Μελέτη της ανάπτυξης του ψυχρότροφου παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes σε τυρί και σε ελιά

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «ΧΗΜΕΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ» ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη της ανάπτυξης του ψυχρότροφου παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes σε τυρί και σε ελιά ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΗΜΑΡΕΛΗ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΑΘΗΝΑ ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ 2013

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη της ανάπτυξης του ψυχρότροφου παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes σε τυρί και σε ελιά ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΔΗΜΑΡΕΛΗ Α.Μ.: 51013 ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: Παναγιώτα Μαρκάκη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Παναγιώτα Μαρκάκη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΕΚΠΑ Κωνσταντίνα Γαλανοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΕΚΠΑ Χαράλαμπος Προεστός, Λέκτορας ΕΚΠΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 25/2/2013

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Listeria monocytogenes (L.m.) είναι ψυχρότροφο, παθογόνο βακτήριο που μπορεί να αναπτύσσεται σε αντίξοες συνθήκες. Μελέτες υποστηρίζουν ότι η L.m., όταν εκτεθεί σε ήπιο στρες, μπορεί να προσαρμοστεί και να αναπτύξει μεγαλύτερη αντοχή στο στρεσογόνο παράγοντα. Έτσι η προσαρμογή σε όξινες συνθήκες έχει τη δυνατότητα να αυξήσει την επιβίωση/ανάπτυξη του βακτηρίου σε μη βέλτιστες συνθήκες. Στις γαλακτοκομικές μονάδες το βακτήριο μπορεί να αντιμετωπίσει όξινες συνθήκες και να προσαρμοστεί. Επίσης το βακτήριο σχηματίζει biofilms στους χώρους επεξεργασίας τροφίμων (συσκευές, δάπεδα κτλ) που αποτελεί μια σημαντική αιτία ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών και μόλυνσης των τροφίμων. Η παρούσα εργασία έχει δύο στόχους. Πρώτος στόχος είναι να εξεταστεί η ανάπτυξη της οξυκαταπονημένης L. monocytogenes (Lm ph:5.5, ph=5,5, θ=30 ο C) σε εργαστηριακά παρασκευασμένο τυρί (τύπου φέτα). Δείγματα 200 ml αιγοπρόβειου (30:70 ν/ν) παστεριωμένου γάλακτος εμβολιάστηκαν με 4,90 log 10 cfu/ml γάλακτος από καλλιέργεια L.m. που αναπτύχθηκε σε βέλτιστες συνθήκες Lm opt (ph=7,3, θ=30 ο C, μάρτυρας) και με 4,87 log 10 cfu/ml γάλακτος από Lm ph:5.5. Προστέθηκε πυτιά και αλάτι. Τα δείγματα αφέθηκαν για πήξη (36 ο C για 20 λεπτά), αποστράγγιση για 24 ώρες, τοποθετήθηκαν σε 6% αποστειρωμένη άλμη και αποθηκεύτηκαν στους 5 ο C για 60 ημέρες. Οι πληθυσμοί της L.m. καταμετρήθηκαν σε εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Oxoid Chromogenic Listeria Agar μετά από 24 ώρες, 30 και 60 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με το αρχικό εμβόλιο οι πληθυσμοί της Lm ph:5.5 αυξήθηκαν κατά 2,30, 2,43 και 2,34 log 10 cfu/g τυριού μετά από 24 ώρες, 30 και 60 ημέρες αντίστοιχα και δε διέφεραν στατιστικά από τους αντίστοιχους πληθυσμούς της Lm opt που σημαίνει ότι και οι δύο καλλιέργειες είναι εξίσου επικίνδυνες. Ο δεύτερος στόχος είναι να ερευνηθεί η δυνατότητα ανάπτυξης της L.m. σε μαύρες ελιές. Οι μαύρες ελιές (28g) εμβολιάστηκαν με 3,75 log 10 cfu/g ελιάς από καλλιέργεια Lm opt (control) και αποθηκεύτηκαν στους 5 o C και στους 30 o C. Οι πληθυσμοί της Lm opt καταμετρήθηκαν μετά από 24 ώρες, 7 και 152 ημέρες συντήρησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Lm opt δεν επιβιώνει σε μαύρες ελιές υπό τις παρούσες εργαστηριακές συνθήκες. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Μικροβιολογία Τροφίμων ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙ ΙΑ: Listeria monocytogenes, μαλακό τυρί, μαύρες ελιές

ABSTRACT Listeria monocytogenes (L.m.) is a bacterium with a remarkable ability to grow in harsh environmental conditions. Many studies have demonstrated that, when exposed to a mild stress, L.m. may adapt, thus developing tolerance or resistance to greater amounts of that stressor. Acid Tolerance Response (ATR) has the potential to influence the survival of bacteria in acidic environments which are suboptimal to growth. In cheese processing environments the bacterium L.m. can experience sub lethal acidic conditions that may result in the development of an Acid Tolerance Response. Αlso, the bacterium is known to form biofilms in food manufacturing and facilities. This study has two targets: The first target was to evaluate the growth potential of acidadapted L.m. (Lm ph:5.5, ph=5,5, θ=30 ο C) in a laboratory scale prepared cheese (type feta). Non-adapted (Lm opt ph=7,3, θ=30 ο C, control) and acid-adapted L.m. was inoculated into pasteurized goats and ewes milk (30:70 ν/ν) at a level of 4,90 and 4,87 log 10 cfu/ml respectively. Rennet and salt was added. Each sample was incubated at 36 o C for 20 min, allowed to drain for 24h at room temperature. After draining, the cheese curd was placed in a 6% sterile salt-brine and was stored at 5 o C for 60 days. L.m. was counted on Oxoid Chromogenic Listeria Agar at 24h, 30 and 60 days. The results showed that, compared to the initial inoculum Lm ph:5.5 populations were increased by 2,30, 2,43 and 2,34 log 10 cfu/g after 24h, 30 and 60 days respectively. The populations of non-adapted and acid-adapted L.m. were not statistically different which means that both exhibit similar degree of risk. The second target was to investigate the occurrence of L.m. in black olives. Black olives (28g) were inoculated with Lm opt (control) at a level of 3,75 log 10 cfu/g and stored at 5 o C and 30 o C. The growth potential of L.m. was evaluated by enumeration on Oxoid Chromogenic Listeria Agar at 24h, 7 and 152 days of storage. The results demonstrated that black olives did not support the survival of Lm opt under current laboratory conditions. SUBJECT AREA: Food microbiology KEYWORDS: Listeria monocytogenes, soft cheese, black olives

Στους γονείς μου

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Το μεταπτυχιακό αυτό δίπλωμα ειδίκευσης εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας Τροφίμων του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών κατά την περίοδο Οκτωβρίου 2010 - Ιανουαρίου 2013. Επιβλέπουσα της ερευνητικής μου εργασίας ήταν η Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, κα Παναγιώτα Μαρκάκη, στην οποία οφείλω να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες για την συνεργασία στην ανάθεση του θέματος και τη βοήθειά της κατά την εκπόνηση αυτής της εργασίας. Τις θερμές μου ευχαριστίες στην καθηγήτρια κα Σοφία Μαστρονικολή για την πολύτιμη συμβολή της και την επιστημονική καθοδήγησή της κατά τη διεξαγωγή αυτής της μεταπτυχιακής μελέτης. Επίσης, ευχαριστώ πολύ τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, την Αναπληρώτρια καθηγήτρια κα Κωνσταντίνα Γαλανοπούλου και το Λέκτορα κο Χαράλαμπο Προεστό, για τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Θεωρώ ιδιαίτερα σημαντικό να ευχαριστήσω τους υποψήφιους διδάκτορες Γιάννη Διακογιάννη και Ανίτα Μπερμπέρι για την άψογη συνεργασία και συνεννόηση που είχαμε. Επιπλέον, τις ευχαριστίες μου θα ήθελα να εκφράσω στα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου για το υπέροχο κλίμα εργασίας που δημιούργησαν. Οφείλω επίσης να ευχαριστήσω την κα Χαρισμιάδου, λέκτορα του εργαστηρίου Γενικής και Ειδικής Ζωοτεχνίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών για την προμήθεια του γάλακτος. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την αμέριστη συμπαράσταση και υποστήριξη που μου προσέφεραν κατά την περάτωση αυτού του απαιτητικού έργου. Αθήνα, Ιανουάριος 2013 Παρασκευή Δημαρέλη

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΤΟ ΨΥΧΡΟΤΡΟΦΟ ΤΡΟΦΟΓΕΝΕΣ ΠΑΘΟΓΟΝΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ LISTERIA MONOCYTOGENES...25 1.1 Ιστορικό...25 1.2 Ταξινόμηση....25 1.3 Μορφολογία...26 1.4 Μεταβολισμός και βιοχημικά χαρακτηριστικά...26 1.5 Προέλευση...27 1.6 Λιστερίωση...28 1.6.1 Η λιστερίωση στην Ελλάδα...32 1.7 Ευρωπαϊκή Νομοθεσία...34 2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΕΜΠΟΔΙΩΝ... 35 2.1 Εισαγωγή...35 2.2 Η αρχή της τεχνολογίας των εμποδίων...35 2.3 Επίδραση του ψύχους στο βακτήριο Listeria monocytogenes...37 2.4 Επίδραση της ωσμωτικής πίεσης στο βακτήριο Listeria monocytogenes...38 2.5 Επίδραση της θερμικής επεξεργασίας στο βακτήριο Listeria monocytogenes.38 2.6 Επίδραση του χαμηλού ph στο βακτήριο Listeria monocytogenes...39 2.6.1 Ασθενή οξέα ως συντηρητικά...41 2.7 Ικανότητα προσκόλλησης της Listeria monocytogenes και άλλων βακτηρίων σε αδρανείς επιφάνειες - biofilms... 43 2.7.1 Παράγοντες που επηρεάζουν τη βακτηριακή προσκόλληση...44 3. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΤΟ ΤΥΡΙ...47 3.1 Πρώτες ύλες για την παρασκευή τυριού...47 3.1.1 Γάλα...47 3.1.2 Ένζυμα πήξης του γάλακτος...49 3.1.3 Αλάτι...50

