Παραγωγή, απομόνωση και χαρακτηρισμός της δράσης μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης

Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής Παραγωγή, απομόνωση και χαρακτηρισμός της δράσης μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης Σταματίνα Κουτρουμπή Βιολόγος Μεταπτυχιακή Εργασία Πάτρα 2012

Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Καθηγητής Σ. Τζάρτος (Επιβλέπων), Τμήμα Φαρμακευτικής Παν. Πατρών 2. Επ. Καθηγητής Γ. Πατρινός, Τμήμα Φαρμακευτικής Παν. Πατρών 3. Επ. Καθηγητής Κ. Πουλάς, Τμήμα Φαρμακευτικής Παν. Πατρών 2

Ευχαριστίες Η διπλωματική αυτή εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια τίτλου ειδίκευσης στην Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία και Βιοϊατρική του τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών. Η υλοποίησή της έγινε στο Εργαστήριο Μοριακής Νευροβιολογίας και Ανοσολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ σε συνεργασία με το εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών με επιστημονικό υπεύθυνο τον Καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο τον οποίο και ευχαριστώ θερμά για την ευκαιρία που μου έδωσε να εργαστώ στο συγκεκριμένο αντικείμενο, για την υποστήριξη και για την διαρκή καθοδήγηση που μου παρείχε. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τους Επίκουρους Καθηγητές κ. Κωνσταντίνο Πουλά και κ. Γεώργιο Πατρινό για την υποστήριξη και τις χρήσιμες συμβουλές που μου παρείχαν για την ολοκλήρωση και συγγραφή αυτής της εργασίας. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τα μέλη των δύο εργαστηρίων για τη συνεργασία και τη γενικότερη υποστήριξη. Ειδικότερα την κα Άννα Κόκλα και τον κ. Νίκο Τράκα για τις συμβουλές και την σημαντική συμβολή τους για τη διεξαγωγή της εργασίας. Επίσης, τον Πέτρο και το Χρήστο για τη διαρκή υποστήριξη και βοήθεια που μου παρείχαν καθώς και τον Κώστα, το Μάριο, τη Βούλα, τον Αλέξανδρο, τη Γιώτα, το Λευτέρη και το Θανάση. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου για τη συμπαράσταση που μου παρείχε κατά τη διάρκεια όλων των σπουδών μου. 3

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 7 Νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης... 7 1.1 Γενικά... 7 1.2 Νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης μυϊκού τύπου... 7 1.2.1 Στοιχειομετρία... 7 1.2.2 Νευρομυϊκή σύναψη... 8 1.2.3 Μυασθένεια... 9 1.3 Νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης νευρικού τύπου... 11 1.3.1 Στοιχειομετρία... 11 1.3.2 Νευρικού τύπου nachrs και συναπτική πλαστικότητα... 12 1.3.3 Νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης α4β2 Ασθένειες, εθισμός στο κάπνισμα... 13 1.3.4 Γονίδια μυϊκού και νευρικού τύπου nachr... 17 1.4 Δομή υποδοχέα ακετυλοχολίνης... 18 1.4.1 Τρισδιάστατη δομή nachr... 19 1.5 Μόρια προσδέτες του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης... 21 1.5.1 Ακετυλοχολίνη... 21 1.5.2 α-μπουγκαροτοξίνη... 22 1.5.3 κ-μπουγκαροτοξίνη... 22 1.5.4 Νικοτίνη... 23 1.5.5 Επιβατιδίνη... 23 1.6 Αλλοστερικές καταστάσεις nachr... 23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 25 Ετερόλογη έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος των υπομονάδων α4 και β2 του ανθρώπου συνδεδεμένες με συνδέτη... 25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3... 26 Ανοσοσφαιρίνες... 26 3.1 Δομή ανοσοσφαιρινών... 26 3.2 Διέγερση Β λεμφοκυττάρων από αντιγόνο και παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων στον οργανισμό... 27 3.3 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων από υβριδώματα... 28 3.4 Χρήσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων... 29 3.5 Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. 31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4... 32 Σκοπός της εργασίας... 32 4.1 Πρώτο Μέρος... 32 4.2 Δεύτερο Μέρος... 33 ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ... 34 4

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5... 38 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του β2-α4... 38 5.1 Ανοσοποίηση ποντικών και αρουραίων... 38 5.1.1 Προετοιμασία ενέσεων... 38 5.2 Έλεγχος ανοσοποίησης πειραματόζωων... 39 5.2.2 Ραδιο-ανοσοπροσδιορισμός (Radio-immunoassay, RIA)... 39 5.3 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων με υβριδώματα... 40 5.3.1 Μέθοδος κυτταρικής σύντηξης και δημιουργίας υβριδωμάτων... 40 Επεξεργασία κυττάρων σπλήνα ζώου... 41 Επεξεργασία μυελωματικών κυττάρων... 42 Σύντηξη σπληνικών και μυελωματικών κυττάρων... 42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6... 43 Χαρακτηρισμός μονοκλωνικών αντισωμάτων... 43 6.1 Ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA)... 43 6.2 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-Page)... 44 Παρασκευή πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου... 45 Προετοιμασία δειγμάτων πρωτεϊνών... 45 Ηλεκτροφόρηση... 45 Χρώση για εντοπισμό των πρωτεϊνών στο πήκτωμα... 46 6.3 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting)... 46 Μεταφορά πρωτεϊνών από πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης... 46 Ανίχνευση πρωτεϊνών... 47 6.4 Προσδιορισμός υποκατηγορίας μονοκλωνικών αντισωμάτων... 48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7... 48 Απομόνωση μονοκλωνικών αντισωμάτων και πέψη για δημιουργία Fab... 48 7.1 Καλλιέργεια μονοκλωνικών αντισωμάτων σε ειδικού τύπου φλάσκα... 48 7.2 Κατακρήμνιση αντισωμάτων με θειικό αμμώνιο... 49 Αρχή μεθόδου... 49 Πορεία διεξαγωγής... 49 7.3 Συμπύκνωση και αλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος μονοκλωνικών αντισωμάτων... 50 7.4 Πέψη αντισωμάτων με παπαΐνη για τη δημιουργία Fab τμημάτων... 50 Αρχή μεθόδου... 50 Πορεία διεξαγωγής... 50 7.5 Διαχωρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία... 51 Αρχή μεθόδου... 51 Πορεία διεξαγωγής... 52 7.6 Ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης (Isoelectric focusing, IEF)... 52 Αρχή μεθόδου... 52 5

Πορεία διεξαγωγής... 53 Προετοιμασία πηκτώματος αγαρόζης... 53 Ηλεκτροφόρηση... 53 Μονιμοποίηση και χρώση του πηκτώματος... 53 7.7 Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με φασματοφωτομέτρηση Μέθοδος Bradford... 54 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8... 55 Παραγωγή και χαρακτηρισμός μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του ECD συγκαταμερούς β2-α4... 55 8.1 Αποτελέσματα ανοσοποίησης ποντικών και αρουραίων... 55 8.2 Διαδικασία παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη βοήθεια υβριδωμάτων... 56 8.3 Έλεγχος των κλώνων για έκκριση αντισωμάτων έναντι του β2-α4... 57 8.4 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων... 57 8.5 Χαρακτηριστικά των παραγόμενων μονοκλωνικών αντισωμάτων... 57 8.5.1 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr1... 59 8.5.2 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr2... 61 8.5.3 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr3... 62 8.5.4 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr4... 63 8.5.5 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr5... 65 8.5.6 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr6... 67 8.5.7 Ανασκόπηση ιδιοτήτων πρόσδεσης mabs... 68 8.5.9 Προσδιορισμός ικανότητας πρόσδεσης mabs με RIA... 69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9... 71 Απομόνωση και πέψη μονοκλωνικών αντισωμάτων για τη δημιουργία συμπλόκων Fab με υπομονάδες υποδοχέων... 71 9.1 Απομόνωση mab73 και παραγωγή Fab θραυσμάτων του... 71 9.1.1 Aπομόνωση mab73... 71 9.2 Σύμπλοκο β1-fab73... 75 9.3 Απομόνωση mab198 και παραγωγή Fab θραυσμάτων του... 77 9.3.1 Απομόνωση mab198... 77 9.3.2 Πέψη mab198 με παπαΐνη και απομόνωση Fab198... 78 9.4 Απομόνωση mabnr2 και παραγωγή Fab θραυσμάτων του... 79 9.4.1 Αποτελέσματα απομόνωσης mabnr2... 79 9.4.2 Πέψη mabnr2 με παπαΐνη και απομόνωση FabNR2... 80 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 83 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 88 SUMMARY... 90 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 92 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ... 107 6

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης 1.1 Γενικά Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) ανήκουν στην υπεροικογένεια των συνδεόμενων με προσδέτη ιοντικών καναλιών (ligand gated ion channels, LGIC) που περιλαμβάνει επίσης τους υποδοχείς γ-αμινοβουτυρικού οξέος Α (GABAA), γλυκίνης και σεροτονίνης (5-ΗΤ 3 ) [Karlin Α et al 1995]. Οι υποδοχείς που ανήκουν σε αυτή την υπεροικογένεια έχουν στο αμινοτελικό εξωκυτταρικό τμήμα (Extracellular domain, ECD) κάθε υπομονάδας τους μια θηλιά που σχηματίζεται από 13 αμινοξέα τα οποία βρίσκονται μεταξύ δύο καταλοίπων κυστεϊνών οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό [Karlin and Akabas 1995; Ortells and Lunt 1995]. Λόγω αυτής της θηλιάς οι LGIC ονομάζονται Cys-loop υποδοχείς. Οι nachrs είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες (Mr ~290000) που δημιουργούν ομο- ή ετερο-πενταμερή με υπομονάδες που διατάσσονται σχηματίζοντας ένα κεντρικό κανάλι ιόντων [Lindstrom 1997]. Στο εξωκυτταρικό τμήμα αυτών των υποδοχέων προσδένεται η ακετυλοχολίνη, ένα μόριο που απελευθερώνεται από τους νευρώνες και συνδεόμενη με τον υποδοχέα οδηγεί σε άνοιγμα του καναλιού. Οι nachrs διακρίνονται σε δύο ομάδες: (α) τους μυϊκού τύπου υποδοχείς, που συναντώνται στους σκελετικούς μυς των σπονδυλωτών, όπου μεταβιβάζουν το σήμα στη νευρομυϊκή σύναψη, καθώς και στα ηλεκτρικά όργανα ψαριών, και (β) στους νευρικού τύπου, που συναντώνται κυρίως στο περιφερικό και κεντρικό νευρικό σύστημα αλλά επίσης και σε μη νευρικούς ιστούς. Βασισμένοι στις διαφορετικές δυνατότητες σύνδεσης προσδετών χωρίζουμε τους υποδοχείς σε δύο κυρίως κατηγορίες: (α) τους nachr που προσδένουν α-μπουγκαροτοξίνη και (β) τους nachrs που δεν προσδένουν α-μπουγκαροτοξίνη [Lindstrom 1997]. 1.2 Νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης μυϊκού τύπου 1.2.1 Στοιχειομετρία Οι μυϊκού τύπου nachrs συναντώνται στην επιφάνεια των μυϊκών κυττάρων των θηλαστικών και στα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών. Στα έμβρυα και τα ηλεκτρικά 7

όργανα των ψαριών η στοιχειομετρία του υποδοχέα είναι (α1) 2 β1γδ, ενώ στο μυϊκό ιστό ενήλικα η γ υπομονάδα αντικαθίσταται από την ε δίνοντας έτσι στοιχειομετρία (α1) 2 β1εδ [Raftery et al. 1980; Mishina et al. 1986; Witzemann et al. 1987]. Η ε υπομονάδα αντικαθιστά σταδιακά την γ στο χρονικό διάστημα δύο εβδομάδων μετά Εικόνα 1. Δομή μυϊκού νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης στη μεμβράνη μυϊκού κυττάρου στο έμβρυο. Φαίνονται οι θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στη διεπιφάνεια μεταξύ α και γ καθώς και μεταξύ της α και δ. Επίσης φαίνεται το κανάλι ιόντων που σχηματίζεται από τις υπομονάδες. από τη γέννηση [Missias et al. 1996; Martinou and Merlie 1991]. Η αντικατάσταση της γ από την ε λαμβάνει χώρα ταυτόχρονα σε όλες τις συνάψεις και φαίνεται ότι το νευρικό σύστημα οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την ε υπομονάδα. Η μυϊκού τύπου υπομονάδα συνεχίζει να εκφράζεται στο θύμο και σε μερικούς εξοφθαλμικούς μυς στον ενήλικα [Yumoto et al. 2005; Missias et al. 1996]. Οι γ, ε και δ υπομονάδες εμπλέκονται με τις α1 υπομονάδες στη δημιουργία των θέσεων πρόσδεσης των προσδετών (Εικόνα 1). 1.2.2 Νευρομυϊκή σύναψη Οι μυϊκού τύπου nachrs συναντώνται κυρίως στη νευρομυϊκή σύναψη (NMJ). Η τελευταία βρίσκεται στα σημεία όπου συναντώνται τα μυϊκά με τα νευρικά κύτταρα και ο ρόλος της είναι να διαβιβάζει τη νευρική ώση στο μυ μέσω ενός χημικού νευροδιαβιβαστή, την ακετυλοχολίνη (ACh). Η ακετυλοχολίνη συντίθεται και αποθηκεύεται σε συναπτικά κυστίδια στους νευράξονες των νευρικών κυττάρων. Στη συνέχεια, κατόπιν κατάλληλου ερεθίσματος, τα μόρια της ακετυλοχολινης απελευθερώνονται στη νευρομυϊκή σύναψη. Διασχίζουν τη συναπτική σχισμή και δεσμεύονται από τους nachrs της επιφάνειας των μυϊκών κυττάρων. Αποτέλεσμα αυτής της δέσμευσης είναι η επαγωγή καθενός υποδοχέα ο οποίος υπόκειται σε αλλοστερική τροποποίηση. Συνέπεια της τελευταίας είναι το άνοιγμα της πύλης του καναλιού και η εισροή ιόντων νατρίου (Na + ). Ταυτόχρονα με την εισροή Na + συμβαίνει μικρή εκροή ιόντων καλίου (Κ + ). Η μεγάλη εισροή των Na + οδηγεί στην 8

εκπόλωση της μυϊκής κυτταρικής μεμβράνης και στην ανάπτυξη δυναμικού της τελικής κινητικής πλάκας. Το δυναμικό αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση καναλιών Na + που εξαρτώνται από αυτό. Με αυτό τον τρόπο πραγματοποιείται περαιτέρω εισροή ιόντων Na + που τελικά θα οδηγήσει το δυναμικό να ξεπεράσει τον ουδό και να δημιουργηθεί δυναμικό ενέργειας που θα καταλήξει στην απελευθέρωση ιόντων ασβεστίου (Ca 2+ ) στο κυτταρόπλασμα. Η υψηλή συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου είναι εκείνη που τελικά θα οδηγήσει το μυ σε σύσπαση. Μετά το τέλος της σύσπασης η ακετυλοχολίνη απομακρύνεται από τη συναπτική σχισμή μέσω υδρόλυσης που υφίσταται από το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση. 1.2.3 Μυασθένεια Οι μυϊκού τύπου nachrs αποτελούν σημαντικό αυτοαντιγόνο που εμπλέκεται στη μυασθένεια. Η μυασθένεια είναι ένα αυτοάνοσο νόσημα το οποίο προκαλείται από καταστροφή της νευρομυϊκής διαβίβασης που οφείλεται στην πρόσδεση αυτοαντισωμάτων στους μυϊκούς nachrs [Lindstrom 2000]. Η νόσος αυτή επηρεάζει ένα στα 8000-10000 άτομα και είναι από τα πιο καλά μελετημένα αυτοάνοσα νοσήματα. Οι ασθενείς που πάσχουν από το νόσημα αυτό παρουσιάζουν μυϊκή αδυναμία και κόπωση, ωστόσο υπάρχει μεγάλη ετερογένεια. Είναι δυνατό να εντοπίζεται σε συγκεκριμένες μυϊκές ομάδες με συνήθεις τους εξοφθαλιμικούς μυς ή μπορεί να παρουσιάζεται σε όλους τους σκελετικούς μυς (γενικευμένη μορφή). Το 85% των ασθενών έχουν αυτοαντισώματα που κατευθύνονται έναντι του μυϊκού nachrs [Vincent 2002]. Από το 15% των ασθενών που δεν παρουσιάζουν αυτοαντισώματα έναντι του nachr το 20-40% παρουσιάζει αντισώματα για μια κινάση της κυτταρικής επιφάνειας των μυϊκών κυττάρων (Musk-Specific Kinase, MuSK). H πρωτεΐνη αυτή παίζει σημαντικό ρόλο στη μετασυναπτική διαβίβαση καθώς και στη συσσωμάτωση του nachr στη μεμβράνη [Hoch et al. 2001; Vincent et al. 2001] Αυτοαντισώματα που προσδένονται στους υποδοχείς οδηγούν αυτούς σε καταστροφή μειώνοντας κατά αυτό τον τρόπο τον αριθμό των λειτουργικών υποδοχέων στην επιφάνεια του κυττάρου. Έτσι αποτυγχάνει η διαβίβαση σήματος στη νευρομυϊκή σύναψη. Τα αυτοαντισώματα που προσδένουν στην περιοχή αυτή οδηγούν σε μείωση των nachrs με τρεις τρόπους. Ο πρώτος τρόπος δράσης των αντισωμάτων είναι η αντιγονική τροποποίηση και στηρίζεται στη δισθενή φύση τους. Το κάθε αντίσωμα έχει την ικανότητα να 9

προσδένεται σε δύο γειτονικούς nachrs οδηγώντας έτσι στην ενδοκυττάρωση αυτών και στην αποικοδόμησή τους στο εσωτερικό του κυττάρου [Kao and Drachman 1977; Appel et al. 1977; Loutrari et al. 1992; Stanley and Drachman 1978]. Έτσι, λοιπόν η σύνδεση μεγάλου αριθμού αντισωμάτων στους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας ενός μυϊκού κυττάρου οδηγεί στην ενδοκυττάρωση αυτών και αποικοδόμησή τους με επακόλουθο τη μείωση του αριθμού λειτουργικών υποδοχέων στην κυτταρική επιφάνεια. Ο δεύτερος τρόπος δράσης των αυτοαντισωμάτων είναι με τη μεσολάβηση του συστήματος του συμπληρώματος και καταστροφή της μετασυναπτικής μεμβράνης. Εικόνα 2. Α. Εικόνα νευρομυϊκής σύναψης φυσιολογικού ατόμου Β. Εικόνα νευρομυϊκής σύναψης ασθενούς με μυασθένεια Τα αυτοαντισώματα προσδένονται στους nachr του μυϊκού κυττάρου και οδηγούν στην ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος το οποίο είναι ένα σύνολο πρωτεϊνών που συμβάλλουν στη φυσική ανοσία. Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος έχει ως αποτέλεσμα την αποκοπή τμημάτων της κυτταρικής μεμβράνης και επομένως στην μείωση του αριθμού των διαθέσιμων υποδοχέων. Η 10

δράση του συμπληρώματος στην εκδήλωση της μυασθένειας έχει αποδειχθεί με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, πειράματα ανοσοϊστοχημείας και παθητικής μεταφοράς μυασθένειας σε πειραματόζωα [Engel and Arahata 1987; Loutrari et al. 1992]. Ο τρίτος τρόπος δράσης είναι μέσω άμεσης παρεμπόδισης της λειτουργίας του ιοντικού καναλιού του υποδοχέα. Σε αυτήν την περίπτωση τα αυτοαντισώματα προσδένονται στον υποδοχέα και ειδικότερα στη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης. Κατά αυτό τον τρόπο τα αντισώματα εμποδίζουν την αλληλεπίδραση της ακετυλοχολίνης με το ιοντικό κανάλι. Τα αυτοαντισώματα μπορεί να προσδεθούν σε διαφορετική θέση στον υποδοχέα προκαλώντας αλλοστερική τροποποίηση του καναλιού που οδηγεί σε αλλαγή της θέσης πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης [Willcox 1993]. Στο εξωκυτταρικό τμήμα της α1 υπομονάδας βρίσκεται η κύρια ανοσογόνος περιοχή (Μain Ιmmunogenic Region-MIR) στην οποία σημαντικό ρόλο παίζουν τα κατάλοιπα 66-76 [Gullick and Lindstrom 1983; Das and Lindstrom 1989; Tzartos et al. 1982; Tzartos et al. 1983; Tzartos et al. 1998]. Έναντι της MIR στρέφεται η πλειοψηφία των αυτοαντισωμάτων που προσδένονται στον υποδοχέα στη μυασθένεια (MG) και την πειραματική μυασθένεια (Experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG) [Tzartos et al, 1998]. 1.3 Νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης νευρικού τύπου 1.3.1 Στοιχειομετρία Οι νευρικού τύπου nachrs εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στα περιφερικά γάγγλια και σε συγκεκριμένες περιοχές στον εγκέφαλο καθώς και σε άλλα κύτταρα όπως επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Έντεκα γονίδια που κωδικοποιούν υπομονάδες νευρικών nachr έχουν αναγνωριστεί σε αρουραίο ή κότα. Οκτώ είναι α τύπου (α2-α9) και τρία β τύπου (β2-β4) [Plazas et al. 2005]. Οι α7-α10 υπομονάδες συναντώνται είτε ως ομοπενταμερή είτε ως ετεροπενταμερή, ενώ οι α2-α6 και β2-β4 σχηματίζουν ετεροπενταμερείς υποδοχείς, με συνήθη στοιχειομετρία (α x )2(β y )3. Οι υπομονάδες α5 και β3 δεν μπορούν να συγκροτήσουν λειτουργικούς υποδοχείς όταν εκφράζονται μόνοι τους ή σε ζεύγη με β ή α υπομονάδες, αντίστοιχα (για παράδειγμα, α3β2α5 και α3β4α5). Για το λόγο αυτό αυτές οι υπομονάδες ονομάστηκαν ορφανές ή βοηθητικές. 11

