EXPRESSION SYSTEMS 1. Bacteria E.coli B. subtilis S. lividans 2. Yeasts S. cerevisiae Pichia pastoris 3. Fungi Trichoderma Aspergillus 4. Insect cells
ΙΑΡΡΗΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι τεχνικές διάρρηξης κυττάρων διακρίνονται σε: Α) Μηχανικές τεχνικές Β) Μη µηχανικές τεχνικές - Η επιλογή και ο συνδυασµός των τεχνικών, εξαρτάται από το τύπο του κυττάρου ή των ιστών και τη σταθερότητα του ενζύµου
ΙΑΡΡΗΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ: ΜΗ ΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 1. Ωσµωτικό σοκ - Χρησιµοποιείται συνήθως σε συνδυασµό µε άλλες τεχνικές - Εφαρµόζεται: α) στα κατά Gram αρνητικά βακτήρια (τοίχωµα µειωµένης µηχανικής αντοχής) β) στην εκχύλιση περιπλασµικών ενζύµων γ) ιάρρηξη θαλάσσιων βακτηρίων (απαιτούν υψηλή συγκέντρωση άλατος 3% NaCl) - Αναποτελεσµατικό στα κατά Gram θετικά βακτήρια - Έκθεση των κυττάρων σε διάλυµα σακχαρόζης (20-25% w/v) (συρρίκνωση λόγω µερικής αφυδάτωσης) εισαγωγή σε ψυχρό νερό διάρρηξη κυττάρου
ΙΑΡΡΗΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ: ΜΗ ΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 2. Επεξεργασία µε βάση - Οικονοµική & αποτελεσµατική τεχνική κυτταρικής λύσης - Καταστρέφονται ανεπιθύµητες πρωτεάσες & πυρετογόνες ουσίες - Προϋποθέτει ότι το ένζυµο είναι σταθερό σε υψηλό ph (σπάνιο) 3. Επιφανειοδραστικές ενώσεις - Βοηθούν στη διαλυτοποίηση λιπών & λιποπρωτεϊνών της κυτταρικής µεµβράνης (αύξηση της διαπερατότητας, κυρίως µη ιοντικές π.χ Tween, Triton) - ιαλυτοποίηση µεµβρανικών ενζύµων (επηρεάζουν αρνητικά την ενζυµική δοµή)
ΙΑΡΡΗΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ: ΜΗ ΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 4. Οργανικοί διαλύτες - Επιτυγχάνουν αποσταθεροποίηση της κυτταρικής µεµβράνης - Χρησιµοποιούνται σε συνδυασµό µε άλλες τεχνικές (π.χ. ωσµωτικό σοκ) 5. Λυσοζύµη -Υδρολύει β-1,4 γλυκοζιτικούς δεσµούς των βλεννοπεπτιδίων του κυτταρικού τοιχώµατος. Μείωση δοµικής σταθερότητας -Χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε άλλες τεχνικές (π.χ. ωσµωτικό σοκ)
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ Ιοντοανταλλάκτες: Ανάλογα µε το εύρος του ph στο όποιο διατηρούν το φορτίο τους διακρίνονται σε ασθενείς και ισχυρούς Ασθενείς: Προέρχονται από ασθενές οξύ ή βάση. εν είναι φορτισµένοι σε όλες τις τιµές ph π.χ. Το ασθενές οξικό οξύ ιονίζεται σε ph >4 ο ασθενής µεθυλοκαρβοξυλικός κατιοντοανταλλάκτης (PK~4) ιονίζεται πλήρως σε ph>6 Ισχυροί: Προέρχονται από ισχυρό οξύ ή βάση. Είναι φορτισµένοι σε όλες σχεδόν τις τιµές ph. π.χ. ο ισχυρός κατιοντοανταλλάκτης µε σουλφονικές ή προπυλσουλφονικές οµάδες (PK~2)
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ - Ιοντοανταλλάκτες: Ανάλογα µε το είδος των φορτισµένων οµάδων διακρίνονται σε κατιοντοανταλάκτες και ανιοντοανταλλάκτες Σε ph διαλύµατος < pi: Το συνολικό φορτίο του ενζύµου είναι θετικό. Προσροφάται σε αρνητικά φορτισµένο κατιοντοανταλλάκτη (cation exchanger) Σε ph διαλύµατος > pi: Το συνολικό φορτίο του ενζύµου είναι αρνητικό. Προσροφάται σε θετικά φορτισµένο ανιοντοανταλλάκτη (anion exchanger)
ΕΚΛΟΥΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΑΠΟ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΚΤΕΣ ιαβάθµιση: Μεταβολή σύστασης της υγρής φάσης ως προς το ph, ιοντική ισχύ, ή κάποιας ουσίας που υποβοηθεί την έκλουση του ενζύµου Συνεχής διαβάθµιση (continuous gradient) Σταδιακή διαβάθµιση (step gradient) Εκλουση συγγένειας (affinity elution)
ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΤΗΛΗΣ 1. Χρωµατογραφία κατανοµής (Partition chromatography) Τα προς διαχωρισµό συστατικά κατανέµονται µεταξύ δύο περιοχών της ίδιας υγρής φάσης Χρωµατογραφία διαπερατότητας ή µοριακού ηθµού (gel permeation, gel filtration) ιαχωρισµός βάσει του µοριακού µεγέθους 2. Χρωµατογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) Τα συστατικά του ενζυµικού διαλύµατος προσροφούνται στη στερεά φάση (προσροφητή) Χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (ion exchange chromatography) ιαχωρισµός µε βάση το ηλεκτρικό φορτίο Χρωµατογραφία συγγένειας (affinity chromatography) ιαχωρισµός µε βάση τη βιολογική συγγένεια του ενζύµου µε το προσροφητή
ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ - Ιοντοανταλλάκτες: Ανάλογα µε το είδος των φορτισµένων οµάδων διακρίνονται σε κατιοντοανταλάκτες και ανιοντοανταλλάκτες Σε ph διαλύµατος < pi: Το συνολικό φορτίο του ενζύµου είναι θετικό. Προσροφάται σε αρνητικά φορτισµένο κατιοντοανταλλάκτη (cation exchanger) Σε ph διαλύµατος > pi: Το συνολικό φορτίο του ενζύµου είναι αρνητικό. Προσροφάται σε θετικά φορτισµένο ανιοντοανταλλάκτη (anion exchanger)