3.1.4 Ειδικές μικροβιακές καλλιέργειες...50 3.2 Παρασκευή τυριού...52 3.3 Φέτα...53 4. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Η ΕΛΙΑ...59 4.1 Βοτανική ταξινόμηση της ελιάς...59 4.2 Δομή και σύσταση του ελαιόκαρπου...59 4.2.1 Νερό...60 4.2.2 Λιπαρές ουσίες...60 4.2.3 Απλά σάκχαρα...61 4.2.4 Πολυσακχαρίτες...61 4.2.5 Πηκτίνες...61 4.2.6 Πρωτεΐνες...61 4.2.7 Οργανικά οξέα...62 4.2.8 Ταννίνες...62 4.2.9 Ελευρωπαΐνη...62 4.2.10 Χρωστικές ουσίες...62 4.2.11 Ανόργανα συστατικά...63 4.3 Ποικιλίες ελιάς στην Ελλάδα...63 4.4 Επεξεργασία ελαιόκαρπου...64 5. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΤΗΣ LISTERIA MONOCYTOGENES ΣΕ ΤΥΡΙ ΚΑΙ ΣΕ ΕΛΙΑ...67 5.1 Παρουσία της Listeria monocytogenes στο τυρί... 67 5.2 Παρουσία της Listeria monocytogenes στην ελιά... 68 6. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...71 6.1 Ασηπτική τεχνική...71 6.2 Ανακαλλιέργεια του βακτηρίου Listeria monocytogenes σε τρυβλία petri...72 6.3 Ανακαλλιέργεια του βακτηρίου Listeria monocytogenes σε γλυκερόλη για αποθήκευση σε κατάψυξη...73

6.4 Καλλιέργεια του βακτηρίου Listeria monocytogenes σε υγρό θρεπτικό υλικό BHI...74 6.5 Ρύθμιση του ph σε καλλιέργεια του βακτηρίου σε υγρό θρεπτικό υλικό και λειτουργία του πεχαμέτρου...75 6.6 Μέτρηση του ph σε στερεό τρόφιμο και λειτουργία του πεχαμέτρου...77 6.7 Έλεγχος ανάπτυξης του βακτηρίου Listeria monocytogenes σε υγρό θρεπτικό υλικό BHI με μέτρηση οπτικής πυκνότητας...79 6.8 Καταμέτρηση αποικιών από καλλιέργεια της Listeria monocytogenes σε υγρό θρεπτικό υλικό με τρυβλία petri και εμπλουτιστικό υπόστρωμα BHΙ...80 6.9 Καταμέτρηση αποικιών της Listeria monocytogenes από καλλιέργεια σε υγρό θρεπτικό υλικό σε τρυβλία με εκλεκτικό θρεπτικό υλικό Oxoid Chromogenic Listeria Agar... 81 6.10 Ανάκτηση του βακτηρίου Listeria monocytogenes από το επιμολυσμένο τρόφιμο...83 6.11 Προσδιορισμός λίπους στο γάλα...84 7. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΥΓΡΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ LISTERIA ΠΟΥ ΑΝΑΠΤΥΧΘΗΚΕ ΣΕ ΒΕΛΤΙΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ Lm opt ΚΑΙ ΣΕ ΟΞΙΝΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ Lm ph:5,5 ΠΟΥ ΘΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΕΙ ΓΙΑ ΝΑ ΕΠΙΜΟΛΥΝΕΙ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΥΡΙΟΥ ΚΑΙ ΕΛΙΑΣ...87 7.1 Εισαγωγή...87 7.2 Καταμέτρηση των αποικιών του βακτηρίου Lm opt σε τρυβλία με εκλεκτικό θρεπτικό υλικό OCLA...88 7.3 Καταμέτρηση των αποικιών του οξυκαταπονημένου βακτηρίου Lm ph:5,5 σε τρυβλία με εμπλουτιστικό υπόστρωμα BHI και σε τρυβλία με εκλεκτικό θρεπτικό υλικό OCLA...90 8. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ Lm opt KAI Lm ph:5,5 ΠΟΥ ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΗΚΕ ΣΕ ΓΑΛΑ ΑΠΟ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗΚΕ ΤΟ ΤΥΡΙ...91 8.1 Πορεία ανάπτυξης του βακτηρίου Lm opt που εμβολιάστηκε σε γάλα προς παρασκευή λευκού τυριού τύπου φέτα κατά τη διάρκεια της ωρίμανσής του σε άλμη...91

8.1.1 Παρασκευή λευκού τυριού τύπου φέτα μετά την επιμόλυνση του γάλακτος με το βακτήριο Lm opt...91 8.1.2 Πρώτη ανάκτηση (24 ώρες) και καταμέτρηση του βακτηρίου Lm opt (Α και Β σειρά) από τα δείγματα του τυριού - Αποτελέσματα...95 8.1.3 Δεύτερη ανάκτηση (30 μέρες) και καταμέτρηση του βακτηρίου Lm opt (Α και Β σειρά) από τα δείγματα του τυριού - Αποτελέσματα...98 8.1.4 Τρίτη ανάκτηση (60 μέρες) και καταμέτρηση του βακτηρίου Lm opt (Α και Β σειρά) από τα δείγματα του τυριού - Αποτελέσματα...100 8.2 Πορεία ανάπτυξης οξυκαταπονημένης L.m. που εμβολιάστηκε σε γάλα προς παρασκευή λευκού τυριού τύπου φέτα κατά τη διάρκεια της ωρίμανσής του σε άλμη...102 8.2.1 Παρασκευή λευκού τυριού τύπου φέτα μετά την επιμόλυνση του γάλακτος με το βακτήριο Lm ph:5,5...102 8.2.2 Πρώτη ανάκτηση (24 ώρες) και καταμέτρηση του βακτηρίου Lm ph:5,5 (Γ και Δ σειρά) από τα δείγματα του τυριού - Αποτελέσματα...106 8.2.3 Δεύτερη ανάκτηση (30 μέρες) και καταμέτρηση του βακτηρίου Lm ph:5,5 (Γ και Δ σειρά) από τα δείγματα του τυριού - Αποτελέσματα...109 8.2.4 Τρίτη ανάκτηση (60 μέρες) και καταμέτρηση του βακτηρίου Lm ph:5,5 (Γ και Δ σειρά) από τα δείγματα του τυριού - Αποτελέσματα...111 8.3 Συγκριτικά αποτελέσματα της επιμόλυνσης του τυριού...113 9. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ ΜΕ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ LISTERIA MONOCYTOGENES ΕΠΙΤΡΑΠΕΖΙΩΝ ΜΑΥΡΩΝ ΕΛΙΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΤΗΡΗΘΗΚΑΝ ΣΤΟΥΣ 30 o C ΚΑΙ ΣΤΟΥΣ 5 o C...117 9.1 Σχεδιασμός της πειραματικής διαδικασίας για την επιμόλυνση των ελιών με το βακτήριο Lm opt...117 9.2 Ανάκτηση του βακτηρίου Lm opt από τις ελιές που συντηρήθηκαν στους 30 ο C και στους 5 ο C...118 9.3 Αποτελέσματα της επιμόλυνσης των ελιών...120 10. ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ...121 11. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ-ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ-ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ...122 12. ΑΝΑΦΟΡΕΣ...123

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1.1: Τρόποι με τους οποίους η L. monocytogenes διαδίδεται στο περιβάλλον, στα ζώα, στα τρόφιμα και στους ανθρώπους...28 Σχήμα 1.2: Επίπτωση της λιστερίωσης (κρούσματα/1.000.000 πληθυσμού) κατά φύλο και ηλικιακή ομάδα στην Ελλάδα...33 Σχήμα 2.1: Αλληλεπίδραση των ασθενών οξέων με την κυτταρική μεμβράνη. Α) Το εξωτερικό του κυττάρου ευνοεί την αδιάστατη μορφή του ασθενούς οξέος, Β) το εσωτερικό του κυττάρου ευνοεί τη διάσταση του οξέος, Γ) οι αντλίες πρωτονίων απομακρύνουν την περίσσεια των Η+ καταναλώνοντας ενέργεια (ATP)...42 Σχήμα 3.1: Διάγραμμα ροής παρασκευής φέτας όπου με έντονο διπλό πλαίσιο επισημαίνονται και τα κρίσιμα σημεία ελέγχου της παραγωγικής διαδικασίας (critical control points, CCP)...55 Σχήμα 7.1: Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας καταμέτρησης των αποικιών 1 lt καλλιέργειας του βακτηρίου Lm opt σε 3 τρυβλία με εκλεκτικό θρεπτικό υλικό OCLA ανά αραίωση. Οι αραιώσεις γίνονται σε βιδωτούς σωλήνες με 9 ml Fraser broth έκαστος (τελικός όγκος 10 ml)...88 Σχήμα 7.2: Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας καταμέτρησης των αποικιών 1 lt καλλιέργειας του βακτηρίου Lm ph:5,5 σε 3 τρυβλία με BHI ανά αραίωση. Οι αραιώσεις γίνονται σε βιδωτούς σωλήνες με 9 ml νερό έκαστος (τελικός όγκος 10 ml)...88 Σχήμα 8.1: Γενική πορεία της όλης διαδικασίας του εμβολιασμού του γάλακτος, της παρασκευής τυριού και των ανακτήσεων. Όπου Α τα δείγματα τυριού από τα οποία θα ανακτηθεί το βακτήριο μετά από 24 ώρες (A1 και A2), από 30 ημέρες (A3 και A4) και μετά από 60 ημέρες (Α5 και Α6). Τα δείγματα με το σύμβολο Β είναι αντιστοίχως το δεύτερο στατιστικό πείραμα...91 Σχήμα 8.2: Διάγραμμα παρασκευής τυριού από γάλα που έχει επιμολυνθεί με Lm opt και ανάκτησης βακτηρίου από τα δείγματα τυριού μετά από 24 ώρες, 30 ημέρες και 60 ημέρες...92 Σχήμα 8.3: Σχηματική παράσταση για την 1 η ανάκτηση (24 ώρες) της διαδικασίας των διαδοχικών αραιώσεων με διάλυμα Fraser Broth Base του ομογενοποιημένου μίγματος (τυριού+fraser) και της μεταφοράς 0,1 ml από τις αραιώσεις σε κατάλληλα τρυβλία με σκοπό την καταμέτρηση των αποικιών της Lm opt για τις δύο πειραματικές σειρές Α και Β.94