Οι νευρικού τύπου υποδοχείς χωρίζονται σε δύο ομάδες: (α) την high-affinity agonist-binding ομάδα, η οποία δεν προσδένει α-bgtx, που όπως βρέθηκε αργότερα αποτελούνται από ετεροπενταμερείς υποδοχείς με α2-α6 και β2-β4 υπομονάδες και (β) την ομάδα που προσδένει αγωνιστές με χαμηλότερη συγγένεια (μμ) και προσδένουν α- Bgtx με συγγένεια nm (γνωστοί και ως α-bgtx υποδοχείς), σε αυτούς ανήκουν οι ομοπενταμερείς που αποτελούνται από α7-α9 υπομονάδες [Lindstrom 2000]. Οι ετεροπενταμερείς υποδοχείς έχουν δύο θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης που συναντώνται στην επιφάνεια μεταξύ των α και β υπομονάδων. 1.3.2 Νευρικού τύπου nachrs και συναπτική πλαστικότητα Διάφορες μελέτες πρόσδεσης, αυτοραδιογραφίας του υποδοχέα και ανοσοϊστοχημικές μελέτες δείχνουν ότι οι υπομονάδες του nachr βρίσκονται τόσο μετασυναπτικά σε δενδρίτες όσο και προσυναπτικά σε απολήξεις νευραξόνων. Πιο συγκεκριμένα, οι υποδοχείς nachr που περιέχουν α7 και β2 υπομονάδες εκφράζονται σε προτερματικά, σωματικά, αξονικά και δενδριτικά διαμερίσματα [Lena et al. 1993; Seguela et al. 1993; Zarei et al. 1999; Fabian-Fine et al. 2001; Xu et al. 2006]. Για το λόγο αυτό η ενεργοποίηση ή η αναστολή καθενός από τους υποδοχείς εξαρτάται κυρίως από τον τύπο του νευρώνα όπου συναντάται ο καθένας και από τη θέση του στο κύτταρο. Οι nachrs που συναντώνται προ-συναπτικά οδηγούν σε απελευθέρωση μιας ποικιλίας νευροδιαβιβαστών στον εγκέφαλο. Η απελευθέρωση αυτή μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα διέγερση ή αναστολή [Mckay et al. 2007]. Ένα παράδειγμα είναι η ενεργοποίηση προσυναπτικών nachrs στους νευρώνες CA1 του ιππόκαμπου που προκαλεί απελευθέρωση GABA στις συνάψεις μεταδίδοντας τμηματικές αναστολές στους πυραμιδικούς νευρώνες [Lena and Changeux 1997]. Αυτή η απόκριση εμποδίζεται από την διυδρο-β-ερυθροϊδίνη (DHβΕ, εκλεκτικός ανταγωνιστής των α4β2 υποδοχέων) αλλά όχι από την μεθυλυκακονιτίνη (MLA) ή την α-μπουγκαροτοξίνη (εκλεκτικός ανταγωνιστής των α7 υποδοχέων), δείχνοντας έτσι ότι η απόκριση αυτή μεσολαβείται από α4β2 υποδοχείς. Αντίθετα, η ενεργοποίηση των προσυναπτικών α7 υποδοχέων οδηγεί σε αύξηση της γλουταμινεργικής διαβίβασης και συγκροτεί τη βάση για την εμπλοκή των υποδοχέων αυτών στη συναπτική πλαστικότητα σε διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές [Gray et al. 1996]. Οι υποδοχείς α7 και α4β2 συναντώνται επίσης μετασυναπτικά [Fabian-Fine et al. 2001], όπου παίζουν σημαντικούς ρόλους σε μηχανισμούς πλαστικότητας σε 12

διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου, συμπεριλαμβανομένου του ιππόκαμπου. Ο ιππόκαμπος έχει κεντρικό ρόλο στους μηχανισμούς μάθησης, μνήμης και προσοχής και οι nachrs συμβάλλουν σε όλες αυτές τις λειτουργίες. 1.3.3 Νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης α4β2 Ασθένειες, εθισμός στο κάπνισμα Η κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας του εγκεφάλου και η συμπαγής μοίρα της μέλαινας ουσίας (substantia nigra pars compacta, SNpc) περιέχουν μέτρια ως υψηλά επίπεδα του α4β2 στο αρουραίο [Wada et al. 1989]. Οι δύο τύποι α4β2 που συναντώνται στον εγκέφαλο είναι ο τύπος με στοιχειομετρία (α4)2(β2)3 ο οποίος είναι ο λεγόμενος υψηλής ευαισθησίας (high sensitivity, HS) και ο τύπος (α4)3(β2)2 που ονομάζεται χαμηλής ευαισθησίας (low sensitivity, LS) διότι διαφέρουν στην ικανότητα για ενεργοποίηση από αγωνιστή [Moroni et al. 2006]. Νόσος Alzheimer Η νόσος Alzheimer είναι μία από τις πιο συνηθισμένες μορφές άνοιας στους ηλικιωμένους ανθρώπους. Υπολογίζεται ότι επηρεάζει περίπου 25 εκατομμύρια ανθρώπους σε ολόκληρο τον κόσμο. Πρόκειται για ένα ετερογενές νόσημα που χαρακτηρίζεται κυρίως από εξωκυτταρική συσσώρευση γεροντικών πλακών των οποίων βασικό χαρακτηριστικό είναι το αμυλοειδές β (Αβ). Παρατηρούνται ακόμα μιτοχονδριακές δυσλειτουργίες, απώλεια των συνάψεων, εκφυλισμός και οξειδωτική καταστροφή των νευρώνων. Από τα τέλη της δεκαετίας του 70 υπήρχαν μελέτες που είχαν δείξει ότι ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της νόσου Alzheimer είναι η απώλεια χολινεργικών νευρώνων [Perry et al. 1978; Davies and Maloney 1976]. Καθώς η ακετυλοχολίνη εμπλέκεται σε σημαντικές λειτουργίες όπως η μάθηση και η μνήμη, η καταστροφή της χολινεργικής διαβίβασης θεωρήθηκε ότι αποτελεί πιθανή αιτία της απώλειας αυτών σε ασθενείς που πάσχουν από Alzheimer [Smith and Swash 1978]. Εξαιτίας αυτού αναπτύχθηκαν στρατηγικές που είχαν ως στόχο την αποκατάσταση της φυσιολογικής χολινεργικής λειτουργίας ως πιθανή θεραπεία για τη νόσο, όπως για παράδειγμα αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης. Οι τελευταίοι χρησιμοποιούνται έως και σήμερα για την θεραπεία της νόσου αν και η αποτελεσματικότητά τους δεν είναι μεγάλη [Nordberg 1993; Nordberg and Svensson 1998; Krall et al. 1999; Muñoz-Torrero 2008]. 13

Αν και η απώλεια των χολινεργικών νευρώνων οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το χολινεργικό σύστημα εμπλέκεται στην παθογένεση της νόσου, ο θάνατος των νευρώνων θεωρείται ότι συμβαίνει σε μετέπειτα στάδια της ασθένειας, δηλαδή μετά την εμφάνιση διαταραχών μνήμης [Klein 2006]. Η απώλεια μνήμης σε πρώιμα στάδια της νόσου μπορεί να σχετίζεται με δύο άλλες όψεις της χολινεργικής διαβίβασης, συγκεκριμένα, αλλαγές στα επίπεδα των nachrs και δυσλειτουργία των υποδοχέων εξαιτίας μοριακών αλληλεπιδράσεων με το αμυλοειδές Aβ. Μείωση του επιπέδου των nachrs παρατηρείται αρχικά σε περιοχές του εγκεφάλου που επηρεάζονται στη νόσο Alzheimer όπως ο εγκεφαλικός φλοιός και ο ιππόκαμπος [Kellar et al. 1987; Wevers et al. 1999; Perry et al. 2000]. O φυσιολογικός εγκέφαλος γηραιότερων ανθρώπων παρουσιάζει, ως ένα βαθμό, μείωση στα επίπεδα του αριθμού των υποδοχέων. Παρόλα αυτά η μείωση αυτή είναι πολύ μεγαλύτερη σε άτομα που πάσχουν από τη νόσο Alzheimer. Για παράδειγμα, έρευνες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της υπομονάδας α4 είναι 80% χαμηλότερα σε ασθενείς με τη νόσο σε σχέση με υγιή άτομα της ίδιας ηλικίας [Perry et al. 2000]. Πειράματα έχουν δείξει ότι η μείωση των nachr στη νόσο δεν οφείλεται στη μείωση της έκφρασης αυτών. Συγκεκριμένα, υπομονάδες όπως η α3 και η α4 εκφράζονται το ίδιο σε ασθενείς και υγιείς, ενώ άλλες, όπως η α7, φαίνεται να εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα στους ασθενείς [Terzano et al. 1998; Mousavi et al. 2003]. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι σημαντικός παράγοντας στην παθογένεση της νόσου ίσως είναι η απώλεια των ήδη διαθέσιμων υποδοχέων, λόγω κυρίως του διαφορετικού ρυθμού ανακύκλωσης παρά σε αλλαγές στο ρυθμό έκφρασης. Έρευνες των τελευταίων χρόνων δείχνουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ του Aβ και των nachrs. Αποτελέσματα πειραμάτων αποκαλύπτουν ότι το Aβ προσδένεται με υψηλή συγγένεια στον υποδοχέα α7 σε περιοχές του φλοιού και στον ιππόκαμπο ασθενών με Alzheimer. Επίσης, βρέθηκε ότι το Αβ προσδένεται και στον α4β2 αλλά με 5000 φορές χαμηλότερη συγγένεια από ότι στην α7 [Wang et al. 2000]. Αξίζει να σημειωθεί ότι πειραματικά αποτελέσματα παρουσιάζουν ότι το Αβ μπορεί να οδηγεί είτε σε ενεργοποίηση είτε σε αναστολή της λειτουργίας των nachrs. Το αποτέλεσμα που θα επιφέρει εξαρτάται από παράγοντες όπως ο τύπος του υποδοχέα και η συγκέντρωση του Αβ. Πειράματα που εξετάζουν την αλληλεπίδραση του υποδοχέα α4β2 με το Αβ καταλήγουν σε αντιφατικά αποτελέσματα. Συγκεκριμένα η χρήση χαμηλών συγκεντρώσεων (nm ή mm) του Αβ δείχνει λειτουργικό ανταγωνισμό των α4β2 14

υποδοχέων τόσο σε επιμολυσμένα ανθρώπινα κύτταρα SH-EP1 όσο και σε ωοκύτταρα Xenopus [Wu et al. 2004; Lamb et al. 2005]. Ταυτόχρονα άλλες έρευνες δείχνουν πως οι ίδιες συγκεντρώσεις Αβ οδηγούν σε ενεργοποίηση του υποδοχέα [Pym et al. 2005; Fu and Jhamandas 2003]. Νόσος Parkinson Η νόσος του Parkinson είναι μία νευροεκφυλιστική διαταραχή κίνησης. Τα χαρακτηριστικά αυτής της νόσου είναι η παρουσία ενδοκυτταρικών σωματίων Lewy (Lewy bodies) και ο εκτεταμένος εκφυλισμός του μελανοραβδωτού ντοπαμινεργικού συστήματος. Εκτός από την απώλεια ντοπαμινεργικών νευρώνων κάποιες μελέτες έχουν δείξει ότι οι nachrs παίζουν σημαντικό ρόλο στη νόσο αυτή. Σε επιδημιολογικές μελέτες το κάπνισμα φαίνεται να προστατεύει ενάντια στη νόσο ενώ πειράματα δείχνουν ότι η νικοτίνη, η οποία δρα στους nachrs, προστατεύει από στην καταστροφή του μελανοραβδωτού [Picciotto and Zoli 2008; Quik et al. 2007; O Neill et al. 2002]. Ένας αριθμός α4β2 αγωνιστών έχουν παρουσιάσει ωφέλιμα αποτελέσματα στη νόσο του Parkinson. Κάποια πειράματα έχουν αποδείξει μειωμένα πρωτεϊνικά επίπεδα των υπομονάδων α4 και α7 στον εγκεφαλικό φλοιό ατόμων που πάσχουν από τη νόσο αυτή [Burghausa et al. 2003]. Σχιζοφρένεια Η σχιζοφρένεια είναι μία νόσος η οποία παρουσιάζει μεγάλη κληρονομική προδιάθεση. Έρευνες έχουν δείξει ότι ο καπνός αποκαθιστά τις συνειδησιακές ελλείψεις που παρουσιάζει ένας ασθενής που πάσχει από σχιζοφρένεια. Πειράματα σε εγκεφάλους ασθενών μετά το θάνατο έχουν δείξει ότι η έκφραση της α7 υπομονάδας είναι μειωμένη στον ιππόκαμπο και στον πρόσθιο φλοιό συγκριτικά με τους υγιείς [Freedman et al. 1995; Guan et al. 1999]. Εθισμός στο κάπνισμα H κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας (Ventral Tegmental Area, VTA) του εγκεφάλου εμπλέκεται στα αποτελέσματα που οδηγούν εθιστικές ουσίες όπως η νικοτίνη. Τα αποτελέσματα του εθισμού στον καπνό οφείλονται στις επαναλαμβανόμενες προσλήψεις νικοτίνης, που υπάρχει στον καπνό του τσιγάρου και προσδένεται ειδικά στους nachrs, καθώς και στη ραγδαία διάχυσή του στο κεντρικό νευρικό σύστημα [Gamberino and Gold 1999; Leshner and Koob 1999]. Η νικοτίνη προκαλεί απελευθέρωση ντοπαμίνης στο μεσομεταιχμιακό μονοπάτι μέσω των nachrs που 15

βρίσκονται στην κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας του εγκεφάλου και στον επικλινή πυρήνα [Corrigall et al. 1992; Pontieri et al. 1996]. Η επαγόμενη από νικοτίνη απελευθέρωση ντοπαμίνης έχει συσχετιστεί με την ευχαρίστηση που αισθάνονται οι καπνιστές λόγω της νικοτίνης του τσιγάρου [Benowitz 1992]. Ο α4β2 υποδοχέας έχει την υψηλότερη ευαισθησία στη νικοτίνη και επαναλαμβανόμενη έκθεση σε νικοτίνη αυξάνει τους λειτουργικούς υποδοχείς στον εγκέφαλο ενώ η χρόνια έκθεση στη νικοτίνη δείχνει να οδηγεί σε αυξημένη έκφραση των υποδοχέων αυτού του τύπου κυρίως στη φλοιώδη και υποφλοιώδη περιοχή, τον ιππόκαμπο και σε αρκετό βαθμό και στην παρεγκεφαλίδα [Perry 1999]. Έρευνες σε εγκεφάλους καπνιστών καθώς και πειραματόζωων έδειξαν ότι η μακροχρόνια έκθεση σε αυτή οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των nachrs. Ταυτόχρονα όμως δεν παρατηρούνταν αύξηση των επιπέδων αγγελιαφόρων RNA (messenger RNA, mrna) των α2, α3, α4, α5 ή β2 σε εγκεφάλους ποντικιών που είχαν εκτεθεί σε νικοτίνη για μεγάλο χρονικό διάστημα. Αυτό οδήγησε στο συμπέρασμα ότι μετα-μεταγραφικοί μηχανισμοί εμπλέκονται σε αυτή την αύξηση των λειτουργικών υποδοχέων [Perry et al. 1999; Marks 1992]. Επιπλέον, ο αυξημένος αριθμός των nachr είναι ανεξάρτητος των κυττάρων στα οποία εκφράζονται οι υποδοχείς [Nashmi et al. 2007]. Μια σειρά in vitro πειραμάτων σε εγκεφάλους πειραματόζωων και ανθρώπων οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η χρόνια έκθεση στη νικοτίνη αυξάνει τόσο τους ενδοκυττάριους υποδοχείς όσο και τους υποδοχείς της επιφάνειας [Corringer et al. 2006]. Διάφορες υποθέσεις διατυπώνονται για αυτή την αύξηση των α4β2 που παρατηρούνται στην περίπτωση της χρόνιας έκθεσης στη νικοτίνη. Ανάμεσα σε αυτές είναι η αυξημένη δυνατότητα δημιουργίας λειτουργικών πενταμερών στην επιφάνεια, η μειωμένη καταστροφή τους, η αυξημένη μεταφορά υποδοχέων στην κυτταρική μεμβράνη, η μειωμένη αποικοδόμηση και μία επαγόμενη αλλαγή διαμόρφωσης η οποία μετατρέπει τους υποδοχείς σε υψηλής συγγένειας, οι οποίοι πλέον μπορούν να ενεργοποιούνται ευκολότερα [Corringer et al. 2006; Picciotto et al. 2008; Gaimarri et al. 2007]. Προστασία έναντι νευροτοξικότητας Οι νευρικού τύπου nachrs έχει αποδειχθεί ότι βοηθούν στην επιβίωση των κυττάρων σε περιπτώσεις νευροτοξικότητας, όπως στη νόσο Alzheimer. Διαρκής ενεργοποίηση των nachrs προστατεύει τους νευρώνες του κεντρικού νευρικού συστήματος έναντι της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από το γλουταμινικό 16

και το Αβ πεπτίδιο. Παρόλο που ο ρόλος της νευροτοξικότητας από γλουταμινικό δεν είναι ξεκάθαρος στη νόσο του Alzheimer, έχει δειχθεί ότι το Αβ αυξάνει την ευαισθησία των νευρώνων στη νευροτοξικότητα από γλουταμινικό. Συνεπώς, το γλουταμινικό μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταροτοξικότητα που επάγεται από το Αβ στον εγκεφαλικό φλοιό [Kihara et al. 1997]. Τα πρώτα στοιχεία σχετικά με την αναλγητική δραστηριότητα της νικοτίνης εμφανίστηκαν το 1932. Ο ρόλος των αγωνιστών του α4β2 υποδοχέα στον πόνο αναγνωρίστηκε με την ανακάλυψη της επιβατιδίνης. Μελέτες έδειξαν ότι η νικοτίνη έχει προστατευτικό ρόλο έναντι της νευροτοξικότητας που προκαλεί το γλουταμινικό [Akaike et al. 1994; Kaneko et al. 1997]. Αυτή η δράση της νικοτίνης στηρίζεται στην ενεργοποίηση των υποδοχέων α4 και α7 μετά από πρόσδεση σε αυτούς. 1.3.4 Γονίδια μυϊκού και νευρικού τύπου nachr Διαφορετικό γονίδιο κωδικοποιεί καθεμιά από τις υπομονάδες του nachr. Συγκεκριμένα, οι υπομονάδες α, γ και δ του μυϊκού τύπου υποδοχέα κωδικοποιούνται από γονίδια που συναντώνται στο χρωμόσωμα 2. Όσον αφορά την α υπομονάδα έχουν αναγνωριστεί δύο ισομορφές της στον άνθρωπο. Η μία ισομορφή της συναντάται στους σκελετικούς μυς και κωδικοποιείται από εννέα εξώνια του γονίδιου που την κωδικοποιεί (Ρ1-Ρ9). Η άλλη ισομορφή της γνωστή ως Ρ3Α εκφράζεται στους σκελετικούς μυς, την καρδιά, τον εγκέφαλο, τους νεφρούς, το θύμο αδένα και τους πνεύμονες. Πρόκειται για μια υπομονάδα α που περιέχει 25 επιπλέον αμινοξέα λόγω ενός επιπλέον εξωνίου που συναντάται στο γονιδιακό προϊόν μεταξύ των εξωνίων Ρ3 και Ρ4 της πρώτης ισομορφής [Beeson et al. 1990]. Οι υπομονάδες β1 και ε του μυϊκού υποδοχέα εκφράζονται από γονίδια που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 17 του ανθρώπου. Η υπομονάδα β1 συναντάται σε δύο ισομορφές οι οποίες διαφέρουν μεταξύ τους λόγω 9 βάσεων στο 5 άκρο της κωδικής περιοχής του mrna [Goldman and Tamai 1989]. Όσον αφορά τον nachr νευρικού τύπου τα γονίδια CHRNA4 και CHRNA7 κωδικοποιούν τις περισσότερες α υπομονάδες του υποδοχέα στον εγκέφαλο των θηλαστικών. Κάποιες μελέτες υποστηρίζουν ότι διαφορετικοί πολυμορφισμοί στο γονίδιο CHRNA4 σχετίζονται με τη νόσο Alzheimer [Winterer 2007]. Μεταλλάξεις στα γονίδια CHRNA4 και CHRNB2 που κωδικοποιούν αντίστοιχα την α4 και β2 υπομονάδα προκαλούν αυτοσωµική επικρατή νυχτερινή επιληψία του µετωπιαίου λοβού [Tapper et al. 2004; Maskos et al. 2005]. Εθιστικές συμπεριφορές όπως το 17

κάπνισμα και ο αλκοολισμός δείχνουν να αλληλοεπικαλύπτονται γενετικά και πολυμορφισμοί των γονιδίων που κωδικοποιούν τους nachr δείχνουν να είναι υποψήφιοι παράγοντες. 1.4 Δομή υποδοχέα ακετυλοχολίνης Οι πρώτες μελέτες στον nachr για τη δομή του και τις υπομονάδες από τις οποίες αποτελείται έγιναν σε μόρια που απομονώθηκαν από τα ηλεκτρικά όργανα του Torpedo και του Electrophorus. Οι ιστοί των οργάνων αυτών σε αυτά τα είδη είναι πλούσιοι σε υποδοχέα (πολλά μg υποδοχέα ανά κιλό οργάνου). Ο υποδοχέας του Torpedo παρουσιάζει μεγάλη ομολογία με τον υποδοχέα στους σκελετικούς μυς των σπονδυλωτών [Changeux et al. 1998]. Αρχικά οι μελέτες χαρακτηρισμού του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης ξεκίνησαν με τη χρήση ενός μεγάλου αριθμού προσδετών. Η α-μπουγκαροτοξίνη ήταν η πρώτη τοξίνη που χρησιμοποιήθηκε για τον χαρακτηρισμό των nachrs. Η τοξίνη αυτή προέρχεται από το φίδι Bungarus multicinctus και όταν προσδεθεί στον υποδοχέα του Torpedo και του Electophorus αναστέλλει τη λειτουργία του μη αναστρέψιμα [Miledi et al. 1971; Kasai et al. 1969]. Εκτεταμένες μελέτες nachrs από διάφορα είδη δείχνουν ότι καθεμιά από τις πέντε υπομονάδες του υποδοχέα αποτελείται από: (α) το αμινοτελικό εξωκυττάριο τμήμα (ECD) που έχει μήκος ~210-220 αμινοξέα και φέρει την περιοχή πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών (LBD) [Dennis et al 1988; Galzi and Changeux 1995] (β) τέσσερα μικρά (μήκους 15-20 αμινοξέων) υδρόφοβα διαμεμβρανικά τμήματα (Μ1-Μ4) και δύο μικρές υδρόφιλες θηλιές που συνδέουν τα τμήματα Μ1-Μ2 και Μ2-Μ3, (γ) μια μεγαλύτερη ποικίλου μεγέθους (100-150 καταλοίπων) και αλληλουχίας μεταξύ των υπομονάδων, η οποία βρίσκεται μεταξύ των Μ3 και Μ4 και φέρει τις φωσφορυλιωμένες περιοχές [Huganir and Greengard 1990] και (δ) το καρβοξυτελικό άκρο που φέρει ένα μικρό (4-28 αμινοξέα) υδρόφιλο εξωκυτταρικό τμήμα (Εικόνα 3). 18

Στη τελική μορφή και σωστή λειτουργία του υποδοχέα συμβάλλουν αρκετές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Ένας δισουλφιδικός δεσμός κοινός σε όλες τις υπομονάδες, σχηματίζεται μεταξύ δύο διπλανών καταλοίπων κυστεΐνης, αντίστοιχα με τα αμινοξέα 192 και 193 της α1 υπομονάδας του Torpedo. Αυτός ο δεσμός συνεισφέρει στο σχηματισμό της περιοχής πρόσδεσης αγωνιστών (ligand binding domain LBD). Θέσεις γλυκοζυλίωσης υπάρχουν στο εξωκυττάριο τμήμα των υπομονάδων καθώς και στο ενδοκυτταρικό κομμάτι μεταξύ των Μ3 και Μ4 διαμεμβρανικών τμημάτων. Δύο κυστεΐνες στις θέσεις 128 και 142 της α υπομονάδας του Torpedo συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό σχηματίζοντας θηλιά 15 αμινοξικών καταλοίπων. Ανάμεσα στις δύο αυτές κυστεΐνες υπάρχει στη θέση 141 της α υπομονάδας του Torpedo ένα συντηρημένο κατάλοιπο κυστεΐνης το οποίο αποτελεί θέση γλυκοζυλίωσης η οποία παίζει σημαντικό ρόλο για τη σωστή ωρίμανση των υπομονάδων [Blount and Merlie 1990]. Οι υπομονάδες των νευρικού τύπου nachr παρουσιάζουν μεγάλη ομολογία με τις υπομονάδες του μυϊκού τύπου nachr μέσα στο ίδιο είδος [Sargent 1993; Boyd 1997]. 1.4.1 Τρισδιάστατη δομή nachr Εικόνα 3. Δομή υπομονάδας νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Φαίνεται το αμινοτελικό εξωκυττάριο τμήμα, τα τέσσερα διαμεμβρανικά τμήματα Μ1-Μ4, η μεγάλη θηλιά μεταξύ των Μ3-Μ4 και το καρβοξυτελικό τμήμα. Χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας δύο διαστάσεων για τον υποδοχέα του Torpedo αποκάλυψε αρκετές δομικές πληροφορίες για τις διαστάσεις, το σχήμα και τη διάταξη των υπομονάδων του υποδοχέα [Unwin 1995; Unwin 1993; Beroukhim and Unwin N. 1995]. Στη συνέχεια ηλεκτρονική μικροσκοπία ανάλυσης 4.6 και 4 Å παρείχε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το εξωκυτταρικό και διαμεμβρανικό τμήμα των υπομονάδων [Miyazawa et al. 1999; Miyazawa et al. 2003]. Εξωκυτταρικά, οι περιοχές πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης βρέθηκαν ότι περιβάλλονται από επτά πτυχωτά β φύλλα. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν τις μελέτες κυκλικού διχρωισμού 19

