Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Φώτης Καρβέλης
Ιστορική αναδρομή Ανακάλυψη του DNA Μελέτη αντιγραφής Απομόνωση ενζύμων Μελέτη της δράσης τους Αποκάλυψη των περιοριστικών ενδονουκλεασών
Περιοριστικές Ενδονουκλεάσες Είναι νουκλεάσες, άρα καταλύουν τη διάσπαση φωσφοδιεστερικών δεσμών. Είναι ενδονουκλεάσες, άρα σπάζουν εσωτερικούς φ.δ., δεν σπάνε ποτέ το πρώτο ή το τελευταίο φ.δ. Είναι ένζυμα, άρα οι πολυπεπτιδικές τους αλυσίδες κωδικοποιούνται από γονίδια. Παράγονται από βακτήρια με σκοπό να αμυνθούν σε ιούς που τους προβάλλουν. Όταν ο ιός εισέλθει στο βακτηριακό κύτταρο, οι ενδονουκλεάσες κόβουν το DNA τους και το καταστρέφουν. Είναι περιοριστικές, διότι περιορίζουν τη δράση τους στο εξωγενές DNA και δεν δρουν όπως είναι λογικό στο DNA του οργανισμού που τις παράγει.
Αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες στο DNA και η καθεμιά δρα σε συγκεκριμένα σημεία. Σπάζουν συγκεκριμένους φ.δ. μεταξύ των διαδοχικών νουκλεοτιδίων. Άρα δρουν με συγκεκριμένο τρόπο. Π ρ ο σ ο χ ή : Στην αλληλουχία αναγνώρισης έχει σημασία και η πολικότητά της, όχι μόνο η αλληλουχία βάσεων. Δηλαδή, άλλο το 5 -GATCC-3 και άλλο το 3 -GATCC-5. Π ρ ο σ ο χ ή : Όταν βλέπουμε την αλληλουχία αναγνώρισης του ενζύμου, ελέγχουμε και την πολικότητα της αλληλουχίας.
Βλέπουμε ότι το κάθε ένζυμο αναγνωρίζει συγκεκριμένες αλληλουχίες και κόβει με συγκεκριμένο τρόπο το DNA.
Βακτήριο: Escherichia coli παράγει Ένζυμο: EcoRI αναγνωρίζει Συγκεκριμένη αλληλουχία
Ανακάλυψη περιοριστικών ενδονουκλεασών Ανακάλυψη διαφόρων τεχνικών οι οποίες μας βοήθησαν να επεξεργαστούμε τα μακρομόρια καλύτερα ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ
ΟΡΙΣΜΟΙ Γενετική Μηχανική: Το σύνολο των τεχνικών που μας επιτρέπουν να επεμβαίνουμε στο γενετικό υλικό των οργανισμών. Έτσι, είναι δυνατή πλέον η εισαγωγή γονιδίων στο γονιδίωμα των οργανισμών. Κλώνος: Το σύνολο των μορίων ή κυττάρων ή οργανισμών που προέρχονται από ένα αρχικό ή μια μικρή αρχική ποσότητα όταν αναφερόμαστε σε μόρια ή κύτταρα. κλώνος μορίων κλώνος κυττάρων κλώνος οργανισμών
Η Γενετική Μηχανική βοήθησε: Στο να κατανοήσουμε τα μυστήρια της ζωής, μιας και καταφέραμε να μελετήσουμε με μεγαλύτερη ακρίβεια δομές και διαδικασίες. Στο να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς εξέλιξης των οργανισμών. Στο να βελτιωθεί η ποιότητα ζωής των ανθρώπων με τις εφαρμογές της στην ιατρική, στην κτηνοτροφία, στη γεωργία. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA περιλαμβάνει όλες εκείνες τις τεχνικές που χρησιμοποιούμε για να μεταφέρουμε τμήματα του γενετικού υλικού από έναν οργανισμό σε έναν άλλο.
Η μεταφορά γενετικού υλικού περιλαμβάνει τους εξής οργανισμούς και μόρια: Ένας ή περισσότεροι οργανισμοί δότες είναι οι οργανισμοί από τους οποίους παίρνουμε τμήματα DNA (γονίδια) με σκοπό να τα εισάγουμε στο γονιδίωμα άλλου οργανισμού (διαφορετικού είδους). φορείς κλωνοποίησης Μόρια που θα φέρουν τα τμήματα αυτά. Τα μόρια αυτά ονομάζονται φορείς κλωνοποίησης. Οργανισμούς οι οποίοι θα δεχθούν το «ξένο» DNA. Διάφορες τεχνικές και ουσίες όπως διαλύματα, αντιβιοτικά, θρεπτικό υλικό κ.ά. καλλιέργεια με χρήση αντιβιοτικού
Φορείς κλωνοποίησης Τα μόρια που θα χρησιμοποιηθούν για τη μεταφορά γενετικού υλικού θα πρέπει να έχουν κάποιες ιδιότητες τις οποίες εκμεταλλευόμαστε για να πετύχουμε το σκοπό μας. Αυτές είναι: 1. Να έχουν την ικανότητα αυτόνομης αντιγραφής. Θα πρέπει να δηλαδή να μπορούν να αντιγράφονται ανεξάρτητα από το κυρίως γενετικό υλικό του οργανισμού στο οποίο βρίσκονται. 2. Να διαθέτουν ένα σημείο έναρξης της αντιγραφής. Εάν τα σημεία έναρξης αντιγραφής είναι περισσότερα, αυξάνεται η πιθανότητα της λάθους επανένωσης. 3. Να διαθέτουν μια περιοχή κατάλληλη για την εισαγωγή του ξένου DNA. Η περιοχή αυτή θα πρέπει να περιέχει μοναδικές θέσεις αναγνώρισης από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Οι θέσεις αυτές θα πρέπει να μην βρίσκονται μέσα στη θέση έναρξης αντιγραφής. 4. Να φέρουν ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό.
Πλασμίδια: Χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση μι- κρών τμημάτων DNA. Βακτηριοφάγος λ: Χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση τμημά- των DNA μέχρι και 20.000 ζ.β. Κοσμίδια: Είναι υβρίδια που έχουμε κατασκευάσει και προέρχονται από ένωση πλασμιδίων και βακτηριοφάγων λ. Χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση τμημάτων DNA μέχρι 45.000 ζ.β. Τεχνητά χρωμοσώματα: Χρησιμοποιούνται για τμήματα DNA > 50.000 ζ.β. τα οποία ενώνονται στο χρωμόσωμα και εισάγονται στο ζυμομύκητα για κλωνοποίηση.