Σχήμα 8.4: Γενική πορεία της όλης διαδικασίας του εμβολιασμού του γάλακτος, της παρασκευής τυριού και των ανακτήσεων. Όπου Γ τα δείγματα τυριού από τα οποία θα ανακτηθεί το βακτήριο μετά από 24 ώρες (Γ1 και Γ2), από 30 ημέρες (Γ3 και Γ4) και μετά από 60 ημέρες (Γ5 και Γ6). Τα δείγματα με το σύμβολο Δ είναι αντιστοίχως το δεύτερο στατιστικό πείραμα...104 Σχήμα 8.5: Διάγραμμα παρασκευής τυριού από γάλα που έχει επιμολυνθεί με Lm ph:5,5 και ανάκτησης βακτηρίου από τα δείγματα τυριού μετά από 24 ώρες, 30 ημέρες και 60 ημέρες....105 Σχήμα 8.6: Σχηματική παράσταση για την 1 η ανάκτηση (24 ώρες) της διαδικασίας των διαδοχικών αραιώσεων με διάλυμα Fraser Broth Base του ομογενοποιημένου μίγματος (τυριού+fraser) και της μεταφοράς 0,1 ml από τις αραιώσεις σε κατάλληλα τρυβλία με σκοπό την καταμέτρηση των αποικιών της Lm ph:5,5 για τις δύο πειραματικές σειρές Γ και Δ....107 Σχήμα 8.7: Μεταβολή των πληθυσμών (log 10 cfu/g) της Lm opt και της Lm ph:5,5 κατά τη διάρκεια της παρασκευής από επιμολυσμένο γάλα και αποθήκευσης στους 5 ο C λευκού τυριού τύπου φέτα που συντηρήθηκε σε άλμη 6%. Οι στατιστικές μπάρες προέρχονται από την επεξεργασία των δύο πειραματικών σειρών....115 Σχήμα 9.1: Διάγραμμα εμβολιασμού ελιάς με το βακτήριο Lm opt και ανάκτησης του βακτηρίου μετά από 24 ώρες, 7 μέρες και 152 μέρες...111 Σχήμα 9.2: Σχηματική παράσταση για την ανάκτηση της διαδικασίας των διαδοχικών αραιώσεων με διάλυμα Fraser του ομογενοποιημένου μίγματος (ελιάς+ Fraser) και της μεταφοράς 0,1 ml από τις αραιώσεις σε κατάλληλα τρυβλία με σκοπό την καταμέτρηση των αποικιών της Lm opt...119

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 6.1: ph-μετρο HandyLab ph11/set...76 Εικόνα 6.2: ph-μετρο ebro PHT 810...78

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.1: Αριθμός δηλωθέντων κρουσμάτων και επίπτωση της λιστερίωσης στην Ελλάδα...33 Πίνακας 2.1: Παράμετροι συντήρησης των τροφίμων, τα επονομαζόμενα εμπόδια..36 Πίνακας 3.1:Ανώτατο μικροβιακό φορτίο νωπού γάλακτος αγελάδος και αιγοπροβάτων...48 Πίνακας 3.2.: Σύσταση (%) του γάλακτος διαφόρων ζώων...48 Πίνακας 4.1: Σύσταση ελαιόκαρπου/100g...60 Πίνακας 7.1: Αποτελέσματα καταμέτρησης των αποικιών 1 lt υγρής καλλιέργειας του βακτηρίου Lm opt σε τρυβλία με εκλεκτικό θρεπτικό υλικό OCLA. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι μέσοι όροι log 10 cfu/ml καλλιέργειας...89 Πίνακας 7.2: Αποτελέσματα καταμέτρησης των αποικιών 1 lt υγρής καλλιέργειας του βακτηρίου Lm ph:5,5 σε τρυβλία με εμπλουτιστικό υπόστρωμα BHI και σε τρυβλία με εκλεκτικό θρεπτικό υλικό OCLA. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι μέσοι όροι log 10 cfu/ml καλλιέργειας...90 Πίνακας 8.1: Καταγράφονται οι καλλιέργειες Lm opt Α και Lm opt Β που χρησιμοποιήθηκαν στη στάσιμη φάση για τον εμβολιασμό των δειγμάτων αιγοπρόβειου γάλακτος στις δύο πειραματικές σειρές, η οπτική τους πυκνότητα (Ο.D.), το ph στη στάσιμη φάση καθώς και οι ποσότητες cfu του βακτηρίου που περιέχονται στο εμβόλιο. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/ml καλλιέργειας και εμβολίου...92 Πίνακας 8.2: Καταγράφονται κατά την πρώτη ανάκτηση (24 ώρες) οι ποσότητες (g) που ζυγίζονται από τα επιμολυσμένα δείγματα του τυριού της σειράς Α και Β, το ph των δειγμάτων τυριού καθώς και οι όγκοι (ml) των ομογενοποιημένων δειγμάτων (τυρί +Fraser)...95 Πίνακας 8.3: Αποτελέσματα πρώτης ανάκτησης (24 ώρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm opt Α και Lm opt Β για τα δείγματα τυριού Α1, Α2, Β1, Β2. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/gr τυριού. Τα σύμβολα Α και Β αντιστοιχούν στο πρώτο και στο δεύτερο στατιστικό πείραμα. (Π.Π.=περισσότερες από 200 αποκίες)...97 Πίνακας 8.4: Καταγράφονται κατά τη δεύτερη ανάκτηση (30 μέρες) οι ποσότητες (g) που ζυγίζονται από τα επιμολυσμένα δείγματα του τυριού της σειράς Α και Β, το ph των δειγμάτων τυριού καθώς και οι όγκοι (ml) των ομογενοποιημένων δειγμάτων (τυρί +Fraser)...98

Πίνακας 8.5: Αποτελέσματα δεύτερης ανάκτησης (30 μέρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm opt Α και Lm opt Β για τα δείγματα Α3, Α4, Β3, Β4. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/gr τυριού. Τα σύμβολα Α και Β αντιστοιχούν στο πρώτο και στο δεύτερο στατιστικό πείραμα. (Π.Π.=περισσότερες από 200 αποκίες)...99 Πίνακας 8.6: Καταγράφονται κατά τη τρίτη ανάκτηση (60 μέρες) οι ποσότητες (g) που ζυγίζονται από τα επιμολυσμένα δείγματα του τυριού της σειράς Α και Β, το ph των δειγμάτων τυριού καθώς και οι όγκοι (ml) των ομογενοποιημένων δειγμάτων (τυρί +Fraser)...100 Πίνακας 8.7: Αποτελέσματα τρίτης ανάκτησης (60 μέρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm opt Α και Lm opt Β για τα δείγματα Α5, Α6, Β5, Β6. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/gr τυριού. Τα σύμβολα Α και Β αντιστοιχούν στο πρώτο και στο δεύτερο στατιστικό πείραμα...101 Πίνακας 8.8: Καταγράφονται οι καλλιέργειες Lm ph:5,5 Γ και Lm ph:5,5 Δ που χρησιμοποιήθηκαν στη στάσιμη φάση για τον εμβολιασμό των δειγμάτων αιγοπρόβειου γάλακτος στις δύο πειραματικές σειρές, η οπτική τους πυκνότητα (Ο.D.), το ph στη στάσιμη φάση καθώς και οι ποσότητες cfu του βακτηρίου που περιέχονται στο εμβόλιο. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/ml καλλιέργειας και εμβολίου...103 Πίνακας 8.9: Καταγράφονται κατά την πρώτη ανάκτηση (24 ώρες) οι ποσότητες (g) που ζυγίζονται από τα επιμολυσμένα δείγματα του τυριού της σειράς Γ και Δ, το ph των δειγμάτων τυριού καθώς και οι όγκοι (ml) των ομογενοποιημένων δειγμάτων (τυρί +Fraser)...106 Πίνακας 8.10: Αποτελέσματα πρώτης ανάκτησης (24 ώρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm ph:5,5 Γ και Lm ph:5,5 Δ για τα δείγματα τυριού Γ1, Γ2, Δ1, Δ2. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/gr τυριού. Τα σύμβολα Α και Β αντιστοιχούν στο πρώτο και στο δεύτερο στατιστικό πείραμα. (Π.Π.=περισσότερες από 200 αποκίες)....108 Πίνακας 8.11: Καταγράφονται κατά τη δεύτερη ανάκτηση (30 μέρες) οι ποσότητες (g) που ζυγίζονται από τα επιμολυσμένα δείγματα του τυριού της σειράς Γ και Δ, το ph των δειγμάτων τυριού καθώς και οι όγκοι (ml) των ομογενοποιημένων δειγμάτων (τυρί +Fraser)...109 Πίνακας 8.12: Αποτελέσματα δεύτερης ανάκτησης (30 μέρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm ph:5,5 Γ και Lm ph:5,5 Δ για τα δείγματα Γ3, Γ4, Δ3, Δ4. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/gr τυριού. Τα σύμβολα Α και Β αντιστοιχούν στο πρώτο και στο δεύτερο στατιστικό πείραμα. (Π.Π.=περισσότερες από 200 αποκίες)....110