[West et al. 1997; Schrattenholz et al. 1998; Alexeev et al. 1999; Grant et al. 1999; Yao et al. 2002; Tsetlin et al. 2002] που έδειχναν ότι οι LBD αποτελούνται κυρίως από β φύλλα. Επίσης, αποδείχθηκε ότι τα τέσσερα μεμβρανικά τμήματα κάθε υπομονάδας (Μ1-Μ4) είναι α έλικες [Miyazawa et al, 2003]. Εικόνα 4. Κάτοψη της AChBP και δεξιά οι δύο υπομονάδες της. Αριστερά η κάτοψη της AChBP. Με διαφορετικά χρώματα και με Α-Ε συμβολίζεται η καθεμιά από τις πανομοιότυπες υπομονάδες της. Δεξιά κάθετα στον άξονα του ομοπενταμερούς φαίνονται δύο υπομονάδες και η περιοχή πρόσδεσης προσδέτη ανάμεσά τους. Η ανάλυση της κρυσταλλικής δομής της AChBP (acetylcholine-binding protein) βοήθησε σημαντικά στις γνώσεις μας σχετικά με τη δομή και λειτουργία των nachrs Αυτή η πρωτεΐνη εκκρίνεται από τα γλοιοκύτταρα του σαλιγκαριού Lymnaea stagnalis στις χολινεργικές συνάψεις όπου ρυθμίζει τη συναπτική διαβίβαση με την πρόσδεση ακετυλοχολίνης. Πρόκειται για μια ομοπενταμερή πρωτεΐνη 210 αμινοξέων η οποία μπορεί να παράγεται σε μεγάλες ποσότητες και λόγω της υδατοδιαλυτότητάς της μπορεί να κρυσταλλωθεί και να αναλυθεί με χρήση ακτίνων Χ. Το 2001 πραγματοποιήθηκε μελέτη της κρυσταλλικής δομής της nachbp με ανάλυση 2.7 Å [Brejc et al. 2001; Smit et al. 2001]. Η πρωτεΐνη αυτή προσδένει αγωνιστές και ανταγωνιστές του nachr όπως η ακετυλοχολίνη, η νικοτίνη, η επιβατιδίνη, η (+)-τουμποκουραρίνη και η α-μπουγκαροτοξίνη. Πρόκειται για ένα μακρομόριο δομικά και λειτουργικά ομόλογο του εξωκυτταρικού τμήματος (ECD) των υπομονάδων του Cys loop υποδοχέα. Έχει ως και 24% ομολογία με τα εξωκυτταρικά τμήματα των ανθρώπινων nachrs και 15-18% ομολογία με τα εξωκυτταρικά τμήματα άλλων LGICs. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται σαν μοντέλο για τις περιοχές πρόσδεσης προσδετών (LBD) των nachrs. 20

Η λύση της κρυσταλλικής δομής της πρωτεΐνης αυτής ως σύμπλοκο με αγωνιστές και ανταγωνιστές [Celie et al. 2004; Celie et al. 2005; Ulens et al. 2006] παρείχε άριστα μοντέλα για τις περιοχές πρόσδεσης των συνδετών (LBD) των LGICs και μοντελοποίηση με βάση την ομολογία του μορίου με άλλα μόρια. Έχει δειχθεί ότι υπάρχουν ομόλογοι LGICs σε προκαρυωτικά κύτταρα [Tasneem et al. 2004]. Ακολούθησε ανάλυση της κρυσταλλικής δομής AChBPs του σαλιγκαριού με γνωστούς χολινεργικούς προσδέτες και τοξίνες. Αυτές οι αναλύσεις προσέφεραν λεπτομερείς πληροφορίες για τις αλλαγές τις διαμόρφωσης που συμβαίνουν όταν προσδένει ένας προσδέτης στον υποδοχέα (Εικόνα 4). Το 2007 επιτεύχθηκε η ανάλυση της κρυσταλλικής δομής ολόκληρου του αμινοτελικού εξωκυτταρικού τμήματος της α1 υπομονάδας του AChR του ποντικού συνδεδεμένη με α-μπουγκαροτοξίνη σε ανάλυση 1.94 Å. Η κρυσταλλική δομή αποκαλύπτει ατομικές λεπτομέρειες για κάποια σημαντικά λειτουργικά στοιχεία του υποδοχέα όπως η Cys-loop και η κύρια ανοσογόνος περιοχή (main immunogenic region, MIR) όπου προσδένεται το μεγαλύτερο ποσοστό αυτοαντισωμάτων που παρουσιάζονται στη μυασθένεια [Cosma D. Dellisanti et al. 2007]. 1.5 Μόρια προσδέτες του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Τα μόρια που προσδένουν στον nachr διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες ανάλογα με τη θέση πρόσδεσής του και τον τρόπο με τον οποίο επηρεάζουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει τους αγωνιστές οι οποίοι προσδένονται στην ίδια θέση με την ακετυλοχολίνη και επάγουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι ανταγωνιστές οι οποίοι προσδένονται στην ίδια θέση με την ακετυλοχολίνη αλλά αναστέλλουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού. Η τρίτη κατηγορία περιλαμβάνει τους αλλοστερικούς υποκαταστάτες οι οποίοι προσδένονται σε διαφορετικές θέσεις από την ακετυλοχολίνη και μπορούν είτε να επάγουν είτε να αναστέλλουν την λειτουργία του υποδοχέα. 1.5.1 Ακετυλοχολίνη Για την πρόσδεση την ακετυλοχολίνης στον nachr συμμετέχουν οκτώ αμινοξικά κατάλοιπα της α υπομονάδας τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στα διάφορα είδη οργανισμών καθώς και κάποια αμινοξικά κατάλοιπα των γ και δ υπομονάδων [Karlin and Akabas 1995; Hucho et al. 1996]. 21

Συγκεκριμένα, μελέτες έκφρασης υπομονάδων του nachr σε ωοκύτταρα Xenopus και ευκαρυωτικές κυτταρικές σειρές επιβεβαίωσαν ότι οι θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στο μυϊκού τύπου υποδοχέα σχηματίζονται μεταξύ των α και γ ή α και ε και μεταξύ των α και δ υπομονάδων [Kurosaki et al. 1987; Blount and Merlie 1989; Sine 1993]. Mε αυτό τον τρόπο δημιουργούνται δύο θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης σε κάθε υποδοχέα. 1.5.2 α-μπουγκαροτοξίνη Η α-μπουγκαροτοξίνη αποτελεί έναν ανταγωνιστή του nachr. Πρόκειται για ένα πολυπεπτίδιο που αποτελεί βασικό συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicintus. Προσδένεται με πολύ υψηλή συγγένεια στον μυϊκού τύπου υποδοχέα εμποδίζοντας την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης. Η πρόσδεσή του εμποδίζει τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού μη αναστρέψιμα [Karlin et al. 1986; Claudio 1989]. Μελέτες με πεπτίδια από πρωτεολυμένη α υπομονάδα, με ανασυνδυασμένα τμήματα της α υπομονάδας καθώς και με συνθετικά πεπτίδια έδειξαν ότι η α-μπουγκαροτοξίνη προσδένεται σε μια μικρή περιοχή της α υπομονάδας η οποία περιλαμβάνει στις θέσεις 192 και 193 δύο κυστεΐνες [Tzartos and Changeux 1983, 1984; Wilson et al. 1985; Barkas et al. 1986; Neumann et al. 1986; Ralston et al. 1987]. Άλλες μελέτες κατέληξαν ότι για την πρόσδεση της α-μπουγκαροτοξίνης βασικό ρόλο παίζουν τα αμινοξέα 189, 190, 192, 193 και 195 [Tzartos and Remoundos 1990; Chaturvedi et al. 1993; Vincent et al. 1998]. Εκτός από τον μυϊκού τύπου nachr η α- μπουγκαροτοξίνη παρουσιάζει υψηλή συγγένεια και για τους νευρικούς υποδοχείς α7, α8 και α9 [Gotti et al. 1997]. 1.5.3 κ-μπουγκαροτοξίνη Η κ-μπουγκαροτοξίνη συναντάται στο δηλητήριο του φιδιού Bungarus multicinus όπως και η α-μπουγκαροτοξίνη με τη διαφορά ότι η τελευταία βρίσκεται σε πολύ μεγαλύτερες ποσότητες εκεί [Chiappinelli 1983]. Πρόκειται για ένα πολυπεπτίδιο το οποίο αναστέλλει τη συναπτική διαβίβαση σε γάγγλια του αυτόνομου νευρικού συστήματος όπου βρίσκονται κάποιοι ετεροδιμερείς τύποι υποδοχέων [Gotti et al. 1997]. Πειράματα έχουν δείξει ότι η κ-μπουγκαροτοξίνη αναστέλλει πλήρως τη λειτουργία του α3β2 του αρουραίου και μερικώς τον α4β2. Πρόσδεσή της στους υποδοχείς α2β2 και α3β4 δεν οδηγεί σε αναστολή αυτών [Luetje et al. 1990, 1993]. Έπειτα από μελέτες αποδείχθηκε ότι τα αμινοξέα 54-63 της β2 υπομονάδας είναι 22

εκείνα που παρουσιάζουν ευαισθησία στην κ-μπουγκαροτοξίνη [Harvey and Luetje 1996]. 1.5.4 Νικοτίνη Η νικοτίνη είναι αγωνιστής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Όταν χορηγείται για μικρό χρονικό διάστημα ενεργοποιεί τους υποδοχείς ενώ η χρήση της για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα μπορεί να προκαλέσει αντιστρεπτή απευαισθητοποίηση ή μόνιμη απενεργοποίηση μερικών νευρικών nachrs όπως ο α4β2 και ο α7 [Hsu et al. 1996]. Είναι γνωστό ότι η νικοτίνη αντιδρά πιο ισχυρά με τους νευρικού τύπου nachrs από ότι με τους μυϊκού τύπου. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η νικοτίνη δημιουργεί κατιόν-π αλληλεπίδραση με ένα κατάλοιπο τρυπτοφάνης στην B θηλιά της α4 υπομονάδας και ένα δεσμό υδρογόνου με την ομάδα καρβονυλίου του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ αυτού του καταλοίπου και του αμέσως επόμενου διπλανού καταλοίπου. Δεν παρατηρείται αντίστοιχη αλληλεπίδραση της νικοτίνης με τον μυϊκού τύπου υποδοχέα [Cashin et al. 2005; Pauly et al. 2005; Xiu et al. 2009] 1.5.5 Επιβατιδίνη Η επιβατιδίνη είναι ένα αλκαλοειδές που απομονώθηκε για πρώτη φορά από το δέρμα του βατράχου Epipedobates tricolor. Λόγω του μεγάλου ενδιαφέροντος που συγκέντρωσε το 1993 κατασκευάστηκε συνθετική επιβατιδίνη σε μεγάλες ποσότητες [Broka 1993; Huang and Shen 1993]. Πρόκειται για αγωνιστή της ακετυλοχολίνης ο οποίος προσδένει σε νευρικούς υποδοχείς όπως α4β2, α7, α3β2, α3β4. Η συγγένεια της επιβατιδίνης για αυτούς είναι πολύ μεγαλύτερη από εκείνη της ακετυλοχολίνης ή της νικοτίνης. Συγκεκριμένα, η επιβατιδίνη παρουσιάζει 20 φορές μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης στους συγκεκριμένους τύπους υποδοχέων από τη νικοτίνη και είναι 200 φορές πιο δραστική από αυτή [Gopalakrishnan et al 1996]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η επιβατιδίνη παρουσιάζει αναλγητικές ιδιότητες όπως η νικοτίνη. 1.6 Αλλοστερικές καταστάσεις nachr Στη νευρομυϊκή σύναψη ο nachr δεσμεύει και αποδεσμεύει ακετυλοχολίνη οδηγώντας έτσι αντίστοιχα σε άνοιγμα και κλείσιμο του καναλιού ιόντων και τη μεταβολή του δυναμικού της μετασυναπτικής μεμβράνης. Οι αλλοστερικές καταστάσεις του υποδοχέα είναι διαφορετικές λειτουργικές καταστάσεις κατά τις οποίες η δομή του μορίου παρουσιάσει μικρές και αμφίδρομες τροποποιήσεις. Αλλοστερικοί τροποποιητές, δηλαδή μόρια υποκαταστάτες, βοήθησαν στη μελέτη 23

των τριών αλλοστερικών καταστάσεων. Οι αλλοστερικές καταστάσεις είναι οι εξής: α) κατάσταση ηρεμίας, β) ενεργή κατάσταση και γ) απευαισθητοποιημένη κατάσταση (Εικόνα 5). Κατά την κατάσταση ηρεμίας το κανάλι είναι κλειστό και έχει τη δυνατότητα ενεργοποίησης αν προσδεθούν στον υποδοχέα δύο μόρια ακετυλοχολίνης. Όταν προσδεθούν αυτά τα μόρια στον nachr τότε μεταπίπτει ταχύτατα (10-100 μs) στην ενεργή κατάσταση κατά την οποία το κανάλι είναι ανοιχτό. Η πρόσδεση των μορίων ακετυλοχολίνης στον υποδοχέα αποτρέπει την πρόσδεση άλλων μορίων ακετυλοχολίνης. Μετά από το άνοιγμα του καναλιού στην προηγούμενη κατάσταση Εικόνα 5. Αλλοστερικές καταστάσεις του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Α. Κατάσταση ηρεμίας Β. Ενεργή κατάσταση Γ. Απευαισθητοποιημένη κατάσταση (ενεργή κατάσταση) ακολουθεί η απευαισθητοποιημένη κατάσταση κατά την οποίο το κανάλι παραμένει κλειστό. Ο υποδοχέας μεταπίπτει από την ενεργή στην απευαισθητοποιημένη κατάσταση με μικρότερη ταχύτητα [Lena and Changex 1993]. 24

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ετερόλογη έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος των υπομονάδων α4 και β2 του ανθρώπου συνδεδεμένες με συνδέτη Το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων α4 και β2 του ανθρώπου εκφράστηκαν συνδεδεμένες με έναν αμινοξικό συνδέτη στο σύστημα έκφρασης του ζυμομύκητα Pichia pastoris Χ-33 με φορέα κλωνοποίησης τον ppicaα [Stergiou et al. 2011]. Ο συνδέτης που ενώνει τις δύο υπομονάδες είναι ένα πεπτίδιο 24 αμινοξέων, επαναλαμβανόμενων τριπλετών AGS (αλανίνη, γλυκίνη, σερίνη). Οι υπομονάδες αυτές συνδέθηκαν μεταξύ τους με διαφορετική σειρά, α4-β2 και β2-α4. Από αυτές το συγκαταμερές με φορά β2-24-α4 (που για συντομία θα αναφερόμαστε σε αυτό ως β2- α4) αποδείχθηκε ότι συγκεντρώνει αρκετά καλές ιδιότητες πρόσδεσης συνδετών και υψηλή υδροφιλικότητα. Όσον αφορά το β2-α4 έχει παρατηρηθεί ότι η γλυκοζυλιωμένη του μορφή εκφράζεται με μοριακό βάρος που αντιστοιχεί σε διμερές. Παρουσιάζει ιδιότητες πρόσδεσης των προσδετών 125 Ι-επιβατιδίνη και 3 Η-νικοτίνη που προσεγγίζουν εκείνες ολόκληρου του υποδοχέα α4β2. Συγκεκριμένα, το συγκαταμερές παρουσιάζει Κd πρόσδεσης της 125 Ι-επιβατιδίνης 0.38nM, τιμή πολύ κοντά στην Κd πρόσδεσης του ίδιου προσδέτη σε ολόκληρο τον υποδοχέα α4β2 (0.05-0.9nM). Αυτό συμβαίνει σε αντίθεση με τις μεμονωμένες υπομονάδες α4 και β2 οι οποίες δεν παρουσιάζουν δυνατότητες πρόσδεσης επιβατιδίνης όταν εκφράζονται μεμονωμένα μιας και η επιφάνεια πρόσδεσης αυτού του προσδέτη συναντάται στην διεπιφάνεια μεταξύ των δύο αυτών υπομονάδων του α4β2. Επίσης, η 3 H-νικοτίνη προσδένει στο β2-α4 με Κd 19nM, τιμή που πλησιάζει αρκετά εκείνη ολόκληρου του υποδοχέα (0.9-10nM). Πειράματα ανταγωνισμού μεταξύ ραδιοσημασμένης επιβατιδίνης ( 125 Ι-επιβατιδίνη) και μερικών μη σημασμένων προσδετών έδειξαν ότι οι τιμές του Ki των τελευταίων πλησιάζουν αυτές που έχει ολόκληρος ο α4β2 υποδοχέας. Πρόκειται, λοιπόν, για ένα μόριο το οποίο συγκεντρώνει πολλά πλεονεκτήματα ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτη. Κρυσταλλογραφική μελέτη του β2-α4 θα παρείχε σημαντικές πληροφορίες για τη δομή του οι οποίες θα ήταν χρήσιμες στην καλύτερη κατανόηση του α4β2 υποδοχέα του ανθρώπου που εμπλέκεται όπως έχει περιγραφεί σε προηγούμενο κεφάλαιο σε νευροεκφυλιστικές νόσους και τον εθισμό στο κάπνισμα. 25

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ανοσοσφαιρίνες 3.1 Δομή ανοσοσφαιρινών Οι ανοσοσφαιρίνες είναι τετραμερή γλυκοπρωτεϊνικά μόρια με χαρακτηριστική διαμόρφωση στο χώρο που μοιάζει με ύψιλον (Υ). Δομικά αποτελούνται από δύο όμοιες βαριές (heavy, Η) πολυπεπτιδικές αλυσίδες, μήκους περίπου 446 αμινοξέων η καθεμιά και από δύο όμοιες ελαφριές (light, L) πολυπεπτιδικές αλυσίδες μήκους περίπου 219 αμινοξέων. Οι πολυπεπτιδικές αυτές αλυσίδες συγκρατούνται μέσω ομοιοπολικών δεσμών (γέφυρες θείου) και μη ομοιοπολικών δεσμών. Η κάθε ελαφριά αλυσίδα αποτελείται από μία μεταβλητή και μία σταθερή περιοχή, ενώ η κάθε βαριά αλυσίδα έχει μία μεταβλητή και τρεις ή τέσσερις σταθερές περιοχές. Κάθε μεταβλητή περιοχή της βαριάς αλυσίδας (V H ) ή της ελαφριάς αλυσίδας (V L ) περιέχει τρεις υπερμεταβλητές περιοχές ή CDRs. Από τις τρεις αυτές περιοχές, εκείνη με τη μεγαλύτερη μεταβλητότητα είναι η CDR3 που βρίσκεται στο σημείο σύνδεσης των περιοχών C και V. H περιοχή αυτή είναι εκείνη που συνεισφέρει περισσότερο στην πρόσδεση του αντιγόνου. Όταν πραγματοποιηθεί πέψη ενός μορίου ανοσοσφαιρίνης με το ένζυμο παπαΐνη τότε προκύπτουν δύο τμήματα Fab (Fragment antigen binding) και ένα Fc (Fragment crystalline). To Fab είναι το τμήμα του αντισώματος που περιλαμβάνει μια ολόκληρη ελαφριά αλυσίδα συνδεδεμένη με την περιοχή V και την πρώτη περιοχή C της βαριάς αλυσίδας. Τα Fab τμήματα περιέχουν την περιοχή πρόσδεσης του αντιγόνου. Οι υπόλοιπες περιοχές C αποτελούν την περιοχή Fc. Σε κάθε μόριο ανοσοσφαιρίνης υπάρχουν δύο πανομοιότυπα τμήματα Fab που προσδένονται με το αντιγόνο και ένα Fc τμήμα που είναι υπεύθυνο για τις περισσότερες δραστικές λειτουργίες των αντισωμάτων. Ανάμεσα στις περιοχές Fab και Fc των περισσοτέρων αντισωμάτων υπάρχει ένα ευλύγιστο τμήμα, η περιοχή άρθρωσης. Η περιοχή άρθρωσης είναι εκείνο το τμήμα που επιτρέπει στα δύο Fab τμήματα να μετακινούνται έτσι ώστε να προσδένονται ταυτόχρονα σε δύο αντιγονικούς επιτόπους που απέχουν διαφορετικές αποστάσεις μεταξύ τους. Τα τμήματα του αντιγόνου που αναγνωρίζονται από τα αντισώματα ονομάζονται επίτοποι ή καθοριστές. Η ισχύς με την οποία ένα αντίσωμα συνδέεται με τον επίτοπο ενός αντιγόνου ονομάζεται συγγένεια αλληλεπίδρασης και εκφράζεται με τη σταθερά διάστασης (Kd) η οποία είναι η μοριακή συγκέντρωση του αντιγόνου που απαιτείται 26

για να καλυφθούν τα μισά από τα διαθέσιμα μόρια του αντισώματος σε ένα διάλυμα. Μεγάλη τιμή της Kd σημαίνει μικρή συγγένεια και το αντίστροφο. Αντισώματα που παράγονται έναντι ενός αντιγόνου μπορεί να προσδένονται και με άλλα αντιγόνα με παρόμοια δομή και η πρόσδεση αυτή ονομάζεται διασταυρούμενη αλληλεπίδραση [Tzartos and Mamalaki 2004]. Τα αντισώματα του ανθρώπου διακρίνονται σε πέντε κύριες κατηγορίες και αρκετές υποκατηγορίες (αλλότυποι ή κλάσεις), δηλαδή πολυμορφικούς τύπους των ανοσοσφαιρινών μέσα σε ένα είδος. Αυτές οι κατηγορίες είναι οι IgM, IgD, IgG, IgE, IgA και διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τις βαριές αλυσίδες μ, δ, γ, ε και α αντιστοίχως. Όσον αφορά τις ελαφριές αλυσίδες αυτές είναι δύο τύπων κ και λ και κάθε αντίσωμα εμφανίζει έναν από τους δύο αυτούς τύπους. Κάθε τύπος ανοσοσφαιρινών έχει διαφορετική λειτουργία στον οργανισμό και όλοι εκκρίνονται από τα ώριμα Β-κύτταρα στο πλάσμα του αίματος. Κάθε φυσιολογικό πλασματοκύτταρο παράγει ανοσοσφαιρίνες που ανήκουν σε μία από αυτές τις πέντε κύριες κατηγορίες. Η ανοσοσφαιρίνη που εμφανίζεται σε υψηλότερα επίπεδα στο αίμα είναι η IgG, ακολουθεί η IgA και η IgM. Οι IgD και IgE εμφανίζονται σε πολύ μικρές ποσότητες στο αίμα [Marmaras and Labropoulou-Marmara 2000]. 3.2 Διέγερση Β λεμφοκυττάρων από αντιγόνο και παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων στον οργανισμό Τα Β λεμφοκύτταρα ενός οργανισμού, σε απόκριση σε κάποιο αντιγόνο, διεγείρονται και εκκρίνουν αντισώματα ειδικά για το αντιγόνο αυτό (χυμική ανοσία). Οι χυμικές ανοσοαπαντήσεις ξεκινούν όταν τα ειδικά για το αντιγόνο Β λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στα λεμφοζίδια του σπλήνα, στους λεμφαδένες και στους βλεννογόνιους λεμφικούς ιστούς αναγνωρίσουν το αντιγόνο. Στους λεμφαδένες τα Β λεμφοκύτταρα είναι συγκεντρωμένα σε διακριτές δομές, τα λεμφοζίδια. Τα λεμφοζίδια βρίσκονται στην περιφέρεια ή φλοιό κάθε λεμφαδένα. Τα Β λεμφοκύτταρα, που είναι ειδικά για ένα αντιγόνο, χρησιμοποιούν τους μεμβρανικούς υποδοχείς ανοσοσφαιρίνης για να αναγνωρίσουν το αντιγόνο αυτό. Τα Β λεμφοκύτταρα που έχουν αναγνωρίσει το αντιγόνο ενεργοποιούνται και κατά συνέπεια ξεκινά ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίησή τους. Με την ενεργοποίησή τους προετοιμάζονται και για αλληλεπίδραση με τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (σε περίπτωση που το αντιγόνο είναι πρωτεΐνη). 27

