κουμαρικό οξύ - - - - - Πρωτοκατεχικό οξύ 705.5 ± 314 63.6 ± 36.7 90.2 ± 16.9 148.7 ± 62.9 118.8 ± 25.7 3,4 δι- OH- - - - - - φαινυλοξικό οξύ Συριγκικό οξύ 147.5 ± 55.4 10.2 ± 0.6 75.3 ± 39.2 130.8 ± 183.9 49.2 ± 21.7 p- Κουμαρικό οξύ 521.2 ± 137.4 53.8 ± 22.2 276.5 ± 63 263.6 ± 300.9 90.6 ± 37.2 Γαλλικό οξύ Φερουλικό οξύ 1353.3 ± 474 159.1 ± 72.8 400 ± 199.8 717.1 ± 885 276.4 ± 93.8 Καφφεϊκό οξύ 3379.1 ± 1070.2 622.4 ± 258.1 603.1 ± 145.3 2388.5 ± 986.8 2196.4 ± 661.1 Σιναπικό οξύ 59.1 ± 4.4 16.8 ± 20.4 15.6 ± 9.3 52.1 ± 47.4 30.1 ± 10.6 Ρεσβερατρόλη - - - - - Χρυσίνη 1134.4 ± 897.7 180.4 ± 164.5 152.5 ± 71.3 355.7 ± 156 516.6 ± 248.8 Επικατεχίνη - - - - - Ναριγκενίνη 674.3 ± 67.9 152.4 ± 170.2 231.8 ± 148.2 712.9 ± 1067.4 169.4 ± 75.3 Κατεχίνη - - - - - Γενιστεΐνη - - - - - Καμπφερόλη 24 ± 0.2 8.7 ± 8.5 26.0 ± 18.5 67.9 ± 105.7 17.2 ± 10.2 Χλωρογενικό οξύ 1847520.8 ± 1442208.1 ± 18556.7 ± 1698016.8 ± 1502374.9 ± 486829.8 18880.2 5097.8 481824.3 43722 Κερκετίνη 1086.9 ± 14 206.9 ± 22 254.7 ± 98.9 610.4 ± 219.9 456.7 ± 27.6 Μυρισετίνη - - - - - Ολεανολικό οξύ 525.7 ± 704.7 20.9 ± 30.8 80.1 ± 56.2 522.0 ± 830.4 221.7 ± 227.5 Ουρσολικό οξύ 538 ± 538.9-156.8 ± 144.5 527.5 ± 913.7 221.33 ± 139.5 116

Παρακάτω φαίνεται ένα χρωματογράφημα επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (Selective Ion Monitoring, SIM GC-MS) απλών πολυφαινολών σε ρόφημα ελληνικού καφέ. Εικόνα 8.1 Χρωματογράφημα SIM των τριμεθυλσιλυλαιθέρων απλών πολυφαινολών σε ρόφημα ελληνικού καφέ (IS=Εσωτερικό πρότυπο). Θέλοντας να ελέγξουμε την ύπαρξη και άλλων χλωρογενικών οξέων, τα σιλυλιωμένα δείγματα μετρήθηκαν επί πλέον και με καταγραφή του συνόλου των ιόντων (SCAN mode). Από τα χρωματογραφήματα αυτά, βάσει των χαρακτηριστικών ιόντων των ισομερών καφφεοϋλκινικών οξέων που δίνονται στην βιβλιογραφία επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των 5-Ο-καφφεοϋλκινικού οξέος (5-CQA, χλωρογενικό οξύ), 4-O-καφφεοϋλκινικού οξέος (4-CQA), 3-Oκαφφεοϋλκινικού οξέος (3-CQA) (Σχήμα 8.2). Στο ίδιο σχήμα, οι μικρότερες κορυφές στην περιοχή των χλωρογενικών πιθανότατα αντιστοιχούν σε άλλα παράγωγα του χλωρογενικού οξέος που βρίσκονται σε χαμηλότερη αφθονία. Λόγω έλλειψης προτύπων ουσιών δεν επιχειρήθηκε η ποσοτικοποίηση των 4- CQA και 3-CQA, όμως βάσει του ύψους των κορυφών και δεδομένης της χημικής ομοιότητάς τους η αφθονία τους φαίνεται ότι μειώνεται κατά σειρά ως εξής: 5-QCA>4-QCA>3-QCA. Αυτή η κατανομή βρίσκεται σε συμφωνία με 117

βιβλιογραφικά δεδομένα που δείχνουν το 5-Ο ισομερές να υπερισχύει των δύο άλλων [132]. Εικόνα 8.2 Χρωματογράφημα εξαγωγής ιόντων από το αρχικό SCAN χρωματογράφημα. Εικόνα 8.3 Χρωματογράφημα SCAN συνολικού ρεύματος ιόντων Κορυφές 1: Χλωρογενικό οξύ (5-Ο-καφφεοϋλκινικό oξύ), 2: 4-O-καφφεοϋλκινικό οξύ, 3: 3-O-καφφεοϋλκινικό οξύ. 118