Πίνακας 8.13: Καταγράφονται κατά τη τρίτη ανάκτηση (60 μέρες) οι ποσότητες (g) που ζυγίζονται από τα επιμολυσμένα δείγματα του τυριού της σειράς Γ και Δ, το ph των δειγμάτων τυριού καθώς και οι όγκοι (ml) των ομογενοποιημένων δειγμάτων (τυρί +Fraser)...111 Πίνακας 8.14: Αποτελέσματα τρίτης ανάκτησης (60 μέρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm ph:5,5 Γ και Lm ph:5,5 Δ για τα δείγματα Γ5, Γ6, Δ5, Δ6. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/gr τυριού. Τα σύμβολα Α και Β αντιστοιχούν στο πρώτο και στο δεύτερο στατιστικό πείραμα. (Π.Π.=περισσότερες από 200 αποκίες)....112 Πίνακας 8.15: Μεταβολή των πληθυσμών (cfu/g) της Lm opt Α και Lm opt Β σε δείγματα λευκού τυριού τύπου φέτα που συντηρήθηκαν σε άλμη 6% στους 5 ο C μετά από 24 ώρες, 30 μέρες και 60 μέρες. Το στέλεχος της Lm opt εμβολιάστηκε σε 200 ml γάλακτος που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του τυριού. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/ml γάλακτος και οι log 10 cfu/g δείγματος τυριού...113 Πίνακας 8.16: Μεταβολή των πληθυσμών (cfu/g) της Lm ph:5,5 Γ και Lm ph:5,5 Δ σε δείγματα λευκού τυριού τύπου φέτα που συντηρήθηκαν σε άλμη 6% στους 5 ο C μετά από 24 ώρες, 30 μέρες και 60 μέρες. Το στέλεχος της Lm ph:5,5 εμβολιάστηκε σε 200 ml γάλακτος που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του τυριού. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/ml γάλακτος και οι log 10 cfu/g δείγματος τυριού...113 Πίνακας 8.17: Μεταβολή των πληθυσμών (logcfu/g) της Lm opt σε δείγμα λευκού τυριού τύπου φέτα που συντηρήθηκε σε άλμη 6% στους 5 ο C για 60 ημέρες μετά τη στατιστική επεξεργασία των δύο πειραματικών σειρών...114 Πίνακας 8.18: Μεταβολή των πληθυσμών (logcfu/g) της Lm ph:5,5 σε δείγμα λευκού τυριού τύπου φέτα που συντηρήθηκε σε άλμη 6% στους 5 ο C για 60 ημέρες μετά τη στατιστική επεξεργασία των δύο πειραματικών σειρών...114 Πίνακας 9.1: Καταγράφεται η καλλιέργεια Lm opt που χρησιμοποιήθηκε στη στάσιμη φάση για τον εμβολιασμό των δειγμάτων της ελιάς, η οπτική της πυκνότητα (Ο.D.), το ph στη στάσιμη φάση καθώς και οι ποσότητες cfu του βακτηρίου που περιέχονται στο εμβόλιο. Στις παρενθέσεις παρουσιάζονται οι log 10 cfu/ml καλλιέργειας και εμβολίου..118 Πίνακας 9.2: Αποτελέσματα πρώτης ανάκτησης (24 ώρες) μετά τον εμβολιασμό με Lm opt των δειγμάτων ελιάς που συντηρήθηκαν στους 30 ο C και στους 5 ο C...120 Πίνακας 10.1: Πίνακας ορολογίας με τις αντιστοιχίσεις των ελληνικών και ξενόγλωσσων όρων...121

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΤΟ ΨΥΧΡΟΤΡΟΦΟ ΤΡΟΦΟΓΕΝΕΣ ΠΑΘΟΓΟΝΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ LISTERIA MONOCYTOGENES 1.1 Ιστορικό H πρώτη περιγραφή του βακτηρίου Listeria monocytogenes (L.m.) έγινε το 1924 από τον Murray και τους συνεργάτες του, 1 οι οποίοι το ονόμασαν Bacterium monocytogenes εξαιτίας μιας χαρακτηριστικής μονοκύτωσης που βρέθηκε στα μολυσμένα εργαστηριακά κουνέλια. Το 1927, κατά τη διάρκεια ερευνών για ασυνήθιστους θανάτους που παρατηρήθηκαν σε γέρβιλους (τρωκτικά) κοντά στο Γιοχάνεσμπουργκ της Νοτίου Αφρικής, ο Pirie 2 ανακάλυψε ένα νέο μικροοργανισμό που τον ονόμασε Listerella hepatolytica, αφιερωμένο στη μνήμη του Lord Lister, ο οποίος ανακάλυψε την αντισηψία. Μετά την διαπίστωση ότι πρόκειται για τον ίδιο μικροοργανισμό, ο Murray και ο Pirie 2 αποφάσισαν να ονομάσουν αυτό το βακτήριο Listerella monocytogenes. 3 Παρόλα αυτά, το 1939, η Εθνική Επιτροπή για τη Συστηματική Βακτηρολογία (International Committee on Systematic Bacteriology) απέρριψε το όνομα Listerella γιατί είχε χρησιμοποιηθεί για ένα γκρουπ μυξομυκήτων. 3 Το 1940, o Pirie 4 πρότεινε το όνομα Listeria. 1.2 Ταξινόμηση Το γένος Listeria ταξινομήθηκε μαζί με τα γένη Lactobacillus, Erysipelothrix, Brochotrix και άλλα γένη στο τμήμα που έχει τον τίτλο Regular, Nonsporing Gram-Positive Rods στην 9 η και τελευταία έκδοση του Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. 5 Από πολλές απόψεις, το γένος Listeria είναι παρόμοιο με το γένος Brochothrix. Και τα δύο γένη είναι θετικά στην καταλάση και έχουν την τάση να συνδέονται το ένα με το άλλο στη φυσιολογία, μαζί με το γένος Lactobacillus. Τα τρία γένη Listeria, Brochothrix και Lactobacillus παράγουν γαλακτικό οξύ από γλυκόζη και άλλα ζυμώσιμα σάκχαρα αλλά, σε αντίθεση με τα γένη Listeria και Brochothrix, το γένος Lactobacillus είναι αρνητικό στο τεστ καταλάσης. Στο παρελθόν, υπήρχε η άποψη ότι τα βακτήρια listeriae συνδέονταν με τα βακτήρια coryneform και γι αυτό είχαν τοποθετηθεί στην 25

οικογένεια Corynebacteriaceae, αλλά σήμερα είναι ξεκάθαρο ότι συγγενεύουν με τα Bacillus, Lactobacillus και Streptococcus. 6 To γένος Listeria αποτελείται από τα είδη L. monocytogenes, L. innocua, L welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii και το L. grayi, που δεν σχετίζεται πολύ στενά με τα άλλα είδη της Listeria, καθώς επίσης και από δύο προσφάτως αναγνωρισμένα είδη το L. Marthii 7 και το L. rocourtiae. 8 Παρόλο που η L. ivanovii και η L. monocytogenes είναι παθογόνα για τον άνθρωπο, η L. ivanovii εμφανίζεται σπάνια και προκαλεί κυρίως ασθένεια στα μηρυκαστικά. Η L. monocytogenes αντιπροσωπεύει το είδος της Listeria που συνδέεται πιο συχνά με ασθένειες τόσο στον άνθρωπο όσο και στα ζώα. 9 1.3 Μορφολογία H Listeria monocytogenes είναι θετικό κατά Gram, μη σπορογόνο, προαιρετικά αναερόβιο ραβδόμορφο βακτήριο που αναπτύσσεται από -0,4 ο C 10,11,12 μέχρι 50 ο C. Διαθέτει περίτριχο μαστίγιο, που του προσδίδει μια χαρακτηριστική τρομώδη κινητικότητα, που λαμβάνει χώρα σε ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασιών. Όταν ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται μεταξύ 20 και 25 ο C η φλαζελλίνη παράγεται και βρίσκεται εντοπισμένη στην επιφάνεια των κυττάρων ενώ σε θερμοκρασία 37 ο C η παραγωγή φλαζελλίνης μειώνεται σημαντικά. 12 Οι αποικίες παρουσιάζουν μια χαρακτηριστική μπλεπράσινη γυαλάδα όταν φωτιστούν πλάγια. 13 1.4 Μεταβολισμός και βιοχημικά χαρακτηριστικά Το βακτήριο Listeria, όπως αναφέρθηκε, είναι προαιρετικά αναερόβιο, μικροαερόφιλο, θετικό στην καταλάση (στελέχη αρνητικά στην καταλάση έχουν παρατηρηθεί σπάνια) και αρνητικό στην οξειδάση. Όλα τα στελέχη αναπτύσσονται στη γλυκόζη σχηματίζοντας σαν κύρια τελικά προϊόντα γαλακτικό, οξικό και ακετοΐνη κάτω από αερόβιες συνθήκες. 14,15 Η ακετοΐνη δεν παράγεται κάτω από αναερόβιες συνθήκες. Μόνο οι εξόζες και οι πεντόζες υποστηρίζουν ανάπτυξη κάτω από αναερόβιες συνθήκες, η μαλτόζη και η λακτόζη υποστηρίζουν την αερόβια ανάπτυξη κάποιων στελεχών του αλλά όχι η σακχαρόζη. 14 Ο καταβολισμός της γλυκόζης πραγματοποιείται μέσω του μονοπατιού Embed-Meyerhof αερόβια και αναερόβια. 5 Επίσης το παθογόνο παράγει οξέα από αμυγδαλίνη, κυτταρίνη, φρουκτόζη, μανόζη, 26