Το λεμφοζίδιο όπου βρίσκονται αυτά τα ειδικά για το αντιγόνο Β λεμφοκύτταρα μπορεί να φέρει μια κεντρική περιοχή που λέγεται βλαστικό κέντρο. Μέσα σε αυτά τα βλαστικά κέντρα τα Β λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται ταχύτατα. Κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού τα γονίδια των αντισωμάτων των κυττάρων υπόκεινται σε σημειακές μεταλλάξεις που ονομάζονται σωματικές υπερμεταλλάξεις. Οι εκτεταμένες αυτές μεταλλάξεις έχουν σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία διαφορετικών κλώνων Β κυττάρων των οποίων τα μόρια των ανοσοσφαιρινών μπορούν να προσδένονται με συγγένεια που ποικίλλει ευρέως στο αντιγόνο που προκάλεσε την απάντηση. Τα Β λεμφοκύτταρα που εκκρίνουν ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα παραμένουν στα λεμφικά όργανα ενώ τα αντισώματα που εκκρίνονται από αυτά εισέρχονται στο αίμα. Ορισμένα από τα κύτταρα που παράγουν αντισώματα μπορεί να μεταναστεύσουν προς το μυελό των οστών και να παραμείνουν εκεί για μεγάλο χρονικό διάστημα συνεχίζοντας την παραγωγή αντισώματος. Κάποια από τα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα δεν διαφοροποιούνται προς κύτταρα που εκκρίνουν αντίσωμα (πλασματοκύτταρα) αλλά γίνονται κύτταρα μνήμης. Τα κύτταρα μνήμης δεν εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνες αλλά κυκλοφορούν στο αίμα και επιβιώνουν για μήνες ή χρόνια χωρίς επιπλέον έκθεση στο αντιγόνο. Τα κύτταρα βρίσκονται σε ετοιμότητα ώστε να αποκριθούν γρήγορα στο αντιγόνο αν αυτό εισέλθει ξανά στον οργανισμό [Tzartos and Mamalaki 2004]. 3.3 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων από υβριδώματα Η τεχνική παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων με χρήση υβριδωμάτων ανακαλύφθηκε από τους Kohler και Milstein το 1975. Η εργασία αυτών των επιστημόνων, η οποία βραβεύτηκε με Νόμπελ το 1984, στηρίχθηκε στην τεχνική της κυτταρικής σύντηξης. Τα παραγόμενα από ποντίκια υβριδώματα αποτελούν την πρώτη αξιόπιστη πηγή για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ικανότητα των Β λεμφοκυττάρων να παράγουν αντισώματα και των μυελωματικών να πολλαπλασιάζονται συνεχώς. Με τη σύντηξη των κυττάρων αυτών προκύπτουν υβριδικά κύτταρα που καλούνται υβριδώματα τα οποία καλλιεργούνται και είναι ικανά να εκκρίνουν διαρκώς το επιθυμητό μονοκλωνικό αντίσωμα. Αρχικά πραγματοποιείται ανοσοποίηση πειραματόζωου έναντι του επιθυμητού αντιγόνου. Αυτό επιτυγχάνεται με ενέσεις που περιέχουν το συγκεκριμένο αντιγόνο. 28

Το αντιγόνο επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β- λεμφοκύτταρων του ζώου σε πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα. Μετά από κάποιες αναμνηστικές ενέσεις αφαιρείται ο σπλήνας του ζώου και συλλέγονται τα κύτταρα από αυτόν. Ανάμεσα στα κύτταρα που περιέχει το όργανο του ζώου υπάρχουν Β-λεμφοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα που προσδένουν στο αντιγόνο. Τα κύτταρα αυτά δεν μπορούν να επιβιώσουν για μεγάλο χρονικό διάστημα σε καλλιέργειες. Για το λόγο αυτό συντήκονται με μυελωματικά κύτταρα τα οποία ανήκουν σε καρκινική κυτταρική σειρά και μπορούν να πολλαπλασιάζονται διαρκώς. Η σύντηξη αυτή πραγματοποιείται με τη βοήθεια πολυαιθυλενογλυκόλης η οποία οδηγεί στη σύντηξη των μεμβρανών των κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό προκύπτουν τα υβριδώματα. Τα μυελωματικά κύτταρα που χρησιμοποιούνται χαρακτηρίζονται από μια ειδική μετάλλαξη λόγω της οποίας τους λείπει το ένζυμο υποξανθίνη γουανίνη φωσφοριβοζυλοτρανσφεράση (HGPRT). Το ένζυμο αυτό καταλύει την αντίδραση σε μια από τις δύο μεταβολικές οδούς που οδηγούν στη σύνθεση της μονοφωσφορικής γουανοσίνη (GMP). Όταν τα κύτταρα αυτά καλλιεργηθούν σε καλλιεργητικό μέσο που περιέχει αμινοπτερίνη ή αμεθοπτερίνη που είναι ανταγωνιστές του φολικού οξέος και αναστέλλουν την κανονική οδό παραγωγής GMP τότε δεν μπορούν να επιβιώσουν. Μόνο τα υβριδώματα μπορούν λόγω του ενεργού γονιδίου παραγωγής HGPRT που υπάρχει στο γενετικό υλικό των B-λεμφοκυττάρων. Με τον τρόπο αυτό μπορούμε να ξεχωρίσουμε τα υβριδώματα από τα μη συντηγμένα κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε αυτό το ειδικό υλικό καθώς τα μυελωματικά λόγω της έλλειψης του γονιδίου HGPRT και της παρουσίας των αναστολέων του φολικού οξέος δεν καταφέρνουν να επιβιώσουν. Όσον αφορά τα Β-λεμφοκύτταρα, αυτά αναπτύσσονται αργά και δεν επιβιώνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα. Κατά συνέπεια, τα μόνα κύτταρα που επιβιώνουν είναι τα υβριδώματα. Κάθε μια από τις αποικίες που δημιουργούν τα υβριδώματα ελέγχονται για έκκριση του επιθυμητού αντισώματος. Αφού βρεθούν οι αποικίες που εκκρίνουν το αντίσωμα κλωνοποιούνται σε καλλιέργεια ή πολλαπλασιάζονται ως όγκος μέσα σε κάποιον οργανισμό [Marmaras and Labropoulou-Marmara 2000]. 3.4 Χρήσεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων Τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται ευρέως στον ερευνητικό τομέα καθώς και σε κλινικό επίπεδο για διάγνωση ή θεραπεία ασθενειών. Για το λόγο αυτό 29

εκτός από την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη χρήση υβριδωμάτων, όπως περιγράφηκε παραπάνω, κατασκευάζονται και ανασυνδυασμένα ανθρώπινα αντισώματα. Στις περιπτώσεις όπου τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται ως θεραπεία σε ασθένειες δεν θα πρέπει να έχουν παραχθεί σε κάποιο πειραματόζωο. Κι αυτό γιατί δεν μπορούν να χορηγηθούν επανειλημμένα σε ανθρώπους λόγω του ότι ο οργανισμός τους αναγνωρίζει την ανοσοσφαιρίνη του ζώου σαν ξένη και πραγματοποιεί ανοσολογική απάντηση έναντι αυτής. Αυτό αντιμετωπίζεται με τη δημιουργία μονοκλωνικών αντισωμάτων που αποτελούνται από περιοχές πρόσδεσης στο αντιγόνο προερχόμενες από ποντίκι ενώ η υπόλοιπη δομή τους είναι ανθρώπινης προέλευσης. Τα αντισώματα αυτά ονομάζονται ανθρωποποιημένα και είναι κατάλληλα για χορήγηση στον άνθρωπο. Επίσης, αντισώματα κατασκευάζονται με τη χρήση της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιώντας mrna των ανθρώπινων αντισωμάτων και επιλέγοντας τα αντισώματα της επιθυμητής ειδικότητας. Επίσης, παραγωγή ανθρώπινων μονοκλωνικών αντισωμάτων σε ποντικούς μπορεί να γίνει με την εισαγωγή και έκφραση ανθρώπινων γονιδίων των ανοσοσφαιρινών σε ποντικούς στους οποίους τα γονίδια παραγωγής αντισωμάτων έχουν εξαλειφθεί. Στη συνέχεια στα ποντίκια αυτά πραγματοποιείται ανοσοποίηση για το επιθυμητό αντιγόνο. Τα μονοκλωνικά αντισώματα που χρησιμοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς μελετώνται σε μεγάλο βαθμό τις τελευταίες δεκαετίες. Περισσότερα από 400 θεραπευτικά μονοκλωνικά αντισώματα βρίσκονται υπό κλινικές δοκιμές από τα οποία τα 200 είναι αντικαρκινικά. Το πλεονέκτημα των μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι η μεγάλη εξειδίκευση που παρουσιάζουν και για το λόγο αυτό μπορεί να αποδειχθούν πολύ αποτελεσματικά. Μερικά εγκεκριμένα μονοκλωνικά αντισώματα για τη θεραπεία του καρκίνου είναι το Panorex (edrecolomab) για το ορθοκολικό καρκίνωμα και το Herceptin (trastuzamab) για το μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται και για τη θεραπεία πολλών αυτοάνοσων νοσημάτων όπως η μυασθένεια. Για παράδειγμα το Rituxan (rituximab), το οποίο χρησιμοποιείται για το non-hodgkin s λέμφωμα, αποτελεί φαρμακευτική αγωγή και στην περίπτωση των μυασθενών. Το φάρμακο αυτό αποτελείται από ανοσοσφαιρίνες που κατευθύνονται έναντι του υποδοχέα CD20 της επιφάνειας των Β λεμφοκυττάρων και οδηγεί με αυτόν τον τρόπο στην καταστροφή των κυττάρων που παράγουν αντισώματα στον οργανισμό των ασθενών που το λαμβάνουν. 30

Αντισώματα χρησιμοποιούνται σε μεγάλο βαθμό στη διάγνωση ασθενειών εντοπίζοντας κάποιο αντιγόνο ή αντίσωμα που συναντάται στον οργανισμό. Μερικές από τις τεχνικές που χρησιμοποιούν αντισώματα είναι η ELISA, η ανοσοϊστοχημεία, ο ραδιο-ανοσοπροσδιορισμός (RIA) και η ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (western blotting). Με τον ραδιο-ανοσοπροσδιορισμό που περιγράφεται στο κεφάλαιο Μεθοδολογία - εντοπίζονται αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στον οργανισμό των ατόμων που πάσχουν από μυασθένεια. 3.5 Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Μονοκλωνικά αντισώματα (mabs) που προσδένουν στη MIR (κύρια ανοσογόνος περιοχή) μπορούν να προκαλέσουν παθητικά πειραματική μυασθένεια σε πειραματόζωα όπως για παράδειγμα μονοκλωνικά αντισώματα που έχουν παραχθεί από ανοσοποίηση αρουραίων με AChRs από τα ηλεκτρικά όργανα του Torpedo californica και του Electrophorus electricus. Τα mabs αυτά κατευθύνονται έναντι της MIR, κάτι που αποδεικνύεται από την δυνατότητα ενός και μόνο τέτοιου αντισώματος να εμποδίζει την πρόσδεση ενός μεγάλου τμήματος αντι-υποδοχέα αντισωμάτων του ορού [Tzartos and Lindstrom 1980]. Η MIR, όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω, βρίσκεται στο εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα και περιλαμβάνει τα αμινοξικά κατάλοιπα 66-76 της υπομονάδας α1. Η περιοχή πρόσδεσης των αντισωμάτων είναι διαφορετική από την περιοχή πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στον υποδοχέα. Μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται στη ΜΙR μπορούν να οδηγήσουν σε ενεργοποίηση του συμπληρώματος σε πειραματική αυτοάνοση μυασθένεια [Tzartos and Lindstrom 1980]. To mab35 που προσδένει στη MIR μπορεί να έχει διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με τον AChR και να προκαλέσει EAMG σε αρουραίους χωρίς να παρεμποδίζει τη λειτουργία του καναλιού [Loutrari et al. 1992]. Επίσης, EAMG μπορεί να προκληθεί σε πειραματόζωα με ανοσοποίηση αυτών με υποδοχέα που έχει απομονωθεί από τα ηλεκτρικά όργανα του Torpedo. 31

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Σκοπός της εργασίας Σκοπός της εργασίας ήταν η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι nachr νευρικού τύπου του ανθρώπου καθώς και ο σε βάθος χαρακτηρισμός τους για την μελλοντική χρήση τους για δομικές μελέτες συμπλόκων του υποδοχέα με τμήματα των αντισωμάτων αυτών. Η εργασία αυτή διακρίνεται σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος αφορά στην παραγωγή και το χαρακτηρισμό mabs του εξωκυττάριου τμήματος των ανθρώπινων υπομονάδων β2 και α4 του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης α4β2 του εγκεφάλου, ενωμένων με ένα συνδέτη (συγκαταμερές β2-α4). Στο δεύτερο μέρος έγινε πέψη και απομόνωση τμημάτων Fab από τα mabs που δημιουργήθηκαν καθώς και από άλλα αντισώματα που ήδη υπήρχαν στο εργαστήριο. Στη συνέχεια σχηματίστηκαν σύμπλοκα των Fab με τις αντίστοιχες υπομονάδες του υποδοχέα και έγιναν προσπάθειες συγκρυστάλλωσης. Τελικός σκοπός αυτής της προσπάθειας είναι η άντληση πληροφοριών για τη δομή του υποδοχέα και για τη σύνδεσή του με τα αντισώματα. 4.1 Πρώτο Μέρος Όσον αφορά το πρώτο μέρος της εργασίας χρησιμοποιήθηκε το συγκαταμερές β2-α4 για ανοσοποίηση πειραματόζωων και στη συνέχεια ακολούθησε παραγωγή mabs έναντι αυτού του πρωτεϊνικού μορίου με την τεχνική της κυτταρικής σύντηξης. Τα mabs που δημιουργήθηκαν χαρακτηρίστηκαν ως προς τις ιδιότητες πρόσδεσής τους. Ο σκοπός παρασκευής αυτών των αντισωμάτων περιλαμβάνει τη χρήση τμημάτων τους για δημιουργία συμπλόκου με το συγκαταμερές και ακόλουθη κρυσταλλογραφική μελέτη αυτού. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση του συμπλόκου θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε καλύτερα τη δομή του β2-α4 και κατ επέκταση ολόκληρου του υποδοχέα α4β2. Εκτός από τη δομή του μορίου του υποδοχέα από την κρυσταλλογραφική αυτή ανάλυση θα μπορέσουμε να αντλήσουμε πληροφορίες και σχετικά με την πρόσδεση του αντισώματος με τον υποδοχέα. Αποτελέσματα μιας τέτοιας έρευνας θα ήταν πολύ σημαντικά καθώς ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης α4β2 εμπλέκεται σε νευροεκφυλιστικές νόσους και στον εθισμό στο κάπνισμα. Η δημιουργία αυτών των mabs θα είναι επίσης χρήσιμη σε εργαστηριακές τεχνικές για τον εντοπισμό υποδοχέα α4β2 σε ιστούς 32

4.2 Δεύτερο Μέρος Τα μονοκλωνικά αντισώματα που δημιουργήθηκαν απομονώθηκαν και στη συνέχεια έγινε πέψη αυτών με παπαΐνη. Τα Fab τμήματα που προέκυψαν από την πέψη αυτή απομονώθηκαν με σκοπό τη δημιουργία συμπλόκου με το συγκαταμερές. Μελλοντικά θα πραγματοποιηθούν προσπάθειες κρυσταλλογραφικής μελέτης των συμπλόκων αυτών για την άντληση πληροφοριών. Εκτός από τον καθαρισμό και πέψη των αντισωμάτων που παράχθηκαν, οι ίδιες διαδικασίες ακολουθήθηκαν και για άλλα μονοκλωνικά αντισώματα που είχαν παραχθεί παλιότερα στο εργαστήριο. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν το mab73, το οποίο είναι ειδικό για τη β1 υπομονάδα του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και το mab198, που είναι ειδικό για την α1 υπομονάδα του ίδιου υποδοχέα. Ο σκοπός αυτών των διαδικασιών ήταν ο ίδιος: η δημιουργία συμπλόκων Fab73-β1 και Fab198- α1 τα οποία να μπορούν να μελετηθούν κρυσταλλογραφικά και να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την β1 υπομονάδα καθώς και την πρόσδεση των αντισωμάτων και στις δύο αυτές υπομονάδες. Έχουν γίνει και συνεχίζουν να πραγματοποιούνται προσπάθειες για κρυστάλλωση των συμπλόκων Fab73-β1, Fab198-α1 και Fab-β2α4. 33

ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ Στον πίνακα 1 φαίνονται οι συσκευές και τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Συσκευές Όργανα Ψυχόμενη μικροφυγόκεντρος, Eppendorf 5415 R Ψυχόμενη φυγόκεντρος, Eppendorf Μετρητής γ-ακτινοβολίας, LKB Wallac CliniGamma 1272, Kontron, Analytical MDA212 Συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης, Mini-Protean ΙΙΙ BIORAD Συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης ισοηλεκτρικής εστίασης Συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη, Mini Trans-Blot BIORAD Συσκευή FPLC, ACTA purifier 90 Amersham Biosciences Πεχάμετρο, ΗΑΝΝΑ ΗΙ 2211 ph/orpmeter Φωτόμετρο για πλάκες ELISA, Biorad Model 680 Microplate Reader Φωτόμετρο, Biorad SmartSpec Plus Spectrophotometer Πίνακας 1. Συσκευές και όργανα που χρησιμοποιήθηκαν Στον πίνακα 2 αναγράφονται τα αναλώσιμα που χρησιμοποιήθηκαν. Αναλώσιμα Δοκιμαστικοί σωλήνες πολυπροπυλενίου μιας χρήσης των 15 και 50ml, Falcon Μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, Hybond P, Amersham Biosciences 34

Xαρτί διήθησης 3 ΜΜ Whatmann. Πλαστικές αποστειρωμένες πιπέτες 10 και 25 ml Costar Μεμβράνη διαπίδυσης, Spectra/Por Spectrum MWCO: 12-14000 Φίλτρα σύριγγας, PALL GHP Acrodisc 13mm Syring filter, 0,2μm membrane Φίλτρα συμπύκνωσης με φυγοκέντρηση, Centrifugal filter units Millipore Τρυβλία καλλιέργειας, 6well culture plates Costar, 24well culture plates Costar, 96well culture plates Costar Πλάκες για Elisa των 96 θέσεων Ειδικού τύπου φλάσκα για καλλιέργεια μονοκλωνικών αντισωμάτων Celline Classic 350 Two-Compartment Bioreactor Integria Bioscience Πίνακας 2. Αναλώσιμα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον πίνακα 3. Αντιδραστήριο Σύσταση-Εταιρεία DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium), RPMI RPMI* HFCS (Hybridoma Fusion and Cloning Supplement) HAT Gibco 2,4mM μερκαπτοεθανόλη 10% v/v FBS 1% v/v πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (P/S) 0,2% v/v HFCS HAT 50X της Roche Hat Media Supplement της Sigma 35

Ορός εμβρύου βοός (FBS) Αλβουμίνη ορού βοός (BSA) Aντιβιοτικά καλλιέργειας Gibco Applichem Πενικιλίνη, Στρεπτομυκίνη της Biochrom DMSO (Dimethyl Sulphoxide) Freud s complete έκδοχο Freud s incomplete έκδοχο 10% v/v για πάγωμα κυττάρων Sigma Sigma Sigma Anti-rat αντίσωμα συζευγμένο με HRP Polyclonal Rabbit anti-rat immunoglobulins/hrp της Dako ELISA kit Διάλυμα παπαΐνης Έγχρωμοι μάρτυρες μοριακών μεγεθών πρωτεϊνών για SDS-page Έγχρωμοι μάρτυρες μοριακών μεγεθών πρωτεϊνών για IEF. TMB Substrate kit Peroxide Solution (H2O2) Peroxidase Substrate (TMB) Της Pierce Papain from papaya latex της Sigma Συγκέντρωση 25μg/μl Fermentas Biorad Ραδιενεργά σημασμένη επιβατιδίνη Διάλυμα χρωματισμού πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Διάλυμα αποχρωματισμού πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Χρωστική Coomassie R-250 0.1% w/v Μεθανόλη 40% v/v Οξικό οξύ 10% v/v Μεθανόλη 40% v/v Οξικό οξύ 10% v/v 36

PBS IgG για δημιουργία πρότυπης καμπύλης για Bradford Kit για προσδιορισμό του ισότυπου των μονοκλωνικών αντισωμάτων του αρουραίου Για 1lt διαλύματος : 8 gr NaCl 0,2 gr KCl 1,44 gr Na2HPO4 0,24 gr KH2PO4 Απιονισμένο νερό Έπειτα, ρυθμίζεται το ph στο 7,4 (με προσθήκη διαλύματος ΗCl) Bovine Gamma Globulin για Biorad Bradford Assay Rat Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit Abd Serotec Πίνακας 3. Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν Πειραματόζωα Έμβιο υλικό Θηλυκοί αρουραίοι Lewis Θηλυκά ποντίκια BALB/C Καρκινική κυτταρική σειρά SP2/O Πίνακας 4. Έμβιο υλικό που χρησιμοποιήθηκε. 37

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του β2-α4 5.1 Ανοσοποίηση ποντικών και αρουραίων Πραγματοποιήθηκε ανοσοποίηση τεσσάρων θηλυκών ποντικών BALB/C και τεσσάρων θηλυκών αρουραίων Lewis έναντι του β2-α4 (συγκαταμερές σε γλυκοζυλιωμένη μορφή, Κεφάλαιο 2). Για την ανοσοποίηση των πειραματοζώων πραγματοποιήθηκαν στο καθένα τρεις ενέσεις με β2-α4 ενδοπεριτοναϊκά. Κάθε ένεση απείχε χρονικά από την προηγούμενη τουλάχιστον τρεις βδομάδες. 5.1.1 Προετοιμασία ενέσεων Για κάθε ένεση χρησιμοποιήθηκε ποσότητα του β2-α4 όπως φαίνεται στους πίνακες 5-6. Η πρωτεΐνη βρίσκονταν διαλυμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS και σε αυτό έγινε η προσθήκη εκδόχου Freund s (Κεφάλαιο Συσκευές και Υλικά ). Η πρώτη ένεση περιείχε πλήρες έκδοχο Freund s ενώ οι επόμενες μη πλήρες έκδοχο Freund s. Το έκδοχο προστέθηκε κάθε φορά σε ίσο όγκο με τον όγκο του διαλύματος της πρωτεΐνης και αναδεύτηκε πολύ καλά ώστε να γαλακτοματοποιηθεί το προς ένεση διάλυμα. Ποσότητες (μg) β2-α4 Ποντίκι 1 η ένεση 2 η ένεση 3 η ένεση Μ1 100 100 100 Μ2 100 100 100 Μ3 40 40 40 Μ4 40 40 40 Πίνακας 5. Ποσότητες β2-α4 για την ανοσοποίηση ποντικών Στον πίνακα αυτό παρουσιάζονται οι ποσότητες (σε μg) στις οποίες χορηγήθηκε το συγκαταμερές β2-α4 σε κάθε ποντίκι. 38