σαλικίνη, μαλτόζη, δεξτρίνες, α-μεθυλο-d-γλυκοζίτη και γλυκερόλη ενώ η παραγωγή οξέος από γαλακτόζη, λακτόζη, μελεζιτόλη, σορβιτόλη, άμυλο και σακχαρόζη διαφοροποιείται. 3 1.5 Προέλευση Περιβάλλον Τα βακτήρια listeriae είναι ευρέως διαδεδομένα στη φύση και μπορούν να βρεθούν σε σάπια βλάστηση, στο έδαφος, σε περιττώματα ζώων, σε λύματα, σε σιλό που φυλάσσονται τα προϊόντα ενσίρωσης (ενσιρώματα) δηλαδή φυτικά προϊόντα που έχουν υποστεί ζύμωση και σε νερό. 16 Στο σχήμα 1.1 απεικονίζονται οι τρόποι με τους οποίους η L. monocytogenes διαδίδεται στο περιβάλλον, στα ζώα, στα τρόφιμα και στους ανθρώπους. 16,17 Τρόφιμα και άνθρωποι Έχει αποδειχθεί ότι οποιοδήποτε φρέσκο τρόφιμο ζωικής ή φυτικής προέλευσης μπορεί να υποκρύπτει διαφορετικούς αριθμούς του βακτηρίου L. monocytogenes. Γενικά, ο μικροοργανισμός έχει βρεθεί συχνότερα σε ακατέργαστο γάλα, σε μαλακά τυριά, σε φρέσκο και κατεψυγμένο κρέας, σε πουλερικά, σε θαλασσινά, σε φρούτα και λαχανικά 16 και σε έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα (Ready To Eat) όπως αναφέρεται παρακάτω στο υποκεφάλαιο 2.1. 27

ΕΚΚΡΙΣΕΙΣ ΖΩΩΝ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΕΙΣ ΖΩΩΝ ΚΑΙ ΑΠΕΚΚΡΙΣΕΙΣ ΑΠΕΚΚΡΙΣΕΙΣ Κόπρανα, εκκρίσεις της μήτρας και κολπικές εκκρίσεις, Κόπρανα, πλακούντας, εκκρίσεις μεμβράνες της μήτρας και κολπικές εκκρίσεις, Μόλυνση αέρα Μόλυνση Μόλυνση αέρα ΖΩΑ ΖΩΑ Ασθένειες/Αποίκιση του εντέρου Λύματα ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΕΔΑΦΟΣ-ΝΕΡΟ ΕΔΑΦΟΣ-ΝΕΡΟ λαχανικά (φυτά, ενσίρωμα) Υγρά απόβλητα ΑΝΘΡΩΠΟΣ ΑΝΘΡΩΠΟΣ Ασθένειες/Αποίκιση Ασθένειες/Αποίκιση του εντέρου ΖΩΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ Γάλα και γαλακτοκομικά προϊόντα, κρέας, σφάγιο Σχήμα 1.1: Τρόποι με τους οποίους η L. monocytogenes διαδίδεται στο περιβάλλον, στα ζώα, στα τρόφιμα και στους ανθρώπους. Πηγή: Από Audurier and Martin, 1989. 1.6 Λιστερίωση Η Listeria monocytogenes είναι ένα μικρόβιο διεισδυτικό. Διαθέτει ισχυρή παθογόνο δράση με ειδικό τροπισμό προς τα κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος. Ο άνθρωπος και τα ζώα μολύνονται από τροφές και υγρά μολυσμένα. Η L.m. αποικίζει το εντερικό κανάλι και από εκεί μέσα τους χυμούς και τους ιστούς του ξενιστή της. Ο μηχανισμός της μετατοπίσεως (translocation) με τον οποίο οι μικροοργανισμοί εγκαταλείπουν το εντερικό κανάλι και εγκαθίστανται σε άλλους ιστούς και όργανα αρχίζει από τις Παϋέριες πλάκες του λεπτού εντέρου όπου οι μικροοργανισμοί φαγοκυτταρώνονται από τα υποβελοννογόνια μακροφάγα και φέρονται στους μεσεντερικούς λεμφαδένες. Χάρις στη λιστεριολυσίνη Ο που παράγει η Listeria κατά την ενδοκυττάριο αυτή φάση διαφεύγει από τα φαγοκύτταρα, επιζεί και μπαίνει στην κυκλοφορία 18. Όπως φαίνεται από δεδομένα, στη διαδικασία αυτή συμμετέχει εκτός από τη λιστεριολυσίνη Ο και μια ειδική φωσφολιπάση της 28

φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης. 19,20,21,22 Επίσης τελευταία 22 ενοχοποιήθηκαν για την παθογένεια και άλλες πρωτεΐνες συνδεδεμένες μα τα λιποτειχοϊκά οξέα της L.mοnocytogenes. Επιπλέον, η είσοδος στο βλεννογόνο του εντέρου, ο ενδοκυττάριος πολλαπλασιασμός και η διασπορά από κύτταρο σε κύτταρο του οργανισμούξενιστή φαίνεται να συντελείται με τη βοήθεια συγκεκριμένων πρωτεϊνών του βακτηρίου. 23 Στην κατηγορία αυτών των πρωτεϊνών ανήκουν η ιντερναλίνη Α (Inl A) και η ιντερναλίνη Β (Inl B). Η ιντερναλίνη Α προωθεί την είσοδο του βακτηρίου στο βλεννογόνο αντιδρώντας με τον κατάλληλο υποδοχέα στην επιφάνεια του επιθηλιακού κυττάρου που, σύμφωνα με μελέτες, 24 είναι το μόριο της Ε-καδερίνης. Ο υποδοχέας για την ιντερναλίνη Β δεν είναι ακόμα γνωστός. 25 Ακτινο-βασιζόμενη κινητικότητα μέσα στο κύτταρο που διεισδύει η Listeria: H Listeria χρησιμοποιεί ένα σύστημα κίνησης που βασίζεται στην ακτίνη. Μετά την ακολουθούμενη φαγοκύτωση από τα φαγοκύτταρα του ξενιστή, η Listeria είναι ικανή να αποδράσει από το φαγόσωμα, όπως έχει αναφερθεί παραπάνω. Μέσα στο κυτόπλασμα τον κυττάρου, η Listeria καλύπτεται από μεγάλο αριθμό νημάτων ακτίνης. Αυτά τα νημάτια ακτίνης επαναοργανώνονται για να σχηματίσουν πολικές ουρές, οι οποίες φαίνεται να συνδέονται με την ενδοκυτταρική κίνηση και τη διακυτταρική μεταφορά. Το σύμπλεγμα αυτό, με το κύτταρο της Listeria στην άκρη του, κινείται με κάποια ταχύτητα στην επιφάνεια ταυ κυττάρου ξενιστή παράγοντας μια ψευδοποδική προβολή στη μεμβράνη. Το ψευδόποδο ακουμπάει ένα γειτονικό κύτταρο, το διεγείρει για να φαγοκυττώσει την προβολή που περιέχει το μικρόβιο. H Listeria τότε χρησιμοποιεί την αιμολυσίνη της για να διαλύσει την διπλή μεμβράνη που το περιβάλλει και μπαίνει στο κυτόπλασμα του δεύτερου κυττάρου ξενιστή, ο κύκλος επαναλαμβάνεται. Έρευνες 20,22 συγκλίνουν πως σε αυτή την διαδικασία συνεισφέρει και μια ειδική φωσφολιπάση της φωσφατιδυλοχολίνης (PC- PLC). Μεταλλαγμένα κύτταρα που είναι ανίκανα να συγκεντρώσουν νημάτια ακτίνης είναι ικανά να μπουν στα μακροφάγα, να αποδράσουν στο κυτόπλασμα και να αναπτυχθούν σε αυτό αλλά δεν μπορούν να διασκορπιστούν σε άλλα μακροφάγα. Η χρήση του αναστολέα της 29

πρωτεϊνοσύνθεσης χλωραμφενικόλης έδειξε ότι το υλικό που επάγει την συνάθροιση της ακτίνης (ίσως PC-PLC) εκκρίνεται από το κύτταρο Listeria και όχι από το μακροφάγο. 26 Σημαντικός παράγοντας για την εμφάνιση νόσου μετά από μόλυνση με τη L. m. είναι η ευπάθεια του μολυνθέντος. Ευπάθεια προς τη λιστερίωση έχουν άτομα με μειωμένη τη φυσική ανοσολογική κατά των λοιμώξεων άμυνα κυρίως σε ότι έχει σχέση με την κυτταρική ανοσία και άτομα ανοσοκατεσταλμένα λόγω νόσου ή θεραπευτικής αγωγής ή φαρμακοθεραπείας. Φυσική ευπάθεια έχουν οι έγκυες και τα άτομα άνω των 65 ετών. 18 Άλλοι παράγοντες που έχει αναφερθεί ότι συμβάλλουν στην παθογένεια: Οι Pearson και Marth αναφέρουν την ύπαρξη μίας τοξίνης της Listeria monocytogenes, cytotonic τoxin, η οποία φαίνεται πως έχει την δυνατότητα να λύει κύτταρα του ιστού (πχ. ερυθροκύτταρα), όπως ακριβώς και η λιστεριολυσίνη Ο και συμβάλλει στην παθογένεια του οργανισμού. Επιπρόσθετα, η Listeria διαθέτει δράση φωσφατάσης γεγονός το οποίο ίσως συνδέεται με την παθογένεια της. 19 Επίσης, οι ενώσεις σιδήρου βελτιώνουν την in vitro ανάπτυξη του οργανισμού, προτείνοντας μια πιθανή ανάμιξη του μεταβολισμού του σιδήρου από τον ξενιστή στη διαδικασία της μόλυνσης. Η σύνθεση της αιμολυσίνης της L.m. αυξάνεται όταν μειώνεται η συγκέντρωση του σιδήρου στο μέσο ανάπτυξης, ίσως έχοντας σαν αποτέλεσμα in vivo την αυξημένη λύση των ερυθροκυττάρων ως μια πηγή σιδήρου. 12 Μελέτες που έγιναν στις επιφανειακές πρωτεΐνες της Listeria monocytogenes έδειξαν πως παρουσίαζε αξιοσημείωτες διαφοροποιήσεις από την L. innocua, γεγονός που σχετίστηκε με την ικανότητα που παρουσιάζει η L.m. να επιζεί σε πολλά περιβάλλοντα και να αλληλεπιδρά με έναν μεγάλο αριθμό διαφορετικών κυττάρων. Επίσης προέκυψε, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, ότι επιφανειακές πρωτεΐνες που συνδέονται ομοιοπολικά με την πεπτιδογλυκάνη με το καρβοξυ-τελικό άκρο τους, φαίνεται να συμβάλλουν στην παθογένεια του βακτηρίου. 22 Η τοξικότητα του οργανισμού επηρεάζεται από την θερμοκρασία ανάπτυξής της. 27 Η ανάπτυξη της L.m. σε χαμηλές θερμοκρασίες (4 ο C) αυξάνει την τοξικότητά της όταν εισέρχεται ενδοφλεβίως σε ποντίκια, ωστόσο δεν 30