Ποσότητες (μg) β2-α4 Αρουραίος 1 η ένεση 2 η ένεση 3 η ένεση R1 100 100 40 R2 100 100 40 R3 40 40 20 R4 40 40 20 Πίνακας 6. Ποσότητες β2-α4 για την ανοσοποίηση των αρουραίων Στον πίνακα αυτό παρουσιάζονται οι ποσότητες (σε μg) στις οποίες χορηγήθηκε το συγκαταμερές β2-α4 σε κάθε αρουραίο. 5.2 Έλεγχος ανοσοποίησης πειραματόζωων Δέκα μέρες μετά την τρίτη επαναληπτική ένεση λήφθηκαν 300-500 μl αίματος από κάθε ποντίκι και αρουραίο ώστε να γίνει έλεγχος του τίτλου των αντισωμάτων έναντι του β2-α4. Το ζώο με τον υψηλότερο τίτλο αντισωμάτων (Κεφάλαιο Αποτελέσματα ) θυσιάστηκε πέντε ημέρες μετά από μια τέταρτη ενισχυτική ένεση με β2-α4. Το αίμα που λήφθηκε από τα ζώα για τον έλεγχο αφέθηκε χωρίς αντιπηκτικό σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 30-60 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά σε 1000rpm. Με τον τρόπο αυτό έγινε συλλογή του ορού του αίματος που βρισκόταν στο υπερκείμενο. Στη συνέχεια ακολούθησε έλεγχος του τίτλου των αντισωμάτων στο αίμα των ποντικών και των αρουραίων με ραδιοανοσοπροσδιορισμό (radioimmuno assay, RIA). 5.2.2 Ραδιο-ανοσοπροσδιορισμός (Radio-immunoassay, RIA) Αρχή μεθόδου Η τεχνική RIA στηρίζεται στην ικανότητα πρόσδεσης αντισωμάτων σε ραδιενεργά σημασμένο nachr και στη δημιουργία μεγαλομοριακών συμπλόκων μετά την πρόσδεση δεύτερων αντι-αντισωμάτων που οδηγούν στην κατακρήμνιση του υποδοχέα. Ανθρώπινος μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σημασμένος έμμεσα με μπουγκαροτοξίνη με ραδιενεργό ιώδιο 125 (Ι 125 ) χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του τίτλου των αντισωμάτων στην περίπτωση της μυασθένειας. 39

Για τις ανάγκες των πειραμάτων αυτής της εργασίας χρησιμοποιήθηκε β2-α4 με ραδιενεργά σημασμένη επιβατιδίνη (β2-α4*) η οποία παρουσιάζει μεγάλη ικανότητα πρόσδεσης στον φυσικό α4β2 καθώς και στο συγκαταμερές β2-α4. Πορεία διεξαγωγής Αρχικά για την κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν 0,4μg του β2-α4 που επωάστηκαν με 0,09μl ραδιενεργής επιβατιδίνης (που αντιστοιχούν σε 20000cpm). Η επώαση αυτή πραγματοποιείται για δύο ώρες στους 4 ο C. Μετά το τέλος της επώασης το ραδιενεργά σημασμένο β2-α4 (β2-α4*) μοιράζεται στα προς εξέταση δείγματα που περιέχουν τα προς τιτλοδότηση αντισώματα. Τα δείγματα επωάζονται με το β2-α4* για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πρόσδεση των αντισωμάτων στον υποδοχέα τα διαλύματα επωάζονται για μία ώρα στους 4 ο C με ένα δεύτερο αντίσωμα ικανό να προσδένει στο πρώτο και είναι anti-mouse στην περίπτωση που ο ορός που εξετάζεται είναι από ποντίκι ή anti-rat στην περίπτωση που ο ορός είναι από. Κατά αυτό τον τρόπο δημιουργούνται μεγαλομοριακά σύμπλοκα που κατακρημνίζονται. Ακολούθησε προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος και φυγοκέντρηση σε 4000rpm, για 20 λεπτά, στους 4 ο C. Μετά από απόρριψη του υπερκείμενου επαναλαμβάνεται η ίδια πλύση. Στο τέλος πραγματοποιείται μέτρηση της γ-ακτινοβολίας που εκπέμπεται από το ίζημα σε μετρητή γ ακτινοβολίας. 5.3 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων με υβριδώματα 5.3.1 Μέθοδος κυτταρικής σύντηξης και δημιουργίας υβριδωμάτων Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην σύντηξη κυττάρων σπλήνα ανοσοποιημένου ζώου με κύτταρα μυελώματος τα οποία είναι καρκινικής κυτταρικής σειράς. Στα κύτταρα σπλήνα του ζώου περιλαμβάνονται Β-λεμφοκύτταρα και συγκεκριμένα πλασματοκύτταρα τα οποία έχουν τη δυνατότητα να εκκρίνουν αντισώματα. 40

Εικόνα 6. Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων με κυτταρική σύντηξη Τα σπληνικά κύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα απομονώνονται από το ανοσοποιημένο ποντίκι (ροζ χρώμα) και αναμιγνύονται με τα μυελωματικά κύτταρα που δεν εκκρίνουν αντισώματα (μπλε χρώμα). Τα σπληνικά κύτταρα αναμιγνύονται με τα μυελωματικά κύτταρα και αφήνονται να συντηχθούν. Στη συνέχεια καλλιεργούνται σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό ώστε να επιβιώσουν μόνο τα κύτταρα υβριδώματα. To ΗΑΤ καλλιεργητικό μέσο περιέχει υποξανθίνη, αμινοπτερίνη και θυμιδίνη. Τα κύτταρα μυελώματος της καρκινικής σειράς SP2/O όπως και άλλες σειρές μυελωματικών φέρουν μια μετάλλαξη που τους οδηγεί σε έλλειψη ενός ενζύμου (υποξανθίνη-γουανίνη φωσφοριβόζυλοτρανσφεράση) που καταλύει τη μία από τις δύο μεταβολικές οδούς που οδηγούν στη σύνθεση της μονοφωσφορικής γουανοσίνης (GMP). Η μονοφωσφορική γουανοσίνη αποτελεί υπόστρωμα για τη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων. To ΗΑΤ περιέχει αμινοπτερίνη που είναι αγωνιστής του φολικού οξέος και έτσι αναστέλλει την κανονική οδό παραγωγής μονοφωσφορικής γουανοσίνης. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα μυελώματος που δεν έχουν συντηχθεί με Β-λεμφοκύτταρα δεν μπορούν να επιβιώσουν. Τα Β-λεμφοκύτταρα του ζώου που δεν έχουν συντηχθεί με μυελωματικά περιλαμβάνουν αυτό το ένζυμο αλλά δεν μπορούν να επιβιώσουν για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα σε κυτταροκαλλιέρειες. Συνεπώς επιβιώνουν μόνο τα μυελωματικά κύτταρα που έχουν συντηχθεί με Β-λεμφοκύτταρα και ονομάζονται υβριδώματα. Πορεία διεξαγωγής Επεξεργασία κυττάρων σπλήνα ζώου Το ανοσοποιημένο ζώο θυσιάζεται και αφαιρείται ο σπλήνας από αυτό. Στη συνέχεια ο σπλήνας ομογενοποιείται με χρήση ειδικού φίλτρου και διαλύματος DMEM 10% P/S (πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη). Το ειδικό φίλτρο χρησιμεύει για την κατακράτηση μεγάλων τμημάτων του οργάνου και ιστών. Μετά την ομογενοποίηση ακολουθεί φυγοκέντρηση των κυττάρων των ιστών του οργάνου σε κωνικό δοκιμαστικό σωλήνα 41

στις 1000rpm για 10min, σε θερμοκρασία δωματίου και απομάκρυνση του υπερκείμενου. Ακολουθούν δύο πλύσεις των κυττάρων του σπλήνα με DMEM 10% P/S. Θεωρούμε ότι τα κύτταρα του σπλήνα του ποντικού είναι περίπου 10 8. Επεξεργασία μυελωματικών κυττάρων Μυελωματικά κύτταρα της καρκινικής κυτταρικής σειράς SP2/O είχαν καλλιεργηθεί τις προηγούμενες μέρες στο εργαστήριο. Ο αριθμός των μυελωματικών κυττάρων που χρησιμοποιείται υπολογίζεται να είναι το 1/5 του αριθμού των κυττάρων του σπλήνα του ζώου. Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται σε κωνικό δοκιμαστικό σωλήνα στις 1000rpm για 10min, σε θερμοκρασία δωματίου και απορρίπτεται το υπερκείμενο. Ακολουθούν δύο πλύσεις των μυελωματικών κυττάρων με DMEM 10% P/S. Σύντηξη σπληνικών και μυελωματικών κυττάρων Τα κύτταρα του σπλήνα αναμιγνύονται με τα μυελωματικά. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση αυτών σε κωνικό δοκιμαστικό σωλήνα στις 1000rpm για 10min, σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την απομάκρυνση του υπερκείμενου προστίθεται 1,5ml PEG σταδιακά στη διάρκεια ενός λεπτού και υπό ανάδευση. Η διαδικασία προσθήκης της PEG πραγματοποιείται στους 37 ο C. Αφού προστεθεί όλη η ποσότητα της PEG τα κύτταρα αναδεύονται για ένα λεπτό και στη συνέχεια προστίθεται σταδιακά RPMI* (Κεφάλαιο Συσκευές και Υλικά ) όπως φαίνεται στον πίνακα 7. Ποσότητα RPMI* 1ml 3ml 16ml Διάρκεια προσθήκης 1min 1min 1-2min Πίνακας 7. Προσθήκη καλλιεργητικού υλικού μετά την κυτταρική σύντηξη Προσθήκη καλλιεργητικού υλικού RPMI* μετά από την σύντηξη των κυτταρικών μεμβρανών με την PEG Στη συνέχεια τα κύτταρα με την PEG και το RPMI φυγοκεντρούνται στις 1000rpm για 10min, σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης και πριν την απόρριψη του υπερκείμενου πραγματοποιείται επώαση του υλικού με τα κύτταρα στους 37 ο C για 5 λεπτά, με προσοχή ώστε να μην ανακινηθούν τα κύτταρα. Έπειτα απορρίπτεται το υπερκείμενο και γίνεται επαναδιάλυση των κυττάρων σε υλικό HAT. Τέλος, το εναιώρημα των κυττάρων μοιράζεται σε καλλιεργητικές πλάκες των 48 και 96 θέσεων. 42

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Χαρακτηρισμός μονοκλωνικών αντισωμάτων 6.1 Ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA) Αρχή της μεθόδου Η ανοσοενζυμική μέθοδος (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) στηρίζεται στη δημιουργία συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος όταν ένα από τα δύο είναι ακινητοποιημένο. Το σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύεται καθώς το αντίσωμα του συμπλόκου ή ένα άλλο αντίσωμα που προσδένει στο αντίσωμα του συμπλόκου είναι συνδεδεμένο με ένα ένζυμο. Το ένζυμο αυτό θα οδηγήσει στη δημιουργία έγχρωμου συμπλόκου όταν γίνει η προσθήκη κατάλλου υποστρώματος. Επομένως, για να λάβουμε έγχρωμο σύμπλοκο μετά την προσθήκη του υποστρώματος θα πρέπει να έχει προηγηθεί σύνδεση αντιγόνου αντισώματος. Με τον τρόπο αυτό είναι δυνατό να ανιχνευθεί σε ένα δείγμα ένα συγκεκριμένο αντιγόνο ή αντίσωμα. Για τις ανάγκες αυτής της τεχνικής χρησιμοποιούνται ειδικές πλάκες των 96 θέσεων. Πορεία διεξαγωγής Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν για τις ανάγκες αυτής της εργασίας ήταν απαραίτητος ο εντοπισμός αντισωμάτων έναντι του συγκαταμερούς β2-α4. Επίσης, χρειάστηκε να προσδιοριστούν τα χαρακτηριστικά πρόσδεσης των αντισωμάτων που δημιουργήθηκαν. Αρχικά οι πλάκες των 96 θέσεων επωάζονται με το επιθυμητό αντιγόνο που μπορεί να είναι το συγκαταμερές β2-α4 ή κάποια άλλη από τις πρωτεΐνες στις οποίες επιθυμούμε να διαπιστώσουμε αν προσδένουν τα αντισώματα. Η ποσότητα των πρωτεϊνών που προστίθεται σε κάθε θέση είναι 0,5μg. Το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται για την επώαση για καθεμιά από τις θέσεις είναι 50μl PBS. Η επώαση αυτή πραγματοποιείται όλη τη νύχτα στους 4 ο C. Μετά το τέλος της επώασης πραγματοποιούνται πλύσεις των θέσεων με PBS ώστε να απομακρυνθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης που δεν προσδέθηκε στα τοιχώματα της κάθε θέσης. Έπειτα η πλάκα στεγνώνεται και ακολουθεί η επώαση με 3% BSA για να καλυφθούν τα κενά χωρίς πρωτεΐνη στην κάθε θέση. Η επώαση αυτή πραγματοποιείται στους 37 ο C για μία ώρα. Στη συνέχεια ακολουθούν τρεις πλύσεις της πλάκας με 0,05% Tween 20 και έπειτα τρεις πλύσεις με PBS. Αφού η πλάκα στεγνώσει ακολουθεί η επώαση με τα διαλύματα των αντισωμάτων ή τοποθετείται στους -20 ο C για επόμενη χρήση. 43

Κάθε θέση επωάζεται με το δείγμα που στα πλαίσια αυτής της εργασίας ήταν τα παραγόμενα μονοκλωνικά αντισώματα σε διαφορετική αραίωση σε κάθε θέση της πλάκας (Kεφάλαιο Αποτελέσματα ). Ο όγκος του διαλύματος του αντισώματος που προστίθεται σε κάθε θέση είναι 50μl. Η επώαση πραγματοποιείται για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το τέλος της επώασης πραγματοποιούνται πλύσεις με 0,05% Tween 20 και έπειτα τρεις πλύσεις με PBS. Αφού η πλάκα στεγνώσει επωάζεται με δεύτερο αντίσωμα το οποίο προσδένει στο πρώτο αντίσωμα και είναι διαλυμένο σε 2% BSA. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα της εργασίας είναι ειδικό για αντισώματα αρουραίου (anti-rat) καθώς το πρώτο αντίσωμα προέρχεται από ανοσοποιημένο αρουραίο. Το anti-rat αντίσωμα που χρησιμοποιείται είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση των αγριοραφανίδων (horseradish peroxidise, HRP), έχει συγκέντρωση 0,05 mol/l και χρησιμοποιείται σε αραίωση 1/2000 σε διάλυμα PBS 2% BSA. Η επώαση με αυτό πραγματοποιείται για μία ώρα στους 37 ο C. Έπειτα ακολουθούν πλύσεις της πλάκας όπως περιγράφηκαν νωρίτερα. Η πλάκα στεγνώνεται και προστίθεται σε κάθε θέση 50μl από το υπόστρωμα του ενζύμου TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) μαζί με H 2 O 2. Τα ΤΜΒ και Η 2 Ο 2 (που περιέχονται στο ELISA kit, Kεφάλαιο Συσκευές και Υλικά ) αραιώνονται τέσσερις φορές το καθένα στο ίδιο διάλυμα PBS 2% BSA. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη σε κάθε θέση 50μl 0,2Ν H 2 SO 4. Στο τέλος πραγματοποιείται ποσοτικοποίηση της έντασης του χρώματος με τη χρήση φασματοφωτομέτρου. Η μέτρηση της οπτικής απορρόφησης έγινε σε φωτόμετρο της Biorad σε μήκος κύματος 450nm. 6.2 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-Page) Αρχή μεθόδου Η μέθοδος αυτή ηλεκτροφόρησης στηρίζεται στο διαχωρισμό πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Η παρουσία θειικού δωδεκυλικού νατρίου (SDS) προκαλεί σε όλες τις πρωτεΐνες αποδιάταξη της τρισδιάστατης δομής τους διασπώντας τους δεσμούς υδρογόνου και εξαλείφοντας τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Το SDS είναι ένα ανιονικό απορρυπαντικό, το μόριο του οποίου αποτελείται από μία αρνητικά φορτισμένη θειική ομάδα (υδροφιλική) και από μια δωδεκαλκυλική ομάδα (υδροφοβική). Οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται όταν η υδρόφοβη ομάδα των μορίων 44

SDS συνδεθεί με τα υδροφοβικά τμήματα των πεπτιδικών αλυσίδων τους. Ο αριθμός των συνδεδεμένων μορίων SDS ανά μόριο πρωτεϊνικής αλυσίδας διαφέρει για κάθε πρωτεΐνη αλλά είναι αρκετά μεγάλος για να τη φορτίσει αρνητικά. Υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου οι πρωτεΐνες λόγω του φορτίου τους θα κινηθούν προς την άνοδο. Η ταχύτητα με την οποία θα κινηθεί καθεμιά τους στο κάθετο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου συγκεκριμένης συγκέντρωσης εξαρτάται κυρίως από το σχήμα τους, το μέγεθός τους και την επίδραση που θα έχει σε αυτά η σύνδεση των μορίων SDS. Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σχηματίζεται με βινυλ-πολυμερισμό του μονομερούς ακρυλαμιδίου που οδηγεί στο σχηματισμό αλυσίδων πολυακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός γίνεται με μια βάση, την ΝΝΝ Ν -τετραμεθυλενοδιαμίνη (TEMED) παρουσία ελεύθερων ριζών οξυγόνου που δημιουργούνται χημικώς με υπερθειικά ιόντα. Πορεία διεξαγωγής Παρασκευή πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου περιλαμβάνει πήκτωμα διαχωρισμού και πήκτωμα συμπύκνωσης. Το πήκτωμα διαχωρισμό περιέχει 0,375Μ Tris-HCl, ph 8,8, 0,1% SDS και 12,5% (w/v) ακρυλαμίδιο. Ο πολυμερισμός του γίνεται με 1% (w/v) APS και 0,1% (v/v) TEMED. Το πήκτωμα συμπύκνωσης περιέχει 0,125Μ Tris-HCl, ph 6,8, 0,1% (w/v) SDS και 4% (w/v) ακρυλαμίδιο. Ο πολυμερισμός του πηκτώματος γίνεται με 1% (w/v) APS και 0,04% (v/v) TEMED. Οι πολυμερισμοί ολοκληρώνονται μετά από ~30 min. Προετοιμασία δειγμάτων πρωτεϊνών Στα διαλύματα των προς ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών προστίθεται διάλυμα που περιέχει SDS και β-μερκαπτοαιθανόλη. Στη συνέχεια τα δείγματα θερμαίνονται στους 95 ο C για 5 λεπτά. Η προσθήκη SDS και ο βρασμός βοηθούν στην αποδιάταξη των πρωτεϊνών καταστρέφοντας ασθενείς δεσμούς. Η β-μερκαπτοαιθανόλη είναι αναγωγικό μέσο και προκαλεί αναγωγή των ομοιοπολικών δισουλφιδικών δεσμών. Ηλεκτροφόρηση Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου τοποθετείται σε ειδική συσκευή. Στα πηγαδάκια του τοποθετούνται τα δείγματα με τις αποδιαταγμένες πρωτεΐνες καθώς και μίγμα πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους το οποίο λειτουργεί ως δείκτης. Για τη 45

διεξαγωγή της ηλεκτροφόρησης απαιτείται επίσης ρυθμιστικό διάλυμα (διάλυμα ηλεκτροφόρησης) PBS που περιέχει 0,1% (w/v) SDS και ιόντα. Η συσκευή με το πήκτωμα και το ρυθμιστικό διάλυμα τροφοδοτείται με ηλεκτρικό ρεύμα 200V για περίπου 40 λεπτά. Χρώση για εντοπισμό των πρωτεϊνών στο πήκτωμα Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα τοποθετείται για χρώση σε διάλυμα χρωματισμού που περιέχει τη χρωστική Coomassie R-250 (Κεφάλαιο Υλικά ) για 30-40 λεπτά στους 37 ο C ή σε όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ήπια ανάδευση. Για τον αποχρωματισμό του πηκτώματος χρησιμοποιείται διάλυμα αποχρωματισμού (Κεφάλαιο Υλικά ). Το διάλυμα αυτό αφήνεται για περίπου 1 ώρα (μέχρι να απομακρυνθεί η περίσσεια της χρωστικής) στους 37 ο C ή όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. 6.3 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) Αρχή μεθόδου Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ικανότητα πρόσδεσης αντισωμάτων σε πρωτεΐνες ακινητοποιημένες σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Με αυτό τον τρόπο δημιουργείται σύμπλοκο αντιγόνου αντισώματος. Ο εντοπισμός αυτού του συμπλόκου πραγματοποιείται με τη χρήση δεύτερου αντισώματος που προσδένει στο πρώτο αντίσωμα και είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο με ένζυμο. Μετά την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος για το ένζυμο πραγματοποιείται αντίδραση που δημιουργεί έγχρωμο προϊόν το οποίο βοηθάει να εντοπιστεί η πρωτεΐνη. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η ανίχνευση ακόμα και ελάχιστων ποσοτήτων πρωτεϊνών. Πορεία διεξαγωγής Μεταφορά πρωτεϊνών από πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Αφού πραγματοποιηθεί ηλεκτροφόρηση SDS- Page το πήκτωμα τοποθετείται σε άμεση επαφή με μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και εκατέρωθεν αυτών τοποθετούνται κομμάτια απορροφητικού χαρτιού Whatman καθώς και ειδικά σφουγγαράκια. Η μεμβράνη και το πήκτωμα (μαζί με τα ειδικά χαρτιά και σφουγγαράκια) τοποθετούνται σε ειδικές πλάκες. Αυτές τοποθετούνται στην ειδική συσκευή που θα τροφοδοτηθεί με ηλεκτρικό ρεύμα για να γίνει η μεταφορά. Στο δοχείο της συσκευής τοποθετείται κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, διάλυμα μεταφοράς, το οποίο θα 46