φαίνεται να επηρεάζει ποντίκια τα οποία μολύνθηκαν δια του στόματος. Σε αυτό το φαινόμενο ίσως να οφείλεται η αύξηση της τοξικότητας τον οργανισμού σε τρόφιμα που βρίσκονται σε θερμοκρασία ψυγείου 12. Η λιστερίωση διακρίνεται σε: Λιστερίωση νεογνών, που εκδηλώνεται κυρίως με μηνιγγίτιδα και σηψαιμία. Η μόλυνση του νεογνού μπορεί να είναι ενδομήτρια από κατάποση αμνιακού υγρού αλλά μπορεί και να έγινε κατά τον τοκετό από τον κόλπο της μητέρας. Πάντως δεν πρόκειται για ενδονοσοκομειακή μόλυνση. Στη νεογνική λιστερίωση η L.m συνήθως απομονώνεται από το αίμα. Λιστερίωση εγκύων γυναικών, που εμφανίζεται σαν ελαφριά εμπύρετη νόσος με διάρροια στην έναρξή της, που μοιάζει με γρίπη. Το έμβρυο μολύνεται, νοσεί με αποτέλεσμα την αποβολή του κατά τους πρώτους μήνες της εγκυμοσύνης. Άλλη έκβαση είναι η γέννηση νεκρού παιδιού και η ελαφρότερη ο πρόωρος τοκετός. Λιστερίωση των ανοσοκατασταλμένων, που προκαλεί ποικίλες λοιμώξεις όπως ενδοκαρδίτιδα, αρθρίτιδα, πνευμονίτιδα, εγκεφαλικό απόστημα. Οι πιο ευπαθείς είναι οι μεταμοσχευμένοι. Σε αυτή την περίπτωση η L.m. απομονώνεται από το αίμα. Λιστερίωση των υγιών ενηλίκων, που εμφανίζεται σαν νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος κυρίως σαν εγκεφαλίτιδα με υψηλή θνητότητα. Εκτός της εγκεφαλίτιδας, μηνιγγίτιδας και του αποστήματος του εγκεφάλου η λιστερίωση στους ενήλικες σπάνια εκδηλώνεται ως πνευμονία, πνευμονίτιδα, πλευρίτιδα, σηπτική αρθρίτιδα, ενδοκαρδίτιδα, περιτονίτιδα. 18 Η διάγνωση της νόσου βασίζεται στην απομόνωση του μικροοργανισμού από το αίμα, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό και το αμνιακό υγρό τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν περιέχουν μικρόβια. Αντίθετα, τα κόπρανα και τα κολπικά υγρά δεν προσφέρονται για διαγνωστική καλλιέργεια διότι βρίσκονται θετικές καλλιέργειες στο 5% των φυσιολογικών ατόμων. Ορολογικές δοκιμασίες που βασίζονται στην ανάπτυξη αντισωμάτων έναντι της L.m. δεν προσφέρονται για διάγνωση, διότι πολλά φυσιολογικά άτομα που έχουν ήδη 31

μολυνθεί έχουν δημιουργήσει αντισώματα και στους πάσχοντες από λιστερίωση δεν αυξάνεται υποχρεωτικά η συγκέντρωση των εν λόγω αντισωμάτων. 19 Αν και σε μερικές περιπτώσεις έχουμε ίαση χωρίς κάποια θεραπεία, η έγκαιρη αντιβιοτική θεραπεία κρίνεται απαραίτητη προκειμένου να αποφευχθούν μόνιμες βλάβες ή ένας πιθανός θάνατος. Η L.m. σε καλλιέργειες in vitro είναι πολύ ευαίσθητη σε αντιβιοτικά όπως η πενικιλλίνη, η αμπικιλλίνη, η τετρακυκλίνη, η ερυθρομυκίνη και η χλωραμφαινικόλη. 12 Για την θεραπεία των λιστεριώσεων απαραίτητη είναι η διεισδυτικότητα του/των αντιβιοτικών μέσα στα κύτταρα όπου βρίσκεται η L.m. και η μικροβιοκτόνος δράση αυτών. Η πενικιλλίνη παρόλο ότι in vitro είναι μικροβιοκτόνος για την L.m. δεν είναι διεισδυτική. Προτιμάται η αμπικιλλίνη. Οι αμινογλυκοσίδες ενισχύουν τη μικροβιοκτόνο δράση της αμπικιλλίνης, ακόμη και της πενικιλλίνης, γι αυτό η θεραπεία γίνεται με συνδυασμό αμπικιλλίνης με γενταμικίνη. Οι κεφαλοσπορίνες, ακόμα και της 3 ης γενεάς δεν θεραπεύουν γιατί η πενικιλλινο-συνδετική-πρωτεΐνη-3 (ΡΚΡ-3) της L. mοnocytogenes έχει μειωμένη συνδετική ικανότητα με τις κεφαλοσπορίνες. Είναι ανθεκτικό στη μοξαλακτάμη. Επιτυχείς ήταν συνδυασμοί αμινοπενικιλλινώνη ουρεϊδοπενικιλλινών με αναστολείς βλακτασμάσης, ή καρμπαπενέμη, στη θεραπεία βαριών λιστεριώσεων. Η λιστερίωση που διαγνώστηκε κατά τη διάρκεια κύησης αντιμετωπίζεται μόνο με αντιβιοτικά ή απαλλαγή του εμβρύου. 18 1.6.1 Η λιστερίωση στην Ελλάδα Η επιτήρηση της λιστερίωσης μέσω του συστήματος υποχρεωτικής δήλωσης νοσημάτων ξεκίνησε στην Ελλάδα το 2004. Συνολικά, το διάστημα 2004-2011 δηλώθηκαν 52 κρούσματα λιστερίωσης στη χώρα μας. 28 Η κατανομή των δηλωθέντων κρουσμάτων, καθώς και η επίπτωση της λιστερίωσης κατ έτος για το χρονικό διάστημα 2004-2011 παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.1. Το διάστημα 2004-2011, το νόσημα παρουσίασε υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης στην ηλικιακή ομάδα 65 έτη και άνω (μέση ετήσια δηλούμενη επίπτωση: 1,9 κρούσματα/1.000.000 πληθυσμού), με δεύτερη σε συχνότητα την ηλικιακή ομάδα 0-4 έτη (0,5 κρούσματα/1.000.000 πληθυσμού). Κατά την ίδια περίοδο, η μέση ετήσια δηλούμενη επίπτωση παρουσίασε μικρή διαφορά 32

μεταξύ των δύο φύλων (άνδρες: 0,6 κρούσματα/1.000.000 πληθυσμού, γυναίκες 0,5 κρούσματα/1.000.000 πληθυσμού). 28 Πίνακας 1.1: Αριθμός δηλωθέντων κρουσμάτων και επίπτωση της λιστερίωσης στην Ελλάδα. (Πηγή: ΚΕΕΛΠΝΟ) Έτος Αριθμός κρουσμάτων Ετήσια επίπτωση (ανά 1.000.000 πληθυσμού) 2004 3 0,27 2005 8 0,72 2006 7 0,62 2007 10 0,90 2008 1 0,10 2009 4 0,35 2010 10 0,90 2011 9 0,80 Η επίπτωση της λιστερίωσης κατά φύλο και ηλικιακή ομάδα παρουσιάζεται στο Γράφημα 1.1. Σχήμα 1.2: Επίπτωση της λιστερίωσης (κρούσματα/1.000.000 πληθυσμού) κατά φύλο και ηλικιακή ομάδα στην Ελλάδα. (Πηγή: ΚΕΕΛΠΝΟ) 33