οδηγήσει στη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα στη μεμβράνη. Στην πλευρά της συσκευής που είναι η κάθοδος πρέπει να βρίσκεται με σειρά: πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και όχι το αντίστροφο. Πάγος που τοποθετείται σε επαφή με τις πλάκες βοηθά στη μείωση της θερμοκρασίας η οποία τείνει να αυξηθεί αρκετά στο εσωτερικό του δοχείου λόγω του ηλεκτρικού ρεύματος. Η μεταφορά πραγματοποιείται με ηλεκτρικό ρεύμα έντασης 300mA για περίπου μία ώρα (για πρωτεΐνες μάζας ~30 kd). Ανίχνευση πρωτεϊνών Αφού ολοκληρωθεί η μεταφορά των πρωτεϊνών στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η τελευταία τοποθετείται σε ρυθμιστικό διάλυμα με 5% (w/v) λυοφιλιωμένο γάλα. Η μεμβράνη παραμένει σε αυτό το διάλυμα για τουλάχιστον 30min σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό το βήμα πραγματοποιείται με σκοπό την πλήρωση των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης ώστε να αποφευχθεί η μετέπειτα πρόσδεση αντισωμάτων σε αυτές. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με το πρώτο αντίσωμα το οποίο έχει αραιωθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα με λυοφιλιωμένο γάλα. Η επώαση αυτού του αντισώματος εξαρτάται από τη δυνατότητα πρόσδεσης αυτού. Μετά το τέλος της επώασης πραγματοποιούνται τρεις πλύσεις με PBS διάρκειας 10 λεπτών η καθεμιά. Ακολουθεί η επώαση με το δεύτερο αντίσωμα που προσδένει στο πρώτο και ταυτόχρονα φέρει το ένζυμο HRP. Η επώαση με αυτό διαρκεί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση και έπειτα γίνονται τρεις πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα PBS για 10 λεπτά η καθεμιά. Τέλος, η μεμβράνη επωάζεται με διάλυμα εμφάνισης το οποίο είναι κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει υπόστρωμα DAB και H 2 O 2. Το DAB (3.3 διαμινοβενζιδίνη αποτελεί το υπόστρωμα για το ένζυμο της HRP. Παρουσία του υπεροξειδίου του υδρογόνου πραγματοποιείται οξείδωση που προσδίδει σκούρο καφέ χρώμα στο ίζημα. Για την αύξηση της ευαισθησίας της αντίδρασης χρησιμοποιούνται ιόντα νικελίου που οδηγούν στη δημιουργία πιο έντονου χρώματος. Με την προσθήκη του διαλύματος εμφάνισης οι ζώνες των πρωτεϊνών παρουσιάζονται μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. 47

6.4 Προσδιορισμός υποκατηγορίας μονοκλωνικών αντισωμάτων Τα μονοκλωνικά που δημιουργήθηκαν με τη βοήθεια της κυτταρικής σύντηξης προέρχονται από διαφορετικούς κλώνους Β λεμφοκυττάρων και συνεπώς είναι δυνατό να ανήκουν σε διαφορετική κλάση (Κεφάλαιο Εισαγωγή ). Για τον προσδιορισμό της κλάσης των μονοκλωνικών αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε ένα kit της Serotec. Η διαδικασία στηρίζεται σε πολυκλωνικά αντισώματα τα οποία είναι συζευγμένα με έγχρωμα μόρια και είναι ειδικά για τα αντισώματα του αρουραίου ανεξάρτητα της κλάσης του αντισώματος. Το προς προσδιορισμό mab αφήνεται να συνδεθεί με τα πολυκλωνικά αυτά αντισώματα και στη συνέχεια στο σύμπλοκο που δημιουργείται εμβαπτίζεται μια χάρτινη λωρίδα στην οποία είναι ακινητοποιημένα ανά περιοχές μονοκλωνικά αντισώματα που συνδέονται ειδικά με συγκεκριμένη υποκατηγορία αντισώματος (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c και ΙgGM) και με κάππα ελαφριές αλυσίδες. Κατά αυτόν τον τρόπο το έγχρωμο σύμπλοκο που περιέχει το άγνωστης κλάσης mab θα συνδεθεί στην περιοχή που υπάρχει το ειδικό για αυτό ακινητοποιημένο μονοκλωνικό και κατά αυτόν τον τρόπο θα εντοπιστεί η υποκατηγορία του. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Απομόνωση μονοκλωνικών αντισωμάτων και πέψη για δημιουργία Fab 7.1 Καλλιέργεια μονοκλωνικών αντισωμάτων σε ειδικού τύπου φλάσκα Πριν περιγραφεί η μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των αντισωμάτων θα πρέπει να αναφερθούν οι συνθήκες καλλιέργειας. Τα υβριδώματα που εκκρίνουν τα μονοκλωνικά mabnr2 (αντι-β2-24-α4), mab73 (αντι-β1) και mab198 (αντι-α1) καλλιεργήθηκαν σε ειδικού τύπου φλάσκα Celline (Κεφάλαιο Υλικά ). Η ειδική αυτή φλάσκα στο εσωτερικό της αποτελείται από δύο θαλάμους. Έναν μεγάλο και έναν μικρό ο οποίος διαχωρίζεται από το μεγάλο με μια ημιπερατή μεμβράνη. Στο μικρό θάλαμο τοποθετείται το επιθυμητό υβρίδωμα με 6ml καλλιεργητικό υλικό DMEM με 1/100 αντιβιοτικό (πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη) και 15% ειδικά επεξεργασμένου ορού εμβρύου βοός (FBS*) από τον οποίο 48

απουσιάζουν τα ΙgG (που κανονικά περιέχονται σε αυτόν). Στο μεγάλο θάλαμο τοποθετούνται περίπου 300ml υλικού DMEM με την ίδια ποσότητα αντιβιοτικού και 3% FBS. Σε κάθε φλάσκα καλλιεργείται για 4-5 μέρες το υβρίδωμα κάθε μονοκλωνικού και στη συνέχεια λαμβάνεται το περιεχόμενο του μικρού θαλάμου της φλάσκας όπου βρίσκονται τα κύτταρα. Το εκκρινόμενο μονοκλωνικό αντίσωμα συγκρατείται λόγω της μεμβράνης στο μικρό θάλαμο και δεν περνά στο μεγάλο. Το περιεχόμενο του μικρού θαλάμου φυγοκεντρείται για 7 λεπτά σε 1000rpm σε θερμοκρασία δωματίου, λαμβάνεται το υπερκείμενο και τοποθετείται στους -20 ο C. Στο υπερκείμενο περιέχεται το επιθυμητό αντίσωμα και αλβουμίνη του ορού αλλά απουσιάζουν τα άλλα IgG του ορού κάτι που διευκολύνει τον μετέπειτα καθαρισμό του εκάστοτε μονοκλωνικού αντισώματος. 7.2 Κατακρήμνιση αντισωμάτων με θειικό αμμώνιο Αρχή μεθόδου Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των πρωτεϊνών να καθιζάνουν όταν αυξάνεται η ιοντική ισχύς του μέσου στο οποίο βρίσκονται με την προσθήκη ορισμένων αλάτων (εξαλάτωση). Η εξαλάτωση οφείλεται σε αφυδάτωση των υδρόφιλων ομάδων της πρωτεΐνης και συνεπώς σε μείωση της διαλυτότητάς της. Για την απομόνωση των αντισωμάτων στη δική μας περίπτωση χρησιμοποιήθηκε για κατακρήμνιση το θειικό αμμώνιο. Τα αντισώματα γνωρίζουμε ότι κατακρημνίζονται όταν βρεθούν σε διάλυμα 33%-40% κορεσμένου θειικού αμμωνίου ενώ η αλβουμίνη κατακρημνίζεται σε διάλυμα 70% κορεσμένου θειικού αμμωνίου. Πορεία διεξαγωγής Σε υπερκείμενο καλλιέργειας (από ειδικού τύπου φλάσκα) που περιέχεται ένα από τα αντισώματα προστίθεται σταδιακά σταγόνα-σταγόνα κορεσμένο διάλυμα θειικού αμμωνίου ώστε το τελικό διάλυμα να περιέχει 45% v/v θειικό αμμώνιο. Στη συνέχεια το διάλυμα αφήνεται στους 4 ο C για μία ώρα. Έπειτα φυγοκεντρείται για 17 λεπτά σε 3000rpm στους 4 ο C. Μετά τη φυγοκέντρηση παρατηρούμε το ίζημα του αντισώματος και απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Επαναδιαλύουμε το ίζημα σε 45% v/v θειικό αμμώνιο και επαναλαμβάνουμε την προηγούμενη φυγοκέντρηση. Απομακρύνουμε ξανά το υπερκείμενο και επαναδιαλύουμε το αντίσωμα σε τόσο όγκο PBS μέχρι το διάλυμα να μην είναι θολό. Με τον τρόπο αυτό έχουμε ένα 49

διάλυμα στο οποίο υπάρχει το επιθυμητό μονοκλωνικό με μικρή μόνο ποσότητα αλβουμίνης. 7.3 Συμπύκνωση και αλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος μονοκλωνικών αντισωμάτων Για τη διέλευση των αντισωμάτων από στήλες χρωματογραφίας καθώς και για την πέψη τους με παπαΐνη (περιγράφεται παρακάτω) χρειάστηκε να συμπυκνωθούν ή να αλλάξουν ρυθμιστικό διάλυμα. Η συμπύκνωση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση φίλτρων συμπύκνωσης με φυγοκέντρηση. Το προς συμπύκνωση διάλυμα τοποθετείται σε αυτά τα φίλτρα και φυγοκεντρείται 3-5 φορές (ανάλογα τον όγκο) για 5-10 λεπτά σε 4000rpm στους 4 ο C. Η αλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος πραγματοποιείται με διαπίδυση με τη χρήση μεμβρανών διαπίδυσης (Κεφάλαιο Συσκευές και Υλικά) μέσα στις οποίες τοποθετείται και κλείνεται το διάλυμα. Έπειτα οι μεμβράνες αυτές τοποθετούνται σε δοχείο με το επιθυμητό ρυθμιστικό διάλυμα και αφήνονται υπό ανάδευση σε αυτό για όλη τη νύχτα στους 4 ο C. 7.4 Πέψη αντισωμάτων με παπαΐνη για τη δημιουργία Fab τμημάτων Αρχή μεθόδου Το πρωτεολυτικό ένζυμο παπαΐνη χρησιμοποιείται για πέψη των αντισωμάτων IgG. Από την πέψη αυτή λαμβάνονται μονομερή τμήματα Fab με μοριακό βάρος περίπου 52000 και τμήματα Fc μοριακού βάρους 50000 (Εικόνα 7). Εικόνα 7. Τμήματα Fab και Fc μετά από πέψη IgG με παπαΐνη Κάθε IgG κόβεται σε τρία τμήματα μετά από δράση του ενζύμου παπαΐνη. Τα τμήματα αυτά είναι δύο Fab το καθένα από τα οποία συνδέεται με το αντιγόνο και ένα Fc. Πορεία διεξαγωγής Για την πέψη αντισώματος χρησιμοποιείται 1% w/v παπαΐνη η οποία προηγουμένως έχει ενεργοποιηθεί. Η ενεργοποίησή της γίνεται για μισή ώρα στους 37 ο C μέσα σε eppendorf που περιέχει L-κυστεΐνη και αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό οξύ (EDTA) 50

διαλυμένα σε 0,1Μ φωσφορικών νατρίου. Η L-κυστεΐνη και το EDTA προστίθενται σε τέτοιους όγκους ώστε στο τελικό διάλυμα μετά την προσθήκη του αντισώματος να έχουν συγκεντρώσεις 0,01Μ και 0,002Μ αντίστοιχα. Η ενεργοποίηση της παπαΐνης γίνεται ώστε να αυτό να έχει την ικανότητα να κόβει πιο ομοιόμορφα και να μην έχουμε πολλές ανεπιθύμητες πρωτεϊνικές αλυσίδες σαν παραπροϊόντα της πέψης. Μετά το τέλος της μισής ώρας προσθέτουμε το διάλυμα των αντισωμάτων το οποίο έχουμε φροντίσει να βρίσκεται σε 0,1Μ φωσφορικών νατρίου ph 7 και να έχει συγκέντρωση 7-10mg αντισώματος ανά ml. Η πέψη πραγματοποιείται στους 37 ο C στο Thermomixer comfort eppendorf με ήπια ανάδευση. Ο χρόνος πέψης εξαρτάται από το εκάστοτε αντίσωμα: 75 λεπτά για το mabnr2, 45 λεπτά για το mab198 και 40 λεπτά για το mab73. Η πέψη τερματίζεται με την προσθήκη 0,2Μ ιωδοακεταμίδιο (ΙΑΑ) διαλυμένο σε 0,1Μ φωσφορικών. Ο τερματισμός πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου για μισή ώρα υπό ανάδευση. 7.5 Διαχωρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία Αρχή μεθόδου Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται βάσει του μοριακού τους βάρους ή του φορτίου τους. Για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών βάσει του μοριακού βάρους τους χρησιμοποιούνται στήλες χρωματογραφίας οι οποίες περιέχουν υλικό με συγκεκριμένη διάμετρο πόρων. Τα πρωτεϊνικά μόρια μεγάλου μοριακού βάρους καθώς δεν περνούν από το εσωτερικό αυτού του υλικού και για το λόγο αυτό εκλούονται πρώτα. Μόρια με μικρότερο μέγεθος διέρχονται μέσα από το υλικό και καθυστερούν να εξέλθουν από αυτό. Ο χρόνος έκλουσης κάθε πρωτεΐνης είναι αντιστρόφως ανάλογος του μεγέθους της και εξαρτάται από το σχήμα της. Στην ανιοντοανταλλακτική χρωματογραφία η στήλη που χρησιμοποιείται περιέχει υλικό το οποίο είναι αρνητικά φορτισμένο. Οι προς διαχωρισμό πρωτεΐνες διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο έχει ph μεγαλύτερο από το ισοηλεκτρικό σημείο τους (PI). Με αυτόν τον τρόπο τα πρωτεϊνικά μόρια φορτίζονται θετικά. Όταν αυτά διέλθουν από την αρνητικά φορτισμένη στήλη δεσμεύονται μέσω ιοντικών δεσμών με το υλικό της. Τα δεσμευμένα στο υλικό της στήλης μόρια αποδεσμεύονται και εκλούονται από αυτό με σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης άλατος. Έτσι επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών. 51

Πορεία διεξαγωγής Για το διαχωρισμό πρωτεϊνών βάσει του μοριακού τους βάρους χρησιμοποιήθηκε στήλη μοριακής διήθησης Superdex 200 (Amersham Biosciences). Με αυτή τη στήλη απομονώθηκαν αντισώματα από διαλύματα που περιείχαν μικρή ποσότητα αλβουμίνης. Η έκλουση των αντισωμάτων σε αυτή τη στήλη έγινε με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος PBS ph 7,5 και τα κλάσματα που συλλέγονταν ήταν όγκου 1ml. Το προς ανάλυση διάλυμα πρωτεϊνών που προστίθεται στη στήλη έχει μέγιστο όγκο 5ml. Η ροή του ρυθμιστικού διαλύματος και της πρωτεΐνης μέσω της στήλης ελέγχονταν από ειδική συσκευή. Η μέτρηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης ήταν στα 280nm και πραγματοποιούνταν αμέσως μετά την έξοδο των μορίων από τη στήλη. Η ανιοντοανταλλακτική χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση στήλης Q- Sepharose η οποία πληρώθηκε με υλικό της εταιρείας Amersham Biosciences στο εργαστήριο. Μέσω αυτής της στήλης διαχωρίστηκαν τα τμήματα Fab και Fc του κάθε αντισώματος μετά από πέψη με παπαΐνη. Το διάλυμα έκλουσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν 25mM Tris, ph 8,8 και 25mM Tris, 1M NaCl ph 8,8. Το ρυθμιστικό διάλυμα με το NaCl χρησιμοποιήθηκε σε αραιώσεις από 0,001M ως 1Μ. Ο όγκος του προς ανάλυση διαλύματος που προστέθηκε στη στήλη ήταν 1-2ml και τα κλάσματα από την έκλουση σε αυτή τη στήλη ήταν όγκου 1ml. 7.6 Ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης (Isoelectric focusing, IEF) Αρχή μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση αυτή διαχωρίζει τις πρωτεΐνες βάσει του ηλεκτρικού τους φορτίου. Στηρίζεται στο γεγονός ότι το φορτίο μιας πρωτεΐνης αλλάζει ανάλογα με το ph του περιβάλλοντος. Οι πρωτεΐνες τοποθετούνται σε πήκτωμα στο οποίο υπάρχει σταθερή διαβάθμιση ph και κινούνται βάσει του φορτίου τους είτε προς την άνοδο είτε προς την κάθοδο. Η άνοδος έχει ph χαμηλότερο από της καθόδου και το εύρος του ph έχει επιλεχθεί έτσι ώστε οι πρωτεΐνες που πρόκειται να διαχωριστούν να έχουν το ισοηλεκτρικό τους σημείο εντός αυτού του εύρους. Για παράδειγμα, μια πρωτεΐνη που βρίσκεται σε ph μικρότερο του ισοηλεκτρικού της σημείου θα φορτιστεί θετικά και θα μετακινηθεί προς την κάθοδο. Κατά τη μετακίνησή της αυτή το ph ελαττώνεται ώσπου η πρωτεΐνη φτάσει σε ένα ph που αντιστοιχεί στο ισοηλεκτρικό της σημείο. Η πρωτεΐνη ακινητοποιείται στο σημείο του πηκτώματος όπου βρέθηκε 52

σε ph ίσο με το ισοηλεκτρικό της σημείο καθώς πλέον δεν έχει φορτίο. Καθώς κάθε πρωτεΐνη διαθέτει διαφορετικό ισοηλεκτρικό σημείο περιορίζεται σε διαφορετικό σημείο στο πήκτωμα και έτσι ξεχωρίζει από τις υπόλοιπες όταν πραγματοποιηθεί χρώση για τον εντοπισμό τους στο πήκτωμα. Η τεχνική αυτή επιτρέπει να διαχωρίζονται σε ένα δείγμα οι πρωτεΐνες που διαθέτουν διαφορετικό ισοηλεκτρικό σημείο. Πορεία διεξαγωγής Προετοιμασία πηκτώματος αγαρόζης Σε ειδικό φύλλο πλαστικού (gelbond) που έχει κοπεί στις επιθυμητές διαστάσεις απλώνεται διάλυμα αγαρόζης 1% w/v (που είχε προηγουμένως θερμανθεί) και 6% v/v αμφολύτες. Το πλαστικό φύλλο πάνω στο οποίο θα δημιουργηθεί το πήκτωμα είναι τοποθετημένο σε ειδική γυάλινη επιφάνεια. Μετά την τοποθέτηση του διαλύματος αγαρόζης αμφολυτών στο πλαστικό φύλλο αφήνεται να στερεοποιηθεί για περίπου μία ώρα στους 4 ο C. Ηλεκτροφόρηση Το πήκτωμα αγαρόζης τοποθετείται οριζόντια πάνω στην πλάκα της ειδικής συσκευής για την ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης. Η συσκευή αυτή διαθέτει σύστημα ψύξης με τη βοήθεια ρέοντος νερού. Στην μία πλευρά του πηκτώματος τοποθετείται λεπτή λωρίδα ειδικού χαρτιού εμβαπτισμένη σε 0,05Μ H 2 SO 4 και στην άλλη λωρίδα χαρτιού εμβαπτισμένη σε 1Ν ΝαΟΗ. Τα διαλύματα των πρωτεϊνών (ποσότητα πρωτεΐνης ανά δείγμα: 20μg) τοποθετούνται σε ειδικά χαρτάκια επιφάνειας 1cm 2. Στη συνέχεια τα χαρτάκια αυτά τοποθετούνται στη μέση περίπου του πηκτώματος. Έπειτα η συσκευή ηλεκτροφόρησης κλείνει ώστε κατά τη διάρκεια τροφοδοσίας με ρεύμα το πήκτωμα με τα δείγματα να μην έρχεται σε επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα. Αφού συνδεθούν τα ηλεκτρόδια με το τροφοδοτικό εφαρμόζεται τάση ως εξής: 150V για 1h, 30min 200V, 30min 300V, 30min 400V, 30min 500V. Η ισχύς που χρησιμοποιείται είναι 15W. Μονιμοποίηση και χρώση του πηκτώματος Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα πλένεται με νερό και στη συνέχεια τοποθετείται σε διάλυμα TCA (Trichloroacetic acid) 20% για μία ώρα. Έπειτα αφήνεται όλη τη νύχτα να πλένεται με νερό. 53

Την επόμενη μέρα πραγματοποιείται χρώση του πηκτώματος με χρήση Coomasie Brilliant Blue για μία ώρα στους 37 ο C. Ακολουθεί αποχρωματισμός του πηκτώματος με χρήση διαλύματος αποχρωματισμού. 7.7 Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με φασματοφωτομέτρηση Μέθοδος Bradford Πρόκειται για μια χρωματομετρική μέθοδο προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε κάποιο διάλυμα. Στηρίζεται στη χρήση αντιδραστηρίου Biorad protein assay το οποίο εκμεταλλεύεται την πρόσδεση της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250 στις πρωτεΐνες (Αρχή Bradford). Η χρωστική προσδένεται στα κατάλοιπα λυσίνης της εκάστοτε πρωτεΐνης και αυτό οδηγεί σε μια σταθερή μη πρωτονιωμένη μορφή μπλε χρώματος. Η ένταση του χρώματος εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυμα. Για την ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης στο διάλυμα χρησιμοποιείται πρότυπη καμπύλη που έχει κατασκευαστεί με βάση αντίσωμα γνωστής συγκέντρωσης (Bio-rad Protein Assay, bovine gamma globulin). Οι συγκεντρώσεις πρότυπου διαλύματος της ανοσοσφαιρίνης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2, 1,4 μg/μl. Για την μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των συγκεντρώσεων αυτών χρησιμοποιήθηκαν 20μl καθεμιάς διαλυμένες σε 1ml διαλύματος Biorad protein assay αραιωμένο πέντε φορές με ddη2ο. H οπτική απορρόφηση (OD) του κάθε διαλύματος μετράται με τοποθέτησή του σε ειδική κυβέτα (Kεφάλαιο Συσκευές και Υλικά ) σε φασματοφωτόμετρο Biorad Smart Spec Plus σε μήκος κύματος 595nm. Κατασκευάζεται έτσι πρότυπη καμπύλη αναφοράς με εξίσωση y = 0,672x (όπου y: ΟD και x: συγκέντρωση σε μg/μl). Η εξίσωση αυτή έχει συντελεστή προσαρμοστικότητας R 2 = 0,9989. Ο συντελεστής αυτός είναι ενδεικτικός για την ποιότητα της ευθείας που έχει δημιουργηθεί. Στην εικόνα φαίνεται η γραφική παράσταση από την οποία προκύπτει η παραπάνω εξίσωση. 54

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Παραγωγή και χαρακτηρισμός μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του ECD συγκαταμερούς β2-α4 8.1 Αποτελέσματα ανοσοποίησης ποντικών και αρουραίων Την ανοσοποίηση των πειραματοζώων ακολούθησε ο έλεγχος του τίτλου των αντισωμάτων έναντι του β2-α4 που καθένα από αυτά είχε δημιουργήσει. Ο έλεγχος πρόσδεσης των αντισωμάτων του ορού κάθε ζώου έγινε με τη μέθοδο του ραδιοανοσοπροσδιορισμού με τη χρήση β2-α4 στο οποίο είχε προσδεθεί ραδιενεργά σημασμένη επιβατιδίνη (β2-α4*). Η ανοσοποίηση των πειραματόζωων και η μέθοδος του ραδιο-ανοσοπροσδιορισμού πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. Τα αποτελέσματα των ελέγχων φαίνονται στις εικόνες 8-9. 1000 800 CPM 600 400 200 0 M1 M2 M3 M4 αρντηικός μάρτυρας ποντίκια Εικόνα 8. RIA για έλεγχο τίτλου αντισωμάτων έναντι του β2-α4* στον ορό ποντικιών. Στον οριζόντιο άξονα αναγράφεται η προέλευση του ορού που εξετάζεται. Με Μ1- Μ4 συμβολίζεται ο ορός που λήφθηκε από τα τέσσερα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν και ως αρνητικός μάρτυρας είναι ο ορός ενός μη ανοσοποιημένου ποντικιού. Στον κάθετο άξονα αναγράφονται οι κρούσεις cpm που μετρήθηκαν στο μετρητή γ ακτινοβολίας για καθέναν από τους ορούς. Παρατηρείται ότι οι οροί των ποντικών παρουσιάζουν τιμές κρούσεων μεγαλύτερες από τον αρνητικό μάρτυρα, που σημαίνει ότι όλα τα ποντίκια έχουν αντισώματα έναντι του β2-α4. 55