1.7 Ευρωπαϊκή Νομοθεσία Η ισχύουσα νομοθεσία στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα περί μικροβιολογικών κριτηρίων για τα τρόφιμα που θεσπίστηκε με τον Ευρωπαϊκό Κανονισμό(ΕΚ) αριθ. 1/2005 29 της Επιτροπής στις 15/11/2005 και τον Κανονισμό(ΕΚ) αριθ. 1441/2007 30 της Επιτροπής στις 5/12/2007 ορίζει απουσία της L. monocytogenes σε 25 g τροφίμου έτοιμου για κατανάλωση που προορίζεται για βρέφη και για ειδικούς ιατρικούς σκοπούς. Σε τρόφιμα έτοιμα για κατανάλωση ικανά να υποστηρίξουν την ανάπτυξη του παθογόνου διαφορετικά από εκείνα που προορίζονται για βρέφη και για ειδικούς ιατρικούς σκοπούς ορίζεται ως ανώτατο επιτρεπτό όριο τα 100 κύτταρα/g (cfu/g) υπό την προϋπόθεση ότι ο παρασκευαστής μπορεί να αποδείξει, ικανοποιώντας την αρμόδια αρχή, ότι το προϊόν δε θα υπερβεί το όριο των 100 cfu/g καθ όλη τη διάρκεια διατήρησης. Σε αντίθετη περίπτωση, εφαρμόζεται το κριτήριο απουσία της L. monocytogenes σε 25 g, πριν το τρόφιμο αποδεσμευτεί από τον άμεσο έλεγχο του υπευθύνου της επιχείρησης τροφίμων που το παρήγαγε. Σημειώνεται ότι για τα έτοιμα για κατανάλωση τρόφιμα μη ικανά να υποστηρίξουν την ανάπτυξη της L. monocytogenes, δεν απαιτείται εφαρμογή του παραπάνω εναλλακτικού κριτηρίου, δηλαδή ισχύει το όριο των 100 cfu/g. Τα προϊόντα με ph 4.4, ή a w 0.92, τα προϊόντα με ph 5.0 και a w 0.94, και τα προϊόντα με διάρκεια διατήρησης μικρότερη από πέντε ημέρες θεωρούνται αυτομάτως ότι ανήκουν σε αυτή την κατηγορία. Άλλες κατηγορίες προϊόντων μπορούν επίσης να ανήκουν σ αυτήν την κατηγορία, εφόσον αποδεικνύεται επιστημονικά. 34

1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2. ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ΕΜΠΟΔΙΩΝ 2.1 Εισαγωγή Η L.m. καταφέρνει να αναπτύσσεται σε μία ποικιλία προϊόντων όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο 1 ( 1.5), και πιο συχνά επιμολύνει μαγειρεμένα, προπαρασκευασμένα και έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα (RTE). Στους επιβεβαιωμένους φορείς της μόλυνσης στην περίπτωση λιστερίωσης συμπεριλαμβάνονται οι προπαρασκευασμένες λαχανοσαλάτες με σάλτσα, το σοκολατούχο γάλα, διάφορα μαλακά τυριά ( 5.1) μαγειρεμένο κοτόπουλο και καπνιστά μύδια. 18,31 Η σύγχρονη νομοθετική πολιτική ( 1.7) έχει υποδείξει την ανάγκη για νέες στρατηγικές στη συντήρηση των τροφίμων με αντικείμενο να αδρανοποιηθεί το βακτήριο της L.m. H επιτρεπόμενη δόση δεν είναι γνωστή, αλλά από πολλές χώρες και από την International Commission on Microbiological Specifications είναι αποδεκτό ότι τρόφιμο που περιέχει λιγότερο από 100 cfu L.m. ανά γραμμάριο είναι ασφαλές. 32,33,34 2.2 Η αρχή της τεχνολογίας των εμποδίων Κατά το παρελθόν για την περιγραφή των μεθόδων οι οποίες εφαρμόζονταν για την διατήρηση των τροφίμων, γινόταν χρήση των εννοιών θέρμανση, αποξήρανση, αλάτισμα, οξίνιση, κ.τ.λ. Με την πάροδο του χρόνου όμως μελέτες έδειξαν ότι οι γνωστές μέχρι πρόσφατα μέθοδοι συντήρησης των τροφίμων ελαφρώς αναστέλλουν ή ίσως και υποβοηθούν ορισμένους παθογόνους μικροοργανισμούς παρά τους αδρανοποιούν, αλλά και ότι κάποιες πιο δραστικές επεξεργασίες μεταβάλλουν ορισμένα από τα επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων. 33 Για αυτούς τους λόγους η επιστημονική έρευνα οδηγήθηκε στην ανάπτυξη της τεχνολογίας του συνδυασμού δύο ή και περισσοτέρων παραγόντων διατήρησης, για ακόμα καλύτερα αποτελέσματα. Οι παράγοντες αυτοί, διατήρησης των τροφίμων ονομάστηκαν εμπόδια (hurdles). Ο όρος αυτός σήμερα, δηλώνει όλους τους πιθανούς συνδυασμούς μεθόδων συντήρησης στα τρόφιμα. Από την κατανόηση του όρου εμπόδιο, πηγάζει και αντλείται η τεχνολογία εμποδίων, 35

που σαν στόχο έχει, όχι μόνο να πετύχει την ασφάλεια και τη σταθερότητα ενός συγκεκριμένου τροφίμου, αλλά και να βελτιώσει τη μικροβιολογική ποιότητα του τροφίμου με τη βελτιστοποίηση και την επιδέξια τροποποίηση του ρόλου των εμποδίων. Ένα επιπλέον βήμα είναι, κατά τον σχεδιασμό του τροφίμου, όχι μόνο προς την κατεύθυνση της μικροβιολογικής ασφάλειας και σταθερότητας, αλλά και ως προς την θρεπτική ποιότητα και την εμφάνισή του. Το μεγάλο πλεονέκτημα της όλης λογικής, που διέπει αυτού του είδους την τεχνολογία, είναι το γεγονός ότι έχει τη δυνατότητα, γνωρίζοντας τη φύση και τη χημεία του τροφίμου που διατίθεται, να επιλέξει να ρυθμίσει αυτούς τους παράγοντες που θα αλλοιώσουν ελάχιστα τη φυσική του κατάσταση. 27,34,35 Συνθήκες όπως η ελάττωση του ph, η προσθήκη οργανικών οξέων (π.χ. γαλακτικό οξύ, φαινολικά οξέα) ή αλάτων τους (διοξικό νάτριο, γαλακτικό νάτριο), βακτηριοσίνες (π.χ. νισίνη) και αιθέρια έλαια (π.χ. καρβακόλη), συχνά αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία ως τεχνολογικά εμπόδια για τους μικροοργανισμούς. Πίνακας 2.1: Παράμετροι συντήρησης των τροφίμων, τα επονομαζόμενα εμπόδια. ΦΥΣΙΚΑ ΕΜΠΟΔΙΑ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΑ ΕΜΠΟΔΙΑ Θερμική επεξεργασία (π.χ. αποστείρωση, παστερίωση, λεύκανση) Ψύξη Ακτινοβόληση α w pη ERH NaCl Ηλεκτρομαγνητική ενέργεια NaNO 2 Υψηλή υδροστατική πίεση (UHP) CO 2 Παλλόμενα ηλεκτρικά πεδία (PEF) Οργανικά οξέα Υπέρηχοι Συντηρητικά MAP Κάπνισμα Ασηπτική συσκευασία Μπαχαρικά Μικροϋφή Ανταγωνιστική μικροχλωρίδα Βακτηριοσίνες Η τεχνολογία συνδυασμού εμποδίων αυτή τη στιγμή κυριαρχεί στο διεθνές ερευνητικό στερέωμα. Το να διερευνηθεί σε βάθος πως τα βακτήρια αισθάνονται και αποκρίνονται σε παράγοντες που τους προκαλούν στρες θα συμβάλλει ουσιαστικά στο σχεδιασμό ήπιων επεξεργασιών που θα 36

συνδυάζουν τη μέγιστη ασφάλεια με τις απαιτήσεις του καταναλωτή για υγιεινά προϊόντα. 36 2.3 Επίδραση του ψύχους στο βακτήριο Listeria monocytogenes Το ιστορικό των συνθηκών της θερμοκρασίας στην οποία αναπτύχθηκε ο μικροοργανισμός είναι μία από τις πιο σημαντικές παραμέτρους που επηρεάζουν την τύχη του εντός του τροφίμου. Γενικά, οι μικροοργανισμοί είναι πιθανό να αντιμετωπίσουν διάφορες θερμοκρασίες σ ένα περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων που μπορεί να φέρει επιπτώσεις στο χρόνο προσαρμογής τους. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε θερμοκρασία κατώτερη της βέλτιστης μπορεί να προκαλέσει έναν αριθμό φυσιολογικών και μορφολογικών αλλαγών, μεταβολική ανισορροπία όπως επίσης και διακοπή της ανάπτυξης εξαιτίας της ευπάθειας ορισμένων ρυθμιστικών μεταβολικών διεργασιών. Όταν η θερμοκρασία μειώνεται, κάποια συστατικά, που υπό φυσιολογικές συνθήκες είναι ρευστά, περνούν σε κατάσταση πηκτής εμποδίζοντας τη σωστή λειτουργία των πρωτεϊνών και οδηγούν στη διάρρηξη της μεμβράνης και συνεπώς στην καταστολή της. Σε αντίθεση, στη Listeria monocytogenes ο κυριότερος τρόπος προσαρμογής της μεμβράνης σε χαμηλή θερμοκρασία (5 ο C) είναι η μεταβολή στη σύσταση των λιπαρών οξέων της μεμβράνης κατά τέτοιο τρόπο που της επιτρέπει να επιτελεί τις λειτουργικές ιδιότητες και να επιβιώνει. 10,27,37 Η κατανόηση του μηχανισμού προσαρμογής των μικροοργανισμών θα βοηθήσει στη βελτίωση του μικροβιολογικού ελέγχου στους χώρους παραγωγής τροφίμων αλλά και στα ίδια τα τρόφιμα. 36 Η προσαρμογή των κυττάρων σε χαμηλή θερμοκρασία απαιτεί μεγάλα ποσά ενέργειας και επομένως σ αυτό το στάδιο σταματά η κυτταρική διαίρεση με αποτέλεσμα την αύξηση της διάρκειας της λανθάνουσας φάσης. 36,38 Οι μικροοργανισμοί που επιμολύνουν ένα τρόφιμο και έχουν προηγουμένως προσαρμοστεί σε χαμηλή θερμοκρασία, έχουν ήδη αναπτύξει το μηχανισμό αντίστασης. Οπότε έτσι υπάρχει η δυνατότητα να ευνοηθεί η ανάπτυξη του μέσα στο ψυχρό τρόφιμο που επιμολύνει και αυτό συμβάλλει στο να παρατηρηθεί μικρότερης διάρκειας λανθάνουσα φάση. Το αποτέλεσμα είναι να ξεκινά η ανάπτυξή του γρηγορότερα ελαττώνοντας έτσι τη χρονική διάρκεια 37