CPM 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 R1 R2 R3 R4 αρνητικός μάρτυρας αρουραίοι Εικόνα 9. RIA για έλεγχο τίτλου αντισωμάτων έναντι του β2-α4* στον ορό αρουραίων. Στον οριζόντιο άξονα αναγράφεται η προέλευση του ορού που εξετάζεται. Με R1- R4 συμβολίζεται ο ορός που λήφθηκε από τους τέσσερις αρουραίους που ανοσοποιήθηκαν και ως αρνητικός μάρτυρας είναι ο ορός ενός μη ανοσοποιημένου αρουραίου.. Στον κάθετο άξονα αναγράφονται οι κρούσεις cpm που μετρήθηκαν στο μετρητή γ ακτινοβολίας για καθέναν από τους ορούς. Οι τιμές των κρούσεων των ορών των αρουραίων ξεπερνούν εκείνη του αρνητικού μάρτυρα υποδηλώνοντας ότι όλοι οι αρουραίοι περιέχουν στον ορό τους αντισώματα που προσδένουν στο β2-α4. Τη μεγαλύτερη τιμή κρούσεων και κατά συνέπεια το μεγαλύτερο τίτλο αντισωμάτων φαίνεται να έχει ο αρουραίος 3. Για τη μέθοδο της κυτταρικής σύντηξης (fusion) για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του β2-α4 επιλέχθηκαν στην αρχή τα ποντίκια Μ1 και Μ2. Η πρώτη κυτταρική σύντηξη μυελωματικών κυττάρων με κύτταρα σπλήνα του ποντικιού Μ1 δεν έδωσε αποικίες. Ακολούθησε η ίδια προσπάθεια με το ποντίκι Μ2 η οποία παρουσίασε μόλυνση και για αυτό απέτυχε. Επιτυχής κυτταρική σύντηξη επιτεύχθηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ο σπλήνας του αρουραίου R3. 8.2 Διαδικασία παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη βοήθεια υβριδωμάτων Η διαδικασία παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη βοήθεια υβριδωμάτων έχει περιγραφεί στο Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. Μετά από την ολοκλήρωση της διαδικασίας αυτής το διάλυμα με τα συντηγμένα και μη κύτταρα μοιράστηκε σε θέσεις καλλιεργητικών πλακών και αφέθηκε για επώαση μέχρι να παρατηρηθεί η εμφάνιση κλώνων. 56

8.3 Έλεγχος των κλώνων για έκκριση αντισωμάτων έναντι του β2-α4 Μετά από συλλογή υπερκείμενου από κάθε πηγαδάκι που περιείχε κλώνο, έγινε έλεγχος για έκκριση των επιθυμητών αντισωμάτων με τη μέθοδο ELISA. Από αυτούς τους ελέγχους βρέθηκαν 45 θέσεις που περιείχαν κλώνους να εκκρίνουν αντισώματα έναντι του β2-α4. 14 από τις 45 αυτές θέσεις παρουσίασαν πιο υψηλή οπτική απορρόφηση στο πείραμα, δηλαδή μεγαλύτερο τίτλο αντισωμάτων. Έξι από τις 14 θέσεις με κλώνους χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων. 8.4 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων, δηλαδή, αντισωμάτων που εκκρίνονται από έναν κλώνο που προέρχεται από διαδοχικές διαιρέσεις ενός και μόνο κυττάρου χρησιμοποιήθηκαν μεγάλες αραιώσεις των διαλυμάτων καθενός από τις 6 θέσεις. Υπολογίστηκαν τέτοιες αραιώσεις ώστε από μία αρχική θέση με άγνωστο αριθμό κλώνων να καταφέρουμε να έχουμε ένα κύτταρο ανά θέση. Για να επιτύχουμε αυτό έγιναν διαδοχικές αραιώσεις. Η μεγαλύτερη αραίωση υπολογίστηκε να περιέχει κατά μέσο όρο 0,3 κύτταρο ανά θέση. Με αυτόν τον τρόπο κατορθώσαμε να απομονώσουμε σε νέες θέσεις ξεχωριστούς κλώνους. 8.5 Χαρακτηριστικά των παραγόμενων μονοκλωνικών αντισωμάτων Με τους τρόπους που περιγράφηκαν παραπάνω πραγματοποιήθηκε η παραγωγή 6 μονοκλωνικών αντισωμάτων με διαφορετικά χαρακτηριστικά το καθένα. Τα αντισώματα αυτά ονομάστηκαν mabnr1 mabnr6. Αρχικά πραγματοποιήθηκε έλεγχος πρόσδεσης αυτών στην β2α4. Με τη χρήση υπερκειμένου από τις καλλιεργητικές πλάκες καθώς και της μεθόδου ELISA λήφθηκαν τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην εικόνα 10. 57

OD450nm 0,9 1 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 mab NR1 mab NR2 mab NR3 mab NR4 mab NR5 mabs mab NR6 θετικός μάρτυρας αρνητικός μάρτυρας Εικόνα 10. ELISA για έλεγχο πρόσδεσης mabs στο β2-α4 Παρουσιάζεται η πρόσδεση καθενός από τα έξι μονοκλωνικά αντισώματα mabnr1- mabnr6 στο β2-α4. Στον οριζόντιο άξονα παρουσιάζονται τα μονοκλωνικά αντισώματα mabnr1- mabnr6 καθώς και ένας θετικός και ένας αρνητικός μάρτυρας. Ο θετικός μάρτυρας αντιστοιχεί στον ορό του αρουραίου R3 και ο αρνητικός σε ορό μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Στον κάθετο άξονα φαίνεται η τιμή της οπτικής απορρόφησης στα 450nm (OD450nm).Οι τιμές της οπτικής απορρόφησης δείχνουν ότι όλα τα μονοκλωνικά έχουν ικανότητα πρόσδεσης στο β2-α4. Με ένα ειδικό kit της Serotec (Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία ) αναγνωρίστηκαν οι υποτάξεις των μονοκλωνικών αντισωμάτων. Αυτές αναγράφονται στον πίνακα 8. Φαίνεται ότι τα τρία από τα μονοκλωνικά (mabnr1, mabnr2, mabnr4) είναι κλάσης IgG1, δύο (mabnr3, mabnr5) είναι IgG2a και ένα (mabnr6) είναι IgG2b. mab NR1 mab NR2 mab NR3 mab NR4 mab NR5 mab NR6 Βαριά αλυσίδα γ1 γ1 γ2α Γ1 γ2α γ2β Ελαφριά αλυσίδα κ κ κ κ κ κ Κλάση IgG1 IgG1 IgG2a IgG1 IgG2a IgG2b Πίνακας 8. Προσδιορισμός υπόταξης και αλυσίδων μονοκλωνικών αντισωμάτων Κάθε στήλη του πίνακα αντιστοιχεί σε ένα από τα mabnr1-mabnr6. Η πρώτη σειρά παρουσιάζει υπόταξη του αντισώματος, η δεύτερη την κατηγορία της βαριάς αλυσίδας κάθε αντισώματος και η τρίτη την κατηγορία της ελαφριάς αλυσίδας. Τα αντισώματα mabnr1, mabnr2, mabnr4 είναι κλάσης IgG1, ενώ τα mabnr3 και mabnr5 είναι IgG2a. Τέλος το αντίσωμα mabnr6 είναι κλάσης IgG2b. 58

Στη συνέχεια χαρακτηρίστηκαν οι ιδιότητες πρόσδεσης στο β2-α4 καθενός από τα έξι μονοκλωνικά. Συγκεκριμένα, ελέχθηκε η πρόσδεσή καθενός από τα μονοκλωνικά στο β2-α4 και το α4-β2. Το τελευταίο είναι συγκαταμερές που έχει επίσης φτιαχτεί στο εργαστήριο και έχει άλλον προσανατολισμό, αλλά δε συγκεντρώνει τις καλές ιδιότητες πρόσδεσης μορίων προσδετών και υδροφιλικότητας που έχει το πρώτο συγκαταμερές (Κεφάλαιο Εισαγωγή ). Επίσης, ελέχθηκε η πρόσδεση στην α4 υπομονάδα και β2 υπομονάδα ξεχωριστά για να διαπιστώσουμε σε ποια από τις δύο προσδένει. Η μυϊκή υπομονάδα β1-his καθώς και το συγκαταμερές α1-γ-myc- His και η νευρική υπομονάδα α7-myc-his χρησιμοποιήθηκαν για να διαπιστωθεί αν τα αντισώματα προσδένουν στο myc-his tag ή στο συνδέτη (για αυτό χρησιμοποιήθηκε το συγκαταμερές α-γ) ή αν εμφανίζουν κάποια διασταυρούμενη αλληλεπίδραση (cross-reaction) με κάποια από αυτές τις υπομονάδες. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε και β2-α4 σε απογλυκοζυλιωμένη μορφή (β2-α4d) με σκοπό να αποκλείσουμε ότι το εκάστοτε αντίσωμα προσδένεται στους ολιγοσακχαρίτες του μορίου. Οι έλεγχοι αυτοί πραγματοποιήθηκαν με τις μεθόδους ELISA και Western blotting όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. 8.5.1 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr1 OD450 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 β2-24- α4-myc- His α4-β2- myc-his α4-mycflag β2-myc- His ECDs β1-his α1-γmyc-his α7-myc- His Εικόνα 11. ELISA για ιδιότητες πρόσδεσης του mabnr1 Οι μπάρες με το σκούρο χρώμα αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος είναι ορός μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Οι ανοιχτόχρωμες μπάρες αντιστοιχούν σε σύμπλοκα του αντισώματος mabnr1 με την καθεμιά από τις πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his και α7-myc-his. Οι τιμές της οπτικής απορρόφησης δείχνουν ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει σε μεγάλο βαθμό στην α4-myc-flag και παρουσιάζει διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με την α7 υπομονάδα του AChR νευρικού τύπου. 59

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 67 kd 37kD β2-α4, α4-β2, α4, β2, α1-γ, β1, α7, β2-α4, β2-α4d ECDs Εικόνα 12. Western blotting για ιδιότητες πρόσδεσης mabnr1 Western blotting όπου βρίσκονται ακινητοποιημένα τα ECD β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his, β1, α7-myc-his και β2- α4d (απογλυκοζυλιωμένη β2-α4). Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το mabnr1 και όπου φαίνεται ζώνη με μαύρο χρώμα σημαίνει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. Στη θέση 1 φαίνονται μια σειρά από έγχρωμες ζώνες οι οποίες αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες γνωστού μοριακού βάρους οι οποίες χρησιμεύουν σαν δείκτης για να εντοπίσουμε τις γνωστού μοριακού βάρους πρωτεΐνες β2-α4 (67kDa) και α4 (37kDa). Οι ζώνες που παρουσιάζονται στις θέσεις 2, 3 και 4 δείχνουν ότι το mabnr1 που έχει προηγουμένως αποδειχτεί ότι προσδένει στο β2-α4 είναι ικανό να συνδέεται κυρίως με την α4 υπομονάδα. Η ζώνη στη θέση 10 αποδεικνύει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένεται εξίσου στη γλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4. Τα αποτελέσματα της ELISA δείχνουν ότι τo mabnr1 προσδένεται σε μεγάλο βαθμό στην α4 υπομονάδα και πολύ λίγο στη β2. Όσον αφορά διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις το αντίσωμα αυτό δείχνει να προσδένεται στην α7 στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας του nachr νευρικού τύπου και ελάχιστα στο συγκαταμερές α1-γ. Στο Western blotting το αντίσωμα προσδένεται στην α4 και καθόλου στην β2 υπομονάδα. Η πρόσδεση στην απογλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4 αποκαλύπτει ότι το συγκεκριμένο αντίσωμα δεν είναι ειδικό για την γλυκοζυλίωση που φέρει το β2- α4. Δε φαίνεται να προσδένει σε καμία άλλη πρωτεΐνη. Συμπεραίνουμε, λοιπόν, ότι το mabnr1 ειδικό για την υπομονάδα α4 και παρουσιάζει σε μικρό βαθμό διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με την α7. 60

8.5.2 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr2 OD450 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 β2-24-α4- myc-his α4-β2- myc-his α4-mycflag β2-myc- His β1-his α1-γ-myc- His α7-myc- His ECDs Εικόνα 13. ELISA για ιδιότητες πρόσδεσης του mabnr2 Οι μπάρες με το σκούρο χρώμα αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος είναι ορός μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Οι ανοιχτόχρωμες μπάρες αντιστοιχούν σε σύμπλοκα του αντισώματος mabnr2 με την κάθε πρωτεΐνη, β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his και α7-myc-his. Οι τιμές της οπτικής απορρόφησης δείχνουν ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει σε μεγάλο βαθμό στη β2-myc-his και λιγότερο στην α4-myc-flag. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 67 kd 35kD β2-α4, α4-β2, α4, β2, α1-γ, β1, α7 β2-α4 β2-α4d ECDs Εικόνα 14. Western blotting για ιδιότητες πρόσδεσης mabnr2 Western blotting με ακινητοποιημένα τα ECDs β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his, β1, α7-myc-his και β2-α4d (απογλυκοζυλιωμένη β2-α4). Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το mabnr2 και οι μαύρες ζώνες δείχνουν σε ποιο από τα ECDs προσδένει το αντίσωμα. Η ζώνη που εμφανίζεται στη θέση 5 δείχνει ότι το mabnr,2 που έχει προηγουμένως αποδειχτεί ότι προσδένει στο β2-α4, είναι ικανό να συνδέεται κυρίως με την β2 υπομονάδα. Η ζώνη στη θέση 10 αποδεικνύει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει εξίσου στη γλυκοζυλιωμένη μορφή β2-α4. 61

Το mabnr2 προσδένει ισχυρά στη β2 υπομονάδα, όπως φαίνεται στην ELISA και το Western blotting. Στην ELISA φαίνεται να παρουσιάζει μικρή πρόσδεση και στην α4 υπομονάδα. Όσον αφορά τις διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις δεν δείχνει να προσδένει σε καμία από τις άλλες υπομονάδες. Παρουσιάζεται να προσδένει στην απογλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4 που σημαίνει ότι πρόκειται για αντίσωμα που δεν εμφανίζει ειδικότητα στη γλυκοζυλιωμένη θέση του β2-α4. Επομένως, το mabnr2 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα με υψηλή ειδικότητα για την β2 υπομονάδα του β2-α4. 8.5.3 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr3 OD450 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 β2-24- α4-myc- His α4-β2- myc-his α4-mycflag β2-myc- His ECDs β1-his α1-γmyc-his α7-myc- His Εικόνα 15. ELISA για ιδιότητες πρόσδεσης του mabnr3 Οι μπάρες με το σκούρο χρώμα αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος είναι ορός μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Οι ανοιχτόχρωμες μπάρες αντιστοιχούν σε σύμπλοκα του αντισώματος mabnr3 με την καθεμιά από τις πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his και α7-myc-his. Οι τιμές της οπτικής απορρόφησης δείχνουν ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει σε μεγάλο βαθμό στην α4-myc-flag και παρουσιάζει διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με την α7 υπομονάδα του AChR νευρικού τύπου καθώς και με τη β1-his. 62

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 67 kd 37kD β2-α4, α4-β2, α4, β2, α1-γ, β1, α7, β2-α4, β2-α4d ECDs Εικόνα 16. Western blotting για ιδιότητες πρόσδεσης mabnr3 Western blotting με ακινητοποιημένα τα ECDs β2-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4- myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his, β1, α7-myc-his και β2-α4d (απογλυκοζυλιωμένη β2-α4). Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το mabnr3 και όπου φαίνεται ζώνη με μαύρο χρώμα σημαίνει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η ζώνη που εμφανίζεται στη θέση 4 δείχνει ότι το mabnr,3 που έχει προηγουμένως αποδειχτεί ότι προσδένει στο β2-α4, είναι ικανό να συνδέεται κυρίως με την α4 υπομονάδα. Η ζώνη στη θέση 10 αποδεικνύει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει εξίσου στη γλυκοζυλιωμένη μορφή β2-α4. Η ELISA για το mabnr3 δείχνει ότι προσδένει σε μεγάλο βαθμό στην α4 υπομονάδα και πολύ μικρό στην β2. Επίσης, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι παρουσιάζει σε μικρό βαθμό διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις με τη β1 και την α7. Στο Western blotting το αντίσωμα παρουσιάζει μεγάλη ειδικότητα προς την α4 και τη γλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4. Αυτή η εικόνα δείχνει ότι το mabnr3 είναι αντια4 και δεν προσδένει στη θέση γλυκοζυλίωσης που φέρει το β2-α4. 63

8.5.4 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr4 0,6 0,5 0,4 OD450 0,3 0,2 0,1 0 β2-24- α4-myc- His α4-β2- myc-his α4-mycflag β2-myc- His ECDs β1-his α1-γmyc-his α7-myc- His Εικόνα 17. ELISA για ιδιότητες πρόσδεσης του mabnr4 Οι μπάρες με το σκούρο χρώμα αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος είναι ορός μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Οι ανοιχτόχρωμες μπάρες αντιστοιχούν σε σύμπλοκα του αντισώματος mabnr4 με την καθεμιά από τις πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his και α7-myc-his. Οι τιμές της οπτικής απορρόφησης δείχνουν ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει σε μεγάλο βαθμό στη β2-myc-his και σε μικρότερο στην a4-myc-flag. Επίσης, παρουσιάζει διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις με την α7 υπομονάδα καθώς και με το συγκαταμερές α1-γ-myc-his. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 67 kd 35kD β2-α4, α4-β2, α4, β2, α1-γ, β1, α7, β2-α4, β2-α4d ECDs Εικόνα 18. Western blotting για ιδιότητες πρόσδεσης mabn4 Western blotting με ακινητοποιημένες τις. β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4- myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his, β1, α7-myc-his και β2-α4d (απογλυκοζυλιωμένη β2-α4). Η ζώνη που εμφανίζεται στη θέση 5 δείχνει ότι το mabnr,4 είναι ικανό να συνδέεται κυρίως με την β2 υπομονάδα. Η ζώνη στη θέση 10 αποδεικνύει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει εξίσου στη γλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4. 64

Το mabnr4 προσδένεται στη β2 υπομονάδα του συγκαταμερούς και παρουσιάζει σε μεγάλο βαθμό διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με την α7. Αυτό φαίνεται τόσο στην ELISA όσο και στο Western blotting. Επίσης, στην ELISA το αντίσωμα δείχνει να προσδένει με μικρή ειδικότητα στο συγκαταμερές α1-γ. Επίσης, στο Western blotting δείχνει να προσδένει στην απογλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4 (β2-α4d). Πρόκειται, επομένως, για αντι-β2 αντίσωμα που παρουσιάζει διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με την υπομονάδα α7. 8.5.5 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr5 1,2 1 0,8 OD450 0,6 0,4 0,2 0 β2-24- α4-myc- His α4-β2- myc-his α4-mycflag β2-myc- His β1-his α1-γmyc-his α7-myc- His Εικόνα 19. ELISA για ιδιότητες πρόσδεσης του mabnr5 Οι μπάρες με το σκούρο χρώμα αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος είναι ορός μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Οι ανοιχτόχρωμες μπάρες αντιστοιχούν σε σύμπλοκα του αντισώματος mabnr5 με την καθεμιά από τις πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his και α7-myc-his. Οι τιμές της οπτικής απορρόφησης δείχνουν ότι το αντίσωμα αυτό έχει την ικανότητα να προσδένεται κυρίως στην α4-myc-flag υπομονάδα και σε μικρότερο βαθμό στη β2-myc-his. Διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις παρουσιάζονται με όλες τις δοκιμαζόμενες πρωτεΐνες και κυρίως με τη β1. Το mabnr5 προσδένει κυρίως στην α4 αλλά παρουσιάζει μικρή πρόσδεση και στη β2. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ELISA παρουσιάζει σε μεγάλο βαθμό διασταυρουμενες αλληλεπιδράσεις με την υπομονάδα β1 και την α7. Προσδένει, επίσης, με λιγότερη ειδικότητα με την α1-γ. 65

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 67 kd 37kD β2-α4, α4-β2, α4, β2, α1-γ, β1, α7, β2-α4, β2-α4d ECDs Εικόνα 20. Western blotting για ιδιότητες πρόσδεσης mabn5 Western blotting με ακινητοποιημένες τις πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2- myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his, β1, α7-myc-his και β2-α4d (απογλυκοζυλιωμένη β2-α4). Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το mabnr5 και όπου φαίνεται ζώνη με μαύρο χρώμα σημαίνει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η ζώνη που εμφανίζεται στη θέση 4 δείχνει ότι το mabnr5 είναι ικανό να συνδέεται κυρίως με την α4 υπομονάδα. Η ζώνη στη θέση 10 αποδεικνύει ότι το αντίσωμα αυτό προσδένει εξίσου στη γλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4. Στο Western blotting φαίνεται να προσδένει στην α4 αλλά σε καμία άλλη υπομονάδα. Η πρόσδεση του αντισώματος στην απογλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-24-α4 δείχνει ότι το mabnr5 δεν προσδένει στη γλυκοζυλιωμένη θέση του β2-24-α4. Συμπεραίνεται ότι αυτό το μονοκλωνικό αντίσωμα είναι αντι-α4 και παρουσιάζει διασταυρούμες αλληλεπιδράσεις με β1-his, α7-his και α1-γ-his. Είναι πιθανό να προσδένει ασθενώς και στο His tag (δηλαδή στις έξι ιστιδίνες). 66

8.5.6 Ιδιότητες πρόσδεσης mabnr6 OD450 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 β2-24- α4-myc- His α4-β2- α4-mycflag β2-mycmyc-his His β1-his α1-γmyc-his α7-myc- His Εικόνα 21. ELISA για ιδιότητες πρόσδεσης του mabnr6 Οι μπάρες με το σκούρο χρώμα αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα ο οποίος είναι ορός μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Οι ανοιχτόχρωμες μπάρες αντιστοιχούν σε σύμπλοκα του αντισώματος mabnr5 με την καθεμιά από τις πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his και α7-myc-his. Το mabnr6 φαίνεται να προσδένει με τον ίδιο βαθμό στις α4 και β2 υπομονάδες καθώς και στην α7 (διασταυρόυμενη αλληλεπίδραση). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 70kD 35kD β2-α4 α4-β2 α4 β2 α1-γ β1 α7 β2-α4 β2-α4d ECDs Εικόνα 22. Western blotting για ιδιότητες πρόσδεσης mabn6 Western blotting με ακινητοποιημένες τις πρωτεΐνες πρωτεΐνες β2-24-α4-myc-his, α4-β2-myc-his, α4-myc-flag, β2-myc-his, a1-γ-myc-his, β1, α7-myc-his και β2- α4d (απογλυκοζυλιωμένη μορφή του β2-α4). Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το mabnr6 στα δεξιά φαίνονται τα μεγέθη των πρωτεϊνών σε kd. Η απουσία σκουρόχρωμων ζωνών σημαίνει ότι το αντίσωμα αυτό δεν δείχνει ικανό να προσδένει σε καμιά από τις ακινητοποιημένες πρωτεΐνες. 67