της ασφάλειας του τροφίμου σε σχέση με τον μικροοργανισμό που έχει επιμολύνει το ίδιο ψυχρό τρόφιμο αλλά έχει αναπτυχθεί υπό κανονικές συνθήκες. 11 2.4 Επίδραση της ωσμωτικής πίεσης στο βακτήριο Listeria monocytogenes Η αύξηση της ωσμωτικής πίεσης (με μείωση της ενεργότητας του νερού) είναι μία από τις ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους για τη συντήρηση των τροφίμων. Με αυτήν, επιτυγχάνεται η μείωση του διαθέσιμου νερού ενός μικροοργανισμού. Η ενεργότητα ενός προϊόντος είναι πολύ σημαντική για τη βακτηριακή ανάπτυξη και οι μικροοργανισμοί έχουν ελάχιστο όριο a w κάτω από το οποίο δε μπορούν να αναπτυχθούν. Η τιμή της a w εξαρτάται από το είδος της διαλυμένης ουσίας που χρησιμοποιείται όπως: 1) άλατα (NaCl, KCl), 2) σάκχαρα (γλυκόζη, σακχαρόζη) και 3) γλυκερόλη. 36 Η απόκριση στην αλατότητα αφορά τις πολικές κεφαλές των μεμβρανικών λιποειδών. Η Listeria monocytogenes αντιδρά στην προσθήκη διαλύματος 2% NaCl (w/v) στο θρεπτικό υλικό, αυξάνοντας τον λόγο διφωσφατιδυλογλυκερόλης προς φωσφατιδυλογλυκερόλη σε σύγκριση με καλλιέργειες ελέγχου. Μια άλλη σημαντική ωσμωρυθμιστική μεταβολή αποτελεί η συσσώρευση κάποιων μορίων προστατών, «ωσμωλυτών». Το σπουδαιότερο τέτοιο μόριο βρέθηκε να είναι η γλυκίνη βεταΐνη. Οι ωσμωλύτες σταθεροποιούν τα ενδοκυτταρικά ένζυμα και άλλες πρωτεΐνες και τους επιτρέπουν να συνεχίσουν να λειτουργούν ακόμα και όταν μειωθεί η ενεργότητα του ύδατος. 39,40 2.5 Επίδραση της θερμικής επεξεργασίας στο βακτήριο Listeria monocytogenes Η ομαδική λιστερίωση στη Μασαχουσέτη το 1983, που συνδέθηκε με την κατανάλωση παστεριωμένου γάλακτος έφερε στο προσκήνιο το ερώτημα της θερμοανθεκτικότητας της L.m. Πολλές έρευνες έγιναν έκτοτε που αφορούσαν την επίδραση της παστερίωσης (high temperature, short time, HTST, 71,7ºC για 15 sec) σύμφωνα με τις οποίες η L.m. δε δύναται να επιβιώσει. Ωστόσο σύμφωνα με κάποιες άλλες έρευνες οι συνθήκες της παστερίωσης δεν παρέχουν αρκετή ασφάλεια καθώς μπόρεσε να ανακτηθεί L.m. από επιμολυσμένο γάλα που παστεριώθηκε δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση και 38

για διάστημα τριών εβδομάδων ενώ δε μπόρεσε να ανακτηθεί αμέσως μετά την παστερίωση. Αυτό δείχνει τη σημασία που έχουν οι τεχνικές ανάκτησης που χρησιμοποιούνται σε θερμικά καταπονημένους οργανισμούς. Οι μικροβιολόγοι του Center for Disease Control and Prevention (CDC) ισχυρίζονται ότι η Listeria μπορεί να επιζήσει στο γάλα μετά την παστερίωση γιατί το μικρόβιο αυτό βρίσκεται μέσα στα μακροφάγα κύτταρα του μαστού του ζώου. Στη θερμοκρασία της παστερίωσης δεν καταστρέφονται τα κύτταρα αίματος. Επίσης, η Listeria βρέθηκε σε παγωτά από παστεριωμένο γάλα καθώς και σε σκόνη γάλα. 12 Εάν η L.m. εκτεθεί σε μη θανατηφόρες γι αυτήν θερμοκρασίες (π.χ. 44 ºC έως 48 ºC για 20 με 60 min) πριν να υποβληθεί στην τελική θερμοκρασία της παστερίωσης, τα κύτταρα αποκτούν αυξημένη θερμοανθεκτικότητα. Σ αυτή φαίνεται να συμβάλλουν δύο παράγοντες οι heat-shock πρωτεΐνες και η ημίρρευστη μεμβράνη. 12 2.6 Επίδραση του χαμηλού ph στο βακτήριο Listeria monocytogenes Γενικά, τα βακτήρια αναπτύσσονται και επιβιώνουν σε τιμές 4<pH<8, ενώ οι ζύμες και οι μύκητες μπορούν να αναπτυχθούν και να επιβιώσουν σε μεγαλύτερο εύρος ph. Οι μικροοργανισμοί, δηλαδή, έχουν βέλτιστα όρια εξωτερικού ph για ανάπτυξη και επιβίωση και έτσι η οξίνιση είναι αρκετά αποτελεσματική στον έλεγχο της μικροβιακής ανάπτυξης. Οι μικροοργανισμοί είναι γενικά πιο ευαίσθητοι σε αλλαγές του phi (εσωτερικό ph) παρά σε αλλαγές του εξωτερικού ph (ph ο ), παρότι σημαντικές αλλαγές σε ένα από τα δύο θα οδηγήσει σε απώλεια βιωσιμότητας. Επειδή τα ισχυρά οξέα δεν επηρεάζουν το ph του κυτοπλάσματος στον ίδιο βαθμό με τα ασθενή οξέα, απαιτούνται σχετικά μεγάλες αλλαγές στο ph ο για την αποτελεσματική συντήρηση των τροφίμων, κάτι που μπορεί να είναι επιζήμιο στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίμου. Ωστόσο, οι μικροοργανισμοί μπορούν να επιβιώνουν σε συνθήκες χαμηλού ph και παρ ότι η ανάπτυξη μπορεί να έχει σταματήσει, τα κύτταρα μπορεί να εξακολουθούν να είναι μεταβολικά ενεργά. 36 39

Τρόπος δράσης του ph Αντίθετα με τα αδιάστατα ασθενή οξέα, που μπορούν να διαχέονται ελεύθερα διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης και να ιονίζονται στο κύτταρο παρέχοντας πρωτόνια που οξινίζουν το εσωτερικό του, τα ισχυρά οξέα ελαττώνουν το ph ο, αλλά δεν είναι ικανά να διαπεράσουν την κυτταρική μεμβράνη. Αυτά τα οξέα ασκούν την αντιμικροβιακή τους δράση μετουσιώνοντας τα ένζυμα που υπάρχουν στην κυτταρική επιφάνεια και ελαττώνοντας το phi, εξαιτίας της αυξημένης διαπερατότητας πρωτονίων όταν η διαφορά ph ο - phi είναι μεγάλη. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μείωση του ρυθμού ανάπτυξης και επιμήκυνση της λανθάνουσας φάσης. Οι μηχανισμοί προσαρμογής σε χαμηλό ph ποικίλλουν, αλλά όλοι βασίζονται στη διατήρηση της ομοιόστασης του ph. Τα βακτήρια επιβιώνουν σε όξινο περιβάλλον εξαιτίας της ικανότητας τους να ρυθμίζουν το phi τους κυρίως με την ελεγχόμενη κίνηση των κατιόντων διαμέσου της μεμβράνης. Διατηρούν δηλαδή την ομοιόσταση του ph (ph κοντά στην ουδετερότητα για τα βακτήρια). Αυτό επιτυγχάνεται με συνδυασμό ενεργητικών και παθητικών μηχανισμών μεταφοράς. 36 Επίδραση του χαμηλού ph στη σύσταση των λιπαρών οξέων της μεμβράνης Όπως και με τη χαμηλή ή υψηλή θερμοκρασία, η μεμβρανική λιποειδική σύσταση μπορεί να επηρεαστεί από το ph του μέσου ανάπτυξης και πιθανόν αυτό αντιπροσωπεύει μια διαδικασία προσαρμογής σε χαμηλό ph. Γενικά, έχει παρατηρηθεί ότι οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται σε χαμηλό ph παρουσιάζουν μείωση του λόγου των ακόρεστων προς τα κεκορεσμένα λιπαρά οξέα με σύγχρονη αύξηση του ποσού των κυκλοπροπανικών λιπαρών οξέων. Η μεταβολή αυτή οδηγεί σε μείωση της ρευστότητας της μεμβράνης προστατεύοντας το κύτταρο από το χαμηλό ph. 36 Πρόσφατη έρευνα 41 έδειξε ότι το βακτήριο μπορεί να αλλάζει τη σύσταση των λιπιδίων της μεμβράνης μετά από όξινο στρες. Μελετήθηκαν οι μεταβολές των φωσφο- και ουδέτερων λιπιδίων καθώς και των λιπαρών οξέων τους κατά την προσαρμογή της Listeria monocytogenes σε χαμηλό ph (5,5) που προερχόταν από διάφορα οξέα (οξικό, γαλακτικό κ.λ.π.). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το χαμηλό ph ενισχύει την αντιμικροβιακή δράση ενός οξέος και ότι 40