Βάσει των αποτελεσμάτων της ELISA το mabnr6 δείχνει να προσδένεται και στις δύο υπομονάδες α4, β2. Επίσης, παρουσιάζει διασταυρούμενη αλληλεπίδραση με την α7 υπομονάδα. Σε αντίθεση με όλα τα υπόλοιπα αντισώματα αυτό δεν έδειξε να προσδένει στις πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν για Western blotting. Τα αποτελέσματα για αυτό το μονοκλωνικό δείχνουν ότι ίσως πρόκειται για αντίσωμα το οποίο προσδένει στην κανονική μορφή του β2-α4 και όχι στην αποδιαταγμένη πρωτεΐνη (του Western blotting). Επίσης, θα μπορούσε το αντίσωμα αυτό να προσδένει στη διεπιφάνεια μεταξύ β2 και α4 και συνεπώς να είναι ανίκανο να προσδεθεί στο β2-α4 στην κατάσταση στην οποία βρίσκεται στην ανοσοαποτύπωση (εικόνα 22). 8.5.7 Ανασκόπηση ιδιοτήτων πρόσδεσης mabs mab NR mab NR mab NR mab NR mab NR mab NR 1 2 3 ELISA/Western blotting β2-α4-myc-his +++/+++ +++/+++ +++/+++ +++/+++ +++/+++ +++/- α4-β2-myc-his +++/+++ +++/+++ +++/+++ +++/+++ +++/+++ +++/- α4-myc-flag +++/+++ +/- +++/+++ +/- +++/+++ +/- β2-myc-his +/- +++/+++ +/- +++/+++ ++/- +/- α1-γ-myc-his +++/- -/- -/- +++/- -/- +/- β1-his +/- -/- -/- -/- ++/- +/- α7-myc-his ++/- -/- +/- ++/+++ ++/- ++/- Πίνακας 9. Σύνοψη ιδιοτήτων πρόσδεσης μονοκλωνικών αντισωμάτων. Φαίνεται ότι όλα τα mabs προσδένουν στο β2-α4-myc-his και στο α4-β2-myc-his και με τις δύο τεχνικές (ELISA και Western blotting) με εξαίρεση το mabnr6 που δεν προσδένει στις πρωτεΐνες αυτές με Western blotting. Συνοψίζοντας διαπιστώνουμε ότι τα mabnr1, mabnr3 και mabnr5 προσδένονται ισχυρότερα στην α4 υπομονάδα (αντι-α4 αντισώματα) ενώ τα mabnr2 και mabnr4 προσδένονται ισχυρότερα στη β2 υπομονάδα (αντι-β2 αντισώματα). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι όλα τα αντισώματα προσδένουν το ίδιο καλά στο β2- α4 και το α4-β2. Εξαίρεση αποτελεί το mabnr6 το οποίο αν και δείχνει να προσδένει στις πρωτεΐνες αυτές στην ELISA δεν προσδένει στο Western blotting. Το 4 5 6 68

αντίσωμα αυτό δε δείχνει να προσδένει σε καμία πρωτεΐνη στο Western blotting. Επίσης, όλα τα μονοκλωνικά αντισώματα εκτός από το mabnr6 φαίνεται να προσδένουν τόσο στη γλυκοζυλιωμένη όσο και στην απογλυκοζυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης σε Western blotting. 8.5.9 Προσδιορισμός ικανότητας πρόσδεσης mabs με RIA Για τον προσδιορισμό της ικανότητας πρόσδεσης των mab1 mab6 στο β2-α4 έγιναν πειράματα με τη μέθοδο της RIA. Στην εικόνα 23 φαίνεται η πρόσδεση των mabs σε β2-α4 σημασμένη με ραδιενεργή επιβατιδίνη. Εικόνα 23. RIA για έλεγχο πρόσδεσης αντισωμάτων στο β2-α4 σημασμένο με ραδιενεργή επιβατιδίνη Στον οριζόντιο άξονα της γραφικής παράστασης φαίνονται τα mab1-mab6 καθώς και μίγμα αυτών (ίδιος όγκος από το καθένα). Επίσης, χρησιμοποιούνται ένας θετικός και ένας αρνητικός μάρτυρας. Ο θετικός μάρτυρας αντιστοιχεί στον ορό του αρουραίου R3 και ο αρνητικός σε ορό μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Στον κάθετο άξονα αναγράφονται οι κρούσεις cpm που μετρήθηκαν στο μετρητή γ ακτινοβολίας για καθένα από τα δείγματα του οριζόντιου άξονα μετά από τη RIA. Ta mabnr2, mabnr3, mabnr5 δείχνει να προσδένει σε μεγάλο βαθμό στο ραδιενεργά σημασμένο β2-α4 με τη μέθοδο της RIA. Όπως παρατηρείται από τα αποτελέσματα στο β2-α4 προσδένουν κυρίως τα mab2, mab3 και mab5 και σε μικρότερο βαθμό το mab1. 69

cpm 2500 2000 1500 1000 500 0 mab1 mab2 mab3 mab4 mab5 mab6 Μίγμα mab Θετικός μάρτυρας Αρνητικός μάρτυρας Εικόνα 24. RIA για έλεγχο πρόσδεσης αντισωμάτων σε ολόκληρο υποδοχέα α4β2 σημασμένο με ραδιενεργή επιβατιδίνη Στον οριζόντιο άξονα της γραφικής παράστασης φαίνονται τα mab1-mab6 καθώς και μίγμα αυτών (ίδιος όγκος από το καθένα). Επίσης, χρησιμοποιούνται ένας θετικός και ένας αρνητικός μάρτυρας. Ο θετικός μάρτυρας αντιστοιχεί στον ορό του αρουραίου R3 και ο αρνητικός σε ορό μη ανοσοποιημένου αρουραίου. Στον κάθετο άξονα αναγράφονται οι κρούσεις cpm που μετρήθηκαν στο μετρητή γ ακτινοβολίας για καθένα από τα δείγματα του οριζόντιου άξονα μετά από τη RIA. To mabnr2 δείχνει να προσδένει σε μεγάλο βαθμό στον ολόκληρο τον α4β2 υποδοχέα με τη μέθοδο της RIA. Με την ίδια μέθοδο (RIA) ελέγχθηκε η ικανότητα πρόσδεσης των mab1 mab6 στον ολόκληρο υποδοχέα α4β2. Ο υποδοχέας που χρησιμοποιήθηκε εκφράζεται στο εργαστήριο σε κύτταρα εντόμων. Η RIA πραγματοποιείται με τον τρόπο που έχει ήδη περιγραφεί με τη χρήση ολόκληρου του υποδοχέα α4β2 σημασμένου με ραδιενεργή επιβατιδίνη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε ολόκληρο τον υποδοχέα α4β2 προσδένει κυρίως το mabnr2 το οποίο όπως έχει αποδειχθεί και με προηγούμενα πειράματα παρουσιάζει μεγάλη ειδικότητα για τη β2 υπομονάδα και ελάχιστες διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις με άλλες υπομονάδες. 70

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Απομόνωση και πέψη μονοκλωνικών αντισωμάτων για τη δημιουργία συμπλόκων Fab με υπομονάδες υποδοχέων 9.1 Απομόνωση mab73 και παραγωγή Fab θραυσμάτων του 9.1.1 Aπομόνωση mab73 Το μονοκλωνικό αυτό αντίσωμα καλλιεργείται και απομονώνεται από καλλιέργεια ειδικού τύπου όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. Η απομόνωση του από υπερκείμενο της καλλιέργειας αυτής ξεκινάει με την κατακρήμνιση του αντισώματος με 45% θειικό αμμώνιο (Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία ) και στη συνέχεια διέρχεται από στήλη μοριακού διαχωρισμού όπως έχει ήδη περιγραφεί. Στο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου της εικόνας 25 φαίνεται το αντίσωμα πριν από την κατακρήμνιση σε θειικό αμμώνιο καθώς και μετά από αυτή. 1 2 3 4 5 6 7 8 65kD 55kD 28kD 25kD Εικόνα 25. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πριν και μετά τον καθαρισμό mab73 με 45% θειικό αμμώνιο Στην 1 η θέση φαίνονται οι πρωτεΐνες δείκτες. Στη 2 η θέση φαίνεται το αντίσωμα πριν από κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο. Παρατηρούνται οι βαριές αλυσίδες (55kD) και οι ελαφριές αλυσίδες οι οποίες είναι δύο ειδών (25kD και 28kD). Επίσης, φαίνεται η αλβουμίνη του ορού (65kD). Στη 3 η θέση βρίσκεται το αντίσωμα μετά την κατακρήμνιση και μια πολύ μικρή ποσότητα αλβουμίνης (65kD) η οποία δεν διακρίνεται καλά. Στη συνέχεια για περαιτέρω καθαρισμό του αντισώματος το διάλυμα που το περιέχει διέρχεται από στήλη μοριακής διήθησης Superdex 200. Το γράφημα που λαμβάνεται από το FPLC φαίνεται παρακάτω. 71

2 1 1 3 1 4 1 1 1 2 3 4 5 6 7 65kD 55kD 28kD 25kD Εικόνα 26. Γράφημα από FPLC για απομόνωση mab73 με στήλη Superdex 200. Στον οριζόντιο άξονα της γραφικής παράστασης απεικονίζεται ο όγκος έκλουσης των μορίων ενώ στον κάθετο οι τιμές της οπτικής απορρόφησης. Στην καμπύλη 2 εκλούεται το mab73. Στα τελευταία κλάσματα αυτής της κορυφής, δηλαδή στο σημείο 3, εκλούεται και η αλβουμίνη. Εικόνα 27. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πριν και μετά από καθαρισμό mab73 με στήλη Superdex200. Στις θέσεις 2 και 3 βρίσκεται το mab73 απαλλαγμένο από άλλα μόρια όπως η αλβουμίνη. Η αλβουμίνη δείχνει να εκλούεται μαζί με μόρια αντισώματος στα τελευταία κλάσματα της μεγάλης καμπύλης (σημείο 3 του γραφήματος, θέση 4 του πηκτώματος). Στη θέση 5 βρίσκεται κλάσμα του γραφήματος που αντιστοιχεί στην τελευταία μικρή καμπύλη (σημείο 4). Στη θέση 7 του πηκτώματος, όπου βρίσκεται το αντίσωμα πριν καθαριστεί από τη στήλη, φαίνεται η αλβουμίνη (65kD). 72

9.1.2 Πέψη mab73 με παπαΐνη και απομόνωση Fab73 Έπειτα από την απομόνωση του mab73 από οποιαδήποτε άλλα στοιχεία της καλλιέργειας ακολουθεί πέψη με 1% παπαΐνη. Οι συνθήκες πέψης περιγράφονται στο Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. Από την πέψη του mab73 με αυτό το ένζυμο προκύπτουν, όπως ήδη έχει αναφερθεί, τμήματα Fab73 και Fc. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ανιοντοανταλλακτική στήλη Q-Sepharose ώστε να απομονωθούν από τα προϊόντα της πέψης τα Fab73. Η γραφική παράσταση της εικόνας 28 απεικονίζει τα κλάσματα διαχωρισμού που προκύπτουν από αυτή τη στήλη. 0,07 3,5 0,06 0,05 2 3 2,5 OD280 0,04 0,03 2 1,5 Συγκέντρωση άλατος 0,02 0,01 1 3 1 0,5 0 1 8 15 22 29 36 43 50 57 64 71 78 85 92 0 Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 28. Γράφημα από FPLC για απομόνωση Fab73 με στήλη Q-Sepharose. Οι καμπύλες με την μπλε γραμμή αντιστοιχούν στις τιμές της οπτικής απορρόφησης και η κίτρινη γραμμή αφορά τη συγκέντρωση άλατος οι τιμές του οποίου αναγράφονται στον κάθετο άξονα δεξιά σε μονάδες mm. Το Fab73 εκλούεται στα 2-5 που αντιστοιχούν σε 260-330mM NaCl. Τα κλάσματα που αντιστοιχούν στο σημείο 6 περιλαμβάνουν τα Fc τμήματα τα οποία εκλούονται σε συγκέντρωση 520-580mM NaCl. 73

1 2 3 4 5 6 7 8 55kD 34kD 25-30kD Εικόνα 29. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου μετά από καθαρισμό των Fab73 με στήλη Q-Sepharose. Στις θέσεις 2-5 του πηκτώματος φαίνονται τα Fab73. Στα 25-30kD των θέσεων 2-5 διακρίνονται τρεις ζώνες οι οποίες φαίνονται σαν μία μεγάλη. Στη θέση 8 βρίσκεται το Fc τμήμα (34kD) που φαίνεται αντίστοιχα με τον ίδιο αριθμό στο γράφημα και στη θέση 6 βρίσκεται ολόκληρο mab73. Από την παραπάνω γραφική παράσταση και την εικόνα του πηκτώματος συμπεραίνεται ότι τα Fab73 μπορούν να διαχωριστούν από το Fc τμήμα του αντισώματος, το οποίο δεν προσδένει στη β1 υπομονάδα. Οι τρεις ζώνες που παρουσιάζονται στα Fab δείχνουν ότι δεν έχει επιτευχθεί πλήρης διαχωρισμός των δύο διαφορετικών Fab που προκύπτουν λόγω των δύο αρχικών αντισωμάτων που έχουμε. Οπότε τα κλάσματα της κορυφής όπου περιλαμβάνονται τα Fab φαίνεται να περιλαμβάνουν τρεις κυρίως ζώνες (τρεις λόγω αποδιατακτικών συνθηκών πηκτώματος). Αν υπήρχαν Fab ενός μόνο αντισώματος θα έπρεπε να φαίνονται δύο ζώνες. Στην εικόνα 30 φαίνεται πήκτωμα αγαρόζης από ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης για τις πρωτεΐνες των κλασμάτων του γραφήματος από στήλη Q-Sepharose. 74

1 2 3 4 5 6 7 ΡΙ 8,4 ΡΙ 8,6 Εικόνα 30. Ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης σε πήκτωμα αγαρόζης για Fab73. Οι θέσεις 1-6 αντιστοιχούν σε κορυφή γραφήματος από Q-Sepharose όπου εκλούονται τα Fab73. Διακρίνονται δύο ζώνες στα ισοηλεκτρικά σημεία 8,4 και 8,6. Στη θέση 7 βρίσκονται οι πρωτεΐνες δείκτες. Παρατηρούνται δύο ζώνες σε κάθε θέση από 1-5 γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία δύο πρωτεϊνών σε κάθε θέση μιας και οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης δεν είνα αποδιατακτικές. Στην εικόνα 30 όπου οι συνθήκες δεν είναι αποδιατακτικές, παρουσιάζονται δύο ζώνες για τα Fab73. Αυτό επιβεβαιώνει την παρουσία των δύο διαφορετικών Fab που προκύπτουν από δύο αρχικά διαφορετικά mab. 9.2 Σύμπλοκο β1-fab73 Τα Fab73 που δημιουργήθηκαν και απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω αναμείχθηκαν με τη β1 υπομονάδα και αφέθηκαν στους 4 ο C όλη τη νύχτα για να προσδεθούν τα Fab στην υπομονάδα και να δημιουργηθεί σύμπλοκο. Η αναλογία ήταν 2 : 1 (Fab : β1). Μετά το τέλος της επώασης το διάλυμα με τις πρωτεΐνες διέρχεται από στήλη μοριακής διήθησης ώστε να απομονωθεί το σύμπλοκο από τα ελεύθερα Fab και β1. Η γραφική παράσταση της εικόνας 31 προκύπτει από αυτή τη χρωματογραφία. 75

OD280 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 2 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 31. Γράφημα από FPLC για απομόνωση συμπλόκου β1-fab73 με στήλη Superose 12. Στον οριζόντιο άξονα της γραφικής παράστασης απεικονίζεται ο όγκος έκλουσης των μορίων ενώ στον κάθετο οι τιμές της οπτικής απορρόφησης. Το σύμπλοκο εκλούεται στα κλάσματα της 1 ης καμπύλης, με κορυφή στα 13,5ml περίπου. Στα κλάσματα της δεύτερης καμπύλης εκλούονται τα μη προσδεδεμένα Fab73 και β1. 1 2 3 4 35kD 25-30kD Εικόνα 32. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για απομόνωση του συμπλόκου β1-fab73 Στη θέση 1 του πηκτώματος παρατηρούνται οι πρωτεΐνες που εκλούονται στη 2 η καμπύλη της γραφικής παράστασης της εικόνας 31. Φαίνονται 4 ζώνες από τις οποίες η μία είναι στα 35kD και αντιστοιχεί στη β1 υπομονάδα και οι άλλες τρεις βρίσκονται στα 25-30kD και αντιστοιχούν στα Fab73. Πρόκειται για μη συμπλοκοποιημένα Fab και β1. Στη θέση 2 φαίνονται τα Fab73 μετά την απομόνωσή τους (βλέπε εικόνα 28). Όπως έχει ήδη αναφερθεί πρόκειται για δύο είδη Fab που στις αποδιατακτικές συνθήκες του πηκτώματος αυτού διακρίνονται ως τρεις ζώνες λόγω βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας. Στη θέση 3 παρατηρείται η β1 η ζώνη της οποίας βρίσκεται στα 50kD. Στη θέση 4 φαίνεται η πρωτεΐνη της 1 ης καμπύλης της γραφικής παράστασης της εικόνας 31. Πρόκειται για το σύμπλοκο β1- Fab73. Παρατηρούνται τρεις ζώνες από τις οποίες η μία βρίσκεται στα 35kD (β1) και οι άλλες δύο στα 25-30kD (Fab73). 76

Τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν στις εικόνες 31 και 32 οδηγούν στο συμπέρασμα ότι προκύπτει σύμπλοκο β1-fab73 που μπορεί να διαχωριστεί ικανοποιητικά. Συγκεκριμένα, μετά τη δημιουργία συμπλόκου η χρήση στήλης μοριακής διήθησης μπορεί να βοηθήσει ώστε αυτό να απομονωθεί από τα μη συμπλοκοποιημένα Fab και β1. Στο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου της εικόνας 32 φαίνεται ότι το σύμπλοκο που προκύπτει είναι ομοιογενές καθώς η β1 υπομονάδα συνδέεται τελικά με ένα από τα δύο είδη Fab73 κάτι που αποδεικνύεται με την παρουσία 2 ζωνών Fab στο σύμπλοκο και όχι 3 (που υπήρχαν στο δείγμα του Fab αρχικά). Αυτός ο σαφής διαχωρισμός του συμπλόκου μπορεί να διευκολύνει τις προσπάθειες κρυστάλλωσης αυτού που έχουν ως τελικό στόχο την ανάλυση της δομής του συμπλόκου αυτού. 9.3 Απομόνωση mab198 και παραγωγή Fab θραυσμάτων του 9.3.1 Απομόνωση mab198 Το mab198 καλλιεργείται και απομονώνεται από καλλιέργεια ειδικού τύπου όπως περιγράφεται στo Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. Η απομόνωση του από υπερκείμενο της καλλιέργειας αυτής ξεκινάει με την κατακρήμνιση του αντισώματος με 45% θειικό αμμώνιο και στη συνέχεια διέρχεται από στήλη μοριακού διαχωρισμού όπως έχει ήδη περιγραφεί. 2,5 2 1,5 OD280 1 0,5 0 30 40 50 60 70 80 Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 33. Γράφημα από FPLC για απομόνωση mab198 με στήλη Superdex 200. Στον οριζόντιο άξονα της γραφικής παράστασης απεικονίζεται ο όγκος έκλουσης των μορίων ενώ στον κάθετο οι τιμές της οπτικής απορρόφησης. Το mab198 εκλούεται στα κλάσματα της μεγάλης καμπύλης, με κορυφή στα 61ml περίπου. Στα τελευταία κλάσματα αυτής της κορυφής εκλούεται η αλβουμίνη. 77

9.3.2 Πέψη mab198 με παπαΐνη και απομόνωση Fab198 Έπειτα από την απομόνωση του mab198 από οποιαδήποτε άλλα στοιχεία της καλλιέργειας ακολουθεί πέψη με 1% παπαΐνη. Οι συνθήκες πέψης περιγράφονται στο Κεφάλαιο Πειραματική Μεθοδολογία. Από την πέψη του mab198 με αυτό το ένζυμο προκύπτουν τμήματα Fab198 και Fc. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ανιοντοανταλλακτική στήλη Q-Sepharose ώστε να απομονωθούν από τα προϊόντα της πέψης τα Fab198. Η γραφική παράσταση της εικόνας απεικονίζει τα κλάσματα διαχωρισμού που προκύπτουν από αυτή τη στήλη. Στην κορυφή 1 και 2 αυτής της γραφικής παράστασης εκλούονται τα Fab198 ενώ στην κορυφή 3 εκλούεται το Fc. OD280 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 8 15 22 29 36 43 50 57 64 71 78 1 2 2 3 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 Συγκέντρωση άλατος Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 34. Γράφημα από FPLC για απομόνωση Fab198 με στήλη Q- Sepharose. Οι καμπύλες με την μπλε γραμμή αντιστοιχούν στις τιμές της οπτικής απορρόφησης και η κίτρινη γραμμή αφορά τη συγκέντρωση άλατος οι τιμές του οποίου αναγράφονται στον κάθετο άξονα δεξιά. Τα Fab198 εκλούονται στα κλάσματα της καμπύλης 1 και 2, δηλαδή σε 240-320mM NaCl. Το τμήμα Fc εκλούεται στην 3 η καμπύλη, δηλαδή σε 330-400mM. 78

1 2 3 4 5 6 55kD 34kD 25-30kD Εικόνα 35. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου μετά από καθαρισμό των Fab198 με στήλη Q-Sepharose. Πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Στη θέση 1 φαίνεται το mab198 απομονωμένο από στήλη Superdex 200. Στη θέση 2-3 φαίνονται τα κλάσματα της καμπύλης 1 του γραφήματος της εικόνας 34. Στις θέσεις 4 και 5 φαίνονται αντίστοιχα κλάσματα της καμπύλης 2. Στη θέση 6 βρίσκεται κλάσμα της καμπύλης 3. Τα Fab του αντισώματος βρίσκονται στις δύο πρώτες καμπύλες (1, 2) ενώ το Fc τμήμα στην καμπύλη 3. 9.4 Απομόνωση mabnr2 και παραγωγή Fab θραυσμάτων του 9.4.1 Αποτελέσματα απομόνωσης mabnr2 Το mabnr2 καλλιεργείται και απομονώνεται από καλλιέργεια ειδικού τύπου. Η απομόνωση του από υπερκείμενο της καλλιέργειας αυτής ξεκινάει με την κατακρήμνιση του αντισώματος με 45% θειικό αμμώνιο και στη συνέχεια διέρχεται από στήλη μοριακού διαχωρισμού όπως έχει ήδη περιγραφεί. 79

1 2 Εικόνα 36. Γράφημα από FPLC για απομόνωση mabnr2 με στήλη Superdex 200. Γράφημα από στήλη Superdex 200. Το mabnr2 εκλούεται στα κλάσματα της μεγάλης καμπύλης (1), με κορυφή στα 61ml περίπου. Στα τελευταία κλάσματα αυτής της κορυφής εκλούεται η αλβουμίνη (2). 65kD 55kD 1 2 3 Εικόνα 37. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πριν και μετά από καθαρισμό mabnr2 με στήλη Superdex200. Πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου όπου στις θέσεις 1 και 2 φαίνονται τα κλάσματα της γραφικής παράστασης της εικόνας 36 και στη θέση 3 οι πρωτεΐνες γνωστού μοριακού βάρους. Είναι φανερές η βαριά και η ελαφριά αλυσίδα του mabnr2 και στις δύο θέσεις. Στη θέση 2 εκτός από το αντίσωμα διακρίνεται και αλβουμίνη (65kD) η οποία εκλούεται στα τελευταία κλάσματα της καμπύλης της γραφικής παράστασης (σημείο 2 της γραφικής παράστασης). 9.4.2 Πέψη mabnr2 με παπαΐνη και απομόνωση FabNR2 Έπειτα από την απομόνωση του mabnr2 από οποιαδήποτε άλλα στοιχεία της καλλιέργειας ακολουθεί πέψη με 1% παπαΐνη. Από την πέψη του FabNR2 με αυτό το ένζυμο προκύπτουν τμήματα FabNR2 και Fc. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ανιοντοανταλλακτική στήλη Q-Sepharose ώστε να απομονωθούν από τα προϊόντα της πέψης τα FabNR2. Η γραφική παράσταση της εικόνας 38 απεικονίζει τα κλάσματα 80